digestión enzimática asistida por ultrasonidos para la

DIGESTIÓN ENZIMÁTICA ASISTIDA POR ULTRASONIDOS PARA
LA DETERMINACIÓN DE ARSÉNICO TOTAL EN ALIMENTOS
COCIDOS: ESTUDIO PRELIMINAR
Polischuk, T.1; Buchhamer, E.1*; Navoni, J.2; Giménez, C.1; Villaamil Lepori, E.2
1
Com. Fernández 755 Cátedra de Química Analítica I, Universidad Nacional del Chaco Austral, Pcia.
Roque Sáenz Peña, Chaco, C.P. 3700.
2
Junín 956 Cátedra de Toxicología y Química Legal-Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA,
Buenos Aires, C.P. 1113
edgarb@uncaus.edu.ar
Resumen
Muchos esfuerzos se han dedicado a resolver los problemas de extracción de especies metálicas en muestras
relacionadas con los alimentos. Es conocida la eficacia de las enzimas como procedimiento para extraer
biomoléculas unidas a especies organometálicas. El objetivo de este trabajo fue comparar diferentes
procedimientos de hidrólisis enzimática para la extracción y determinación cuantitativa de arsénico total en
alimentos cocidos mediante FI-HG-AAS. Dadas las características del alimento a estudiar (guisado de arroz,
verduras y carne cocido con agua con una concentración de Arsénico de 200 µg/l), dos enzimas (celulasa y
pancreatina) fueron seleccionadas y combinadas con dos procesos de agitación (baño termostatizado/
ultrasonidos). La confiabilidad de los procedimientos fue comprobada con el material de referencia (Brown rice
SYTED105PI0272) y los resultados fueron comparados con el procedimiento clásico de extracción de arsénico
total por Dry Ashing. Las recuperaciones obtenidas fueron las siguientes: 101% para baño termostatizadopancreatina, 104% para baño termostatizado-celulasa, 99% para ultrasonidos-celulasa y 85% para ultrasonidospancreatina. La prueba de comparación de medias T (p<0,05) mostró que los valores de arsénico total extraído
en los tres primeros procedimientos fueron semejantes, con muy buenos rendimientos, siendo diferente y menor
la combinación ultrasonidos-pancreatina. Los valores encontrados permiten concluir que la enzima celulasa
presenta un mejor comportamiento para la extracción de AsT en las muestras de alimentos cocidos
seleccionados en este estudio; pero además, que como procedimiento de hidrólisis enzimática, la combinación
ultrasonidos-enzima presenta la ventaja de reducir los tiempos de tratamiento y consumo de reactivo.
Palabras clave: enzimas, ultrasonidos, arsénico, alimentos.
Introducción
Muchos esfuerzos se han dedicando a resolver los problemas de extracción de especies
organometálicas en muestras de alimentos. A pesar de que la extracción con solventes como el
cloroformo (Laparra, J.M. 2005; Dietz, C. 2007) o el metanol (Morand, E. 2003) han dado muy
buenos resultados, los procedimientos resultan largos y trabajosos y de difícil aplicación en el análisis
de rutina en el laboratorio.
Las enzimas pueden ser utilizadas como procedimiento suave para extraer biomoléculas
vinculadas a especies organometálicas. Por ejemplo, la lipasa es una enzima que permite digerir la
grasa, así como la amilasa que actúa sobre los azúcares y el almidón (Branch, S. 1994). La mezcla de
ellos como la pancreatina (lipasa + amilasa + proteasa) pueden ser utilizadas para digerir matrices
poco homogéneas. La tripsina ha sido empleada en la digestión enzimática de arsénico en especies de
pescado (Branch, S. 1994), y con el mismo fin en alimentos para niños (Pardo-Martínez, M. 2001).
Los resultados alcanzados por (Ebdon, L. 1994) y corroborados por (Méndez Alonso, M. 1995)
usando tripsina en distintos tipos de pescados y crustáceos no dejan lugar a dudas sobre su eficacia en
la extracción de arsénico en materiales con alto contenido proteico, no así en algas. Sin embargo, las
enzimas celulasa y pancreatina muestran una mejor eficacia en material vegetal, donde la tripsina no
resulta útil (Ayala, J. 1999). En el caso de otros metales (por ejemplo, mercurio, estaño y plomo) los
métodos enzimáticos no son tan eficaces porque en general, no están incorporados a las biomoléculas
más grandes, por lo tanto otros procedimientos de extracción son más adecuados.
1
Un inconveniente general del procedimiento de digestión enzimática es el largo tiempo de
incubación que deben aplicarse, normalmente de 12 a 24 h y, el relativo alto costo de los reactivos a
usar. Esto ha llevado a algunos investigadores a intentar desarrollar un método alternativo más rápido
y sencillo que consiste en la combinación de ultrasonidos y el uso de enzimas (Vale, G. 2008). El
primero proporciona una ruptura efectiva de las paredes celulares, que facilita la interacción de las
enzimas con los componentes liberados de las células, resultando en una reducción del tiempo de
tratamiento de horas a minutos solamente. La lipasa y proteasa combinadas con ultrasonidos han
demostrado ser válidas para la extracción de especies de arsénico en pelo humano, con una
recuperación del 60% y un tiempo de extracción de 10 min., alcanzando límites de detección del
método de 19.6, 12.7, 14.3 y 19.4 ng L-1 de As (III), DMA, MMA y As (V), respectivamente (Dietz,
C. 2007). Con Amilasa y proteasa se alcanzaron rendimientos de extracción de 98 – 110% con LOD
de 13-20 ng L-1 en Materiales de Referencia a base de arroz y muslo de pollo (Vale, G. 2008 y SanzMedel, E. 2007).
Atendiendo a estos antecedentes, se pensó en la posibilidad de emplear un procedimientos de
hidrólisis enzimática asistida por ultrasonido (USAED), como metodología factible de ser utilizada
para la extracción de arsénico total y especies de arsénico inorgánico en alimentos cocidos en el
análisis de rutina para la determinación cuantitativa de arsénico en alimentos cocidos mediante FI-HGAAS (Morand, E. 2003; Vale, G. 2008 y Vale, G. 2010).
Materiales y Métodos
1)
Toma de muestras
En los diferentes métodos de digestión enzimática se trabajó con un guisado de arroz, verduras y
carne cocido con agua con una concentración de Arsénico de 200 µg/l. Los ingredientes usados para
su preparación fueron: arroz, cebolla, carne, papa, zanahoria, pimiento, tomate perita y ajo, utilizando
600 ml de agua para su cocción. El tiempo de cocción fue de 25 minutos.
Dadas las características del alimento a estudiar, dos enzimas (celulasa y pancreatina) fueron
seleccionadas para realizar los procesos de digestión y combinadas con dos procesos de agitación
(baño termostatizado y ultrasonidos). La confiabilidad de los procedimientos fue comprobada con el
material de referencia (Brown rice CYTED105PI0272; As 0,508+0,032) y los resultados fueron
comparados con el procedimiento clásico de extracción de arsénico total por Dry Ashing.
2)
Tratamiento de las muestras
Se determinó el contenido de humedad secándolo en estufa a 105°C hasta peso constante,
obteniendo una humedad promedio de 75,5%. EL material seco se sometió a molienda en un molino
de cuchillas marca DALVO modelo MC/I V.C.A. 220, guardándose en recipientes plásticos
herméticos y almacenados a -20°C hasta su análisis. Previo al análisis el material fue secado
nuevamente a 105°C durante 2 h.
3)
Métodos de extracción seleccionados
3.a) Mineralización por calcinación en mufla
Se pesaron alrededor de 0,25 g de muestra seca o MRC, se le adicionaron 3 ml de agente
coadyuvante de la mineralización formado por Mg(NO3)2 al 20% (m/v) y MgO al 2% (m/v) y 10 ml de
HNO3 (50% v/v). La mezcla homogeneizada se colocó en plancha calefactora evaporándose el
contenido hasta total sequedad. Este residuo seco se llevó a mufla, siguiendo un programa de
temperatura hasta llegar a 450 °C manteniéndose por 12 h, hasta cenizas blancas. Estas cenizas fueron
disueltas con 5 ml de HCl 6M y 5 ml de solución reductora formada por KI 5% (m/v) y ácido
ascórbico 5% (m/v). Transcurridos 30 min, la disolución se transfirió a matraz de 25 ml y se llevó a
volumen final con HCl 6M.
2
3.b) Digestión enzimática
Para el tratamiento de las muestras fueron seleccionadas dos enzimas, para lo cual se tuvo en
cuenta las características del material a analizar, seleccionándose para cada procedimiento la relación
muestra – enzima más adecuada, según se describe a continuación:
3.b.1) Pancreatina
Baño termostatizado: Se pesaron 250 mg de muestra seca o Material de Referencia (MR) al que se
adicionó 250 mg de enzima (Pancreatin, From Porcine Pancreas P10750 SIGMA) relación muestra –
enzima 1:1 (Morand, E. 2003 y Ayala, J. 1999) utilizando para ello una disolución de pancreatina al
1,66% (m/v) en buffer NH4HCO3 0,1M (pH=8), hasta un volumen total de 15 ml.
Ultrasonidos: Se pesaron 250 mg de muestra seca o Material de Referencia (MR) al que se adicionó
100 mg de enzima relación muestra – enzima 2,5:1 (Vale, G. 2010) utilizando para ello una disolución
de pancreatina al 1,00% (m/v) en buffer pH=8, hasta un volumen total de 10 ml.
3.b.2) Celulasa
Baño termostatizado: A la muestra seca o material de referencia (MR) se añadió la enzima
correspondiente (Cellulase, From Penicillium funiculosum C0901 SIGMA) en una proporción muestra
– enzima 1:2, valor ajustado a partir de (Morand, E. 2003 y Ayala, J. 1999), utilizando para ello una
disolución de celulasa al 3,33% (m/v) en buffer CH3COONH4 0,02M (pH=5), hasta un volumen total
de 15 ml.
Ultrasonidos: A la muestra seca o material de referencia (MR) se agregó enzima en una proporción
muestra – enzima 2,5:1 (Vale, G. 2010) utilizando para ello una disolución de celulasa al 1,00% (m/v)
en buffer correspondiente, hasta un volumen total de 10 ml.
3.c) Mecanismos de agitación
Una vez conseguida la homogeneización completa de muestra y reactivos; se procedió a someter
a cada uno de los preparados descriptos anteriormente al mecanismo de agitación correspondiente. El
procedimiento de los dos mecanismos de agitación, para cada enzima, se describe a continuación.
Baño Termostatizado: La mezcla muestra-enzima colocadas tubos Falcon de 50 ml se incubó en un
baño termostatizado con agitación (120 rpm) a 37°C durante 12 h. Finalizada esta etapa se
sumergieron en baño con hielo. La separación del extracto y el pellet se obtuvo con una centrífuga
refrigerada marca ROLCO modelo CR5900 (3000 rpm - 10 minutos - 6°C).
Ultrasonidos: La mezcla en tubos Falcon de 15 ml colocados en gradilla fueron sometidos a agitación
por ultrasonidos durante 20 min (lavador ultrasonido TESTLAB modelo TB10TDCD, potencia
ultrasónica 400W y frecuencia 40kHz). Concluida esta etapa los tubos se sumergieron en un baño con
hielo. La separación del sobrenadante se obtuvo por centrifugación siguiendo las condiciones
detalladas anteriormente.
Los extractos obtenidos fueron filtrados (filtro 45 μm) y transferidos a matraces de 25 ml para
baño termostatizado, y a matraces de 10 ml para ultrasonidos. Se completaron los volúmenes con
buffers libres de enzimas correspondientes a cada metodología; estos se guardaron en heladera para su
posterior análisis. Ver Figura 1.
4)
Análisis de Arsénico
Se trabajó con un Espectrofotómetro de Absorción Atómica VARIAN SpectrAA 220 Atomic
Absorption Spectrometer; se utilizó un generador de hidruros con separador gas-líquido, acoplado a
una bomba peristáltica de cuatro vías, una para el ingreso de la muestra, y tres para los reactivos:
solución pre-reductora de Yoduro de potasio (KI), solución reductora de Borohidruro de Sodio
(NaBH4) y ácido Clorhídrico (HCl).
3
5)
Reactivos
En todos los casos se emplearon reactivos de grado analítico. Para la preparación de todas las
soluciones reactivas y estándar se utilizó agua bidestilada.
Todo el material volumétrico de vidrio y plástico utilizado en la preparación de reactivos y
disoluciones y para las digestiones enzimáticas se mantuvo en un baño de HNO3 al 30% durante 24 h,
el que fue enjuagado con agua destilada y secado previo a su utilización.
Figura 1: Esquema del proceso de digestión enzimática
Muestra
Enzima- Buffer
Enzima - Buffer
10 ml sn Enzima/Buffer
15 ml sn Enzima/Buffer
Ultrasonidos
Baño Termostatizado
Agitación | Incubación
Centrifugación
Residuo
Extracto
Filtración
Volumen final con Buffer
sin enzima
Análisis
Resultados y Discusión
Las concentraciones de arsénico halladas en los extractos enzimáticos fueron comparadas y
analizadas mediante ANOVA de un factor (p<0,05), empleando (LSD) de Fisher para la comparación
de medias haciendo uso del software estadístico SPSS Statistics 17.0.
Tabla 1: Concentraciones de arsénico y porcentaje de recuperación hallados para los diferentes métodos de
extracción aplicados en las muestras de alimentos cocidos. Resultados expresados en (μg/g) de m.s.
Método de Extracción
Mineralización por Calcinación en mufla
Baño Termostatizado-Celulasa
Baño Termostatizado-Pancreatina
Ultrasonidos-Celulasa
Ultrasonidos-Pancreatina
Total As
extractado
0,757
0,788
0,763
0,753
0,641
S.D.
C.V.
0,0306
0,0164
0,0391
0,0311
0,0268
4,0%
2,1%
5,1%
4,1%
4,2%
Recuperación
%
----104%
101%
99%
85%
Los resultados muestran que las extracciones efectuadas con baño termostatizado-enzimas
presentan un rendimiento similar, en cambio, cuando se emplea el procedimiento de agitación por
ultrasonidos, no se observa semejanza en el rendimiento obtenido con ambas enzimas (Tabla 1). La
4
enzima celulasa exhibe un mejor rendimiento extractivo, semejante al alcanzado con el método con
baño termostatizado, que no se logra con la enzima pancreatina. Considerando la concentración de
arsénico total extraída, se puede deducir que los métodos baño termostatizado-enzimas y ultrasonidoscelulasa generan niveles de extracciones satisfactorios, comparables con los alcanzados con el método
de mineralización por calcinación en mufla.
Tabla 2: Concentraciones de arsénico y porcentaje de recuperación hallados para los diferentes métodos de
extracción aplicados en MR (Brown rice CYTED105PI0272). Resultados expresados en (μg/g) de m.s.
Método de Extracción
Total As
extractado
0,492
Mineralización por Calcinación en mufla
0,492
Baño Termostatizado-Celulasa
0,501
Baño Termostatizado-Pancreatina
Ultrasonidos-Celulasa
0,492
Ultrasonidos-Pancreatina
0,471
Valor de referencia: As 0,508+0,032 (como Arsénico Total)
S.D.
C.V.
0,0156
0,0051
0,0206
0,0013
0,0037
3,2%
1,0%
4,1%
0,3%
0,8%
Recuperación
%
----100%
102%
100%
96%
La Tabla 2 muestra los resultados obtenidos para el material de referencia, observándose que
todas las recuperaciones no muestran diferencias significativas a un (p<0,05) para las pruebas T de
student y ANOVA de un factor (SPSS Statistics 17.0).
Figura 2: Recuperación % para los distintos métodos de extracción en las muestras de alimentos cocidos.
104%
99%
85%
100%
% de recuperación
101%
75%
50%
25%
0%
B-C
B-P
U-C
U-P
Tipo de extracción
En la Figura 2 se muestran las recuperaciones alcanzadas por los diferentes tratamientos
efectuados, siendo estos de 104% para Baño termostatizado-Celulasa, 101% para Baño
termostatizado-Pancreatina, 99% para Ultrasonidos-Celulasa y 85% cuando se empleó la combinación
Ultrasonidos-Pancreatina. El resultado de la aplicación del procedimiento estadístico (LSD) de Fisher,
para discriminar entre medias muestra que no existen diferencias significativas (p<0,05) entre las tres
primeras metodologías, no así la combinación Ultrasonidos-Pancreatina quién evidenció un menor
rendimiento.
Conclusiones
Para ambos procedimiento, la enzima celulasa demostró su efectividad en la extracción de AsT en
las muestras de alimentos cocidos consideradas, no siendo así para el caso de la enzima pancreatina.
Cabe destacar, que como procedimiento para la extracción de biomoléculas unidas a especies
organometálicas la digestión enzimática asistida por ultrasonidos presenta la gran ventaja de ser
simple, efectiva y reducir los tiempos de tratamiento y consumo de reactivos siempre que estén
garantizadas las condiciones de pH, temperatura, agitación y relación muestra-enzima. Si bien no se ha
5
conseguido, hasta el momento, alcanzar una buena respuesta con la enzima pancreatina, son necesarios
nuevos estudios para mejorar su efectividad.
Agradecimientos
El presente trabajo ha sido desarrollado con fondos de la SICyT de la UNCAus. PI: WINSIP
36/00005
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