Hartwig, Vanessa Graciela. 2015 09 23

Obtención de extractos secos de yerba mate con
alto contenido de polifenoles y alta capacidad
antioxidante
Hartwig, Vanessa Graciela
2015 09 23
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
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Contacto: digital@bl.fcen.uba.ar
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Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Industrias
Obtención de extractos secos de yerba mate con alto contenido de polifenoles y alta
capacidad antioxidante
Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires
en el área Química Industrial
Vanessa Graciela Hartwig
Directores de tesis:
Dra. Stella Maris Alzamora
Dr. Miguel Eduardo Schmalko
Consejero de estudios: Dra. Stella Maris Alzamora
Lugar de trabajo: Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales de la Universidad
Nacional de Misiones.
Buenos Aires, 2015
Obtención de extractos secos de yerba mate con alto contenido de polifenoles y alta
capacidad antioxidante
El objetivo de la tesis fue obtener un producto en polvo para consumo con elevada
capacidad antioxidante a partir de yerba mate. Para ello se abordaron una serie de objetivos
particulares: seleccionar y adaptar técnicas de evaluación del contenido de polifenoles y de
la capacidad antioxidante de los extractos; evaluar la influencia de la materia prima
mediante la comparación de diferentes fracciones y procedencias geográficas; y optimizar la
obtención de los extractos y su posterior secado.
El contenido de polifenoles y la capacidad antioxidante se determinaron mediante los
métodos de Folin-Ciocalteu y del radical DPPH, usando principalmente ácido clorogénico y
Trolox como estándares.
El uso de la fracción de hojas del material cosechado durante el inicio del periodo de
cosecha permitió obtener extractos con alto contenido de polifenoles y alta capacidad
antioxidante, ya que la fracción hojas posee mayor concentración de polifenoles totales que
la fracción palos.
En cuanto a las soluciones extractivas, tanto el agua como soluciones acuosas binarias de
metanol y de etanol mostraron ser eficaces en la extracción de dichos compuestos fenólicos,
lográndose extracciones cercanas al 55 % del valor máximo posible.
La pérdida de polifenoles durante el secado spray usando maltodextrinas como agentes de
secado fue despreciable, sugiriéndose que los compuestos que contribuyen al valor del
contenido de polifenoles del producto en polvo son muy estables a las temperaturas
ensayadas, o sus posibles productos de hidrólisis durante el proceso de secado mantienen su
capacidad antioxidante.
Los resultados confirman la potencialidad del mate soluble como un alimento funcional.
Palabras Claves: yerba mate; antioxidantes; extracción; mate soluble; Illex paraguariensis
Production of dried yerba mate extracts with high polyphenol content and
antioxidant capacity
This thesis was aimed to obtain a powder for human consumption with high
antioxidant capacity from yerba mate. Specific objectives included the selection and
adaptation of techniques to measure phenol content and antioxidant capacity of the
extracts; choosing the more adequate raw material by comparing different fractions
and geographical origins; and finally optimizing the extraction and drying conditions.
Total polyphenol content and antioxidant capacity were measured by Folin-Ciocalteu
method and DPPH assay respectively, using mainly chlorogenic acid and Trolox as
standards.
The use of leaf fraction harvested during the early harvest was found to be the most
convenient for obtaining yerba mate extracts rich in polyphenols with high antioxidant
capacity, due to the higher polyphenol content of this fraction compared with the stick
one.
Water and aqueous binary solutions of methanol and ethanol were found to be suitable
for extraction of total polyphenols, reaching around 55% of the maximum value
possible to achieve.
Loss of polyphenolic compounds during spray-drying was negligible, suggesting that
polyphenols compounds present in maté extracts were stable during spray drying or
their hydrolysis products were still reactive to the Folin–Ciocalteu reagent.
These results confirmed the potentiality of the soluble mate as a functional food.
Keywords: yerba mate; antioxidants; extraction, soluble mate; Illexparaguariensis
Agradecimientos
A mis directores de tesis Stella Alzamora y Miguel Schmalko y al doctor Luis
Brumovsky por la oportunidad brindada, por su dedicación y conocimiento, por su
constante apoyo, colaboración y comprensión; sin los cuales no hubiese sido posible el
trabajo.
Al Instituto Nacional de la Yerba Mate por la financiación parcial de este trabajo de
investigación, a la fundación DINCYT y al Laboratorio de Yerba Mate de la Universidad
Nacional de Misiones por el uso de sus equipos e instalaciones.
A los integrantes del laboratorio: Paola, Raquel, Gustavo, Hernán y Nicolás. por su
colaboración en los análisis de laboratorio.
Y a mi familia por su incesante apoyo, tolerancia y contención.
Vanessa
INDICE
SECCION I .......................................................................................................................................... 7
OBJETIVOS Y JUSTIFICACIÓN.................................................................................................... 7
CAPITULO 1 ....................................................................................................................................... 8
1.1.
Objetivo general ........................................................................................................................ 9
1.2.
Objetivos específicos................................................................................................................. 9
1.3.
Organización de la tesis............................................................................................................. 9
SECCION II....................................................................................................................................... 11
INTRODUCCIÓN............................................................................................................................. 11
CAPITULO 2 ..................................................................................................................................... 12
2.1.
Descripción de la planta .......................................................................................................... 13
2.2.
Cosecha y procesamiento ........................................................................................................ 13
2.2.1.
Cosecha ........................................................................................................................... 13
2.2.2.
Procesamiento ................................................................................................................. 14
2.2.3.
Escaldado o “zapecado” ................................................................................................. 14
2.2.4.
Secado ............................................................................................................................. 16
2.2.5.
Canchado ......................................................................................................................... 16
2.2.6.
Estacionamiento .............................................................................................................. 16
2.2.7.
Molienda.......................................................................................................................... 17
2.2.8.
Envasado ......................................................................................................................... 17
2.3.
Tipos de producto y normativa vigente ................................................................................... 17
2.4.
Formas de consumo ................................................................................................................. 20
2.4.1.
Principales formas de consumo ....................................................................................... 20
2.4.2.
Otros usos ........................................................................................................................ 21
2.5.
Composición nutricional de la yerba mate .............................................................................. 22
CAPITULO 3 ..................................................................................................................................... 25
3.1.
Definición de términos generales ............................................................................................ 26
3.2.
Antioxidantes y salud ............................................................................................................. 26
3.2.1.
Antioxidantes y patologías asociadas .............................................................................. 26
3.2.2.
Mecanismos internos contra la acción de los radicales libres ......................................... 28
3.2.3.
Principal sistema enzimático de defensa antioxidante .................................................... 30
3.2.3.1.
3.3.
Antioxidantes no enzimáticos ....................................................................................32
Antioxidantes y reacciones de oxidación en alimentos ........................................................... 32
3.3.1.
Tipos de deterioro en lípidos ........................................................................................... 33
3.3.2.
Oxidación lipídica por lipoxidasas .................................................................................. 36
3.3.3.
Oxidación lipídica fotosensibilizada ............................................................................... 37
1
3.3.4.
Pro-oxidantes en sistemas lipídicos ................................................................................. 38
3.3.5.
Efectos de la oxidación de lípidos en el alimento ........................................................... 38
3.3.5.1.
Sabores oxidados ........................................................................................................38
3.3.5.2.
Pérdidas de vitaminas liposolubles y pigmentos ........................................................39
3.3.5.3.
Efecto sobre las proteínas ...........................................................................................39
3.3.6.
Estrategias de control y retardo de la oxidación .............................................................. 40
3.3.6.1.
Concentración de oxígeno y oxidación de lípidos ......................................................41
3.3.6.2.
Actividad acuosa y oxidación de lípidos ....................................................................42
3.3.6.3.
Temperatura y oxidación de lípidos ...........................................................................43
3.3.6.4.
Aditivos antioxidantes y oxidación de lípidos............................................................43
3.3.7.
Clasificación de antioxidantes alimenticios .................................................................... 44
3.3.8.
Sinergismo entre antioxidantes ....................................................................................... 45
3.3.9.
Sustancias potenciadoras de antioxidantes/agentes quelantes ......................................... 47
3.3.10.
Antioxidantes sintéticos .................................................................................................. 48
3.3.11.
Antioxidantes naturales ................................................................................................... 49
3.4.
Breve descripción de algunos antioxidantes naturales ............................................................ 50
3.4.1.
Tocoferoles (vitamina E) ................................................................................................. 50
3.4.2.
Carotenoides .................................................................................................................... 53
3.4.3.
Ascorbato ........................................................................................................................ 56
3.4.4.
Antioxidantes fenólicos ................................................................................................... 57
3.4.4.1.
3.5.
Clasificación general de compuestos fenólicos ........................................................... 58
Polifenoles en yerba mate........................................................................................................ 65
SECCION III ..................................................................................................................................... 67
DESARROLLO ................................................................................................................................. 67
CAPITULO 4 ..................................................................................................................................... 68
4.1.
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 69
4.1.1.
Complejidad en la estandarización de una metodología universal .................................. 69
4.1.2.
Mecanismos de reacción de los antioxidantes ................................................................. 69
4.1.3.
Pruebas químicas in vitro de medida de la actividad antioxidante en sistemas
alimenticios ..................................................................................................................................... 71
4.1.3.1.
Métodos basados en mecanismos de transferencia de átomos de hidrógeno .............72
4.1.3.2.
Métodos basados en mecanismos de transferencia de electrones...............................76
4.1.3.3.
Métodos basados en mecanismos HAT y SET...........................................................78
4.1.4.
4.2.
Objetivos ......................................................................................................................... 82
MATERIALES Y METODOS .............................................................................................. 83
4.2.1.
Adaptación del método de Folin-Ciocalteu (FC) ............................................................ 83
4.2.1.1.
Materia prima .............................................................................................................83
2
4.2.1.2.
Reactivos ....................................................................................................................83
4.2.1.3.
Equipos .......................................................................................................................83
4.2.1.4.
Determinación de humedad ........................................................................................83
4.2.1.5.
Preparación del material de vidrio..............................................................................83
4.2.1.6.
Preparación de soluciones y patrones .........................................................................84
4.2.1.7.
Obtención de los extractos y diluciones .....................................................................84
4.2.1.8.
Determinación de polifenoles totales .........................................................................85
4.2.1.9.
Estabilidad del acido clorogénico como patrón estándar ...........................................85
4.2.2.
4.3.
Adaptación del método de DPPH .................................................................................... 86
4.2.2.1.
Materia prima .............................................................................................................86
4.2.2.2.
Reactivos ....................................................................................................................86
4.2.2.3.
Equipos .......................................................................................................................86
4.2.2.4.
Determinación de humedad ........................................................................................86
4.2.2.5.
Preparación del material de vidrio..............................................................................86
4.2.2.6.
Preparación de soluciones y patrones .........................................................................86
4.2.2.7.
Obtención de los extractos y diluciones .....................................................................87
4.2.2.8.
Determinación de polifenoles totales .........................................................................87
4.2.2.9.
Elección de la longitud de onda para el ensayo ..........................................................87
4.2.2.10.
Determinación del perfil de absorbancia ....................................................................88
4.2.2.11.
Determinación de la capacidad antioxidante ..............................................................88
4.2.2.12.
Efecto de la temperatura de incubación en la reacción del DPPH .............................88
4.2.2.13.
Evaluación de repetibilidad y reproducibilidad ..........................................................89
4.2.2.14.
Análisis estadístico .....................................................................................................89
RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................................. 89
4.3.1.
Adaptación del método de Folin Ciocalteu ..................................................................... 89
4.3.2.
Adaptación del ensayo de reducción del radical DPPH .................................................. 91
4.4.
CONCLUSIONES DEL CAPITULO ..................................................................................... 98
CAPITULO 5 ................................................................................................................................... 100
5.1.
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 101
5.1.1.
Estudios sobre composición fisicoquímica y manejo agronómico de yerba mate ........ 101
5.1.2.
Cosecha y procesamiento de yerba mate ....................................................................... 102
5.1.3.
Estudios sobre composición fisicoquímica y procesamiento ....................................... 105
5.1.4.
Objetivos y justificación ................................................................................................ 108
5.2.
MATERIALES Y METODOS ............................................................................................. 108
5.2.1.
Selección de las zonas productoras y de los establecimientos yerbateros ..................... 108
3
5.2.2.
Materia prima ................................................................................................................ 109
5.2.3.
Reactivos ....................................................................................................................... 110
5.2.4.
Equipos .......................................................................................................................... 110
5.2.5.
Determinación de humedad ........................................................................................... 110
5.2.6.
Preparación del material de vidrio................................................................................. 111
5.2.7.
Preparación de soluciones y patrones ............................................................................ 111
5.2.8.
Obtención de los extractos y diluciones ........................................................................ 111
5.2.9.
Determinación de polifenoles totales ............................................................................ 111
5.2.10.
Determinación de la capacidad antioxidante ................................................................. 111
5.2.11.
Análisis estadístico ........................................................................................................ 112
5.3.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................... 112
5.4.
CONCLUSIONES DEL CAPITULO ................................................................................... 118
CAPITULO 6 ................................................................................................................................... 119
6.1.
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 120
6.1.1.
Extracción de compuestos fenólicos ............................................................................. 120
6.1.2.
Extracción de polifenoles a partir de yerba mate .......................................................... 121
6.1.3.
Objetivos y justificación ................................................................................................ 122
6.2.
MATERIALES Y METODOS ............................................................................................. 123
6.2.1.
Materia prima ................................................................................................................ 123
6.2.2.
Reactivos ....................................................................................................................... 123
6.2.3.
Equipos .......................................................................................................................... 124
6.2.4.
Determinación de humedad ........................................................................................... 124
6.2.5.
Preparación del material de vidrio................................................................................. 124
6.2.6.
Preparación de soluciones y patrones ............................................................................ 124
6.2.7.
Planeamiento factorial y análisis de datos ..................................................................... 124
6.2.8.
Extracciones adicionales ............................................................................................... 126
6.2.9.
Obtención de los extractos y diluciones ........................................................................ 126
6.2.10.
Modelado de la extracción acuosa................................................................................. 128
6.2.11.
Determinación del contenido de polifenoles totales ..................................................... 129
6.2.12.
Determinación de la capacidad antioxidante ................................................................. 129
6.2.13.
Determinación del contenido de cafeína ....................................................................... 129
6.2.14.
Análisis estadístico ........................................................................................................ 130
6.3.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................... 130
6.3.1.
Experiencias preliminares y modelado de la extracción acuosa.................................... 130
6.3.2.
Análisis de correlación .................................................................................................. 133
6.3.3.
Análisis de superficies de respuesta .............................................................................. 134
6.3.4.
Extracciones adicionales ............................................................................................... 142
6.4.
CONCLUSIONES DEL CAPITULO ................................................................................... 144
4
CAPITULO 7 ................................................................................................................................... 145
7.1.
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 146
7.1.1.
Alimentos funcionales ................................................................................................... 146
7.1.2.
Extractos en polvo ......................................................................................................... 150
7.1.3.
Secado spray .................................................................................................................. 151
7.1.4.
Actividad acuosa, isotermas de adsorción, y temperatura de transición vítrea - Conceptos
y aplicaciones. ............................................................................................................................... 152
7.1.5.
7.2.
Objetivos ....................................................................................................................... 154
MATERIALES Y METODOS ............................................................................................. 155
7.2.1.
Materia prima ................................................................................................................ 155
7.2.2.
Reactivos ....................................................................................................................... 155
7.2.3.
Equipos .......................................................................................................................... 155
7.2.4.
Preparación del material de vidrio................................................................................. 156
7.2.5.
Preparación de soluciones y patrones ............................................................................ 156
7.2.6.
Preparación de las muestras y condiciones de secado ................................................... 156
7.2.7.
Planeamiento factorial y análisis de datos ..................................................................... 156
7.2.8.
Diluciones...................................................................................................................... 157
7.2.9.
Determinación de polifenoles totales ............................................................................ 158
7.2.10.
Determinación de la capacidad antioxidante ................................................................. 158
7.2.11.
Determinaciones analíticas del jarabe ........................................................................... 159
7.2.11.1.
7.2.12.
Determinaciones analíticas de los polvos ...................................................................... 159
7.2.12.1.
Determinación de humedad ......................................................................................159
7.2.12.2.
Densidad ...................................................................................................................159
7.2.12.3.
Solubilidad en agua ..................................................................................................159
7.2.12.4.
Actividad acuosa ......................................................................................................160
7.2.12.5.
Color .........................................................................................................................160
7.2.12.6.
Cinética de adsorción e higroscopicidad ..................................................................160
7.2.12.7.
Isotermas de adsorción .............................................................................................161
7.2.12.8.
Temperatura de transición vítrea ..............................................................................162
7.2.13.
7.3.
Sólidos solubles ........................................................................................................159
Análisis estadístico ........................................................................................................ 163
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................... 163
7.3.1.
Propiedades antioxidantes y solubilidad ....................................................................... 163
7.3.2.
Contenido de humedad .................................................................................................. 170
7.3.3.
Densidad ........................................................................................................................ 171
7.3.4.
Color .............................................................................................................................. 172
7.3.5.
Cinética de adsorción e higroscopicidad ....................................................................... 176
5
7.3.6.
Isotermas de adsorción .................................................................................................. 179
7.3.7.
Temperatura de transición vítrea ................................................................................... 184
7.3.8.
Discusión de criterios de estabilidad ............................................................................. 187
7.4.
CONCLUSIONES DEL CAPITULO ................................................................................... 193
SECCION IV ................................................................................................................................... 195
CONCLUSIONES FINALES......................................................................................................... 196
SECCION V ..................................................................................................................................... 200
REFERENCIAS .............................................................................................................................. 201
6
SECCION I
OBJETIVOS Y JUSTIFICACIÓN
7
CAPITULO 1
“Objetivos y organización de la tesis”
8
1.1. Objetivo general
El objetivo del presente trabajo fue obtener un producto en polvo para consumo con
elevada capacidad antioxidante a partir de yerba mate.
Para cumplir estos objetivos generales fue necesario abordar una serie de objetivos
particulares que se mencionan a continuación.
1.2. Objetivos específicos
•
Adaptar la técnica de evaluación del contenido de polifenoles totales (CPT)
para extractos de yerba mate.
•
Proponer una metodología para estandarizar la determinación de capacidad
antioxidante (CAO) en extractos de yerba mate.
•
Evaluar los efectos del origen, tipo de procesamiento y época de cosecha
sobre el CPT y la CAO de la yerba mate canchada.
•
Optimizar la extracción de polifenoles totales (PT) a partir de yerba mate.
•
Optimizar el secado por aspersión de extractos de yerba maximizando el CPT
y su CAO.
•
Caracterizar los polvos obtenidos mediante la evaluación de la densidad bruta,
el contenido de humedad, la actividad acuosa, la cinética de adsorción e higroscopicidad, el
color y la temperatura de transición vítrea.
1.3. Organización de la tesis
El desarrollo de la tesis se expone en seis secciones y a su vez cada sección incluye
capítulos independientes para cumplir cada uno de los objetivos particulares. La sección I
comprende al capítulo 1 y en el se presentan los objetivos y la justificación del presente
trabajo. La sección II se refiere a capítulos introductorios a la temática del trabajo; incluye
dos capítulos, el primero introduce en forma general al lector en temas relacionados
exclusivamente a la yerba mate como su procesamiento, formas de consumo y valor
nutricional; el segundo introduce en forma general al lector en temas relacionados a los
9
antioxidantes y su importancia. La sección III comprende el desarrollo del trabajo, consta de
cuatro capítulos dependientes que incluyen introducción, materiales y métodos, resultados y
discusión y conclusiones: el capítulo 4 expone la puesta a punto de las técnicas analíticas de
CPT y CAO; el capítulo 5 expone las comparación de CPT y CAO de diferentes fracciones
y procedencias geográficas; el capítulo 6 expone la optimización de la extracción de
polifenoles y finalmente el capítulo 7 expone la optimización del secado y la caracterización
de los polvos obtenidos. La sección IV comprende las conclusiones generales del trabajo. En
la sección V se presentan las referencias bibliográficas. Finalmente se adjunta un archivo en
formato digital en el cual se presentan los anexos donde pueden constatarse los datos
experimentales y los análisis estadísticos.
10
SECCION II
INTRODUCCIÓN
11
CAPITULO 2
“Yerba Mate”
12
2.1. Descripción de la planta
La planta pertenece a la especie Ilex paraguariensis Saint Hilaire y vulgarmente es
denominada “yerba mate”. Es un árbol de porte erecto y copa redondeada, con follaje
persistente compuesto por hojas gruesas y coriáceas, y pertenece a la familia botánica de
las Aquifoliaceas. En su hábitat natural puede alcanzar un desarrollo de hasta 20 metros de
altura, aunque bajo cultivo se realizan podas para que su porte arbustivo sea de 3-6 m de
altura a fin de facilitar la cosecha. Las flores son pequeñas, tetrámeras, dioicas,
blanquecinas, dispuestas en cimas auxiliares muy cortas. El fruto es carnoso, globoso, de
5-7 cm de diámetro y color pardusco (Parra, 2005). Florece en primavera y fructifica en
verano. Es nativa de las regiones subtropicales de Argentina (región noreste), Brasil
(región sur) y Paraguay (región oriental); su área de distribución natural está delimitada
por la costa atlántica de Brasil por el este y por el río Paraguay al oeste, entre los 21 y 30 °
de latitud sur y entre 48° 38´ y 56° 10´de longitud oeste, abarcando un área total de 540
mil km2 (Da Croce, 2002).
2.2. Cosecha y procesamiento
2.2.1.
Cosecha
La entrada en producción del yerbal ocurre entre el 4° y 6° año de la implantación,
alcanzando su máximo rendimiento entre el 8° y 10° año, con un período productivo entre
25 y 30 años, llegando en algunos casos a los 60 años, dependiendo del cuidado del suelo.
La cosecha “o tarefa” se realiza anualmente extendiéndose desde enero hasta octubre
pero el período más adecuado comprende los meses de abril-octubre (Parra, 2005).
Durante este período la planta disminuye la circulación de su sabia y cuenta con mayor
porcentaje de hojas maduras y además se evitan las épocas de florescencia, brotación o
fructificación. Se realiza en forma manual con tijeras o serruchos, retirando alrededor del
75% del follaje maduro. Durante la cosecha, el material recolectado se deposita sobre
paños de arpillera, que con sus cuatro extremos ligados forman un atado los cuales son
pesados in situ y transportados a las playas de recepción en tractores y/o camiones, con un
tiempo entre cosecha e ingreso al procesamiento inferior a las 12 h.
13
2.2.2.
Procesamiento
Su procesamiento comprende cinco etapas: 1) Zapecado o Escaldado; 2) Secado; 3)
Molienda Gruesa o Canchado; 4) Estacionamiento y 5) Molienda Fina, Tipificación y
Envasado. Las tres primeras etapas se llevan a cabo en establecimientos denominados
“secaderos” y la quinta etapa en establecimientos industriales denominados “molinos”. El
estacionamiento se realiza indistintamente en los secaderos o en los molinos. En general, los
molinos procesan yerba mate proveniente de diferentes secaderos, ya sean propios o de otras
empresas. En Brasil, el procesamiento de la yerba mate no incluye la etapa de
estacionamiento.
2.2.3.
Escaldado o “zapecado”
Esta operación consiste en exponer durante 20 o 30 segundos las ramas a la acción
directa de llamas y luego a gases de combustión provenientes del quemado de leña (y en
algunos casos chips de madera) por 2-3 minutos, lo que genera vapor de agua en el
parénquima foliar, formándose así pequeñas ampollas que rompen la epidermis de las hojas,
además se inactivan las enzimas responsables de los procesos biológicos de degradación.
Esto
impide la oxidación enzimática de ciertas sustancias contenidas en la hoja por
inactivación de enzimas (peroxidasa y polifenoloxidasa), asegurando la conservación de su
color verde. En esta etapa la yerba mate adquiere su aroma característico (Parra, 2005) y se
produce una pérdida importante de humedad de las hojas de tal forma que cuando las
mismas se disponen en el lecho de secado, éste tenga una porosidad alta para facilitar el flujo
del gas de secado; además se logra una disminución de la carga microbiológica y la
pérdida de probables residuos de agroquímicos (por ejemplo cipermetria y dimetoato)
(Escalada, 1999; Schmalko, 2005), como así también, parte de algunos compuestos como la
vitamina C, la cafeína y la clorofila (Bertoni et al., 1991, 1992, 1993; Ramallo et al., 1998b;
Schmalko y Alzamora, 2001). Debe realizarse dentro de las 24 h de efectuada la cosecha.
Esta operación se lleva a cabo en un equipo similar a un secadero rotatorio. El equipo
consiste en un cilindro metálico con pequeñas perforaciones que gira por medio de un
engranaje a bajas revoluciones (unas 10 rpm). Las ramas se introducen en el extremo del
cilindro en que se produce el quemado de la leña (o de chips de madera), recibiendo de la
misma calor por radiación de la llama y convección. Luego, el aire y las ramas se desplazan
hacia el extremo opuesto en corrientes paralelas. El desplazamiento del sólido es producido
14
por a) una serie de aletas dispuestas en forma discontinua y con una ligera inclinación para
favorecer el desplazamiento y b) por el arrastre de los gases de combustión (Esmelindro et
al., 2002; Schmalko, 2005) (Figura 2.1).
El flujo de los gases de combustión es producido por una chimenea ubicada en el
extremo de salida y es regulado por un deflector ubicado en su interior. De acuerdo con
Esmelindro et al. (2002), la temperatura media del aire al ingreso al zapecador ronda los 400
°C y a la salida 120 °C.
Figura 2.1. Diagrama general de un zapecador
Núñez y Känzig (1995) realizaron un relevamiento de las condiciones de operación
de zapecadores en 6 establecimientos, encontrando las siguientes dimensiones y condiciones
de trabajo: longitud: 6,5-7,5 m; diámetro: 1,6-2,5 m; tiempo de residencia: 2-4 min;
contenido de humedad de salida: 29-34 % (base húmeda); capacidad de procesamiento:
1.500-3.000 kg de hoja verde/h.
Cabe mencionar que el contenido de humedad de las ramas a la entrada es de
aproximadamente un 60 % (base húmeda).
Se debe destacar la gran uniformidad de diseño y operación de los zapecadores que
existen en los diferentes establecimientos industriales.
El control que se realiza en los zapecadores es bastante deficiente y se basa en la
experiencia de los operarios, ya sea en la alimentación de la leña o el material, la que en la
mayoría de los establecimientos es cargada con horquillas sobre una cinta transportadora que
a su vez alimenta el zapecador. En algunos establecimientos, se mide la temperatura de
salida de los gases y ésta y la velocidad de los gases son reguladas con la apertura o cierre de
un deflector localizado en la chimenea. Un operario con experiencia controla, en forma
manual, que las ramas a la salida tengan el tratamiento adecuado, es decir, que las hojas no
estén quemadas (excesivo tratamiento) ni tengan una excesiva humedad que produciría
15
inconvenientes en la etapa de secado (en la industria se denomina a ésta “yerba cruda” y es
consecuencia de un tratamiento térmico defectuoso) (Schmalko, 2005).
2.2.4.
Secado
Dentro de las 24 horas siguientes al zapecado, el material zapecado debe ser sometido
a un proceso de secado para reducir su contenido en humedad, hasta un valor entre 3-6 %
(Parra, 2005). En Argentina actualmente se utilizan tres tipos de secado: barbacuá (lecho de
ramas en contacto directo durante 9 y 24 h con gases de combustión de leña alcanzando
temperaturas entre 60 y 90 °C); cinta (lecho móvil de baja velocidad en contacto con aire
caliente y gases de combustión de leña, durante 2-5 h, temperaturas entre 80 y 130 ºC);
rotatorio o tubular (tambores rotatorios, en algunos modelos las ramas no toman contacto
directo con los gases de combustión sino únicamente con aire caliente (secaderos
neumáticos) con tiempos de residencia entre 10-20 min y temperaturas superiores a 200 ºC).
En el capítulo 5 se presenta una descripción más profunda y detallada de los tipos de secado.
2.2.5.
Canchado
Consiste en un proceso de molienda gruesa para disminuir el volumen de la hoja (lo
cual facilita su embolsado y transporte) y para aumentar la superficie expuesta al contacto
con la atmósfera y la humedad ambiente (lo cual favorece el inicio de reacciones que se
ocurren durante el estacionamiento) (Gómez Vara et al., 1979). En general, la relación
volumen de hoja verde: volumen de yerba mate canchada es de 3:1 (Parra, 2005). Los
rendimientos industriales después de este proceso, varían entre 34 y 38 g peso seco/peso
verde) en yerbas cosechadas al final del invierno.
2.2.6.
Estacionamiento
Tras el canchado, la yerba se coloca en bolsas de arpillera de 40-50 kg y entra en un
período de estacionamiento que puede ser natural o acelerado a fin de que el producto
adquiera las características de sabor, aroma y color requeridas por los consumidores.
En el estacionamiento natural, la yerba canchada se mantiene almacenada en depósitos
cerrados por un lapso que oscila entre 6 y 24 meses; durante ese tiempo, se controla la
evolución del producto y se ventila el depósito, a través de la apertura de puertas y ventanas
en días secos y soleados. En el estacionamiento acelerado la yerba canchada se mantiene
16
almacenada por un período de 30 a 60 días en depósitos cerrados especialmente
acondicionados, donde se regula la temperatura, la humedad y la circulación interna del aire.
2.2.7.
Molienda
Una vez canchada y estacionada, la yerba pasa a la etapa de molienda. Esta comprende
sucesivas operaciones de trituración, zarandeo y mezcla, que arrojan como resultado final la
yerba mate adecuada al gusto de diferentes regiones y grupos de consumidores.
La materia prima se coloca sobre cintas transportadoras que la conducen hacia una
zaranda circular de alambre, conocida como "zaranda de limpieza", que elimina posibles
cuerpos extraños, palos y ramas excesivamente gruesas. El proceso continúa con un
zarandeo primario de clasificación que separa las hojas muy grandes y el palo.
Estas hojas se someten a una trituración más o menos intensa en un molino o bien en el
"trapiche" (tanque de hierro en el que giran dos pesados rodillos de hierro, de forma cónica
truncada y superficie estriada) y luego son zarandeadas nuevamente. En este punto se
utilizan zarandas vibradoras que permiten obtener distintos productos según su grado de
trituración, que se almacenan en silos.
Concluida la clasificación se puede proceder a una mezcla con "palos" (cortados
previamente en trozos uniformes mediante un “corta palos"), en distintas proporciones,
según características deseadas de acuerdo a calidad, origen y sabor, entre otras. Del proceso
y de la granulometría de la mezcla depende el sabor que diferencia las distintas yerbas.
(Kotik, 1994)
2.2.8.
Envasado
Para preservar las características organolépticas de la yerba mate, los envases cuentan
con varias capas de diversos materiales. Las presentaciones más usuales son de medio y de
un kilogramo, aunque también se comercializan envases de un cuarto y de dos kilogramos
(Parra, 2005).
2.3. Tipos de producto y normativa vigente
El 75 % del total de la yerba mate que egresa de la zona productora (74 % molida y
envasada y 1 % en saquitos) lo hace en su último proceso de industrialización. El 25 %
17
restante está integrado por yerba mate canchada (12 %) y molida a granel (13 %), con
destino a sucesivos procesos de elaboración y fraccionamiento.
La yerba mate debe cumplir con las siguientes normativas obligatorias vigentes:
•
Dadas por el Código Alimentario Argentino
La normativa específica vigente para la yerba mate se halla en los Artículos 1193 al
1198 del Código Alimentario Argentino (2008); los mismos definen los siguientes
productos:
a- yerba mate canchada: es la yerba mate zapecada, secada y groseramente triturada.
Constituye la materia prima de los molinos.
b- yerba mate elaborada: es la yerba mate canchada que ha sido sometida a los
procesos de zarandeo, trituración, molienda y estacionamiento.
b1- yerba mate elaborada o yerba mate elaborada con palos: es la yerba mate
elaborada que contiene más de 65 % de hojas y menos del 35 % de palos. Debe además
cumplir ciertos requisitos de tamizado.
b2- yerba mate elaborada despalada o despalillada: es la yerba mate elaborada que
contiene más de 90 % de hojas y menos del 10 % de palos. Debe además cumplir ciertos
requisitos de tamizado.
c- yerba mate tostada: es la yerba mate elaborada sometida posteriormente a un
proceso de tostación.
d- yerba mate soluble ( o
mate instantáneo, extracto de mate en polvo,
concentrado de mate): es el producto en polvo resultante de la deshidratación de los
extractos acuosos de yerba mate canchada despalada.
e-yerba mate compuesta o yerba mate aromatizada: es la yerba mate elaborada
(con palos o despalillada) adicionada de una o varias hierbas sápido-aromáticas de
reconocida inocuidad fisiológica en la forma habitual de su uso (cedrón, menta, tomillo,
etc.). Estas hierbas pueden adicionarse hasta en un 40 %.
18
Además de los límites impuestos al porcentaje máximo de palos, las características que
deben reunir los productos están mencionadas en los artículos 1195 y 1198 (Tabla 2.1).
•
Dada por la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca de la Nación; en la
Resolución 20/95 (1995); referida al contenido máximo de plaguicidas (Tabla 2.2).
•
Existen también otras normas de aplicación referidas a la higiene y seguridad
de los establecimientos industriales, rotulado, tipo de envases, etc.
Tabla 2.1 Características exigidas por el CAA
Productos
Componente
yerba mate
elaborada
yerba mate
soluble
yerba mate
compuesta
Max. 9,5 %
Humedad (100-105 °C)
Max. 9,5 %
Max. 7,5 %
Cenizas totales (500-550 °C),
método de la AOAC (sobre producto
seco)
Cenizas
insolubles
en
ácido
clorhídrico al 10 % p/v, método de la
AOAC (sobre producto seco)
Cafeína, método de Cortés (sobre
producto seco)
Extracto Acuoso, método de la
AOAC (sobre producto seco)
Sustancias vegetales extrañas
Max. 9,0 %
Max. 9,0 %
Max. 1,5 %
--------------
Max. 2,0 %
Min. 0,6 %
--------------
--------------
Min. 25 %
--------------
--------------
Max. 1,0 %
--------------
--------------
Semillas de yerba mate
Max. 1,0 %
--------------
--------------
Nitrógeno total
--------------
Max. 3,0 %
--------------
Hidratos de carbono totales (como
glucosa)
Bases purínicas totales, método de
Bailey-Andrew
Alcalinidad de las cenizas (en ml de
ácido /g de cenizas
pH de una solución al 2% p/v en
agua destilada
Observaciones
--------------
18-24 %
--------------
--------------
Min. 2,5 %
--------------
--------------
25-30
--------------
--------------
5,0-6,0
--------------
No deberá
estar ardida,
agotada o
alterada
Se prohíbe el -------------agregado de
hidratos de
carbono y
aromatizantes
artificiales
--------------
19
También se dispone de normativas de aplicación voluntaria referidas a la calidad de la
yerba mate, elaboradas por el Instituto Argentino de Normalización y Certificación (IRAM).
Estas normas se caracterizan por ser voluntarias. Las empresas adheridas deben pagar un
canon para ser controladas (generalmente el control es realizado por el INTA) y como
contrapartida incluyen en su producto el sello de IRAM de certificación de calidad.
Actualmente existen más de 25 normas aprobadas o en estudio. Estas normas tratan
cuestiones relacionadas a las definiciones sobre los diferentes tipos de yerba mate, análisis
físico-químicos, de muestreo, preparación de muestra y buenas prácticas de manufactura.
Tabla 2.2 Contenido máximo de plaguicidas
Producto
Nivel de tolerancia (mg/kg sólido seco)
Oxifluorfen
0,01
Paraquat
0,1
Tiometon
0,1
Dimetoato
0,5
Glifosato
0,5
Mirex
0,01
2.4. Formas de consumo
2.4.1.
Principales formas de consumo
La yerba mate se consume en un 99 % como infusión. El término infusión abarca cinco
formas de consumo: el mate caliente (o simplemente mate), mate frío (o tereré) y en tazas en
forma similar al té (mate cocido o en saquitos; y mate soluble) (Schmalko, 2005).
Mate: Cuando se consume en forma de mate, entre 20 y 100 g de yerba “elaborada” y
en menor medida la denominada “yerba mate compuesta” con otras hierbas es colocada en
un recipiente “o mate” sobre el cual se vierten porciones de agua (aprox. 25 mL; entre 65-90
°C) que son succionadas con una bombilla metálica.
Los recipientes utilizados varían mucho según la región. El recipiente tradicional es
una calabaza; pero también se utilizan vasos de vidrio, tazas de cerámica, metal, etc. El agua
caliente es generalmente mantenida en termos durante el consumo del mate. La norma
IRAM 20540-1 (1997) normalizó la degustación de yerba mate a ser utilizada en las
20
transacciones comerciales. Esta norma sugiere la utilización de un recipiente de vidrio con
50 g de yerba mate con una bombilla lisa de acero inoxidable y agua a 70 °C.
Mate frío: El mate frío “o tereré” se consume generalmente en el verano y en algunas
zonas cálidas durante todo el año. La forma de preparar es similar a la del mate; pero se
utiliza agua fría, jugos o bebidas carbonatadas (5-10 °C). En algunas regiones de Argentina y
Paraguay es muy común adicionar hierbas (por ejemplo menta o cedrón) por considerárselas
refrescantes.
Yerba Mate en saquitos: La yerba mate en saquitos se consume en tazas en una forma
similar al té. Los saquitos contienen 3 g de yerba mate y están contenidos en una bolsita de
papel de filtro tissue, ensobrados con papel común. La bebida se prepara con
aproximadamente 250 mL de agua caliente (aprox. 95°C).
Mate cocido: El mate cocido es preparado en forma similar al caso anterior; pero en
este caso la yerba mate elaborada es vertida sobre el agua caliente, se mantiene en el
recipiente hasta ebullición y después es filtrada. En algunos casos, la infusión es saborizada
con cáscara de naranja o azúcar quemada.
Mate soluble: o “yerba mate soluble” es el polvo resultante de la deshidratación de los
extractos acuosos obtenidos exclusivamente de la yerba mate. Es preparado en forma similar
al café instantáneo. También se le conoce con el nombre de mate instantáneo, extracto de
mate en polvo, concentrado de mate, o yerba mate soluble en forma sólida. Su elaboración se
resume en cuatro etapas: extracción de los solubles, concentrado por evaporación, secado por
atomización y envasado.
El consumo per capita en Argentina y Uruguay ronda los 5-7 kg/año de yerba mate
lista para consumir mientras que en Brasil alcanza a 1,2 kg/año (Pagliosa et al., 2010).
2.4.2.
Otros usos
Concientes de la dificultad que representa que los compradores de otros países
consuman la Ilex paraguariensis a través del mate y la bombilla, los exportadores locales
avanzaron en el desarrollo de diferentes productos elaborados en base al producto. La yerba
mate se utiliza en la elaboración de bebidas energizantes, gaseosas, aguas saborizadas,
preparados de leche, y hierbas exóticas; como saborizante de cervezas amargas, té helado,
21
chocolates, barritas de cereales y helados. En general para bebidas se elabora un concentrado
partiendo de yerba mate canchada (estacionada o verde) que se utiliza como base o como
ingrediente en la elaboración de bebidas. A partir de éste concentrado se elaboran bebidas
refrigerantes, carbonatadas y licores. También se la destina para productos cosméticos
(elaboración de jabones, perfumes, cremas, entre otros productos) (De Paula y Chociai,
2000). Las hojas de la yerba mate podrían ser utilizadas para la obtención de clorofila y
cafeína. Esta propuesta se debe al elevado contenido de clorofilas (6 mg/100 g sólido seco) y
cafeína (1,6 g/100 g sólido seco), pero hasta el presente no se tiene conocimiento que se haya
realizado un estudio técnico-económico de este proceso. Maccari y Rodriquez Pinto (2000)
mencionan la aplicación de la yerba mate en productos de higiene y tratamiento de residuos
aprovechando su contenido de saponinas. Se están realizando estudios a escala piloto para
este uso, ya que las saponinas normalmente utilizadas son obtenidas de otras fuentes (por
ejemplo semillas de té).
2.5. Composición nutricional de la yerba mate
En algunos sectores de la población, la yerba mate es uno de los principales productos
alimenticios. Su aporte de nutrientes puede ser importante debido a su forma particular de
consumo, el mate, en el que se utiliza una porción relativamente grande (aproximadamente
50 g de material sólido).
Respecto al contenido de nutrientes en la yerba mate, se pueden citar tres trabajos
realizados en los últimos tiempos: el primer trabajo se realizó sobre el producto seco y
comprendía el análisis de azúcares, cafeína, proteína, vitaminas y minerales (Schmalko et al.,
1995); el segundo trabajo se realizó a partir de una solución de yerba mate y comprendía
los minerales presentes (Tenorio Sanz y Torija Isasa, 1991); y el tercero simuló las formas
tradicionales de consumo (Tabla 2.3) (Ramallo et al., 1998a).
En la tabla 2.4 se presenta el aporte de nutrientes que representa el consumo diario de
100 g de yerba mate (2 porciones) en forma de mate caliente, con respecto a la Dosis Diaria
Recomendada (DDR); se puede observar que existen aportes importantes únicamente de
tiamina y piridoxina (B6).
El contenido de polifenoles totales (CPT) presente en las bebidas de yerba mate
habituales depende de la forma de consumo (p ≤ 0,0001), decreciendo en el orden: infusión
22
de mate en saquitos > mate caliente > mate frío. El CPT promedio en cada tipo de bebida y
el porcentaje de los sólidos solubles que dicho valor representa, se pueden apreciar en la
tabla 2.5 (Brumovsky et al., 2009).
El hábito de consumo del mate caliente y frío involucra el consumo diario de grandes
volúmenes: más de 1,5 L en el caso de los consumidores fuertes y menos de 0,5 L en el caso
de los consumidores suaves (Castellsague et al., 2000).
Tabla 2.3 Contenido de nutrientes en el extracto acuoso de yerba mate obtenido con
tres formas diferentes de extracción.
Composición
general
Glucosa (g)
Sacarosa (g)
Proteínas (g)
Cafeína (g)
Cenizas totales (g)
Extracto acuoso (g)
Vitaminas
Vitamina C (mg)
Tiamina (B1) (mg)
Niacinamida (mg)
Piridoxina (B6)(mg)
Minerales
Infusión
de mate en
saquitos
0,54±0,54
2,97±1,41
3,69±3,26
1,27±2,90
3,80±1,38
40,22±1,34*
Mate caliente
Mate frío
0,59±0,41+
2,77±0,53+
2,14±0,39+
0,85±0,08+
3,23±0,37+
27,02±3,09+
0,15±0,04
1,19±0,50
1,24±0,52
0,44±0,35
1,86±0,75
15,60±6,38
4,89±3,04
1,59±1,38
4,38±4,89
0,54±0,51
5,11±2,78
1,48±1,86
1,27±0,68+
0,94±0,97
2,35±0,13
0,15±0,10
n.d
n.d
Calcio (mg)
107,25±9,42*
80,94±9,78+
43,90±19,45
Fósforo (mg)
60,5±7,25
45,89±6,31+
21,27±8,70
Hierro (mg)
2,54±0,36
2,22±0,34+
1,10±0,46
Magnesio (mg)
86,96±7,25*
58,58±7,57+
33,17±13,64
Potasio (mg)
99,64±13,40
100,59±18,32+
41,63±16,85
Sodio (mg)
27,54±5,43*
14,04±2,45
11,07±4,11
Valores expresados como media ± DE a partir de cinco muestras comerciales;
referidos a % ms. n.d : No detectado
* Denota diferencias significativas entre la infusión de saquitos y el mate caliente
(p < 0,05)
+ Denota diferencias significativas entre el mate caliente y el mate frío (p < 0,05)
Fuente: Ramallo et al. (1998a)
23
Tabla 2.4 Aportes nutricionales que representa el consumo de 100 g de yerba mate en
forma de mate caliente con respecto a la Dosis Diaria Recomendada
Aportes nutricionales del mate
Valor medio
DDR
% de la DDR
Proteínas (g)
2,14
50
4,3
Vitamina C (mg)
5,11
60
8,5
Tiamina (mg)
1,48
1,4
100
Niacinamida (mg)
1,27
18
7,1
Piridoxina (mg)
0,94
2
47
Calcio (mg)
80,94
800
10,1
Hierro (mg)
2,22
14
15,9
Magnesio (mg)
58,78
300
19,5
Fuente: Ramallo et al. (1998a)
Tabla 2.5 Contenido de polifenoles totales (CPT) en el extracto acuoso de yerba mate
obtenido por simulación de las tres formas de consumo.
Forma de consumo
CPT
Infusión de mate en 19,25 g EAC %ms
saquitos
10,52 g EAG %ms
Mate caliente
11 g EAC %ms
Porcentaje de sólidos
solubles
50 %
48 %
6,25 g EAG %ms
Mate frío
4,03 g EAC %ms;
36 %
2,32 g EAG %ms
EAC: equivalentes a ácido clorogénico; EAG: equivalentes a ácido gálico;
%ms: por 100 g de muestra seca. Fuente: Brumovsky et al. (2009)
24
CAPITULO 3
“Antioxidantes”
25
3.1. Definición de términos generales
El término radical libre se refiere a cualquier especie química capaz de existir
independientemente de otras especies (por ello el término “libre”), y que posee uno o más
electrones desapareados. Son especies químicas altamente inestables y muy reactivas. Para
estabilizarse reaccionan rápidamente con moléculas adyacentes mediante reacciones de
oxido-reducción. Especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxigen Species, ROS en inglés) es
un término colectivo referido no solo a compuestos radicales que contienen oxígeno como el
radical hidroxilo (OH°); el radical superóxido (O2°-) y el radical óxido nítrico (NO°), sino
también a los compuestos derivados del oxígeno no radicales que son oxidantes y/o que se
convierten fácilmente en radicales libres como el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el ozono
(O3). La producción de ROS es una consecuencia normal de una serie de reacciones
bioquímicas esenciales para el organismo (propias del metabolismo biológico) y resulta en
daños biológicos cuando estas especies se hallan en concentraciones normalmente elevadas o
cuando las concentraciones de antioxidantes se hallan disminuidas (estrés oxidativo). El
término antioxidante hace referencia a cualquier sustancia que, estando presente a una
concentración más baja comparada con la de un sustrato susceptible al ataque de radicales
libres, es capaz de retrasar o prevenir la oxidación de dicho radical libre. Una especie
oxidante es aquella capaz de aceptar electrones y reducirse. Los agentes antioxidantes
exógenos son aquellos que se ingieren a través de la dieta. El estrés oxidativo es una
condición del organismo en la cual hay un desequilibrio oxidantes/antioxidantes, ya sea por
elevada concentración de ROS o porque las concentraciones de antioxidantes se hallan
disminuidas.
3.2. Antioxidantes y salud
3.2.1.
Antioxidantes y patologías asociadas
Se estima que las células humanas producen por día 10.000 situaciones probables para
generar radicales libres o ROS (Ames, 1983), pero que en general estos son eliminados por
mecanismos que dispone el organismo, los que al fallar pueden dar lugar a que dichos
radicales libres ejerzan sus acciones nocivas sobre ciertas moléculas o procesos biológicos
generando diversas patologías (Figura 3.1). Los efectos biológicos de las ROS (disminución
de las defensas, daño celular con la posibilidad de producir cáncer, arteriosclerosis y
envejecimiento) son controlados en los seres vivos por una gama de mecanismos fisiológicos
26
de defensa antioxidante, que involucran a un complejo grupo de procesos, todos
encaminados a evitar el exceso de oxidación a nivel celular, que es en definitiva el causante
de los trastornos de salud. “Cuando predominan los compuestos agresores, se rompe el
equilibrio a favor de las sustancias pro-oxidantes, desencadenándose alteraciones en la
estructura celular y cambios en las reacciones metabólicas” (Cabrera-Silva, 2005). Con el
paso del tiempo, el proceso se hace crónico y se produce entonces el deterioro de los tejidos,
los órganos y luego del organismo, con lo que deviene la enfermedad.
Figura 3.1. Relación entre estrés oxidativo y enfermedad
Existen varios procesos patológicos atribuibles razonablemente al estrés oxidativo en
el organismo (Figura 3.2) como cáncer (Rao y Berk, 1992), diabetes (Kashiwagi et al.,
1996), enfermedades neurodegenerativas (Astley, 2003; Jiménez-Jiménez et al., 2006),
enfermedades cardiovasculares (Astley, 2003; Delgado Roche et al., 2009), enfermedades
relacionadas a la edad (Astley, 2003), entre otras (Atoui et al., 2005). Entre las enfermedades
neurodegenerativas se pueden nombrar alteraciones frecuentes y debilitantes como la
enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington y la
esclerosis lateral amiotrófica.
Entre las principales alteraciones celulares y metabólicas producidas por el estrés
oxidativo se pueden nombrar: 1-destrucción de compuestos protectores del estrés oxidativo
(vitamina E, grupos tioles de péptidos o proteínas, vitamina C); 2-modificación de la
estructura del ADN celular produciendo mutaciones y daño celular; 3-alteraciones de las
reacciones enzimáticas a través de la destrucción de nucleótidos: cambios en el grupo tiol de
27
las enzimas y cambios en el estado redox de las coenzimas; 4-iniciación
ión y desarrollo de la
lipoperoxidación (o peroxida
idación de lípidos) principalmente en las membranas
me
celulares
debido a la presencia de ácido
idos grasos poli-insaturados, que reaccionan con
co facilidad con los
radicales, dando lugar a reacc
acciones en cadena que alteran la funcionalidad
ad de las membranas
celulares y sub-celulares (Cabrera-Silva,
(C
2005). Por ejemplo cuandoo el radical OH° es
generado cerca de las membra
branas celulares, ataca las cadenas laterales de ácido grasos de los
fosfolípidos de la membrana
na originando un radical centrado en un carbon
ono de la membrana,
el cual por lo general reaccio
ciona con oxígeno generando al radical peroxil
xilo (o peroxiradical)
(Figura 3.3). El radical peroxi
oxilo puede reaccionar con otra cadena lateral del
d ácido graso para
originar hidroperóxidos lípid
idos (Figura 3.3), los cuales son capaces dee alterar
a
la fluidez de
las membranas pudiendo prov
rovocar su ruptura además de producir product
uctos cito-tóxicos que
dañan a las proteínas de mem
embrana, inactivan receptores, dañan mecanism
smos de transducción
y proteínas de transporte (Moora, 2002).
CEREBRO
PIEL
Cancer
Shock,
Parkinson
CORAZON
Cardiopatías,
trombosis,
infarto
ARTICULA
ACIÓN
Reumatism
ismos
INTEST
STINO
Pancreatitis,
tis, ulcera
PULMÓN
ÓN
Asma
RL
Sistema
a Vascular
Vas
Esteroescle
sclerosis,
hipertens
ensión
RIÑON
ON
Insuficien
iencia
renal crón
rónica
MULTIORGANICA
Diabetes, HIV,
intoxicaciones,
inflamaciones
Sistema
Ocular
Cataratas,
retinopatías
Figura 3..2. Patologías asociadas al estrés oxidativo
3.2.2.
Mecanismos
os internos contra la acción de los radicaless libres
l
La acción de los radic
dicales libres genera enfermedades que puede
den ser frenadas por
mecanismos internos y para
ara fortalecer estos mecanismos, se deben proveer
pr
hábitos que
28
lleven a la formación de menor cantidad de radicales libres y una dieta que aporte nutrientes
esenciales antioxidantes (Tabla 3.1) y otros compuestos bioactivos denominados
fitoquímicos que, si bien no son esenciales para el organismo, presentan propiedades
saludables (Cabrera-Silva, 2005).
Figura 3.3. Formación de radicales
Tabla 3.1 Nutrientes protectores del estrés oxidativo y fitoquímicos con capacidad
antioxidante
Nutrientes protectores del estrés oxidativo
Directos
Vitamina E y C; β-caroteno
Indirectos
Vitamina B2 (glutatión reductasa), Selenio
(glutatión
azufrados
peroxidasa),
(glutatión),
aminoácidos
cobre
(superoxidismutasa),
manganeso
(superoxidismutasa),
zinc
(superoxidismutasa)
Fitoquímicos con capacidad antioxidante presentes en los alimentos
Fitatos (cereales integrales, leguminosas), taninos (leguminosas, frutas), flavonoides
(frutas, verduras, leguminosas, infusiones de té), alilcisteína (ajos), compuestos azufrados
presentes en la familia de las crucíferas (coles, mostaza, coliflor, rábanos), licopeno
(tomates, sandias)
Fuente: Cabrera-Silva (2005)
29
La Sociedad Española de Ciencias de la Alimentación propone como recurso didáctico
una “rueda de los alimentos” (Figura 3.4) con el objetivo de informar sobre los alimentos
más ricos en antioxidantes y sus porciones diarias recomendadas. Existen diversos sistemas
de defensa para mantener el equilibrio ROS-antioxidantes y en diferentes niveles.
Básicamente existen dos líneas defensivas basadas en mecanismos antioxidantes: la primera
está compuesta por enzimas protectoras y el secuestro de iones metálicos y la segunda línea
está constituida por varias sustancias no enzimáticas como los tocoferoles, los carotenoides o
el ácido ascórbico (Cabrera-Silva, 2005; Mora, 2002). Las células poseen además otros
mecanismos no antioxidantes para remover el exceso de radicales libres del organismo,
como los mecanismos de reparación de ADN, de degradación de proteínas dañadas y de
metabolización de hidroperóxidos en las membranas (Gil, 2010a).
Figura 3.4. Rueda de los Alimentos (Fuente: web 1)
3.2.3.
Principal sistema enzimático de defensa antioxidante
El principal sistema enzimático de defensa antioxidante está compuesto por un sistema
antioxidante enzimático integrado por las enzimas superoxidismutasa (SOD), catalasa (CAT)
y glutatión peroxidasa (GP). Para que este sistema sea eficiente es necesario que la SOD se
30
halle integrada a la acción de peroxidasas y catalasas que permitan la eliminación del agua
oxigenada (Cabrera-Silva, 2005).
La enzima SOD está presente en el organismo y actúa como inhibidora preventiva de
la oxidación lipídica catalizando la dismutación del anión superóxido (O2°-) en peróxido de
hidrógeno (H2O2) y O2, mediante el mecanismo descripto en la ecuación 3.1. Si bien el
peróxido de hidrógeno no es especialmente reactivo por sí solo, es un importante precursor
de otras sustancias radicales mas reactivas como el radical hidroxilo (°OH).
2O° + 2H H O + O 3.1
La remoción del radical superóxido (O2°-) y del H2O2 es importante por cuanto el
radical superóxido acelera por vía de la reacción de Fenton (Ec. 3.2a y 3.2b) la producción
del radical hidroxilo (°OH) a partir de moléculas de H2O2 e iones ferrosos (generados por la
acción del radical anión superóxido) (Cabrera-Silva, 2005; Gil, 2010a; Mora, 2002).
O° + Fe
Fe
X → Fe
X + H O → Fe
X + O X + OH° + OH
3.2a
3.2b
Las peroxidasas intervienen como primera estrategia defensiva cuando las
concentraciones de H2O2 son bajas y las catalasas (CAT) actúan cuando las concentraciones
de H2O2 son mayores. En las ecuaciones 3.3a y 3.3b se describen los mecanismos de
actuación de las nombradas enzimas, donde “D” corresponde a una molécula donadora de
átomos de hidrógeno (es decir representa a alguna molécula que se oxidó).
La peroxidasa más efectiva en este sistema de protección es la glutatión peroxidasa
(GP). Esta enzima cataliza la reducción del hidrógeno de los peróxidos lipídicos (LOOH) y
al peróxido de hidrógeno por medio del antioxidante glutatión (GSH) (GSH es el medio
reductor) el cual es convertido a glutatión oxidado (GSSG). El GSSG luego es nuevamente
reducido a GSH, reacción que es catalizada por la enzima glutatión reductasa en presencia de
la NADPH como agente reductor.
2H O
O + 2H O Catalasa H O + DH
!
D + 2H O Peroxidasa
3.3a
3.3b
31
El secuestro de iones metálicos (potenciales catalizadores de oxidación) como
mecanismo de defensa se refiere principalmente al secuestro de los iones de hierro y cobre,
los cuales están ligados a las proteínas ceruloplasmina y transferrina respectivamente. Estas
proteínas actúan manteniendo los metales de transición en su estado de oxidación mas
inactivo, ya sea secuestrados o ligados de forma que en condiciones normales no existan
iones de hierro o de cobre libres en circulación (Mora, 2002).
3.2.3.1.
Antioxidantes no enzimáticos
La segunda línea de defensa antioxidante está representada por una gama de
compuestos antioxidantes no enzimáticos los cuales intervienen directamente en la cadena de
formación de radicales libres, inactivándolos o dando lugar a la formación de un radical de
baja energía (Ec. 3.4). Su efectividad depende de sus propiedades químicas como las
energías de enlace, la posibilidad de formación de distintas formas resonantes del radical
formado y la susceptibilidad a la oxidación; esta última viene dada por el valor de su
potencial de reducción. Otro aspecto importante es la solubilidad en distintos medios ya que
los radicales responsables del deterioro lipídico se forman tanto en la parte lipofílica de las
células (ruptura de peróxidos o hidroperóxidos lipídicos) como en el citosol (peróxido de
hidrógeno, superóxido, etc) (Iglesias Neira, 2009)
R° + AH → RH + A°
3.4
Entre los antioxidantes de tipo hidrofílicos se destacan el ascorbato, los tioles y varios
tipos de compuestos nitrogenados mientras que los tocoferoles, la ubiquinona y los
carotenoides son los más importantes entre los de tipo lipofílico.
3.3. Antioxidantes y reacciones de oxidación en alimentos
En tecnología de alimentos, los antioxidantes son definidos como sustancias que
previenen o retardan la oxidación de las grasas responsable de la formación de compuestos
químicos que pueden afectar negativamente la calidad del alimento. Entre los principales
aspectos relacionados a la calidad del alimento que tienen relación directa con la oxidación
de lípidos están: calidad nutricional, toxicidad, “flavors” anómalos, textura y color (Finley y
Given, 1986; Huang et al., 2005). Es importante mencionar que la oxidación y la necesidad
de antioxidantes no está limitada a alimentos de alto tenor lipídico (aceites vegetales, grasas
32
animales, saborizantes, productos cárnicos procesados y productos snack) sino que incluye a
alimentos de bajo contenido lipídico como los cereales (Finley y Given, 1986).
3.3.1.
Tipos de deterioro en lípidos
La oxidación de los lípidos constituye una de las principales causas de deterioro de los
alimentos. Tiene como consecuencias las alteraciones en el aroma, en el sabor
(enranciamiento), en el color (especialmente en el caso de los carotenos) y la textura, la
pérdida de determinados nutrientes (por ejemplo la vitamina E) y la formación de sustancias
potencialmente nocivas (Frankel, 1996). El grado de deterioro depende del tipo de grasa o
de aceite; en terminos generales, los lípidos que más fácilmente se afectan son los de origen
marino, seguidos por los aceites vegetales y finalmente por las grasas animales. El término
rancidez se usa para describir diferentes mecanismos de alteración de lípidos. Existen tres
mecanismos principales:
a-rancidez hidrolítica o lipólisis: se debe a la hidrólisis de grasas con liberación de
glicerol y ácidos grasos libres (R) (Ec. 3.5). Se origina generalmente por presencia de
humedad y de altas temperaturas, aunque también puede tener origen enzimático por acción
de las enzimas lipolíticas (lipasas) sobre el enlace éster (-(C=O)-R) de los triglicéridos. Si los
ácidos grasos generados son de cadena corta (como en la leche: ácido butírico (también
responsable del deterioro en manteca), ácido caproico, ácido caprílico y ácido láurico) se
producen olores peculiares y representan un deterioro sensorial del alimento. Si bien en
general la lipólisis es indeseable, hay alimentos donde es totalmente deseable, tal es el caso
de algunos quesos en los cuales se añaden lipasas microbianas o algunos microorganismos
con fuerte actividad lipolítica. Este tipo de deterioro también puede ocurrir en granos
almacenados que han sufrido calentamiento moderado o sostenido crecimiento de hongos
productores de lipasas capaces de producir rancidez hidrolítica en éstos. La forma usual de
prevenir este tipo de deterioro es mediante la inactivación de las enzimas mediante calor o
evitando el contacto del alimento con la humedad y el calor. La medición de este tipo de
deterioro se realiza mediante el índice de acidez de grasas (FFAV).
33
3.5
b-autoxidación o rancidez oxidativa: se refiere fundamentalmente a la acción del
oxígeno atmosférico (reacción espontánea) y de las lipoxigenasas (ver siguiente ítem) sobre
las insaturaciones de los ácidos grasos liberando compuestos peróxidos y compuestos
carbonilos volátiles (que luego pueden participar en reacciones de pardeamiento no
enzimático) de “flavor rancio”. Es la principal forma de oxidación de los lípidos. Recibe el
nombre de auto-oxidación pues es un mecanismo que genera compuestos que a su vez
mantienen y aceleran la reacción; entre los productos sintetizados se encuentran aldehídos,
cetonas y alcoholes; algunos de peso molecular bajo que le confieren el olor característico a
las grasas oxidadas, y otros cuya toxicidad todavía se halla en estudio. La presencia de hierro
y cobre (aun en concentraciones menores al 1 ppm) favorecen el inicio de la reacción; los
ácidos grasos libres solubilizan estos iones y facilitan su acción catalizadora pues provocan
un mayor contacto con el lípido. Los peróxidos provenientes de grasas oxidadas también
producen esta reacción, por lo que no es conveniente mezclar grasas usadas con grasas
frescas; la energía radiante del ultravioleta es también un importante agente que favorece
estos cambios.
Entre los compuestos formados por la oxidación de los lípidos los más abundantes son
los aldehídos, cuya composición cuali y cuantitativa está influenciada por la composición de
los ácidos grados originales. Gran parte de los aldehídos formados son muy volátiles y
poseen un bajo umbral de olfatación, por lo que provocan modificaciones importantes en el
aroma de los alimentos donde se forman, siendo los principales responsables del “flavor”
característico de muchos de ellos y en otros casos desencadenando la aparición de sabores y
aromas desagradables a rancio o a fritura, etc.
El proceso más importante por el cual el oxígeno atmosférico y los ácidos grasos
insaturados interactúan es por medio de un mecanismo de radicales libres caracterizado por
tres fases: iniciación, propagación y terminación (Barreiro et al., 2006).
34
i. reacciones de iniciación: Esta fase ocurre cuando el hidrógeno es removido de la
molécula de los ácidos grasos insaturados, por ruptura homolítica del enlace C-H dando
lugar a un radical libre lipídico (Ec. 3.6a y 3.6b). Los radicales libres lipídicos tienden a
estabilizarse mediante reordenamiento interno originando dienos conjugados.
ii. reacciones de propagación: Los radicales formados en la etapa de iniciación (L°)
pueden reaccionar con el oxígeno para formar radicales peróxido (LOO°) los cuales
inmediatamente forman hidroperóxidos (LOOH) y un nuevo radical lipídico al abstraer otro
hidrógeno a un ácido graso y propagando así la reacción en cadena (Ec. 3.6c).
Los hidroperóxidos generados también pueden fragmentarse por acción térmica o
descomponerse por la catálisis de metales de transición, lo que genera nuevos radicales que
autocatalizan el proceso de oxidación (Ec. 3.6d).
LH → L° + H°
LH +O → LOO° + H°
LH +LOO° → L° + LOOH
LOOH → LO° + °OH
3.6a
3.6b
3.6c
3.6d
Este tipo de interacciones ocurren entre 10 y 100 veces antes de que se combinen dos
radicales para terminar el proceso. Se caracterizan por una cierta acumulación de peróxidos
lipídicos. Se crean tantos radicales libres como se consumen. Es la etapa de oxidación de los
ácidos grasos insaturados.
Los hidroperóxidos generados en esta etapa se caracterizan por ser insípidos e inoloros
y son denominados “productos primarios” de la oxidación lipídica.
iii. reacciones de terminación: Los radicales libres provenientes de la descomposición
de hidroperóxidos se asocian para formar productos no-radicales que no pueden formar parte
en las reacciones de la etapa de propagación (aldehídos, alcoholes, cetonas de bajo peso
molecular responsables del olor a rancio) (Ec. 3.7a y 3.7b) y son comúnmente denominados
“productos secundarios”.
35
L° +L° → LL
LOO° +L° → LOOL
3.7a
3.7b
Salvo al comienzo de la autoxidación, las reacciones de iniciación, propagación y
terminación se desarrollan simultáneamente (Graciani Constante, 2006).
Las pruebas de laboratorio más usuales para determinar la rancidez oxidativa son el
número de peróxidos, la prueba de Kreis y la prueba del ácido tiobarbitúrico.
c- reversión: se debe generalmente a la autoxidación del ácido linoleico; su
mecanismo es poco conocido. Es característico en aceites vegetales con un contenido
relativamente alto de ácidos no saturados (semilla de lino, soja, colza). Los sabores
"revertidos" se deben a aldehídos no saturados. Este tipo de deterioro tiene menos
importancia que los dos anteriores.
3.3.2.
Oxidación lipídica por lipoxidasas
Las lipoxigenasas (en un principio conocidas como lipoxidasas) son un grupo de
enzimas muy heterogéneas presentes en algunos alimentos (legumbres, trigo, papas, rábanos,
carne de cerdo y pescado, oleaginosas etc), que poseen efecto prooxidante sobre algunos
ácidos grasos (Gutiérrez, 2000). Estas enzimas poseen en su estructura un átomo de Fe(II) y
catalizan en forma altamente específica la oxidación de los sistemas 1,4 pentadieno cis-cis
existentes en los ácidos linoleico, linolénico y araquidónico. Tambien puede afectar a los
estructuras carotenoides con la consigiente pérdida de valor nutricional y de propiedades
sensoriales. En su forma activa (en forma férrica) es capaz de remover un electrón de un
doble enlace no conjugado para convertirse nuevamente en su forma natural liberando un
radical catiónico. Se cree que su acción se inicia con la formación de radicales libres y luego
tienen lugar reacciones en cadena similares a las descriptas en el caso de la autoxidación.
Los mecanismos de formacion de hidroperóxidos serían diferentes a los mecanismos de
autooxidacion estudiados, ya que los productos secundarios que se originan son muy
distintos (Gutiérrez, 2000). Aun no se conocen con exactitud los mecanismos implicados en
el enranciamiento de lípidos por enzimas lipoxidasas.
36
Las lipoxigenasas son
on capaces de permanecer activas aun a bajas
b
temperaturas.
Representan un factor de imp
mportancia en el deterioro de productos congela
elados y conservados
a bajas temperaturas.
3.3.3.
Oxidación lipídica
lip
fotosensibilizada
La formación de prod
roductos de oxidación de lípidos (hidroperóx
róxidos) es también
posible mediante la adiciónn directa
d
del oxígeno al doble enlace de los lípi
ípidos (en lugar de la
acción del oxígeno es su form
orma más estable, triplete, sobre la moléculaa li
lipídica insaturada);
pero para que esta vía ocurra
ra es necesaria la excitación previa del oxígeno
no al estado singlete.
Una de las formass más
m
comunes de generación del oxígeno
eno singlete es por
fotosensibilización, que consi
nsiste en un proceso activado por la luz en pres
resencia de sustancias
absorbedoras de luz (fotos
tosensibilizadores) (Ec. 3.8.d). Los fotosen
sensibilizadores son
pigmentos naturales present
entes en los alimentos tales como clorofila,
la, feofitina, flavina,
mioglobina.
La irradiación con luzz visible produce la excitación electrónica del fotosensibilizador
(sens) que pasan desde el estado
est
fundamental a los estados excitados (1sens°
se
y 3sens°) (Ec.
3.8.a y 2.8.b). Luego las espe
species del sensibilizador en estado triplete excitado
ex
transfiere la
energía directamente al oxíge
ígeno triplete convirtiéndolo en oxígeno single
glete (Ec. 3.8.c). Una
vez que alcanza el estado sing
inglete mediante excitación electrónica, el oxíge
ígeno se convierte en
una especie muy electrofílica
ica y excepcionalmente reactiva (reacción 1500
500 veces más rápido
con los lípidos que el oxígeno
eno triplete) y se adiciona directamente a los dobles
do
enlaces de las
cadenas de los ácidos graso
sos dando lugar a hidroperóxidos alílicos (Graciani
(G
Constante,
2006; Cabrera-Silva, 2005).
3.8a
3.8b
3.8c
3.8d
37
3.3.4.
Pro-oxidantes en sistemas lipídicos
Para que la oxidación lipídica se inicie es necesaria la presencia de iniciadores que
catalicen el proceso: como energía (proporcionada por la luz o por calentamiento), y/o
presencia de metales o enzimas.
Los pro-oxidantes poseen la habilidad de reducir la estabilidad de los lípidos.
Muchas sustancias usadas como aditivos antioxidantes pueden ejercer un efecto
prooxidante. Ejemplos de ellos son la vitamina C, la cual ejerce un efecto antioxidante o prooxidante según sea su concentración (Bradshaw et al., 2003; Rietjens et al., 2002; Yen et al.,
2002) o dada la presencia de metales pesados, los β carotenos a altas presiones de oxígeno
(Rietjens et al., 2002), los flavonoides en presencia de iones Cu+2 y Fe+3 (Rietjens et al.,
2002) y la quercetina, la miricetina y el kaemferol en presencia de metales de transición en
carnes curadas.
El hierro en presencia de peróxido cataliza la descomposición de los hidroperóxidos
dando lugar a la formación de nuevos radicales libres (Ec. 3.9a y 3.9b). En un sistema libre
de peróxidos, el Fe+2 reacciona con el oxígeno molecular dando lugar a nuevas especies
reactivas de oxígeno (Ec. 3.9c).
LOOH + Fe
LOOH + Fe
→ LO° + OH° + Fe
→ LOO° + H + Fe
O + Fe
→ Fe
3.3.5.
+ O°
3.9a
3.9b
3.9c
Efectos de la oxidación de lípidos en el alimento
3.3.5.1.
Sabores oxidados
El efecto inmediatamente reconocible de la oxidación de los lípidos en los alimentos es
el desarrollo de olores y sabores indeseables. Los productos "rancios" de la oxidación de lípidos son en su mayoría compuestos carbonílicos de cadena corta, formados como resultado
de la descomposición de los peróxidos. La aparición de “flavors” rancios en productos
lácteos se debe fundamentalmente a la auto-oxidación; por ejemplo en el caso de la leche
líquida, el sustrato está representado por los fosfolipidos y la reacción es catalizada por
vestigios de hierro o de cobre, en cambio en la leche en polvo la auto-oxidación afecta
fundamentalmente a los ácidos grados de los triglicéridos. Según Jayathilakan et al. (2007),
38
las papas, cuando son cocidas en agua a ebullición y luego almacenadas en frío, desarrollan
rápidamente un sabor no agradable como resultado de la actividad de la lipoxigenasa.
3.3.5.2.
Pérdidas de vitaminas liposolubles y pigmentos
La oxidación de lípidos en alimentos ricos en vitaminas liposolubles (A, D, E y K)
suele ir acompañada de pérdidas en dichos compuestos por reacciones catalizadas que
involucran la presencia de radicales libres. La vitamina E, por ejemplo, actúa como
antioxidante y es consumida durante el período de inducción de las reacciones de autooxidación (Pokorny, 1991). La oxidación de los lípidos puede afectar indirectamente el
color de los alimentos; un típico ejemplo lo constituyen los pigmentos carotenoides y
clorofilas por reacción con los hidroperóxidos.
3.3.5.3.
Efecto sobre las proteínas
Los productos de la oxidación lipídica pueden reaccionar con las proteínas presentes
en el alimento provocando la polimerización de las proteínas con un significativo aumento
del peso molecular da las mismas (Berlett y Standtman, 1997; Zayas, 1997).
El mecanismo de interacción entre los lípidos oxidados y las proteínas implica la
propagación de la cadena de radicales libres al sistema proteico. Existen varios grupos en la
molécula de proteína capaces de convertirse en radicales libres mediante la pérdida de un
átomo de hidrógeno ante la acción de un radical libre de origen lipídico. Los radicales libres
de la proteína así formados tienden a combinarse por entre-cruzamiento. Se ha atribuido la
dureza en el pescado congelado a la agregación de moléculas de miosina como resultado del
ataque de radicales libres de lípidos oxidados. El sitio más vulnerable a dicho ataque, en la
molécula de proteína, parecería ser el grupo NH.
La interacción entre lípidos oxidados y proteínas afecta negativamente al valor
nutricional y a la funcionalidad de las proteínas en sistemas alimenticios debido a la
desnaturalización de las proteínas con la consiguiente disminución de su solubilidad y de su
capacidad de retención de agua, también es responsable de cambios texturales (“hardening
texture”). Entre los aminoácidos más vulnerables a los productos de la oxidación lipídica se
encuentran la metionina, la histidina, la cistina y la lisina (Richardson y Finley, 1985).
39
Mottram y Edwards (1983) sugieren que el flavor característico a carne tostada se debe
a la reacción entre las proteínas y los compuestos carbonílicos derivados de la oxidación de
los fosfolipidos.
La interacción entre las proteínas y los productos de la oxidación de los lípidos puede
determinar cambios en la textura. Según Decker (2000) los productos preparados con carne
que exhiben claros signos de rancidez oxidativa tienden a mostrar una baja habilidad para
moldearse y baja retención de agua.
3.3.6. Estrategias de control y retardo de la oxidación
Actualmente el diseño de estrategias de control de la oxidación lipidica en alimentos
constituye un aspecto muy importante desde el punto de vista comercial y de calidad
organoléptica (Iglesias Neira, 2009). Posibles estrategias a combinar son: reducción de la
actividad acuosa, uso de materiales pobres en lípidos poli-insaturados (las moléculas se
tornan más reactivas cuando existe un carbono metilénico entre dobles enlaces), protección
del alimento del contacto con el oxígeno (eliminación de la mayor parte del aire disuelto y en
el caso de aceites, disminución del espacio de cabeza del envase para limitar la entrada de
aire a través de su superficie, reemplazo del aire por gases no reactivos como nitrógeno o
dióxido de carbono, o finalmente realizando vacío; siempre acompañada esta estrategia por
un empaque que limite el ingreso de oxígeno) (Formanek et al., 2001; Lund et al., 2007),
inactivación de enzimas (especialmente lipoxigenasas), reducción de temperatura y agregado
de aditivos inhibidores de la oxidación (antioxidantes solos, combinados o en combinación
con agentes sinérgicos de la oxidación como el ácido cítrico o polifosfatos); eliminación de
trazas de elementos metálicos como Cu e Fe (propios del alimento, provenientes de aguas no
tratadas correctamente o de los equipos) por agregado de agentes quelantes (Frankel, 1996);
evitar la presencia de luz VIS-UV o IR (usando envases opacos) (Kim et al., 2002). En la
tabla 3.2 se presenta un resumen de los principales factores que influyen en la oxidación de
lípidos.
El agregado de aditivos antioxidantes a productos alimenticios ricos en grasas de
origen animal (excepto productos de la pesca) puede ser una estrategia muy útil dado que no
poseen (o poseen trazas) antioxidantes naturales (o endógenos); en cambio los aceites
vegetales comestibles, debido a la presencia de tocoferoles, disponen de una protección
40
natural frente a la auto-oxidación (siempre que el almacenamiento no sea demasiado
prolongado).
La autoxidación de lípidos en pescados puede ser una alteración muy importante
debido al alto grado de insaturación de sus lípidos (de 4 a 8 dobles enlaces) y a la presencia
de mioglobina muscular, la cual cataliza la auto-oxidación.
Tabla 3.2 Factores que influyen en la oxidación de lípidos
Promotores
Inhibidores
Temperaturas altas
Temperaturas bajas
Metales: Cu, Fe
Agentes quelantes (o secuestradores)
Contacto con oxígeno atmosférico
Atmosfera modificadas o controladas.
Vacío
Presencia de luz VIS, UV o IR
Empaque opaco
Peróxidos de lípidos oxidados
Antioxidantes
Peroxidasas
Tratamiento térmico
Poli-insaturaciones
Hidrogenación de las insaturaciones
3.3.6.1.
Concentración de oxígeno y oxidación de lípidos
En un sentido estricto la ausencia de oxígeno impediría la oxidación de los lípidos, ya
que el oxígeno es un reactivo imprescindible para la propagación de la reacción (Graciani
Constante, 2006). Estudios basados en cinética de absorción de oxígeno demostraron la
presencia de dos etapas características en el desarrollo de la oxidación: i- un período de
inducción, de duración variable, donde el consumo de oxígeno es muy bajo y tiene lugar la
formación de los hidroperóxidos a través de las reacciones de propagación, y ii- un período
caracterizado por un aumento brusco del consumo de oxígeno en el que se da un desarrollo
acelerado de la formación de nuevos compuestos de terminación. Desde el punto de vista de
la conservación del alimento, se debe aumentar al máximo el período de inducción (Graciani
Constante, 2006).
41
3.3.6.2.
Actividad acuosa y oxidación de lípidos
La reducción de la actividad acuosa como método de conservación contempla otras
metas más allá del punto de vista microbiológico, ya que ejerce influencia en otras
reacciones de deterioro de alimentos tanto químicas como bioquímicas, entre ellas la
oxidación de lípidos.
Cuando la actividad acuosa (aw) es menor a 0,2 la velocidad de oxidación es muy
elevada. La sucesión de reacciones comienza con la generación de radicales libres y continúa
con la fijación de oxígeno sobre ellos dando lugar a peróxidos, los cuales se degradarán
formando compuestos carbonilo. A valores de aw muy bajos, al aumentar el contenido de
agua se evidencia un efecto antioxidante del agua, ya que las moléculas de agua se unen
mediante enlaces de puentes de hidrógeno a los peróxidos y además compiten con el oxígeno
por los lugares de adsorción en los lípidos.
A partir de valores de aw de aproximadamente 0,2 (cuando la interfase lipídica está
saturada de agua), el efecto antioxidante del agua ya no aumenta. La velocidad de los
procesos de oxidación presenta un mínimo en el rango 0,2 < aw < 0,5, ya que en este rango
gran parte de los peróxidos están unidos al agua e imposibilitados para continuar con las
reacciones de oxidación; la hidratación de los átomos metálicos dificultaría su acción
catalizadora sobre las reacciones de oxidación.
A valores de aw superiores a 0,5 la oxidación se acelera, ya que el efecto antioxidante
del agua se ve superado por el efecto catalizador de la oxidación de los metales, los cuales al
haber más agua disponible, difunden más fácilmente hacia los otros compuestos implicados
en la oxidación.
Cuando la aw es muy alta la velocidad de oxidación se lentifica un poco debido a un
efecto de dilución (Labuza, 1971)
En la figura 3.5 se puede observar la velocidad de oxidación de lípidos en función de la
actividad acuosa.
42
Figura 3.5. Velocidad de oxidación en alimentos según actividad acuosa y contenido de
humedad (Fuente: adaptado de Labuza, 1971)
3.3.6.3.
Temperatura y oxidación de lípidos
La disminución de temperatura reduce las tasas de oxidación de acuerdo a la ecuación
de Ahrrenius.
3.3.6.4.
Aditivos antioxidantes y oxidación de lípidos
Además del rol de los antioxidantes como benefactores de la salud, estos se
desempeñan como aditivos alimentarios para prevenir o retrasar el desarrollo de
rancidez de grasas u otros deterioros de “flavor” debidos a la oxidación durante el
almacenamiento (exposición del alimento a factores como: aire, luz, temperatura, etc) o
durante el procesamiento (Pokorny, 1991). Sin embargo, se debe contemplar que la
utilización de antioxidantes, si bien retrasa la alteración oxidativa del alimento, no la
evita de una forma definitiva (Jacobsen et al., 2008).
En la elección de un aditivo antioxidante se deben considerar aspectos
económicos, de salud y normativos, entre los que se destacan:
1-capacidad de inhibir la oxidación lipidica, 2-inocuidad: el uso de antioxidantes
sintéticos está sujeto a normativas, por ejemplo el Código Alimentario Argentino (CAA)
especifica 200 mg/kg como límite máximo de los antioxidantes butil-hidroxianisol (BHA) y
butil-hidroxitolueno (BHT) agregados a aceites comestibles (CAA, 2000), 3-modificaciones
43
organolépticas del alimento (color, aroma, sabor), 4-deben ser efectivos a bajas
concentraciones para eludir sus niveles de toxicidad, 5-modo de incorporación del
antioxidante al alimento, pues su actividad no depende exclusivamente de las propiedades
químicas del mismo sino también de su accesibilidad o difusión hacia los puntos sensibles a
la oxidación (interfase aire/lípido si es un sólido graso o interfase lípido/agua si es una
emulsión); además la solubilidad del AO debe ser compatible con el estado físico del
sustrato lipídico sobre el que actuara (Iglesias Neira, 2009), 6-estabilidad del antioxidante
durante el almacenamiento y procesamiento y 7-el costo del antioxidante y su aplicación, ya
que no deben encarecer significativamente el precio del producto sobre el que se adiciona.
3.3.7.
Clasificación de antioxidantes alimenticios
Según el mecanismo general de acción se clasifican en:
Antioxidantes de tipo I: Estas sustancias son capaces de interrumpir y detener la
reacción de propagación en cadena al reaccionar con los radicales libres, cediendo un radical
hidrógeno a un radical lipídico libre. Su forma de actuación puede representarse
esquemáticamente en la ecuación 3.10 donde el radical del ácido graso o del hidroperóxido
(R°) se transforma en una molécula y el antioxidante AH se transforma en el radical libre
(A°). La diferencia fundamental es que el radical libre del antioxidante no es lo
suficientemente reactivo para seguir dando lugar a reacciones de propagación, y se destruye
o se une a otro radical libre, dando entonces una molécula estable.
R° + AH → RH + A°
3.10
Los antioxidantes de tipo I pueden ser fenólicos (artificiales: galato de propilo,
butilhidroxianisol y butilhidroxitolueno; o naturales) o no fenólicos (carotenoides; a su vez
pueden ser carotenoides o xantinas). En la tabla 3.3 se presentan algunas características de
los antioxidantes de tipo I.
Antioxidantes de tipo II: Son compuestos que impiden o disminuyen la formación de
radicales libres (Ec. 3.11). Su acción depende del pH y de la temperatura. Dentro de este
grupo se puede mencionar aminoácidos como la histidina y la cisteína y fosfatos. Son
secuestrantes de metales o reaccionan con el oxígeno. Potencian la acción de antioxidantes
de tipo I. Ejemplos: ácidos ascórbico, cítrico, láctico y sus derivados, EDTA (ácido
44
etilendiaminotetraacético y sus derivados: etilendiamono tetracetato cálcico disódico y
etilendiamono tetracetato disódico).
Tabla 3.3 Antioxidantes de tipo I
Antioxidantes tipo I fenólicos
Lipofílicos: tocoferoles y tocotrienoles
Solubles en grasas y aceites, inestables a
altas temperaturas
Hidrofílicos: ácidos fenólicos, flavonoides Solubles en medios polares, inestables a
(antocianos) y taninos
altas temperaturas
Antioxidantes tipo I no fenólicos: carotenoides
Hidrocarburos formados únicamente por
Carotenos
átomos de carbono e hidrógeno
Presentan grupos oxigenados: alcoholes,
Xantofilas
cetonas, aldehídos, ácidos carboxílicos y
ésteres
M
+ H Y + e → MHY + H
3.11
Antioxidantes tipo III: están definidos como procedimientos destinados a proteger el
producto alimenticio frente a la oxidación estableciendo condiciones físicas adecuadas, en
especial en lo que respecta al contenido de oxígeno, luz, humedad y temperatura. Entre los
ejemplos que podrían citarse se destacan los embalajes impermeables al oxígeno y el
envasado al vacío o en atmosferas inertes con N2 o CO2. Se suelen asociar con antioxidantes
de tipo I y II.
3.3.8.
Sinergismo entre antioxidantes
Para que exista un efecto sinérgico entre antioxidantes es necesario que el efecto
antioxidante de la combinación de ellos sea mayor a la suma de los efectos causados por
dichos compuestos por separado. Simbólicamente: (A + B) > A + B.
Para que exista un efecto antagónico entre antioxidantes es necesario que el efecto
antioxidante de la combinación de ellos sea menor a la suma de los efectos causados por
dichos compuestos por separado. Simbólicamente: (A + B) < A + B.
45
Para que exista un efecto de potenciación de un antioxidante, es necesario que el efecto
de dicho antioxidante en combinación con su potenciador sea
mayor al efecto causado por
dicho antioxidante sin combinación. Simbólicamente: (A + P) > A.
Para que exista un efecto de inhibición de un antioxidante, es necesario que el efecto
de dicho antioxidante en combinación con su inhibidor sea menor al efecto causado por
dicho antioxidante sin combinación. Simbólicamente: (A + P) < A.
En muchas ocasiones, pero no en todas, la combinación de dos o más antioxidantes
presenta un efecto sinérgico (Miranova et al., 2008); por ejemplo el agregado de mezclas de
carotenoides resultan más efectivas que el agregado de dichos compuestos en forma
individual.
En algunas ocasiones el papel del compuesto sinergista consiste en regenerar el
antioxidante oxidado mediante una reacción redox que cataliza su paso al estado reducido
original. Esto es lo que ocurre entre la vitamina C y la vitamina E, cuando la primera
regenera a la segunda, así como entre el β-caroteno y la vitamina C.
La figura 3.6 ilustra el sinergismo típico entre los antioxidantes sintéticos BHA y BHT
en una grasa animal (Allen y Hamilton, 1994).
Figura 3.6. Sinergismo en una grasa animal típica, con (a) 0,02% de BHA, (b) 0,02%
de BHT, (c) 0,01% de BHA + 0,01% de BHT (Fuente: adaptado de Allen y Hamilton,
1994)
46
3.3.9.
Sustancias potenciadoras de antioxidantes/agentes quelantes
Los sinérgicos (SH) son sustancias que no tienen actividad antioxidante por si mismas,
pero benefician la actividad de los antioxidantes (AH) eliminando los radicales oxidantes
(A°) formados durante la reacción entre el radical peróxido (ROO°) y el antioxidante (AH) y
dando lugar a un nuevo radical libre S° menos reactivo. Las sustancias sinérgicas previenen
la descomposición de los peróxidos, retrasando así la aparición de los productos secundarios
de la oxidación lipidica responsables del deterioro sensorial del alimento. También pueden
actuar como secuestrantes o complejantes de iones metálicos, inhibiendo su acción prooxidante (Cubero et al., 2002).
La concentración máxima permitida por el CAA para los sinergistas ácido cítrico,
ácido fosfórico, citrato de monoisopropilo y ésteres de monoglicéridos con ácido cítrico, en
aceites comestibles es de 100 mg / kg, aislados o mezclados (CAA, 2000).
A continuación se nombran los principales compuestos sinergistas de uso alimenticio:
Acido cítrico y citratos
Estos compuestos se desempeñan como sinérgicos de otros antioxidantes y como
agentes complejantes de iones metálicos catalizadores de la auto-oxidación lipídica. La
cantidad que se puede agregar es limitada dada su baja solubilidad en grasas y aceites
(Cubero et al., 2002).
Polifosfatos
Los polifosfatos se hallan representados en su mayoría por moléculas de carácter
alcalino. Si bien poseen poder secuestrante de iones metálicos, su eficacia está limitada por
el pH, siendo más eficiente en medios de baja acidez (Cubero et al., 2002).
Etilen-diamin-tetracetato de calcio y disodio
Este compuesto, más conocido por su sigla EDTA, presenta interés como sinérgico por
su acción complejante de iones metálicos altamente estables. En forma de sal sódica es más
soluble en agua que en su forma de ácido. Se usa como secuestrante con alta afinidad por el
hierro, plomo, cobre, zinc, etc.
47
3.3.10. Antioxidantes
tes sintéticos
Algunos de los antioxid
xidantes sintéticos más usados son compuesto
stos fenólicos como
el butil-hidroxianisol (BHA),
A), el butil-hidroxitolueno (BHT), la butil-hidr
idroquinona terciaria
(o ter-butilhidroquinona, TBH
BHQ) y los ésteres del ácido gálico como el galato de propilo
(PG); sus estructuras química
icas se muestran en la figura 3.7.
Figura 3.7. Estru
tructuras de los principales antioxidantes sin
sintéticos
El BHA y el BHT son
on muy poco solubles en agua, pero solubless en
e etanol, aceites y
parafinas. Son considerados
dos más efectivos en las aplicaciones a gras
rasas animales que a
aceites vegetales (Amerling,
g, 2001;
2
Cubero et al., 2002), encontrándose también
tam
aplicaciones
como protectores del colorr y del aroma de aceites esenciales (Cubero et al.,
a 2002). El BHA
no es volatilizable como el BHT. Ambos son estables al calor (temper
peraturas de fritura y
horneado) por lo que suelen
en usarse como protectores de lípidos en prod
oductos de confitería
con contenido graso (hornea
neados y fritos) (Cubero et al., 2002) y adem
emás son usados en
combinación debido al efecto
cto sinérgico resultante (Pokorny, 1991). El BHA
BH ejerce un efecto
antimicrobiano frente a bacte
cterias Gram positivas y hongos y un efecto algo
a
menor frente a
bacterias Gram negativas mie
mientras que el BHT lo ejerce frente a C. botu
otulinum y S. aureus.
(Cubero et al., 2002).
La TBHQ es muy poco
oco soluble en agua y muy soluble en lípidos.
os. Es considerado el
mejor antioxidante para las aplicaciones de fritura (Cubero et al., 2002)
2
y en aceites
vegetales (Pokorny, 2001),
), pero resulta poco eficaz en los procesos
os de panificación u
horneado. Su uso no está auto
utorizado en la UE, pero si en Estados Unidos.
En los ésteres del ácido
ido gálico (como galato de propilo, galato de octilo y galato de
dodecilo) la presencia de tres
tre grupos fenólicos los hace muy activos,
s, pero también son
responsables de su capacida
dad para formar complejos intensamente colo
oloreados (negruzco-
48
azulados) con algunos metales (especialmente hierro y cobre). Son poco estables a altas
temperaturas por lo que no son aptos para la protección del contenido lipídico de productos
de fritura y horneado. Al aumentar el peso molecular aumenta su solubilidad en grasas y
disminuye su solubilidad en agua. Presentan el fenómeno de reversión cuando superan
concentraciones de aplicación del 0,1% (Cubero et al., 2002). En la tabla 3.4 se presenta un
listado de los principales antioxidantes sintéticos de uso industrial.
Tabla 3.4 Listado de principales antioxidantes sintéticos de uso industrial
Nombre
Origen
Uso habitual en
Galato de propilo
Síntesis
artificial
Copos de cereales, chicles, purés de
papa instantáneos, aperitivos, grasas y
aceites vegetales
Ácido eritorbico
Eritorbato sódico
Butilhidroxianisol (BHA)
Butilhidroxitolueno (BHT)
Síntesis
artificial
Síntesis
artificial
Síntesis
artificial
Síntesis
Artificial
Carnes en conserva
Carnes en conserva, mermeladas,
confituras, jaleas, productos con huevos
Galletas, dulces, arroz aromatizado.
Chicles
3.3.11. Antioxidantes naturales
Al contrario de los antioxidantes sintéticos, los cuales se encuentran disponibles como
sustancias puras de composición perfectamente conocida y de aplicación directa, los
antioxidantes naturales se obtienen a partir de materias primas cuya composición varia con
diversos factores (manejo agronómico, variedad de la materia prima, condiciones climáticas,
grado de madurez, etc) y por lo tanto su contenido de sustancias bioactivas no es homogéneo
en el tiempo; se requeriría de determinaciones analíticas de cada lote para dosificar dicho
antioxidante antes de agregarlo al alimento. Además, al trabajar con antioxidantes naturales
se debe considerar que se trata de una mezcla de compuestos bioactivos y no bioactivos, y no
de sustancias puras.
La gran mayoría de los compuestos antioxidantes naturales que se usan actualmente en
la industria alimenticia no son estrictamente naturales, sino “idénticos al natural”. Esta nueva
denominación “idéntico al natural” significa que la estructura química del compuesto es la
misma que la del compuesto natural pero que dicho compuesto ha sido preparado por
49
síntesis, lo cual posibilita su presentación con un estado de relativa pureza, como cualquier
otro antioxidante sintético y su aplicación directa. A este grupo pertenecen aditivos como el
ácido ascórbico, los α-tocoferoles, los β-carotenos, etc (Ohlsson y Bengtsson, 2002).
Por otro lado muchos componentes con capacidad antioxidante son agregados como
ingredientes al alimento en su forma natural (o con pretratamientos mínimos: secado,
molido, etc) como es el caso de las hierbas (salvia, menta, romero, etc) y las especias
(orégano, nuez moscada, etc.), las cuales son reconocidas como sustancias GRAS
(“generally regarded as safe” o sustancias generalmente conocidas como inocuas). Especias
es el nombre dado a ciertos aromatizantes de origen vegetal, que se usan para sazonar los
alimentos. Técnicamente se considera una especia a las partes duras, como las semillas o
cortezas, de ciertas plantas aromáticas, aunque por similitud, muchas veces también se
engloba a las fragantes hojas de algunas plantas herbáceas, cuyo nombre real es hierbas. Al
ser ingredientes alimenticios aromáticos, su uso está restringido a alimentos que admitan ser
condimentados, tales como productos cárnicos y de confitería. El clavo de olor, el romero
(Rosmarinus officinalis L.) y la salvia (Salvia officinalis) resultan ser muy efectivos como
inhibidores de la rancidez oxidativa en productos cárnicos (Georgantelis et al., 2007;
Johnston et al., 2003; Nassu et al., 2003). En la tabla 3.5 se presenta un listado de los
principales antioxidantes naturales de uso industrial.
3.4. Breve descripción de algunos antioxidantes naturales
3.4.1.
Tocoferoles (vitamina E)
La vitamina E pertenece al grupo de las vitaminas liposolubles y está conformada por
un grupo de 8 vitámeros. Su estructura consta de 2 partes primarias: un anillo complejo
cromano y una larga cadena lateral. Los 8 vitámeros se dividen en 2 grupos fundamentales
según sea la saturación de la cadena lateral: los tocoferoles (TF; poseen cadena saturada) y
los tocotrienoles (TT; poseen una cadena insaturada con 3 dobles enlaces) (Rodríguez,
1997) (Figura 3.8).
Dentro de cada grupo los vitámeros difieren en el número y posición de los grupos
metilo enlazados al anillo fenólico, designándose como α, β, δ y γ (Figura 3.9). Su acción
antioxidante disminuye de la forma delta a la forma alfa (Cubero et al., 2002).
50
Tabla 3.5 Antioxidantes naturales
Nombre
Ácido láctico
Origen
Bacteriano
Ácido Lascórbico
Síntesis artificial
Ascorbato sódico
Ascorbato cálcico
Palmitato de
ascorbilo
Tocoferoles de
origen natural
Síntesis artificial
Síntesis artificial
Síntesis artificial
Tocoferol
sintético
Lecitina
Uso habitual en
Arvejas, pepinos, alimentos infantiles,
bebidas carbonatadas, salsas de ensaladas,
margarinas ligeras.
Bebidas frutales, productos congelados con
huevos, derivados de papa deshidratada,
jugos instantáneos deshidratados.
Comidas preparadas.
Embutidos.
Embutidos, extractos de caldo de pollo.
Extractos de aceite de soja, Postres preparados, aceites vegetales.
germen de arroz y trigo,
semillas de algodón
Embutidos.
Síntesis artificial
Granos de soja, maíz, maní Postres cremas, yogurt, leche en polvo,
chocolates,
margarina,
productos
de
y huevos
Lactato de sodio
Lactato de calcio
Ácido cítrico
Sal sódica de ác. Láctico
Sal cálcica de ác. Láctico
Citrato de sodio
Síntesis artificial
Citrato de calcio
Síntesis artificial
Ácido L (+)
tartárico
Tartrato de sodio
Síntesis artificial
Tartrato de
potasio
Síntesis artificial
Síntesis artificial
pastelería.
Quesos.
Pasteles rellenos, empanadas, merengues.
Frutas y hortalizas en conserva, sopas,
helados, pescado y mariscos congelados,
bollería.
Quesos loncha, helados, bebidas carbónicas,
vino, dulces.
Quesos,
confiterías,
vino,
bebidas
carbónicas.
Confitería, jaleas, mermeladas, bebidas
carbónicas.
Confitería, jaleas, mermeladas, bebidas
carbónicas.
Mermeladas, merengue de limón, pasteles
variados.
Inicialmente el radical tocoferilo se forma al ceder a otro radical el hidrógeno
perteneciente al grupo fenólico (Figura 3.10). Su actividad antioxidante se debe a su
estructura fenólica, la cual permite estabilizar al radical tocoferilo resultante por
deslocalización electrónica a lo largo del anillo del electrón desapareado (estabilización por
resonancia).
51
Figura 3.8. Estructuras
Est
químicas generales de los tocofer
feroles
Figura 3.9.
3 Estructura química de los tocoferoles
Los TF y TT son impo
portantes constituyentes de las membranas de los cloroplastos en
las plantas verdes. Los TT son
so productos menos ampliamente distribuido
idos en la naturaleza;
tienen una actividad biológi
ógica más baja que los TF y, por lo tanto,, menor
m
importancia
nutricional (Rodríguez, 1997)
7).
52
Constituyen el princi
ncipal antioxidante lipídico y en el orga
rganismo se hallan
mayoritariamente en la fase
se lipídica de las membranas y lipoproteínass donde
d
actúan como
bloqueadores de la reacción
ón oxidativa en cadena, inhibiendo la lipopero
eroxidación (LOO°).
También estabilizan a las RO
OS, como el radical superóxido y el oxígeno singlete.
si
Dentro de los agentes
es reductores (regeneradores) de la vitaminaa E se han descrito,
principalmente, el ascorbato
to (regenera a la vitamina E por vía no enzimá
mática) y el glutatión
(regenera a la vitamina E po
por vía enzimática, enzima: hidroperóxido glutatión
gl
peroxidasa
selenio dependiente).
Figura 3.10. Estabilizació
ción por resonancia de un radical libre de toc
tocoferol. Fuente:
Decker et al. (2000)
3.4.2.
Carotenoides
es
Constituidos por un grupo
gr
que comprende alrededor de 600 comp
mpuestos coloreados
lipofílicos producidos por veg
vegetales y algas. Algunos carotenoides dietari
arios importantes son
licopeno y β-caroteno, zeaxan
xantina, astaxantina, cantaxantina y luteína (Figura
(Fi
3.11). Pueden
encontrarse en sistemas acuos
uosos enlazados a proteínas.
53
Fig
Figura
3.11. Estructuras de carotenos
Los carotenos así como
mo también sus oxi-derivados (xantofilas: carot
rotenos que presentan
grupos oxidrilos) poseen un sistema de deslocalización electrónica (sis
sistema extendido de
dobles enlaces conjugados)) que
q los hace muy efectivos en la desactivaci
ación (“scavenging”)
de ROS y de otros agentes
es electrófilos, especialmente del oxígeno singlete
sing
y del radical
peroxilo. Además son efect
ectivos desactivando moléculas excitadas electrónicamente,
ele
las
cuales están involucradas en la generación tanto de radicales como del
d propio oxígeno
singlete.
En el caso de la desac
sactivación de radicales peroxilo, el mecanism
ismo antioxidante es
diferente al mecanismo antio
tioxidante de los compuestos fenólicos, ya que
ue el radical peroxilo
no es capaz de abstraer un hi
hidrógeno de los carotenoides. Se cree que el radical peroxilo se
une por adición al sistemaa cconjugado de la molécula del carotenoide,, luego
l
de la cual el
carotenoide pierde su activ
ctividad (Ec. 3.12a). El radical formado (R
(ROO-Car°) puede
reaccionar con otro radical
al para formar un producto estable (Ec. 3.12b),
3.1
atacar a otra
molécula de β-caroteno, o ata
atacar a un sustrato lipídico para generar otroo radical.
r
Por lo tanto
el β-caroteno puede actuar como
co
antioxidante o como prooxidante y suu ccomportamiento es
muy sensible a la presiónn de oxígeno. Los mecanismos propuestoss ppara bajas y altas
presiones de oxígeno se pres
resentan en las ecuaciones 3.12a-c y 3.12d, donde ROO° es el
radical peroxil-lipídico, y RO
ROO-Car° es un radical muy estabilizado porr rresonancia, es decir
poco reactivo; ROO-Car-OO
OOR es un precursor de oxidaciones con pro
productos finales no
radicales y ROO-Car-OO° es el radical peroxil-carotenoide.
54
3.12.a
3.12.b
3.12.c
3.12.d
Su efecto pro-oxidan
ante es observado ante presiones parciales
es de oxígeno altas
(mayores a 150 torr; Gil, 201
010a) mediante reacciones en cadena (Ec. 3.1
.12d) y conlleva a la
formación del radical peroxil
xil-carotenoide (Decker et al., 2000).
Los caroteonoides también
tam
pueden desactivar al oxígeno single
glete a través de un
atrapamiento (“quenching”)
”) ffísico o químico. El oxígeno singlete es el estado
e
del oxígeno
con mayor energia y se form
rma en sistemas biologicos por reaciones de fotosensibiliazación.
fo
En el “quenching” físico,, la
l energía del oxígeno singlete es transferid
erida directamente al
carotenoide produciendo oxíg
xígeno molecular en su estado basal y caroten
teno triplete excitado.
En este proceso el caroteno
no conserva su estructura química (es decirr regresa
re
a su estado
fundamental o basal disipand
ndo la energia en forma de calor) y puede volv
olver a actuar durante
varios ciclos sobre otras moléculas
m
de oxígeno singlete (Ec. 3.13a-bb). La inactivación
química (“quenching” quím
ímico) por reacción química ente el oxíge
ígeno singlete y los
carotenoides resulta ser de m
menor importancia, contribuyendo con meno
enos del 0,05% de la
tasa total de “quenching” (Ec.
Ec. 3.13c).
3.13a
3.13b
3.13.c
55
3.4.3.
Ascorbato
La vitamina C (o acido
ido o ascórbico) es una molécula hidrosoluble
le que
q en condiciones
fisiológicas se encuentra en su forma desprotonada (ascorbato). Una ve
vez que actúa como
antioxidante se convierte en dehidroascorbato y es nuevamente llevado
do a su forma activa
(reducida) por el glutatión reducido
red
(Figura 3.12).
El ascorbato es un exc
excelente agente reductor, ya que la pérdida
da de un electrón en
procesos redox con radicales
ales lipídicos da lugar a la formación del radical
rad
semi-dehidroascorbato, que es relativamen
ente estable debido a la deslocalización del ele
electrón desapareado.
Las propiedades antioxidante
ntes del ascorbato se basan en su capacidadd rreductora sobre los
peróxidos lipídicos, en su capacidad
cap
para quelar y neutralizar la acción catalítica
ca
de metales
y en su capacidad para ne
neutralizar ROS (especialmente oxígeno singlete
si
y
radical
superóxido) (Iglesias Neira,, 22009). También interactúa en la regeneración
ión de la forma activa
de la vitamina E.
Figura 3.12.
3
Algunas estructuras de la vitamina C
Dado que el ácido ascó
scórbico como tal no es soluble en grasas, see utilizan
u
también los
ésteres del ácido ascórbico co
con el ácido esteárico o con el ácido palmítico,
co, que sí lo son.
Además de su capacida
idad como antioxidante también puede actuarr como
c
pro-oxidante,
dependiendo de su concentrac
tración. Al ser un potente agente reductor es cap
capaz de reducir a los
iones férrico y cúprico, los cuales
cu
en su estado reducido (Fe+2 y Cu+1) catalizan
cata
en presencia
de oxígeno la formación dee radicales
ra
libres. Hay mucha controversia en la bibliografía hacer
acerca de cuál es la concent
entración a la cual el ascorbato actúa comoo pro-oxidante (Gil,
56
2010a). Su actuación como pro-oxidante ocurre si la concentración de ascorbato es baja y la
concentración de metales en el medio es elevada.
3.4.4.
Antioxidantes fenólicos
Los compuestos fenólicos son sustancias que presentan uno o más anillos aromáticos
(Figura 3.13), con al menos un sustituyente hidroxilo como elemento común en sus
estructuras moleculares, pudiendo incluir grupos funcionales como ésteres, metil ésteres,
glicósidos, etc (Duthie et al., 2000). Debido a su actividad antioxidante, representan uno de
los grupos de mayor interés desde un punto de vista tecnológico y nutricional (Berra et al.,
1995; Matos-Chamorro et al., 2010).
Figura 3.13. Ejemplos de estructuras fenólicas
La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos se atribuye a su facilidad para
ceder átomos de hidrógeno de un grupo hidroxilo aromático a un radical libre y a la
posibilidad de deslocalización de cargas en el sistema de dobles enlaces del anillo aromático
(Duthie et al., 2003) (Figura 3.14). Poseen además una estructura química ideal para captar
iones metálicos (principalmente hierro y cobre) y por tanto para inhibir la formación de
radicales libres a través de reacciones de Fenton (Rice-Evans et al., 1997).
Los compuestos fenólicos constituyen una de las principales clases de metabolitos
secundarios de las plantas, en las que desempeñan diversas funciones fisiológicas, tales
como el crecimiento y reproducción de la planta y procesos defensivos frente a patógenos,
depredadores o radiación solar (Friedman y Jürgens, 2000). Sus cantidades y tipos varían en
función de la especie vegetal y variedad, parte de la planta considerada (frutos, semillas,
hojas, tallos, etc.), horas de exposición solar, grado de madurez, condiciones de cultivo,
57
procesamiento y almacenamiento, etc. En los alimentos, los compuestos fenólicos
habitualmente se presentan conjugados con azúcares como la glucosa, galactosa, arabinosa,
ramnosa, xilosa, o los ácidos glucurónico y galacturónico. También pueden unirse a ácidos
carboxílicos, ácidos orgánicos, aminas y lípidos (Duthie et al., 2003).
Figura 3.14. Deslocalización de cargas de los compuestos fenólicos
3.4.4.1.
Clasificación general de compuestos fenólicos
Se han descripto más de 8000 estructuras fenólicas diferentes (Gil, 2010b). Dada su
diversidad estructural, no es posible una clasificación perfecta y exhaustiva. Se pueden
clasificar de varias maneras; una de las más usuales los clasifica en dos grandes grupos:
flavonoides y no flavonoides (Tabla 3.6).
A continuación se describen los principales grupos de compuestos fenólicos presentes
en los alimentos vegetales.
a-No flavonoides: Los compuestos fenólicos no flavonoides incluyen dos grandes
familias: los ácidos fenólicos y los estilbenos.
Ácidos fenólicos: Los ácidos fenólicos se caracterizan por la presencia de un solo
anillo bencénico en su estructura. A su vez se subdividen en dos grupos: los derivados del
ácido p-hidroxibenzoico y los derivados del ácido cinámico (Figura 3.15 y Tabla 3.7).
58
Tabla 3.6 Clasificación de compuestos fenólicos
No
Ácidos fenólicos y
Derivados del ácido benzoico
sus derivados
Derivados del ácido cinámico
flavonoides
Estilbenos
Flavanoles
Flavonoles
Flavonas
Compuestos
fenólicos
Flavononoles
Flavonoides
Antocianidinas
Flavanonas
Isoflavonas
Leucoantocianidinas
Taninos
Figura 3.15. Estructuras químicas de los ácidos fenólicos
Tabla 3.7 Estructura química de los ácidos fenólicos
Principales ácidos
hidroxibenzoicos
Ác. phidroxibenzoico
Ác. gálico
Ác. siríngico
R1
R2
Principales ácidos
hidroxicinámicos
R1
R2
H
H
Ác. p-cumárico
H
H
OH
OH
Ác. Cafeico
OH
H
Ác. Ferúlico
OCH3
H
OCH3 OCH3
Ác. protocatecuico
H
OH
Ác. vaníllico
H
OCH3
59
Los ácidos benzoicos o derivados del ácido p-hidroxibenzoico tienen una estructura
básica C6-C1. Los principales son los ácidos gálico, salicílico, p-hidroxibenzoico,
protocatécuico, vaníllico y siríngico. Generalmente se presentan de forma conjugada en los
vegetales, aunque pueden ser detectados en forma libre en algunas frutas o tras su liberación
como consecuencia del procesamiento. El ácido gálico se puede encontrar conjugado como
tal o como sus dímeros (ácido elágico), trímeros (ácido tergálico) o tetrámeros (ácido
galágico), los dos últimos menos frecuentes. Generalmente los contenidos en estos ácidos
son bajos a excepción de las frutas rojas (Manach et al., 2004).
Los ácidos de la serie cinámica, los ácidos cinámicos, tienen una estructura básica C6C3 y raramente se hallan en su forma libre, en general se presentan predominantemente en
forma esterificada con ácido quínico, tartárico o glucosa (ésteres hidroxicinámicos): así el
ácido cafeico se halla esterificado con el acido quínico para dar lugar a los ácidos:
clorogénico, isoclorogénico, neoclorogénico y criptoclorogénico (Figura 3.16) (Castillo
García y Martínez Solís, 2007). Los ácidos cinámicos más comunes son los ácidos cafeico,
ferúlico, sinápico y p-cumárico. El ácido cafeico, libre o esterificado, constituye el ácido
fenólico más abundante en muchas frutas (Manach et al., 2004).
Figura 3.16. Estructuras químicas del ácido quínico, de ácidos hidroxicinámicos y de
mono-ésteres hidroxicinámicos
60
Estilbenos: Se caracter
terizan por poseer un esqueleto básico de 14 carbonos
car
(C6-C2-C6)
conformado por dos cicloss bencénicos unidos generalmente por una ccadena de etanol o
eventualmente etileno. Su estructura
e
química general se presenta enn la
l figura 3.17. Su
distribución en alimentos veg
vegetales no es muy amplia (Scalbert et al., 200
2000). Los estilbenos
con mayor interés nutriciona
onal son el resveratrol (3, 5, 4’-trihidroxiestilb
tilbeno) y el piceido
(resveratrol-3-O-b-D-glucósi
sido), presentes en uvas y vinos (Figura 3.17 y Tabla 3.8).
Figuraa 3.17.
3
Estructura química de los estilbenos
Tabla 3.88 Estructuras de los principales estilbenos
Principales
les estilbenos
R1
R2
R3
Resve
sveratrol
OH
H
OH
Astrin
tringina
O-glucosa
OH
OH
Picet
cetanol
OH
OH
OH
b-Flavonoides
Este gran grupo supone
ne la mitad de los compuestos fenólicos prese
sentes en las plantas,
conformados por una gran diversidad
div
de compuestos, siendo todos compu
puestos polifenólicos
y solubles en agua. Los flavo
vonoides se encuentran en los tejidos vegetales
les como flavonoides
libres o unidos a azúcares formando
form
glicósidos (la mayoría de las veces,, co
como O-glicósidos),
como sulfatos y algunas vece
ces como dímeros y polímeros. Los azúcares que
qu aparecen unidos
con más frecuencia a las geni
eninas (estructura no glucídica, también llamad
ada aglicona) son Dglucosa, D-galactosa, L-ram
amnosa, L-arabinosa, D-xilosa y D-glucurónic
nico. Los glicósidos
pueden ser de dos clases:: ccon los carbohidratos ligados a través de átomos
á
de oxígeno
(enlace hemiacetal) como O
O-glicósidos; o con los carbohidratos ligados
os a través de enlaces
C-C, como C-glicósidos. Las
as antocianinas por su parte se encuentran com
mo sales. Muy pocas
veces se encuentran varias clases
cla de flavonoides en un mismo tejido veget
getal.
Su estructura se caracte
acteriza por un esqueleto de 15 carbonos (C66-C3-C6) de tipo 2fenil-benzopirona (Figura 3.1
.18); es decir formada por dos anillos bencénic
nicos (A y B) ligados
61
a través de un anillo hetero
rocíclico C de pirano o pirona (si tiene unn doble
d
enlace en la
posición 4; Figura 3.19). Los
os átomos de carbono en los anillos C y A see numeran
n
del 2 al 8,
y los del anillo B desde el 2 al
a 6 (Figura 3.20). Esta estructura básica perm
rmite una multitud de
patrones de sustitución (es decir
de múltiples adiciones de grupos funcionale
ales) y variaciones en
el anillo C.
Figura
ra 3.18. Estructura de 2-fenil-benzopirona
Figur
ura 3.19. Estructura del anillo de pirano
.
oides
Figura 3.20.. Numeración de los anillos de los flavonoid
Tal como se muestra en la figura 3.21, los flavonoides pueden clas
lasificarse en función
de su estructura química en:
Flavanoles: poseen unn grupo
g
hidroxilo en posición 3 del anillo C.. Ej
Ejemplo: catequina.
Flavonoles: poseen un grupo carbonilo en posición 4, un grupo -OH
OH en posición 3 del
anillo C y un doble enlace ent
entre los carbonos 2 y 3 del anillo C. Ejemplo:
o: quercetina.
q
62
Figura 3.21. Estructuras de flavonoides y ejemplos
63
Un derivado frecuente
nte de la quercetina es la rutina (Figura 3.2
.22); químicamente
agrupada como flavonol glicosidado
glic
cuya glicona es un disacárido red
reductor denominado
rutinosa, formado por una ra
ramnosa (6-desoxi-L-manosa) unida a una glucosa
glu
mediante un
enlace glicosídico de tipo (1
(1β-α6) y cuya aglicona o genina es un flavonol
flav
denominado
quercetina.
Figur
gura 3.22. Estructura química de rutina
Flavonas: poseen un grupo
g
carbonilo en posición 4 del anillo C y carecen del grupo
hidroxilo en posición C3. Eje
jemplo: luteolina.
Flavononoles: poseen
en un grupo carbonilo en posición 4 y unn grupo oxidrilo en
posición 3 del anillo C y noo presentan
p
doble enlace entre los carbonos 2 y 3 del anillo C.
Flavanonas: poseen un grupo carbonilo en posición 4 del anillo C, carecen del grupo
hidroxilo en posición C3 y no presentan el doble enlace entre los carbonos
os 2 y 3 del anillo C.
Isoflavonas: poseen el anillo bencénico B en la posición 3 del anill
illo central C, en vez
de tenerlo en la posición 2. Además poseen un doble enlace entre loss ccarbonos 2 y 3 del
anillo C. Existen 230 tipos de isoflavonas.
Antocianidinas: posee
een un grupo hidroxilo en posición 3 del anillo
ani C pero además
poseen un doble enlace entre
ent los carbonos 3 y 4 del anillo C. Enn las antocianidinas
glicosidadas, los azúcares se unen generalmente al hidroxilo en posiciónn 3 de la genina. Con
menos frecuencia puede apar
arecer unida en posición 5 ó 7. Los azúcaress ppueden ser glucosa,
galactosa, ramnosa o arabinos
nosa, y pueden presentar diversas acilaciones .
64
Leucoantocianidinas: poseen estructura equivalente a la de los flavanoles pero con un
grupo hidroxilo adicional en la posición 4 del anillo C (Gil, 2010b).
Taninos: representados por los polímeros fenólicos de pesos moleculares
comprendidos entre 500 y 3000 daltons. Además de presentar propiedades típicas de
polifenoles, precipitan a los alcaloides, y a ciertas proteínas como la gelatina. Según si la
polimerización es entre moléculas elementales y otras, se tienen los taninos hidrolizables y
los taninos condensados. El nombre de taninos condensados tiende a ser sustituido en la
actualidad por el de procianidinas o proantocianidinas según liberen, respectivamente,
antocinidinas o cianidinas por hidrólisis ácida (Gil, 2010b).
3.5. Polifenoles en yerba mate
Los compuestos polifenólicos presentes en los extractos de yerba mate se hallan
representados mayoritariamente por compuestos del grupo de los ácidos hidroxicinámicos,
principalmente derivados de ácidos hidroxicimanoilquínicos (Figura 3.23, Tabla 3.9): iMono-ésteres de ácido quínico con ácido cafeico: específicamente isómeros del ácido
cafeoilquínico: ácido 5-o-cafeoilquínico (ácido clorogénico), ácido 3-o-cafeoilquínico (ácido
neoclorogénico) y ácido 4-o-cafeoilquínico (ácido criptoclorogénico); ii- Di-ésteres de ácido
quínico con ácido cafeico: específicamente isómeros del ácido di-cafeoilquínico
representados por los ácidos
3,4 dicafeoilquínico, 3,5 dicafeoilquínico (ácido
isoclorogénico) y 4,5 dicafeoilquínico y es posible pero no está confirmada la presencia del
ácido 1,5 dicafeoilquínico (cinarina) (Bravo y Angus, 2007; Cardozo et al., 2007; Carini et
al., 1998; Filip et al., 2001; Heck y Mejía Gonzalez, 2007).
Entre los isómeros hidroxicimanoilquínicos minoritarios se encuentran algunos
isómeros del ácido feruloilquínico, y del ácido p-coumarilquínico; y no se reportó ácido
cafeico libre.
En promedio según Bravo y Angus (2007), los isómeros del ácido cafeoilquínico
representan el 53 % del contenido de polifenoles totales (CPT) en yerba mate elaborada
mientras los isómeros del ácido di-y tri-cafeoilquínico representan el 37,5% representando
en forma conjunta el 90 % del CPT y aproximadamente 77 mg por g de materia seca. La
gran mayoría de los estudios de yerba mate se basan en yerba mate elaborada.
65
El grupo de los ácid
cidos hidroxibenzoicos únicamente se halla
lla representado por
derivados del ácido gálico
co y del ácido siríngico, reconocidos porr ssu baja capacidad
antioxidante.
A la presencia de loss m
mencionados isómeros del ácido hidroxicin
cinamoilquínico se le
atribuye una probada activida
idad antioxidante in vitro (Bravo y Angus, 2007
007; Chandra y Mejía
Gonzalez, 2004), igual o superior a la de sustancias reconocidas
as por su actividad
antioxidante como el ácidoo ascórbico
a
y la vitamina E. Según Liu et al.
al (2009), entre los
compuestos del grupo de loss ácidos
á
hidroxicinámicos, los derivados del ác
ácido cafeico son los
más antioxidantes de la serie,
ie, tanto en sistemas biológicos como alimentic
ticios.
Figura 3.23. Estruc
ructura de los principales di-ésteres hidroxic
xicinámicos
Tabla 3.9 Estructura de los
lo principales compuestos di-ésteres hidrox
oxicinámicos (CA:
ácido caféico)
Principales
es compuestos
R1
R2
R3
Ácido 3,4 dicafeoilquínico
dic
CA
CA
H
Ácido 3,4 dicafeoilquínico
dic
CA
H
CA
Ácido 3,4 dicafeoilquínico
dic
H
CA
CA
Entre los flavonoidess presentes
p
se destacan dos grupos de flavonole
oles glicosidados: los
derivados de la quercetina (rutina)
(ru
y los derivados de kaempferol, represe
esentando el 5 % del
CPT (Bravo y Angus, 2007;; C
Carini et al., 1998; Cardozo et al., 2007; Filip
lip et al., 2001).
Es posible que los com
ompuestos fenólicos conjuntamente con las xa
xantinas y saponinas
contribuyan al sabor del mate
ate (Schneider et al., 2006). En el caso del café
fé se sabe que uno de
los principales compuestoss re
responsables de la astringencia es el ácido clorogénico
clo
mientras
que el ácido cafeico contribuy
buye al sabor amargo (Variyar et al., 2003).
66
SECCION III
DESARROLLO
67
CAPITULO 4
“Adaptación de técnicas analíticas”
68
4.1. INTRODUCCIÓN
4.1.1.
Complejidad en la estandarización de una metodología universal
En los últimos años se publicaron varias revisiones sobre métodos de medición de
capacidad antioxidante (CAO) (Joon-Kwan y Takayuki, 2009; Niki, 2002; Prior et al., 2005;
Sanchez-Moreno, 2002). No existe un método simple y universal para cuantificar la CAO
con precisión (Prior et al., 2005) dado que el tema de antioxidantes es un tópico de alta
complejidad y cada alimento particular es una matriz compleja en la que generalmente se
hallan involucrados sistemas multi-fases.
Dentro de un mismo sistema alimenticio, un determinado antioxidante puede actuar
por múltiples mecanismos o por mecanismos específicos diferentes según sean las
condiciones del medio de reacción (matriz alimenticia + condiciones ambientales) y además
su respuesta no es la misma para todas las fuentes oxidantes. Un ejemplo citado por Prior et
al. (2005) lo constituyen los carotenos, los cuales, comparados con los (poli)fenoles, son
pobres antioxidantes ante radicales peróxidos pero son excepcionales agentes atrapadores
(“quenching agents”) de oxígeno singlete (ver apartado 3.4.2).
Hay quienes sostienen que el enfoque in vitro es insuficiente, siendo indispensable
realizar evaluaciones biológicas.
Entre las diversas propuestas que apuntan a solucionar este problema, una de las que
goza de bastante aceptación es la de combinar varios ensayos in vitro y crear luego algún
tipo de escala que refleje con mayor precisión el poder antioxidante real de las sustancias o
productos (Sun, 2007).
4.1.2.
Mecanismos de reacción de los antioxidantes
Según revisiones relacionadas (Huang et al., 2005; Prior et al., 2005), un antioxidante
puede actuar mediante dos principales mecanismos principales: de transferencia de átomos
de hidrógenos o protones (HAT, Hydrogen Atom Transfer, por sus siglas en inglés) (Ec. 4.1)
y de transferencia de electrones (SET, Single Electron Transfer, por sus siglas en inglés) (Ec.
4.2a - 4.2d).
En los métodos basados en la transferencia de hidrógeno se mide la habilidad de un
compuesto antioxidante (AH) de atrapar radicales libres por donación de un átomo de
69
hidrógeno, basándose en competiciones de tipo cinéticas. Estos métodos generalmente
involucran a una sustancia antioxidante, a un generador de radicales libres y a una sustancia
oxidable (Huang et al., 2005). De acuerdo con Prior et al. (2005), las reacciones que
involucran transferencia de átomos de hidrógeno son independientes del solvente y del pH y
por lo general son rápidas; además la presencia de agentes reductores incluidos los metales,
representa una complicación para este tipo de métodos.
X° + AH → XH + A°
4.1
X° + AH → X + AH°
AH°
-.
4.2a
A° + H O°
4.2b
X +H O → XH + H O
4.2c
M III + AH → AH + M II
4.2d
Los métodos basados en la transferencia de electrones detectan la habilidad de una
sustancia para transferir un electrón y provocar la reducción de un compuesto (metálicos,
carbonílicos y radicales). Las reacciones basadas en la transferencia de electrones son
generalmente lentas y requieren tiempo para lograr el estado estable; por esta razón la
cuantificación de CAO se realiza por lo general en porcentajes de productos más que por
consideraciones cinéticas (Prior et al., 2005).
Los mecanismos HAT y SET ocurren en simultáneo en todos los casos, con la balanza
determinada por el pH y la estructura del compuesto antioxidante (Prior et al., 2005). Las
condiciones en que predominan cada tipo de mecanismos se detallan en la tabla 4.1.
Tabla 4.1. Condiciones para cada tipo de mecanismos de reacción
Mecanismo
prevalente
∆ potencial de
ionización
Energía de disociación de
enlace del grupo donador de H
HAT
< - 36 Kcal/mol
~ - 10 Kcal/mol
SET
> - 45 Kcal/mol
Fuente: Prior et al. (2005).
70
4.1.3.
Pruebas químicas in vitro de medida de la actividad antioxidante en
sistemas alimenticios
Existen numerosos métodos de medición de la actividad antioxidante total en muestras
biológicas y alimentos; los mismos difieren en términos de sustratos, patrones, fuentes de
radicales libres, condiciones de reacción y metodología de cuantificación. Generalmente se
basan en la captación o secuestro de radicales libres generados en la mezcla de reacción
mientras que otros están basados en la reducción de iones metálicos tales como el Fe(III) o el
Cu(II) (Prior et al., 2005; Sánchez-Moreno, 2002; Schlesier et al., 2002). Los generadores de
radicales peroxilo más usados son los compuestos azo termolábiles: i- 2,2´-azobis (2amidinopropano)
dihidrocloruro
(AAPH)
y
ii-el
azo-compuesto
2,2'-azobis-(2-
amidinopropano) hidrocloruro (ABAP), ambos solubles en agua y el 2,2´-azobis (2,4dimetilvaleronitrilo) (AMVN), liposoluble; los cuales por calentamiento generan los
radicales libres en cuestión a una velocidad constante.
Como se puede apreciar en muchos estudios relacionados a la temática, los datos a
menudo son cruzados con el contenido de polifenoles totales de las muestras, determinados
como equivalentes de ácido gálico, ya que la respuesta de este compuesto representa la
respuesta media de los principales compuestos polifenólicos en frutas y vegetales (Georgé et
al., 2005).
Sin embargo, cada vez es más frecuente recurrir a técnicas de separación acopladas a
sistemas de detección como el arreglo de diodos (DAD) o la espectrometría de masas (LCMS). Dichas técnicas permiten medir de mejor manera la actividad antioxidante y asignarla a
un grupo específico de compuestos (Bravo y Angus, 2007).
En las siguientes secciones se describen brevemente algunos de los métodos más
comúnmente utilizados para la medición de la CAO in vitro de compuestos químicos,
alimentos y muestras biológicas puntualizando el mecanismo de reacción, el tipo de radical
evaluado, y sus principales ventajas y desventajas (Tabla 4.2). Estos métodos no son
alternativos, sino más bien complementarios.
71
Tabla 4.2 Comparación de métodos para medición de capacidad antioxidante
Ensayo
Simplicidad
Equipos
Mecanismo
Relevancia
biológica
ORAC
++a
---
HAT
+++
TRAP
---b
---
HAT
+++
FRAP
+++
+++
SET
--
CUPRAC
+++
+++
SET
TEAC
+
+++
SET
-
DPPH
+
+++
SET
-
a
+, ++, +++ = nivel de puntuación positiva de la característica;
nivel de puntuación negativa de la característica.
4.1.3.1.
b
-, --, --- =
Métodos basados en mecanismos de transferencia de átomos de
hidrógeno
Los métodos basados en mecanismos de transferencia de átomos de hidrógeno por lo
general consisten en poner en contacto un generador sintético de radicales más moléculas
oxidables que actúen como sonda, más un antioxidante.
Entre los métodos más usados, basados en un mecanismo de tipo HAT, se destacan los
métodos: i- método de la capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC), iimétodo del potencial antioxidante total (TRAP) y iii-método de decoloración del β-caroteno.
Los dos primeros miden la habilidad de un antioxidante para secuestrar radicales peroxilos
por transferencia de un átomo de hidrógeno.
Capacidad de absorción de radicales de oxígeno
Este método conocido como ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity, por sus
siglas en inglés) consiste en mezclar un sustrato oxidable fluorescente con algún generador
de radicales peroxilos (generalmente compuestos iniciadores azo, por ejemplo el AAPH) y
medir la pérdida de fluorescencia. La intensidad de la fluorescencia disminuye a medida que
avanza la oxidación. Los antioxidantes protegen al compuesto fluorescente de la oxidación.
Los tiempos de monitoreo usuales rondan los 35 min luego del agregado del generador de
radicales. El grado de protección antioxidante se mide en un fluorímetro disponible
comercialmente. La capacidad antioxidante se calcula como el área entre las dos curvas de
72
decaimiento de la fluorescencia (intensidad de fluorescencia vs tiempo) (con y sin
antioxidante; Figura 4.1), y los resultados de este método suelen ser expresados en unidades
de Trolox equivalentes (TE).
Figura 4.1. Actividad antioxidante de una muestra mediante el ensayo ORAC
expresada como el área neta debajo de la curva (AUC). (Fuente: adaptado de Prior et
al. (2005))
Este método ha sido adoptado por el Departamento Federal de Agricultura de
Norteamérica para medir el potencial antioxidante total de alimentos y suplementos
nutricionales. Con el tiempo se han propuesto varias modificaciones y variantes, como por
ejemplo el método ORAC-EPR (Kohri et al., 2009), que utiliza la resonancia paramagnética
electrónica.
Entre los sustratos oxidables fluorescentes más usados están la fluoresceína (FL; 3´,6´dihidroxispiro [isobenzofuran-1[3H],9´[9H]-xanten]-3-ona)
(ORAC-FL), el rojo de
pirogalol (ORAC-PGR) o la diclorofluoresceína (H2DCF-dA; diacetato de 2´,7´diclorodihidrofluorescein) (ORAC-H2DCF-dA). Inicialmente se usaba como sustrato
oxidable una proteína denominada ficoeritrina (PE) pero la misma presenta ciertos
inconvenientes: varía de lote a lote, no es fotoestable y se puede decolorar tras su exposición
a una luz de excitación, es capaz de interaccionar con polifenoles dando lugar a valores
73
erróneos; actualmente es reemplazada por la FL la cual no interacciona con polifenoles, es
fotoestable y reduce los costos del experimento.
En el ensayo ORAC-FL, los tiempos de inducción están fuertemente influenciados por
el número de grupos fenólicos presentes en la muestra, mientras que en el ensayo ORACPGR, dichos tiempos prácticamente no se observan y el decaimiento de la absorbancia se ve
influenciado principalmente por la reactividad de los fenoles de la muestra. Recientemente,
se ha planteado que ambos índices ORAC (FL y PGR) son complementarios y su relación es
un mejor indicador de la calidad promedio de los antioxidantes de una muestra (Poblete et
al., 2009).
Este método es especialmente útil para alimentos, suplementos alimentarios y sistemas
biológicos que contienen varios ingredientes con capacidad antioxidante rápida y lenta, y
puede ser adaptado para medición de antioxidantes tanto hidrofílicos como lipofílicos
variando el generador de radicales y el solvente (Davalos et al., 2004; Huang et al., 2002;
Prior et al., 2003). Además en él se han introducido modificaciones que permiten medir el
efecto de antioxidantes sobre otras especies reactivas del oxígeno y nitrógeno dando origen a
variantes para los radicales hidroxilo (HORAC), peroxinitrito (NORAC) y anión superóxido
(SORAC).
Numerosos estudios consideran que ciertos ensayos como el ORAC poseen ventajas
comparativas en relación al resto (Ou et al., 2001). Es un método que actualmente se
encuentra automatizado aunque requiere de equipo relativamente sofisticado y es muy
sensible a la temperatura.
Potencial antioxidante total
Este método conocido como TRAP (Total Radical-Trapping Parameter, por sus siglas
en inglés) fue desarrollado para medir el estado antioxidante del plasma humano contra
radicales peroxilo.
Mide la capacidad de un antioxidante de interferir en la reacción entre radicales
peroxilos (ROO°) y un sustrato oxidable (usualmente: el compuesto fluorescente Rficoeritrina, o el compuesto ABTS (ácido 2,2-azinobis-(3-etilbenzotioazolín-6-sulfónico));
hidrosoluble y químicamente estable; cuyo radical catiónico es cromógeno.
74
La oxidación y su inhibición se miden mediante monitoreo de absorbancia, monitoreo
de fluorescencia (Pineda Alonso et al., 1999) o por monitoreo de absorción de oxígeno (u
oxígeno consumido) (Wayner et al., 1985), dependiendo de cuál sea el sustrato oxidable
empleado.
La capacidad antioxidante se determina de tres maneras posibles: i-como el tiempo
necesario para consumir todo el antioxidante, ii-como porcentaje de disminución de la
reacción a un determinado tiempo o iii-como el período de inducción, en el que la oxidación
se inhibe, usando Trolox como estándar.
No hay uniformidad en cuanto al tiempo de detección (end-point), al sustrato oxidable
ni al método de monitoreo; por ende las comparaciones son impracticables. Cuando la
reacción se basa en el tiempo de inducción (tiempo lag) existe el inconveniente de que no
todos los antioxidantes presentan un tiempo lag evidente, y en estos casos se subestimaría la
CAO de dichos antioxidantes ya que se ignora el efecto del antioxidante fuera de dicho
tiempo lag.
Este método ha sido aplicado a alimentos y extractos vegetales (Pellegrini et al., 2003;
Pineda Alonso et al., 1999).
Método de decoloración de crocina o del β-caroteno
Los carotenoides se pueden blanquear por tres vías principales: i-autoxidación, iioxidación inducida por calor o luz
o iii- oxidación inducida por radicales peroxilos
(generados por el generador AAPH o por la oxidación de lípidos). Esta decoloración (o
blanqueo) puede ser prevenida o disminuida por el agregado de algún compuesto
antioxidante capaz de donar átomos de hidrógeno para neutralizar radicales libres (Ec. 4.3a y
4.3b).
crocina_H naranja + ROO° → crocina° decolorado + ROOH
crocina_H naranja + ROO° + AH → crocina° decolorado + ROOH + A° + H
4.3a
4.3b
Se destacan dos métodos de decoloración: el método CBA (Crocin Bleaching Assay,
por sus siglas en inglés) o el β-CBA (β-Carotene Bleaching Assay); se diferencian en el
sustrato oxidable utilizado (crocina y β-caroteno respectivamente).
75
Se recomienda el uso de crocina como sustrato oxidable ya que su decoloración se da
únicamente por vía de oxidación por radicales libres; mientras que el β-caroteno que
usualmente se usa como sustrato oxidable en este método puede decolorarse por varios
mecanismos alternativos, lo cual complica la interpretación de resultados.
Este método mide la capacidad de un antioxidante para proteger
a un derivado
carotenoide natural (crocina) del blanqueo por radicales libres empleando como generador
AAPH y monitoreando su decoloración a 443 nm.
Es un método simple y rápido (Bors et al., 1984; Fukumoto y Mazza, 2000), no
requiere equipos sofisticados, pero posee la desventaja de que la crocina no está disponible
comercialmente y por ello debe ser extraída. La crocina es una mezcla de pigmentos
naturales extraídos del azafrán y por ende está sujeta a variaciones lote-a-lote, lo cual limita
su aplicación como método cuantitativo industrial. No hay estándares en la forma de
expresar los resultados ni en el modo de cálculo de las cinéticas.
4.1.3.2.
Métodos basados en mecanismos de transferencia de electrones
Los métodos basados en mecanismos de transferencia de electrones por lo general siguen la
siguiente ecuación genérica:
Entre los métodos más usados basados en este mecanismo se destacan los métodos FRAP y
CUPRAC.
Método del poder antioxidante del ion férrico
También conocido como ensayo FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power, por sus
siglas en inglés). Fue desarrollado por Benzie y Strain (1996) para cuantificación de
capacidad antioxidante en plasma; posteriormente fue aplicado a muestras botánicas. El
método determina la capacidad de la muestra para reducir iones ferricos presentes en la
molécula tripiridil-s-triazina (TPTZ) a su forma ferrosa (producto intensamente coloreado,
593 nm); se realiza en condiciones de pH ácido (3,6) para asegurar la solubilidad del Fe+3.
Según Prior et al. (2005) éste método no detecta capacidad antioxidante de compuestos que
actúen por mecanismo HAT de neutralización de radicales libres. Es un método sencillo,
76
fácilmente automatizable y generalmente rápido (4-8 min para completar la reacción),
aunque en algunos casos sobre todo en muestras ricas en polifenoles se describieron
reacciones más lentas (desde 30 min hasta varias horas para completar la reacción) (PuertasMejía et al., 2009; Pulido et al., 2000) y puede presentar interferencias ante la presencia de
ácido cítrico y azúcares.
Método del poder antioxidante del ion cúprico
Este método posee dos variantes: el ensayo CUPRAC y el ensayo Bioxytech AOP490. Ambos métodos consisten en una modificación del método FRAP, al reemplazar el ion
férrico por iones cúpricos. El método determina la capacidad de la muestra para reducir los
iones cúpricos presentes en las moléculas de neocuproína (2,9-dimetil-1,10-fenantrolina) en
el ensayo CUPRAC o de batocuproína en el ensayo AOP-490, a iones cuprosos por
formación de un complejo cromóforo de Cu+1 con máximos de absorción a 450 nm
(CUPRAC) o 490 nm (AOP-490). El ensayo se ha adaptado para al análisis de antioxidantes
hidrofílicos y lipofílicos (Apak et al., 2010; Celik et al., 2007) y en la determinación de la
capacidad captadora de radical hidroxilo (Bektasoglu et al., 2008).
Este ensayo ha sido empleado para la determinación de la capacidad antioxidante de
polifenoles, ácido ascórbico y tioles (Apak et al., 2004; Cekic et al., 2009). El ensayo AOP490 requiere solo 3 min de reacción mientras que la duración del ensayo CUPRAC varía
desde pocos minutos para el caso de compuesto sencillos como los ácidos gálico, ascórbico o
la quercetina hasta 30-60 min para moléculas más complejas (Prior et al., 2005), por lo que
requiere la determinación experimental del tiempo de reacción en el caso de mezclas
complejas de antioxidantes.
Los valores obtenidos por el ensayo CUPRAC son considerablemente mayores a los
obtenibles con el ensayo FRAP (Prior et al., 2005). Frente al ensayo FRAP, este ensayo
presenta menores interferencias para todos los tipos de antioxidantes incluyendo a los tioles;
además las reacciones cinéticas del cobre son más veloces que las del hierro (Prior et al.,
2005). Comparada con técnicas de detección HPLC/electroquímica, este método resulta una
alternativa conveniente, eficiente y menos costosa.
77
4.1.3.3.
Métodos basados en mecanismos HAT y SET
Entre los métodos más usados basados en mecanismos combinados HAT y SET se destacan
los métodos TEAC-ABTS, DPPH y Folin-Ciocalteu.
Capacidad antioxidante expresada en equivalentes Trolox (Ensayo TEAC-ABTS)
Este método es conocido comúnmente por método TEAC (Trolox Equivalent
Antioxidant Capacity, por sus siglas en inglés) o por método del secuestro del radical
catiónico de ABTS (ácido 2,2-azinobis-(3-etilbenzotioazolín-6-sulfónico); se basa en la
captación o secuestro del radical catión ABTS°+ (que pasa a ABTS, no coloreado) por parte
de los antioxidantes monitoreado por la decoloración del medio (inhibición de la
absorbancia).
El radical catiónico del ABTS (ABTS°+) posee una coloración verde-azulada con un
máximo de absorción a 415 nm y una serie máximos secundarios de absorción a 645, 660,
734, 815 y 820 nm (Sánchez-Moreno, 2002; Re et al., 1999). Dependiendo de la variante del
método TEAC utilizada se emplean distintas longitudes de onda, aunque las más frecuentes
son 415 y 734 nm (Prior et al., 2005).
Para el desarrollo del método se suelen emplear dos estrategias: i-inhibición y iidecoloración. En la estrategia de inhibición los antioxidantes se añaden previamente a la
generación del radical ABTS, y se determina la inhibición en la formación del radical,
evidenciada por el retraso en la aparición de la coloración verde-azulada (también conocida
como estrategia de la fase lag). En esta estrategia la CAO se cuantifica según a la duración
de dicha fase lag. En la estrategia de decoloración, los antioxidantes se añaden una vez que
el ABTS°+ se ha formado y se determina entonces la disminución de la absorbancia debida a
la reducción del radical, es decir a la decoloración de éste (Sánchez-Moreno, 2002). Cuando
se emplea esta estrategia, la CAO se cuantifica como porcentaje de inhibición de la
absorbancia. El agregado del antioxidante luego de la generación del radical catiónico
previene interferencias en la formación de dicho radical y evita la sobreestimación de la
CAO (Sánchez-Moreno, 2002).
El radical ABTS°+ puede ser generado: i-por reacción química (reacción química entre
el ABTS y persulfato de potasio, dióxido de manganeso o cloruro de 2,2’-azo-bis-(2amidinopropano) (ABAP); ii-por reacción enzimática (incubando el ABTS con peróxido de
78
hidrógeno y con metamioglobina o hemoglobina). La generación del radical ABTS°+ por
reacción química generalmente requiere largos períodos de incubación (mayor a 16 h en el
caso del persulfato de potasio) (Leong y Shui, 2002; Prior et al., 2005) o altas temperaturas
(60ºC en el caso del ABAP) (Prior et al., 2005).
La denominación de este método como método TEAC deriva del patrón que se suele
emplear, el Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametil-cromán-2-carboxílico), un análogo
sintético hidrosoluble de la vitamina E. Los resultados del ensayo se expresan como
equivalentes a Trolox, es decir la concentración de una solución de Trolox que posee un
potencial antioxidante equivalente a 1 mmol/L de la solución de la sustancia en estudio.
Como el radical ABTS°+ es soluble en agua y en soluciones etanólica acidificadas, este
método resulta apto para determinar la capacidad antioxidante de compuestos tanto
hidrofílicos como lipofílicos (Sánchez-Moreno, 2002).
Es un método aplicable al estudio de antioxidantes puros o en extractos alimenticios
(Leong y Shui, 2002).
Este método, ensayado como método de inhibición y generando el radical ABTS°+ por
reacción enzimática, es un método ampliamente utilizado en ensayos clínicos, al ser rápido,
sencillo y automatizable. Incluso existen kits comercializados por Randox Laboratories Ltd.
(Reino Unido) para su uso.
Los valores obtenidos por el ensayo TEAC son comparables a los valores del ensayo
CUPRAC en compuestos polifenólicos (Prior et al., 2005).
Reducción del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (Ensayo DPPH)
Este método se basa en la habilidad del antioxidante de neutralizar al radical libre
DPPH°, el cual se reduce tras aceptar un átomo de hidrógeno.
El radical DPPH° es un radical orgánico nitrogenado, intensamente coloreado
(púrpura), estable y disponible comercialmente. No requiere ser generado in situ como el
radical ABTS°+.
79
El ensayo puede ser monitoreado por espectroscopía de resonancia paramagnética
electrónica (EPR, Electron Spin Resonance, por sus siglas en inglés) pero la forma más
frecuente de realizar el ensayo es monitoreando la inhibición de absorbancia en presencia
del antioxidante como una técnica espectrofotométrica de decoloración. Esta última consiste
en medir la pérdida de color del radical DPPH a una determinada longitud de onda
comprendida entre 515 y 528 nm (Sánchez-Moreno, 2002) luego de iniciada la reacción
entre el radical y la muestra antioxidante en un medio hidro-alcohólico (etanol o metanol)
hasta alcanzar el estado estable (Brand-Williams et al., 1995) usando un espectrofotómetro
UV-VIS habitual.
Desde el punto de vista metodológico es un ensayo simple, preciso, de bajo costo y
rápido, lo cual sumado a que no requiere equipos de medición complejos, hace de este
método uno de los más ampliamente usados; sin embargo a pesar de ello; su aplicación no
está estandarizada (Tabla 4.3). Según Sánchez-Moreno (2002) sus resultados son altamente
reproducibles y comparables a los obtenibles por otros métodos de neutralización de
radicales como el método ABTS.
Este método ha sido ampliamente aplicado tanto a compuestos puros como a extractos
vegetales (Diallo et al., 2001), a frutos y vegetales comestibles (Du Toit et al., 2001; Leong y
Shui, 2002; Bennett et al., 2010), a compuestos polifenólicos (Hayes et al., 2011), ácidos
fenólicos y sus derivados (Silva et al., 2000), a compuestos derivados de ácidos
hidroxicinámicos (Kumar Maurya y Asir Devasagayam, 2010), a flavonoides (Sansone et al.,
2011), a té (Macedo et al., 2011), etc.
Como desventajas adicionales a la falta de estandarización, la reacción en que se basa
este método puede estar influenciada por impedimentos estéricos: las moléculas pequeñas al
presentar mejor accesibilidad al centro activo del radical mostrarían una mayor actividad
antioxidante (Prior et al., 2005). Además, según Prior et al. (2005), el radical DPPH no
presenta similaridad estructural con los radicales peroxilos involucrados en las reacciones de
peroxidación lipidica, por lo que ciertos sustancias antioxidantes que neutralizan
rápidamente a los radicales peroxilo pueden ser inertes (por impedimento estérico) o bien
reaccionar lentamente con el radical DPPH°. No resulta adecuado para medir CAO en
plasma o suero ya que el medio alcohólico
provocaría la precipitación de proteínas
(Sánchez-Moreno, 2002).
80
Tabla 4.3 Resumen de publicaciones representativas de la aplicación del ensayo del
radical DPPH
Referencias
Concentración del DPPH (µM)
4
25
60
190
500
Pineda Rivelli et al., (2007)
Göktürk Baydar et., (2007)
Brands-Williams et al., (1995)
Kevers et al., (2007)
Elzaawely et al., (2007), Chen et al., (2005)
Medio de reacción
Metanol
Etanol
Tolueno
Metanol buffer (pH: 5,5)
Pineda Rivelli et al., (2007); Kevers et al., (2007)
Lo Scalzo, (2000); Karioti et al., (2004)
Wettasinghe y Shahid, (2000)
Chen et al., (2005)
Tiempo de incubación (min)
5
15
30
60
120
1440
Kevers et al., (2007)
Meda et al., (2005)
Chen et al., (2005)
Paixao et al., (2007)
Pineda Rivelli et al., (2007)
Thaipong et al., (2006)
Longitud de onda (nm)
515
517
Paixao et al., (2007; Brands-Williams et al., (1995);
Thaipong et al., (2006; Saito et al., (2007)
Pineda Rivelli et al., (2007); Chen et al., (2005); Meda et
al., (2005)
Ensayo del contenido de fenoles totales
El método del contenido de fenoles totales, más conocido como método de FolinCiocalteu, que se utiliza actualmente es una modificación efectuada por Singleton y Rossi
(1965) de un método empleado para la determinación de tirosina, el cual se basaba en la
oxidación de los fenoles por un reactivo de molibdeno y wolframio (tungsteno).
La presencia de (poli)fenoles contenidos en una muestra es determinada
colorimétricamente usando el reactivo de Folin-Ciocalteau. El principal constituyente del
reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser
reducido por los grupos fenólicos (reacciona con los grupos oxidrilos de los fenoles)
81
presentes en la muestra da lugar a la formación de sales complejas de color azul intenso, las
cuales presentan un máximo de absorción a 765 nm. El mecanismo básico del método es una
reacción redox, por lo que puede considerarse como otro método de medida de la actividad
antioxidante total (Prior et al., 2005).
Los resultados se obtienen
por espectrofotometría en base a una recta patrón;
generalmente de ácido gálico, aunque también se reporta el uso de otros patrones como ácido
cafeico, ácido clorogénico, ácido ferúlico, catequina, etc. Según George et al. (2005), la
respuesta del ácido gálico representa la respuesta media de todos los compuestos
polifenólicos principales en frutas y vegetales, ya sea como agliconas o conjugados.
Entre las sustancias de naturaleza no fenólica que pueden interferir en las
determinaciones se destacan las proteínas, el ácido ascórbico, el ácido úrico, algunos
aminoácidos y nucleótidos, azúcares y algunas sales inorgánicas (Prior et al., 2005).
Si bien el reactivo de Folin-Ciocalteu no es específico para polifenoles, en condiciones
básicas reacciona con un amplio rango de ellos, y con la utilización de patrones apropiados,
representa una medida adecuada del contenido total de polifenoles. El ensayo de FolinCiocalteu también se ha empleado en estudios in vivo para la determinación de los niveles de
compuestos fenólicos totales en plasma/suero tras la ingesta de vino (Duthie et al., 1998;
Serafini et al., 1998) y zumos de frutas ricos en compuestos fenólicos (Pedersen et al., 2000).
4.1.4.
Objetivos
Los objetivos del presente estudio fueron:
•
Adaptar el método de Folin-Ciocalteu para la determinación del contenido de
polifenoles totales (CPT) en extractos de yerba mate.
•
Proponer una metodología para estandarizar la determinación de capacidad
antioxidante (CAO) en extractos de yerba mate.
Objetivos particulares:
•
Determinar el contenido de polifenoles totales (CPT) en extractos de yerba
mate y su CAO.
82
•
Verificar cuestiones inherentes a la metodología de cuantificación de CAO, a
saber: verificar los valores de CAO de dos sustancias reconocidas por su acción frente al
DPPH; verificar la no interferencia de la cafeína en la determinacion de CAO y evaluar la
repetibilidad y reproducibilidad del método propuesto.
4.2. MATERIALES Y METODOS
4.2.1.
Adaptación del método de Folin-Ciocalteu (FC)
4.2.1.1.
Materia prima
Se muestrearon al azar 10 marcas comerciales de yerba mate elaborada (YME). El
contenido de cada paquete comercial se mezcló por cuarteos sucesivos antes de tomar la
muestra.
4.2.1.2.
Reactivos
Para la determinación de polifenoles totales se utilizaron los siguientes reactivos: ácido
clorogénico (MP Biomedicals, Argentina), ácido gálico (MP Biomedicals, Argentina),
reactivo de Folin-Ciocalteu (Fluka, Argentina), carbonato de sodio (Anedra, Argentina).
4.2.1.3.
Equipos
Las mediciones de absorbancia se realizaron en un espectrofotómetro UV/VIS
(Espectro SP-21029; Estados Unidos) usando cubetas de cuarzo de 10 mm de camino óptico.
Se utilizó un agitador de tubos (Vortexer VWR mini; Estados Unidos), una centrifuga, y
estufas de aire de convección natural.
4.2.1.4.
Determinación de humedad
El contenido de agua se determinó por triplicado por el método gravimétrico: la
muestra (aproximadamente 2,5 g) se secó en estufa de aire con convección natural (6 h; 103
± 2 º C; IRAM 20503, 1995).
4.2.1.5.
Preparación del material de vidrio
Debido a la sensibilidad del ensayo de Folin-Ciocalteu a trazas de impurezas
orgánicas, todo el material fue lavado con una solución diluida de detergente no iónico; se
83
enjuagó con agua destilada al menos tres veces consecutivas y seguidamente fue sumergido
en una solución de ácido nítrico (15 %v/v) durante algunos minutos. Finalmente se enjuagó
con agua destilada siete veces (adaptado de ISO 14502-1, 2004).
4.2.1.6.
Preparación de soluciones y patrones
Para la preparación de la solución del reactivo de Folin-Ciocalteau diluido (10 %v/v),
se trasfirió el reactivo Folin-Ciocalteau (10 mL) a un matraz aforado (100 mL), se enrazó
con agua y se mezcló.
Para la preparación de la solución de carbonato de sodio (7,5 %p/p), se pesó y disolvió
una porción de carbonato de sodio anhidro (37,50 ± 0,01 g) y se enrazó (500 mL). Esta
solución es estable a temperatura ambiente por un mes.
Para la preparación de la solución estándar de ácido clorogénico (1000 µg/mL) se pesó
y disolvió una porción de ácido clorogénico (0,100 ± 0,001 g) y se enrazó (100 mL).
Para la preparación de la solución estándar de ácido gálico (1000 µg/mL) se pesó y
disolvió una porción de ácido gálico monohidratado (0,100 ± 0,001 g) y se enrazó (100 mL).
Para la dilución de las soluciones de ácido clorogénico y de ácido gálico se trasfirieron
diferentes volúmenes de las soluciones estándar de ácido clorogénico y de ácido gálico (1, 2,
3, 4, 5 y 6 mL) y se enrazó cada matraz aforado a 100 mL; obteniéndose las respectivas
concentraciones nominales (10, 20, 30, 40, 50 y 60 µg/mL).
4.2.1.7.
Obtención de los extractos y diluciones
Se mezcló la muestra sólida por duplicado (0,2 ± 0,001 g) con metanol (5 mL; 70
%v/v; en baño agitado a 70 °C) en un tubo usando un agitador de tubos (10 min; 1800 rpm).
Se enfrió a temperatura ambiente y se centrifugó (10 min; 1800 rpm). El sobrenadante se
recolectó. El paso de extracción se repitió una vez sobre el residuo sólido. Los sobrenadantes
se combinaron y se ajustó el volumen (10 mL; metanol; 70 %v/v; 70 °C) (ISO 14502-1,
2004).
Para la determinación de CPT, los extractos de yerba mate se diluyeron 1:100 (v/v).
84
4.2.1.8.
Determinación de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales (CPT) se determinó espectrofotométricamente por
duplicado por el método de Folin-Ciocalteu (ISO 14502-1, 2004): una alícuota de muestra
(1 mL de extracto diluido, de soluciones estándar del ácido clorogénico, del ácido gálico o
de agua) se mezcló por duplicado con la solución del Reactivo de Folin-Ciocalteu diluido (5
mL; 10 %v/v). Transcurrido un tiempo (3-8 min) se agregó la solución de carbonato de sodio
(4 mL; 7,5 % p/v), se mezcló y se dejó en reposo (60 min). Se determinó su absorbancia
(765 nm; espectrofotómetro UV/VIS calibrado con agua).
El CPT se expresó como gramos equivalentes a ácido clorogénico por 100 g de
muestra seca (gEAC %ms) y como gramos equivalentes a ácido gálico por 100 g de muestra
seca (gEAG %ms) a partir de las respectivas curvas de calibración.
Para la lectura del blanco de reactivos, se realizó el mismo procedimiento descripto es
este ítem, pero reemplazando la alícuota de muestra por agua destilada. Dicha lectura debió
en todos los casos mostrar una absorbancia menor o igual a 0,01 ya que valores mayores
indicarían problemas de contaminación que pidrían deberse a una pobre calidad del agua y/o
de los reactivos o a suciedades del material de vidrio utilizado.
El cálculo del contenido de polifenoles totales equivalentes a ácido clorogénico en 100
g de yerba mate seca (EAC %ms) cuando de usa la extracción descripta en el ítem 4.2.1.7 es
presentado en el Anexo 1-Nota 1.
4.2.1.9.
Estabilidad del acido clorogénico como patrón estándar
Se evalúo la estabilidad del acido clorogénico como patrón estándar. Para ello se
preparó el patrón y sus correspondientes diluciones y se determinó el CPT; el remanente de
las diluciones se almacenó en matraces aforados cubiertos con papel de aluminio (24 h, a
temperatura ambiente; en oscuridad) y se procedió a una segunda determinación.
85
4.2.2.
Adaptación del método de DPPH
4.2.2.1.
Materia prima
Se utilizó la fracción de hojas manualmente separada, molida (malla de 4 mm) y
tamizada (40 mesh) obtenida a partir de un lote de yerba mate canchada y estacionada
producido en Apóstoles, Argentina.
4.2.2.2.
Reactivos
Para la determinación de CAO se utilizaron los siguientes reactivos: DPPH (Sigma),
metanol (Merck; grado HPLC, Argentina), ácido ascórbico (Sigma Ultra, Argentina), Trolox
(Aldrich, Argentina), cafeína (Sigma, Argentina), etanol 96º (Sigma Aldrich, Argentina).
4.2.2.3.
Equipos
Los equipos utilizados se mencionan en el ítem 4.2.1.3.
4.2.2.4.
Determinación de humedad
El contenido de humedad se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem
4.2.1.4.
4.2.2.5.
Preparación del material de vidrio
El material de vidrio se preparó acorde al protocolo descripto en el ítem 4.2.1.5.
4.2.2.6.
Preparación de soluciones y patrones
Para la preparación de la solución stock del radical DPPH° (1 mM) se pesó y disolvió
una porción de DPPH° en polvo (0,0986 g; PM: 394,32 g/mol) y se enrazó (250 mL;
metanol). La misma fue almacenada por períodos no mayores a 10 días a -18 ± 1 °C hasta
ser utilizada.
La solución de DPPH de trabajo (100 µM) se preparó diariamente por dilución con
metanol de la solución stock de manera de lograr en la lectura del blanco de reactivos una
absorbancia de 1 ± 0,05 unidades a 517 nm.
Para la preparación diaria de la solución estándar de ácido ascórbico (1000 µg/mL) se
pesó y disolvió una porción de ácido ascórbico (0,100 ± 0,001 g) y se enrazó (100 mL).
86
Para la preparación diaria de la solución estándar de Trolox (1000 µg/mL) se pesó y
disolvió una porción de Trolox (0,100 ± 0,001 g) y se enrazó con metanol (100 mL).
Para la dilución de las soluciones de ácido ascórbico y de Trolox, se transfirieron
diferentes volúmenes de las soluciones estándar respectivas y cada matraz aforado se enrazó
con agua (100 mL), obteniéndose las respectivas concentraciones nominales (de 0 a 1,2
mM).
Para la preparación de la solución de cafeína (0,1 p/v so/sn) se pesó y disolvió una
porción de cafeína (0,100 ± 0,001 g) y se enrazó (100 mL) con una solución etanol/agua (1/4
v/v).
4.2.2.7.
Obtención de los extractos y diluciones
Para la obtención de los extractos, la muestra (fracción hojas, 30 ± 0,001 g ms) se
mezcló por duplicado con etanol (75 %p/p; 180 mL) en erlenmeyer (500 mL) y se mantuvo
en baño (60 ± 1 °C; 30 min; 120 rpm). Luego el sobrenadante se filtró (diámetro de poro: 1
mm) y se registró el volumen recolectado. Para la determinación de CPT, los extractos se
diluyeron (1:5; luego 1:100). Para la determinación de CAO, los extractos se diluyeron en la
relación 1:75, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:400 y 1:500 (v/v).
Los extractos para estudiar el efecto de la temperatura de incubación sobre la
capacidad de neutralizar radicales libres por parte de los extractos y para la validación del
ensayo, se obtuvieron acorde a la metodología descripta en el ítem 4.2.1.7. La dilución usada
fue 1:30 (v/v).
4.2.2.8.
Determinación de polifenoles totales
El CPT se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem 4.2.1.8.
4.2.2.9.
Elección de la longitud de onda para el ensayo
Para la elección de la longitud de onda de trabajo se monitoreó la absorbancia del
radical. Para ello se mezcló metanol absoluto (100 µL) con una solución metanólica de
DPPH (3 mL, 100 µM) y se midió inmediatamente a diferentes longitudes de onda (350-900
nm; temperatura ambiente).
87
4.2.2.10. Determinación del perfil de absorbancia
Para el perfil de absorbancia del radical, se mezcló metanol absoluto (100 µL) con una
solución metanólica de DPPH (3 mL, 10-200 µM) y se midió la absorbancia inmediatamente
(517 nm; temperatura ambiente).
4.2.2.11. Determinación de la capacidad antioxidante
La CAO se determinó por duplicado con el ensayo del radical DPPH: se mezcló la
muestra, la cafeína o los patrones (100 µL) con una solución metanólica de DPPH (3 mL,
100 µM). La absorbancia se midió a varios intervalos de tiempo hasta que la reacción
alcanzó el equilibrio siempre a temperatura ambiente (25 ± 2 ºC). Se midió en oscuridad a
temperatura ambiente (517 nm) con metanol como blanco. Para la lectura del blanco de
reactivos se realizó el mismo procedimiento descripto es este ítem, pero reemplazando la
alícuota de muestra por metanol.
Los resultados se expresaron como equivalentes de ácido ascórbico (EAA) y
equivalentes de Trolox (ET) por 100 g de muestra seca (g %ms) y se calculó como el
porcentaje de radical remanente en el equilibrio (%DPPHR, Ec. 4.4), donde DPPHee la
concentración del radical DPPH en el estado estable y DPPHo la concentración inicial de
dicho radical (ambas en µM).
R (%)= %DPPHR= DPPHee*100/ DPPHo
4.4
La concentración del radical en el medio se calculó con una curva de calibración (10100 µM).
4.2.2.12. Efecto de la temperatura de incubación en la reacción del DPPH
La mezcla de reacción (100 µL de muestra; 3 mL de solución metanólica de DPPH,
100 µM) se incubó durante 120 min en oscuridad en estufas a cuatro temperaturas (20 ± 2ºC,
25 ± 2ºC, 30 ± 2ºC y 40 ± 2ºC °C) y luego se determinó la absorbancia (517 nm; temperatura
ambiente).
88
4.2.2.13. Evaluación de repetibilidad y reproducibilidad
Las condiciones para la evaluación de la repetibilidad fueron tales que los resultados
de ensayos independientes de una misma muestra fueron obtenidos con el mismo método,
sobre ítems de ensayo idénticos, en el mismo laboratorio, por el mismo operador usando el
mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo (ISO 14502-1; 2004). Los valores de
repetibilidad se expresaron como el promedio de cinco determinaciones independientes.
Las condiciones para la evaluación de la reproducibilidad fueron tales que los
resultados de ensayos independientes de una misma muestra fueron obtenidos con el mismo
método, sobre ítems de ensayo idénticos, en diferentes laboratorios con diferentes
operadores usando distintos equipos (ISO 14502-1; 2004). Participaron tres laboratorios,
obteniéndose cuatro resultados por muestra; usando dos muestras en total.
4.2.2.14. Análisis estadístico
Los datos se evaluaron mediante los siguientes análisis: regresión lineal, análisis de
varianza y correlación (Pearson) usando Statgraphics Centurion XVI Académico. Los datos
se expresaron como media ± error estándar (ee) a partir de experimentos independientes
realizados por duplicado.
4.3. RESULTADOS Y DISCUSION
4.3.1.
Adaptación del método de Folin Ciocalteu
El análisis y cuantificación de los compuestos polifenólicos presentes en un producto
vegetal dado está influenciado por numerosos factores, tales como su naturaleza química, el
método de extracción utilizado (polaridad de la fase extractiva, tamaño de las partículas de
las muestras, tiempo y temperatura de extracción, etc.), el tiempo y condiciones de
almacenamiento tanto de las muestras como de los extractos, el método de ensayo empleado,
los estándares elegidos, y la presencia de sustancias que interfieren en las determinaciones
(Huang et al., 2005; Kuskoski et al., 2005).
Los datos de la primer experiencia de obtención de la curva de calibración de ácido
clorogénico como patrón estándar del CPT se presentan en anexo 1- Cuadro A1. Los mismos
se ajustaron a una ecuación lineal: Abs=a*x+b, siendo a= 0,0067 (error estándar=9,1x10-5) y
b= -0,0104 (error estándar=3,3x10-3) con un R² = 0,9977 (análisis estadístico en Anexo 1-
89
Cuadro A2) siendo x = concentración del patrón y Abs = absorbancia. Las diluciones del
patrón de ácido clorogénico pueden usarse hasta 24 horas desde su preparación (prueba de
hipótesis disponible en Anexo 1 - Cuadro A3).
Los datos de la primer experiencia de obtención de la curva de calibración de ácido
gálico como patrón estándar del CPT se presentan en el Anexo 1-Cuadro A4; los mismos se
ajustaron a una ecuación lineal: Abs=a*x+b, siendo a= 0,0122 (error estándar=1,3x10-4) y b=
-0,009 (error estándar=4,8x10-3;) con un R² = 0,998 (análisis estadístico- Anexo 1-Cuadro
A5) siendo x = concentración del patrón.
Se encontró que el contenido de polifenoles totales (CPT) expresado en equivalentes a
ácido clorogénico (EAC) es mayor al expresado en equivalentes de ácido gálico (EAG), lo
cual coincide con lo reportado por González de Mejía et al. (2005). La expresión del
contenido de polifenoles totales como equivalentes a ácido clorogénico sería más adecuada
para la yerba mate debido a que el ácido gálico se halla en menor proporción que el ácido
clorogénico.
Los resultados de CPT se presentan en la tabla 4.4 según su marca comercial
codificada (los datos sin procesar se presentan en el Anexo 1 - Cuadros A6 y A7).
Tabla 4.4 Cuadro comparativo del CPT por marca
Marca
CPT-EAC
CPT-EAG
1
19,32±0,41
10,56±0,22
2
15,84±0,29
8,66±0,16
3
16,50±0,14
9,02±0,08
4
17,10±0,63
9,35±0,35
5
17,45±0,13
9,56±0,07
6
16,87±0,37
9,22±0,20
7
17,31±0,08
9,46±0,05
8
18,24±0,10
9,97±0,06
9
17,45±0,05
9,54±0,03
10
17,91±0,07
9,79±0,04
Los datos se presentan como media ± ee de dos determinaciones por muestra y se expresan como g
equivalentes al patrón % ms
90
El CPT varió entre 15,8
15 y 19,3 gEAC %ms y entre 8,7 y 10,7 gEAG
gE
%ms. Bravo y
Angus (2007) reportaron un valor promedio de 8 gEAG %ms obtenido
idos como infusiones
(1,5 g de YME molida enn 150 mL de agua en ebullición por 5 min;
in; método de Folin
Ciocalteu).
Dudonné et al. (2009)
9) posicionan a los extractos acuosos de YM entre los cinco
extractos de plantas con mayo
ayor capacidad antioxidante de 30 plantas selecc
eccionadas.
4.3.2.
Adaptación de
del ensayo de reducción del radical DPPH
La reacción del ensayo
ayo DPPH se basa en el cambio de color cuando
cu
el átomo de
nitrógeno del radical DPPH
PH, que posee un electrón desapareado, es reducido por un
antioxidante o por algún rad
radical (Ec. 4.5a y 4.5b; Huang et al., 2005
05). Este método se
monitorea por el descensoo en la absorbancia hasta alcanzar el estad
tado estable (BrandWilliams et al., 1995) a algu
lguna longitud de onda en la cual el radicall DPPH°
D
presente un
máximo de absorción. Dicho
ho rango de longitud de onda resultó entre 515
15 y 520 nm, (Figura
4.2; Anexo 1-Cuadro A8), coincidiendo
co
con el rango 515 - 528 nm repor
portado por SánchezMoreno (2002).
DPPH° + AH → DPPH-H + A°
4.5a
DPPH° + R° → DPPH-R
4.5b
Figura 4.2. Absorban
ancia del radical DPPH a diferentes longitud
tudes de onda
91
El perfil de absorbancia
cia del radical resultó lineal en el rango 10-200
00 µM; coincidiendo
con Sharma y Bhat, (2009),
), (Figura 4.3; Anexo 1-Cuadro A9). Comoo es deseable que la
concentración del radical dur
durante el ensayo varíe en un intervalo tal que
ue su absorbancia se
encuentre dentro del rango de precisión de la mayoría de los espectrofotó
otómetros (0,4 < Abs
< 0,9), ya que para absorb
rbancias mayores resultaría difícil medir la intensidad y para
absorbancias menores se dificultaría
difi
la diferenciación entre la muestra
ra y su referencia, se
eligió 100 µM como concentr
ntración de trabajo.
Figura 4.3. Absorbancia de diferentes soluciones del radical DPPH disuelto
di
en metanol
puro
La concentración dell rradical DPPH en el medio de reacción a distintos
di
tiempos se
estimó a partir del perfil de absorbancia del radical, Abs = 0,0103 x - 0,0013 siendo x =
concentración del radical DPP
PPH (µM) (R2 = 0,999) válida para el rangoo 10-100
1
µM (Anexo
1- Cuadros A9 y A10).
La duración del ensayo
yo se estimó como el tiempo necesario para alc
alcanzar el equilibrio
en oscuridad y a temperatur
tura ambiente entre el radical DPPH y la sust
ustancia antioxidante
(ácido ascórbico, Trolox y extractos
ex
diluidos de yerba mate). Las concen
entraciones del ácido
ascórbico y de Trolox ensaya
yadas estuvieron comprendidas entre 0 y 1,22 mM/L
m
mientras que
las diluciones del extracto de yerba mate se realizaron en relación 1:75,, 1:100,
1
1:150, 1:200,
1:250, 1:300, 1:400 y 1:5000 (v/v).
(v
92
Las curvas cinéticas de la reacción del radical DPPH con los estánd
ándares (µAA / µg de
DPPH y µg Trolox / µ
µg dee D
DPPH) y con los extractos (µgEAC / µ
µg dee DPPH)
D
para varios
cocientes másicos se present
entan en las figuras 4.4, 4.5 y 4.6 (datos dispon
ponibles en el Anexo
1- Cuadros A11 a A13). El cálculo de los mencionados cocientes másicos
má
se encuentra
disponible en el Anexo 1- Cuuadro A14.
Figura 4.4. Curvas cinéti
éticas de la reacción del radical DPPH con
n ácido
á
ascórbico
Los patrones ácido ascó
scórbico y Trolox alcanzaron el equilibrio dee la
l reacción a 3 min
y 20 min, mientras que loss eextractos de yerba mate requirieron un tiem
empo de 120 min. El
tiempo de reacción obtenido
do experimentalmente para los extractos de yerba
yer mate concuerda
con lo reportado por Pineda
eda Rivelli et al. (2007) para la determinaci
ación de la CAO de
extractos acuosos e hidroalco
lcohólicos de Ilex paraguariensis mediante el ensayo del radical
DPPH. Acorde a lo esperado
do, los extractos más diluidos alcanzaron el equilibrio
eq
a menores
tiempos de reacción.
Los datos de las curva
rvas de calibración de los estándares ácido ascórbico
a
y Trolox
(disuelto en metanol y dilui
iluido en agua) para el rango de concentracio
ciones 0-1,2 mM se
presentan en la figura 4.7 y een el Anexo 1 (Cuadro A15 y A16). Los mism
ismos se ajustaron al
modelo lineal: y =a*x+b, sien
iendo y = % R en el equilibrio y x = cantidadd del
d patrón estándar
agregada (µg patrón). Loss ccoeficientes resultaron a= -3,98 (error está
stándar=0,049;) y b=
99,99 (error estándar=0,640)
0) (R² = 0,998; Anexo 1- Cuadro A15) para áci
ácido ascórbico y a =
93
-2,77 (error estándar=0,036
36) y b= 99,05(error estándar=0,6590) (R²² = 0,999; Anexo 1Cuadro A16). Coincidiendoo con
c Dae-Ok et al. (2002), el ácido ascórbicoo mostró
m
mayor CAO
que el Trolox frente al radic
dical DPPH (Figura 4.7). El ácido ascórbicoo es un antioxidante
natural y el Trolox es una sustancia
su
sintética soluble en agua equivalent
ente a la vitamina E,
ambos son comúnmente usad
sados como estándares para CAO (Chan ett al.,
al 2010; Sharma y
Bhat, 2009).
Figura 4.5. Curvass ccinéticas de la reacción del radical DPPH con
c Trolox
Figura 4.6. Curvas
as cinéticas de la reacción del radical DPPH
H con diferentes
diluciones de extracto
94
Figura 4.7. Curvas de calibración de los estándares ácido ascórb
órbico y Trolox
El CPT de los extracto
tos resultó 8,10 ± 0,22 gEAC %ms, y su con
oncentración (CoPT)
fue 19,75 ± 0,55 mgEAC / mL (datos disponibles en el Anexo 1- Cuadroo A17)
A
y su CAO fue
de 10 ± 0,255 gEAA %ms y 14,1
1
± 0,35 gET %ms (datos disponibles enn el
e Anexo 1- Cuadro
A18). La relación entre CAO
CA y CPT fue lineal (R2 = 0,987) en ell rango
r
de cocientes
másicos 0 - 0,168 µgEAC / µgradical
µ
DPPH (Figuras 4.8 y 4.9; Anexo 11 Cuadro A18). Por
ello se sugiere diluir los extra
tractos hasta que la CoPT se halle entre 90 -105
105 µgEAC / mL, así
el cociente másico extracto/r
o/radical DPPH se hallaría entre 0,075-0,0888 (Figuras
(
4.8 y 4.9);
si el extracto se obtiene según
gún la Norma ISO 14502, la CoPT debería hall
allarse entre 130-150
µgEAC / mL.
Figura 4.8. Relación entree C
CAO y CPT de diferentes diluciones del ex
extracto expresadas
co
como
% de DPPH remanente (%R)
95
Figura 4.9. Rango lineall de la relación entre CAO y CPT de diferent
entes diluciones del
extracto exp
xpresadas como % de DPPH remanente (%R
%R)
Coincidiendo con Pined
neda Rivelli et al. (2007), se comprobó que la ccafeína presente en
los extractos no interfiere enn la
l determinación (Figura 4.10; Anexo 1-Cuad
uadro A20).
Figura 4.10. Ciné
inética de reacción entre el radical DPPH° y cafeína
Los datos de CAO de los extractos obtenidos tras la incuba
ubación a diferentes
temperaturas y sus respectivo
ivos análisis estadísticos se hallan en el Anexo
exo 1 (Cuadro A21aA21c). Se observó que a m
mayores temperaturas de incubación de laa reacción,
r
el estado
estable se alcanzaba a menor
nores concentraciones del radical (p ≤ 10-3) con lo cual se estaría
sobreestimando la CAO (Fig
Fig. 4.11). Se recomienda una temperatura de incubación de la
96
reacción de 37 °C. Esta tem
emperatura ya ha sido usada por numerososs autores entre ellos
Benzie y Strain, (1996); Dudo
udonné et al. (2009); Pulido et al. (2000); Serafi
afini et al. (2000).
Figura 4.11.. Efecto
Ef
de la temperatura de incubación dee la reacción
En las tablas 4.5 y 4.
4.6 se presentan los estadísticos de precisió
sión calculados. La
diferencia absoluta entre dos
os resultados de ensayos independientes de un
una misma muestra,
obtenidos con el mismo méto
étodo, sobre ítems de ensayo idénticos, en el mismo
m
laboratorio,
por el mismo operador usand
ndo el mismo equipo, dentro de un intervaloo ccorto de tiempo, no
deberá superar en el 95% de los casos, el valor de repetibilidad presenta
ntado en la tabla 4.5
(ISO 14502-1; 2004). La diferencia
dife
absoluta entre resultados de ensayos
os independientes de
una misma muestra, obtenido
idos con el mismo método, sobre ítems de ensayo
en
idénticos, en
diferentes laboratorios conn ddiferentes operadores usando distintos equi
uipos no deberá ser
mayor al valor de la reprodu
ducibilidad presentado en la Tabla 4.6; en ell 95%
95 de las muestras
(ISO 14502-1; 2004).
97
Tabla 4.5 Evaluación de la repetibilidad del ensayo
CAO
Muestra 1
g EAA %ms
Muestra 2
g ET %ms
Muestra 2
Muestra 1
5
5
5
5
Promedio (x)
18,12
16,32
25,46
22,89
Desvío Estándar (DS)
DS de los resultados
(Sr = DS*m-0,5)
Repetibilidad
(r = 2,77*Sr)
Repetibilidad en %
(%r = 100*r/x)
0,255
0,180
0,370
0,261
0,367
0,259
0,497
0,352
0,499
0,724
0,719
0,974
2,8
4,4
2,8
4,3
N° de resultados aceptados
Repetibilidad promedio en %
3,6
3,5
m: número de muestras; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox, ms:
masa seca
Tabla 4.6 Evaluación de la reproducibilidad del ensayo
CAO
g EAA %ms
g ET %ms
Laboratorio
Media
DS
Media
DS
1
16,90
0,29
23,68
0,42
2
16,75
0,25
23,48
0,36
3
17,11
0,31
24,00
0,45
Promedio
16,92
0,29
23,72
0,41
DS entre laboratorios; Sn
0,181
0,260
DS entre laboratorios corregido; SR
0,231
0,332
Reproducibilidad (entre laboratorios);
0,639
0,919
R = 2,77*SR
Reproducibilidad (entre laboratorios)
3,8
3,9
en %
DS: desvío estándar; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox, ms: masa seca
4.4. CONCLUSIONES DEL CAPITULO
• Se recomienda incorporar como parámetro de calidad en las muestras de yerba mate
la determinación de polifenoles totales basada en la Norma ISO 14502 y expresar los
resultados en equivalentes de ácido clorogénico. El CPT de extractos de yerba mate
elaborada, obtenidos por la metodología descripta en la norma ISO 14502 (2004), varió entre
15,8 y 19,3 g equivalentes a ácido clorogénico por 100 g de masa seca con un promedio
98
global de 17,4 ± 0,3 gEAC %ms y entre 8,6 y 10,5 g equivalentes ácido gálico por 100 g de
masa seca.
• Los resultados de la aplicación del ensayo del radical DPPH para determinación de
capacidad antioxidante tanto para extractos vegetales como para compuestos puros depende,
entre otros factores, de la concentración final de los extractos, de la concentración inicial del
la solución de DPPH, de las alícuotas de extractos y de soluciones de DPPH, del tiempo y
temperatura de incubación. Para asegurar estandarización en la determinación de CAO de
extractos de yerba mate mediante este ensayo, el protocolo sugerido consiste en mezclar por
duplicado el extracto (100 µL) convenientemente diluido con la solución metanólica de
DPPH (3,0 mL; 100 µM) durante 2 h a 37 ± 1 °C en oscuridad, y medir la absorbancia a 517
nm con metanol puro como blanco de calibración. En la lectura del blanco de reactivos,
reemplazar la porción de extracto por metanol puro de manera de lograr una absorbancia de
1,05 ± 0,05 unidades a 517 nm. Los resultados deberían ser expresados como equivalentes a
ácido ascórbico o Trolox en porcentaje másico (peso seco), para facilitar posteriores
comparaciones.
• Los extractos etanólicos de yerba mate deberían ser diluidos de forma que la CoPT se
halle entre 90 y 105 µg EAC / mL, en cambio si el extracto se obtiene según la Norma ISO
14502-1 (2004) la CoPT debería estar comprendida entre 130 y 150 µg EAC / mL. Ambos
estándares (ácido clorogénico y ácido gálico) mostraron sencillez de manejo y gran
estabilidad en las condiciones del ensayo. La presencia de cafeína en los extractos no
interfiere en la determinación de CAO. El protocolo propuesto es apropiado para la
determinación de la capacidad antioxidante in vitro de los extractos de I. paraguariensis y
podría contribuir al control de calidad de productos. Su uso podría extenderse a otros
extractos vegetales como té o café.
99
CAPITULO 5
“Efectos del orígen y del procesamiento sobre el contenido de polifenoles”
100
5.1. INTRODUCCIÓN
5.1.1.
Estudios sobre composición fisicoquímica y manejo agronómico de yerba
mate
La materia prima de la yerba mate puede proceder de dos manejos culturales: cultivos
naturales (típicos de Brasil y algunas regiones de Paraguay) y plantaciones denominadas
“rosados o yerbales” (típicas de Argentina y Paraguay). En los cultivos naturales (“bajo
cubierta”) los árboles de yerba mate crecen como arboles nativos preferentemente en subbosques de araucarias (Araucaria angustifolia), con poca disponibilidad de luz solar (hasta
60-70% de sombra; Scarminio et al., 2011), limitados en su proceso de fotosíntesis (de allí
su baja producción de biomasa), desde donde son cosechados manualmente. En cambio en
las plantaciones (“monocultivos”), las plantas de yerba mate crecen en grandes extensiones
de terrenos abiertos, en condiciones de exposición solar; este sistema es por lejos más
productivo y consistente que el anterior tanto en calidad como en cantidad.
En el área de la fitoquímica es conocido el hecho de que las condiciones de
crecimiento juegan un importante rol en la producción de estos compuestos en las plantas
(Meyer et al., 2006). El crecimiento en condiciones adversas o “crecimiento bajo stress”,
como la presencia de insectos o incluso la alta exposición a rayos ultravioletas, puede
desencadenar la producción de compuestos destinados a la protección de la planta (Meyer et
al., 2006). Dichos compuestos son generalmente compuestos fenólicos y compuestos
alcaloides. Por ejemplo la cafeína y la teobromina son compuestos alcaloides que resultan
tóxicos para ciertos insectos y hongos, cuya producción en ciertas plantas tolerantes a la
sombra se ve incrementada bajo condiciones de sombra, tal vez como un mecanismo de
protección de la longevidad foliar, pudiendo además jugar un rol como agente químico de
defensa (Hoft et al., 1996; Hoft et al., 1998; Itoyama y Bicudo, 1992).
La especie Ilex es considerada de baja selectividad en cuanto a exigencias nutricionales
(Oliva et al., 2006); en tanto que su composición química, como la de todo producto
agrícola, puede variar significativamente con el tipo de suelo, clima, época, edad de la planta
y las hojas, dimorfismo sexual y características genéticas. En la literatura se reportan
diferencias significativas en el contenido de minerales (N, P, Ca y Mg) en hojas de yerba
mate de diferentes procedencias geográficas en Brasil (Ivaí, PR y Barao de Cotegipe, RS)
(Oliva et al., 2006). Se han encontrado mayores contenidos de polifenoles y menores
101
contenidos de minerales en extractos de yerba mate provenientes de plantas que crecen
expuestas a la luz solar (típicas condiciones dadas en los cultivares de yerba mate,
“yerbales”) que en los provenientes de plantas que crecen a la sombra (típicas condiciones
dadas en plantas nativas) (Heck et al., 2008; Jacques et al., 2007).
Da Croce (2002) evaluó el efecto de la época de cosecha y de las regiones geográficas
de procedencia en Brasil (Regiones: Chapeco, Canoinhas, Irani y Concordia; todas con
suelos y climas bien diferenciados entre sí) sobre varias características físico-químicas de
extractos de yerba mate. El hallazgo más relevante fue un efecto significativo de la época de
cosecha sobre el contenido de cafeína (p ≤ 0,05): siendo éste más bajo en los meses de
brotación (meses de mayor crecimiento vegetativo, septiembre a diciembre) y aumentando a
medida que las hojas maduran. El efecto de la procedencia geográfica brasileña sobre el
contenido de metilxantinas (específicamente cafeína y teobromina) y sobre los ácidos
clorogénico y cafeico también fue reportado por Cardozo et al. (2010).
Streit et al. (2007) evaluaron la composición química asociada al perfil sensorial de
infusiones de yerba mate usando hojas provenientes de dos regiones diferentes del sur de
Brasil (estados de Rio Grande do Sur y Santa Catarina) y dos prácticas culturales (cultivos
nativos y plantaciones) encontrando que existía un efecto significativo tanto de la región
geográfica de procedencia como de la práctica cultural. Las infusiones a partir de plantas
provenientes de cultivos nativos respecto de las provenientes de plantaciones mostraron un
contenido de ácido cafeico significativamente menor y contenidos significativamente
mayores de ácido clorogénico, cafeína, catequina y ácido gálico. Las infusiones a partir de
plantas provenientes del estado de Santa Catarina mostraron un contenido significativamente
mayor de cafeína y ácido gálico que las provenientes del estado de Rio Grande do Sur.
5.1.2.
Cosecha y procesamiento de yerba mate
La densidad foliar de la yerba mate tiene variaciones significativas en el año
calendario; sin embargo los niveles de densidad más altos se obtienen a mediados de
septiembre pero decaen bruscamente al comenzar el período de brotación; en la figura 5.1 se
muestran las variaciones de densidad durante el transcurso de dos años (Silva y Rakocevic,
2010).
102
La cosecha de la yerba mate (denominada zafra) se extiende generalmente por un
período de aproximadamente 6 meses. La zafra comienza entre los meses de abril y mayo
(inicio de zafra; IZ) y culmina en el mes de septiembre (fin de zafra; FZ). Como regla
general se evita cosechar cuando la planta se encuentra en etapa de brotación, floración o
fructificación. Este cultivo presenta un crecimiento monopodial y rítmico con dos ciclos de
brotación, que se dan en los meses de marzo a mayo y de septiembre a diciembre (Silva y
Rakocevic, 2010). De acuerdo con Da Croce (2002), el período de mayor brotación se da
entre los meses de septiembre a diciembre; entre enero y marzo las hojas se hallan en una
etapa de maduración intermedia en la que una parte de las hojas han alcanzado su ciclo de
crecimiento y otra parte aun no lo ha alcanzado, mientras que durante los meses de junio a
julio las hojas se encuentran prácticamente maduras, es decir con su ciclo de crecimiento
completo.
Figura 5.1. Crecimiento promedio de plantas de yerba mate bajo dos prácticas
culturales (MO, monocultivo, y FUS, bajo cubierta); i corresponde al inicio de mes y f
al final de mes; GU son períodos de crecimiento diferenciados entre si durante un
período de dos años (2003-2005). Fuente: Silva y Rakocevic, 2010
De acuerdo a lo mencionado en el capítulo 1, el proceso de industrialización primario
consta de tres etapas: el zapecado, el secado y una molienda gruesa (denominada canchado)
con la que se obtiene la yerba mate canchada.
103
En general existe un alto grado de uniformidad en el tipo de zapecado llevado a cabo
(Nuñez y Känzig, 1995) (Ver ítem 1.2.3).
El secado es la etapa que sigue a la etapa del zapecado; tiene por objetivo reducir el
contenido de humedad de la yerba mate desde el 29-34 % (base húmeda) hasta valores donde
el producto se vuelve estable y puede ser estacionado. En la yerba mate este valor es menor
al 5 % (base húmeda) o actividad de agua de 0,3 (correspondiente a los valores de contenido
de humedad de la monocapa) (Schmalko, 2005). En general en Argentina las condiciones de
trabajo en los establecimientos industriales difieren mucho entre sí, ya sea en el tipo de
secadero utilizado, la temperatura del aire y/o el tiempo de residencia. Sin embargo el
contenido de humedad del producto a la salida es bastante uniforme, encontrándose valores
entre el 2 y el 4 % (base húmeda) (Nuñez y Känzig, 1995). Actualmente se utilizan tres
tipos de secado: i-secado tipo barbacuá, ii-secado tipo cinta y iii- secado rotatorio o tubular.
(Prat Krikum, 1994):
Secado “tipo barbacuá” (también conocido como secadero de catre): en este tipo de
secadero la materia prima se seca durante un período comprendido entre 6 y 24 h sobre un
lecho de ramas. Se trata de secaderos discontinuos con flujo de gases de combustión de leña
a través de dicho lecho, con temperaturas entre 60 y 90 °C. Los secaderos de “catre” tienen
paredes de mampostería y una malla metálica sobre la cual se colocan las ramas en un lecho
de 0,8 a 1,2 m de altura. El gas para el secado (generalmente gas de combustión de leña y
aire) se introduce por tubos, ubicados en la parte inferior y homogéneamente distribuidos,
teniéndose una altura de 2-3 m entre los conductos de alimentación de los gases y la cinta
con el material (Prat Krikum, 1994; Schmalko, 2005).
Secado tipo cinta: este tipo de secado se realiza en secaderos de flujo cruzado continuos. El
material es transportado de un extremo al otro sobre una malla o lecho móvil perforado de
baja velocidad en contacto con aire caliente y gases de combustión de leña, con un tiempo de
residencia que varía entre 2 y 6 h y con temperaturas entre 80 y 130 ºC. Estos secaderos de
cinta son construidos de mampostería pudiendo alcanzar longitudes de hasta 30 m y 5 m de
ancho.
Pueden existir secaderos de hasta 3 cintas superpuestas, o en otros casos
consecutivas. El gas de secado (generalmente gas de combustión de leña y aire) se introduce
en la parte inferior por conductos uniformemente distribuidos, pasa a través del lecho de
ramas y sale por chimeneas ubicadas en el techo. El tiro puede ser natural o inducido,
104
utilizándose en este caso ventiladores ubicados a la salida. El lecho de hojas tiene alturas que
varían de 0,7 a 1 m (Prat Krikum, 1994; Schmalko, 2005). El contenido de humedad y la
temperatura del producto y del aire varían a lo largo y alto del lecho. La velocidad de secado
depende de la velocidad y temperatura del aire, el flujo de material, la altura y porosidad del
lecho y el tipo de material (Khankari y Patankar, 1999; Sturgeon, 1995).
Secado rotatorio: en este tipo de secado las ramas se secan en tambores rotatorios, con la
salvedad de que en algunos modelos las ramas no toman contacto directo con los gases de
combustión sino únicamente con aire caliente (secaderos neumáticos). Los tiempos de
residencia en los secaderos rotatorios varían entre 10 y 20 min y las temperaturas son
superiores a los 200 ºC (Prat Krikum, 1994; Schmalko, 2005). Los secadores rotatorios o
tubulares consisten en cilindros giratorios alimentados en un extremo con la materia prima y
los gases de combustión (corrientes paralelas) y son muy similares a los zapecadores.
5.1.3.
Estudios sobre composición fisicoquímica y procesamiento
Entre los cambios físico-químicos se citarán estudios referidos a la degradación de
compuestos que guardan relación con la calidad y el valor nutritivo de la yerba mate a lo
largo del procesamiento.
Ramallo et al. (1998b) midieron las modificaciones de la vitamina C durante el
procesamiento, encontrando que en las etapas de zapecado y secado se degradaba el 79 % de
su contenido inicial y además concluyeron que el contenido de vitamina C en los palos era
mucho menor que en las hojas y durante el procesamiento, el contenido de vitamina C en las
hojas disminuía un 90 %.
La degradación durante el procesamiento de dos plaguicidas utilizados en el cultivo de
la yerba mate (cipermetrina y dimetoato) fue estudiada por Escalada et al. (1999) y
Schmalko et al. (1999). En ambos trabajos se concluyó que los plaguicidas sufrían un gran
deterioro durante el zapecado y el secado. La cipermetrina se degradaba un 63,4 % en el
zapecado y un 18,2 % en el secado, mientras que el dimetoato se degradaba un 33 % en el
zapecado y un 52 % en el secado. Además, en el estacionamiento (acelerado) sufrían
degradaciones que reducían la concentración por debajo del límite de detección de los
equipos. Por lo tanto, las concentraciones de salida de estos plaguicidas se encontraban muy
por debajo de los valores máximos permitidos.
105
Paredes et al. (2000a) estudiaron las modificaciones en el contenido de azúcares
(glucosa, fructosa y sacarosa) en las etapas de zapecado y secado y encontraron que durante
el zapecado se producía una disminución del contenido de los azúcares simples y un
aumento de la sacarosa. Además encontraron que las concentraciones de los azúcares
dependían de la época de cosecha y de si las hojas eran jóvenes o maduras. También
estudiaron las variaciones de los azúcares durante el secado cuando el mismo se realizaba
por circulación transversal en condiciones controladas. Encontraron que las variaciones de
tiempo y temperatura no producían variaciones tan importantes como las que se producían
en el zapecado (Paredes et al., 2000b).
Esmelindro et al. (2002) realizaron una caracterización fisicoquímica de yerba mate en
función de las etapas de procesamiento industrial (zapecado, secado y molienda)
encontrando que las etapas de zapecado y secado no afectan significativamente a los
contenidos de cenizas y fibras pero si provocan reducciones en los contenidos de grasas,
proteínas, glucosa, sacarosa y cafeína. En dicho trabajo, que se realizó en Brasil, se
ensayaron dos tipos de secaderos, (rotatorio y cinta), pero las temperaturas y tiempos de
residencia aplicados no fueron especificadas.
Valerga et al. (2011) evaluaron el contenido de polifenoles totales en hojas de yerba
mate (método de Folin Ciocalteau) a lo largo del procesamiento, encontraron que el único
tratamiento que tuvo una incidencia significativa fue el zapecado, ya que las muestras
zapecadas presentaron un contenido de polifenoles totales (98,86 ± 12,15 mg EAG / g ms)
aproximadamente 22 veces mayor respecto al de las hojas frescas, y el mismo se mantuvo
sin variaciones significativas en las etapas sucesivas al zapecado, no aclarando los tipos de
secado y estacionamiento a que fueron sometidas las muestras.
López et al. (2006) analizaron extractos acuosos de Ilex paraguariensis en las distintas
etapas del procesamiento industrial. Hallaron que la capacidad antioxidante disminuyó
significativamente durante el zapecado, pero luego se mantuvo constante durante el secado y
el estacionamiento acelerado.
Los ácidos clorogénicos forman parte de la composición de diversas especies vegetales
y sus frutos. El contenido total de derivados del cafeoil (ácido clorogénico, ácido cafeico, y
106
ácidos mono y dicafeoilquinicos) en hojas frescas de Ilex paraguariensis reportado por
Isolabella et al. (2010) es de aproximadamente 6 % en peso seco (determinado por HPLC).
El único informe encontrado sobre la variación cuantitativa de derivados del cafeoil
durante cada una de las etapas del proceso de industrialización de yerba mate (Isolabella et
al., 2010) informa un aumento del contenido de metilxantinas (cafeína y teobromina) luego
del zapecado y una disminución del mismo luego del secado para mantenerse constante
durante el estacionamiento. Parte de estos resultados concuerdan con Schmalko y Alzamora,
(2001) quienes informaron que la pérdida más significativa de cafeína (alrededor del 20 %)
ocurre durante la etapa de secado.
En el mismo informe (Isolabella et al., 2010) también se reporta un aumento del
contenido totales de compuestos derivados del cafeoil (ácido clorogénico e isómeros del
ácido isoclorogénico: 3,2 DCQ, 3,5 DCQ y el 4,5 DCQ) durante el zapecado respecto de la
hoja fresca (no tan evidente como en el trabajo de Valerga et al. (2011) antes mencionado) y
otro aumento aunque menos pronunciado durante el secado para mantenerse constante
durante el estacionamiento; mientras que el
contenido de ácido cafeico se mantuvo
constante a lo largo de dichas etapas. La disrupción celular y al impacto mecánico al que son
expuestas las hojas influyen positivamente sobre la extracción de cafeína y de acido 5cafeoilquínico (Bastos et al., 2006).
En la figura 5.2 se muestran los resultados obtenidos por Isolabella et al., (2010) para
el contenido total de derivados cafeoílicos durante las diferentes etapas del procesamiento
industrial; los valores fueron obtenidos por HPLC y representan la media ± error estándar de
tres experimentos llevados a cabo por duplicado.
Murakami et al. (2004) analizaron la estabilidad de diferentes polifenoles frente al
tratamiento térmico y encontraron que el ácido clorogénico era el más estable dentro de los
compuestos analizados. Al tratar térmicamente este compuesto a 100 ºC, luego de 6 h, los
valores de contenido de polifenoles totales y de actividad antioxidante permanecieron
prácticamente constantes; al repetir la experiencia térmica a 180º C luego de 15 minutos, la
actividad antioxidante disminuyó un 20 % y el contenido de polifenoles totales permaneció
cercano al 100 %, a pesar de que el contenido de ácido clorogénico disminuyó (30 %). Esto
implicaría que a 180º C parte del ácido clorogénico se descompone, pero sus productos de
107
descomposición siguen siendo reactivos al reactivo de Folin-Ciocalteau y algunos de ellos
también poseen actividad antioxidante.
Figura 5.2. Contenido total de derivados cafeoílicos durante el procesamiento.
Letras diferentes representan diferencias significativas entre las muestras (p < 0,05).
Etapas: H: cosecha, Z: zapecado; D: Secado; FA: almacenamiento acelerado; NA:
almacenamiento natural. Fuente: Isolabella et al., (2010).
5.1.4.
Objetivos y justificación
El cultivo de la yerba mate se halla ampliamente distribuido en la provincia de
Misiones.
Por lo expuesto la zona de procedencia de la materia prima (dentro de la provincia de
Misiones), el tipo de secado y la época de cosecha podrían afectar tanto al contenido de
polifenoles totales (CPT) como a la capacidad antioxidante (CAO) de los extractos de yerba
mate.
En esta etapa se empleó yerba mate canchada en lugar de yerba mate elaborada como
material vegetal de estudio, como una medida para evitar la confusión de efectos; ya que tal
y como se expuso en el capítulo II, la yerba mate elaborada posee dos etapas industriales
posteriores al secado, que son la molienda y el estacionamiento.
Los objetivos del presentecapítulo fueron evaluar los efectos del origen de la materia
prima, del tipo de secado y de la época de cosecha, sobre el CPT y la CAO de la yerba mate
canchada.
5.2. MATERIALES Y METODOS
5.2.1.
Selección de las zonas productoras y de los establecimientos yerbateros
108
En base a la distribución geográfica de los establecimientos productores de yerba mate,
en la Provincia de Misiones (Figura 5.3) se definieron cuatro orígenes: i- Zona sur:
departamentos de Apóstoles, Concepción de la Sierra y San Javier. Banda latitudinal: S28°
08’ 17’’ - S27° 45’ 00’’; ii- Zona centro: departamentos de Candelaria, Alem, Oberá, San
Ignacio, 25 de Mayo, Cainguás, Guaraní, y parte de Gral. San Martín. Banda latitudinal:
S27° 45’ 00’’- S26° 55’ 00’’; iii- Zona centro-norte: departamentos de Montecarlo, San
Pedro y parte de Eldorado. Banda latitudinal: S26° 55’ 00’’- S26° 22’ 00’’; iv- Zona norte:
departamentos de Iguazú y Gral. Manuel Belgrano. Banda latitudinal: S26° 22’ 00’’- S25°
30’ 00’’.
Figura 5.3. Mapa de Misiones con la ubicación de los establecimientos yerbateros
existentes
La selección de los 19 establecimientos yerbateros se llevó a cabo de acuerdo a su
ubicación geográfica, el tipo de proceso de secado utilizado y la procedencia de la materia
prima que acopian (Tabla 5.1). La totalidad de los establecimientos muestreados procesan
material procedente de la misma zona geográfica en que se encuentran ubicados.
5.2.2.
Materia prima
Se tomaron 2 muestras de yerba mate canchada (yerba mate seca, molido grueso) en
cada establecimiento industrial, una al inicio de la zafra (meses de abril-mayo de 2009) y
otra al final de la zafra (septiembre de 2009), cosechadas del modo convencional sin
discriminar edad de la hoja ni posición en la planta (tal y como lo realizan los cosechadores).
109
Tabla 5.1 Zonas geográficas y tipos de secado de los establecimientos muestreados.
Establecimiento
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Secado
Cinta
Cinta
Barbacuá
Barbacuá
Tubular
Cinta
Cinta
Barbacuá
Barbacuá
Tubular
Tubular
Cinta
Cinta
Barbacuá
Barbacuá
Tubular
Cinta
Cinta
Tubular
Orígen
Sur
Sur
Sur
Sur
Sur
Centro
Centro
Centro
Centro
Centro
Centro
Centro-Norte
Centro-Norte
Centro-Norte
Centro-Norte
Centro-Norte
Norte
Norte
Norte
Para cada muestra se realizó un cuarteo sucesivo y posterior remoción manual de las
fracciones de hoja y palo. Se utilizó la fracción de hoja molida que atraviesa una malla de
500 micrómetros de apertura nominal.
5.2.3.
Reactivos
Para la determinación de polifenoles totales y capacidad antioxidante se utilizaron los
reactivos mencionados en los ítems 4.2.1.2 y 4.2.2.2, respectivamente.
5.2.4.
Equipos
Los equipos utilizados se mencionan en el ítem 4.2.1.3.
5.2.5.
Determinación de humedad
110
El contenido de humedad se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem
4.2.1.4.
5.2.6.
Preparación del material de vidrio
El material de vidrio se preparó acorde al protocolo descripto en el ítem 4.2.1.5.
5.2.7.
Preparación de soluciones y patrones
La solución del reactivo de Folin-Ciocalteu (RFCD), la solución de carbonato de
sodio, las soluciones estándar de los ácidos clorogénico y sus respectivas diluciones para las
curvas de calibración se prepararon acordes al ítem 4.2.1.6
La solución stock del radical DPPH°, la solución de DPPH de trabajo; las soluciones
estándar de ácido ascórbico y Trolox y sus respectivas diluciones se prepararon acordes al
ítem 4.2.2.6
5.2.8.
Obtención de los extractos y diluciones
Los extractos de yerba mate se obtuvieron acorde a la metodología descripta en el ítem
4.2.1.7. Las extracciones se realizaron por duplicado.
Para la determinación de CPT se utilizó una dilución acuosa 1:100. Para la
determinación de CAO se utilizó una dilución acuosa 1:25 ó 1:30 según fue necesario.
5.2.9.
Determinación de polifenoles totales
El CPT se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem 4.2.1.8.
5.2.10. Determinación de la capacidad antioxidante
El ensayo consistió en mezclar la muestra diluida, los patrones estándares o el blanco
(metanol) (100 µL) con la solución de DPPH de trabajo (3 mL). Transcurridos 120 min en
oscuridad a 37 ± 1°C se midió la absorbancia de las muestras a 517 nm usando metanol
puro como blanco.
La concentración del radical DPPH en el medio a cualquier tiempo y la capacidad
antioxidante calculada como el % de DPPH remanente fueron calculados según lo descripto
en el ítem 4.2.2.11.
111
La capacidad antioxidante se expresó en g equivalentes a ácido ascórbico (gEAA) y g
equivalentes a Trolox (gET) en 100 g ms (%ms).
5.2.11. Análisis estadístico
Para el análisis de los datos experimentales se realizó un análisis de varianza y
comparación de muestras pareadas (test t) usando Statgraphics Centurion XVI Académico.
Todas las comparaciones fueron realizadas con un nivel de confianza del 95%. Los datos
fueron expresados como media ± error estándar (ee).
5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El CPT varió entre 19,21 y 24,28 g EAC %ms, con una media global de 21,58 gEAC
%ms. Dicho valor coincide razonablemente con el valor de 22,20 gEAC %ms reportado por
Brumovsky et al. (2009) para extractos de yerba mate elaborada comercial, obtenidos
aplicando la metodología descripta en la norma ISO 14502 (2004), tal como fue aplicada en
el presente trabajo. La CAO varió entre 29,99 y 44,8 gET %ms y entre 21,23 y 31,53 gEAA
%ms con medias globales de 37,42 gET %ms y 26,40 gEAA %ms.
Un resumen de los resultados de CPT (expresados en gEAC %ms) y CAO (expresados
en gET y gEAA en %ms) para todas las muestras analizadas se presenta en la tabla 5.2
(Datos disponibles en Anexo 2, Cuadros B1 y B2) mientras que en la figura 5.3 se visualizan
gráficos de medias con barras de error estándar para las tres variables respuesta estudiadas.
Del análisis de varianza de efectos simples realizado (Datos disponibles en Anexo B,
Cuadros B3 y B4) no surgen evidencias suficientes para afirmar que el origen y el tipo de
secado ejerzan un efecto significativo sobre el CPT y sobre la CAO. En cambio la época de
cosecha sí ejerce un efecto significativo tanto sobre el CPT como sobre la CAO. La media
global del CPT para todos los orígenes y tipos de secado fue de 22,06 gEAC %ms en el
inicio de zafra y de 21,10 gEAC %ms en el final de la zafra. La medias globales de la CAO
fueron de 39,74 gET %ms y 28,01 gEAA %ms en el inicio de la zafra y de 35,10 gET %ms
y 24,78 gEAA %ms en el final de la zafra. Los valores obtenidos permiten afirmar que el
CPT y la CAO de los extractos de yerba mate son mayores al inico de zafra que al final de la
misma. Esto podría atribuirse a las distintas condiciones climáticas (temperatura, humedad
ambiental, intensidad solar, etc.), a la fase de desarrollo de la planta (Silva y Rakocevic,
2010) y a otros factores no identificados que se dan al inicio y al final de la zafra y que
112
podrían afectar al contenido de polifenoles presentes en la planta de yerba mate, ya que
como se mencionó en el ítem 5.1.2 del presente capítulo el inicio de zafra se lleva a cabo al
en los meses de abril-mayo, y que el fin de la zafra se realiza al terminar el invierno (agostoseptiembre). Según Rakocevic et al. (2011), las hojas de Ilex paraguariensis cultivadas en
yerbales crecen durante aproximadamente seis meses, llegando a los meses de marzo-abril
con edades foliares menores a cinco o seis meses. Uno de los factores no identificados podría
ser el grado de madurez de las hojas (o edad) ya que en abril-mayo el crecimiento foliar sería
entre intermedio y completo (es decir con hojas que completaron su crecimiento foliar y
otras que no) mientras que en septiembre la cosecha ya tendría una mayor proporción de
brotes nuevos. Este efecto de la época de mayor tasa de brotación fue observado sobre el
contenido de cafeína en muestras de yerba mate; durante meses de brotación (período de
mayor crecimiento vegetativo), el contenido de cafeína es relativamente bajo pero aumenta a
medida que la hoja madura (Da Croce, 2002).
Holovaty (2007) evaluó el CPT (Folin-Ciocalteu) y la CAO (reducción del radical
DPPH) de hojas y palos frescos, cosechados en dos épocas del año: noviembre de 2004 (mes
dentro del período de brotación con floración) y en septiembre de 2004 (mes dentro del
período de mayor madurez de las hojas), y reportó que no se encontraron diferencias en
ambas variables con la época de cosecha, tanto en las hojas como en los palos (p ≤ 0,05).
Bortoluzzi et al. (2006) reportaron un mayor contenido de compuestos fenólicos (ácido
clorogénico y ácido gálico) en muestras comerciales obtenidas en octubre (mes dentro del
período de mayor tasa de brotación) respecto de las obtenidas en abril (mes intermedio entre
los períodos de crecimiento foliar intermedio y completo) de 2004. Esta aparente
contradicción con los presentes resultados podría puede justificarse mencionando que otros
compuestos fenólicos presentes en los extractos de yerba mate, especialmente los ácidos
dicafeoilquínicos, contribuyen en la determinación del CPT. Estos autores cuantificaron
únicamente ácido clorogénico y ácido caféico, por cromatografía líquida (HPLC) en
extractos acuosos de yerba mate elaborada comercializada en la ciudad de Toledo, Brasil;
además, este último hecho hace que no se pueda confirmar la época de cosecha. Sin embargo
cabe mencionar que en Brasil, la yerba mate elaborada se comercializa sin ser sometida al
período de estacionamiento que se hace en Argentina.
113
No se hallaron evidencias de la existencia de interacciones dobles entre los factores
origen-época y entre los factores secado-época para el CPT de las muestras (Datos
disponibles en Anexo 2, Cuadro B5 y B6), por lo que la época de cosecha influye de igual
forma en el CPT de los extractos de la yerba mate de todos los orígenes y de todos los tipos
de secado.
No se hallaron evidencias de la existencia de interacción doble entre los factores
origen-época para la CAO de las muestras (Anexo 2, Cuadro B7); por lo tanto la época de
cosecha afecta a la CAO de las muestras de yerba mate independientemente del origen de las
mismas. En cambio se halló interacción significativa entre los factores época y secado para
la CAO (Anexo 2, Cuadro B8). Este resultado nos permite afirmar que los diferentes tipos de
secado inciden de distinta forma sobre la CAO según cual sea la fase de desarrollo en que se
encuentre la planta. Así, por ejemplo en el secado barbacuá no se detectaron variaciones
significativas en la CAO mientras que en los otros dos tipos de secado se halló variación
significativa de la CAO según las épocas de zafra, encontrándose valores mayores en el
inicio de la zafra, tanto para el secado en cinta como para el secado tubular (Anexo 2-Cuadro
B9). Este comportamiento podría deberse a la variación del tratamiento térmico realizado en
cada tipo de secado
114
Tabla 5.2. Valores medios ± error estándar de CPT y CAO en las muestras analizadas.
Muestra Origen
Secado
Época
CPT
CAO
ET
EAA
300
Centro
Cinta
IZ
21,98±0,69
43,20±0,46
30,41±0,31
301
Centro
Cinta
IZ
23,28±0,17
42,73±3,37
30,09±2,34
302
Norte
Cinta
IZ
24,22±0,06
40,91±0,10
28,83±0,07
303
Norte
Cinta
IZ
22,74±0,18
36,84±1,95
25,98±1,35
304
Sur
Tubular
IZ
21,59±0,25
35,79±0,19
25,27±0,13
305
Centro Barbacuá
IZ
19,73±0,08
37,22±1,39
26,26±0,97
306
Centro Tubular
IZ
21,31±0,20
39,75±2,70
28,02±1,87
307
C-N
Cinta
IZ
22,79±0,02
44,31±1,22
31,19±0,85
308
Centro Tubular
IZ
21,91±0,50
40,46±0,46
28,51±0,32
309
Norte Tubular
IZ
23,20±0,20
39,1±0,25
27,64±0,12
310
C-N
Tubular
IZ
23,08±0,62
44,81±0,29
31,53±0,20
311
C-N Barbacuá
IZ
22,55±1,53
37,62±0,69
26,54±0,48
312
Sur
Cinta
IZ
21,73±0,55
42,99±0,24
30,27±0,17
313
C-N
Cinta
IZ
21,77±0,41
37,84±2,34
26,69±1,63
314
Sur
Barbacuá
IZ
21,87±0,28
37,93±0,84
26,75±0,59
315
C-N Barbacuá
IZ
21,65±0,24
35,94±0,05
25,37±0,04
316
Sur
Cinta
IZ
20,91±0,04
41,53±0,12
29,25±0,08
317
Centro Barbacuá
IZ
21,28±1,25
38,46±0,54
27,12±0,38
318
Sur
Barbacuá
IZ
22,09±0,62
37,69±0,03
26,58±0,02
319
C-N
Cinta
FZ
21,90±0,51
33,54±0,88
23,69±0,61
320
Sur
Cinta
FZ
20,94±1,08
32,43±0,80
22,93±0,55
321
C-N Barbacuá
FZ
20,12±0,57
34,70±1,10
24,50±0,77
322
Sur
Barbacuá
FZ
20,79±0,60
37,01±0,02
26,12±0,02
FZ
20,08±1,53
37,26±0,59
26,29±0,41
323
C-N Barbacuá
324
C-N
Cinta
FZ
20,46±0,59
35,78±0,40
25,25±0,27
325
Centro
Cinta
FZ
20,43±0,20
35,20±0,98
24,85±0,68
326
Centro
Cinta
FZ
20,14±0,20
30,97±0,88
21,91±0,61
327
Norte Tubular
FZ
20,50±0,80
39,70±0,61
27,98±0,42
328
Norte
Cinta
FZ
21,12±0,15
37,90±0,19
26,72±0,13
329
Norte
Cinta
FZ
20,92±0,10
31,22±1,97
22,08±1,37
330
Centro Barbacuá
FZ
22,48±1,37
40,52±0,28
28,55±0,19
331
C-N
Tubular
FZ
23,82±0,20
37,01±0,51
26,11±0,35
332
Sur
Tubular
FZ
21,91±0,32
33,63±0,86
23,75±0,60
333
Centro Tubular
FZ
21,49±0,05
34,18±2,35
24,15±1,63
334
C-N
Cinta
FZ
24,28±0,66
32,67±1,18
23,09±0,82
335
Centro Tubular
FZ
20,10±0,71
30,98±0,08
21,23±0,06
336
sur
Barbacuá
FZ
21,51±0,96
37,83±0,62
26,67±0,43
337
centro Barbacuá
FZ
19,65±0,43
35,41±0,41
24,99±0,28
CPT: Contenido de polifenoles totales (g EAC % ms); EAC: equivalentes a ácido
clorogénico; ms: masa seca; CAO: Capacidad antioxidante (g ET %ms y g EAA %ms);
ET: equivalente a Trolox; EAA: equivalente a ácido ascórbico. IZ: Inicio de zafra; FZ:
Final de zafra. C-N: Centro-norte.Datos expresados como media ± error estándar.
115
Figura 5.3. Gráfico de medias y barras de error estándar .CPT: Contenido de
polifenoles totales, en g EAC %ms; CAO: Capacidad antioxidante, en g ET %ms y
g EAA %ms (EAC: equivalentes a ácido clorogénico; ET: equivalente a Trolox; EAA:
equivalente a ácido ascórbico; ms: masa seca; FZ: fin de zafra; IZ: inicio de zafra)
116
Tabla 5.3. Estadísticos descriptivos de las variables
Variable respuesta: CPT (gEAC %ms)
Recuento
Media
Error estándar
ORÍGEN
Centro
Centro-Norte
Norte
Sur
SECADO
Barbacuá
Cinta
Tubular
EPOCA
FZ
IZ
ORIGEN
Centro
Centro-Norte
Norte
Sur
SECADO
Barbacuá
Cinta
Tubular
EPOCA
FZ
IZ
ORIGEN
Centro
Centro-Norte
Norte
Sur
SECADO
Barbacuá
Cinta
Tubular
EPOCA
FZ
IZ
12
11
6
9
21,69
21,28
22,17
21,42
0,426
0,404
0,534
0,304
12
16
10
21,04
21,61
22,18
0,384
0,309
0,350
19
21,10
0,298
19
22,06
0,250
Variable respuesta: CAO (gET %ms)
Recuento
Media
Error estándar
12
11
6
9
37,34
37,40
37,61
37,42
1,240
1,177
1,403
1,121
12
16
10
37,29
37,50
37,44
0,434
1,155
1,333
19
35,10
0,673
19
39,74
0,652
Variable respuesta: CAO (gEAA %ms)
Recuento
Media
Error estándar
12
11
6
9
26,34
26,38
26,54
26,40
0,862
0,819
0,979
0,780
12
16
10
26,31
26,45
26,42
0,302
0,803
0,927
19
19
24,78
28,01
0,468
0,453
CPT: Contenido de polifenoles totales (gEAC %ms); EAC: equivalentes a
ácido clorogénico; ms: masa seca; CAO: Capacidad antioxidante (gET %ms y
gEAA %ms); ET: equivalente a Trolox; EAA: equivalente a ácido ascórbico.
IZ: Inicio de zafra; FZ: Final de zafra
117
5.4. CONCLUSIONES DEL CAPITULO
• No se encontró efecto del orígen ni del tipo de secado sobre el CPT de los extractos
de la yerba mate.
• El efecto de la época de cosecha influye sobre el contenido de polifenoles totales
(CPT) de los extractos de la yerba mate independientemente del origen y del tipo de secado
al que fuera sometida la hoja verde. El CPT para el inicio de zafra es 4,5 % mayor respecto
del valor para el final de zafra correspondiente al año 2009; esto podría deberse a la
distribución de edades foliares en el material cosechado.
• La época de cosecha (la cual guarda relación con la fase de desarrollo del cultivo)
afecta a la CAO de los extractos de yerba mate independientemente del origen de las
muestras.
• Los diferentes tipos de secado inciden de distinta forma sobre la CAO según se trate
del inicio o del final de la zafra. En el secado tipo barbacuá no se detectaron variaciones
significativas en la CAO mientras que en los otros dos tipos de secado (cinta y tubular) se
halló variación significativa de la CAO según las épocas de zafra, encontrándose valores
mayores en el inicio de la zafra, tanto para el secado en cinta como para el secado tubular.
• EL CPT varió entre 19,21 y 24,28 gEAC %ms con un valor medio de 21,58 gEAC %
ms.
• La CAO varió entre 21,23 y 31,53 gEAA %ms (29,99 y 44,8 gET %ms) con valor
medio de 26,40 gEAA %ms (o 37,42 gET %ms).
• Los resultados encontrados demostraron que si se quiere obtener extractos de yerba
mate con altos CPT y CAO se debe trabajar con materia prima cosechada al inicio de zafra.
118
CAPITULO 6
“Optimización de la extracción”
119
6.1. INTRODUCCIÓN
6.1.1.
Extracción de compuestos fenólicos
Existen numerosos trabajos publicados que comprueban que ciertos factores como la
temperatura de extracción (Wettasinghe y Shahidi, 1999), la polaridad del solvente
(Turkmen y Sari, 2006), y la relación sólido/solvente (Cacace y Mazza, 2003) pueden influir
en forma directa sobre la extracción de polifenoles. Por citar ejemplos para la extracción de
polifenoles, soluciones extractivas de metanol absoluto (en té; Yao et al., 2006) y de acetona
al 50 % (en trigo; Zhou y Yu, 2004) resultaron ser más efectivas que el agua. En cambio
Khokhar y Magnusdotti´r (2002) encontraron al agua como el mejor solvente para extraer
catequinas de té, en comparación con metanol al 80 % y etanol al 70 %. Hayouni et al.
(2007) reportaron que tanto agua como diferentes solventes usados en forma individual o en
mezclas tales como acetona/agua/ácido acético (90/9,5/0,5) y acetato de etilo/metanol/agua
(60/30/10) afectaban significativamente el CPT de extractos frutales de Quercus coccifera
L. y Juniperus phoenicea L. Yu et al. (2005) reportaron que para la extracción de
compuestos fenólicos totales a partir de la piel de maní, tanto soluciones metanólicas como
etanólicas al 80 % resultan más efectivas que el agua.
Hay evidencias de la efectividad del etanol en la extracción de polifenoles a partir de
varios tejidos vegetales: granos de soja (Jokić et al., 2010), té negro y verde (Astill et al.,
2001), salvia (Durling et al., 2007), semillas de uvas (Shi et al., 2003; Yilmaz y Toledo,
2006) y arándanos (Dragović-Uzelac et al., 2010). Spigno et al. (2007) encontraron que a
mayores proporciones de agua en soluciones extractivas etanol:agua (concentraciones de
etanol inferiores al 50 %) se reduce la extracción de polifenoles a partir de uvas. Rostango et
al. (2004) encontraron que es necesario el agregado de cierta cantidad de agua (30-40 %) en
la solución extractiva para aumentar la extracción de compuestos fenólicos a partir de granos
de soja (ricos en isoflavonas); mientras que si el contenido de agua es mayor al 60 % la
eficiencia de extracción de los mismos compuestos se ve reducida.
Es sabido que la reducción del tamaño de partículas contribuye a mejorar la velocidad
y la eficiencia de extracción de cualquier compuesto bioactivo. Dos formas de lograrlo son
mediante la molienda (reducción a escala macromolecular) y el agregado de enzimas
(reducción a escala micromolecular). Varios estudios reportaron un incremento en la
eficiencia de extracción de polifenoles por el agregado de pectinas (Furhman et al., 2001;
120
Landbo y Meyer, 2001); sin embargo este incremento no siempre fue traducido en un
aumento de la capacidad antioxidante.
6.1.2.
Extracción de polifenoles a partir de yerba mate
En referencia a la extracción de polifenoles a partir de yerba mate, se han empleado
varios solventes: agua (Dudonné et al., 2009; Markowicz Bastos et al., 2006; Schinella et al.,
2000; Turkmen y Sari, 2006), acetona, metanol y etanol en diferentes soluciones
hidroalcohólicas (Pineda Rivelli et al., 2007; Turkmen y Sari, 2006). Sin embargo la
literatura sobre la evaluación de diferentes sistemas de extracción de polifenoles a partir de
yerba mate es muy escasa.
Hasta la fecha únicamente en dos trabajos se comparó el CPT a partir de diferentes
soluciones extractivas (Pagliosa et al., 2010; Turkmen y Sari, 2006).
Turkmen y Sari (2006) analizaron el efecto de diferentes soluciones extractivas a
temperatura ambiente (agua y acetona, metanol, etanol en concentraciones 50 %, 80 % y 100
%) sobre el CPT y la CAO a partir de té negro y yerba mate. Todos los extractos preparados
con 50 % de solvente mostraron los niveles de CPT más altos, seguidos por aquellos con 80
y 100 %. Los contenidos más bajos se obtuvieron con acetona y etanol al 100 %,
concluyéndose que con incrementos en la polaridad de la solución extractiva (reduciendo la
proporción de alcohol o acetona) utilizada se logran mayores valores de CPT. En la tabla 6.1
se presenta un resumen parcial de los resultados obtenidos en dicho trabajo.
Pagliosa et al. (2010) compararon los contenidos de metilxantinas y compuestos
fenólicos además de la capacidad antioxidante de hojas y cortezas de ramas (diámetro mayor
a 10 mm; descartadas como residuo durante la cosecha) de yerba mate cosechadas (Brasil,
agosto de 2007) a partir de 30 árboles maduros (más de 20 años) usando dos soluciones
extractivas a 85 ± 1 °C: metanol/agua (80/20 v/v) y agua destilada. Los extractos acuosos de
las cortezas presentaron menores CPT que los metanólicos (12,5 y 17,5 g equivalentes a
ácido gálico (gEAG) en 100 g de muestra seca (%ms), respectivamente; p ≤ 0,05), mientras
que en el caso de los extractos de hojas, la relación se invirtió (7,01 y 5,21 gEAG %ms,
respectivamente; p ≤ 0,05); sugiriendo que la solubilidad de los compuestos fenólicos
presentes en ambos materiales vegetales es diferente.
121
Tabla 6.1 Efecto de diferentes solventes sobre el contenido de polifenoles totales y la
capacidad antioxidante
Solvente
CPT
Agua
(mg EAG / g ms)
64,2 ± 1,36
61,2 ± 0,89
50%
120,4 ± 1,49
93,7 ± 0,18
80 %
113,4 ± 1,00
94,2 ± 0,30
100%
2,6 ± 0,44
Nd
50%
106,1 ± 3,24
94,3 ± 0,53
80 %
83,5 ± 2,66
78,7 ± 1,13
100%
4,8 ± 0,06
4,7 ± 0,75
50%
96,6 ± 2,63
89,6 ± 0,17
80 %
85,6 ± 1,60
82,0 ± 1,20
100%
35,5 ± 0,36
40,0 ± 1,73
CAO (%)
Acetona
Etanol
Metanol
Datos expresados como media ± desvío estándar de tres
experiencias. nd = no detectado. EAG: equivalentes a
ácido gálico; ms: masa seca. Adaptado de Turkmen y
Sari (2006)
6.1.3.
Objetivos y justificación
El objetivo del presente trabajo fue evaluar diferentes
mezclas etanol-agua y
diferentes relaciones líquido/sólido para maximizar la extracción de polifenoles totales
(CPT) a partir de yerba mate. Para ello se usaron diferentes proporciones de etanol/agua; la
elección de ambos solventes (etanol y agua) para los diferentes ensayos se basó en las
conclusiones de Pagliosa et al. (2010)
y de Turkmen y Sari (2006). En principio la
extracción acuosa presentaría la desventaja competitiva de ser inadecuada para la extracción
122
de compuestos antioxidantes de baja polaridad o liposolubles; sin embargo estos compuestos
no representan grupos importantes entre los compuestos antioxidantes de la yerba mate. Por
otro lado, la elección de etanol en lugar de acetona se respaldó en que este alcohol es un biosolvente generado a partir de fermentación de azúcares o almidones, con posibilidades de ser
reciclado, constituyendo un elemento básico para el desarrollo de procesos sustentables.
También se consideró el uso potencial en alimentos y nutracéuticos de los extractos en polvo
de yerba mate.
Un segundo objetivo fue comparar los valores de CPT extraíbles al emplear ambos
solventes puros (agua y etanol) en sus puntos de ebullición normales y con metanol, dado
que éste último es el solvente usado en la normativa ISO referente a extracción de
polifenoles en té.
6.2. MATERIALES Y METODOS
6.2.1.
Materia prima
Se utilizó un lote de yerba mate canchada obtenido en un establecimiento industrial en
Apóstoles, Argentina.
Cada fracción (hojas y palos) fue manualmente separada y molida (malla de 1 mm). Se
utilizó la fracción de hoja molida retenida en un tamiz de 40 mesh. La fracción de palos
retenida en un tamiz de 40 mesh se utilizó únicamente durante la comparación del CPT de
cada fracción.
6.2.2.
Reactivos
Para las extracciones se utilizó etanol (Bioalcohol, Argentina; 96°) y metanol (Merck,
Argentina; grado HPLC).
Para la determinación de polifenoles totales y de capacidad antioxidante se utilizaron
los reactivos mencionados en el ítem 5.2.3.
Para la determinación de cafeína se utilizaron los siguientes reactivos: cafeína (Sigma
Ultra, Argentina; 99 % de pureza-catálogo C8960) y metanol (Merck, Argentina; grado
HPLC).
123
6.2.3.
Equipos
Las determinaciones de cromatografía HPLC se realizaron utilizando un detector
espectrofotométrico UV-Vis (Waters, modelo 481). El baño termostatizado usado fue un
Dubnoff Metabolic Shaking Incubator (GCA Corporation; Precision Scientic Group; USA).
Los demás equipos utilizados en el presente trabajo se detallan en el ítem 4.2.1.3.
6.2.4.
Determinación de humedad
El contenido de humedad se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem
4.2.1.4.
6.2.5.
Preparación del material de vidrio
El material de vidrio se preparó acorde al protocolo descripto en el ítem 4.2.1.5.
6.2.6.
Preparación de soluciones y patrones
La solución del reactivo de Folin-Ciocalteau diluido, la solución de carbonato de
sodio, las soluciones estándar de los ácidos clorogénico y sus respectivas diluciones para las
curvas de calibración se prepararon acordes al ítem 4.2.1.6.
La solución stock del radical DPPH°, la solución de DPPH de trabajo, las soluciones
estándar de ácido ascórbico y Trolox y sus respectivas diluciones se prepararon acordes al
ítem 4.2.2.6.
6.2.7.
Planeamiento factorial y análisis de datos
La extracción se optimizó siguiendo un diseño de superficie de respuesta incompleto
de dos factores con cuatro repeticiones en el punto central, constituido por 12 ensayos por
duplicado, ejecutados en orden aleatorio. Las variables respuesta fueron: contenido de
polifenoles totales (CPT), contenido de cafeína (CC), capacidad antioxidante (CAO) y
concentración de polifenoles totales (CoPT) (Tabla 6.2).
Las variables de diseño fueron i-la relación líquido/sólido (X1, g líquido/g sólido seco),
en el rango 5-11 g líquido/g sólido seco y ii- la concentración de etanol (X2, % p/p so/sn) en
el rango 15-85 % p/p so/sn. Los valores codificados de las variables de diseño fueron
124
determinados como xi=(Xi-Xio)/∆xi, donde xi es el valor codificado de la i-esima variable, Xi
es el valor real de la i-ésima variable y Xio es el valor real de la i-ésima variable en el punto
central y ∆xi fue el factor de incremento. Los factores de incremento (∆x1 = 2 g líquido / g
sólido seco; ∆x2 = 25 g etanol / 100 g de líquido) se estimaron en base al trabajo de
Sambiasi et al. (2002). Los valores reales seleccionados para las dos variables en el punto
central fueron X10 = 8 g líquido / g sólido seco y X20 = 50 g etanol / 100 g de líquido;
(entiéndase como líquido a la suma de las masas de etanol y agua).
Tabla 6.2 Listado de abreviaciones empleadas en el presente capítulo
Abreviación Variable
Contenido
CPT
polifenoles totales
Técnica analítica
Punto 6.2.10
CoPT
Punto 6.2.10
CC
CAO-EAA
CAO-ET
Unidades
de g equivalentes de ácido
clorogénico / 100 g de sólido
seco (% ms)
Concentración
de g equivalentes a ácido
polifenoles totales
clorogénico / 100 mL de
extracto
Contenido de cafeína
g de cafeína / 100 g de sólido
seco (% ms)
Capacidad
g equivalentes a ácido
antioxidante
ascórbico / 100 g de sólido
seco (EAA % ms)
Capacidad
g equivalentes a Trolox / 100
antioxidante
g de sólido seco (ET % ms)
Punto 6.2.12
Punto 6.2.11
Punto 6.2.11
Se eligió 60 °C como temperatura para la extracción acuosa y para las extracciones
correspondientes al diseño experimental debido a que la misma es una temperatura
relativamente alejada de los puntos de ebullición normales de ambos solventes puros (agua y
etanol); su empleo aseguraría la no ebullición de las mezclas.
En la tabla 6.3 se presenta el diseño factorial utilizado para la optimización y las demás
extracciones utilizadas a lo largo del trabajo.
El ajuste a los datos experimentales se realizó por regresión no lineal con un polinomio
de segundo orden con interacción (Ec. 6.1), usando el método de Marquardt. En la ecuación
6.1, Y representa la respuesta predicha, a0, a1, a2, a11, a22 y a12 son los coeficientes estimados
y X1 y X2 son las variables independientes no codificadas.
Y = a0+a1*X1+a2*X2+a11*X12+a22*X22+a12*X1*X2
6.1
125
Para evaluar el ajuste de los modelos de superficie de respuesta se empleó como
criterio al Error Promedio Porcentual (EMP) y al coeficiente de determinación (R2). El EMP
se calculó con la ecuación 6.2, donde N representa el número de datos experimentales. El
objetivo de los puntos centrales fue estimar el error puro y la curvatura.
EMP =
Yexp − Y pred
100
∑
N
Yexp
6.2.8.
6.2
Extracciones adicionales
Adicionalmente a las extracciones correspondientes al diseño experimental, se ensayaron
cinco extracciones adicionales:
•
Extracción “control” (sistema extractivo 1): Se realizó por considerarla la extracción
control.
•
Extracción acuosa (sistema extractivo 2): Su elección se basó en la hipótesis inicial:
“el empleo de agua a 60°C constituiría el sistema extractivo menos eficiente”.
•
Extracción adicional (sistema extractivo 12): Se ensayó para evaluar algún indicio
del efecto de la temperatura de extracción sobre el CPT.
•
Extracción adicional (sistema extractivo 13): Se ensayó para verificar la predicción
de los modelos en base a la superposición de máximos.
•
Extracción adicional (sistema extractivo 14): Se ensayó para verificar que el empleo
de etanol comercial (96°) efectivamente reduce la extracción de polifenoles.
6.2.9.
Obtención de los extractos y diluciones
Para la comparación del CPT de las fracciones hoja y palo, los extractos de cada
fracción fueron obtenidos según la metodología descripta en el ítem 4.2.1.7. Las extracciones
se realizaron por duplicado. La muestra (0,2 ± 0,001 g) se mezcló con metanol (5 mL, 70 %
v/v, 70 °C) en un tubo usando un agitador de tubos (10 min). Luego se enfrió a temperatura
ambiente y se centrifugó (10 min, 1800 rpm); el sobrenadante se recolectó. El paso de
126
extracción se repitió una vez más. Los sobrenadantes se combinaron y se ajustó el volumen
(10 mL, metanol, 70 % v/v, 25°C). El extracto se diluyó en proporción volumétrica 1:100
(extracto:agua) (ISO 14502-1, 2004).
El sistema extractivo 1 considerado como el método de extracción “total”, consistió en
la extracción metanolica descripta en el párrafo anterior y empleando unicamente la fracción
de hojas.
Para la determinación del tiempo de extracción, se mezcló la muestra (fracción hojas,
30 ± 0,001 g ms) con agua (240 ± 1 g, 60 ± 2 °C) en un erlenmeyer (500 mL) y se mantuvo
en un baño (60 ± 1 °C; 10, 20, 30, 50, 60 y 120 min; 200 rpm). Luego el sobrenadante se
filtró (diámetro de poro: 1 mm) y se registró el volumen recolectado (agua; sistema 2; ver
Tabla 6.3). El sistema extractivo utilizado para la selección del tiempo de extracción se basó
en la hipótesis inicial: “el empleo de agua a 60°C constituiría el sistema extractivo menos
eficiente”.
Los extractos de yerba mate para el diseño experimental se prepararon por duplicado
acorde al sistema 2 pero reemplazando el agua por cierta cantidad de solución extractiva
(agua y etanol al 96°; acorde al diseño experimental) durante 30 min (sistemas 3 al 11; ver
Tabla 6.3).
Adicionalmente se probaron por duplicado tres sistemas extractivos: sistema 12 (idem
al sistema 2 pero a 95 ± 2 °C), sistema 13 (idem al sistema 10 pero con etanol al 40 %) y
sistema 14 (idem al sistema 10 pero con etanol al 96 %). Los sobrenadantes fueron unidos y
filtrados (diámetro de poro: 1 mm), se registró el volumen recolectado y se almacenaron a 21 °C.
Antes de las determinaciones analíticas, los extractos fueron centrifugados (5 min) y
diluidos (1:5, 1:8 o 1:9 y luego 1:100 para determinar CPT y 1:50-1:200 para determinar
CAO y CC).
127
Tabla 6.3. Diseño de las extracciones empleadas con X1: relación líquido a sólido
(g líquido/g sólido seco) y X2: concentración de etanol (% p/p).
Sistema
extractivo
N°
Sistema
extractivo
Variables independientes
Valores
codificados
Valores reales Temperatura Tiempo
x1
x2
X1
X2
(°C)
(min)
-
-
*
**
70±1
10-10
Control
1
Acuoso
2
3
-
-
8
0
60±1
30
-1
-1
6
25
60±1
30
4
-1
1
6
75
60±1
30
5
1
-1
10
25
60±1
30
6
1
1
10
75
60±1
30
7
1,41
0
10,82
50
60±1
30
8
-1,41
0
5,18
50
60±1
30
9
0
1,41
8
85,25
60±1
30
10
0
-1,41
8
14,75
60±1
30
11
0
0
8
50
60±1
30
12
-
-
8
0
95±2
30
13
-
-
8
40
60±1
30
14
-
-
8
96
60±1
30
De diseño
Adicionales
*X1: 50 g líquido / g sólido; **X2: 70% v/v metanol / agua
6.2.10. Modelado de la extracción acuosa
Los modelos matemáticos para describir la curva de extracción acuosa (contenido de
polifenoles totales vs. tiempo) fueron tres: modelo de Peleg (1988) (Ec. 6.3), modelo
logarítmico (Ec. 6.4) y modelo propuesto por Pilosof et al. (1985) (Ec. 6.5).
t
CPT t = K
1 + t*K2
CPT t =a* log t +b
9∗;
CPT t = <
;
6.3
6.4
6.5
En la ecuación 6.3, CPT(t) es el contenido de polifenoles totales al tiempo t (expresado
en %ms); t es el tiempo de extracción (en minutos), K1 constante de velocidad de Peleg (en
128
min * %ms / g) y K2 constante de Peleg de capacidad en (100 g ms / g). La constante K1 se
relaciona con la velocidad de extracción (vo) a tiempo inicial (t=t0) (Ec. 6.6). La constante
K2 se relaciona con el máximo CPT en el equilibrio, (Ec. 6.7) esto es CPTe cuando t→∞.
vo=
1
6.6
K1
CPT t → ∞ = CPTe =
@
A.
6.7
En la ecuación 6.4, a y b son las constantes del modelo logarítmico, CPT(t) en el
contenido de polifenoles totales al tiempo t, expresadas en g %ms y t es el tiempo de
extracción en minutos.
En la ecuación 6.5, a representa el máximo CPT alcanzado expresado en %ms y b el
tiempo necesario para lograr un CPT igual a la mitad del CPT máximo expresado en
minutos.
6.2.11. Determinación del contenido de polifenoles totales
El CPT se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem 4.2.1.8. El CPT se
expresó como g equivalentes a ácido clorogénico (gEAC) en 100 g muestra seca (%ms) a
partir de la curva de calibración.
6.2.12. Determinación de la capacidad antioxidante
La CAO se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem 5.2.10.
La concentración del radical DPPH en el medio a cualquier tiempo y la capacidad
antioxidante calculada como el porcentaje de radical de DPPH remanente (% R) fueron
calculados según lo descripto en el ítem 4.2.2.11.
La capacidad antioxidante se expresó en g equivalentes a ácido ascórbico (EAA) y g
equivalentes a Trolox (ET) en 100 g muestra seca (EAA %ms y ET %ms) a partir de las
curvas de calibración detalladas en el apartado 4.3.2.
6.2.13. Determinación del contenido de cafeína
El contenido de cafeína (CC) se determinó por duplicado por cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC) (IRAM 20512, 2003) y se expresó como g de cafeína/100 g ms
129
(%ms). Se usó una columna C18 (Ultrasphere; 250 mm × 4.6 mm., Beckman. USA) con un
diámetro de partícula de 5 µm, una fase móvil de metanol:agua (30:70 v/v), con un caudal de
1,1 mL / min y a 280 nm usando un detector espectrofotométrico UV-Vis. Como patrón de
referencia se utilizó cafeína.
6.2.14. Análisis estadístico
Los datos experimentales obtenidos se expresaron como media ± error estándar (ee).
Los análisis empleados fueron: análisis de regresión múltiple no lineal (p ≤ 0,05), análisis de
correlación (Pearson) y prueba t (Student), usando Statgraphics Centurion XVI Académico.
6.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.3.1.
Experiencias preliminares y modelado de la extracción acuosa
Para la selección de la materia prima se comparó el CPT de las fracciones de hojas y
palos de yerba mate canchada (seca, molido grueso) extraíble empleando el sistema
extractivo 1; se encontró que el CPT de los palos es 36% menor al de las hojas (14,1 ± 1,24 y
22,2 ± 0,14 %ms respectivamente; p ≤ 0,012). Los datos están disponibles en el Anexo 3Cuadros C1 y C2 para el sistema extractivo 1). Por esta razón se eligió la fracción hojas
como materia prima para las extracciones. Hollovaty (2007) reportó CPT de 6,6 y 17,3 %ms,
para las fracciones de palos y hojas de yerba elaborada respectivamente. Estas diferencias
entre grupos de investigación pueden atribuirse a la falta de estandarización en la extracción
y la determinación del CPT y a diferencias en el material utilizado.
La diferencia en el CPT de las hojas y de los palos podría deberse a la distinta
composición y función de los tejidos en estos materiales. Mientras que en las hojas se
realizan muchas funciones metabólicas, el tallo sirve fundamentalmente para la circulación y
transporte de los metabolitos. En las hojas, el ácido clorogénico, uno de los componentes
mayoritarios de los compuestos fenólicos en la yerba mate, participa del ciclo de Calvin de la
fotosíntesis; en cambio en los tallos prácticamente no hay cloroplastos, siendo escasa la
fotosíntesis. Se demostró con isótopos radiactivos que los ácidos clorogénicos en su mayoría
se incorporan como lignina a las hojas de papas (Taylor y Zucker, 1996).
Los compuestos fenólicos se originan principalmente a partir de carbohidratos simples
(fotosintatos), a través de la vía del ácido siquímico que genera fenilalanina (y tirosina) que
130
es transformada a ácido cinámico mediante la enzima fenilalanina liasa. Ante estímulos
externos, como ataques por insectos o por hongos, se incrementa la concentración de dicha
enzima y aumenta el contenido de compuestos fenólicos, que funcionarían como metabolitos
de defensa vegetal. Los más simples actuarían como fitotóxicos o inhibiendo el crecimiento
de otras plantas competidoras en la vecindad. Los más complejos estarían representados por
los polímeros ligninas, que unidos covalentemente a la celulosa y otros polisacáridos,
aumentarían la indigestibilidad para los herbívoros; la lignificación en los vegetales bloquea
el crecimiento de patógenos y es la respuesta frecuente a la infección (Taitz y Zieger, 1991).
El CPT de las hojas usando el sistema 1 fue considerado como el valor máximo
posible de CPT y dicha extracción se consideró como extracción control para las sucesivas
extracciones.
La curva de extracción acuosa de polifenoles totales correspondiente a los datos de la
Tabla 6.4 (CPT vs. Tiempo; Fig. 6.1) muestra un aumento de la eficiencia de extracción con
el tiempo. A partir de dichos datos se observa una velocidad de extracción inicial alta,
seguida de la velocidad de extracción menor que se aproxima asintóticamente al CPT de
equilibrio. Mas precisamente, durante los primeros 10 min se logró una extracción cercana
al 69 % del CPT de equilibrio, logrando a los 20 min una extracción cercana al 82 % del
CPT de equilibrio, bajo las condiciones dadas. El equilibrio de extracción acuosa de
polifenoles totales se alcanzaría a partir de los 30 minutos, con un valor experimental de
equilibrio de 11,3 ± 0,18 %ms (sistema 2). En la tabla 6.4 se presentan los valores medios
del CPT obtenidos a partir de diferentes tiempos de extracción (datos disponibles en Anexo
3- Cuadro C3).
En la figura 6.1 se muestra la curva de extracción basada en los valores experimentales
y los predichos por los modelos de Peleg y Pilosof. En la tabla 6.5 se presentan los valores
para las constantes de los modelos matemáticos, los coeficientes de determinación y la raíz
media de la desviación al cuadrado (RMSD) aplicados a la extracción acuosa (análisis
estadístico disponible en anexo C-Cuadro C4). En el caso de los modelos de Peleg y Pilosof,
los R2 fueron altos y las raíces medias de la desviación al cuadrado estuvieron en el rango
0,45 a 0,51, lo cual implica una buena concordancia entre los valores experimentales y los
valores predichos por ambos modelos. En realidad ambos modelos, son algebraicamente
idénticos, con K1= a*b-1 y K2=a-1.
131
Tabla 6.4 Contenid
nido de polifenoles totales obtenido a diferen
entes tiempos de
extracción emple
pleando el sistema extractivo 2 (extracción acuosa)
a
Tie
Tiempo
(s)
CPT (%ms)
0
0±0
10
8,17 ± 0,01
20
9,77 ± 0,03
30
11,39 ± 0,02
50
10,46 ± 0,04
60
11,31 ± 0,18
120
11,32 ± 0,16
Valo
alores corresponden a media ± DE de
dos
os muestras analizadas por duplicado.
Figura 6.1. Comparac
ración de datos experimentales de CPT en fu
función del tiempo
de extracción (sistema extra
tractivo 2) y datos obtenidos mediante el ajus
juste de los modelos
de Pilosof y de Peleg
Una razón más por las
as que
q las extracciones acuosas serían poco efic
ficientes para extraer
compuestos polifenólicos es debido a la actividad de las enzimas
polifenol-oxidasas
presentes en el medio acuoso
oso, las cuales en medios hidroalcohólicos permanecen
per
inactivas
132
(Lapornik et al., 2005); aunque al tratarse de yerba mate canchada la misma ha sido sometida
al proceso de zapecado el cual inactiva enzimas (Capítulo 2).
En un principio y en base a la bibliografía específica analizada, la extracción acuosa a
temperatura inferior a la temperatura de ebullición fue considerada como la extracción
potencialmente más ineficiente; de allí que se eligió 30 min como tiempo de extracción para
las extracciones del diseño experimental.
Tabla 6.5 Constantes de los modelos matemáticos, coeficientes de determinación y
raíces medias de las desviaciones al cuadrado (RMSD) correspondientes a la extracción
acuosa de polifenoles totales
Modelo
Constantes
Coeficiente de
Raíz media de la
determinación
desviación al
(R2; en %)
cuadrado
(RMSD)
Peleg
K1 =0,3518 (min*100
g ms/g)
98,72
0,510
69,74
2,449
98,72
0,455
K2 = (0,0837 100 g
ms/g)
Logarítmico a=1,208
b=6,079 (g EAC/100 g
ms)
Pilosof
a=11,93 (g EAC/100 g
ms)
b= 4,2 min
.
6.3.2.
Análisis de correlación
En la tabla 6.6 se presenta el análisis de correlación con datos del coeficiente de
Pearson en el área triangular inferior a la diagonal de 1 y los correspondientes datos de
probabilidad en el área triangular superior a la diagonal de 1, para las variables: CPT, CAOEAA, CAO-ET y CC empleando extractos correspondientes a los sistemas extractivos 3 al
11 (el correspondiente análisis estadístico se halla disponible en el Anexo 3-Cuadro C10 y
133
C11). Existe una fuerte asociación lineal directa entre CPT y cualquiera de las formas de
expresar CAO, como puede apreciarse en la figura 6.2, mientras que la asociación del CPT
con el CC es una asociación lineal directa débil. No se encontró relación lineal entre CAO y
CC.
La diferencia en el CPT entre ambas fracciones (hojas y palos) y por otro lado la alta
correlación entre estos y su CAO, indican que los aportes de polifenoles totales en la yerba
mate elaborada estarán determinados fundamentalmente por la proporción hojas:palos que
contenga el producto comercial. Esta proporción normalmente es del 80:20 hojas:palos. Por
lo tanto, las yerbas elaboradas sin palo (despaladas) presentarían amplias ventajas respecto
del producto elaborado con palo, desde el punto de vista de sus propiedades antioxidantes.
Tabla 6.6 Análisis de correlación (coeficiente/probabilidad)
CPT
CAO-EAA
CAO-ET
CC
CPT
1
0,92
0,92
0,45
CAO-EAA
<10-4
1
1
0,32
CAO-ET
<10-4
<10-4
1
0,32
CC
0,03
0,12
0,12
1
Figura 6.2. Análisis de regresión entre el contenido de polifenoles totales y la
capacidad antioxidante de los extractos de yerba mate elaborada frente al radical
DPPH
6.3.3.
Análisis de superficies de respuesta
La metodología de superficies de respuesta es un conjunto de técnicas matemáticas y
estadísticas utilizadas para modelar y analizar casos en los que la variable de interés es
influenciada por otras. El objetivo es siempre optimizar la variable de interés y el modo de
lograrlo es determinar las condiciones óptimas de operación del sistema.
134
Dada la cantidad de datos experimentales correspondientes al diseño experimental, en
el presente capítulo se presentan únicamente los datos resumidos expresados como media ±
ee; sin embargo los datos se encuentran disponibles en el Anexo 3-Cuadros C5 al C10.
El diseño factorial y un resumen de los resultados se muestran en la tabla 6.7 (análisis
estadístico disponible en Anexo 3-Cuadro C12), mientras que en la tabla 6.8 se presentan
los coeficientes de regresión y los criterios para evaluar el ajuste de las superficies de
respuesta (Análisis disponible en Anexo 3-Cuadro C12). De las cuatro variables medidas
(CoPT, CPT, CAO y CC), ajustaron adecuadamente únicamente las variables CPT y CAO
con coeficientes de determinación mayores a 90% y con EMP menores a 5; mientras que el
ajuste de los modelos para CoPT y CC fue deficiente (R2 < 80 % a EMP > 5). En los
cuatro modelos, los coeficientes de los términos independientes y lineales (a0, a1 y a2) fueron
los más relevantes en comparación al resto de los coeficientes; siendo los valores de a0 todos
negativos y de a1 y a2 todos
positivos, mientras que los coeficientes de los términos
cuadráticos fueron todos negativos.
Los gráficos de superficies de respuesta muestran el valor de la variable predicha en
función de las variables independientes seleccionadas en el modelo polinomial. En el caso de
las superficies de respuestas presentadas en el presente capítulo, éstas incluyen los valores
experimentales que dieron origen a los modelos elegidos (mostrados como puntos negros).
Los gráficos de contorno facilitan la visualización de la forma de la superficie de
respuesta; en este gráfico, las curvas de los valores iguales de respuesta se grafican en un
plano donde los ejes coordenados representan los niveles de los factores. Cada curva
representa un valor específico de la altura de la superficie, es decir un valor especifico de la
respuesta estimada.
135
Tabla 6.7. Diseño de las superficies de respuesta y resumen de los valores experimentales para la extracción etanólica con X1:
relación líquido a sólido (g líquido / g sólido seco) y X2: concentración de etanol (% p/p).
Sistema
extractivo
Variables independientes
X1 (x1)
X2(x2)
Respuestas
CoPT
CPT
CC
CAO-ET
CAO-EAA
3
6(-1)
25(-1)
37,9±2,10 a,c
11,0±0,00a
0,34±0,02a,b
18,6±0,07a,d
13,2±0,05a,b
4
6(-1)
75(1)
41,5±2,04 b,c
8,2±0,15d
0,35±0,01a,b,c
14,1±0,35e
10±0,26e
5
10(1)
25(-1)
34,8±0,06 a,d
13,4±0,40b
0,45±0,02e
21,8±1,49b,c
15,5±1,04c,d
6
10(1)
75(1)
23,5±1,27f
9,7±0,60c
0,37±0,01d,e
14,3±1,12e
10,1±0,79e
7
10,82(1,41)
50(0)
29,0±1,00e
12,8±0,20b 0,43±0,01b,c,d
23,1±0,46b
16,4±0,35d
8
5,18(-1,41)
50(0)
31,7±1,19 d,e
9,6±0,00c
0,29±0,01a
17,2±1,01d
12,2±0,7a
9
8(0)
85,25(1,41)
21,6±0,73f
7,0±0,15d
0,41±0,01c,d,e
12,8±0,01e
9,1±0,01e
10
8(0)
14,75(-1,41)
36,2±1,27a,d
10,0±0,25a,c 0,35±0,01a,b,c
21±1,76a,c
14,9±1,23 b,c
11
8(0)
50(0)
42,96±0,89b
12,7±0,27b
22,2±0,45b
15,7±0,32d
0,42±0,01d,e
Los datos se expresan como media ± ee. Valores de una misma columna que poseen letras diferentes son significativamente
diferentes a p ≤ 0,012. CoPT: concentración de polifenoles totales (g EAC / mL); CPT: contenido de polifenoles totales (EAC
%ms); CC: contenido de cafeína (%ms); CAO: capacidad antioxidante (EAA %ms y ET %ms); EAC: equivalente a ácido
clorogénico; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox.
136
Tabla 6.8. Coeficientes de regresión de los términos significativos y criterios de
ajuste (variables independientes no codificadas)
CAO
Coeficiente
CoPT
(%)
CPT
CC
ET
EAA
a0
-72,54
-7,90
-0,40
-17,98
-12,63
a1
22,62
3,14
0,16
6,77
4,79
a2
1,39
0,29
0,004
0,52
0,36
a11
-1,28
-0,15
-0,008
-0,33
-0,23
a22
-0,01
-0,00
-0,00
-0,00
-0,00
a12
-0,075
-0,00
0,00
-0,015
-0,01
R2 (%)
79,5
91,5
64,2
89,9
90,3
EMP
8,09
4,45
5,89
4,88
4,81
Lineal
Cuadrático
Cruzado
R2: coeficiente de determinación; EMP: error medio porcentual; CoPT:
concentración de polifenoles totales (g EAC / mL); CPT: contenido de polifenoles
totales (%ms); CC: contenido de cafeína (%ms); CAO: capacidad antioxidante
(EAA %ms y ET %ms); EAC: equivalente a ácido clorogénico; EAA: equivalente
a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox; ms: muestra seca.
En la figura 6.3 se presentan los gráficos de superficies de respuesta y de contorno
para CoPT. En estas superficies de respuestas se observa que la curvatura de las isolineas X1
es mayor que la curvatura de las isolíneas X2 y además, se puede preveer que la CoPT será
baja cuando X1 y X2 sean ambos altos o ambos bajos. El valor de CoPT del punto central
experimental es 42,9 g EAC / mL; el cual coincidiría con la zona de máxima extracción
predicha por el modelo.
137
En la figura 6.4 se presentan los gráficos de superficies de respuesta y de contorno
para CPT (%ms).
Figura 6.3. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Concentración de
polifenoles totales, con X1: relación líquido a sólido (g líquido / g sólido seco) y X2:
concentración de etanol (% p/p).
Figura 6.4. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Contenido de
polifenoles totales, con X1: relación líquido a sólido (g líquido / g sólido seco) y X2:
concentración de etanol (% p/p).
138
En la figura 6.5 se presentan los gráficos de superficies de respuesta y de contorno
para CAO; al igual que para la CoPT, se puede observar gráficamente que dentro del rango
estudiado, la curvatura de las líneas de CAO a valores de X1 constantes es mucho mayor que
la curvatura de las líneas a valores de X2 constantes.
Figura 6.5. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Capacidad
antioxidante, con X1: relación líquido a sólido (g líquido / g sólido seco) y X2:
concentración de etanol (% p/p).
En la figura 6.6 se presentan los gráficos de superficies de respuesta y de contorno
para CC. La predicción del modelo de CC para el máximo de CC no coincide con el valor
experimental de cafeína del extracto N° 3 con un valor de 0,455 ± 0,02 cuando X1 = 10 g
líquido / g peso seco y X2 = 25 g etanol / 100 g de líquido; esta discrepancia se debe
probablemente a que el modelo posee un valor relativamente bajo de R2.
En base a los gráficos de contornos, los valores predichos para cada respuesta y los
rangos óptimos de las variables controladas se presentan en la tabla 6.9.
El CPT (11,3 ± 0,18 %ms) logrado al emplear el sistema extractivo 2 (agua, 60 °C; 30
min; X1 = 8), considerado en la presente investigación como el sistema extractivo
teóricamente más desfavorable dado que usa agua a una temperatura relativamente mas baja,
representa aproximadamente el 51 % del CPT máximo posible (22,2 ± 0,14 %ms; sistema 1;
metanol 70 %; 70 °C, 10 min).
139
Figura 6.6. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Contenido de
cafeína, con X1: relación líquido a sólido (g líquido / g sólido seco) y X2: concentración
de etanol (% p/p)
Tabla 6.9. Valores predichos para cada respuesta y rangos óptimos de las variables
controladas.
Rangos Óptimos
Respuesta
Valores Predichos
X1
X2
CoTP
40
5,7 – 9,4
22 – 66
CPT
13
8 – 11,8
27 – 53
CAO
22 (ET) y 15,5 (EAA)
7,3 – 11,5
19 – 54
CC
0,42
8 – 12,3
19 – 55
CoPT: concentración de polifenoles totales (µg EAC / mL); CPT: contenido
de polifenoles totales (%ms); CC: contenido de cafeína (%ms); CAO:
capacidad antioxidante (EAA y ET en %ms); EAC: equivalente a ácido
clorogénico; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox;
ms: muestra seca; X1: relación líquido a sólido (g líquido / g ms); X2:
concentración de etanol (g etanol / 100 g líquido)
140
El CPT máximo experimental obtenido siguiendo el diseño experimental fue 13,4 ±
0,40 %ms cuando X1 fue de 10 g líquido / g sólido seco y X2 de 25 g etanol / 100 g de
líquido (sistema 5), este valor representa el 60,4 % del valor máximo posible (22,2 ± 0,14
%ms; sistema 1; metanol 70 %; 70 °C, 10 min).
Brumovsky et al. (2009) reportaron valores de CPT en infusiones (conocidas
regionalmente como “mate cocido”) de 10 marcas diferentes de yerba mate preparadas
vertiendo 200 mL de agua destilada en ebullición sobre un saquito de aproximadamente 3 g
mantenido durante 5 minutos, de 19,40 ± 0,38 %ms. Si bien la extracción reportada en dicho
trabajo fue mayor, se debe resaltar que usaron una relación liquido a sólido (X1) de
aproximadamente 67 g líquido / g sólido seco y una temperatura de extracción próxima a los
100 °C,
mientras que en el presente trabajo se utilizaron relaciones líquido a sólido
comprendidas entre 5,2 y 10,8 g líquido / g sólido seco y 60 ± 1 °C como temperatura de
extracción. La elección de los rangos de X1 bajos se fundamentó en los futuros costos de
evaporación del solvente a escala industrial.
La zona de óptimos para CPT estaría comprendida entre 8 < X1 < 12 y 27 < X2 < 53; y
en general el CPT tiene a disminuir conforme X2 (proporción de etanol) se aleja del rango
propuesto (27 < X2 < 53).
Turkmen y Sari (2006), aplicando varias extracciones sucesivas a partir de yerba mate,
al usar una solución etanólica al 50 % reportaron un valor de CPT de 10,61 g equivalentes a
ácido gálico en 100 g ms (106,1 ± 3,24 mgEAG/g ms; datos publicados) y al usar una
solución etanólica al 80 %, un valor de CPT de 8,35 gEAG %ms (83,5 mgEAG/g ms, datos
publicados), valor que condice con lo hallado en la presente investigación al emplear una
solución etanol-agua al 85,25 %. Se debe recordar que el CPT de yerba mate, cuando es
expresado como equivalentes a ácido clorogénico, es ligeramente superior a cuando es
expresado como equivalentes a ácido gálico. El incremento de concentración de etanol en
una solución acuosa, como ocurre con cualquier otro alcohol simple, provoca una reducción
de la polaridad de la mezcla.
Pagliosa et al., (2010) usando una solución metanólica (80/20 v/v; 85 °C) reportaron
diferencias en el CPT de los tallos frescos (diámetro > 10 mm) y de las hojas frescas (p ≤
0,05; 17,5 ± 0,66 y 5 ± 0,60 gEAG %ms, respectivamente); esta diferencia en el CPT de
141
ambas partes de la planta también fue encontrada usando extractos acuosos en las mismas
condiciones de extracción (p ≤ 0,05; 5,21 ± 0,31 y 7,01 ± 0,25 gEAG %ms, para los palos y
las hojas, respectivamente).
Al realizar la superposición de las zonas de máximos para las variables dependientes
estudiadas en función de las dos variables controladas, la zona de óptimos para una
extracción de 30 min estaría entre: 8 ≤ X1 ≤ 9 y 30 ≤ X2 ≤ 50 a 60 °C, siendo los valores
predichos: 40 µg EAC / mL para CoPT; con un CPT de aproximadamente 13 %ms; una
CAO de 22 gET %ms y 15,5 gEAA %ms y un CC de 0,42 %ms.
6.3.4.
Extracciones adicionales
Los valores obtenidos a partir de la extracción con etanol (sistema 13; etanol, 40%; 60
ºC; 30 min; Tabla 6.10) resultaron razonablemente cercanos a los predichos (ver Tabla 6.9)
confirmando la validez y suficiencia de los modelos correspondientes a las variables CPT y
CAO.
Si bien el rendimiento de extracción de polifenoles totales usando agua a temperatura
próxima al punto de ebullición (sistema 12; agua; 95ºC; 30 min; Tabla 6.10) es
razonablemente cercano al obtenido usando etanol (sistema 13; etanol, 40%; 60 ºC; 30 min;
Tabla 6.10), la CAO resultó mayor en el primer caso (sistema 12; agua; 95ºC; 30 min; Tabla
6.10).
Bastos et al. (2006) sugieren que la solubilidad de los compuestos fenólicos presentes
en hojas de yerba mate y en yerba mate elaborada (compuesta por 80:20 hojas:palos) es
mayor en solventes polares como el agua. Además la mayor temperatura de extracción
empleada (95 ± 1 °C) provoca un incremento en la velocidad de difusión y en la solubilidad
de las sustancias extraíbles. De acuerdo con Naczk y Shaidi (2005), los compuestos
fenólicos que presentan mayor solubilidad en agua se hallan presentes principalmente en las
células vasculares, hallándose bajo la forma de glicósidos, mientras que los menos solubles
se hallan asociados principalmente al material lignocelulósico.
Los resultados obtenidos por Pagliosa et al. (2010) a partir de hojas de yerba mate
usando el método de reducción del radical DPPH revelan una CAO mayor en 1,2 órdenes de
magnitud para los extractos acuosos en comparación con los extractos metanólicos. Turkmen
142
y Sari (2006) afirman que los extractos de yerba mate y té negro obtenidos con soluciones
extractivas altamente polares (con menor proporción de alcoholes simples) muestran una
mayor eficacia como atrapadores de radicales libres que los obtenidos con soluciones
extractivas menos polares.
Empleando etanol puro como solvente extractivo (sistema 14; etanol, 96º; 60 ºC; 30
min; Tabla 6.10), la extracción de los compuestos fenólicos se vió reducida
aproximadamente en 6,4 y 5,3 veces respecto de las soluciones extractivas 12 y 13, en
concordancia con los resultados publicados por Turkmen y Sari (2006). La concentración de
etanol juega un rol clave cuando se desea extraer la mayor cantidad de antioxidantes a partir
de una matriz vegetal; el usode etanol sin el agregado de agua no permite alcanzar altos
CPT; mientras que el empleo de mezclas de agua y etanol en supone la posibilidad de extraer
compuestos antioxidantes de baja polaridad. Ademas se debe tener en cuenta que los
compuestos polifenolicos deben difundirse desde el interior de la hoja hacia el seno de la
solución extractiva, a través de caminos tortuosos y probablemente se hallan asociados
macroscópicamente entre si y/o con moléculas de cafeína.
Tabla 6.10. Datos experimentales de las extracciones adicionales
Sistema
extractivo
12
CPT
CAO-ET
CAO-EAA
12,25 ± 0,16
26,9 ± 0,4
19,0 ± 0,3
13
12,33 ± 1,35
22,5 ± 2,8
16,0 ± 1,9
14
2,85 ± 0,10
4,2 ± 0,2
3,1 ± 0,2
Datos expresados como media ± ee; CPT: contenido de polifenoles totales (%ms);
CAO: Capacidad antioxidante (EAA %ms y ET %ms); EAC: equivalente a ácido
clorogénico; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox; ms:
muestra seca
Si bien la extracción metanólica (sistema 1; metanol 70 %; 70 °C, 10 min; CPT = 22,2
± 0,14 %ms) fue la más eficiente, el etanol y el agua han mostrado ser eficaces en la
extracción de los compuestos fenólicos presentes en yerba mate canchada y presentan la
ventaja competitiva de ser de baja toxicidad (etanol) y alta abundancia relativa (agua).
Si se comparan los valores de CPT obtenidos al emplear agua como único solvente
extractivo a 60 ºC y 95 ºC (sistemas 2 y 12) y empleando una misma relación X1, se
143
evidencia un efecto positivo de la temperatura sobre esta variable (11,3 ± 0,18 %ms versus
12,25 ± 0,16 %ms); posiblemente por el incremento en la velocidad de difusión que suponen
los incrementos en la temperatura y por un mayor daño en la estructura del tejido que
disminuiría las barreras estructurales a la transferencia de masa.
Considerando el uso potencial en alimentos y nutracéuticos, los extractos acuosos de
vegetales presentan ventajas en relación a la certificación y seguridad, por lo que la
extracción acuosa a temperatura de ebullición sería la recomendada.
6.4. CONCLUSIONES DEL CAPITULO
• La fracción hojas posee mayor CPT que la fracción palos, por lo que para la
extracción de polifenoles a partir de yerba mate canchada se sugiere la utilización
únicamente de la fracción de hojas.
• Existe una fuerte asociación lineal directa entre CPT y cualquiera de las formas de
expresar CAO, mientras que la asociación del CPT con el contenido de cafeína es una
asociación lineal directa débil.
• La eficiencia de extracción y la capacidad antioxidante de los extractos de yerba mate
dependen, entre otros factores, de la polaridad de la solución extractiva, la cual determina en
forma cuantitativa y cualitativa los compuestos antioxidantes extraíbles. Se recomiendan dos
sistemas extractivos: soluciones etanólicas (concentraciones 30-50 % p/p con relaciones
líquido a sólido comprendidas entre 8 y 9 g líquido / g ms durante 30 min a 60 ± 2 °C y
agua en ebullición usando la misma relación líquido a sólido (8-9) y el mismo tiempo de
extracción (30 min).
144
CAPITULO 7
“Producto en polvo”
145
7.1. INTRODUCCIÓN
7.1.1.
Alimentos funcionales
El consumidor actual es un consumidor conciente del cuidado de su salud y por ende
de su cuerpo y tiende a elegir productos que contribuyan a su salud.
El concepto de alimento funcional esta mas allá de la mera cobertura de necesidades de
nutrientes; está relacionado a la prevención y tratamiento de enfermedades; son alimentos
que contienen ciertos componentes capaces de afectar de forma específica determinadas las
funciones del organismo y así promover un efecto benefico físico y/o mental.
No hay consenso en cuanto a si el término “alimentos funcionales” incluyen a los
alimentos naturales, sin procesamiento, que son una fuente superior de determinados
componentes benéficos (“alimentos saludables”) o simplemente abarcan a alimentos
procesados para lograr
eliminar o modificar la concentración de algún determinado
compuesto o directamente sustituirlo o para alterar la disponibilidad metabólica de algún
determinado componente o grupo de componentes presentes en el alimento. Ejemplos de
alimentos funcionales naturales lo constituyen la soja y otras legumbres, el té y el tomate, los
cítricos, el aceite de oliva o la carne de pescado; mientras que los alimentos de bajo
contenido lipídico, los libres de gluten, los alimentos enriquecidos con minerales, folatos y/o
vitaminas y las mermeladas dietéticas son claros ejemplos de alimentos funcionales del
segundo grupo (Silveira Rodríguez et al., 2003).
Son beneficiosos para la salud, pero a la vez deben ser consumidos en una medida
justa; es decir que deben ser usados como un complemento saludable en el marco de una
dieta apropiada y ejercicio activo (Hasler, 2002; Silveira Rodríguez et al., 2003).
Según Silveira Rodríguez et al. (2003) los alimentos funcionales pueden ser
clasificados como:
Alimentos Probióticos:
Los probióticos son alimentos funcionales que se caracterizan por contener
microorganismos vivos que al ser ingeridos en cantidades suficientes, ejercen un efecto
positivo en la salud más allá de los efectos nutricionales básicos. Las bacterias ácido-lácticas
146
ejercen similares acciones saludables en el organismo: equilibran la flora intestinal y
potencian el sistema de defensas o inmunológico.
El yogur (obtenido de la fermentación de la leche por Lactobacillus bulgaricus y
Streptococcus thermophilus) y otros derivados lácteos fermentados (Bifidobacterium y
Lactobacillus casei inmunitas, etc.) son los principales representantes de este grupo de
alimentos funcionales, al que también pertenecen algunos vegetales y productos cárnicos
fermentados. No todas las cepas de bacterias ejercen efectos probióticos y existe gran
variabilidad en cuanto a sus acciones, tanto entre las distintas especies como dentro de la
misma. Para su funcionalidad, resulta esencial que los probióticos permanezcan vivos
durante su tránsito por el tracto gastrointestinal (Silveira Rodríguez et al., 2003).
Alimentos Prebióticos:
Un prebiótico es el sustrato trófico del probiótico. Son sustancias del alimento no
digeribles por el hombre, las cuales benefician al huésped estimulando de forma selectiva el
crecimiento y/o actividad de una o un número limitado de bacterias en el colon. Actúan a
nivel gastrointestinal; llegando al colon sin ser digeridos y allí son fermentados por las
bacterias colónicas, lo que favorece la selección de la flora de bifidobacterias u otras
bacterias potencialmente beneficiosas (Silveira Rodriguez et al., 2003; Gil Hernández,
2010b).
Los prebióticos son generalmente hidratos de carbono de cadena corta que pueden ser
fermentados a lo largo del tracto gastrointestinal; es por ello que un requisito clave para que
un ingrediente sea clasificado como prebiótico es que no sea hidrolizado ni absorbido en la
parte alta del tracto gastrointestinal.
Todavía hay poca experiencia en su empleo; por el momento los únicos datos
relevantes se refieren a los fructanos tipo inulina (oligosacáridos no digeribles: inulina,
hidrolizados enzimáticos de la inulina, oligofructosacáridos (C2-10), fructosacáridos
sintéticos de cadena larga) que se agregan a leches, yogures y flanes. De forma natural están
presentes en el trigo, la cebolla, los plátanos, el ajo y los puerros (Silveira Rodríguez et al.,
2003).
147
Alimentos Simbióticos:
Los alimentos simbióticos son alimentos que combinan un probiótico (generalmente
una bacteria) con un prebiótico (generalmente fructanos naturales como carbohidratos). Su
nombre alude al sinergismo entre ambos componentes. Ejemplos de este grupo de alimentos
son las leches que contienen bifidobacterias (probiótico) con galactooligosacáridos o con
fructooligosacáridos (prebióticos).
Alimentos enriquecidos en fibras:
La denominación de fibra dietética se aplica a aquellas sustancias de origen vegetal, en
su mayor parte hidratos de carbono, no digeridas por las enzimas humanas y con la
peculiaridad de ser parcialmente fermentadas por bacterias colónicas. La fibra insoluble
engloba a la celulosa, hemicelulosas y lignina; entre las acciones funcionales que se le
atribuyen se destacan la sensación de saciedad, el incremento del bolo fecal, el estímulo de la
motilidad intestinal; la mayor necesidad de masticado, el aumento de la excreción de ácidos
biliares y propiedades antioxidantes e hipocolesterolemiantes. La fibra soluble está
representada fundamentalmente por pectinas, gomas, mucílagos y algunas hemicelulosas; su
principal característica es su capacidad para atrapar agua y formar geles viscosos, lo que
determina su poder laxante. Asimismo, al incrementar significativamente la cantidad y
consistencia del bolo fecal se consigue un efecto positivo en el caso de diarreas. Además
produce un enlentecimiento del proceso digestivo, del tránsito y de la absorción de hidratos
de carbono, así como una adicional sensación de plenitud.
Ambos tipos de fibras se encuentran en proporciones variables en los alimentos,
aunque de forma genérica puede decirse que la insoluble predomina en los cereales enteros
mientras que la soluble abunda en frutas, vegetales y tubérculos. De forma industrial
numerosos productos aparecen enriquecidos con las mismas, desde panes, bollos y bebidas a
otros tan variados como fiambres, patés o embutidos (Silveira Rodríguez et al., 2003).
Alimentos enriquecidos en ácidos mono y poli-insaturados:
La mayor parte de las investigaciones encaminadas a optimizar la composición grasa
de la dieta se han centrado en los ácidos grasos mono y poli-insaturados y, más
recientemente, en una nueva familia de moléculas vegetales: los fito-esteroles.
148
El representante dietético fundamental de los ácidos grasos mono-insaturados es el
acido oleico y entre los poli-insaturados se destacan el ácido linolénico y el ácido linoleico.
La industria alimentaria fabrica alimentos que han sustituido ácidos grasos saturados o poliinsaturados omega 6 por omega 3, como bollería, leche y derivados, embutidos o incluso
huevos (modificando la composición de los piensos de las gallinas, con adición de aceites de
pescado). Un claro ejemplo lo constituyen las leches leches enriquecidas con omega 3.
Alimentos enriquecidos en fitoesteroles:
Genéricamente la denominación de fito-esteroles engloba tanto a los fitoesteroles
como a fitoestanoles. Son propiamente esteroles que se describen como sólidos cristalinos a
temperatura
ambiente
y
son
principalmente
alcoholes
derivados
del
ciclopentanoperhidrofenantreno con una estructura química muy similar a la del colesterol.
Los fitoestanoles son menos abundantes en la naturaleza que los fitoesteroles; pueden ser
obtenidos por reducción química de los fitoesteroles, como en el caso de sitostanol,
campestanol y estigmastanol. En la naturaleza, se han descrito más de 200 tipos diferentes de
esteroles vegetales en diferentes especies de plantas, siendo los más abundantes: el βsitosterol, el campesterol y el estigmasterol, constituyendo el 95-98%de los fitoesteroles
identificados. Su principal fuente natural son los aceites vegetales (de cereales, de semillas
oleoginosas, legunmbres, frutas secas, etc.). Debido a su similitud estructural con el
colesterol, compiten con éste por la solubilización en micelas; de este modo, inhiben la
absorción tanto del colesterol de la dieta como el endógeno (efecto hipocolesterolemiante).
En la industria de los alimentos se presentan por enriquecimiento en alimentos tanto grasos
(como margarinas) como poco grasos (zumos de frutas, leches descremadas). Un claro
ejemplo lo constituyen las leches “anti-colesterol” (con fitoesteroles) (Ortega al., 2006;
Simojoki et al., 2005).
Alimentos ricos en fitoestrógenos:
Los fitoestrógenos (especialmente las isoflavonas) son moléculas de origen vegetal no
esteroideas que poseen una estructura difenólica heterocíclica común, a la cual se encuentran
unidos grupos oxo, ceto, hidroxi o ésteres con una estructura química similar a los
estrógenos; se les atribuyen ciertas acciones beneficiosas como reducción de la osteoporosis,
disminución de la incidencia de cáncer de mama y de próstata, mejora de la sintomatología
149
asociada al climaterio y mejoras en el sistema cardiovascular. Su mayor fuente natural son
las legumbres (especialmente la soja), el trébol rojo, y ciertos cereales (Bacciottini et al.,
2007; Heide et al., 2004).
Alimentos ricos en compuestos (poli)-fenólicos:
Se encuentran principalmente en frutas y verduras asi como también en bebidas como
el té, la cerveza, el vino, el cacao y diferentes bebidas derivadas de productos naturales. Los
polifenoles importantes en tecnología de alimentos se clasifican según su estructura química
(generalmente en función de sus anillos fenólicos y las sustituciones presentes en dichos
anillos). Este grupo de fitoquímicos recientemente ha despertado gran interés, incluso a nivel
popular, debido a su actividad antioxidante la cual consiste en la capacidad de neutralizar
radicales libres o de quelar metales. Tambien pueden ejercer un efecto pro-oxidante como el
caso del consumo en altas dosis o ante la presencia de determinados compuestos.
La mayoría de estos compuestos confieren a los alimentos unas características
peculiares en cuanto al sabor: amargor (polifenoles de bajo peso molecular) y astringencia
(polifenoles de alto peso molecular) (Lesschaeve y Noble, 2005; Silveira Rodríguez et al.,
2003).
Otros productos:
Cabe mencionar la oferta de ciertos productos que favorecen las funciones psicológicas
y de conducta relacionadas con el rendimiento cognitivo, el humor y el manejo del estrés,
entre ellos los alimentos ricos en sustancias excitantes (cafeína, ginseng, etc.) o
tranquilizantes.
7.1.2.
Extractos en polvo
El interés por compuestos fitoquímicos bioactivos se ha visto incrementado en los
últimos años debido a su poder anti-radical y a su asociación con la prevención de
enfermedades. Actualmente se producen extractos con propiedades antioxidantes a partir de
plantas comestibles y medicinales y a partir de subproductos que antiguamente constituían
desechos.
150
Los extractos de yerba mate constituyen una atractiva materia prima para la industria
alimenticia y nutracéutica debido a su alto contenido de polifenoles (principalmente
derivados de ácidos hidroxicimanoilquínicos), con buena propiedades antioxidantes (Bravo y
Angus, 2007; Heck et al., 2008) y antimicrobianas (Heck y Mejía Gonzalez, 2007).
Una manera conveniente de incrementar la vida de anaquel y mejorar las
características organolépticas de cualquier extracto vegetal es transformándolo en un polvo
seco estable por secado por atomización o spray
con el agregado de los polímeros
adecuados.
Desde el punto de vista de la tecnología de alimentos, la microencapsulación, ya sea
por el agregado de algún polímero formador de película o por el atrapamiento en una matriz
polimérica, reduce el contenido de humedad y actúa como una barrera física al oxigeno y a
ciertas moléculas pequeñas, inhibiendo las reacciones de degradación oxidativas y
enzimáticas; incluso dependiendo del polímero usado, la microencapsulación puede mejorar
las características de solubilidad/dispersión y contribuir al control de las modificaciones
organolépticas del producto final.
7.1.3.
Secado spray
El secado por aspersión es una operación de secado en la cual un producto líquido
(solución, emulsión o suspensión) es atomizado en una corriente de gas caliente
(normalmente aire, pero puede ser reemplazado por un gas inerte como el nitrógeno) para
convertirse casi instantáneamente en un producto en polvo.
El tamaño de las partículas de polvo depende fundamentalmente de las condiciones de
operación, entre las que se destaca la velocidad de alimentación del liquido, pudiendo
obtenerse polvos finos o polvos particulados (2-3 mm).
Este tipo de secado es muy común en la industria de alimentos, ya que permite
asegurar la estabilidad microbiológica del producto final, reducir el riesgo de degradaciones
químicas o biológicas, y reducir los costos de almacenamiento y transporte.
Para ciertas combinaciones de materiales a secar y ayudantes de secado, el secado por
aspersión puede ser considerado un método de encapsulación, como es el caso del secado de
leche: el glóbulo de grasa constituye el material encapsulado en una pared formada por una
151
mezcla de azúcares y proteínas. El secado por aspersión resulta muy apropiado en el caso de
la encapsulación de compuestos sensibles al calor como los polifenoles.
La adición de agentes de secado (“carriers”) es muy común en el secado por aspersión.
Los tipos más usados incluyen a polímeros de carbohidratos, gomas, y polímeros sintéticos y
semisintéticos derivados de la celulosa. Se pueden mencionar, entre otros, maltodextrinas,
goma arábica, proteínas de soja, cloruro de sodio, glucosa, etc. Cada agente posee sus
ventajas y desventajas en términos de propiedades, costos y eficiencia de encapsulación. Las
maltodextrinas son los materiales más empleados debido a su alta solubilidad, baja
viscosidad y bajo contenido de azúcar (Robert et al., 2010) y han mostrado ser efectivas en la
preservación de compuestos fenólicos, como carotenoides, flavonoides (Fernandes Souza et
al., 2009), antocianinas (Robert et al., 2010) y aditivos aromáticos. Poseen la desventaja de
presentar baja temperatura de transición vítrea, lo cual puede facilitar la formación de
cristales ante aumentos de temperatura, contribuyendo a la disrupción de la integridad
estructural de la cobertura y a la tendencia de aglomeración y colapso de los polvos.
7.1.4.
Actividad acuosa, isotermas de adsorción, y temperatura de transición
vítrea - Conceptos y aplicaciones.
Desde hace muchos años el concepto de actividad acuosa (aw) viene siendo
considerado en lugar del contenido de humedad en lo concerniente a la calidad y estabilidad
de los alimentos. Las isotermas de adsorción constituyen una importante herramienta
termodinámica para predecir las interacciones entre el agua y los componentes del alimento;
las mismas describen la relación entre aw y el contenido de humedad de equilibrio de un
alimento a una determinada temperatura. Numerosos son los modelos propuestos para la
descripción de las isotermas de adsorción, entre ellos los más citados son los modelos de
Guggenhein, Anderson y deBoer (GAB) y de Brunauer-Emmett-Teller modificado (BET)
(Tabla 7.1). En dichas ecuaciones, Xe, Xm y aw representan el contenido de humedad en el
equilibrio en base seca (g agua/g masa seca), el contenido de humedad de la monocapa en
base seca (g agua/g masa seca), y la actividad acuosa, respectivamente, mientras que los
demás símbolos (CBET,CGAB, K, n) son constantes matemáticas de cada modelo.
Los modelos GAB y BET modificado contemplan el concepto de contenido de
humedad de la monocapa. Conceptualmente, Xm representa la cantidad de agua que se
152
encuentra fuertemente ligada a ciertos sitios activos del alimento y es considerado un valor
importante para asegurar la estabilidad del alimento.
Tabla 7.1. Modelos matemáticos usados para el modelado de las isotermas de
adsorción
Modelo
GAB (van den
Expresión matemática
BC =
Berg y Bruin,
DE FGHI JGHI KL
@ JGHI KL @ JGHI KL FGHI JGHI KL (7.1)
1981)
BET modificado
(Brunauer et al.,
BC =
DE FIMN KL [@
@ KL [@
P @ KL Q P KL QRS ]
FIMN @ KL FIMN KL QRS ]
(7.2)
1938)
El concepto de actividad acuosa debe ser considerado conjuntamente con el concepto
de temperatura de transición vítrea a fin de evaluar la estabilidad de un alimento
deshidratado, ya que ambos conceptos permiten un abordamiento integral del rol del agua en
los alimentos (Moraga et al., 2006; Kurozawa et al., 2009; Tonon et al., 2009). Aquellos
alimentos que posean bajos contenidos de humedad y que sean almacenados a temperaturas
inferiores a su temperatura de transición vítrea pueden ser considerados estables.
La temperatura de transición vítrea (Tg) se define como la temperatura a la cual un
sistema amorfo pasa del estado “vítreo” al estado “goma”. Cuando los alimentos de tipo
polvo amorfo son almacenados a temperaturas superiores a su Tg o cuando su contenido de
humedad se incrementa, dichos polvos pueden sufrir en cambio de estado pasando del estado
vítreo al estado gomoso. Este cambio de estado suele ir acompañado de importantes cambios
estructurales en el sistema, tales como pérdida de la naturaleza “free flowing”, pegajosidad,
aglomeración, colapso y cristalización. Estos cambios están asociados a un aumento de la
movilidad molecular y a una disminución de la viscosidad respecto del estado amorfo vítreo
(Hartmann y Palzer, 2011).
153
Ligeros incrementos de agua en el alimento provocan drásticas disminuciones en la Tg
del alimento. Este efecto plastificador del agua sobre la Tg suele ser modelado con la
ecuación de Gordon y Taylor, aunque también se encontró otro modelo empírico
desarrollado por Khalloufi et al. (2000) para alimentos (Tabla 7.2). En dichos modelos, Tg
representa la temperatura de transición vítrea, Tgs representa la temperatura de transición
vítrea de los sólidos anhidros o secos (°C); Tgw representa el valor de temperatura de
transición vítrea del agua (-135°C; Johari et al., 1987), ww es el contenido de humedad en
base seca; ws=(1-ww) representa la fracción de sólidos secos en base seca y aw representa a
la actividad acuosa. Los símbolos k, C, c, D, d y E representan constantes propias de cada
modelo.
La temperatura de transición vítrea de un sistema es proporcional al peso molecular de
sus componentes; por ello el agregado de agentes de secado de alto peso molecular tales
como maltodextrina o goma arábiga contribuye a elevar la temperatura de transición vítrea
del sistema alimenticio.
Tabla 7.2 Modelos matemáticos usados para el modelado de la variación de la
temperatura de transición vítrea con el contenido de humedad y la aw
Modelo
Expresión matemática
Gordon y Taylor (1952)
UV =
Khalloufi et al. (2000)
UV =
7.1.5.
WX YVX ZWL YVL
WX ZWL
(7.3)
[\W + ]\W + ^
_\W + `\W + 1
Objetivos
Los objetivos del presente trabajo fueron:
•
desarrollar un procedimiento adecuado de secado por aspersión para obtener
un producto final altamente soluble y con alto contenido de polifenoles totales,
a partir de extractos concentrados de yerba mate con el agregado de
maltodextrina como agente de secado.
154
•
proporcionar datos experimentales de adsorción de agua y de la temperatura de
transición vítrea de mate soluble obtenido por secado spray y formulado con
tres porcentajes de maltodextrina (MD: 0; 7,05 y 14,10 % p/v) a fin de
disponer de información útil relacionada a la estabilidad de los polvos.
7.2. MATERIALES Y METODOS
7.2.1.
Materia prima
Se utilizó un lote de extractos concentrados de yerba mate canchada (jarabe) con un
contenido de sólidos solubles (SS) de 21 ± 1 % y un contenido de polifenoles totales (CPT)
de 9,60 ± 0,075 g equivalentes a ácido clorogénico por 100 mL de jarabe (gEAC / 100 mL) y
45,73 ± 0,35 g equivalentes a ácido clorogénico por 100 gramos de sólidos solubles (gEAC /
100 SS), obtenido en un establecimiento industrial en Apóstoles, Argentina.
7.2.2.
Reactivos
Para la determinación de polifenoles totales se utilizaron los siguientes reactivos: ácido
clorogénico (MP Biomedicals), reactivo de Folin-Ciocalteu (Fluka), carbonato de sodio
(Anedra) y acetonitrilo (Merck; grado HPLC).
Para la determinación de CAO se utilizaron los siguientes reactivos: radical DPPH
(radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo; Sigma), metanol (Merck; grado HPLC), ácido
ascórbico (Sigma Ultra) y Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico;
Aldrich).
Para la determinación de cafeína se utilizaron los siguientes reactivos: cafeína (Sigma
Ultra, 99 % de pureza, catálogo C8960) y metanol (Merck; grado HPLC).
El agente de secado utilizado fue maltodextrina (MD) (DE: 15, Globe 019150,
Argentina,).
7.2.3.
Equipos
Las mediciones de los parámetros de color se realizaron usando un colorímetro Hunter
Lab modelo D25-9 de Hunter Associates Laboratory (Virginia, EEUU).
155
Las mediciones de actividad acuosa se realizaron usando un medidor de aw modelo
AquaLab PawKit (marca Decagon Devices; Pullman, Washington, EEUU).
Las mediciones de temperatura de transición vítrea se realizaron usando un calorímetro
diferencial de barrido (Equipo Mettler DSC 30 con un procesador TA 4000 y un sistema de
análisis térmico TA72). Se emplearon cápsulas de aluminio (Mettler aluminum pan).
Los demás equipos utilizados en el presente trabajo se detallan en el ítem 4.2.1.3.
7.2.4.
Preparación del material de vidrio
El material de vidrio se preparó acorde al protocolo descripto en el ítem 4.2.1.5.
7.2.5.
Preparación de soluciones y patrones
La solución de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido, la solución de carbonato de sodio,
la solución estándar del ácido clorogénico y sus respectivas diluciones para las curvas de
calibración, se prepararon de acuerdo al ítem 4.2.1.6.
La solución stock del radical DPPH°, la solución de DPPH de trabajo; las soluciones
estándar de ácido ascórbico y Trolox y sus respectivas diluciones se prepararon de acuerdo al
ítem 4.2.2.6.
7.2.6.
Preparación de las muestras y condiciones de secado
La maltodextrina fue añadida directamente al jarabe, con agitación manual hasta su
completa disolución, antes del proceso de secado spray. La tabla 7.3 muestra las diferentes
formulaciones (jarabe + maltodextrina) ensayadas siguiendo el diseño experimental. Las
experiencias de secado spray se realizaron a escala piloto en un equipo modelo EQI
(ESPAQ, Argentina) provisto de un rotor atomizador de disco (120 mm de diámetro). El
caudal de alimentación fue 200 mL / min y se usó una bomba de desplazamiento positivo.
Los polvos obtenidos se mantuvieron en frascos de vidrio con cierre hermético a -20 ºC
hasta su análisis, que no tardó mas de 7 días en realizarse.
7.2.7.
Planeamiento factorial y análisis de datos
Para la optimización del secado por aspersión se usó un diseño de superficie de
respuesta con cinco repeticiones en el punto central, constituido por un total de 13 ensayos
156
en orden aleatorio con temperatura del aire de entrada (X1, ºC) en el rango 192 - 240 ºC y
concentración de maltodextrina (X2, %p/v), en el rango de 0 a 14,1 g MD / 100 mL como
variables de diseño. Las variables respuesta fueron: contenido de polifenoles totales (CPTP),
capacidad antioxidante (CAO) y solubilidad del polvo a 25°C (S). Los valores codificados
de las variables de diseño fueron determinados como xi=(Xi-Xio)/∆xi, donde xi es el valor
codificado de la i-ésima variable, Xi es el valor no codificado de la i-ésima variable, Xio es
el valor no codificado de la i-ésima variable en el punto central y ∆xi es el factor de
incremento. El diseño experimental empleado se presenta en la tabla 7.3. Para estimar la
función respuesta, se realizó un análisis de regresión con un polinomio de segundo orden
(Ec. 7.4), donde y es la respuesta predicha, a0, a1, a2, a11, a22 and a12 son los coeficientes
estimados y x1 y x2 son las variables independientes codificadas. El grado de ajuste se
determinó utilizando los parámetros estadísticos: coeficiente de determinación (R2), valor de
Chi-cuadrado (χ2, ecuación 6.2), raíz del cuadrado medio del error (RCME, Ec. 6.3) y error
medio promedio porcentual (EMP, Ec. 6.4). Los valores de R2 proporcionan el porcentaje de
variación explicada por el modelo; el valor de χ2 considera las diferencias entre valores
experimentales (exp) y predichos (pre), el número de datos experimentales (N) y el número
de parámetros (Np) utilizados en el modelo (N-Np, o grados de libertad). La RMSE se
expresó como la diferencia media absoluta entre los valores experimentales y los predichos,
mientras que el error promedio porcentual se relaciona con la diferencia relativa. (Scipioni et
al., 2010). El propósito de los puntos centrales fue estimar el error puro y curvatura.
y = a0+a1 . x1+a2 . x2+a11 . x12+a22 . x22+a12 . x1 . x2
7.2.8.
7.4
Diluciones
Para la determinación de contenido de polifenoles totales, las muestras de jarabe se
diluyeron (relación jarabe:agua; 1:50 v/v y luego 1:100 v/v); en el caso de los polvos, los
mismos fueron reconstituidos de acuerdo a la metodología descripta en la norma ISO-14502.
Brevemente, una porción de polvo (0,500 ± 0,001g; bh) se disolvió en agua caliente (25 mL;
temperatura inferior a 60 °C) y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Luego se agregó
acetonitrilo (5 mL) y se enrazó la mezcla (agua; 50 mL)
Para determinar la CAO, las muestras de jarabe se diluyeron (relación jarabe:agua;
1:50 v/v y luego 1:25 v/v); en el caso de los polvos, alrededor de 0,5 g (bh) se
157
reconstituyeron en agua (50 mL) y luego se diluyeron (relación reconstituido:agua; 1:25
v/v).
7.2.9.
Determinación de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinó acorde a la metodología descripta en
el ítem 4.2.1.8.
El contenido de polifenoles totales en el jarabe (CPTJ) se expresó como g EAC en 100
mL de jarabe (gEAC / 100mL) y como g EAC en 100 g de sólidos solubles (gEAC %SS).
El contenido de polifenoles totales teórico en los polvos (CPTT) se calculó como el
cociente porcentual entre el contenido de polifenoles totales del jarabe (gEAC / 100 mL) y
el peso total de los sólidos contenidos en 100 mL de la formulación ingresada al secadero
(SST; g sólidos solubles / 100 mL de formulación).
El contenido de polifenoles totales de los polvos se expresó como gEAC / 100 g de
polvo seco (CPTP) y como gEAC / 100 de polvo seco libre de maltodextrina (CPTP*).
La eficiencia de retención de polifenoles totales (EPT; en %) se calculó como el
cociente entre el CPTP y el CPTT en porcentaje.
7.2.10. Determinación de la capacidad antioxidante
La CAO se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem 6.2.11.
La concentración del radical DPPH en el medio a cualquier tiempo y la capacidad
antioxidante calculada como porcentaje de DPPH remanente fueron calculados según lo
descripto en el ítem 4.2.2.11.
La capacidad antioxidante se expresó como equivalentes de ácido ascórbico (AAE) y
equivalentes de Trolox (ET) en g / 100 g de polvo seco (CAO, g %ms) y g / 100 g de polvo
seco libre de maltodextrina (CAO*; g %ms lm).
158
7.2.11.
Determinaciones analíticas del jarabe
7.2.11.1.
Sólidos solubles
Para determinar los sólidos solubles del jarabe (SS), el jarabe (50 mL) se filtró y una
alícuota (10 mL) fue transferida a un vaso tarado y evaporada a sequedad. El residuo se secó
en estufa (12 h; 103 ± 2 ºC). Las determinaciones se realizaron por duplicado. Los resultados
se expresaron en unidades de concentración p/v (soluto/jarabe). Los sólidos solubles totales
(SST; g sólidos solubles / 100 mL de formulación) en cada formulación ingresada al
secadero se calcularon como la suma de los sólidos solubles aportados por el jarabe (SS, g
sólidos solubles / 100 mL) y los sólidos aportados por la maltodextrina (%MD, g sólidos /
100 mL de formulación).
7.2.12.
Determinaciones analíticas de los polvos
7.2.12.1.
Determinación de humedad
El contenido de humedad se determinó por triplicado acorde a la metodología descripta
en el ítem 4.2.1.4. Los resultados se expresaron como porcentaje de masa (g %bh).
7.2.12.2.
Densidad
La densidad (db) fue determinada por triplicado; para ello, una muestra en polvo
(aproximadamente 4 g, bh) se colocó en una probeta de 20 mL, luego se asentó el contenido
manualmente dejando caer la probeta 10 veces desde una altura de 1,5 cm, registrándose la
lectura del volumen final ocupado por el polvo. La densidad se calculó como la masa de
polvo sobre el volumen ocupado por el mismo (Goula et al., 2004).
7.2.12.3. Solubilidad en agua
Para la determinación de la solubilidad, la muestra en polvo (aproximadamente 2 g,
bh) se mezcló con agua (40 mL; 25 ºC) usando un agitador de tubos (1 min; 1800 rpm).
Luego se centrifugó (5 min; 2500 g). Una alícuota del sobrenadante (20 mL) se extrajo
cuidadosamente sin remover los sedimentos y fue secada en estufa (6 h; 105 ± 2 ºC). El
porcentaje de solubilidad se calculó como el peso de sobrenadante seco con respecto al peso
del polvo contenido en la correspondiente alícuota (Kha et al., 2010; Cano-Chauca et al.,
2005). Las mediciones se realizaron por duplicado.
159
7.2.12.4.
Actividad acuosa
Los valores de actividad acuosa (aw) se determinaron usando el medidor de actividad
acuosa antes descripto calibrado con soluciones salinas saturadas a 25 ± 1 ºC (LiCl, MgCl2,
K2CO3, Mg(NO3)2) (Greenspan, 1977). Para el análisis de los datos se utilizaron los valores
medios de tres lecturas por muestra.
7.2.12.5.
Color
Para la medición del color se colocó una porción de la muestra en polvo
(aproximadamente 3 g, bh) sobre un platillo de vidrio y se determinaron los parámetros de
color: luminosidad (L*), rojo-verde (a*) y amarillo-azul (b*) con un colorímetro Hunter Lab
girando el platillo 3 veces en sentido horario. Para el análisis de los datos se utilizaron los
valores medios de tres réplicas por muestra.
Para comparar dichos parámetros con datos de referencia del material de partida (yerba
mate elaborada), se calculó la diferencia absoluta de color, utilizando la ecuación 7.5 en la
cual Lo, ao y bo representan los parámetros de color de la yerba mate elaborada y los valores
L*, a* y b* representan los valores medios de los resultados de las mediciones de color de
los polvos obtenidos.
∆ E = [(L * − L )
0
2
2
+ (a * − a 0 ) + (b * − b0 ) ]2
1
2
7.5
7.2.12.6. Cinética de adsorción e higroscopicidad
La muestra (aproximadamente 1 g, bs) se colocó por triplicado en recipientes tarados y
se acondicionó en un recipiente cerrado sobre una solución saturada de ClK a 25 °C
(proporcionando un valor de humedad relativa de 84,34 %), (Greenspan, 1977). Se
determinó la ganancia en peso a intervalos de tiempo regulares (12, 24, 48, 72, 120, 168,
456, 480, 528 h) de acuerdo a la ecuación 7.6. En dicha ecuación, HG es la ganancia en peso
al tiempo t (en %), P(t) y P(0) son los pesos de los pocillos conteniendo los polvos
descontado el peso de cada pocillo, a tiempo t y a tiempo inicial (t=0 h) respectivamente.
HG =
! ;
! b
! b
∗ 100
7.6
160
Los modelos matemáticos para describir la cinética de adsorción (ganancia en peso vs.
tiempo) fueron el modelo de Peleg (1988) (Ec. 7.7) y el modelo logarítmico (Ec. 7.8).
G t =A
;
S
;∗A.
7.7
G t = a ∗ log t + b
7.8
En la ecuación 7.7, G(t) es la ganancia en peso al tiempo t en (%) calculada como la
diferencia entre P(t) y P(0); t es el tiempo de exposición a la atmosfera especificada (en h),
K1 la constante de velocidad de Peleg (en h*g ms / g agua) y K2 la constante de Peleg de
capacidad (en g ms / g agua). La constante K1 se relaciona con la velocidad de adsorción
(vo) a tiempo inicial (t=t0) (Ec. 7.9). La constante K2 se relaciona con la máxima ganancia
alcanzada en el equilibrio (Ec. 7.10) esto es G(equilibrio) cuando t→∞.
vo =
@
7.9
AS
G t → ∞ = Gequilibrio =
@
A.
7.10
En la ecuación 7.8, a (adimensional) y b (en g agua/g ms) son las constantes del
modelo logarítmico, G(t) es la ganancia al tiempo t, calculada como la diferencia entre P(t) y
P(0) y t es el tiempo de extracción en horas.
Si bien la higroscopicidad (HG) está basada en el contenido de humedad de equilibrio,
para posibilitar las comparaciones entre muestras, el incremento en peso por g de polvo
luego de estar expuesto a dicha atmosfera durante 12 h se determinó como porcentaje (Ec.
7.11) siendo P(12) y P(0) los pesos de los pocillos conteniendo los polvos descontado el
peso de cada pocillo, a un tiempo de 12 h y a tiempo inicial (t=0 h) respectivamente (Goula
et al., 2004; Goula y Adamopoulos, 2008).
HG =
! @ g
! b
! b
∗ 100
7.11
7.2.12.7. Isotermas de adsorción
Las isotermas de adsorción se determinaron por el método gravimétrico. Para ello
porciones (aproximadamente 3 g, bh) de las muestras 1, 3, 7, 8 y 9 fueron pre-secados en
estufa (50 °C; 3 días). Luego se colocó una porción de muestra (aproximadamente 1 g, bs)
en un pocillo plástico pequeño y se equilibró sobre soluciones salinas sobresaturadas de
161
LiCl, MgCl2, Mg(NO3)2, BrNa, Cl2Co, NaNO3, ClNa y ClK, las cuales proporcionaban
humedades relativas ambientes de 11,3 %, 32,78 %, 52,89 %, 57,57 %, 64,92 %, 74,25 %,
75,29 % and 84,34 %, respectivamente, de acuerdo con Greenspan (1977), en recipientes
cerrados hasta lograr el equilibrio (25 ± 2 °C). Una vez logrado el equilibrio las muestras
equilibradas fueron secadas utilizando la metodología descripta en el ítem 7.2.6.1
(determinación de humedad) para determinar su contenido de humedad. También se observó
la apariencia física de los polvos para corroborar si las muestras en polvo sufrieron algún
cambio visible como colapso o aglomeración. Algunas muestras no pudieron dejarse el
tiempo necesario para lograr el equilibrio porque comenzaban a mostrar cambios visuales
(pegajosidad y apelmazamiento).
Los modelos utilizados para la descripción de las isotermas de adsorción fueron: BET
modificado (Ec. 7.1 de tabla 7.1) y GAB (Ec. 7.2, de tabla 7.1).
El grado de ajuste se determinó utilizando los parámetros estadísticos: coeficiente de
determinación (R2) y porcentaje de error promedio porcentual (MPE, Ec. 6.4).
7.2.12.8. Temperatura de transición vítrea
Para la determinación de la temperatura de transición vítrea, porciones de las muestras
1, 3, 7, 8 y 9 (aproximadamente 1 g) fueron pre-secadas en estufa (50 °C; 3 días) y luego
colocadas en desecadores (25 ± 2 °C; 3-4 días) con atmósferas de distinta humedad relativa,
utilizándose
soluciones salinas saturadas de LiCl, MgCl2, Mg(NO3)2, ClNa y ClK
(humedades relativas de 11,3 %, 32,78 %, 52,89%, 75,29% y 84,34 %, respectivamente, de
acuerdo con Greenspan (1977)). Algunas muestras no pudieron dejarse el tiempo necesario
para lograr el equilibrio porque comenzaban a mostrar cambios visuales (pegajosidad y
apelmazamiento).
Luego
las
muestras
fueron
aisladas
herméticamente para las
determinaciones de contenido de humedad y temperatura de transición vítrea.
Para la determinación de temperatura de transición vítrea, la muestra previamente
acondicionada (aproximadamente 8-15 mg) fue colocada en una cápsula de aluminio de 40
µL herméticamente sellada en un calorímetro diferencial de barrido. Como referencia se
utilizó una cápsula vacía perforada. Luego del enfriamiento de la muestra a -20 °C, la
temperatura de transición vítrea se determinó a partir de las curvas termo-analíticas por
162
calentamiento de la muestras a 10 °C / min hasta 100 °C. Todos los análisis se realizaron por
duplicado.
Para describir el efecto plastificador del agua en los polvos, los datos de temperatura
de transición vítrea (promedios de 2 determinaciones por muestras) fueron modelados
usando el modelo de Gordon y Taylor (G-T) (Ec. 7.3 de tabla 7.2). La temperatura de
transición vítrea de la mezcla (Tg) se modeló con los valores de la temperatura de inicio de
la transición vítrea (Tgonset). La bondad del ajuste se determinó utilizando los parámetros
estadísticos: coeficiente de determinación (R2) y porcentaje de error promedio porcentual
(MPE, Ec. 6.4).
7.2.13. Análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± error estándar. Los datos experimentales se
estudiaron usando metodología de superficie de respuesta, análisis de regresión múltiple no
lineal (p ≤ 0,05), análisis de correlación de Pearson, análisis de varianza, test t-Student y
test de mínima diferencia significativa (LSD) de comparación de medias utilizando
Statgraphics Centurion XVI Académico.
7.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.3.1.
Propiedades antioxidantes y solubilidad
Los sólidos solubles representan una forma de medir la concentración de una solución;
en el jarabe su concentración fué: 21 ± 1 g SS / 100 mL de jarabe.
El contenido de polifenoles totales en el jarabe fué de 9,6 ± 0,075 g EAC / 100 mL de
jarabe y 45,73 ± 0,35 g EAC / 100 g de SS. Un resumen de los resultados de las propiedades
antioxidantes de los polvos obtenidos se muestra en la tabla 7.3 (datos disponibles en Anexo
4 Cuadros D3 a D7).
Los contenidos de polifenoles totales en los polvos resultantes (CPTP) resultaron muy
cercanos al contenido de polifenoles totales presente en las formulaciones que fueron
alimentadas al secadero (CPTT). Consecuentemente las eficiencias de retención de
polifenoles totales (EPT; en %) resultaron más satisfactorias de lo esperado (EPT ≥ 91). En
la mayoría de los ensayos, excepto en los ensayos 1 y 3, las EPT fueron mayores a 98, lo que
indica que en la zona de operación estudiada la pérdida de polifenoles fue despreciable. Esta
163
última observación sugiere que los componentes que contribuyen al valor de CPTP son muy
estables a las temperaturas ensayadas. Las eficiencias de retención de polifenoles totales
mayores a 1 podrían ser una consecuencia de la hidrólisis de los polifenoles de yerba mate
durante el proceso de secado (Turkmen et al., 2005). Robert et al. (2010) reportan
porcentajes de recuperación de polifenoles totales de 96 y 99 % para jugo y extracto
etanólico de granada (Punica granatum) en polvo respectivamente, ambos obtenidos por
secado por aspersión usando maltodextrina (12 < DE < 20) como agente encapsulante y 153
°C como temperatura de secado, mientras que usando proteínas aisladas de soja en
reemplazo de la maltodextrina los porcentajes de recuperación fueron de 121 y 103 %
empleando 120 y 100 °C como temperatura de secado. En la encapsulación de β-carotenos
con maltodextrina (25 DE) las pérdidas fueron del 11 % (Desobry et al., 1997).
En cuanto a los resultados de solubilidad a 25 °C presentados en la tabla 7.3, puede
observarse que esta propiedad presentó valores aceptables (siempre mayores o iguales al
91%) y en las experiencias realizadas no se observaron depósitos en la preparación de
infusiones (datos disponibles en Anexo 4-Cuadro D6 y D7). Es importante que la solubilidad
de los polvos obtenidos durante la operación sea elevada, ya que esto garantiza la ausencia
de depósitos en la preparación de infusiones, contribuyendo a la buena imagen del producto.
En la tabla 7.4 se presentan los coeficientes de regresión y los criterios para evaluar el
ajuste de las superficies de respuesta de las distintas variables de respuesta (Análisis
disponible en Anexo 4-Cuadros D8 a D10) en función de las variables independientes del
proceso. Los cuatro modelos (CPTP, CAO-EAA, CAO-ET, S) se ajustaron adecuadamente
con coeficientes de determinación mayores o iguales a 93 % y con MPE menores a 2,00.
Cotejando los valores relativos de los coeficientes del modelo para para las variables
dependientes, se observó la preponderancia de los coeficientes lineales para ambas variables
independientes frente a los demás coeficientes del modelo; los demás términos presentaron
importancias relativas menores. En las figuras 7.1 a 7.4 se presentan los gráficos de
superficies de respuesta y de contorno para los cuatro modelos.
164
Tabla 7.3 Resumen de datos sobre contenido de polifenoles totales, capacidad antioxidante y solubilidad
Nº de
Ensayo
Condiciones
Nº de
CPTT
muestra
1
200 °C(-1); 2,05 %MD(-1)
2
41,6
37,9 ± 0,37
91 ± 1
2
200 °C(-1); 12,05 %MD(+1)
2
29,0
29,3 ± 0,35
3
240 °C(+1); 2,05 %MD(-1)
2
41,6
4
240 °C(+1); 12,05 %MD(+1)
2
5
248,2 °C(1,41); 7,05 %MD(0)
CAOEAA
CAO-ET
41,5 ± 0,41
48,5 ± 0,16
68,9 ± 0,24
53,3 ± 0,25
75,6 ± 0,25
93 ± 0,0
101 ± 1
46,1 ± 0,55
38,8 ± 0,34
54,9 ± 0,48
61,1 ± 0,53
86,5 ± 0,75
97 ± 0,5
38,8 ± 0,04
93 ± 0
42,6 ± 0,04
47,3 ± 0,88
67,1 ± 1,27
51,9 ± 0,97
73,7 ± 1,39
94 ± 0,3
29,0
28,9 ± 0,02
101 ± 0
45,5 ± 0,03
37,0 ± 0,28
52,3 ± 0,40
58,2 ± 0,44
82,4 ± 0,63
94 ± 1,1
2
34,2
34,3 ± 0,49
101 ± 1
45,8 ± 0,66
43,8 ± 0,75
62,1 ± 1,08
58,5 ± 0,99
83,0 ± 1,44
96 ± 1,7
CPTP
EPT
CPTP*
CAO*-EAA
CAO*-ET
S
6
191,8 °C(-1,41); 7,05 %MD(0)
2
34,2
33,5 ± 0,97
98 ± 3
44,7 ± 1,30
44,3 ± 0,50
62,8 ± 0,72
59,2 ± 0,67
83,8 ± 0,96
97 ± 0,2
7
220 °C(0); 14,1 %MD(1,41)
2
27,4
28,2 ± 0,46
103 ± 2
47,1 ± 0,78
37,4 ± 0,57
52,9 ± 0,82
62,5 ± 0,95
88,5 ± 1,38
95 ± 0,5
8
220 °C(0); 0 %MD(-1,41)
2
45,7
44,7 ± 0,30
98 ± 1
44,7 ± 0,30
51,7 ± 0,42
73,4 ± 0,60
51,7 ± 0,42
73,4 ± 0,60
91 ± 0,1
220 °C(0); 7,05 %MD(0)
10
34,2
33,9 ± 0,10
45,3 ± 0,14
42,7 ± 0,43
60,6 ± 0,63
57,1 ± 0,59
80,9 ± 0,84
95 ± 0,5
9
99 ±
0,00
CPTT: contenido de polifenoles totales teórico (g EAC %ms); CPTP: contenido de polifenoles totales (g EAC %ms); EPT: eficiencias de retención de polifenoles totales;
CPTP*(g EAC %ms lm); CAO-EAA (g EAA %ms); CAO-ET (g ET %ms); CAO*-EAA (g EAA% ms lm); CAO*-ET (g ET %ms lm); S: solubilidad (%); ms: muestra
seca; lm: libre de maltodextrina
165
Tabla 7.4 Coeficientes de regresión de los términos significativos y criterios de
ajuste
Respuesta
Coeficiente
a0
Lineal
CPTP
CAO-EAA
CAO-ET
S
-10,804
91,018
128,181
169,742
a1
0,455
-0,351
-0,489
-0,754
a2
Cuadrático
-0,800
-1,004
-1,431
2,678
a11
-0,001
0,001
0,001
0,002
a22
Cruzado
0,037
0,023
0,032
-0,035
a12
-0,003
-0,001
-0,002
-0,009
R2
0,96
0,94
0,94
0,93
χ2
0,96
1,35
2,80
0,36
RMSE
0,86
1,02
1,47
0,42
MPE
1,79
1,97
2,00
0,39
2
2
R : coeficiente de determinación; χ : Chi-cuadrado; RSME:
raíz del cuadrado medio del error; MPE: porcentaje de error
promedio porcentual; CPTP: contenido de polifenoles
totales (gEAC %ms); CAO: Capacidad antioxidante (g EAA
y g ET en %ms); S: solubilidad (%); EAC: equivalente a
ácido clorogénico; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET:
equivalente a Trolox. Variables no codificadas.
166
Figura 7.1. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Contenido de
polifenoles totales de los polvos (CPTP; g EAC %ms).
167
Figura 7.2. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Capacidad
antioxidante de los polvos (CAO; g EAA %ms)
168
Figura 7.3. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Capacidad
antioxidante de los polvos (CAO; g ET %ms).
169
Figura 7.4. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Solubilidad de los
polvos a 25 °C (S; %).
7.3.1.
Contenido de humedad
El contenido de humedad (CH) varió entre 3,2-7,7 % bh, excepto el polvo 6 (191,8 °C;
7,05 %MD), que presentó un CH del 10,6 ± 0,07 % bh (datos disponibles en Anexo 4Cuadro D11). Para té soluble en polvo, se reportaron CH entre 6-8 % (Sinija y Mishra,
2008).
La figura 7.5 muestra los valores de CH logrados empleando diferentes temperaturas
de entrada de aire; y se puede observar en general que con mayores temperaturas de entrada
de aire se lograron menores CH de los polvos debido a la mayor tasa de transferencia de
calor, lo cual facilita la eliminación de agua (Kha et al., 2010). A bajas temperaturas de
entrada de aire (prueba 6; 191,8 ºC), el polvo resultó demasiado húmedo.
170
Por lo general para una
na misma temperatura de entrada de aire sería
ía esperable
e
que, ante
aumentos en la concentración
ión de maltodextrina, se produzcan aumentos
os en el contenido de
humedad final, ya que lass grandes
g
moléculas de maltodextrina dificul
cultan la difusión de
moléculas de agua (Adhikar
kari et al., 2005); esta observación sólo resul
sultó válida para los
polvos obtenidos a 220 ºC.
7.3.2.
Densidad
La densidad (db) prom
romedio de todas las muestras (excepto ell caso
c
de la muestra
obtenida en el ensayo Nº6),
), fue
f de 0,279 ± 0,039 g / mL con valores minimo
min
y máximo de
0,226-0,356 g / mL respectiva
tivamente. En el caso del polvo obtenido en el ensayo
e
Nº 6 (191,8
°C; 7,05 %MD), que present
entó un valor de 0,45 ± 2,5x10-4 g / mL (ver
er Figura 7.6) (datos
disponibles en Anexo A4-Cu
Cuadro D12). Es lógico pensar que el efecto de la temperatura de
entrada del aire sobre la dens
nsidad está relacionado al efecto de este factor
tor sobre el contenido
de humedad de los polvos, ya
y que un producto con mayor contenido dee humedad
h
tenderá a
tener mayor peso bruto debid
bido a la presencia de agua, con lo cual será
rá considerablemente
más denso que un producto
to seco. Este supuesto fue respaldado por unn alto coeficiente de
correlación (rpearson: -0,849;; análisis disponible en Anexo 4-Cuadro
dro D13) (a mayor
temperatura de entrada del air
aire, menor CH, menor densidad).
Figura 7.5. Contenid
nido de humedad de los polvos (CH; % bh)
h) para diferentes
temperaturas de entradaa de aire (Ti; °C) y varias concentracioness d
de maltodextrina
(MD; %p/v)
Mayores temperaturass de
d entrada de aire provocarían una reducción
ión en la densidad del
producto final, pues mayores
es temperaturas de entrada de aire implican mayor
m
velocidad de
171
evaporación dando productos
tos con estructuras más porosas o huecas (W
Walton, 2000); sobre
todo cuando se usan “agent
ntes de secado” con características “formad
adoras de películas”
como lo es la maltodextrina
ina. Según Kwapinska y Zbicinski (2005), el material en polvo
obtenido por secado por asper
persión con agregado de materiales formadores
res de película, suelen
contener burbujas de aire, lo cual
c incrementaría el volumen de aire atrapad
pado disminuyendo la
densidad.
m
de densidad de los polvos (db; g/mL
mL) para diferentes
Figura 7.6. Valoress medios
temperaturas de entrad
ada de aire (Ti) y varias concentraciones dee m
maltodextrina
(%MD)
Según Goula y Adamop
opoulos (2008), altos valores de densidad se asocian
as
a polvos con
mayor naturaleza pegajosa,, yya que las partículas que muestran esta tenden
dencia dejan menores
espacios entre ellas y por end
nde resultan en un menor volumen bruto.
Las características óptim
ptimas de densidad para el producto dependerá
erán de los objetivos
particulares de quien lo produ
oduzca, no pudiendo hacer “a priori” ningunaa afirmación
a
respecto
a la existencia de un valor ópt
óptimo para este parámetro.
7.3.3.
Color
El color es un atribut
buto de suma importancia comercial, ya que el mismo es un
parámetro de calidad desdee el
e punto de vista del consumidor, teniendoo iincidencia sobre el
consumo. El color debiera,, en principio, ser asociado con facilidad al prod
roducto de origen, en
este caso la yerba mate, e ince
ncentivar al consumo.
El sistema de color Hunter
H
L*, a*, b* es un espacio de colorr rrectangular de tres
dimensiones basado en la teoría
teo de los colores opuestos (ver Figura 7.7)) donde
d
“L*” mide la
172
luminosidad o claridad y es el atributo que hace corresponder a cada color con respecto a la
escala de grises; este parámetro varía de 100 para blanco perfecto a 0 para el negro,
aproximadamente como el ojo lo evaluaría. Los ejes “a*” y “b*” permiten evaluar la
cromaticidad; y se caracterizan por carecer de límites numéricos definidos. Concretamente:
“a*” mide el componente rojo en el eje positivo, gris cuando es 0 y el componente verde en
el eje negativo y “b*” mide el amarillo en el eje positivo, gris cuando es 0 y el azul en el eje
negativo. Todos los colores que se pueden percibir visualmente se pueden mostrar en este
espacio rectangular de color (Hunter Lab., 2001).
Figura 7.7. Escala de color de Hunter Lab
Los resultados de las mediciones de color de los polvos para las diferentes condiciones
ensayadas se presentan en la tabla 7.6 (datos disponibles en Anexo 4-Cuadro D14) y los
gráficos de superficie de respuesta se presentan en la figura 7.8 (coeficientes de las
superficies de respuesta y respectivos parámetros de ajuste disponibles en Anexo 4-Cuadro
D14). Los coeficientes de la ecuación del modelo de superficie de respuesta significativos se
presentan en las ecuaciones 7.12 a 7.14 para los parámetros L*; a* y b* respectivamente (X1
representa a la temperatura del aire que entrada al secadero en ºC y X2 la concentración de
maltodextrina, en %MD).
L*= -236,8 + 2,58*X1- 0,005* X12+0,0004*X1*X2
R2= 69,4 %
7.12
a* = 87,9502-0,778872*X1-0,0373762*X2+0,0016868*X12 R2= 79,5 %
7.13
b*= -6,25165 + 0,28 * X1 – 0,054 *X2 -0,0006 * X12 + 0,0019* x22 R2=64 %
7.14
Los valores obtenidos para el parámetro “L*” presentaron un valor medio de 59,1 y un
desvío estándar de 3,1, indicando una luminosidad elevada de los polvos en las condiciones
en las que fueron obtenidos. El coeficiente importante en la ecuación del modelo de
superficie de respuesta fue el coeficiente lineal para la temperatura de entrada de aire al
173
secadero; indicando que el parámetro L* es mas influenciado por la temperatura de entrada
de aire al secadero que por la cantidad de maltodextrina empleada en la formulación (ver
Anexo 4 – Cuadro D14 y su análisis).
Figura 7.8. Superficies de respuesta para los parámetros colorimétricos L* , a* y b *
para distintas temperaturas del aire de secado y distintas concentraciones de
maltodextrinas.
Los valores del parámetro “a*” se localizaron en la región central (a* ≈ 0) sin
tendencia al verde o al rojo; presentando un valor de -1,6 ± 0,91 (media ± de).
174
Tabla 7.6 Parámetros colorimétricos de los polvos para las diferentes condiciones ensayadas y valores de higroscopicidad
(HG)
Parámetro
N° de ensayo
X1 (x1)
X2 (x2)
L*
a*
b*
HG (%)
1
200 °C (-1)
2,05 %MD (-1)
58,50 ± 0,03
-1,12 ± 0,05
24,97 ± 0,01
6,8 ± 0,50
2
200 °C (-1)
12,05 %MD (1)
58,62 ± 0,05
-1,33 ± 0,02
24,55 ± 0,05
6,8 ± 0,41
3
240 °C (1)
2,05 %MD (-1)
60,56 ± 0,01
-1,91 ± 0,03
25,33 ± 0,01
7,8 ± 0,13
4
240 °C (1)
12,05 %MD (1)
62,46 ± 0,01
-2,26 ± 0,02
24,84 ± 0,02
7,2 ± 0,61
5
248,2 °C (1,41)
7,05 %MD (0)
58,93 ± 0,04
-1,84 ± 0,04
24,56 ± 0,04
8,7 ± 1,22
6
191,8 °C (-1,41)
7,05 %MD (0)
50,09 ± 0,06
1,09 ± 0,04
24,10 ± 0,00
4,9 ± 0,33
7
220 ° C (0)
14,1%MD (1,41) 59,76 ± 0,05
-1,96 ± 0,03
24,86 ± 0,02
7,0 ± 0,19
8
220 °C (0)
0 %MD (-1,41)
58,56 ± 0,03
-1,30 ± 0,03
24,97 ± 0,01
7,6 ± 0,07
9-13
220 °C (0)
7,05 %MD (0)
60,57 ± 0,43
-2,06 ± 0,09
24,97 ± 0,07
6,7 ± 0,49
Datos expresados como media ± desvío estándar
175
Los valores para “b
“b*” mostraron una desviación estándar de 0,33
0, alrededor de
una media de 24,8. Los elevados
el
valores hallados para “b*” indicann uuna tendencia de
los polvos hacia el amarillo
rillo. Sus valores tienden a disminuir conformee sse incremente la
concentración de maltodex
extrina en la formulación.
Trela et al. (2012) reportaron
re
los siguientes parámetros de colo
lor en yerba mate
estacionada: Lo* = 41,55 ± 0,5; ao*= -2,9 ± 0,4 y bo*= 15,7± 0,2. Comparando
Co
estos
valores con los del polvoo de
d yerba mate, dados en la tabla 7.6, se puede
ede concluir que el
producto obtenido en el presente
pr
trabajo es más claro y amarillo y men
enos verde que el
producto de partida. El valor
val de la diferencia absoluta de color fue ∆E= 19,8.
7.3.4.
Cinética de adsorción e higroscopicidad
La humedad adsorb
orbida por los polvos luego de 12 h en las
as condiciones de
almacenamiento ensayadas
das (22 ± 1 °C y 84,3 ± 2% de humedad relativ
tiva) es presentada
en la figura 7.9 y en la tabla
ta
7.6; los datos representan los valores promedio
p
de tres
pseudo-replicas (Datos dis
disponibles en Anexo 4-Cuadro D15 y D16). El contenido de
humedad inicial de las mue
uestras no fue uniforme (ver punto 7.3.4)
Figura 7.9. Valores
res medios de higroscopicidad de los polvoss (HG; %) para
diferentes temperatur
turas de entrada de aire (Ti) y varias concent
entraciones de
maltodextrina (MD)
Generalmente los po
polvos obtenidos por secado spray son higroscó
scópicos y tienden
a adsorber con facilidad
ad humedad del aire circundante y a menos que
qu se tomen las
precauciones necesariass la superficie de los polvos se vuelve pegaj
gajosa y ocurre el
fenómeno de apelmazamie
miento (caking). Según Ross (1993), la higrosc
oscopicidad es una
176
más de las características de los polvos deshidratados que puede ser atribuida al
fenómeno de transición vítrea.
Tabla 7.7 Constantes y parámetros de ajuste del modelo de Peleg y del
modelo logarítmico para la cinética de adsorción de humedad.
Modelo Condiciones
Constante
K1
Peleg
K2
Parámetro
R2
EMA(%)
200°C; 2,05 %MD
145,61
2,66
99,86
0,30
200°C; 12,05 %MD
55,47
2,49
98,01
1,40
240°C; 2,05 %MD
144,94
2,56
99,48
0,60
240°C; 12,05 %MD
147,85
3,12
99,05
0,70
248,2°C; 7,05 %MD
131,02
2,81
99,10
0,70
191,8°C; 7,05 %MD
194,62
2,64
99,61
0,50
220°C; 0 %MD
141,37
2,60
99,59
0,60
220°C; 7,05 %MD
152,72
2,86
98,30
1,00
220°C; 14,1 %MD
131,05
3,17
99,57
0,40
Constante
Log
A
B
Parámetro
R2
EMA(%)
200°C; 2,05 %MD
0,1674 -0,1050
99,45
0,59
200°C; 12,05 %MD
0,1398 0,0247
99,37
0,40
240°C; 2,05 %MD
0,1716 -0,1058
99,71
0,30
240°C; 12,05 %MD
0,1380 -0,0716
99,36
0,50
248,2°C; 7,05 %MD
0,1506 -0,0729
99,55
0,40
191,8°C; 7,05 %MD
0,1754 -0,1392
99,38
0,50
220°C; 0 %MD
0,1687 -0,1009
99,71
0,40
220°C; 7,05 %MD
0,1537 -0,0916
98,91
0,50
220°C; 14,1 %MD
0,1333 -0,0588
98,66
0,70
EMA: error medio absoluto; K1 (en h*g ms/g agua); K2 (en g ms/g agua); a
(adimensional); b (en g agua/g ms)
Por lo general, para una misma temperatura de entrada del aire, el agregado de
maltodextrina contribuyó a disminuir la higroscopicidad de los polvos. Este efecto
puede apreciarse mejor en la figura 7.10.
177
Fig. 7.10. Cinética de ganancia de humedad (G, %) en función del tiempoEfecto del agregado de maltodextrina
Modelado de la cinética de adsorción:
Las cinéticas de adsorción se modelaron empleando el modelo de Peleg y el
modelo logarítmico; el ajuste de los modelos fue evaluado por el coeficiente de
determinación (R2 ) y por el EMA (error medio absoluto) (Datos disponibles en Anexo
178
4-Cuadro 17). Estos valores y los parámetros de ajuste de los modelos se presentan en
la tabla 7.7. Los resultados mostraron que para las diferentes condiciones de secado
ensayadas, el modelo logarítmico presentó mejor ajuste que el modelo de Peleg, con
EMA menores a 0,7 % y R2 cercanos a la unidad.
En las figuras 7.10 y 7.11 se muestran los datos experimentales con sus
respectivos valores calculados utilizando el modelo logarítmico. Se esperaría que el
agregado de maltodextrina contribuya a disminuir la tendencia a la higroscopicidad, lo
cual puede apreciarse en la figura 7.10; mientras que para un mismo porcentaje de
maltodextrina (7,05 %MD) dentro del rango de temperaturas de entrada de aire al
secadero comprendidas entre 191 y 248 °C (Figura 7.11), la temperatura no parece
tener efecto sobre la higroscopicidad.
Figura 7.11. Cinética de ganancia de humedad (G; %) en función del
tiempo-Efecto de la temperatura de entrada del aire al secadero
7.3.5.
Isotermas de adsorción
El contenido de humedad de equilibrio de las muestras en polvo obtenido con
diferentes proporciones de maltodextrina y diferentes temperaturas de entrada de aire
equilibrados a seis actividades acuosas se presentan en la tabla 7.8 (datos disponibles
en Anexo 4 - Cuadro D18). Dichos datos experimentales se modelaron usando los
179
Tabla 7.8 Contenido de humedad de equilibrio del mate soluble formulado con diferentes porcentajes de maltodextrina y deshidratado a
diferentes temperaturas de entrada del aire de secado
Contenido de humedad de equilibrio, CHe (g/g ms) a 25ºC.
aw
220°C; 0 %MD
220°C; 7,05 %MD
220°C; 14,1 %MD
240°C; 2,05 %MD
200°C; 2,05 %MD
0,113
0,037 ± 0,001
0,037 ± 0,001
0,048 ± 0,000
0,025 ± 0,001
0,030 ± 0,001
0,327
0,075 ± 0,000
0,062 ± 0,000
0,067 ± 0,000
0,055 ± 0,001
0,056 ± 0,004
0,528
0,103 ± 0,003
0,085 ± 0,005
0,103 ± 0,003
0,120 ± 0,005
0,118 ± 0,001
0,649
0,128 ± 0,004
0,109 ± 0,003
0,122 ± 0,003
0,158 ± 0,011
0,143 ± 0,002
0,753
0,236 ± 0,007
0,185 ± 0,005
0,168 ± 0,002
0,250 ± 0,007
0,259 ± 0,004
0,843
0,321 ± 0,012
0,295 ± 0,013
0,278 ± 0,009
0,384 ± 0,006
0,381 ± 0,005
180
modelos de GAB y BET modificado, cuyos parámetros estimados y de ajuste se
presentan en la tabla 7.9 (análisis estadístico disponible en Anexo 4 - Cuadros D19 y
D20).
Tabla 7.9 Parámetros estimados de los modelos GAB y BET modificado
para mate soluble formulado con diferentes porcentajes de maltodextrina y
deshidratado a diferentes temperaturas de entrada del aire de secado
Modelo
GAB
Condiciones
Constante
R2
MPE(%)
Xm
CGAB
kGAB
0 %MD; 220 °C
0,057
10,03
0,982
0,980
7,58
2,05 %MD; 200 °C
0,072
2,75
0,979
0,990
10,62
2,05 %MD; 240 °C
0,075
2,56
0,972
0,998
6,98
7,05 %MD; 220 °C
0,041
34,11
1,024
0,994
4,41
14,10 %MD; 220 °C 0,049
23,21
0,971
0,990
6,28
Xm
CBET
N
0 %MD; 220 °C
0,054
12,76
22,89
0,981
6,79
2,05 %MD; 200 °C
0,065
3,49
23,50
0,990
9,81
2,05 %MD; 240 °C
0,066
3,47
20,96
0,997
5,82
7,05 %MD; 220 °C
0,045
17,69
11,16
0,990
5,94
14,10 %MD; 220 °C 0,044
14,45
13,98
0,983
10,82
BET
Xm: contenido de humedad de la monocapa (g agua / g de producto seco); Constantes
adimensioanles de los modelos (CGAB, kGAB, CBET, n)
La figura 7.12 muestra las isotermas experimentales y el ajuste del modelo GAB
para los polvos formulados con 2,05 %MD y obtenidos a dos temperaturas de entrada
de aire al secadero (200 y 240 °C). La figura 7.13 muestra las isotermas
experimentales y el ajuste del modelo GAB
para los polvos obtenidos a una
temperatura de entrada de aire de 220 °C y formulados con tres concentraciones de
maltodextrina (%MD, 0, 7,05 y 14,10 %MD). En ella se puede observar que para aw ≤
0,8 el agregado de dicho aditivo provoca la reducción del contenido de humedad final
de equilibrio; probablemente debido que se modifica el balance de los sitios
hidrofílicos/hidrofobicos (Perez-Alonso et al., 2006). Resultados similares fueron
observados por Kurozawa et al. (2009).
181
Figura 7.12. Isote
otermas de adsorción de mate soluble formul
ulado con 2,05
%MD y deshidratado utilizando
u
diferentes temperaturas de entra
trada del aire de
secado (200 y 240 °C)
Ambas figuras mue
uestran el perfil de adsorción de agua típico
ico de materiales
amorfos: se verifica la ads
dsorción de cantidades incrementales de aguaa a medida que se
incrementa
la humedad
dad
relativa a
temperatura
constante;
ppresentando
un
comportamiento tipo III seegún la clasificación de Brunauer. La aw a un dado contenido
de humedad es función de la composición química, de la estructura su
supramolecular y
de la microestructura dell ppolvo.
Para cada muestra
tra acondicionada, se evidenció un tiempoo necesario para
alcanzar el equilibrio, cuya
cuy duración se incrementó con el aumento
to de la humedad
relativa. Luego de aproxim
ximadamente dos semanas de acondicionamien
iento a 25 °C, las
muestras expuestas a hume
medades relativas menores a 64 % alcanzaronn eel equilibrio; sin
embargo cuando fueron ac
acondicionadas a humedades relativas mayor
yores continuaron
adsorbiendo humedad incl
ncluso luego de 30 días. Este fenómeno de continua
con
adsorción
de humedad por parte de los polvos también fue observado y reporta
rtado por Li et al.
(2011).
Los valores prome
medio del contenido de humedad de la m
monocapa (Xm)
resultaron 0,058 ± 0,0144 g agua / g de producto seco de acuerdo al modelo
mo
de GAB y
182
0,058 ± 0,0105 g agua / g de producto seco de acuerdo al modelo de BET (ver Tabla
7.9). En la bibliografía se reportan valores de Xm de 0,06029 ± 0,0055
0553 g agua / g de
producto seco; con const
nstantes k = 0,9618 ± 0,00735 y C = 1,417
417 ± 0,262 para
isotermas a 25 °C segúnn el
e modelo de GAB para muestras de té verde
rde instantáneo sin
aditivos, disponibles come
mercialmente (Li et al., 2011). Los valores dee X
Xm reportados a
partir de isotermas a 20,, 30,
30 40 y 50ºC y usando el modelo de GAB en hojas y palos de
yerba mate estacionada varían
va
de entre 4,11 y 5,39 kg de agua / 100 kg de sólido seco
para la fracción de hojass y entre 5,30 y 5,95 kg de agua / 100 kg de sólido
sól
seco para la
fracción de palos. (Känzig
zig et al., 1985, 1987). Valores de k cercanos
os a la unidad han
sido reportados en product
uctos vegetales en polvo en varios trabajos (Ped
edro et al., 2010).
Comparando el valo
alor de Xm correspondiente a los polvos obten
tenidos a una dada
temperatura de aire de entrada
en
(220°C), se aprecia que el agregado de
d maltodextrina
entre 7 y 14 % contribuye
ye a una disminución de este parámetro. Kuroza
ozawa et al. (2009)
atribuyen esta disminuci
ución al efecto encapsulador de la maltode
odextrina lo cual
provocaría una disminució
ción de los sitios polares expuestos a las molécu
éculas de agua.
Figura 7.13. Isoterm
ermas de adsorción de mate soluble puro y mate
m
formulado
con diferentes porcent
entajes de maltodextrina, deshidratados utiliz
tilizando 220 ºC
como tem
temperatura de entrada del aire de secado.
183
7.3.6.
Temperatura de transición vítrea
Las temperaturas de transición vítrea (onset y midpoint; Tgos y Tgmp
respectivamente) de los polvos de mate soluble acondicionados en ambientes con 53,
33 y 11 % de humedad relativa y de los sólidos secos (Tgs) presentes en los mismos se
presentan en la tabla 7.10 (datos disponibles en Anexo 4 - Cuadros D21 y D22). Los
datos experimentales de Tgos (datos disponibles en Anexo 4 - Cuadro D23) se ajustaron
a la ecuación de Gordon y Taylor (G-T; ecuación 7.3 en tabla 7.2). Los parámetros
obtenidos por regresión no lineal (la constante empírica k y la temperatura de
transición vítrea de los sólidos secos o anhidros (Tgs) se presentan en la tabla 7.11
(análisis estadístico disponible en Anexo 4 - Cuadros D24 y D25); mientras que las
curvas predichas por el modelo de G-T aplicadas a Tgos se presentan en la figura 7.14.
Tabla 7.10 Temperaturas de transición vítrea de mate soluble puro y
formulado con diferentes porcentajes de maltodextrina y obtenidos con una
temperatura de aire de entrada de 220 ºC
Condiciones
0 %MD
7,05 %MD
14,1 %MD
Muestra
aw muestra
Tgos(°C)
Tgmp (°C)
8
0,53
15,4
35,9
8
0,44
30,8
37,3
8
0,41
39,2
43,6
9
0,55
14,8
28,4
9
0,46
31,4
37,1
9
0,41
42,9
47,3
7
0,52
27,6
39,8
7
0,47
36,2
41,2
7
0,44
52,1
60,5
Para un sistema binario, el parámetro k del modelo de G-T controla el grado de
curvatura de la linea Tg-CH, y puede ser relacionado a la fuerza de la interacción entre
los componentes del sistema. En la bibliografía se reportan casos en los que la adición
de maltodextrina incrementa el valor de k (Silva et al., 2006); sin embargo en la
184
presente investigación dicho incremento no se verificó. Los valores de k estimados se
encuentran en el rango de valores reportados en la bibliografía para productos en polvo
formulados con y sin maltodextrina (3,9≤ k ≤ 5,5; Silva et al.; 2006). Li et al. (2011)
reporta una k de 2,946 para muestras comerciales de té verde instantáneo sin aditivos.
Tabla 7.11 Parámetros estimados del modelo de G-T para mate soluble
formulado con diferentes porcentajes de maltodextrina y deshidratados a una
temperatura de entrada del aire de secado de 220 °C
Condiciones
R2 MPE (%)
Constantes
Tgs (ºC)
k
0 %MD
63,2
2,466
0,902
10,50
7,05 %MD
62,0
2,514
0,993
2,76
14,1 %MD
70,0
2,428
0,969
5,39
Figura 7.14. Temperatura de transición vítrea en función del contenido de
sólidos para mate soluble formulado con 0; 7,05 y 14,10 %MD) y deshidratado
utilizando una temperatura de aire de entrada al secadero spray de 220 °C
185
Los polvos obtenidos empleando una temperatura de aire de entrada al secadero
de 220 °C, formulados con 0 y 7,05 %MD, presentaron temperaturas de transición
vítrea (Tgos) a humedades relativas comprendidas entre 53-55 % de 14,8 y 15,4 °C,
ambas inferiores a la temperatura ambiente. Cuando se formularon con 14 %MD, su
Tgos se elevó a 27,6 °C para una humedad relativa del 52%, confirmando que el
agregado de maltodextrina en un 14 % eleva la Tgos de los polvos hasta la zona estable.
Dicho comportamiento es esperable, dado que al aumentar el porcentaje de
maltodextrina se está provocando un incremento del peso molecular medio de los
sólidos solubles de los polvos. Para los polvos obtenidos empleando 220 °C como
temperatura de entrada de aire, se encontró un efecto significativo sobre la temperatura
de transición vítrea de los sólidos secos (Tgs) por parte de la variable concentración de
maltodextrina (p ≤ 0,0926; ANOVA disponible en Anexo 4 - Cuadro D26) (Figura
7.15). Sin embargo no se encontraron diferencias significativas en los valores de Tgs
de los polvos formulados con 0 y 7 %MD, pero si entre la Tgs de estos últimos y la Tgs
de los polvos formulados con 14 % MD (Anexo 4 - Cuadro D26). Esto podría
interpretarse considerando que el agregado de maltodextrina de 0 a 7 % no implica un
incremento suficiente en el peso molecular medio de los sólidos en el producto final
como para provocar un aumento en escala práctica de la temperatura de transición
vítrea, mientras que el agregado de un 7 % más de dicho aditivo hasta lograr un 14 %
MD resulta suficiente.
Figura 7.15. Medias e intervalos de mínima diferencia significativa (p ≤0,05) para
temperaturas de transición vítrea de los sólidos secos en mate soluble formulado
con 0; 7,05 y 14,10 %MD y deshidratado utilizando una temperatura de aire de
entrada al secadero spray de 220 °C
186
7.3.7.
Discusión de criterios de estabilidad
El enfoque basado en el concepto de aw sugiere que un producto a una
determinada temperatura posee su mayor estabilidad química cuando su contenido de
humedad corresponde al contenido de humedad de la monocapa a dicha temperatura, el
cual depende de la composición química y la temperatura a la que se encuentra el
material. Este enfoque si bien es aun ampliamente aceptado, posee algunas
limitaciones tales como: i- que el alimento puede no encontrarse en un estado de
equilibrio, ii- que la naturaleza de los solutos presentes puede desempeñar un rol
importante en el desarrollo de reacciones químicas, iii- no indica acerca del estado del
agua presente en el alimento y en como sus moléculas están interactuando con las
moléculas de los sustratos, iv-que los valores de aw límites estipulados para
determinados cambios pueden ser influenciados por niveles altos o bajos de otros
factores presentes tales como pH, sales, agentes antimicrobianos, tipos de tratamientos,
etc (Rahman, 2006). Por ejemplo, este enfoque postula que los cambio debidos a
actividad microbiológica estarán restringidos si la aw del alimento es menor a 0,6; sin
embargo, la tecnología de efecto valla (“hurdle effect”) que se basa en la combinación
inteligente de varios factores de preservación para lograr la estabilidad microbiológica
de un alimento, postula que dicha aw límite puede incrementarse si se contempla el
efecto de otros factores de preservación tales como el pH del producto.
En la tabla 7.12 se presentan los valores de contenido de humedad
correspondientes al valor de la monocapa predichos por el modelo de GAB y sus
correspondientes valores de aw obtenidos gráficamente a partir de las isotermas para
polvos obtenidos a una temperatura del aire de entrada de 220 ºC.
Tabla 7.12 Valores del contenido de humedad y de actividad acuosa de la
monocapa (Xm y aw) para las formulaciones de mate soluble a 25ºC.
MD
(%)
Xm (GAB)
(g agua / g sólidos secos)
0
0,057
0,23
7,05
0,041
0,11
14,10
0,049
0,11
aw (GAB)
187
De acuedo con Rahman (2006) existen alimentos cuya estabilidad no se explica
únicamente con el concepto de aw siendo necesario un abordaje multienfoque
(actividad acuosa + transición vítrea) para el estudio de la estabilidad del alimento.
Durante la deshidratación por aspersión, la eliminación de agua normalmente se da en
un tiempo menor al que fija la cinética de cristalización de los solutos presentes en el
extracto inicial. Por ello en este tipo de proceso es frecuente llevar a los solutos
solubles y a los insolubles compatibles con el agua a un estado amorfo,
molecularmente desordenado, de no equilibrio termodinámico, que exhibe cambios
dependientes del tiempo aproximándose al equilibrio (Roos et al., 1996). El problema
con el manejo de los alimentos en polvo es que usualmente se hallan en un estado
amorfo inestable, por lo que su estado físico puede cambiar de un estado de sólido
amorfo vítreo a un estado de sólido amorfo viscoso una vez que el producto alcanza su
Tg, ya sea como consecuencia de una ganancia de humedad o por su exposición a una
temperatura de almacenamiento superior a su Tg. Por ello, el enfoque de aw,
empleando Xm como único criterio de estabilidad del producto, no resultaría
suficiente.
El concepto de transición vítrea postula que un producto será estable siempre que
se halle en estado amorfo vítreo, es decir que se halle a una temperatura por debajo de
su temperatura de transición vítrea. En alimentos deshidratados en polvo, ciertos
cambios tanto estructurales como fisicoquímicos se correlacionan más con el
fenómeno de transición vítrea a través del efecto de plastificación del agua o de la
temperatura que con el contenido de humedad de la monocapa. Entre dichos cambios
se pueden mencionar los fenómenos de pegajosidad (pérdida del “free flowing”),
colapso, apelmazamiento y sinterizado de la superficie del material (Lievonen y Roos,
2002; Miao y Roos, 2006; Slade y Levine, 1991).
El fenómeno de caking es un fenómeno indeseable, por el cual los polvos “free
flowing” de bajo contenido de humedad, con el transcurso del tiempo, al ser expuestos
a altas humedades relativas o altas temperaturas, se van transformando en partículas
pegajosas que luego se van adhiriendo unas a otras, lo cual reduce la capacidad de los
polvos de dispersarse libremente (estadío de apelmazamiento y pegajosidad). Con el
progreso del fenómeno de caking, se comienzan a formar bultos quebradizos tipo
terrones que luego se transforman en masas aglomeradas comúnmente denominadas
“tortas”. En la fase más avanzada de este fenómeno, las partículas pierden su estructura
188
interna estabilizadora, por lo que la estructura de los polvos colapsa y desaparecen los
poros abiertos que presentaban dichas estructuras, obteniéndose una masa amorfa
altamente viscosa, (Hartmann y Palzer, 2011). Estos cambios resultan en pérdidas de
funcionalidad y calidad (Aguilera et al., 1995) (Figura 7.16). La principal causa de
dicho fenómeno es la plastificación de la superficie de la partícula sólida debida a la
ganancia de humedad. La figura 7.17 presenta, a los fines de ilustración, los “puentes”
entre partículas de polvo de tomate obtenido por secado spray que sufrieron el
fenómeno de caking.
Figura 7.16. Diferentes fases del proceso de coalescencia de las partículas.
Adaptado de Hartmann y Palzer (2011)
Figura 7.17. “Puentes” entre partículas de polvo que sufrieron el fenómeno de
caking. Hartmann y Palzer (2011)
En relación a la apariencia de los polvos luego de ser equilibrados sobre
soluciones salinas saturadas, las muestras correspondientes a los ensayos 1(200 ºC;
2,05 %MD), 3 (200 ºC; 12,05 %MD), 7 (220 ºC; 14,1 %MD), 8 (220 ºC; 0 %MD) y 9
(220 ºC; 7,05 %MD) sufrieron el fenómeno de caking. El mismo incluyó los estadios
de apelmazamiento, pegajosidad, colapso y melting (Figura 7.16), todos observables
189
macroscópicamente cuando fueron almacenadas a 25 ± 2°C en ambientes de
humedades relativas superiores a 64 % (soluciones salinas saturadas de Mg(NO3)2,
ClNa y ClK).
Ross (1993), evaluando ambos conceptos (aw y Tg) en relación al peso molecular
de una serie de compuestos homólogos, definió un contenido de agua crítico (CHC)
que provocaba una caída de la temperatura de transición vítrea del producto hasta
igualarse a la temperatura ambiente (25 °C). Dicho contenido crítico de agua podría
relacionarse a un valor de actividad acuosa crítica (aWC) obtenible a partir de la
isoterma a 25 °C.
Ambos conceptos arriba mencionados (CHC y aWC) fueron relacionados
gráficamente en la figura 7.18, en la cual se combinaron los datos experimentales de
temperatura de transición vítrea con los datos correspondientes a las isotermas
(experimentales y calculadas mediante el modelo GAB) para las muestras
deshidratadas empleando una temperatura de aire de entrada de 220 °C y formuladas
con 0; 7,05 y 14,10 % MD (muestras 8, 9 y 7). A partir de estos gráficos combinados
(Figura 7.18) se ha evaluado, para una determinada temperatura de almacenamiento
(25 ºC), cual será la aWC y el contenido de humedad critico (CHC) que delimitan la
transición vítreo-goma y por lo tanto la humedad relativa ambiente límite de
almacenamiento del producto a esa temperatura para las tres formulaciones antes
citadas. Los valores críticos encontrados se presentan en la tabla 7.13.
Tabla 7.13 Valores críticos para contenido de humedad (CHC) y actividad
acuosa (aWC) para las formulaciones de mate soluble
CHC
aWC (GAB)
MD
(%)
(g agua / g sólidos secos)
0
0,082
0,42
7,05
0,075
0,42
14,10
0,110
>0,55 (experimental) o
= 0,603 (predicho por GAB)
190
El CHC resultó muy similar para el mate soluble puro y el mate soluble
formulado con 7,05 % MD. Cuando estos productos son almacenados a una humedad
relativa ambiente del 42%, presentarán un contenido de humedad cercano al 7-8 % bs
y su Tg será de 25 °C, por lo tanto si estos productos se almacenan y comercializan a
una temperatura menor a 25 °C, el nivel máximo de humedad relativa ambiente que
permitiría asegurar el estado vítreo sería del 42% (es decir sin signos deteriorativos
gobernados por fenómenos difusionales). Este valor de CHC es 1,4 y 1,7 veces superior
a los correspondientes Xm a 25ºC predichos por el modelo de GAB.
La transición vítrea en condiciones ambientales (25 °C) para la formulación con
14 %MD ocurriría cuando la humedad relativa ambiente ronde el 58-60 %, por lo que
dicha formulación puede ser considerada la más estable desde el punto de vista de los
deterioros gobernados por fenómenos difusionales. Esta formulación presentaría una
aWC probablemente mayor a 0,55 (de acuerdo a la extrapolación de la línea de Tg en la
figura 7.18c) (o de 0,6 según predicciones del modelo de G-T y modelo de GAB
combinados). Esto significa que las muestras formuladas con 14,1 % MD pueden ser
almacenadas a temperaturas hasta 25 °C a una humedad relativa máxima de
aproximadamente 60 % sin presentar cambios físicos deteriorativos asociados a la
transición de su estado vítreo con un CHC cercano al 11 % bs. Este CHC es
aproximadamente 2,2 veces mayor al contenido de humedad de la monocapa a 25ºC
predicho por el modelo de GAB (ver Tabla 7.12).
El agregado de maltodextrina en dicho porcentaje permitiría elevar la tolerancia
del producto a HR de almacenamiento del 60%, por lo que su uso resultaría apropiado
para prolongar la vida útil del mate soluble desde el punto de vista de su estabilidad
estructural. Sin embargo, si se consideran otras reacciones químicas de deterioro que
no están limitadas por la difusión de los reactantes, el valor de humedad de monocapa,
menor que los valores de CHC determinados para los polvos formulados con las
distintas concentraciones de maltodextrina, debe tomarse en consideración para
mantener la estabilidad de los polvos. Dichos valores de Xm implican valores de aw en
el rango 0,11-0,23 (Tabla 7.12) para polvos deshidratados a 220 ºC.
191
Figura 7.18. Rela
elación entre la actividad acuosa (a 25 °C), el contenido de
humedad de equilibrio
io y la temperatura de transición vítrea para
ra mate soluble:
(a) puro
uro; (b) con 7,05 %MD; (c) con 14,1 %MD
192
7.4. CONCLUSIONES DEL CAPITULO
•
La adsorción de agua por parte de los polvos de mate soluble
ensayados pudo ser descripta adecuadamente por los modelos de GAB y BET
modificado. La temperatura de transición vítrea disminuyó conforme aumentó el
contenido de humedad de los productos, confirmando el efecto plastificador del agua
sobre esta propiedad.
•
El efecto simultaneo de la temperatura de entrada al secadero y
y del porcentaje de maltodextrina agregado previamente al secado ha podido
modelarse adecuadamente; y permitiría la predicción del contenido de polifenoles
totales y de la capacidad antioxidante de los polvos.
•
El mate soluble constituye un material amorfo, ya que las
moléculas de sus solutos fueron inmovilizadas por la rápida deshidratación durante su
secado spray. El problema de la perdida de fluidez y del apelmazamiento del producto
es un problema omnipresente por lo que para lograr su estabilidad (tanto física como
química) se deben considerar los conceptos de actividad acuosa y de transición vítrea
combinados. Un ligero aumento en la aw de las muestras, provocado por una leve
humectación o aumento en la temperatura de almacenamiento, provocaría fenómenos
indeseables asociados al cambio de estado vítreo a estado gomoso, por lo que sería
necesario emplear envases de muy baja permeabilidad al vapor de agua para mantener
la calidad del producto y controlar la temperatura de almacenamiento.
•
El secado spray de extractos concentrados de yerba mate con la
utilización de maltodextrina como agente encapsulante en concentraciones entre 0 y
14,1% p/v y con temperaturas de entrada de aire entre 192 y 248 ºC permite la
obtención de mate soluble con un contenido de polifenoles totales similar al del
extracto líquido; de coloración acorde al producto original,
con valores muy
aceptables de solubilidad a 25 ºC (siempre mayores al 91%) y que al ser rehidratados
no presentan depósitos sedimentados visualmente perceptibles.
•
Se recomienda como futuros rangos de operación el de las
temperaturas bajas a medias (200-220 ºC) y concentraciones de maltodextrina elevadas
(10-14 % p/v) a partir de las cuales se logra menores pérdidas de polifenoles y una
mayor estabilidad física del producto final.
•
El agregado de maltodextrina en un 14% permitiría elevar la
humedad relativa crítica de almacenamiento (en relación a los cambios físicos); efecto
193
no evidenciado a menores porcentajes de maltodextrina. Sin embargo, la estabilidad de
los polvos desde el punto de vista de reacciones químicas requeriría humedades de
almacenamiento menores e iguales a las de monocapa.
Con base en lo concluido anteriormente, se presentan las siguienes recomendaciones:
1-Evaluar el tipo de empaque más adecuado para el producto.
2-Realizar un análisis sensorial de los polvos.
3-Evaluar si el producto en polvo podría ser un ingrediente de alimentos como
yogures, mermeladas, etc., por su efecto antioxidante.
4-Evaluar la ocurrencia y extensión de reacciones químicas de deterioro de polifenoles
durante su almacenamiento en ambientes a diferentes humedades relativas y en
función de la permeabilidad de los envases.
194
SECCION IV
CONCLUSIONES FINALES
195
CONCLUSIONES FINALES
196
•
La metodología ISO/FDIS 14502 para la determinación del
contenido de polifenoles totales (CPT) pudo adaptarse sin inconvenientes a muestras
de yerba mate elaborada (Ilex paraguariensis). Los resultados obtenidos fueron
razonablemente cercanos a los reportados en la bibliografía y los estándares ácido
clorogénico y ácido gálico mostraron sencillez de manejo y estabilidad en las
condiciones de los ensayos.
• Los resultados obtenidos a partir del empleo de método del
radical DPPH para la determinación de capacidad antioxidante (CAO) in vitro de los
extractos de yerba mate adaptada, resultaron apropiados y podrían contribuir al control
de calidad del producto, sin embargo la temperatura de incubación es un factor que
debe ser estandarizado a lo largo de las determinaciones; el método no presentó
interferencia con la cafeína presente en los extractos. Los estándares ácido ascórbico y
Trolox mostraron sencillez de manejo y estabilidad en las condiciones de los ensayos.
•
Al evaluar los efectos del origen, tipo de procesamiento y época
de cosecha, sobre el CPT y la CAO de la yerba mate, se encontró que:
• de los tres factores estudiados, el único que ejerce un efecto
significativo sobre el CPT de los extractos de la yerba mate fue la época de cosecha,
resultando el CPT promedio 4,5 % mayor al inicio de la época de cosecha que al final
de la misma, probablemente debido a distribución de edades foliares en el material
cosechado;
• la época de cosecha (la cual guarda relación con la fase de
desarrollo del cultivo) afecta a la CAO de los extractos de yerba mate
independientemente del origen de las muestras. Los diferentes tipos de secado inciden
de distinta forma sobre la CAO según se trate del inicio o del final de la época de
cosecha. En el secado tipo barbacuá no se detectaron variaciones significativas en la
CAO de los extractos provenientes de muestras cosechas en ambas épocas, mientras
que en los otros dos tipos de secado (cinta y tubular) se halló variación significativa de
la CAO según las épocas de cosecha, encontrándose valores mayores en el inicio de la
cosecha (marzo – abril), tanto para el secado en cinta como para el secado tubular. En
base a los resultados, para obtener extractos de yerba mate con altos CPT y CAO se
debe trabajar con materia prima cosechada al inicio de la cosecha.
•
Al optimizar la extracción de polifenoles totales a partir de la
yerba mate se encontró que:
197
• la fracción hojas posee mayor CPT que la fracción palos (22,2 ±
0,14 y 14,1 ± 1,24 gEAC %ms respectivamente; p ≤ 0,012) por lo que para la
extracción de polifenoles a partir de yerba mate se sugiere la utilización únicamente de
la fracción de hojas;
• existe una fuerte asociación lineal directa entre CPT y
cualquiera de las formas de expresar CAO;
• si bien la extracción metanólica (metanol al 70 % en volumen, a
70 ºC durante 10 min) a partir de la fracción de hojas fue la más eficiente, el etanol y el
agua han mostrado ser eficaces en la extracción de los compuestos fenólicos presentes
en yerba mate y presentan la ventaja competitiva de ser de baja toxicidad (etanol) y
alta abundancia relativa (agua);
• se considera conveniente utilizar dos sistemas extractivos:
soluciones etanólicas (concentraciones 30-50 %p/p con relaciones líquido a sólido
comprendidas entre 8 y 9 g líquido / g ms por 30 min a 65 ± 2° C) y agua en ebullición
usando la misma relación líquido a sólido (8 - 9) y el mismo tiempo de extracción (30
min). Con ambos sistemas extractivos se logra una eficiencia de extracción cercana al
55 % del valor máximo posible (metanol al 70 % en volumen; a 70 °C por 10 min).
• El secado spray de extractos concentrados de yerba mate con la
utilización de maltodextrina como agente encapsulante en concentraciones entre 0 y
14,1% p/v y con temperaturas de entrada de aire entre 192 y 248 ºC permite la
obtención de mate soluble con un contenido de polifenoles totales similar al del
extracto líquido previo al secado; de coloración acorde al producto original, con
valores muy aceptables de solubilidad a 25 ºC (siempre mayores al 91%) y que al ser
rehidratados no presentan depósitos sedimentados visualmente perceptibles. La
adsorción de agua por parte de los polvos de mate soluble ensayados puede ser
descripta adecuadamente por los modelos de GAB y BET modificado.
•
En el rango operación estudiada (temperatura del aire de
entrada entre 192 ºC y 248 ºC y porcentaje de maltodextrina (MD) entre 0 y 14,1
%p/v) la pérdida de polifenoles fue despreciable (no mayor al 9%) lo cual sugiere que
los compuestos que contribuyen al valor de CPT del producto en polvo son muy
estables a las temperaturas ensayadas o sus posibles productos de hidrólisis durante el
proceso de secado continúan presentando estructuras moleculares con grupos oxidrilos
198
unidos al anillo bencénico, es decir que mantienen su capacidad reductora (o
antioxidante).
• El problema de la perdida de fluidez y del apelmazamiento del
producto es un problema omnipresente. El mate soluble constituye un material amorfo,
ya que las moléculas de sus solutos fueron inmovilizadas por la rápida deshidratación
durante su secado spray. Por lo tanto cuando se desea lograr su estabilidad (tanto física
como química) se deben considerar ambos conceptos, tanto actividad acuosa como
transición vítrea. Un ligero aumento en la aw de las muestras, provocado por una leve
humectación o aumento en la temperatura de almacenamiento, provocaría fenómenos
indeseables asociados al cambio de estado vítreo a estado gomoso, por lo que sería
necesario emplear envases de muy baja permeabilidad al vapor de agua para mantener
la calidad del producto. El agregado de maltodextrina en un 14% porcentaje permitió
lograr un nivel máximo de HR del almacenamiento sin riesgo de aparición de signos
de deterioro asociados al paso al estado gomoso de la matriz amorfa; resultando este
porcentaje de maltodextrina el adecuado para prolongar la vida del mate soluble. Sin
embargo, la estabilidad de los polvos desde el punto de vista de reacciones químicas de
deterioro requeriría humedades de almacenamiento menores o iguales a las de la
monocapa.
• los resultados obtenidos en el rango estudiado orientan la zona
óptima (mínima pérdida de polifenoles) hacia las temperaturas bajas a medias (200 220 ºC) y 14,1 %p/v como concentración de maltodextrina a partir de las cuales se
logra menores pérdidas de polifenoles y una mayor estabilidad física del producto
final.
199
SECCION V
REFERENCIAS
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ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1............................................................................................................................ 5
Nota 1. Modo de cálculo del contenido de polifenoles totales ............................................ 6
Cuadro A.1. Datos del ácido clorogénico como patrón estándar......................................... 6
Cuadro A.2. Análisis de regresión lineal para la curva de calibración con ácido
clorogénico como estándar .................................................................................................. 7
Cuadro A.3. Contraste de hipótesis ..................................................................................... 7
Cuadro A.4. Datos del ácido gálico como patrón estándar................................................. 8
Cuadro A.5. Análisis de regresión lineal para la curva de calibración con ácido gálico
como estándar ...................................................................................................................... 8
Cuadro A.6. Datos crudos de lecturas de CPT .................................................................... 9
Cuadro A.7. Datos promediados de las lecturas de CPT del cuadro A6 ...........................10
Cuadro A.8. Datos de lectura de absorbancia del blanco de reactivos del ensayo del
radical DPPH a diferentes longitudes de onda ..................................................................11
Cuadro A.9. Perfil de absorbancia del blanco de reactivos del ensayo del radical DPPH a
diferentes concentraciones de la solución de trabajo del radical DPPH. ...........................11
Cuadro A.10. Análisis de regresión lineal del perfil de absorbancia del radical DPPH ....12
Cuadro A.11. Cinética de reacción entre el radical DPPH y el patrón ácido ascórbico ...12
Cuadro A.12. Cinética de reacción entre el radical DPPH y el patrón Trolox .................14
Cuadro A.13. Cinética de reacción entre el radical DPPH y los extractos diluidos de
yerba mate .........................................................................................................................15
Cuadro A.14. Planilla de cálculo de los cocientes másicos empleados .............................19
Cuadro A.15. Análisis de regresión lineal- Curva de calibración con Trolox ...................20
Cuadro A.16. Análisis de regresión lineal-Curva de calibración con ácido ascórbico ......21
Cuadro A.17. Datos del ensayo de Folin-Ciocalteu ..........................................................21
Cuadro A.18. Datos correspondientes al ensayo DPPH ....................................................22
Cuadro A.19. Datos y análisis de regresión para la relación CPT-CAO de extractos de
yerba mate .........................................................................................................................23
Cuadro A.20. Datos cinéticos correspondientes a la reacción del radical DPPH con
cafeína ...............................................................................................................................24
Cuadro A.21a. Efecto de la temperatura de incubación sobre el ensayo del radical DPPH
...........................................................................................................................................25
Cuadro A.21b. Análisis de varianza para los efectos simples extracto (A) y temperatura
(B) sobre la CAO (utilizando Trolox como patrón estándar) ............................................25
Cuadro A.21c. Análisis de varianza para los efectos simples extracto (A) y temperatura
(B) sobre la CAO (utilizando ácido ascórbico como patrón estándar) ..............................26
ANEXO 2..........................................................................................................................27
Cuadro B.1. Datos de la determinación de contenido de polifenoles totales- Método de
Folin-Ciocalteu ..................................................................................................................28
Cuadro B.2. Datos de la determinación de Capacidad Antioxidante- Método de reducción
del radical DPPH ...............................................................................................................31
Cuadro B.3. Análisis de la Varianza para CPT (efectos simples) .....................................34
Cuadro B.4. Análisis de la Varianza para CAO (efectos simples) ....................................34
Cuadro B.5. Análisis de la Varianza para CPT (efectos dobles: Orígen y época).............35
Cuadro B.6. Análisis de la Varianza para CPT (efectos dobles: Secado y época) ............35
Cuadro B.7. Análisis de la Varianza para CAO (efectos dobles: Orígen y época)............35
Cuadro B.8. Análisis de la Varianza para CAO (efectos dobles: Secado y época) ...........36
Cuadro B.9. Contrastes de hipótesis ..................................................................................37
ANEXO 3..........................................................................................................................38
Cuadro C.1. Datos de determinación de CPT- Método de Folin-Ciucalteu ......................39
Cuadro C.2. Resumen estadístico de CPT de las fracciones de hojas y palos y prueba t 39
Cuadro C.3. Datos correspondientes a la experiencia de determinación del tiempo de
extracción ..........................................................................................................................40
Cuadro C.4. Análisis de regresión no lineal – tiempo de extracción .................................41
Cuadro C.5. Planilla de cálculo de las cantidades a agregar - Experiencia correspondiente
al diseño experimental .......................................................................................................44
Cuadro C.6. Datos de concentración y contenido de polifenoles totales...........................46
Cuadro C.7. Resumenes estadísticos y gráficos de dispersión ..........................................48
Cuadro C.8. Datos de capacidad antioxidante ...................................................................51
Nota C.3. Modo de cálculo del contenido de cafeína (CC) para extracciones del diseño .52
Cuadro C.9. Datos de contenido de cafeína.......................................................................52
Cuadro C.10. Datos empleados para el análisis de regresión y de correlación .................54
Cuadro C.11. Análisis de correlación para los pares de variables .....................................55
Cuadro C.12. Análisis de mínima diferencia significativa (LSD, 95%) ...........................58
Cuadro C.13. Análisis de regresión no lineal ....................................................................64
ANEXO 4..........................................................................................................................72
Cuadro D.1. Datos del ácido clorogénico como patrón estándar y análisis de regresión
lineal ..................................................................................................................................73
Nota D.1. Modo de cálculo de CPT para experiencias de secado ....................................74
Cuadro D.2. Datos crudos de contenido de polifenoles totales de los polvos -Experiencia
de secado ...........................................................................................................................75
Cuadro D.3. Resúmen de datos de contenido de polifenoles totales de los polvos ...........76
Nota D.2. Modo de cálculo de la capacidad antioxidante .................................................76
Cuadro D.4. Datos crudos de capacidad antioxidante de los polvos -Experiencia de
secado ................................................................................................................................78
Cuadro D.5. Resumen de datos de Capacidad Antioxidante de los polvos .......................80
Cuadro D.6. Datos crudos de Solubilidad de los polvos (a 25°C)-Experiencia de secado 81
Cuadro D.7. Resumen de datos de solubilidad de los polvos ............................................81
Cuadro D.8. Datos usados para el análisis de superficie de respuesta (con variables
independientes codificadas)...............................................................................................82
Cuadro D.9. Análisis de superficie de respuesta ...............................................................82
Cuadro D.10. Estimación de errores del análisis de superficie de respuesta .....................86
Cuadro D.11. Datos crudos de determinación de humedad (CH, %bh) ............................90
Cuadro D.12. Datos crudos de determinación de densidad bruta (db; g/mL) ...................91
Cuadro D.13. Análisis de correlación entre contenido de humedad (CH) y densidad (db)
...........................................................................................................................................92
Cuadro D.14. Determinación de parámetros de color .......................................................94
Cuadro D.15. Datos crudos de determinación de ganancia de humedad de los diferentes
polvos, almacenados a 22 °C y 84,34% de humedad relativa. ..........................................95
Cuadro D.16. Planilla de cálculo de higroscopicidad (HG, %) .........................................96
Cuadro D.17. Valores medios de ganancia en peso...........................................................97
Cuadro D.18. Datos obtenidos a partir de la determinación de humedad para isotermas104
Cuadro D.19. Datos de contenido de humedad de equilibrio (CHe; g agua / g ms) –
Experiencia de isotermas .................................................................................................107
Cuadro D.20. Cálculo de errores-Modelado de las isotermas de adsorción ....................117
Cuadro D.21. Datos de contenidos de humedad (CH), y fracciones de agua (ww) y de
sólidos secos (ws), basados en nota D.3. .........................................................................120
Cuadro D.23. Resumen de datos empleados en el modelado de la ecuación de Gordon y
Taylor ..............................................................................................................................121
Cuadro D.24. Análisis de regresión no lineal-Modelo de Gordon y Taylor ....................122
Cuadro D.25. Cálculo de errores-Modelado de Gordon y Taylor ...................................125
Cuadro D.26. Datos empleados en el ANOVA de efecto simple del factor X2 (%MD)
sobre la Tgs predicha por el modelo de Gordon y Taylor. ..............................................126
ANEXO 1
Nota 1. Modo de cálculo del contenido de polifenoles totales
Cuando de utiliza la extracción descripta en el ítem 4.2.1.7, el CPT de la muestra (expresado en gramos de
equivalente por 100 g de muestra seca, g E % ms) se calcula con los siguientes datos: Volumen del extracto
(VO; mL), Peso de la muestra empleada (wi; g base húmeda), Volumen de dilución del extracto (VD; mL),
Volumen de reacción (VR; mL), Equivalentes al patrón (E; mg equivalentes al patrón / mL) (valor obtenido
de la curva de calibración del patrón elegido) y Contenido de humedad de la muestra (CH; g % base
húmeda), utilizándola siguiente ecuación:
Cuadro A.1. Datos del ácido clorogénico como patrón estándar
Absorbancia (765nm)
Concentración
(µg/mL)
Tiempo 0 h Tiempo 24 h
0
0,0002
0,0003
0
0,0001
0,0001
10
0,052
0,054
10
0,053
0,053
20
0,112
0,114
20
0,113
0,11
30
0,191
0,19
30
0,187
0,192
40
0,256
0,26
40
0,256
0,259
50
0,331
0,329
50
0,322
0,32
60
0,393
0,39
60
0,393
0,394
Cuadro A.2. Análisis de regresión lineal para la curva de calibración con ácido clorogénico
como estándar
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: A(0 h; 765 nm)
Variable independiente: concentración de ácido clorogénico(ug/mL)
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
-0,0104125
0,00330632
-3,14928
0,0084
Pendiente
0,00667875
0,0000917007
72,832
0,0000
-----------------------------------------------------------------------------
Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
0,249792
1
0,249792
5304,51
0,0000
Residuo
0,000565086
12 0,0000470905
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
0,250357
13
Coeficiente de Correlación = 0,998871
R-cuadrado = 99,7743 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99,7555 porcentaje
Error estándar de est. = 0,00686225
Error absoluto medio = 0,00500357
Estadístico de Durbin-Watson = 1,05665 (P=0,0101)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,365631
Hipótesis del presente análisis de regresión: Hnula (Ho): la variable dependiente (Absorbancia) no depende
linealmente de la variable independiente (concentración). H alternativa (Ha): la variable dependiente
(Absorbancia) depende linealmente de la variable independiente (concentración).
Conclusión: Se rechaza la Ho. El modelo lineal es válido.
Cuadro A.3. Contraste de hipótesis
Lecturas de absorbancia para las diluciones de ácido clorogénico a 0 y 24 h desde su preparación
(A(0h)-A(24h)), (prueba t para muestras pareadas)
Media muestral = -0,000435714
Mediana muestral = -0,00005
contraste t
----------Hipótesis nula: media = 0,0
Alternativa: no igual
Estadístico t = -0,643842
P-valor = 0,530874
No se rechaza la hipótesis nula para alpha = 0,05.
Cuadro A.4. Datos del ácido gálico como patrón estándar
Concentración Absorbancia
(µg/mL)
(765nm)
0
0
10
10
20
20
30
30
40
40
50
50
60
60
0,002
0,002
0,095
0,098
0,23
0,236
0,351
0,363
0,483
0,493
0,593
0,599
0,716
0,723
Cuadro A.5. Análisis de regresión lineal para la curva de calibración con ácido gálico como
estándar
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: A (PATRÓN ÁCIDO GÁLICO)
Variable independiente: Concentración (ug/mL)
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
-0,00898214
0,00481321
-1,86615
0,0866
Pendiente
0,0121661
0,000133494
91,1355
0,0000
-----------------------------------------------------------------------------
Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
0,828874
1
0,828874
8305,68
0,0000
Residuo
0,00119755
12 0,0000997961
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
0,830072
13
Coeficiente de Correlación = 0,999278
R-cuadrado = 99,8557 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99,8437 porcentaje
Error estándar de est. = 0,0099898
Error absoluto medio = 0,00761735
Estadístico de Durbin-Watson = 1,53677 (P=0,1026)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,179557
Hipótesis del presente análisis de regresión: Hnula (Ho): la variable dependiente (Absorbancia) no depende
linealmente de la variable independiente (concentración). H alternativa (Ha): la variable dependiente
(Absorbancia) depende linealmente de la variable independiente (concentración). . Conclusión: Se rechaza la
Ho. El modelo lineal es válido.
Cuadro A.6. Datos crudos de lecturas de CPT
Concentración
Equivalente
Muestra
Extracción
Peso (g)
CH
Lectura
A
EAC
EAG
CPT
CPT-EAC
CPTEAG
1
1
0,2082
9,2
1
0,224
34,99
19,10
18,51
10,10
1
1
0,2082
9,2
2
0,226
35,28
19,26
18,66
10,19
1
2
0,2015
9,2
1
0,235
36,63
20,00
20,02
10,93
1
2
0,2015
9,2
2
0,234
36,48
19,92
19,94
10,89
2
1
0,2065
6,5
1
0,193
30,36
16,56
15,72
8,58
2
1
0,2065
6,5
2
0,184
29,01
15,82
15,03
8,19
2
2
0,2085
6,5
1
0,202
31,70
17,30
16,26
8,87
2
2
0,2085
6,5
2
0,202
31,70
17,30
16,26
8,87
3
1
0,2042
6,3
1
0,200
31,40
17,13
16,41
8,95
3
1
0,2042
6,3
2
0,196
30,81
16,80
16,10
8,78
3
2
0,2110
6,3
1
0,210
32,90
17,95
16,64
9,08
3
2
0,2110
6,3
2
0,211
33,04
18,03
16,71
9,12
4
1
0,2005
6,9
1
0,190
29,91
16,31
16,02
8,74
4
1
0,2005
6,9
2
0,189
29,76
16,23
15,94
8,69
4
2
0,2057
6,9
1
0,220
34,39
18,77
17,96
9,80
4
2
0,2057
6,9
2
0,225
35,13
19,18
18,35
10,02
5
1
0,2087
7
1
0,215
33,64
18,36
17,33
9,46
5
1
0,2087
7
2
0,220
34,39
18,77
17,72
9,67
5
2
0,2048
7
1
0,208
32,60
17,79
17,11
9,34
5
2
0,2048
7
2
0,213
33,34
18,20
17,51
9,55
6
1
0,2031
6,9
1
0,193
30,36
16,56
16,06
8,76
6
1
0,2031
6,9
2
0,197
30,96
16,89
16,37
8,93
6
2
0,2079
6,9
1
0,217
33,94
18,52
17,54
9,57
6
2
0,2079
6,9
2
0,215
33,64
18,36
17,38
9,49
7
1
0,2028
7,5
1
0,209
32,75
17,87
17,46
9,53
7
1
0,2028
7,5
2
0,204
32,00
17,46
17,06
9,31
7
2
0,2080
7,5
1
0,213
33,34
18,20
17,33
9,46
7
2
0,2080
7,5
2
0,212
33,19
18,11
17,25
9,42
8
1
0,2013
5,3
1
0,225
35,13
19,18
18,43
10,06
8
1
0,2013
5,3
2
0,223
34,84
19,02
18,27
9,98
8
2
0,2015
5,3
1
0,219
34,24
18,69
17,94
9,79
8
2
0,2015
5,3
2
0,222
34,69
18,93
18,18
9,92
9
1
0,2054
6,4
1
0,212
33,19
18,11
17,27
9,42
9
1
0,2054
6,4
2
0,215
33,64
18,36
17,50
9,55
9
2
0,2120
6,4
1
0,221
34,54
18,85
17,41
9,50
9
2
0,2120
6,4
2
0,222
34,69
18,93
17,48
9,54
10
1
0,2056
7,7
1
0,216
33,79
18,44
17,81
9,72
10
1
0,2056
7,7
2
0,215
33,64
18,36
17,73
9,68
10
2
0,2062
7,7
1
0,218
34,09
18,61
17,91
9,78
10
2
0,2062
7,7
2
0,220
34,39
18,77
18,07
9,86
CH: Contenido de humedad (g % bh); concentración equivalente (µg/mL); CTP-EAC: contenido de
polifenoles totales equivalente a ácido clorogénico (g%ms); CTP-EAG: contenido de polifenoles totales
equivalente a ácido gálico (g%ms)
Cuadro A.7. Datos promediados de las lecturas de CPT del cuadro A6
Muestra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Extracción
CPT-(EAC)
CPT-(EAG)
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
18,59±0,08
19,98±0,04
15,38±0,35
16,26±0,00
16,26±0,16
16,68±0,04
15,98±0,04
18,16±0,20
17,53±0,20
17,31±0,20
16,22±0,16
17,46±0,08
17,26±0,20
17,29±0,04
18,35±0,08
18,06±0,12
17,39±0,12
17,45±0,04
17,77±0,04
10,15±0,05
10,91±0,02
8,39±0,20
8,87±0,00
8,87±0,09
9,10±0,02
8,72±0,03
9,91±0,11
9,57±0,11
9,45±0,11
8,85±0,09
9,53±0,04
9,42±0,11
9,44±0,02
10,02±0,04
9,86±0,07
9,49±0,07
9,52±0,02
9,70±0,02
CPT -(EAC)
CPT-(EAG)
19,28 ± 0,7
10,53 ± 0,38
15,82 ± 0,44
8,63 ± 0,24
16,47 ± 0,21
8,98 ± 0,12
17,07 ± 1,09
9,31 ± 0,6
17,42 ± 0,11
9,51 ± 0,06
16,84 ± 0,62
9,19 ± 0,34
17,28 ± 0,02
9,43 ± 0,01
18,21 ± 0,15
9,94 ± 0,08
17,42 ± 0,03
9,5 ± 0,02
17,88 ±0,11
9,76 ± 0,06
2
17,99±0,08
9,82±0,04
Datos expresados como media ± error estándar. CTP-EAC: contenido de polifenoles totales equivalente a
ácido clorogénico (g%ms); CTP-EAG: contenido de polifenoles totales equivalente a ácido gálico (g%ms).
Resumen Estadístico para CPT-EACResumen Estadístico para CPT-EAG
Frecuencia = 20
Media = 17,3663
Varianza = 1,11314
Desviación típica = 1,05506
Error estándar = 0,235918
Mínimo = 15,375
Máximo = 19,98
Rango = 4,605
Asimetría tipi. = 0,60125
Curtosis típificada = 0,762547
Frecuencia = 20
Media = 9,47725
Varianza = 0,335162
Desviación típica = 0,578932
Error estándar = 0,129453
Mínimo = 8,385
Máximo = 10,91
Rango = 2,525
Asimetría tipi. = 0,594174
Curtosis típificada = 0,754426
Cuadro A.8. Datos de lectura de absorbancia del blanco de reactivos del ensayo del radical
DPPH a diferentes longitudes de onda
λ (nm)
A
350
360
370
380
390
400
410
420
430
450
460
480
490
500
505
510
511
512
513
514
515
516
517
518
519
520
521
0,651
0,475
0,39
0,328
0,292
0,284
0,301
0,325
0,412
0,485
0,7
0,824
0,956
1,005
1,038
1,038
1,038
1,047
1,049
1,049
1,052
1,052
1,053
1,053
1,051
1,047
1,031
522
523
524
525
530
540
550
570
580
600
620
640
660
675
700
725
750
775
800
825
850
875
900
925
950
975
1000
1,033
1,027
1,022
1,02
0,97
0,862
0,758
0,607
0,559
0,487
0,433
0,379
0,334
0,297
0,231
0,17
0,11
0,071
0,046
0,022
0,02
0,012
0,005
0,004
0,007
0,006
0,004
Cuadro A.9. Perfil de absorbancia del blanco de reactivos del ensayo del radical DPPH a
diferentes concentraciones de la solución de trabajo del radical DPPH.
Concentración de
la solución del
radical (µM)
A (517 nm)
10
0,103
20
0,201
40
0,408
60
0,617
80
0,82
100
1,023
150
1,602
200
1,919
Cuadro A.10. Análisis de regresión lineal del perfil de absorbancia del radical DPPH
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: Absorbancia
Variable independiente: Concentración del radical DPPH (uM)
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
-0,00133425
0,0018582
-0,718033
0,5124
Pendiente
0,0102581
0,0000306176
335,039
0,0000
-----------------------------------------------------------------------------
Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
0,640139
1
0,640139 112251,05
0,0000
Residuo
0,000022811
40,00000570274
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
0,640161
5
Coeficiente de Correlación = 0,999982
R-cuadrado = 99,9964 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99,9955 porcentaje
Error estándar de est. = 0,00238804
Error absoluto medio = 0,00176347
Estadístico de Durbin-Watson = 2,12362 (P=0,1158)
Autocorrelación residual en Lag 1 = -0,176824
Hipótesis del presente análisis de regresión: H nula (Ho): la variable dependiente (Absorbancia) no depende
linealmente de la variable independiente (concentración). H alternativa (Ha): la variable dependiente
(Absorbancia) depende linealmente de la variable independiente (concentración).
Se rechaza la Ho. El modelo lineal es válido.
Cuadro A.11. Cinética de reacción entre el radical DPPH y el patrón ácido ascórbico
Concentración: 8 mg / 100 mL
Concentración: 10 mg / 100 mL
Tiempo (min) A(517nm) %R
0
1,045
100
0,19
0,7
70,2
0,34
0,7
70,2
1
0,7
70,4
2
0,7
70,2
3
0,7
70,2
4
0,7
70,3
6
0,7
70,3
Tiempo (min) A(517nm) %R
0
1,045
100
0,21
0,7
63,0
0,29
0,7
62,8
0,45
0,7
62,8
1
0,7
63,0
1,25
0,7
63,1
2
0,7
63,5
3
0,7
63,5
6
0,7
63,1
Concentración: 20 mg / 100 mL
Concentración: 16 mg / 100 mL
Tiempo (min) A(517nm) %R
0
1,045
100
0,3
0,4
37,9
1,12
0,4
38,0
1,3
0,4
38,1
2,3
0,4
38,3
3,3
0,4
37,9
6
0,4
38,1
3
0,7
63,5
6
0,7
63,1
Tiempo (min) A(517nm) %R
0
1,045
100
0,25
0,257
24,7
1
0,258
24,8
6
0,258
24,8
Concentración: 21 mg / 100 mL
Tiempo (min) A(517nm) %R
0
1,045
100
0,25
0,2
15,2
0,55
0,2
15,1
1,05
0,2
15,2
6
0,2
15,2
Cuadro A.12. Cinética de reacción entre el radical DPPH y el patrón Trolox
Cuadro A.13. Cinética de reacción entre el radical DPPH y los extractos diluidos de yerba
mate
Dilución:
Tiempo (min)
0
1
3
5
8
9
10
12
15
17
19
21
24
27
31
33
36
39
42
45
48
51
54
57
65
1:400
A (517nm-ee)
1,12
1,023
1,007
0,994
0,977
0,972
0,967
0,958
0,946
0,94
0,934
0,928
0,921
0,915
0,913
0,909
0,905
0,904
0,903
0,902
0,902
0,902
0,904
0,903
0,905
%R
100
91,3
89,9
88,8
87,2
86,8
86,4
85,6
84,5
83,9
83,4
82,9
82,3
81,7
81,5
81,2
80,8
80,7
80,6
80,6
80,6
80,6
80,7
80,6
80,8
Dilución:
1: 300
Tiempo (min)
A (517nm-ee)
0
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
31
34
36
39
42
45
48
51
54
57
60
63
66
69
72
75
78
81
84
88
90
93
96
99
102
105
1,05
0,897
0,882
0,87
0,859
0,849
0,842
0,834
0,826
0,82
0,812
0,805
0,799
0,796
0,789
0,784
0,779
0,776
0,77
0,766
0,763
0,759
0,757
0,754
0,756
0,752
0,751
0,749
0,748
0,747
0,747
0,744
0,744
0,743
0,742
0,744
0,743
%R
100
85,4
84,0
82,9
81,8
80,9
80,2
79,5
78,7
78,1
77,4
76,7
76,1
75,8
75,2
74,7
74,2
73,9
73,4
73,0
72,7
72,3
72,1
71,8
72,0
71,7
71,6
71,4
71,3
71,2
71,2
70,9
70,9
70,8
70,7
70,9
70,8
Dilución:
Tiempo (min)
0
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
31
34
37
40
43
46
49
52
55
58
61
64
67
70
73
76
79
82
85
88
91
94
97
100
103
106
109
112
115
118
120
122
1:250
A (517nm-ee)
%R
1,038
0,845
0,828
0,815
0,802
0,79
0,779
0,768
0,758
0,749
0,743
0,734
0,728
0,721
0,713
0,709
0,702
0,699
0,694
0,689
0,685
0,684
0,681
0,678
0,677
0,673
0,672
0,668
0,665
0,664
0,661
0,661
0,659
0,656
0,655
0,652
0,651
0,65
0,649
0,648
0,647
0,647
0,647
100
81,4
79,8
78,5
77,3
76,1
75,1
74,0
73,1
72,2
71,6
70,7
70,2
69,5
68,7
68,3
67,7
67,4
66,9
66,4
66,0
65,9
65,6
65,4
65,3
64,9
64,8
64,4
64,1
64,0
63,7
63,7
63,5
63,2
63,1
62,9
62,8
62,7
62,6
62,5
62,4
62,4
62,4
Dilución:
1:200
Tiempo (min)
A (517nm-ee)
%R
1,038
0,805
0,781
0,759
0,739
0,72
0,703
0,686
0,672
0,657
0,645
0,633
0,619
0,606
0,6
0,591
0,582
0,573
0,566
0,558
0,552
0,544
0,539
0,534
0,531
0,527
0,524
0,521
0,517
0,516
0,511
0,509
0,505
0,502
0,5
0,498
0,496
0,495
0,495
0,495
100
77,6
75,3
73,2
71,2
69,4
67,8
66,1
64,8
63,3
62,2
61,0
59,7
58,4
57,9
57,0
56,1
55,3
54,6
53,8
53,2
52,5
52,0
51,5
51,2
50,8
50,5
50,3
49,9
49,8
49,3
49,1
48,7
48,4
48,2
48,0
47,8
47,8
47,8
47,8
0
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
31
34
37
40
43
46
49
52
55
58
61
64
67
70
73
76
79
82
85
88
91
94
97
100
104
107
110
113
116
Dilución:
1:150
Tiempo (min)
A (517nm-ee)
%R
Dilución
0
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
31
34
37
40
43
46
49
52
55
58
61
64
67
70
73
76
79
82
85
88
91
94
97
100
103
106
109
112
115
118
119
120
121
122
1,025
0,751
0,716
0,688
0,662
0,638
0,618
0,597
0,577
0,562
0,544
0,528
0,514
0,501
0,49
0,478
0,465
0,455
0,445
0,436
0,427
0,418
0,41
0,403
0,397
0,391
0,385
0,38
0,374
0,37
0,366
0,361
0,357
0,354
0,35
0,349
0,343
0,341
0,339
0,334
0,333
0,332
0,332
0,332
0,332
100
73,3
69,9
67,2
64,6
62,3
60,3
58,3
56,3
54,9
53,1
51,6
50,2
48,9
47,9
46,7
45,4
44,5
43,5
42,6
41,7
40,9
40,1
39,4
38,8
38,2
37,6
37,2
36,6
36,2
35,8
35,3
34,9
34,6
34,2
34,1
33,5
33,4
33,2
32,7
32,6
32,5
32,5
32,5
32,5
1:100
Tiempo (min)
0
0,5
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48
51
54
57
60
63
66
69
72
75
78
81
84
87
90
93
96
99
102
105
108
111
114
117
120
123
A (517nm-ee)
%R
1,024
0,643
0,598
0,558
0,521
0,488
0,458
0,43
0,404
0,38
0,358
0,336
0,317
0,299
0,281
0,265
0,25
0,237
0,223
0,212
0,201
0,191
0,181
0,172
0,163
0,156
0,149
0,142
0,137
0,131
0,128
0,122
0,118
0,115
0,112
0,108
0,106
0,104
0,101
0,1
0,099
0,096
0,096
100
62,8
58,5
54,5
50,9
47,7
44,8
42,1
39,5
37,2
35,0
32,9
31,0
29,3
27,5
26,0
24,5
23,2
21,9
20,8
19,7
18,8
17,8
16,9
16,0
15,3
14,7
14,0
13,5
12,9
12,6
12,0
11,6
11,3
11,1
10,7
10,5
10,3
10,0
9,9
9,8
9,5
9,5
Dilución:
Tiempo (min)
0
0,5
3
6
9
10
14
15
19
20
22
24
27
30
33
36
39
43
46
49
52
55
58
61
64
67
70
73
76
79
82
85
88
91
94
97
100
1:75
A (517nm-ee)
%R
1,038
0,570
0,517
0,475
0,437
0,426
0,383
0,374
0,335
0,326
0,308
0,297
0,269
0,246
0,225
0,204
0,186
0,163
0,146
0,133
0,121
0,112
0,103
0,097
0,092
0,088
0,086
0,083
0,082
0,08
0,079
0,079
0,078
0,077
0,076
0,077
0,078
100
55,0
49,9
45,8
42,2
41,1
37,0
36,1
32,4
31,5
29,8
28,7
26,0
23,8
21,8
19,8
18,0
15,8
14,2
12,9
11,8
10,9
10,0
9,5
9,0
8,6
8,4
8,1
8,0
7,8
7,7
7,7
7,6
7,5
7,4
7,5
7,5
Cuadro A.14. Planilla de cálculo de los cocientes másicos empleados
Abs
(t:0517 nm
C1
C2
Cantidad
Abs
de
(equilibrioTrolox
517 nm)
(µg)
%R
Cantidad
de
Cociente másico
DPPH (µgTrolox/µgDPPH)
(µg)
100
1,099 0,00 0,00
0
1,099
0,2
5,2
0,934
1,098 10,01 0,4
10
0,775
1,098 15,02 0,6
15
0,617
1,098 20,02 0,8
20
0,472
1,100 25,03
25
0,335
1,098 5,20
1
0
85,1
126,26
0,041
70,6
126,26
0,079
56,2
126,26
0,119
43,1
126,26
0,158
30,5
126,48
0,198
16,7 126,48
0,237
1,100 30,04 1,2
30
0,183
C1: Concentración del patrón (mg/100 mL); C2: Concentración del patrón
(mM/L)
Lectura
A (t:0517 nm
C1
Cantidad Lectura
A
de ácido
C2
ascórbico (equilibrio(µg)
517 nm)
1,045
0
0
0
1,045
1,045
8
0,45
8
0,734
1,045
10
0,56
10
0,659
1,045
16
0,90
16
0,397
1,045
20
1,10
20
0,258
Cantidad
de
Cociente másico
%R
DPPH
(µg AA/µgDPPH)
(µg)
100 120,168
0
70,3 120,168
0,067
63,1 120,168
0,083
38,1 120,168
0,133
24,8 120,168
0,166
15,2 120,168
0,175
1,045 21 1,20
21
0,158
C1: Concentración del patrón (mg/100 mL); C2: Concentración del patrón
(mM/L); AA: ácido ascórbico
Cuadro A.15. Análisis de regresión lineal- Curva de calibración con Trolox
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: % R
Variable independiente: Cantidad de Trolox (ug)
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
99,0541
0,659668
150,157
0,0000
Pendiente
-2,76757
0,0365754
-75,6676
0,0000
-----------------------------------------------------------------------------
Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
5331,25
1
5331,25
5725,59
0,0000
Residuo
4,65564
5
0,931127
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
5335,91
6
Coeficiente de Correlación = -0,999564
R-cuadrado = 99,9127 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99,8953 porcentaje
Error estándar de est. = 0,964949
Error absoluto medio = 0,774716
Estadístico de Durbin-Watson = 0,88246 (P=0,0025)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,415587
Hipótesis del presente análisis de regresión: Hnula (Ho): la variable dependiente (Absorbancia) no
depende linealmente de la variable independiente (concentración). H alternativa (Ha): la variable
dependiente (Absorbancia) depende linealmente de la variable independiente (concentración).
Conclusión: Se rechaza la Ho. El modelo lineal es válido.
Cuadro A.16. Análisis de regresión lineal-Curva de calibración con ácido ascórbico
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: % R
Variable independiente: Cantidad de ácido ascórbico (ug)
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
99,9964
0,640298
156,172
0,0000
Pendiente
-3,98081
0,0498346
-79,8806
0,0000
-----------------------------------------------------------------------------
Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
8730,3
1
8730,3
6380,90
0,0000
Residuo
13,6819
10
1,36819
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
8743,98
11
Coeficiente de Correlación = -0,999217
R-cuadrado = 99,8435 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99,8279 porcentaje
Error estándar de est. = 1,1697
Error absoluto medio = 0,846099
Estadístico de Durbin-Watson = 1,30938 (P=0,0434)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,313996
Hipótesis del presente análisis de regresión: Hnula (Ho): la variable dependiente (Absorbancia) no
depende linealmente de la variable independiente (concentración). H alternativa (Ha): la variable
dependiente (Absorbancia) depende linealmente de la variable independiente (concentración).
Conclusión: Se rechaza la Ho. El modelo lineal es válido.
Cuadro A.17. Datos del ensayo de Folin-Ciocalteu
Extracto
Lectura
A leída
µgEAC
PT EXTRAIDOS
(gEAC/30g hoja
seca)
CPT
(gEAC/100
g ms)
1
1
0,247
37,89
2,33
7,77
1
2
0,254
38,97
2,40
7,99
2
1
0,264
40,51
2,49
8,30
CoPT
(mg
EAC/mL)
18,95
19,48
20,25
20,33
2
2
0,265
40,66
2,50
8,34
Dilución del extracto: 1:5; Muestra B2; PT: polifenoles totales; CPT: contenido de polifenoles totales;
CoPT: concentración de polifenoles totales
Resúmenes Estadísticos para lecturas de CPT
Error
Extracción
N° lecturas
Media
Estándar
----------------------------------------------------------------1
2
7,88
0,11
2
2
8,32
0,02
----------------------------------------------------------------Total
4
8,1
0,134969
Resumen Estadístico para CPT
Resumen Estadístico para CoPT
Frecuencia = 2
Media = 8,1
Varianza = 0,0968
Desviación típica = 0,311127
Error estándar = 0,22
Mínimo = 7,88
Máximo = 8,32
Frecuencia = 2
Media = 19,75
Varianza = 0,605
Desviación típica = 0,777817
Error estándar = 0,55
Mínimo = 19,2
Máximo = 20,3
Rango = 1,1
Resúmenes Estadísticos para CoPT
Error
Extracción
N° Lecturas
Media
Estándar
----------------------------------------------------------------1
2
19,2154
0,269231
2
2
20,2923
0,0384615
----------------------------------------------------------------Total
4
19,7538
0,330113
Cuadro A.18. Datos correspondientes al ensayo DPPH
DPPH
E
wi
1
2
VO
31,5 116
31,5 123
VD(1:xx)
180
200
A
(t=0)
1,055
1,030
A
(t=120)
Gramos
equivalentes
X
0,467 45,47
0,517 50,32
%R
44,33
50,26
gEAA
gET
13,98
12,49
19,77
17,63
CAO
CAOEAA(g%ms)
CAOET(g%ms)
9,74
10,25
13,77
14,46
9,99
14,12
E: extracto; Contenido de Humedad (CHbh): 4,8%; wi: peso de muestra base humeda (g); VO: volumen
original (mL); VD: volumen de dilución (mL); t:tiempo (min); A: absorbancia; EAA: equivalentes a
ácido ascórbico; ET: equivalentes a Trolox
Resumen Estadístico para CAO_EAA
Resumen Estadístico para CAO_ET
Frecuencia = 2
Media = 9,995
Varianza = 0,13005
Desviación típica = 0,360624
Error estándar = 0,255
Mínimo = 9,74
Máximo = 10,25
Rango = 0,51
Frecuencia = 2
Media = 14,115
Varianza = 0,23805
Desviación típica = 0,487904
Error estándar = 0,345
Mínimo = 13,77
Máximo = 14,46
Rango = 0,69
Cuadro A.19. Datos y análisis de regresión para la relación CPT-CAO de extractos de
yerba mate
Dilución 1:x
75
µg-PFT
26,337
A (t=0)
1,038
X
100,90
µgDPPH
119,364
µg-PFT / µgDPPH
0,221
100
19,753
1,024
99,54
117,756
0,168
150
13,168
1,025
99,64
117,871
0,112
200
9,876
1,038
100,90
119,364
0,083
250
7,901
1,038
100,90
119,364
0,066
300
6,584
1,050
102,06
120,742
0,055
400
4,938
1,120
108,86
128,781
0,038
500
3,950
1,030
100,12
118,445
0,033
0
0,000
1,118
108,66
128,552
0,000
Modo de cálculo del cociente másico:
EXTRACTO B2: 19753 µgEAC/mL de extracto original
Para una dilución de 1:75 será:
1 mL de extracto original----- 19753µgEAC--------------------75mL=75000 µL
26,337 µgEAC=x--------------- 100 µL
PM del DPPH=394,32 g/mol
1 mol--1000 mM----1x106 µM
1X106 µM---------394,32 g/mol
100 µM------------x=0,039432 g DPPH
1000 mL de solución de DPPH----------------0,039432 g DPPH
3 mL (usado en la reacción)--------- x=1,18296x10-4 g de DPPH=118,296 µg de DPPH
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: %R
Variable independiente: cociente ug PFT/ugDPPH en el estado estacionario.
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
99,692
2,16345
46,0801
0,0000
Pendiente
-561,687
25,5029
-22,0244
0,0000
-----------------------------------------------------------------------------
Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
6015,76
1
6015,76
485,07
0,0000
Residuo
74,4103
6
12,4017
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
6090,18
7
Coeficiente de Correlación = -0,993872
R-cuadrado = 98,7782 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 98,5746 porcentaje
Error estándar de est. = 3,52161
Error absoluto medio = 2,44395
Estadístico de Durbin-Watson = 1,42432 (P=0,0794)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,17028
%R
100
80
60
40
20
0
0
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
ug PFT/ ug DPPH en el estado estacionario
0,18
Cuadro A.20. Datos cinéticos correspondientes a la reacción del radical DPPH con cafeína
Tiempo (min)
0
1
2
3
5
10
17
20
25
30
A (517 nm)
1,134
1,133
1,132
1,132
1,132
1,133
1,137
1,140
1,144
1,140
Cuadro A.21a. Efecto de la temperatura de incubación sobre el ensayo del radical DPPH
T
(°C)
E
Volumen
(mL)
Abs (517nm)
Cantidad de DPPH°
CAO (g % ms)
%R
CAOEAA
20
1
10
30
1,07
0,648
104,01
63,04
60,61
20,46
14,57
20
1
10
30
1,07
0,642
104,01
62,46
60,05
20,76
14,78
25
1
10
30
1,07
0,491
104,01
47,79
45,95
28,26
19,99
25
1
10
30
1,07
0,489
104,01
47,60
45,77
28,36
20,06
30
1
10
30
1,07
0,391
104,01
38,09
36,62
33,23
23,45
30
1
10
30
1,07
0,386
104,01
37,60
36,15
33,47
23,62
40
1
10
30
1,07
0,326
104,01
31,78
30,55
36,45
25,69
40
1
10
30
1,07
0,323
104,01
31,48
30,27
36,60
25,80
20
2
10
30
1,07
0,609
104,01
59,25
56,97
22,45
15,96
20
2
10
30
1,07
0,612
104,01
59,54
57,25
22,30
15,85
25
2
10
30
1,07
0,442
104,01
43,04
41,38
30,77
21,74
25
2
10
30
1,07
0,438
104,01
42,65
41,01
30,97
21,88
30
2
10
30
1,07
0,372
104,01
36,24
34,85
34,25
24,16
30
2
10
30
1,07
0,365
104,01
35,56
34,19
34,60
24,40
40
2
10
30
1,07
0,322
104,01
31,39
30,18
36,74
25,89
40
2
10
30
1,07
0,32
104,01
31,19
29,99
36,84
25,96
T: temperatura de incubación; E: extracto; VO: volumen original; VD: Volumen de dilución; Peso de
muestra empleado (wi): 0,2037 g (Extracto 1) y 0,2032 g (Extracto 2)
VO
VD
(t=0)
(t=120) a t= 0 min
a t=120 min
CAO-ET
Cuadro A.21b. Análisis de varianza para los efectos simples extracto (A) y temperatura (B)
sobre la CAO (utilizando Trolox como patrón estándar)
Análisis de la Varianza para CAO_ET - Sumas de Cuadrados de Tipo III
---------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado Medio Cociente-F
P-V
---------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES
A:extracto
4,6818
1
4,6818
8,39
0,
B:T
306,19
3
102,063
182,83
0,
RESIDUOS
1,6747
3
0,558233
---------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO)
312,547
7
---------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
Cuadro A.21c. Análisis de varianza para los efectos simples extracto (A) y temperatura (B)
sobre la CAO (utilizando ácido ascórbico como patrón estándar)
Análisis de la Varianza paraCAO_EAA - Sumas de Cuadrados de Tipo III
------------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado Medio Cociente-F
P-Valo
------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES
A:extracto
2,26845
1
2,26845
8,43
0,062
B:T
147,979
3
49,3263
183,31
0,000
RESIDUOS
0,80725
3
0,269083
------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO)
151,055
7
------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
En ambos análisis de varianza, las hipótesis a prueba fueron:
Ho(extracto): no hay variabilidad en la CAO debida a los extractos. Ha (extractos): hay variabilidad en la
CAO debida a los extractos. Como Pv:0,0623, no se rechaza Ho.
Ho(temperatura): no hay efecto de la temperatura sobre la CAO. Ha (temperatura): hay efecto de la
temperatura sobre la CAO. Como Pv:0,0007, se rechaza Ho.
La temperatura de incubación afecta a las lecturas de CAO.
ANEXO 2
Cuadro B.1. Datos de la determinación de contenido de polifenoles totales- Método de
Folin-Ciocalteu
Muestra
Origen
300
300
300
300
301
301
301
301
302
302
302
302
303
303
303
303
304
304
304
304
305
305
305
305
306
306
306
306
307
307
307
307
308
308
308
308
309
309
309
309
310
310
310
310
311
311
C
C
C
C
C
C
C
C
N
N
N
N
N
N
N
N
S
S
S
S
C
C
C
C
C
C
C
C
CN
CN
CN
CN
C
C
C
C
N
N
N
N
CN
CN
CN
CN
CN
CN
SeÉpoc Peso
cad
a
(g)
o
ci
IZ 0,2021
ci
IZ 0,2021
ci
IZ 0,2037
ci
IZ 0,2037
ci
IZ 0,2062
ci
IZ 0,2062
ci
IZ 0,2055
ci
IZ 0,2055
ci
IZ 0,2074
ci
IZ 0,2074
ci
IZ 0,2057
ci
IZ 0,2057
ci
IZ 0,2076
ci
IZ 0,2076
ci
IZ 0,2031
ci
IZ 0,2031
tu
IZ 0,2001
tu
IZ 0,2001
tu
IZ 0,2007
tu
IZ 0,2007
ba
IZ 0,2029
ba
IZ 0,2029
ba
IZ 0,2019
ba
IZ 0,2019
tu
IZ 0,2021
tu
IZ 0,2021
tu
IZ
0,202
tu
IZ
0,202
ci
IZ 0,2004
ci
IZ 0,2004
ci
IZ 0,2005
ci
IZ 0,2005
tu
IZ 0,2017
tu
IZ 0,2017
tu
IZ 0,2026
tu
IZ 0,2026
tu
IZ 0,2050
tu
IZ 0,2050
tu
IZ 0,2057
tu
IZ 0,2057
tu
IZ 0,2001
tu
IZ 0,2001
tu
IZ 0,2029
tu
IZ 0,2029
ba
IZ 0,2058
ba
IZ 0,2058
CH
(%bh)
Extracci
ón
Lectura
8,74
8,74
8,74
8,74
8,32
8,32
8,32
8,32
7,73
7,73
7,73
7,73
8,33
8,33
8,33
8,33
7,72
7,72
7,72
7,72
9,15
9,15
9,15
9,15
7,43
7,43
7,43
7,43
8,26
8,26
8,26
8,26
7,65
7,65
7,65
7,65
7,4
7,4
7,4
7,4
7,84
7,84
7,84
7,84
9,39
9,39
300ª
300ª
300B
300B
301ª
301ª
301B
301B
302ª
302ª
302B
302B
303ª
303ª
303B
303B
304ª
304ª
304B
304B
305ª
305ª
305B
305B
306ª
306ª
306B
306B
307ª
307ª
307B
307B
308ª
308ª
308B
308B
309ª
309ª
309B
309B
310ª
310ª
310B
310B
311ª
311ª
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
Abs
(765
nm)
0,284
0,285
0,304
0,306
0,316
0,316
0,319
0,32
0,333
0,335
0,333
0,333
0,316
0,315
0,303
0,305
0,285
0,286
0,294
0,292
0,264
0,266
0,262
0,261
0,293
0,29
0,287
0,285
0,302
0,305
0,305
0,301
0,287
0,291
0,303
0,304
0,320
0,317
0,311
0,308
0,317
0,315
0,324
0,327
0,287
0,281
CPT
CoPT
(µgEAC/m (gEAC/100g
ms)
L)
39,18
39,32
42,00
42,28
43,69
43,69
44,11
44,25
46,08
46,37
46,08
46,08
43,69
43,55
41,86
42,14
39,32
39,46
40,59
40,31
36,37
36,65
36,08
35,94
40,45
40,03
39,61
39,32
41,72
42,14
42,14
41,58
39,61
40,17
41,86
42,00
44,25
43,83
42,99
42,56
43,83
43,55
44,82
45,24
39,61
38,76
21,24
21,32
22,59
22,74
23,11
23,11
23,41
23,49
24,08
24,23
24,28
24,28
22,96
22,88
22,48
22,63
21,30
21,37
21,92
21,76
19,73
19,88
19,67
19,60
21,62
21,40
21,18
21,03
22,69
22,92
22,91
22,60
21,26
21,56
22,37
22,45
23,31
23,09
22,57
22,35
23,77
23,62
23,97
24,19
21,24
20,79
311
311
312
312
312
312
313
313
313
313
314
314
314
314
315
315
315
315
316
316
316
316
317
317
317
317
318
318
318
318
319
319
319
319
320
320
320
320
321
321
321
321
322
322
322
322
323
323
323
323
324
324
CN
CN
S
S
S
S
CN
CN
CN
CN
S
S
S
S
CN
CN
CN
CN
S
S
S
S
C
C
C
C
S
S
S
S
CN
CN
CN
CN
S
S
S
S
CN
CN
CN
CN
S
S
S
S
CN
CN
CN
CN
CN
CN
ba
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ba
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IZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
0,2057
0,2057
0,204
0,204
0,2025
0,2025
0,2028
0,2028
0,2006
0,2006
0,2022
0,2022
0,2041
0,2041
0,2075
0,2075
0,2065
0,2065
0,2051
0,2051
0,2057
0,2057
0,2064
0,2064
0,207
0,207
0,2096
0,2096
0,2051
0,2051
0,2048
0,2048
0,2021
0,2021
0,2024
0,2024
0,2018
0,2018
0,2061
0,2061
0,2071
0,2071
0,2039
0,2039
0,2015
0,2015
0,2023
0,2023
0,2038
0,2038
0,2017
0,2017
9,39
9,39
8,83
8,83
8,83
8,83
8,34
8,34
8,34
8,34
7,76
7,76
7,76
7,76
7,6
7,6
7,6
7,6
6,17
6,17
6,17
6,17
9,24
9,24
9,24
9,24
9,55
9,55
9,55
9,55
8,44
8,44
8,44
8,44
9,84
9,84
9,84
9,84
9,33
9,33
9,33
9,33
9,82
9,82
9,82
9,82
8,13
8,13
8,13
8,13
7,89
7,89
311B
311B
312ª
312ª
312B
312B
313ª
313ª
313B
313B
314ª
314ª
314B
314B
315ª
315ª
315B
315B
316ª
316ª
316B
316B
317ª
317ª
317B
317B
318ª
318ª
318B
318B
319ª
319ª
319B
319B
320ª
320ª
320B
320B
321ª
321ª
321B
321B
322ª
322ª
322B
322B
323ª
323ª
323B
323B
324ª
324ª
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
0,286
0,286
0,298
0,302
0,297
0,296
0,289
0,286
0,295
0,295
0,291
0,292
0,299
0,23
0,296
0,298
0,288
0,289
0,291
0,293
0,314
0,315
0,271
0,273
0,293
0,291
0,312
0,311
0,301
0,301
0,29
0,291
0,296
0,294
0,271
0,255
0,271
0,275
0,262
0,268
0,277
0,273
0,285
0,285
0,282
0,287
0,25
0,251
0,27
0,27
0,283
0,284
39,46
39,46
41,15
41,72
41,01
40,87
39,89
39,46
40,73
40,73
40,17
40,31
41,30
31,58
40,87
41,15
39,75
39,89
40,17
40,45
43,41
43,55
37,35
37,63
40,45
40,17
43,13
42,99
41,58
41,58
40,03
40,17
40,87
40,59
37,35
35,10
37,35
37,92
36,08
36,93
38,20
37,63
39,32
39,32
38,90
39,61
34,39
34,54
37,21
37,21
39,04
39,18
21,17
21,17
22,13
22,43
22,22
22,14
21,46
21,23
22,15
22,15
21,54
21,61
21,94
16,77
21,32
21,47
20,83
20,90
20,87
21,02
22,49
22,56
19,94
20,09
21,53
21,38
22,75
22,67
22,41
22,41
21,35
21,42
22,09
21,94
20,47
19,23
20,53
20,84
19,31
19,76
20,34
20,04
21,39
21,39
21,41
21,80
18,51
18,58
19,87
19,87
21,01
21,09
324
324
325
325
325
325
326
326
326
326
327
327
327
327
328
328
328
328
329
329
329
329
330
330
330
330
331
331
331
331
332
332
332
332
333
333
333
333
334
334
334
334
335
335
335
335
336
336
336
336
337
337
CN
CN
C
C
C
C
C
C
C
C
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
C
C
C
C
CN
CN
CN
CN
S
S
S
S
C
C
C
C
S
S
S
S
C
C
C
C
S
S
S
S
C
C
ci
ci
ci
ci
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ci
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ba
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tu
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ba
ba
ba
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
0,2028
0,2028
0,2005
0,2005
0,2004
0,2004
0,2007
0,2007
0,2009
0,2009
0,2016
0,2016
0,2005
0,2005
0,2042
0,2042
0,2059
0,2059
0,2029
0,2029
0,2044
0,2044
0,2028
0,2028
0,206
0,206
0,2049
0,2049
0,2028
0,2028
0,2012
0,2012
0,2029
0,2029
0,2019
0,2019
0,204
0,204
0,2017
0,2017
0,2025
0,2025
0,209
0,209
0,2062
0,2062
0,2096
0,2096
0,2086
0,2086
0,2035
0,2035
7,89
7,89
6,78
6,78
6,78
6,78
8,03
8,03
8,03
8,03
6,29
6,29
6,29
6,29
8,3
8,3
8,3
8,3
7,19
7,19
7,19
7,19
7,79
7,79
7,79
7,79
8,7
8,7
8,7
8,7
6,47
6,47
6,47
6,47
8,88
8,88
8,88
8,88
7,5
7,5
7,5
7,5
8,17
8,17
8,17
8,17
8,39
8,39
8,39
8,39
8,1
8,1
324B
324B
325ª
325ª
325B
325B
326ª
326ª
326B
326B
327ª
327ª
327B
327B
328ª
328ª
328B
328B
329ª
329ª
329B
329B
330ª
330ª
330B
330B
331ª
331ª
331B
331B
332ª
332ª
332B
332B
333ª
333ª
333B
333B
334ª
334ª
334B
334B
335ª
335ª
335B
335B
336ª
336ª
336B
336B
337ª
337ª
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
0,274
0,274
0,279
0,28
0,275
0,276
0,266
0,268
0,263
0,265
0,29
0,293
0,282
0,289
0,287
0,29
0,287
0,288
0,283
0,285
0,29
0,29
0,32
0,325
0,326
0,328
0,301
0,301
0,289
0,290
0,293
0,291
0,295
0,297
0,331
0,332
0,318
0,317
0,262
0,263
0,282
0,283
0,311
0,313
0,283
0,281
0,279
0,28
0,266
0,267
0,288
0,288
37,77
37,77
38,48
38,62
37,92
38,06
36,65
36,93
36,23
36,51
40,03
40,45
38,90
39,89
39,61
40,03
39,61
39,75
39,04
39,32
40,03
40,03
44,25
44,96
45,10
45,38
41,58
41,58
39,89
40,03
40,45
40,17
40,73
41,01
45,80
45,94
43,97
43,83
36,08
36,23
38,90
39,04
42,99
43,27
39,04
38,76
38,48
38,62
36,65
36,79
39,75
39,75
20,22
20,22
20,59
20,66
20,30
20,37
19,85
20,01
19,61
19,76
21,19
21,41
20,70
21,23
21,15
21,38
20,98
21,05
20,73
20,88
21,10
21,10
23,66
24,04
23,74
23,89
22,23
22,23
21,54
21,62
21,50
21,35
21,46
21,61
24,90
24,97
23,66
23,58
19,34
19,42
20,77
20,84
22,40
22,54
20,62
20,47
20,04
20,11
19,18
19,25
21,25
21,25
337
C
ba
FZ 0,2045
8,1
337B
1
0,294
40,59
21,60
337
C
ba
FZ 0,2045
8,1
337B
2
0,296
40,87
21,75
C: centro, S: sur, N: norte, CN: centro-norte; ci: cinta; tu: tubular; ba: barbacuá; FZ: fin de zafra; IZ:
inicio de zafra.
Cuadro B.2. Datos de la determinación de Capacidad Antioxidante- Método de reducción
del radical DPPH
Muestra
300
300
300
300
301
301
301
301
309
309
309
309
303
303
303
303
304
304
304
304
305
305
305
305
311
311
311
311
307
307
307
307
313
313
313
313
310
310
310
310
312
Orígen
C
C
C
C
C
C
C
C
N
N
N
N
N
N
N
N
S
S
S
S
C
C
C
C
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
S
Secado
ci
ci
ci
ci
ci
ci
ci
ci
tu
tu
tu
tu
ci
ci
ci
ci
tu
tu
tu
tu
ba
ba
ba
ba
ba
ba
ba
ba
ci
ci
ci
ci
ci
ci
ci
ci
tu
tu
tu
tu
ci
Época
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
IZ
Ex
trac- CH
to (%bh)
A
8,74
A
8,74
B
8,74
B
8,74
A
8,32
A
8,32
B
8,32
B
8,32
A
7,40
A
7,40
B
7,40
B
7,40
A
8,33
A
8,33
B
8,33
B
8,33
A
7,72
A
7,72
B
7,72
B
7,72
A
9,15
A
9,15
B
9,15
B
9,15
A
9,39
A
9,39
B
9,39
B
9,39
A
8,26
A
8,26
B
8,26
B
8,26
A
8,34
A
8,34
B
8,34
B
8,34
A
7,84
A
7,84
B
7,84
B
7,84
A
8,83
Peso VD
(wi; g) (mL)
0,2021
25
0,2021
25
0,2037
25
0,2037
25
0,2062
25
0,2062
25
0,2055
25
0,2055
25
0,2050
30
0,2050
30
0,2057
30
0,2057
30
0,2076
25
0,2076
25
0,2031
25
0,2031
25
0,2001
30
0,2001
30
0,2007
30
0,2007
30
0,2029
30
0,2029
30
0,2019
30
0,2019
30
0,2058
30
0,2058
30
0,2057
30
0,2057
30
0,2004
30
0,2004
30
0,2005
30
0,2005
30
0,2010
30
0,2010
30
0,2017
30
0,2017
30
0,2007
30
0,2007
30
0,2033
30
0,2033
30
0,2037
30
A0
1,078
1,078
1,078
1,078
1,078
1,078
1,078
1,078
1,055
1,055
1,055
1,055
1,078
1,078
1,078
1,078
1,037
1,037
1,037
1,037
1,037
1,037
1,037
1,037
1,073
1,073
1,073
1,073
1,037
1,037
1,037
1,037
1,073
1,073
1,073
1,073
1,073
1,073
1,073
1,073
1,073
A120
0,370
0,372
0,405
0,395
0,376
0,387
0,357
0,352
0,492
0,472
0,432
0,460
0,316
0,319
0,387
0,385
0,676
0,673
0,673
0,669
0,671
0,680
0,704
0,702
0,655
0,654
0,711
0,710
0,691
0,670
0,701
0,665
0,630
0,629
0,625
0,626
0,660
0,659
0,658
0,657
0,610
DPPH
t=0
104,79
104,79
104,79
104,79
104,79
104,79
104,79
104,79
102,55
102,55
102,55
102,55
104,79
104,79
104,79
104,79
100,81
100,81
100,81
100,81
100,81
100,81
100,81
100,81
104,30
104,30
104,30
104,30
100,81
100,81
100,81
100,81
104,30
104,30
104,30
104,30
104,30
104,30
104,30
104,30
104,30
DPPH
t=120
36,05
36,24
39,45
38,48
36,63
37,70
34,79
34,30
47,89
45,95
42,07
44,79
30,81
31,10
37,70
37,50
65,76
65,47
65,47
65,08
65,27
66,15
68,48
68,28
63,72
63,62
69,16
69,06
67,21
65,17
68,18
64,69
61,29
61,19
60,81
60,90
64,20
64,11
64,01
63,91
59,35
%R
34,40
34,59
37,64
36,72
34,96
35,98
33,20
32,73
46,70
44,81
41,02
43,67
29,40
29,68
35,98
35,79
65,23
64,94
64,94
64,56
64,75
65,62
67,93
67,74
61,09
61,00
66,30
66,21
66,68
64,65
67,64
64,17
58,76
58,67
58,30
58,39
61,56
61,46
61,37
61,28
56,90
CAOET
31,67
31,57
29,84
30,29
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1,074
1,074
0,556
0,551
0,460
0,444
0,426
0,413
0,307
0,335
0,277
0,288
0,375
0,392
0,377
0,390
0,416
0,424
0,407
0,412
0,338
0,374
0,392
0,397
0,363
0,340
0,385
0,382
0,315
0,338
0,344
0,342
0,275
0,273
0,292
0,295
0,412
0,406
0,412
0,406
0,280
0,263
0,299
0,293
0,453
0,433
0,413
0,422
0,325
0,323
0,294
0,296
0,492
0,418
0,415
104,40
104,40
101,78
101,78
101,78
101,78
97,50
97,50
97,50
97,50
104,40
104,40
104,40
104,40
101,78
101,78
101,78
101,78
101,58
101,58
101,58
101,58
101,58
101,58
101,58
101,58
101,00
101,00
101,00
101,00
97,50
97,50
97,50
97,50
101,78
101,78
101,78
101,78
104,40
104,40
104,40
104,40
102,55
102,55
102,55
102,55
101,00
101,00
101,00
101,00
104,40
104,40
104,40
54,11
53,62
44,79
43,23
41,49
40,22
29,93
32,65
27,02
28,09
36,53
38,18
36,73
37,99
40,51
41,29
39,64
40,13
32,94
36,44
38,18
38,67
35,37
33,14
37,50
37,21
30,71
32,94
33,52
33,33
26,83
26,63
28,48
28,77
40,13
39,54
40,13
39,54
27,31
25,66
29,16
28,57
44,11
42,17
40,22
41,10
31,68
31,49
28,67
28,86
47,89
40,71
40,42
51,83
51,36
44,00
42,48
40,76
39,52
30,70
33,49
27,71
28,81
34,99
36,58
35,18
36,39
39,81
40,57
38,95
39,43
32,43
35,87
37,59
38,07
34,82
32,62
36,92
36,63
30,40
32,62
33,19
33,00
27,51
27,31
29,20
29,50
39,43
38,85
39,43
38,85
26,16
24,58
27,93
27,37
43,01
41,12
39,22
40,07
31,37
31,17
28,39
28,58
45,88
38,99
38,71
27,40
27,67
32,65
33,56
34,42
35,16
40,30
38,65
42,56
41,91
36,88
35,97
36,50
35,81
34,21
33,77
34,79
34,51
37,61
35,67
34,87
34,59
36,28
37,52
35,57
35,73
39,54
38,27
37,62
37,73
34,79
34,88
33,78
33,63
35,44
35,78
35,47
35,81
42,26
43,17
40,59
40,91
32,48
33,57
35,03
34,53
39,88
40,00
41,21
41,10
30,51
34,46
34,81
19,43
19,62
23,09
23,72
24,32
24,83
28,40
27,26
29,98
29,52
26,01
25,38
25,75
25,27
24,16
23,85
24,56
24,37
26,52
25,17
24,61
24,42
25,59
26,46
25,10
25,22
27,87
26,98
26,53
26,61
24,50
24,57
23,80
23,70
25,02
25,26
25,05
25,29
29,76
30,39
28,59
28,81
22,96
23,72
24,74
24,39
28,11
28,19
29,03
28,95
21,59
24,33
24,58
327
337
337
337
337
N
C
C
C
C
tu
ba
ba
ba
ba
FZ
FZ
FZ
FZ
FZ
B
A
A
B
B
6,29
8,10
8,10
8,10
8,10
0,2005
0,2035
0,2035
0,2045
0,2045
30
30
30
30
30
1,074
1,045
1,045
1,045
1,045
0,428
0,350
0,387
0,344
0,372
104,40
101,58
101,58
101,58
101,58
41,68
34,11
37,70
33,52
36,24
39,92
33,58
37,11
33,00
35,68
34,11
37,95
35,90
38,10
36,56
Cuadro B.3. Análisis de la Varianza para CPT (efectos simples)
Análisis de la Varianza para CPT - Sumas de Cuadrados de Tipo III
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado Medio Cociente-F
P-Va
----------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES
A:Orígen
1,51893
3
0,506311
0,36
0,7
B:Secado
5,25692
2
2,62846
1,89
0,1
C:Epoca
8,71243
1
8,71243
6,25
0,0
RESIDUOS
43,2063
31
1,39375
----------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO)
60,6715
37
----------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
Cuadro B.4. Análisis de la Varianza para CAO (efectos simples)
Análisis de la Varianza para CAO_ET - Sumas de Cuadrados de Tipo III
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado Medio Cociente-F
P-Va
----------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES
A:origen
1,11476
3
0,371587
0,04
0,9
B:secado
0,117774
2
0,058887
0,01
0,9
C:Epoca
205,489
1
205,489
21,28
0,0
RESIDUOS
299,283
31
9,65428
----------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO)
505,247
37
----------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
Análisis de la Varianza paraCAO_EAA - Sumas de Cuadrados de Tipo III
-------------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado Medio Cociente-F
P-Valor
-------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES
A:origen
0,557667
3
0,185889
0,04
0,9892
B:secado
0,0544743
2
0,0272371
0,01
0,9942
C:Epoca
99,7533
1
99,7533
21,38
0,0001
RESIDUOS
144,61
31
4,66485
-------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO)
244,608
37
-------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
24,09
26,77
25,34
26,86
25,79
Cuadro B.5. Análisis de la Varianza para CPT (efectos dobles: Orígen y época)
Análisis de la Varianza para CPT - Sumas de Cuadrados de Tipo III
-----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado Medio Cociente-F
P-Val
-----------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES
A:Orígen
3,29916
3
1,09972
0,84
0,48
B:Epoca
11,5672
1
11,5672
8,80
0,00
INTERACCIONES
AB
9,02911
3
3,0097
2,29
0,09
RESIDUOS
39,4341
30
1,31447
-----------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO)
60,6715
37
-----------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
Cuadro B.6. Análisis de la Varianza para CPT (efectos dobles: Secado y época)
Análisis de la Varianza para CPT - Sumas de Cuadrados de Tipo III
------------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado Medio Cociente-F
P-Valo
------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES
A:secado
7,13341
2
3,56671
3,01
0,063
B:Epoca
6,05285
1
6,05285
5,10
0,030
INTERACCIONES
AB
6,7626
2
3,3813
2,85
0,072
RESIDUOS
37,9626
32
1,18633
------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO)
60,6715
37
------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
Cuadro B.7. Análisis de la Varianza para CAO (efectos dobles: Orígen y época)
Análisis de la Varianza para CAO_EAA - Sumas de Cuadrados de Tipo III
------------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado Medio Cociente-F
P-Valo
------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES
A:Orígen
0,584818
3
0,194939
0,04
0,988
B:Epoca
82,0344
1
82,0344
17,71
0,000
INTERACCIONES
AB
5,68709
3
1,8957
0,41
0,747
RESIDUOS
138,978
30
4,63259
------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO)
244,608
37
------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
Análisis de la Varianza para CAO_ET - Sumas de Cuadrados de Tipo III
------------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado Medio Cociente-F
P-Valo
------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES
A:Orígen
1,17279
3
0,390929
0,04
0,988
B:Epoca
168,674
1
168,674
17,61
0,000
INTERACCIONES
AB
12,0009
3
4,00031
0,42
0,741
RESIDUOS
287,399
30
9,57998
------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO)
505,247
37
------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
Cuadro B.8. Análisis de la Varianza para CAO (efectos dobles: Secado y época)
Análisis de la Varianza para CAO_EAA - Sumas de Cuadrados de Tipo III
-----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado Medio Cociente-F
P-Val
-----------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES
A:secado
0,141519
2
0,0707597
0,02
0,97
B:Epoca
83,7061
1
83,7061
26,37
0,00
INTERACCIONES
AB
43,5914
2
21,7957
6,87
0,00
RESIDUOS
101,577
32
3,17427
-----------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO)
244,608
37
-----------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
Análisis de la Varianza para CAO_ET - Sumas de Cuadrados de Tipo III
-----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado Medio Cociente-F
P-Val
-----------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES
A:Secado
0,295643
2
0,147821
0,02
0,97
B:Epoca
172,215
1
172,215
26,21
0,00
INTERACCIONES
AB
90,135
2
45,0675
6,86
0,00
RESIDUOS
210,262
32
6,5707
-----------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO)
505,247
37
-----------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
Cuadro B.9. Contrastes de hipótesis
Contraste Múltiple de Rango para CAO_ET según Epoca (secado tipo cinta)
----------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSD
Epoca
Frec.
Media
Grupos homogéneos
----------------------------------------------------------------------------FZ
8
33,7122
X
IZ
8
41,2931
X
----------------------------------------------------------------------------Contraste
Diferencias
+/- Límites
----------------------------------------------------------------------------FZ - IZ
*-7,58094
2,72145
----------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
Contraste Múltiple de Rango para CAO_ET según Epoca (secado tubular)
----------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSD
Epoca
Frec.
Media
Grupos homogéneos
----------------------------------------------------------------------------FZ
5
34,9045
X
IZ
5
39,981
X
----------------------------------------------------------------------------Contraste
Diferencias
+/- Límites
----------------------------------------------------------------------------FZ - IZ
*-5,0765
5,04115
----------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
Contraste Múltiple de Rango para CAO_ET según Epoca (secado tipo barbacúa)
------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSD
Epoca
Frec.
Media
Grupos homogéneos
------------------------------------------------------------------------------FZ
6
37,1192
X
IZ
6
37,475
X
------------------------------------------------------------------------------Contraste
Diferencias
+/- Límites
------------------------------------------------------------------------------FZ - IZ
-0,355833
2,01446
------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
ANEXO 3
Cuadro C.1. Datos de determinación de CPT- Método de Folin-Ciucalteu
Abs
CoPT
CPT
Muestra Wi (g) CH(bh) Extracción Lectura (765 nm) (µgEAC/mL) (gEAC %ms)
hojas
0,2286
4,8 H1
1
0,309
47,80
22,0
hojas
0,2286
4,8 H1
2
0,312
48,25
22,2
hojas
0,2256
4,8 H2
1
0,309
47,80
22,3
hojas
0,2256
4,8 H2
2
0,310
47,95
22,3
palos
0,2405
5,7 P1
1
0,190
29,96
13,2
palos
0,2405
5,7 P1
2
0,192
30,26
13,3
palos
0,2261
5,7 P2
1
0,206
32,36
15,2
palos
0,2261
5,7 P2
2
0,201
31,61
14,8
Wi: peso de muestra empleada, CH: contenido de humedad (%, base humeda), Abs:
absorbancia, CoPT: concentración de polifenoles totales; CPT: contenido de polifenoles
totales
Error
Código
Recuento
Media
Estánda
-------------------------------------------------------H
2
22,2
0,1
P
2
14,125
0,875
-------------------------------------------------------Total
4
18,1625
2,35862
Cuadro C.2. Resumen estadístico de CPT de las fracciones de hojas y palos y prueba t
CPThojas
CPTpalos
-------------------------------------------------------Frecuencia
2
2
Media
22,2
14,125
Varianza
0,02
1,53125
Desviación típica
0,141421
1,23744
Error estándar
0,1
0,875
Mínimo
22,1
13,25
Máximo
22,3
15,0
Comparación de Medias, Prueba t-Student
--------------------95,0% intervalo de confianza para la media de CPThojas: 22,2 +/- 1,27062
[20,9294,2
95,0% intervalo de confianza para la media de CPTpalos: 14,125 +/- 11,1179
[3,00707
95,0% intervalos de confianza para la diferencia de medias:
suponiendo varianzas iguales: 8,075 +/- 3,78933
[4,28567,11,8643]
contrastes t de comparación de medias
Hipótesis nula: media1 = media2
Hipótesis alt.: media1 <> media2
suponiendo varianzas iguales: t = 9,16889
P-Valor = 0,0116869
Cuadro C.3. Datos correspondientes a la experiencia de determinación del tiempo de
extracción
VA
(mL)a
t (min)
Peso
inicial
(g)
Peso
final
(g)
VR (mL)
VF (mL)b
VRM (mL)
238
10
437
437
140
140
98
238
20
443
443
146
156
82
238
30
441
441
156
166
72
238
50
439
438
136
146
92
238
50 --167
167
71
238
60
442
442
145
145
93
238
120
431
431
150
160
78
VA: volumen de agua agregado; t: tiempo de extracción; VR: volumen
recolectado; VF: volumen final; VRM: volumen de liquido retenido en la muestra;
a
Para la cantidad de agua agregada, se contempló el contenido de humedad de la
muestra.
b
Volumen final luego de exprimir manualmente la muestra humedecida.
Peso
CPT
CH(% VE
CoPT
(g,
Abs.
Dilución
g EACc (g EAC %
bh) (mL)
(µg/mL)
bh)
ms)
1 10
31,5 0,381
4,8 140 1+2
58,25 2,4467
8,156
1 10
31,5 0,382
4,8 140 1+2
58,40 2,4529
8,176
2 20
31,5 0,409
4,8 156 1+2
62,43 2,9219
9,740
2 20
31,5 0,412
4,8 156 1+2
62,88 2,9428
9,809
3 30
31,5 0,266
4,8 166 1+4
41,09 3,4104
11,368
3 30
31,5 0,267
4,8 166 1+4
41,24 3,4228
11,409
5 50
31,5 0,242
4,8 167 1+4
37,51 3,1319
10,440
5 50
31,5 0,241
4,8 167 1+4
37,36 3,1194
10,398
5 50
31,5 0,244
4,8 167 1+4
37,81 3,1568
10,523
5 50
31,5 0,243
4,8 167 1+4
37,66 3,1443
10,481
7 60
31,5 0,253
4,8 170 1+4
39,15 3,3277
11,092
7 60
31,5 0,255
4,8 170 1+4
39,45 3,3531
11,177
7 60
31,5 0,261
4,8 170 1+4
40,34 3,4292
11,431
7 60
31,5 0,264
4,8 170 1+4
40,79 3,4672
11,557
8 120
31,5 0,271
4,8 160 1+4
41,84 3,3469
11,156
8 120
31,5 0,279
4,8 160 1+4
43,03 3,4424
11,475
t: tiempo de extracción; wi: peso de la muestra en base humeda; Abs: absorbancia; CH:
contenido de humedad; VE: volumen extraído; CoPT: concentración de polifenoles totales;
CPT: contenido de polifenoles totales
c
Recta de calibración con ácido clorogénico: Abs==0,0067*x-0,0093 siendo x la
concentración del patrón ácido clorogénico válida entre 0 y 60 µgEAC/mL.
Muestra
t
(min)
Cuadro de medias:
Error
Tiempo (min) Recuento
Media
Estándar
---------------------------------------------------0
1
0,0
0,0
10
2
8,166
0,01
20
2
9,7745
0,0345
30
2
11,3885
0,0205
50
2
10,4605
0,0415
60
2
11,3145
0,1795
120
2
11,3155
0,1595
---------------------------------------------------Total
13
9,603
0,862684
Cuadro C.4. Análisis de regresión no lineal – tiempo de extracción
a)- Modelo de Peleg:
Regresión No líneal---MODELO DE PELEG
------------------Variable dependiente: cpt
Variables independientes: t
Función a estimar: t/(k1+k2*t)
Estimaciones del parámetro inicial:
k1 = 0,1
k2 = 0,1
Método de estimación: Marquardt
La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos.
Número de iteracciones: 3
Número de llamadas de funciones: 11
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------------------------Asintótica 95,0%
Asintótica
Intervalos de Confianza
Parámetro
Estimado Error Estándar
Inferior
Superior
---------------------------------------------------------------------------k1
0,351854
0,0796942
0,146993
0,556715
k2
0,0837909
0,0029293
0,0762609
0,0913209
----------------------------------------------------------------------------
Análisis de Varianza
----------------------------------------------------Fuente
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio
----------------------------------------------------Modelo
656,118
2
328,059
Residuos
1,28438
5
0,256877
----------------------------------------------------Total
657,403
7
Total (Corr.)
100,804
6
R-Cuadrado = 98,7259 porcentaje
R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 98,471 porcentaje
Error Estándar de la Est. = 0,50683
Error absoluto de la Media = 0,310417
Estadístico Durbin-Watson = 3,03595
Autocorrelación residual Lag 1 = -0,53605
Análisis de Residuos
--------------------------------Estimación
Validación
n
7
MSE
0,256877
MAE
0,310417
MAPE
ME
-0,0018265
MPE
b)- Modelo Logarítmico:
Regresión No líneal---Modelo Logarítmico
------------------Variable dependiente: CPT
Variables independientes: t
Función a estimar: a*LOG(t)+b
Estimaciones del parámetro inicial:
a = 0,1
b = 0,1
Método de estimación: Marquardt
La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de resi
Número de iteracciones: 3
Número de llamadas de funciones: 11
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------------------------Asintótica 95,0%
Asintótica
Intervalos de Confianza
Parámetro
Estimado Error Estándar
Inferior
Superior
---------------------------------------------------------------------------a
1,20855
0,39798
0,10358
2,31353
b
6,07394
1,46076
2,01821
10,1297
---------------------------------------------------------------------------Análisis de Varianza
----------------------------------------------------Fuente
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio
----------------------------------------------------Modelo
654,971
2
327,486
Residuos
2,43153
4
0,607882
----------------------------------------------------Total
657,403
6
Total (Corr.)
8,03719
5
R-Cuadrado = 69,7465 porcentaje
R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 62,1832 porcentaje
Error Estándar de la Est. = 0,779668
Error absoluto de la Media = 0,525477
Estadístico Durbin-Watson = 2,1991
Autocorrelación residual Lag 1 = -0,258597
c)- Modelo de Pilosof:
Cuadro C.5. Planilla de cálculo de las cantidades a agregar - Experiencia correspondiente
al diseño experimental
Sistema
extractivo
3
4
5
6
7
8
9
10
11
11
11
11
Variables codificadas Variables codificadas
x1
x2
X1
X2
WA (g)
WB (g)
WD
(g)
WE (g)
-1
-1
1
1
1,41
-1,41
0
0
0
0
0
0
-1
1
-1
1
0
0
1,41
-1,41
0
0
0
0
6
6
10
10
10,82
5,18
8
8
8
8
8
8
25
75
25
75
50
50
85,25
14,75
50
50
50
50
180
180
300
300
324,6
155,4
240
240
240
240
240
240
45
135
75
225
162,3
77,7
204,6
35,4
120
120
120
120
2,2
6,6
3,7
11,0
8,0
3,8
10,0
1,7
5,9
5,9
5,9
5,9
131,3
36,9
219,8
62,5
152,8
72,4
23,9
201,4
112,6
112,6
112,6
112,6
Datos adicionales y nomanclatura presentados en el cuadro C5:
WA-Cantidad total de liquido a agregar
WB-Cantidad de etanol a agregar
WC-Cantidad de agua aportada por la muestra = 1,5 g de agua
WD- Cantidad de agua aportada por la solucion etanolica
WA= (WMbs)*X1
WB=WA*X2
WE=WA-WB-WC-WD
Densidad de etanol (96°) =0,816 g/mL (a 27°C)
Humedad de las muestras: 4,7%(bh)
Peso de muestra húmeda utilizado en la extracción= WMbh= 31,5 g YM bh
Peso de muestra seca utilizado en la extracción= WMbs= 30 g YM bs
Nota C1. Modo de cálculo de CPT para extracciones del diseño
Ejemplo para A1a:
1 mL de reacción------Abs------ 67,74µgEAC
100 mL------------------------- x1= 6774 µgEAC
1 mL------------------------------------------ 6774 µgEAC
5 mL (vol dilución)------------------------- x2= 33870 µgEAC
1 mL --------------------------------- 33870 µgEAC
103 mL (Vol recuperado)-------- x3=3,4886 g EAC
30 g hoja seca-------------3,4886 g EAC
100 g hoja seca------------- x4= 11,6287 g EAC
Cuadro C.6. Datos de concentración y contenido de polifenoles totales
Curvas de calibración empleadas:
• Acido gálico: Abs=0,0122*X1+0,001 con X1 expresado como µgEAG/mL (R2:0,9994)
• Ácido clorogénico: Abs=0,0065*X2+0,0007 con X2 expresado como µgEAC/mL (R2:0,9995)
• Abs: absorbancia leída a 765 nm
Muestra: Fracción de hojas
Peso de la muestra: 31,5 g (bh) = 30 g (bs)
Sist.
Extractivo
3
3
3
3
4
4
4
4
5
5
5
5
6
6
6
6
7
7
7
7
8
8
8
8
9
9
9
9
10
10
10
Continúa
Extra- Muescción
tra
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
Lectura
Abs
Dilución
1:x
VR(mL)
CoPT
(µgEAC/mL)
CPT-EAC (gEAC
%ms)
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
0,251
0,251
0,271
0,269
0,289
0,296
0,273
0,278
0,227
0,220
0,225
0,238
0,130
0,131
0,151
0,168
0,199
0,198
0,194
0,192
0,236
0,236
0,193
0,193
0,141
0,142
0,150
0,151
0,252
0,249
0,241
8
8
8
8
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
10
10
10
10
5
5
5
5
5
5
5
103
103
103
103
116
116
116
116
224
224
224
224
247
247
247
247
260
260
260
260
88
88
88
88
194
194
194
194
164
164
164
38,51
38,51
41,58
41,28
44,35
45,43
41,89
42,66
34,82
33,74
34,51
36,51
19,89
20,05
23,12
25,74
30,51
30,35
29,74
29,43
36,20
36,20
29,58
29,58
21,58
21,74
22,97
23,12
38,66
38,20
36,97
10,58
10,58
11,42
11,34
8,58
8,78
8,10
8,25
13,00
12,60
12,88
13,63
8,19
8,25
9,52
10,60
13,22
13,15
12,89
12,75
10,62
10,62
8,68
8,68
6,98
7,03
7,43
7,48
10,57
10,44
10,10
Continuación cuadro C.6
10
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
11
A
3
B
3
B
3
B
3
B
4
B
4
B
4
B
4
B
5
B
5
B
5
B
5
B
6
B
6
B
6
B
6
B
7
B
7
B
7
B
7
B
8
B
8
B
8
B
8
B
9
B
Continúa
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
0,236
0,317
0,320
0,339
0,348
0,274
0,276
0,286
0,288
0,270
0,270
0,300
0,305
0,301
0,305
0,307
0,309
0,236
0,237
0,229
0,231
0,247
0,254
0,264
0,265
0,233
0,232
0,223
0,219
0,162
0,159
0,164
0,161
0,180
0,182
0,184
0,185
0,193
0,195
0,206
0,202
0,132
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
8
8
8
8
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
10
10
10
10
5
164
180
180
180
180
179
179
179
179
175
175
175
175
175
175
175
175
115
115
115
115
123
123
123
123
238
238
238
238
251
251
251
251
270
270
270
270
94
94
94
94
197
36,20
48,66
49,12
52,05
53,43
42,05
42,35
43,89
44,20
41,43
41,43
46,05
46,82
46,20
46,82
47,12
47,43
36,20
36,35
35,12
35,43
37,89
38,97
40,51
40,66
35,74
35,58
34,20
33,58
24,82
24,35
25,12
24,66
27,58
27,89
28,20
28,35
29,58
29,89
31,58
30,97
20,20
9,89
14,60
14,74
15,61
16,03
12,54
12,64
13,09
13,19
12,08
12,08
13,43
13,65
13,48
13,65
13,74
13,83
11,10
11,15
10,77
10,87
7,77
7,99
8,30
8,34
14,18
14,12
13,57
13,32
10,38
10,19
10,51
10,32
12,41
12,55
12,69
12,76
9,27
9,37
9,90
9,70
6,63
Continuación cuadro C.6
9
B
a
2
0,130
9
B
b
1
0,140
9
B
b
2
0,144
10
B
a
1
0,216
10
B
a
2
0,222
10
B
b
1
0,241
10
B
b
2
0,233
11
B
a
1
0,243
11
B
a
2
0,251
11
B
b
1
0,255
11
B
b
2
0,257
11
B
a
1
0,258
11
B
a
2
0,265
11
B
b
1
0,264
11
B
b
2
0,264
11
B
a
1
0,271
11
B
a
2
0,271
11
B
b
1
0,302
11
B
b
2
0,301
11
B
a
1
0,272
11
B
a
2
0,275
11
B
b
1
0,294
11
B
b
2
0,300
SE: Sistema extractivo; VR: volumen recuperado
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
197
197
197
168
168
168
168
175
175
175
175
178
178
178
178
181
181
181
181
180
180
180
180
19,89
21,43
22,05
33,12
34,05
36,97
35,74
37,28
38,51
39,12
39,43
39,58
40,66
40,51
40,51
41,58
41,58
46,35
46,20
41,74
42,20
45,12
46,05
6,53
7,04
7,24
9,27
9,53
10,35
10,01
10,87
11,23
11,41
11,50
11,74
12,06
12,02
12,02
12,54
12,54
13,98
13,94
12,52
12,66
13,54
13,81
Cuadro C.7. Resumenes estadísticos y gráficos de dispersión
Para: a)-Contenido de polifenoles totales (CPT; g EAC %ms) y b)-Concentración de polifenoles totales
(CoPT; µg EAC / mL). Extracciones correspondientes al diseño experimental
a)- CPT (g EAC %ms)
Sistema
Extractivo
Recuento
Media
Error Estándar
--------------------------------------------------------------3
2
11,0
0,0
4
2
8,25
0,15
5
2
13,4
0,4
6
2
9,7
0,6
7
2
12,8
0,2
8
2
9,6
0,0
9
2
7,05
0,15
10
2
10,05
0,25
11
8
13,0375
0,40
b)- CoPT (µg EAC /mL)
Sistema
Extractivo
Recuento
Media
Error Estándar
------------------------------------------------------------------------3
2
37,875
2,095
4
2
41,545
2,035
5
2
34,835
0,055
6
2
23,47
1,27
7
2
29,01
1,0
8
2
31,7
1,19
9
2
21,62
0,73
10
2
36,24
1,27
11
8
43,9213
1,32669
Nota C.2. Modo de cálculo de CAO para extracciones del diseño
Ejemplo de cálculo:
Volumen de extracto original (zz mL)---------m g YMH
1mL--------------------------------------------------x=x1
VD=Volumen de dilución-----------------------x1
100µL=0,1 mL------------------------------------x=x2
100 g YMH-------------------------(100-CH) gYMS
x2-------------------------------------x=x3 g YMS
x3 g YMS---------------------xµgEAA/1000000(µg/g)
100 g YMS-------------------x=CAO
Cuadro C.8. Datos de capacidad antioxidante
Curvas de calibración empleadas:
• Ácido Ascórbico: R(%)=-3,9898*(uequivalentes a AA)+99,996
• Trolox: R(%)=-2,7675*(uequivalenes a T) + 99,054
Absorbancia leída a 517 nm
Muestra: Fracción de hojas
Peso de la muestra: w= 31,5 g (bh) = 30 g (bs)
CAO
Vor
VD
CAO- CAOA
E
w
A(t=0)
X
R(%) gEAA gET
(mL)
(mL)
EAA
ET
(t=120)
A1 31,5
103
300
1,055
0,518
50,42
49,16 12,77 18,03 13,16 18,58
B1 31,5
115
275
1,032
0,515
50,13
49,97 12,57 17,74 13,25 18,71
A2 31,5
116
180
1,055
0,467
45,47
44,33 13,98 19,77
9,74
13,77
B2 31,5
123
200
1,030
0,517
50,32
50,26 12,49 17,63 10,25 14,46
A3 31,5
224
170
1,032
0,565
54,98
54,80 11,35 15,99 14,42 20,30
B3 31,5
238
170
1,032
0,529
51,49
51,32 12,23 17,25 16,50 23,27
A4 31,5
247
92
1,032
0,524
51,00
50,84 12,35 17,42
9,36
13,20
B4 31,5
251
100
1,026
0,492
47,89
48,02 13,06 18,44 10,93 15,43
A5 31,5
260
136
1,005
0,461
44,88
45,94 13,58 19,19 16,01 22,63
B5 31,5
270
154
1,029
0,535
52,07
52,05 12,04 16,98 16,70 23,55
A6 31,5
88
330
1,032
0,544
52,94
52,77 11,86 16,72 11,49 16,19
B6 31,5
94
300
1,026
0,466
45,37
45,49 13,69 19,36 12,88 18,20
A7 31,5
194
118
1,032
0,542
52,75
52,58 11,91 16,79
9,09
12,82
B7 31,5
197
114
1,029
0,532
51,78
51,76 12,12 17,09
9,07
12,80
A8 31,5
164
220
1,029
0,479
46,63
46,62 13,41 18,95 16,13 22,80
B8 31,5
168
196
1,030
0,519
50,51
50,45 12,45 17,56 13,67 19,28
A9 31,5
180
220
1,032
0,568
55,27
55,10 11,28 15,88 14,89 20,98
B9 31,5
175
200
1,029
0,496
48,28
48,27 12,99 18,35 15,17 21,42
A10 31,5
179
220
1,029
0,549
53,43
53,41 11,70 16,49 15,37 21,66
B10 31,5
178
210
1,029
0,509
49,54
49,53 12,68 17,90 15,80 22,31
A11 31,5
175
220
1,029
0,531
51,68
51,66 12,14 17,12 15,59 21,98
B11 31,5
181
218
1,026
0,551
53,62
53,76 11,61 16,37 15,28 21,53
A12 31,5
175
240
1,055
0,522
50,81
49,54 12,67 17,89 17,75 25,06
B12 31,5
180
218
1,029
0,523
50,90
50,89 12,34 17,40 16,14 22,77
E: extracto; Ai: corresponde al extracto del sistema extractivo i; Bi: corresponde a la replica del extracto
del sistema extractivo i.
w: peso (g); Vor: Volumen Original; VD: Volumen de dilución; A: Absorbancia; t: tiempo (min); CAOEAA: capacidad antioxidante expresada en g EAA %ms; CAO-ET: capacidad antioxidante expresada en
g ET %ms; EAA: equivalentes a ácido ascórbico; ET: equivalentes a Trolox
Nota C.3. Modo de cálculo del contenido de cafeína (CC) para extracciones del diseño
Ejemplo de cálculo para A1:
1000 mL-------------------------------0,95 g CAF
Vrecuperado=103 mL------------- x=0,09785 g CAF
31,5 g YMHUM-----30 g YM SECA-----------0,09785 g CAF
100 g Ymseca-----------x=0,3261 g CAF
Cuadro C.9. Datos de contenido de cafeína
3
4
5
6
7
8
9
10
11
11
11
11
3
4
5
6
7
8
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
B
86300
83700
53800
41100
35700
90100
56300
57300
60700
64200
67900
64900
85000
78700
54200
50600
43900
87500
0,95
0,92
0,59
0,45
0,39
0,99
0,62
0,63
0,67
0,70
0,74
0,71
0,93
0,86
0,59
0,56
0,48
0,96
103
116
224
247
260
88
194
164
180
179
175
175
115
123
238
251
270
94
CC
(gCAF/100
g ms)
0,326
0,356
0,441
0,371
0,338
0,290
0,401
0,344
0,402
0,418
0,432
0,414
0,357
0,353
0,473
0,469
0,432
0,301
9
10
11
11
11
11
B
B
B
B
B
B
58700
59400
92800
66500
66200
68100
0,64
0,65
0,65
0,73
0,72
0,75
197
168
175
178
181
180
0,420
0,364
0,379
0,433
0,434
0,450
Sistema
Extracción Área
extractivo
gCAF/L
Vrecuperado (mL)
Resumen estadístico y gráfico de dispersion para Contenido de cafeína (CC; g CAF %ms). Extracciones
correspondientes al diseño experimental
Sistema
Extractivo Recuento
Media
Error Estándar
--------------------------------------------------------3
2
0,3415
0,0155
4
2
0,3545
0,0015
5
2
0,457
0,016
6
2
0,42
0,049
7
2
0,385
0,047
8
2
0,2955
0,0055
9
2
0,4105
0,0095
10
2
0,354
0,01
11
8
0,42025
0,007853
Gráfico de Dispersión-CC
0,48
CC
0,44
0,4
0,36
0,32
0,28
3
4
5
6
7
8
Sistema Extractivo
9
10
11
Cuadro C.10. Datos empleados para el análisis de regresión y de correlación
Variables independientes: x1: relación líquido a sólido (g líquido/g sólido seco); x2: concentración de
etanol (% p/p)
x1
x2
6
6
6
6
10
10
10
10
10,82
10,82
5,18
5,18
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
CoPT
25
25
75
75
25
25
75
75
50
50
50
50
85,25
85,25
14,75
14,75
50
50
50
50
50
50
50
50
CPT
39,97
35,78
43,58
39,51
34,89
34,78
22,20
24,74
30,01
28,01
32,89
30,51
22,35
20,89
37,51
34,97
43,10
38,58
43,12
40,32
43,93
43,93
46,89
43,78
11,0
11,0
8,4
8,1
13,0
13,8
9,10
10,3
13,0
12,6
9,6
9,6
7,2
6,9
10,3
9,8
12,9
11,3
12,9
12,0
12,8
13,3
13,7
13,1
CAO-ET
CC
18,6
18,7
13,8
14,5
20,3
23,3
13,2
15,4
22,6
23,5
16,2
18,2
12,8
12,8
20,7
19,3
21,0
21,4
21,7
22,3
22,2
21,5
25,1
22,8
0,326
0,357
0,356
0,353
0,441
0,473
0,371
0,469
0,338
0,432
0,290
0,301
0,401
0,420
0,344
0,364
0,402
0,379
0,418
0,433
0,432
0,434
0,414
0,450
CAO-EAA
13,2
13,2
9,7
10,2
14,4
16,5
9,4
10,9
16,0
16,7
11,5
12,9
9,1
9,1
14,7
13,7
14,9
15,2
15,4
15,8
15,7
15,3
17,7
16,1
Cuadro C.11. Análisis de correlación para los pares de variables
a)CPT-CAO_EAA; b)CPT-CAO_ET; c)CPT-CC; d)CAO_EAA-CAO_ET;
e)- CAO_EAA-CC; f) CAO_ET-CC
a)CPT-CAO_EAA
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CPT
Variable independiente: CAO_EAA
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
1,1588
0,909843
1,27362
0,2161
Pendiente
0,726822
0,0655112
11,0946
0,0000
----------------------------------------------------------------------------Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
87,543
1
87,543
123,09
0,0000
Residuo
15,6466
22
0,711208
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
103,19
23
Coeficiente de Correlación = 0,92107
R-cuadrado = 84,8371 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 84,1478 porcentaje
Error estándar de est. = 0,843331
Error absoluto medio = 0,690136
Estadístico de Durbin-Watson = 1,54187 (P=0,0816)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,225283
b)CPT-CAO_ET
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CPT
Variable independiente: CAO_ET
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
1,16477
0,908778
1,28169
0,2133
Pendiente
0,514712
0,0463655
11,1012
0,0000
----------------------------------------------------------------------------Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
87,5587
1
87,5587
123,24
0,0000
Residuo
15,6309
22
0,710494
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
103,19
23
Coeficiente de Correlación = 0,921153
R-cuadrado = 84,8523 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 84,1638 porcentaje
Error estándar de est. = 0,842908
Error absoluto medio = 0,687652
Estadístico de Durbin-Watson = 1,58113 (P=0,0981)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,205971
c)CPT-CC
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CPT
Variable independiente: CC
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
3,86118
3,10468
1,24367
0,2267
Pendiente
18,4115
7,86393
2,34126
0,0287
----------------------------------------------------------------------------Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
20,5824
1
20,5824
5,48
0,0287
Residuo
82,6072
22
3,75487
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
103,19
23
Coeficiente de Correlación = 0,446612
R-cuadrado = 19,9462 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 16,3074 porcentaje
Error estándar de est. = 1,93775
Error absoluto medio = 1,46378
Estadístico de Durbin-Watson = 1,35115 (P=0,0286)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,3111
d)CAO_EAA-CAO_ET
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CAO_EAA
Variable independiente: CAO_ET
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
0,0111562
0,0468619
0,238066
0,8140
Pendiente
0,708015
0,00239088
296,132
0,0000
----------------------------------------------------------------------------Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
165,675
1
165,675
87694,29
0,0000
Residuo
0,0415631
22
0,00188923
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
165,716
23
Coeficiente de Correlación = 0,999875
R-cuadrado = 99,9749 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99,9738 porcentaje
Error estándar de est. = 0,0434653
Error absoluto medio = 0,0341941
Estadístico de Durbin-Watson = 1,47008 (P=0,0568)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,225306
e) CAO_ET-CC
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CAO_ET
Variable independiente: CC
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
9,79669
5,86848
1,66937
0,1092
Pendiente
24,1306
14,8644
1,62338
0,1188
----------------------------------------------------------------------------Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
35,3552
1
35,3552
2,64
0,1188
Residuo
295,144
22
13,4157
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
330,5
23
Coeficiente de Correlación = 0,32707
R-cuadrado = 10,6975 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 6,63829 porcentaje
Error estándar de est. = 3,66274
Error absoluto medio = 2,85021
Estadístico de Durbin-Watson = 1,41524 (P=0,0419)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,283105
f)- CAO_EAA-CC
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CAO_EAA
Variable independiente: CC
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
6,94207
4,15516
1,67071
0,1089
Pendiente
17,0984
10,5247
1,62459
0,1185
----------------------------------------------------------------------------Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
17,7511
1
17,7511
2,64
0,1185
Residuo
147,965
22
6,72569
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
165,716
23
Coeficiente de Correlación = 0,327288
R-cuadrado = 10,7117 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 6,65318 porcentaje
Error estándar de est. = 2,59339
Error absoluto medio = 2,02155
Estadístico de Durbin-Watson = 1,40892 (P=0,0404)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,286722
Cuadro C.12. Análisis de mínima diferencia significativa (LSD, 95%)
Para las variables: a)-CoPT (µg EAC/mL); b)-CPT (g EAC %ms); c)-CAO-EAA (g EAA %ms); d)CAO-ET (g ET %ms); e)-CC (g CAF %ms)
a)-CoPT (µg EAC/mL)
--------------------------------------------------------------------------Variable: CoPT
Sistema
extractivo
Frec.
Media
Grupos homogéneos
--------------------------------------------------------------------------9
2
21,62
X
6
2
23,47
X
7
2
29,01
X
8
2
31,7
XX
5
2
34,835
XX
10
2
36,24
XX
3
2
37,875
XX
4
2
41,545
XX
11
8
42,9563
X
--------------------------------------------------------------------------Contraste
Diferencias
+/- Límite
--------------------------------------------------------------------------3 - 4
-3,67
4,72184
3 - 5
3,04
4,72184
3 - 6
*14,405
4,72184
3 - 7
*8,865
4,72184
3 - 8
*6,175
4,72184
3 - 9
*16,255
4,72184
3 - 10
1,635
4,72184
3 - 11
*-5,08125
3,73294
4 - 5
*6,71
4,72184
4 - 6
*18,075
4,72184
4 - 7
*12,535
4,72184
4 - 8
*9,845
4,72184
4 - 9
*19,925
4,72184
4 - 10
*5,305
4,72184
4 - 11
-1,41125
3,73294
5 - 6
*11,365
4,72184
5 - 7
*5,825
4,72184
5 - 8
3,135
4,72184
5 - 9
*13,215
4,72184
5 - 10
-1,405
4,72184
5 - 11
*-8,12125
3,73294
6 - 7
*-5,54
4,72184
6 - 8
*-8,23
4,72184
6 - 9
1,85
4,72184
6 - 10
*-12,77
4,72184
6 - 11
*-19,4863
3,73294
7 - 8
-2,69
4,72184
7 - 9
*7,39
4,72184
7 - 10
*-7,23
4,72184
7 - 11
*-13,9463
3,73294
8 - 9
*10,08
4,72184
8 - 10
-4,54
4,72184
8 - 11
*-11,2563
3,73294
9 - 10
*-14,62
4,72184
9 - 11
*-21,3363
3,73294
10 - 11
*-6,71625
3,73294
--------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
b)-CPT (g EAC %ms)
---------------------------------------------------------------------------Variable: CPT
Sistema
extractivo
Frec.
Media
Grupos homogéneos
---------------------------------------------------------------------------9
2
7,05
X
4
2
8,25
X
8
2
9,6
X
6
2
9,7
X
10
2
10,05
XX
3
2
11,0
X
11
8
12,75
X
7
2
12,8
X
5
2
13,4
X
---------------------------------------------------------------------------Contraste
Diferencias
+/- Límites
---------------------------------------------------------------------------3 - 4
*2,75
1,27591
3 - 5
*-2,4
1,27591
3 - 6
*1,3
1,27591
3 - 7
*-1,8
1,27591
3 - 8
*1,4
1,27591
3 - 9
*3,95
1,27591
3 - 10
0,95
1,27591
3 - 11
*-1,75
1,00869
4 - 5
*-5,15
1,27591
4 - 6
*-1,45
1,27591
4 - 7
*-4,55
1,27591
4 - 8
*-1,35
1,27591
4 - 9
1,2
1,27591
4 - 10
*-1,8
1,27591
4 - 11
*-4,5
1,00869
5 - 6
*3,7
1,27591
5 - 7
0,6
1,27591
5 - 8
*3,8
1,27591
5 - 9
*6,35
1,27591
5 - 10
*3,35
1,27591
5 - 11
0,65
1,00869
6 - 7
*-3,1
1,27591
6 - 8
0,1
1,27591
6 - 9
*2,65
1,27591
6 - 10
-0,35
1,27591
6 - 11
*-3,05
1,00869
7 - 8
*3,2
1,27591
7 - 9
*5,75
1,27591
7 - 10
*2,75
1,27591
7 - 11
0,05
1,00869
8 - 9
*2,55
1,27591
8 - 10
-0,45
1,27591
8 - 11
*-3,15
1,00869
9 - 10
*-3,0
1,27591
9 - 11
*-5,7
1,00869
10 - 11
*-2,7
1,00869
---------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
c)-CAO-EAA (g EAA %ms)
----------------------------------------------------------------------------Variable: CAO_EAA
Sistema
extractivo
Frec.
Media
Grupos homogéneos
----------------------------------------------------------------------------9
2
9,1
X
4
2
9,95
X
6
2
10,15
X
8
2
12,2
X
3
2
13,2
XX
10
2
14,2
XX
5
2
15,45
XX
11
8
15,7625
X
7
2
16,35
X
----------------------------------------------------------------------------Contraste
Diferencias
+/- Límites
----------------------------------------------------------------------------3 - 4
*3,25
1,7798
3 - 5
*-2,25
1,7798
3 - 6
*3,05
1,7798
3 - 7
*-3,15
1,7798
3 - 8
1,0
1,7798
3 - 9
*4,1
1,7798
3 - 10
-1,0
1,7798
3 - 11
*-2,5625
1,40705
4 - 5
*-5,5
1,7798
4 - 6
-0,2
1,7798
4 - 7
*-6,4
1,7798
4 - 8
*-2,25
1,7798
4 - 9
0,85
1,7798
4 - 10
*-4,25
1,7798
4 - 11
*-5,8125
1,40705
5 - 6
*5,3
1,7798
5 - 7
-0,9
1,7798
5 - 8
*3,25
1,7798
5 - 9
*6,35
1,7798
5 - 10
1,25
1,7798
5 - 11
-0,3125
1,40705
6 - 7
*-6,2
1,7798
6 - 8
*-2,05
1,7798
6 - 9
1,05
1,7798
6 - 10
*-4,05
1,7798
6 - 11
*-5,6125
1,40705
7 - 8
*4,15
1,7798
7 - 9
*7,25
1,7798
7 - 10
*2,15
1,7798
7 - 11
0,5875
1,40705
8 - 9
*3,1
1,7798
8 - 10
*-2,0
1,7798
8 - 11
*-3,5625
1,40705
9 - 10
*-5,1
1,7798
9 - 11
*-6,6625
1,40705
10 - 11
*-1,5625
1,40705
----------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
d)-CAO-ET (g ET %ms)
---------------------------------------------------------------------------Variable: CAO_ET
Sistema
extractivo
Frec.
Media
Grupos homogéneos
---------------------------------------------------------------------------9
2
12,8
X
4
2
14,15
X
6
2
14,3
X
8
2
17,2
X
3
2
18,65
XX
10
2
20,0
XX
5
2
21,8
XX
11
8
22,25
X
7
2
23,05
X
---------------------------------------------------------------------------Contraste
Diferencias
+/- Límites
---------------------------------------------------------------------------3 - 4
*4,5
2,58923
3 - 5
*-3,15
2,58923
3 - 6
*4,35
2,58923
3 - 7
*-4,4
2,58923
3 - 8
1,45
2,58923
3 - 9
*5,85
2,58923
3 - 10
-1,35
2,58923
3 - 11
*-3,6
2,04696
4 - 5
*-7,65
2,58923
4 - 6
-0,15
2,58923
4 - 7
*-8,9
2,58923
4 - 8
*-3,05
2,58923
4 - 9
1,35
2,58923
4 - 10
*-5,85
2,58923
4 - 11
*-8,1
2,04696
5 - 6
*7,5
2,58923
5 - 7
-1,25
2,58923
5 - 8
*4,6
2,58923
5 - 9
*9,0
2,58923
5 - 10
1,8
2,58923
5 - 11
-0,45
2,04696
6 - 7
*-8,75
2,58923
6 - 8
*-2,9
2,58923
6 - 9
1,5
2,58923
6 - 10
*-5,7
2,58923
6 - 11
*-7,95
2,04696
7 - 8
*5,85
2,58923
7 - 9
*10,25
2,58923
7 - 10
*3,05
2,58923
7 - 11
0,8
2,04696
8 - 9
*4,4
2,58923
8 - 10
*-2,8
2,58923
8 - 11
*-5,05
2,04696
9 - 10
*-7,2
2,58923
9 - 11
*-9,45
2,04696
10 - 11
*-2,25
2,04696
---------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
e)-CC (g CAF %ms)
----------------------------------------------------------------------------Variable: CC
Sistema
extractivo
Frec.
Media
Grupos homogéneos
----------------------------------------------------------------------------8
2
0,2955
X
3
2
0,3415
XX
10
2
0,354
XXX
4
2
0,3545
XXX
7
2
0,385
XXX
9
2
0,4105
XXX
6
2
0,42
XX
11
8
0,42025
XX
5
2
0,457
X
----------------------------------------------------------------------------Contraste
Diferencias
+/- Límites
----------------------------------------------------------------------------3 - 4
-0,013
0,0653758
3 - 5
*-0,1155
0,0653758
3 - 6
*-0,0785
0,0653758
3 - 7
-0,0435
0,0653758
3 - 8
0,046
0,0653758
3 - 9
*-0,069
0,0653758
3 - 10
-0,0125
0,0653758
3 - 11
*-0,07875
0,0516841
4 - 5
*-0,1025
0,0653758
4 - 6
*-0,0655
0,0653758
4 - 7
-0,0305
0,0653758
4 - 8
0,059
0,0653758
4 - 9
-0,056
0,0653758
4 - 10
0,0005
0,0653758
4 - 11
*-0,06575
0,0516841
5 - 6
0,037
0,0653758
5 - 7
*0,072
0,0653758
5 - 8
*0,1615
0,0653758
5 - 9
0,0465
0,0653758
5 - 10
*0,103
0,0653758
5 - 11
0,03675
0,0516841
6 - 7
0,035
0,0653758
6 - 8
*0,1245
0,0653758
6 - 9
0,0095
0,0653758
6 - 10
*0,066
0,0653758
6 - 11
-0,00025
0,0516841
7 - 8
*0,0895
0,0653758
7 - 9
-0,0255
0,0653758
7 - 10
0,031
0,0653758
7 - 11
-0,03525
0,0516841
8 - 9
*-0,115
0,0653758
8 - 10
-0,0585
0,0653758
8 - 11
*-0,12475
0,0516841
9 - 10
0,0565
0,0653758
9 - 11
-0,00975
0,0516841
10 - 11
*-0,06625
0,0516841
----------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
Gráficos de medias con barras de intervalos de LSD (NC: 95%)
Cuadro C.13. Análisis de regresión no lineal
Variables independientes:
• x1: relación líquido a sólido (g líquido/g sólido seco)
• x2: concentración de etanol (% p/p)
Estimaciones del parámetro inicial: A0=a1=a2=a11=a12=a22=0,1
a)-Variable dependiente: CoPT
Resultados de la Estimación
-------------------------------------------------------------------------Asintótica 95,0%
Asintótica
Intervalos de Confian
Parámetro
Estimado Error Estándar
Inferior
Superi
-------------------------------------------------------------------------A0
-72,5398
21,8926
-118,535
-26,5
a1
22,6242
4,70881
12,7313
32,5
a2
1,39119
0,290072
0,781767
2,000
a11
-1,27668
0,279136
-1,86312
-0,6902
a22
-0,00931755
0,00178647
-0,0130708
-0,00556
a12
-0,075175
0,0281291
-0,134272
-0,01607
-------------------------------------------------------------------------Análisis de Varianza
----------------------------------------------------Fuente
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio
----------------------------------------------------Modelo
31654,8
6
5275,8
Residuos
284,848
18
15,8249
----------------------------------------------------Total
31939,6
24
Total (Corr.)
1391,85
23
R-Cuadrado = 79,5345 porcentaje
R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 73,8497 porcentaje
Error Estándar de la Est. = 3,97805
Error absoluto de la Media = 2,66214
Estadístico Durbin-Watson = 1,04898
Autocorrelación residual Lag 1 = 0,429595
Análisis de Residuos
--------------------------------Estimación
Validación
n
24
MSE
15,8249
MAE
2,66214
MAPE 8,08994
ME
-1,52239E-9
MPE
-1,08303
b)-Variable dependiente: CPT
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------------------------Asintótica 95,0%
Asintótica
Intervalos de Confianza
Parámetro
Estimado Error Estándar
Inferior
Superior
---------------------------------------------------------------------------A0
-7,90009
3,85039
-15,9895
0,189301
a1
3,14182
0,828167
1,4019
4,88174
a2
0,292915
0,0510167
0,185733
0,400097
a11
-0,148759
0,0490934
-0,2519
-0,045617
a22
-0,00308474
0,000314198
-0,00374485
-0,00242464
a12
-0,00475
0,00494723
-0,0151438
0,00564377
---------------------------------------------------------------------------Análisis de Varianza
----------------------------------------------------Fuente
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio
----------------------------------------------------Modelo
3035,9
6
505,983
Residuos
8,81104
18
0,489502
----------------------------------------------------Total
3044,71
24
Total (Corr.)
103,19
23
R-Cuadrado = 91,4613 porcentaje
R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 89,0894 porcentaje
Error Estándar de la Est. = 0,699644
Error absoluto de la Media = 0,490352
Estadístico Durbin-Watson = 1,69184
Autocorrelación residual Lag 1 = 0,117456
Análisis de Residuos
--------------------------------Estimación
Validación
n
24
MSE
0,489502
MAE
0,490352
MAPE 4,44619
ME
-2,92232E-10
MPE
-0,265535
c)-Variable dependiente: CAO-ET
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------------------------Asintótica 95,0%
Asintótica
Intervalos de Confianza
Parámetro
Estimado Error Estándar
Inferior
Superior
---------------------------------------------------------------------------A0
-17,9844
7,4789
-33,697
-2,27176
a1
6,7751
1,60861
3,39553
10,1547
a2
0,52074
0,0990935
0,312552
0,728928
a11
-0,331323
0,0953577
-0,531663
-0,130984
a22
-0,0051183
0,000610289
-0,00640048
-0,00383613
a12
-0,015
0,00960937
-0,0351886
0,00518859
---------------------------------------------------------------------------Análisis de Varianza
----------------------------------------------------Fuente
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio
----------------------------------------------------Modelo
9186,91
6
1531,15
Residuos
33,2424
18
1,8468
----------------------------------------------------Total
9220,15
24
Total (Corr.)
330,5
23
R-Cuadrado = 89,9418 porcentaje
R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 87,1478 porcentaje
Error Estándar de la Est. = 1,35897
Error absoluto de la Media = 0,908939
Estadístico Durbin-Watson = 2,10111
Autocorrelación residual Lag 1 = -0,0563351
Análisis de Residuos
--------------------------------Estimación
Validación
n
24
MSE
1,8468
MAE
0,908939
MAPE 4,88052
ME
-5,07228E-10
MPE
-0,34309
d)-Variable dependiente: CAO-EAA
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------------------------Asintótica 95,0%
Asintótica
Intervalos de Confianza
Parámetro
Estimado Error Estándar
Inferior
Superior
---------------------------------------------------------------------------A0
-12,6333
5,20803
-23,575
-1,69161
a1
4,79299
1,12018
2,43958
7,1464
a2
0,364721
0,069005
0,219746
0,509696
a11
-0,235006
0,0664035
-0,374515
-0,0954971
a22
-0,00361661
0,000424983
-0,00450947
-0,00272375
a12
-0,01025
0,00669161
-0,0243086
0,00380858
---------------------------------------------------------------------------Análisis de Varianza
----------------------------------------------------Fuente
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio
----------------------------------------------------Modelo
4613,15
6
768,858
Residuos
16,12
18
0,895553
----------------------------------------------------Total
4629,27
24
Total (Corr.)
165,716
23
R-Cuadrado = 90,2726 porcentaje
R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 87,5705 porcentaje
Error Estándar de la Est. = 0,946337
Error absoluto de la Media = 0,633139
Estadístico Durbin-Watson = 2,0776
Autocorrelación residual Lag 1 = -0,0437251
Análisis de Residuos
--------------------------------Estimación
Validación
n
24
MSE
0,895553
MAE
0,633139
MAPE 4,81589
ME
-3,87948E-10
MPE
-0,33179
e)-Variable dependiente: CC
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------------------------Asintótica 95,0%
Asintótica
Intervalos de Confianza
Parámetro
Estimado Error Estándar
Inferior
Superior
---------------------------------------------------------------------------A0
-0,404449
0,191104
-0,805944
-0,00295374
a1
0,159975
0,0411038
0,0736192
0,246331
a2
0,00402778
0,00253208
-0,00129193
0,00934748
a11
-0,00801365
0,00243662
-0,0131328
-0,00289449
a22
-0,0000174862
0,0000155943 -0,0000502488 0,0000152763
a12
-0,00025
0,000245542 -0,000765866
0,000265867
---------------------------------------------------------------------------Análisis de Varianza
----------------------------------------------------Fuente
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio
----------------------------------------------------Modelo
3,71911
6
0,619852
Residuos
0,0217048
18
0,00120582
----------------------------------------------------Total
3,74082
24
Total (Corr.)
0,0607178
23
R-Cuadrado = 64,253 porcentaje
R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 54,3233 porcentaje
Error Estándar de la Est. = 0,0347249
Error absoluto de la Media = 0,0230383
Estadístico Durbin-Watson = 2,64731
Autocorrelación residual Lag 1 = -0,34525
Análisis de Residuos
--------------------------------Estimación
Validación
n
24
MSE
0,00120582
MAE
0,0230383
MAPE 5,89603
ME
-1,14717E-10
MPE
-0,569322
ANEXO 4
Cuadro D.1. Datos del ácido clorogénico como patrón estándar y análisis de regresión
lineal
Concentración
Absorbancia
(µg/mL)
Lecturas
(765nm)
0
1
0,005
0
2
0,005
0
1
0,005
0
2
0,004
10
1
0,085
10
2
0,087
20
1
0,154
20
2
0,152
30
1
0,219
30
2
0,219
40
1
0,281
40
2
0,284
50
1
0,345
50
2
0,345
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X-Muestras: polvos-secadero spray
----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: Absorbancia (765nm)
Variable independiente: concentración de ácido clorogénico (ug/mL)
----------------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Ordenada
0,0104063
0,00250443
4,15513
0,0013
Pendiente
0,00681438
0,0000893464
76,2692
0,0000
-----------------------------------------------------------------------------
Análisis de la Varianza
----------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-Valor
----------------------------------------------------------------------------Modelo
0,212278
1
0,212278
5816,98
0,0000
Residuo
0,000437913
12 0,0000364927
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
0,212715
13
Coeficiente de Correlación = 0,99897
R-cuadrado = 99,7941 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99,777 porcentaje
Error estándar de est. = 0,00604092
Error absoluto medio = 0,00526518
Estadístico de Durbin-Watson = 0,627245 (P=0,0002)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,610172
Nota D.1. Modo de cálculo de CPT para experiencias de secado
Ejemplo para calcular CPTP correspondientes al polvo S1:
Ejemplo para calcular CPTP* correspondientes al polvo S2:
Cuadro D.2. Datos crudos de contenido de polifenoles totales de los polvos -Experiencia de
secado
Polvo
s1
s1
s1
s1
s2
s2
s2
s2
s3
s3
s3
s3
s4
s4
s4
s4
s5
s5
s5
s5
s6
s6
s6
s6
s7
s7
s7
s7
s8
s8
s8
s8
s9
s9
s9
s9
s10
s10
s10
s10
s11
s11
s11
s11
s12
s12
Continúa
CH
7,7
7,7
7,7
7,7
7,03
7,03
7,03
7,03
3,66
3,66
3,66
3,66
4,45
4,45
4,45
4,45
3,16
3,16
3,16
3,16
10,59
10,59
10,59
10,59
7,09
7,09
7,09
7,09
4,02
4,02
4,02
4,02
3,57
3,57
3,57
3,57
3,45
3,45
3,45
3,45
5,64
5,64
5,64
5,64
4,29
4,29
w
0,5008
0,5008
0,5003
0,5003
0,5016
0,5016
0,5005
0,5005
0,5008
0,5008
0,5048
0,5048
0,5014
0,5014
0,5048
0,5048
0,5016
0,5016
0,5072
0,5072
0,5037
0,5037
0,5014
0,5014
0,5072
0,5072
0,5059
0,5059
0,5054
0,5054
0,5045
0,5045
0,5048
0,5048
0,5064
0,5064
0,5018
0,5018
0,5023
0,5023
0,508
0,508
0,5041
0,5041
0,5054
0,5054
E
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
µg
Sólidos de
L Abs
EAC CPTP SS*
YM
CPTP*
1
0,243 34,21 37,00 23,05
91,11
40,61
2
0,249 35,09 37,95 23,05
91,11
41,66
1
0,249 35,09 37,99 23,05
91,11
41,70
2
0,252 35,53 38,47 23,05
91,11
42,23
1
0,194 27,00 28,95 33,05
63,54
45,56
2
0,194 27,00 28,95 33,05
63,54
45,56
1
0,195 27,15 29,17 33,05
63,54
45,91
2
0,201 28,03 30,12 33,05
63,54
47,40
1
0,261 36,85 38,19 23,05
91,11
41,92
2
0,269 38,03 39,41 23,05
91,11
43,26
1
0,268 37,88 38,95 23,05
91,11
42,75
2
0,267 37,74 38,80 23,05
91,11
42,58
1
0,198 27,59 28,79 33,05
63,54
45,31
2
0,199 27,74 28,95 33,05
63,54
45,56
1
0,201 28,03 29,06 33,05
63,54
45,73
2
0,199 27,74 28,75 33,05
63,54
45,25
1
0,239 33,62 34,60 28,05
74,87
46,22
2
0,241 33,91 34,91 28,05
74,87
46,63
1
0,235 33,03 33,62 28,05
74,87
44,91
2
0,237 33,32 33,92 28,05
74,87
45,31
1
0,209 29,21 32,43 28,05
74,87
43,31
2
0,21 29,35 32,59 28,05
74,87
43,53
1
0,221 30,97 34,54 28,05
74,87
46,14
2
0,22 30,82 34,38 28,05
74,87
45,92
1
0,189 26,26 27,87 35,10
59,83
46,58
2
0,187 25,97 27,56 35,10
59,83
46,06
1
0,193 26,85 28,57 35,10
59,83
47,74
2
0,194 27,00 28,72 35,10
59,83
48,01
1
0,307 43,62 44,96 21,00
100,00
44,96
2
0,308 43,76 45,11 21,00
100,00
45,11
1
0,303 43,03 44,43 21,00
100,00
44,43
2
0,303 43,03 44,43 21,00
100,00
44,43
1
0,238 33,47 34,38 28,05
74,87
45,92
2
0,237 33,32 34,23 28,05
74,87
45,72
1
0,236 33,18 33,97 28,05
74,87
45,37
2
0,236 33,18 33,97 28,05
74,87
45,37
1
0,233 32,74 33,78 28,05
74,87
45,12
2
0,233 32,74 33,78 28,05
74,87
45,12
1
0,231 32,44 33,45 28,05
74,87
44,68
2
0,232 32,59 33,60 28,05
74,87
44,88
1
0,229 32,15 33,53 28,05
74,87
44,79
2
0,227 31,85 33,23 28,05
74,87
44,38
1
0,229 32,15 33,79 28,05
74,87
45,14
2
0,231 32,44 34,10 28,05
74,87
45,55
1
0,236 33,18 34,29 28,05
74,87
45,81
2
0,237 33,32 34,45 28,05
74,87
46,01
Continuación
s12
4,29
0,5025 b
1
0,234 32,88 34,19 28,05
74,87
45,66
s12
4,29
0,5025 b
2
0,235 33,03 34,34 28,05
74,87
45,87
s13
3,62
0,5076 a
1
0,233 32,74 33,46 28,05
74,87
44,69
s13
3,62
0,5076 a
2
0,237 33,32 34,06 28,05
74,87
45,49
s13
3,62
0,5071 b
1
0,235 33,03 33,79 28,05
74,87
45,13
s13
3,62
0,5071 b
2
0,234 32,88 33,64 28,05
74,87
44,93
w: peso de la muestra (g); CH: contenido de humedad (%bh); E: extracto; L: N° de lectura; Abs:
absorbancia; CPTP: contenido de polifenoles totales (g EAC %ms); SS*: sólidos solubles totales
YM: sólidos de yerba mate; CPTP*: contenido de polifenoles totales libre de maltodextrina (g EAC %ms
lm)
Cuadro D.3. Resúmen de datos de contenido de polifenoles totales de los polvos
Muestra
s1
s2
s3
s4
s5
s6
s7
s8
s9
s10
s11
s12
s13
Replica
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
CPTP*
(g EAC %ms lm)
Media
Error Estándar
41,6
0,42
46,1
0,55
42,6
0,04
45,5
0,03
45,8
0,66
44,7
1,31
47,1
0,78
44,7
0,30
45,6
0,23
45,0
0,17
45,0
0,38
45,8
0,07
45,1
0,03
Nota D.2. Modo de cálculo de la capacidad antioxidante
CPTP
(%EAC %ms)
Media
Error Estándar
37,9
0,38
29,3
0,35
38,8
0,04
28,9
0,02
34,3
0,49
33,5
0,98
28,2
0,47
44,7
0,30
34,1
0,17
33,7
0,13
33,7
0,28
34,3
0,05
33,7
0,02
Ejemplo de cálculo de CAO (g Epatrón % ms)
Ejemplo de cálculo de CAO* (g Epatrón %ms lm)
Cuadro D.4. Datos crudos de capacidad antioxidante de los polvos -Experiencia de secado
Polvo
s1
s1
s1
s1
s2
s2
s2
s2
s3
s3
s3
s3
s4
s4
s4
s4
s5
s5
s5
s5
s6
s6
s6
s6
s7
s7
s7
s7
s8
s8
s8
s8
s9
s9
s9
s9
s10
s10
s10
s10
s11
s11
s11
s11
s12
s12
s12
Continúa
CH
(%bh) W
D
7,7
0,5008
7,7
0,5008
7,7
0,5032
7,7
0,5032
7,03
0,5041
7,03
0,5041
7,03
0,5047
7,03
0,5047
3,66
0,5029
3,66
0,5029
3,66
0,5058
3,66
4,45
4,45
4,45
4,45
3,16
3,16
3,16
3,16
10,59
10,59
10,59
10,59
7,09
7,09
7,09
7,09
4,02
4,02
4,02
4,02
3,57
3,57
3,57
3,57
3,45
3,45
3,45
3,45
5,64
5,64
5,64
5,64
4,29
4,29
4,29
0,5058
0,5030
0,5030
0,5036
0,5036
0,5041
0,5041
0,5071
0,5071
0,5030
0,5030
0,5056
0,5056
0,5097
0,5097
0,5055
0,5055
0,5032
0,5032
0,5020
0,5020
0,5042
0,5042
0,5012
0,5012
0,5041
0,5041
0,5050
0,5050
0,5064
0,5064
0,5027
0,5027
0,5046
0,5046
0,5023
Absorbancia
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
dilución
1:x
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
E
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
b
a
a
b
L
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
Concentración del
DPPH
µgA0
A120
C0
C120
%R
µgEAA ET
1,079
0,310
104,88
30,22 28,82
17,88 25,38
1,079
0,299
104,88
29,16 27,80
18,14 25,75
1,079
0,305
104,88
29,74 28,35
18,00 25,55
1,079
0,307
104,88
29,93 28,54
17,95 25,48
1,079
0,460
104,88
44,79 42,70
14,39 20,36
1,079
0,435
104,88
42,36 40,39
14,97 21,20
1,079
0,454
104,88
44,20 42,15
14,53 20,56
1,079
0,461
104,88
44,88 42,79
14,37 20,33
1,079
0,284
104,88
27,70 26,41
18,49 26,25
1,079
0,268
104,88
26,15 24,93
18,86 26,78
1,079
0,303
104,88
29,54 28,17
18,04 25,61
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,079
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
1,087
0,299
0,464
0,461
0,473
0,469
0,353
0,359
0,332
0,321
0,404
0,399
0,385
0,380
0,458
0,462
0,482
0,485
0,225
0,205
0,234
0,228
0,403
0,426
0,371
0,349
0,376
0,383
0,418
0,381
0,409
0,399
0,370
0,386
0,339
0,357
0,350
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
104,88
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
105,66
29,16
45,17
44,88
46,05
45,66
34,40
34,98
32,36
31,29
39,35
38,86
37,50
37,02
44,59
44,98
46,92
47,21
21,97
20,03
22,84
22,26
39,25
41,49
36,15
34,01
36,63
37,31
40,71
37,12
39,83
38,86
36,05
37,60
33,04
34,79
34,11
27,80
43,07
42,79
43,90
43,53
32,80
33,35
30,85
29,83
37,52
37,05
35,76
35,30
42,52
42,89
44,74
45,02
20,79
18,96
21,62
21,07
37,15
39,26
34,21
32,19
34,67
35,31
38,53
35,13
37,70
36,78
34,12
35,59
31,27
32,92
32,28
18,14
14,30
14,37
14,09
14,18
16,88
16,74
17,37
17,63
15,69
15,81
16,14
16,25
14,44
14,35
13,88
13,81
19,90
20,36
19,69
19,83
15,79
15,26
16,53
17,03
16,41
16,25
15,44
16,30
15,65
15,88
16,55
16,18
17,26
16,85
17,01
25,75
20,23
20,33
19,93
20,06
23,94
23,74
24,64
25,01
22,24
22,40
22,87
23,04
20,43
20,30
19,63
19,53
28,28
28,94
27,98
28,18
22,37
21,60
23,43
24,16
23,26
23,03
21,87
23,10
22,17
22,50
23,46
22,93
24,49
23,90
24,13
Continuación
s12
4,29
s13
3,62
s13
3,62
s13
3,62
0,5023
0,5086
0,5086
0,5067
50
50
50
50
25
25
25
25
b
a
a
b
2
1
2
1
1,087
1,087
1,087
1,087
0,358
0,350
0,348
0,347
105,66
105,66
105,66
105,66
34,88
34,11
33,91
33,82
33,01
32,28
32,10
32,00
16,83
17,01
17,06
17,08
23,86
24,13
24,19
24,23
s13
3,62
0,5067
50
25 b
2 1,087
0,355
105,66
34,59 32,74
16,90 23,96
CH: contenido de humedad (%ms), w: peso de la muestra en polvo (g); D: volumen de dilución (mL); A0: absorbancia a tiempo
inicial; A120: absorbancia a 120 min; E: extracto; L: N° de lectura; C0: concentración de DPPH a tiempo inicial; C120:
concentración de DPPH a 120 min.
Cálculo de capacidad antioxidante por 100 g de sólidos de yerba mate secos (libres de maltodextrina)
s1
s1
s1
s1
s2
s2
s2
s2
s3
s3
s3
s3
s4
s4
s4
s4
s5
s5
s5
s5
s6
s6
s6
s6
s7
s7
s7
s7
s8
s8
s8
s8
s9
Continúa
CAO*
CAO
Polvo
Sólidos de YM %ms
g EAA %ms
g ET %ms
48,35
49,05
48,44
48,31
38,39
39,94
38,71
38,28
47,69
48,65
46,29
46,52
37,19
37,37
36,60
36,84
43,22
42,87
44,21
44,86
43,62
43,95
44,62
44,94
38,11
37,87
36,94
36,76
51,49
52,69
51,08
51,44
40,59
68,63
69,63
68,75
68,57
54,31
56,54
54,78
54,16
67,72
69,10
65,70
66,05
52,61
52,87
51,77
52,11
61,30
60,79
62,73
63,67
61,80
62,27
63,24
63,70
53,92
53,57
52,24
51,97
73,19
74,91
72,59
73,10
57,51
91,11
91,11
91,11
91,11
63,54
63,54
63,54
63,54
91,11
91,11
91,11
91,11
63,54
63,54
63,54
63,54
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
59,83
59,83
59,83
59,83
100,00
100,00
100,00
100,00
74,87
g EAA %ms lm
53,07
53,83
53,16
53,03
60,42
62,86
60,93
60,25
52,35
53,40
50,80
51,07
58,53
58,82
57,61
57,99
57,74
57,26
59,05
59,92
58,27
58,70
59,60
60,03
63,70
63,29
61,75
61,44
51,49
52,69
51,08
51,44
54,21
g ET %ms lm
75,33
76,42
75,47
75,27
85,47
88,98
86,21
85,23
74,33
75,85
72,12
72,50
82,80
83,21
81,47
82,02
81,88
81,20
83,79
85,04
82,55
83,17
84,47
85,09
90,13
89,54
87,31
86,86
73,19
74,91
72,59
73,10
76,81
Continuación
s9
39,22
s9
42,74
s9
44,06
s10
42,15
s10
41,73
s10
39,59
s10
41,78
s11
40,94
s11
41,54
s11
43,61
s11
42,64
s12
44,69
s12
43,61
s12
44,23
s12
43,75
s13
43,38
s13
43,50
s13
43,72
s13
43,25
55,54
60,60
62,49
59,75
59,15
56,07
59,22
57,99
58,86
61,83
60,43
63,39
61,85
62,74
62,04
61,53
61,70
62,01
61,33
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
74,87
Eliminado
57,09
58,85
56,30
55,74
Eliminado
55,80
54,68
55,49
58,25
56,95
59,69
58,25
59,08
58,44
57,94
58,10
58,39
57,76
eliminado
80,94
83,47
79,81
79,01
eliminado
79,10
77,46
78,62
82,59
80,72
84,68
82,61
83,80
82,87
82,18
82,41
82,83
81,92
Cuadro D.5. Resumen de datos de Capacidad Antioxidante de los polvos
Mues
-tra Recuento
s1
s2
s3
s4
s5
s6
s7
s8
s9
s10
s11
s12
s13
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
CAO
CAO*
(g EAA %ms)
(g ET %ms)
Error
Media Standard
Error
Media Standard
48,5
38,8
47,3
37,0
43,8
44,3
37,4
51,7
42,0
41,9
42,2
44,1
43,5
0,16
0,34
0,88
0,28
0,75
0,50
0,57
0,42
1,41
0,08
0,94
0,08
0,02
68,9
54,9
67,1
52,3
62,1
62,8
52,9
73,4
59,5
59,3
59,8
62,5
61,6
(g EAA %ms lm)
0,24
0,48
1,27
0,40
1,08
0,72
0,82
0,60
2,02
0,12
1,35
0,12
0,03
Media
53,27
61,11
51,90
58,24
58,49
59,15
62,54
51,67
56,09
55,91
56,34
58,86
58,05
Error
Standard
0,18
0,52
0,97
0,44
0,99
0,66
0,95
0,41
1,88
0,11
1,26
0,10
0,03
(g ET %ms lm)
Media
75,62
86,47
73,70
82,37
82,98
83,82
88,46
73,44
79,51
79,25
79,85
83,49
82,33
Error
Standard
0,25
0,75
1,39
0,63
1,43
0,96
1,37
0,60
2,69
0,15
1,80
0,15
0,04
Cuadro D.6. Datos crudos de Solubilidad de los polvos (a 25°C)-Experiencia de secado
Polvo
S1
S1
S2
S2
S3
S3
S4
S4
S5
S5
S6
S6
S7
S7
S8
S8
S9
S9
S10
S10
S11
S11
S12
S12
S13
S13
Muestra Peso(g bh)Humedad
1
2,0044 7,7046
2
2,0000 7,7046
1
2,0034 7,0332
2
2,0004 7,0332
1
1,9993 3,6600
2
2,0042 3,6600
1
2,0001 4,4464
2
2,0007 4,4464
1
1,9992 3,1565
2
1,9993 3,1565
1
2,0006 10,5904
2
1,9994 10,5904
1
1,9992 7,0950
2
2,0000 7,0950
1
2,0022 0,0000
2
2,0005 0,0000
1
2,0028 3,5692
2
1,9984 3,5692
1
2,0016 3,4512
2
1,9974 3,4512
1
2,0015 5,6436
2
2,0007 5,6436
1
1,9967 4,2929
2
2,0032 4,2929
1
2,0018 3,6228
2
1,9999 3,6228
Peso seco (g) Peso Crisol (PC) PC + Ms 105 Solubilidad Solubilidad (%)
1,8500
49,8928
50,7555
0,93
93,3
1,8459
49,5829
1,8625
49,4009
50,2983
0,96
96,4
1,8597
48,0119
48,9181
0,97
97,5
1,9261
46,5868
47,4935
0,94
94,1
1,9308
48,2963
49,1991
0,94
93,5
1,9112
46,6348
47,5219
0,93
92,8
1,9117
43,8294
44,7381
0,95
95,1
1,9361
44,9031
45,8158
0,94
94,3
1,9362
48,3078
49,2538
0,98
97,7
1,7887
49,0666
49,9289
0,96
96,4
1,7877
50,2593
51,1247
0,97
96,8
1,8574
50,3065
51,1866
0,95
94,8
1,8581
50,4392
51,3291
0,96
95,8
2,0022
48,2643
49,1758
0,91
91,0
2,0005
49,0365
49,9451
0,91
90,8
1,9313
48,3000
49,2243
0,96
95,7
1,9271
48,7960
49,7141
0,95
95,3
1,9325
47,3342
48,2445
0,94
94,2
1,9285
50,0112
50,9191
0,94
94,2
1,8885
46,3384
47,2385
0,95
95,3
1,8878
51,4424
52,3336
0,94
94,4
1,9110
48,2906
1,9172
49,4848
50,3589
0,91
91,2
1,9293
48,5115
49,4185
0,94
94,0
1,9274
50,0592
50,9738
0,95
94,9
Cuadro D.7. Resumen de datos de solubilidad de los polvos
Muestra
Réplica
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S13
S9-13
(promediado)
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Solubilidad (S; %)
Error
Media
Standard
93
0,00
97
0,55
94
0,30
94
1,15
96
1,70
97
0,20
95
0,50
91
0,10
96
0,20
94
0,00
95
0,45
94
0,45
95
0,48
Cuadro D.8. Datos usados para el análisis de superficie de respuesta (con variables
independientes codificadas)
Polvo
s1
s2
s3
s4
s5
s6
s7
s8
s9
s10
s11
s12
s13
x1
x2
-1
-1
1
1
1,41
-1,41
0
0
0
0
0
0
0
CPTP
-1
1
-1
1
0
0
1,41
-1,41
0
0
0
0
0
37,90
29,30
38,80
28,90
34,30
33,50
28,20
44,70
34,14
33,65
33,66
34,32
33,74
CAO-EAA CAO-ET
S
48,5
68,9
38,8
54,9
47,3
67,1
37,0
52,3
43,8
62,1
44,3
62,8
37,4
52,9
51,7
73,4
42,0
59,5
42,0
59,5
42,2
59,8
44,1
62,5
43,5
61,6 --
93,3
97,0
93,8
94,0
96,0
96,6
95,3
90,9
95,5
94,2
94,9
94,5
Cuadro D.9. Análisis de superficie de respuesta
Variables: a)- variable dependiente: contenido de polefenoles totales de los polvos (CPTP; g EAC %ms);
b)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-EAA; g EAA %ms); c)- variable dependiente:
capacidad antioxidante (CAO-ET; gET %ms); d)- variable dependiente: Solubilidad (S; %).
a)- variable dependiente: contenido de polefenoles totales de los polvos (CPTP; g EAC %ms)
Regresión No líneal
------------------Variable dependiente: CPTP
Variables independientes:
x1
x2
Función a estimar: A0+a1*x1+a2*x2+a11*x1^2+a22*x2^2+a12*x1*x2
Estimaciones del parámetro inicial:
A0 = 0,1
a1 = 0,1
a2 = 0,1
a11 = 0,1
a22 = 0,1
a12 = 0,1
Método de estimación: Marquardt
La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos.
Número de iteracciones: 3
Número de llamadas de funciones: 23
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------------------------Asintótica 95,0%
Asintótica
Intervalos de Confianza
Parámetro
Estimado Error Estándar
Inferior
Superior
---------------------------------------------------------------------------A0
33,9075
0,4674
32,8022
35,0127
a1
0,204107
0,370066
-0,670961
1,07918
a2
-5,2362
0,370066
-6,11127
-4,36113
a11
-0,370328
0,397958
-1,31135
0,570695
a22
0,912304
0,397958
-0,0287192
1,85333
a12
-0,325
0,522573
-1,56069
0,910691
---------------------------------------------------------------------------Análisis de Varianza
----------------------------------------------------Fuente
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio
----------------------------------------------------Modelo
15467,8
6
2577,96
Residuos
7,6463
7
1,09233
----------------------------------------------------Total
15475,4
13
Total (Corr.)
234,492
12
R-Cuadrado = 96,7392 porcentaje
R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 94,4101 porcentaje
Error Estándar de la Est. = 1,04515
Error absoluto de la Media = 0,568978
Estadístico Durbin-Watson = 1,62797
Autocorrelación residual Lag 1 = 0,0809344
Análisis de Residuos
--------------------------------Estimación
Validación
n
13
MSE
1,09233
MAE
0,568978
MAPE 1,5343
ME
3,98003E-8
MPE
-0,0350083
b)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-EAA; g EAA %ms)
Regresión No líneal
------------------Variable dependiente: CAO (gEAA %ms)
Variables independientes (CODIFICADAS): x1; x2
Función a estimar: A0+a1*x1+a2*x2+a11*x1^2+a22*x2^2+a12*x1*x2
Estimaciones del parámetro inicial: A0 = 0,1=a1=a2=a11=a22=a12=0,1
Método de estimación: Marquardt
La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de
Número de iteracciones: 3
Número de llamadas de funciones: 23
Resultados de la Estimación
--------------------------------------------------------------------------Asintótica 95,0%
Asintótica
Intervalos de Confianz
Parámetro
Estimado Error Estándar
Inferior
Superio
--------------------------------------------------------------------------A0
42,7634
0,490596
41,6033
43,923
a1
-0,464507
0,388431
-1,383
0,45398
a2
-5,03536
0,388431
-5,95385
-4,1168
a11
0,292772
0,417707
-0,694951
1,280
a22
0,544268
0,417707
-0,443455
1,5319
a12
-0,15
0,548507
-1,44702
1,1470
---------------------------------------------------------------------------
Análisis de Varianza
----------------------------------------------------Fuente
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio
----------------------------------------------------Modelo
24554,0
6
4092,34
Residuos
8,42406
7
1,20344
----------------------------------------------------Total
24562,5
13
Total (Corr.)
214,863
12
R-Cuadrado = 96,0793 porcentaje
R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 93,2789 porcentaje
Error Estándar de la Est. = 1,09701
Error absoluto de la Media = 0,75256
Estadístico Durbin-Watson = 1,39745
Autocorrelación residual Lag 1 = 0,257036
Análisis de Residuos
--------------------------------Estimación
Validación
n
13
MSE
1,20344
MAE
0,75256
MAPE 1,74987
ME
5,00924E-8
MPE
-0,0354625
c)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-ET; gET %ms)
Variable dependiente: CAO (gET %ms)
Variables independientes: x1; x2
Función a estimar: A0+a1*x1+a2*x2+a11*x1^2+a22*x2^2+a12*x1*x2
Estimaciones del parámetro inicial: A0=a1=a2=a11=a22=a12=0,1
Método de estimación: Marquardt
La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados
Número de iteracciones: 3
Número de llamadas de funciones: 23
Resultados de la Estimación
------------------------------------------------------------------------Asintótica 95,0%
Asintótica
Intervalos de Confia
Parámetro
Estimado Error Estándar
Inferior
Super
------------------------------------------------------------------------A0
60,5848
0,700658
58,928
62,2
a1
-0,675384
0,554749
-1,98716
0,636
a2
-7,23465
0,554749
-8,54642
-5,92
a11
0,431868
0,59656
-0,978777
1,84
a22
0,783963
0,59656
-0,626682
2,19
a12
-0,2
0,783365
-2,05237
1,65
------------------------------------------------------------------------Análisis de Varianza
----------------------------------------------------Fuente
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio
----------------------------------------------------Modelo
49325,3
6
8220,88
Residuos
17,1825
7
2,45464
----------------------------------------------------Total
49342,5
13
Total (Corr.)
443,468
12
R-Cuadrado = 96,1254 porcentaje
R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 93,3579 porcentaje
Error Estándar de la Est. = 1,56673
Error absoluto de la Media = 1,07029
Estadístico Durbin-Watson = 1,4194
Autocorrelación residual Lag 1 = 0,249457
Análisis de Residuos
--------------------------------Estimación
Validación
n
13
MSE
2,45464
MAE
1,07029
MAPE 1,75854
ME
7,09433E-8
MPE
-0,0361757
d)- variable dependiente: Solubilidad (S; %)
Regresión No líneal
------------------Variable dependiente: S (%)
Variables independientes: x1; x2
Función a estimar: A0+a1*x1+a2*x2+a11*x1^2+a22*x2^2+a12*x1*x2
Estimaciones del parámetro inicial: A0=a1=a2=a11=a12=a22=0,1
Método de estimación: Marquardt
La estimación se detuvo debido a la convergencia de las estimaciones del parámetro.
Número de iteracciones: 4
Número de llamadas de funciones: 29
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------------------------Asintótica 95,0%
Asintótica
Intervalos de Confianza
Parámetro
Estimado Error Estándar
Inferior
Superior
---------------------------------------------------------------------------A0
94,7755
0,29083
94,0639
95,4872
a1
-0,419498
0,205956
-0,923456
0,0844595
a2
1,26677
0,205956
0,762811
1,77073
a11
0,722906
0,230884
0,157953
1,28786
a22
-0,886671
0,230884
-1,45162
-0,321718
a12
-0,875
0,290832
-1,58664
-0,163357
---------------------------------------------------------------------------Análisis de Varianza
----------------------------------------------------Fuente
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio
----------------------------------------------------Modelo
107569,0
6
17928,2
Residuos
2,03
6
0,338333
----------------------------------------------------Total
107571,0
12
Total (Corr.)
29,6067
11
R-Cuadrado = 93,1434 porcentaje
R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 87,4296 porcentaje
Error Estándar de la Est. = 0,581664
Error absoluto de la Media = 0,356562
Estadístico Durbin-Watson = 3,25369
Autocorrelación residual Lag 1 = -0,687051
Análisis de Residuos
--------------------------------Estimación
Validación
n
12
MSE
0,338333
MAE
0,356562
MAPE 0,376964
ME
1,52381E-7
MPE
-0,00193406
Cuadro D.10. Estimación de errores del análisis de superficie de respuesta
Para: a)- variable dependiente: contenido de polefenoles totales de los polvos (CPTP; g EAC %ms); b)variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-EAA; g EAA %ms); c)- variable dependiente:
capacidad antioxidante (CAO-ET; gET %ms); d)- variable dependiente: Solubilidad (S; %)
a)- variable dependiente: contenido de polefenoles totales de los polvos (CPTP; g EAC %ms)
Ypred
39,2
29,3
40,2
29,1
33,5
32,9
28,3
43,1
33,9
33,9
33,9
33,9
33,9
sumatorias
Ypred-Yexp
1,30
0,03
1,37
0,20
-0,81
-0,60
0,15
-1,63
-0,23
0,25
0,24
-0,41
0,17
0,05
Np=6
N: número de datos exp
R2
χ2
RMSE
MPE
CPTP
(Ypred-Yexp)2 ABS(YpreYexp)/Yexp
(Yexp-Yprom)2
1,69
0,03
13,1
0,00
0,00
24,4
1,89
0,04
21,2
0,04
0,01
28,6
0,65
0,02
0,0
0,36
0,02
0,6
0,02
0,01
36,6
2,66
0,04
110,2
0,05
0,01
0,0
0,06
0,01
0,3
0,06
0,01
0,3
0,17
0,01
0,0
0,03
0,00
0,2
7,70
0,20
235,57
13
0,967
1,099
0,769
1,537
b)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-EAA; g EAA %ms)
CAO-EAA
Ypred
49,0
39,2
48,3
38,0
42,7
44,0
36,7
50,9
42,8
42,8
42,8
42,8
42,8
Sumatorias
Np=6
N: número de datos exp
R2
χ2
RMSE
MPE
Ypred-Yexp (Ypred-Yexp)2 ABS(Ypre-Yexp)/Yexp
(Yexp-Yprom)2
0,41
0,17
0,01
27,8
0,35
0,12
0,01
19,7
1,03
1,07
0,02
16,2
0,95
0,90
0,03
39,3
-1,10
1,21
0,03
0,3
-0,28
0,08
0,01
1,0
-0,67
0,45
0,02
34,2
-0,73
0,53
0,01
70,7
0,77
0,59
0,02
1,6
0,81
0,66
0,02
1,7
0,58
0,34
0,01
1,2
-1,31
1,71
0,03
0,6
-0,70
0,49
0,02
0,0
0,12
8,32
0,23
214,30
13
0,961
1,189
0,800
1,737
c)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-ET; gET %ms)
CAO-ET
Ypred
69,5
55,4
68,6
53,7
60,5
62,4
51,9
72,3
60,6
60,6
60,6
60,6
60,6
sumatorias
Np=6
N: número de datos exp
R2
χ2
RMSE
MPE
Ypred-Yexp
(Ypred-Yexp)2 ABS(Ypre-Yexp)/Yexp (Yexp-Yprom)2
0,62
0,38
0,01
57,0
0,49
0,24
0,01
40,9
1,42
2,01
0,02
33,6
1,35
1,82
0,03
81,1
-1,63
2,66
0,03
0,6
-0,36
0,13
0,01
2,0
-0,98
0,97
0,02
70,9
-1,10
1,22
0,02
146,5
1,06
1,12
0,02
3,3
1,12
1,25
0,02
3,5
0,81
0,65
0,01
2,5
-1,92
3,69
0,03
1,3
-1,06
1,12
0,02
0,1
-0,19
17,25
0,23
443,30
13
0,961
2,464
1,152
1,756
d)- variable dependiente: Solubilidad (S; %)
Ypred
92,9
97,2
93,8
94,6
95,6
96,8
94,8
91,2
94,8
94,8
94,8
94,8
sumatorias
Np=6
N: número de datos exp
R2
χ2
RMSE
MPE
S
Ypred-Yexp (Ypred-Yexp)2
-0,41
0,17
0,22
0,05
0,00
0,00
0,63
0,40
-0,38
0,14
0,20
0,04
-0,50
0,25
0,33
0,11
-0,72
0,52
0,58
0,33
-0,07
0,01
0,33
0,11
0,20
2,13
12
0,92762222
0,35513363
0,42138678
0,38576537
ABS(Ypre-Yexp)/Yexp
0,00
0,00
0,00
0,01
0,00
0,00
0,01
0,00
0,01
0,01
0,00
0,00
0,05
(Yexp-Yprom)2
1,8
5,3
0,7
0,5
1,8
3,8
0,4
14,1
0,7
0,2
0,0
0,0
29,44
Cuadro D.11. Datos crudos de determinación de humedad (CH, %bh)
Muestra
NºCrisol
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
S13
Peso Crisol Crisol + Mh Crisol + Ms Peso Mh
19,0094
21,0153
20,8608
2,0059
1,8514
7,7023
21
22
23
18,9833
18,6367
18,1001
20,9893
20,6370
20,1008
20,8347
20,4961
19,9603
2,0060
2,0003
2,0007
1,8514
1,8594
1,8602
7,7069
7,0439
7,0225
28
19,2766
21,2726
21,1982
1,9960
1,9216
3,7275
27
859
860
19,1006
36,3850
37,5366
21,1075
38,3806
39,5352
21,0354
38,2934
39,4448
2,0069
1,9956
1,9986
1,9348
1,9084
1,9082
3,5926
4,3696
4,5232
815
36,9073
38,9037
38,8408
1,9964
1,9335
3,1507
24
21
27
18,2105
18,9826
19,1017
20,2185
20,4032
20,5157
20,1550
20,2518
20,3669
2,0080
1,4206
1,4140
1,9445
1,2692
1,2652
3,1624
10,6575
10,5233
25
18,5081
20,5064
20,3657
1,9983
1,8576
7,0410
26
842
858
19,0716
36,8387
36,3960
21,0747
38,8381
38,3956
20,9315
38,7574
38,3155
2,0031
1,9994
1,9996
1,8599
1,9187
1,9195
7,1489
4,0362
4,0058
841
36,7338
38,7349
38,6614
2,0011
1,9276
3,6730
852
836
849
37,4838
36,4564
38,1236
39,4835
38,4583
40,1233
39,4142
38,3907
40,0528
1,9997
2,0019
1,9997
1,9304
1,9343
1,9292
3,4655
3,3768
3,5255
828
36,8941
38,8895
38,7777
1,9954
1,8836
5,6029
844
831
816
37,0971
36,1797
36,4399
39,1044
38,1717
38,4427
38,9903
38,0872
38,3557
2,0073
1,9920
2,0028
1,8932
1,9075
1,9158
5,6843
4,2420
4,3439
5
13,5446
14,5162
14,4806
0,9716
0,9360
3,6641
0,9130
0,8803
3,5816
Resumen de resultados de la determinación del contenido de humedad (CH, %bh)
Desviación Error
Estándar
NºMuestra Recuento Promedio Estándar
2
2
2
2
2
2
2
2
10
CH (%bh)
29
28
19,2768
20,1898
20,1571
Mh: muestra húmeda; Ms: muestra seca; CH: contenido de humedad
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9-13
Peso Ms
7,7
7,03
3,66
4,45
3,15
10,56
7,09
4,02
4,12
0,00325269
0,0151321
0,0953887
0,108612
0,00827315
0,0948937
0,0762968
0,021496
0,865548
0,0023
0,0107
0,06745
0,0768
0,00585
0,0671
0,05395
0,0152
0,27371
Cuadro D.12. Datos crudos de determinación de densidad bruta (db; g/mL)
Muestra
Peso (g)
1,9994
S1
1,9998
S1
2,0014
S1
2,0004
S2
2,0041
S2
2,0021
S2
2,0008
S3
1,9977
S3
1,9994
S3
2,0004
S4
2,0054
S4
1,9984
S4
2,0004
S5
2,0015
S5
1,9993
S5
1,9986
S6
1,9984
S6
2,0004
S6
2,0007
S7
2,0010
S7
2,0001
S7
1,9999
S8/2
2,0009
S8/2
1,9995
S8/2
1,9976
S9
2,0005
S9
2,0030
S9
1,9990
S10
2,0008
S10
1,9998
S10
1,9981
S11
1,9992
S11
1,9996
S11
1,9969
S12
2,0009
S12
1,9967
S12
1,9977
S13
2,0022
S13
2,0004
S13
CV(%): coeficiente de variación
Volumen (mL)
6,9
6,8
6,9
5,9
6,1
6,0
8,7
8,9
8,9
6,3
6,5
6,4
7,0
7,0
7,2
4,4
4,4
4,4
5,7
5,6
5,5
7,9
8,1
8,0
7,7
8,0
7,9
8,0
8,3
8,4
8,0
8,1
7,9
6,9
7,1
7,1
7,3
7,5
7,5
Densidad
0,2898
0,2941
0,2901
0,3391
0,3285
0,3337
0,2300
0,2245
0,2247
0,3175
0,3085
0,3123
0,2858
0,2859
0,2777
0,4542
0,4542
0,4546
0,3510
0,3573
0,3637
0,2532
0,2470
0,2499
0,2594
0,2501
0,2535
0,2499
0,2411
0,2381
0,2498
0,2468
0,2531
0,2894
0,2818
0,2812
0,2737
0,2670
0,2667
CV %
0,8290
1,5746
1,3833
1,4460
1,6661
0,0551
1,7707
1,2257
1,8613
2,5254
1,2612
1,6054
1,4633
Resumen de resultados de la determinación de la densidad (db; g/mL)
X1
X2
Muestra
N° replicas
200
200
240
240
248,2
191,8
220
220
220
220
220
220
220
2,05
12,05
2,05
12,05
7,05
7,05
14,10
0,00
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
S13
s9-13 prom
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Media
0,291
0,334
0,226
0,313
0,283
0,454
0,357
0,250
0,254
0,243
0,250
0,284
0,269
0,260
Densidad
Error Standard
0,001
0,003
0,002
0,003
0,003
0,000
0,004
0,002
0,003
0,004
0,002
0,003
0,002
0,007
Cuadro D.13. Análisis de correlación entre contenido de humedad (CH) y densidad (db)
MUESTRA
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8/2
S9
S10
S11
S12
S13
s9-13 prom
N° de replicas
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
db (g/L)
0,291
0,334
0,226
0,313
0,283
0,454
0,357
0,250
0,254
0,243
0,250
0,284
0,269
0,260
CH (%bh)
7,7
7,03
3,66
4,45
3,16
10,59
7,09
4,02
3,57
3,45
5,64
4,29
3,62
4,114
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
-----------------------------------------------------------------------Variables: CH (%bh) y db (g/mL)
-----------------------------------------------------------------------Error
Estadístico
Parámetro
Estimación
estándar
T
P-Valor
-----------------------------------------------------------------------Ordenada
-3,82477
1,73134
-2,20913
0,0493
Pendiente
30,9853
5,79468
5,3472
0,0002
------------------------------------------------------------------------
Análisis de la Varianza
-----------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio Cociente-F
P-----------------------------------------------------------------------Modelo
43,2682
1
43,2682
28,59
0
Residuo
16,646
11
1,51327
-----------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
59,9142
12
Coeficiente de Correlación = 0,849806
R-cuadrado = 72,217 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 69,6913 porcentaje
Error estándar de est. = 1,23015
Error absoluto medio = 0,870794
Estadístico de Durbin-Watson = 1,3643 (P=0,0534)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,105101
Cuadro D.14. Determinación de parámetros de color
X1
200
200
200
200
200
200
240
240
240
240
240
240
248,2
248,2
248,2
191,8
191,8
191,8
220
220
220
220
220
220
220
220
220
220
220
220
220
220
220
220
220
220
X2
2,05
2,05
2,05
12,05
12,05
12,05
2,05
2,05
2,05
12,05
12,05
12,05
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
14,10
14,10
14,10
0,00
0,00
0,00
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
Polvo
s1
s1
s1
s2
s2
s2
s3
s3
s3
s4
s4
s4
s5
s5
s5
s6
s6
s6
s7
s7
s7
s8
s8
s8
s9
s9
s9
s10
s10
s10
s11
s11
s11
s12
s12
s12
Muestra
s1
s1
s1
s2
s2
s2
s3
s3
s3
s4
s4
s4
s5
s5
s5
s6
s6
s6
s7
s7
s7
s8
s8
s8
s9
s9
s9
s10
s10
s10
s11
s11
s11
s12
s12
s12
L*
58,44
58,50
58,56
58,70
58,62
58,54
60,56
60,58
60,55
62,45
62,46
62,48
58,92
58,86
59,00
50,19
50,10
49,99
59,85
59,76
59,68
58,59
58,60
58,50
60,82
60,72
61,06
61,54
61,52
61,49
61,75
61,77
61,77
58,20
58,18
58,06
a*
-1,13
-1,04
-1,20
-1,30
-1,35
-1,34
-1,86
-1,94
-1,94
-2,28
-2,22
-2,28
-1,84
-1,91
-1,76
1,17
1,06
1,04
-1,92
-1,93
-2,02
-1,34
-1,23
-1,32
-2,47
-2,56
-2,55
-2,01
-2,12
-1,98
-1,97
-1,93
-1,99
-1,64
-1,77
-1,73
b*
24,95
24,97
24,98
24,63
24,55
24,47
25,33
25,34
25,31
24,87
24,85
24,81
24,63
24,56
24,49
24,10
24,10
24,10
24,83
24,87
24,88
24,96
24,98
24,96
24,56
24,60
24,81
25,19
25,22
25,23
25,15
25,17
25,16
24,83
24,84
24,87
Resumen de resultados de la determinación de los parámetros de color
Muestra
s1
s2
s3
s4
s5
s6
s7
s8
s9-12
L*
58,50±0,035
58,62±0,046
60,56±0,009
62,46±0,009
58,93±0,041
50,09±0,058
59,76±0,049
58,56±0,032
60,57±0,434
a*
-1,12±0,046
-1,33±0,015
-1,91±0,027
-2,26±0,02
-1,84±0,043
1,09±0,04
-1,96±0,032
-1,30±0,034
-2,06±0,09
b*
24,97±0,01
24,55±0,05
25,33±0,01
24,84±0,02
24,56±0,04
24,10±0,00
24,86±0,01
24,97±0,01
24,97±0,07
Cuadro D.15. Datos crudos de determinación de ganancia de humedad de los diferentes
polvos, almacenados a 22 °C y 84,34% de humedad relativa.
Muestra
S1
S1
S1
S2
S2
S2
S3
S3
S3
S4
S4
S4
S5
S5
S5
S6
S6
S6
S7
S7
S7
S8
S8
S8
S11
S11
S11
Frasco
44
32
10
16
22
26
20
24
46
42
45
35
17
11
48
36
33
15
18
52
13
19
27
21
34
7
1
0h
p(f+tapa) p(polvo)
4,4562
1,0028 5,4590
3,9277
1,0570 4,9847
4,0353
1,0645 5,0998
4,3881
1,0055 5,3936
5,2432
1,0175 6,2607
4,3380
1,0121 5,3501
4,2905
1,0180 5,3085
4,2479
1,0162 5,2641
4,2718
1,0128 5,2846
4,3436
1,0104 5,3540
4,0897
1,0056 5,0953
4,4479
1,0193 5,4672
5,1307
1,0104 6,1411
4,1393
1,0056 5,1449
4,4190
1,0193 5,4383
5,0569
1,0396 6,0965
3,9832
1,0659 5,0491
4,4463
1,1657 5,6120
4,0051
1,0030 5,0081
3,9219
1,0018 4,9237
4,5441
1,0025 5,5466
4,5223
1,0090 5,5313
4,0877
1,0283 5,1160
3,9985
1,0091 5,0076
4,0085
1,0470 5,0555
4,1443
1,0477 5,1920
4,3930
1,0170 5,4100
12 h
5,5376
5,0491
5,1713
5,4696
6,3233
5,4188
5,3902
5,3459
5,3613
5,4186
5,1802
5,5365
6,2170
5,2217
5,5520
6,1521
5,1051
5,6623
5,0758
4,9956
5,6196
5,6082
5,1966
5,0842
5,1268
5,2525
5,4866
24 h
48 h
72 h
P(F+tapa+muestra)
5,5908 5,6404 5,6831
5,0994 5,1599 5,1913
5,2169 5,2732 5,3050
5,5382 5,5652 5,5856
6,3677 6,4186 6,4460
5,4668 5,5134 5,5168
5,4358 5,4841 5,5135
5,3983 5,4485 5,4808
5,4141 5,4665 5,4951
5,467 5,5148 5,5203
5,2283 5,2733 5,2772
5,5841 5,6292 5,6549
6,2619 6,3196 6,3389
5,2724 5,3213 5,3503
5,5769 5,6239 5,6549
6,1969 6,2538 6,2809
5,1562 5,2162 5,2158
5,7124 5,7791 5,8111
5,1474 5,1789 5,2030
5,0414 5,0884 5,0896
5,6674 5,7116 5,7436
5,6597 5,7111 5,7420
5,2422 5,2953 5,3268
5,1326 5,1878 5,2182
5,1776 5,2272 5,2847
5,2955 5,3417 5,3702
5,5364 5,5880 5,6177
120 h
168 h
5,7057
5,2346
5,3490
5,6176
6,4859
5,5590
5,5545
5,5236
5,5337
5,5619
5,3203
5,6873
6,3778
5,3809
5,6810
6,3175
5,2615
5,8501
5,2364
5,1338
5,7941
5,7824
5,3757
5,2620
5,2898
5,4092
5,6532
5,7433
5,2633
5,3782
5,6538
6,511
5,5875
5,5835
5,5713
5,5635
5,5883
5,3459
5,7133
6,4057
5,4123
5,7107
6,3516
5,2927
5,9165
5,2603
5,1618
5,8016
5,8111
5,4021
5,2880
5,3173
5,4359
5,5889
Cuadro D.16. Planilla de cálculo de higroscopicidad (HG, %)
Muestra
S1
S1
S1
S2
S2
S2
S3
S3
S3
S4
S4
S4
S5
S5
S5
S6
S6
S6
S7
S7
S7
S8
S8
S8
S11
S11
S11
X1
200
200
200
200
200
200
240
240
240
240
240
240
248,2
248,2
248,2
191,8
191,8
191,8
220
220
220
220
220
220
220
220
220
X2
2,05
2,05
2,05
12,05
12,05
12,05
2,05
2,05
2,05
12,05
12,05
12,05
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
7,05
14,10
14,10
14,10
0,00
0,00
0,00
7,05
7,05
7,05
HG(12h)
0,0786
0,0644
0,0715
0,0760
0,0626
0,0687
0,0817
0,0818
0,0767
0,0646
0,0849
0,0693
0,0759
0,0768
0,1137
0,0556
0,0560
0,0503
0,0677
0,0719
0,0730
0,0769
0,0806
0,0766
0,0713
0,0605
0,0766
HG(%)
7,8
6,1
6,7
7,6
6,2
6,8
8,0
8,0
7,6
6,4
8,4
6,8
7,5
7,6
----5,3
5,3
4,3
6,7
7,2
7,3
7,6
7,8
7,6
6,8
5,8
7,5
Resumen de resultados para Higroscopicidad (HG; %)
HG (%)
Muestra
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
Recuento
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Valor medio
6,9
6,9
7,9
7,2
8,8
5,0
7,1
7,7
6,7
Error Estándar
0,50
0,41
0,13
0,61
1,22
0,33
0,19
0,07
0,49
Cuadro D.17. Valores medios de ganancia en peso
Función: G(t)=P(t)-P(t=0) (en g agua/g ms) a partir de tres replicas para el modelado de la
cinética de adsorción-Análisis de ajuste de modelos.
G(t)=P(t)-P(t=0)
t (h)
s1
0
12
24
48
72
120
168
456
480
528
0,00
0,07
0,12
0,18
0,21
0,25
0,28
0,34
0,34
0,34
s2
s3
s4
s5
s6
s7
s8
s9
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,17
0,08
0,07
0,09
0,05
0,07
0,08
0,07
0,22
0,13
0,12
0,13
0,10
0,13
0,13
0,12
0,26
0,18
0,17
0,18
0,16
0,17
0,18
0,17
0,28
0,21
0,18
0,21
0,18
0,19
0,21
0,21
0,32
0,25
0,22
0,24
0,22
0,23
0,26
0,23
0,35
0,29
0,24
0,27
0,27
0,25
0,28
0,23
0,39
0,35
0,29
0,32
0,33
0,29
0,35
0,32
0,40
0,35
0,29
0,34
0,33
0,29
0,35
0,32
0,40
0,36
0,31
0,33
0,33
0,30
0,35
0,33
Cuadro D.16. Análisis de Regresión No Lineal empleado en el modelado de la cinética de
adsorción y gráficos de ajuste de los modelos
Variable dependiente: G(t)=P(t)-P(t=0), g Agua/g ms). Estimaciones iniciales de parámetros: a = 0,1, b = 0,1, K1=
0,1 y K2 = 0,1. Funciones a estimar:
Modelo LOG: G=a*LOG10(t)+b
;
Modelo de Peleg: G= t / (k1 +k2*t)
Modelo Logarítmico-muestra S1:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados.
Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13
Resultados de la Estimación
Parámetro
a
B
Estimado
0,167437
-0,105002
Error Estándar
Asintótico
0,00468421
0,00991126
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Modelo
0,583067
Residuo
0,000432631
Total
0,5835
Total (Corr.)
0,0794
Gl
2
7
9
8
Intervalo Confianza a
Asintótico
Inferior
0,15636
-0,128439
95,0%
Superior
0,178513
-0,0815659
Cuadrado Medio
0,291534
0,0000618045
R-Cuadrada = 99,4551 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,3773 porciento
Error estándar del est. = 0,00786158
Error medio absoluto = 0,00595425
Modelo Logarítmico-muestra S2:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados.
Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13
Resultados de la Estimación
Parámetro
a
b
Estimado
0,139801
0,0247231
Error Estándar
Asintótico
0,0042042
0,0088956
Intervalo Confianza a
Asintótico
Inferior
0,12986
0,00368833
95,0%
Superior
0,149743
0,045758
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Modelo
0,919951
Residuo
0,000348506
Total
0,9203
Total (Corr.)
0,0554
Gl
2
7
9
8
Cuadrado Medio
0,459976
0,0000497866
R-Cuadrada = 99,3709 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,2811 porciento
Error estándar del est. = 0,00705596
Error medio absoluto = 0,00483894
Modelo Logarítmico-muestra S3:
Método de estimación: Marquardt La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados.
Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13
Resultados de la Estimación
Parámetro
A
B
Estimado
0,171647
-0,105817
Error Estándar
Asintótico
0,00343853
0,00727554
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Modelo
0,620767
Residuo
0,000233126
Total
0,621
Total (Corr.)
0,0832222
Gl
2
7
9
8
Intervalo Confianza a
Asintótico
Inferior
0,163516
-0,123021
95,0%
Superior
0,179778
-0,088613
Cuadrado Medio
0,310383
0,0000333037
R-Cuadrada = 99,7199 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,6799 porciento
Error estándar del est. = 0,00577093
Error medio absoluto = 0,00320606
Modelo Logarítmico-muestra S4:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados.
Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13
Resultados de la Estimación
Parámetro
A
B
Estimado
0,138017
-0,0716351
Error Estándar
Asintótico
0,00418317
0,00885112
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Modelo
0,450555
Residuo
0,000345029
Total
0,4509
Total (Corr.)
0,054
Gl
2
7
9
8
Intervalo Confianza a
Asintótico
Inferior
0,128125
-0,0925647
Cuadrado Medio
0,225277
0,0000492899
R-Cuadrada = 99,3611 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,2698 porciento
Error estándar del est. = 0,00702068
Error medio absoluto = 0,00572986
Modelo Logarítmico-muestra S5:
95,0%
Superior
0,147908
-0,0507055
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados.
Número de iteraciones: 4.Número de llamadas de la función: 13
Resultados de la Estimación
Parámetro
a
B
Error Estándar
Asintótico
0,00380809
0,00805748
Estimado
0,150661
-0,0729921
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Modelo
0,558614
Residuo
0,000285929
Total
0,5589
Total (Corr.)
0,0642222
Gl
2
7
9
8
Intervalo Confianza a
Asintótico
Inferior
0,141656
-0,0920451
95,0%
Superior
0,159665
-0,0539392
Cuadrado Medio
0,279307
0,000040847
R-Cuadrada = 99,5548 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,4912 porciento
Error estándar del est. = 0,00639117
Error medio absoluto = 0,00451704
Modelo Logarítmico-muestra S6:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados.
Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13
Resultados de la Estimación
Parámetro
a
b
Estimado
0,175497
-0,139228
Error Estándar
Asintótico
0,00521069
0,0110252
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Modelo
0,517965
Residuo
0,000535346
Total
0,5185
Total (Corr.)
0,0872889
Gl
2
7
9
8
Intervalo Confianza a
Asintótico
Inferior
0,163176
-0,165299
95,0%
Superior
0,187818
-0,113158
Cuadrado Medio
0,258982
0,0000764781
R-Cuadrada = 99,3867 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,2991 porciento
Error estándar del est. = 0,00874517
Error medio absoluto = 0,00565701
Modelo Logarítmico-muestra S7:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados.
Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13
Resultados de la Estimación
Intervalo Confianza a
95,0%
Error Estándar Asintótico
Parámetro Estimado
Asintótico
Inferior
Superior
a
0,133393
0,00587166
0,119509
0,147277
b
-0,0588668
0,0124238
-0,0882444
-0,0294892
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Modelo
0,45972
2
0,22986
Residuo
0,000679777
7
0,000097111
Total
0,4604
9
Total (Corr.)
0,0508
8
R-Cuadrada = 98,6619 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,4707 porciento
Error estándar del est. = 0,00985449
Error medio absoluto = 0,00755867
Modelo Logarítmico-muestra S8:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados.
Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13
Resultados de la Estimación
Intervalo Confianza a
95,0%
Error Estándar Asintótico
Parámetro Estimado
Asintótico
Inferior
Superior
a
0,168707
0,00341266
0,160637
0,176777
b
-0,100928
0,00722079
-0,118003
-0,0838539
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Modelo
0,61307
2
0,306535
Residuo
0,000229631
7
0,0000328044
Total
0,6133
9
Total (Corr.)
0,0804
8
R-Cuadrada = 99,7144 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,6736 porciento
Error estándar del est. = 0,00572751
Error medio absoluto = 0,00400022
Modelo Logarítmico-muestra S9:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados.
Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13
Resultados de la Estimación
Intervalo Confianza a
95,0%
Error Estándar Asintótico
Parámetro Estimado
Asintótico
Inferior
Superior
a
0,153798
0,00607878
0,139424
0,168172
b
-0,0916167
0,012862
-0,122031
-0,0612029
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Modelo
0,511071
2
0,255536
Residuo
0,000728579
7
0,000104083
Total
0,5118
9
Total (Corr.)
0,0673556
8
R-Cuadrada = 98,9183 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,7638 porciento
Error estándar del est. = 0,0102021
Error medio absoluto = 0,00586716
Modelo de Peleg -muestra S1:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos.
Número de iteraciones: 11. Número de llamadas de la función: 35
Resultados de la Estimación
Intervalo Confianza a
95,0%
Error Estándar Asintótico
Parámetro Estimado
Asintótico
Inferior
Superior
k1
145,606
4,40989
135,437
155,775
k2
2,6613
0,0267855
2,59954
2,72307
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Modelo
0,583328
2
0,291664
Residuo
0,00017193
8
0,0000214912
Total
0,5835
10
Total (Corr.)
0,12981
9
R-Cuadrada = 99,8676 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,851 porciento
Error estándar del est. = 0,00463586
Error medio absoluto = 0,00349474
Modelo de Peleg -muestra S2:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos.
Número de iteraciones: 11. Número de llamadas de la función: 35
Resultados de la Estimación
Intervalo Confianza a
95,0%
Error Estándar Asintótico
Parámetro Estimado
Asintótico
Inferior
Superior
k1
55,4736
6,78881
39,8185
71,1287
k2
2,48656
0,0702923
2,32447
2,64866
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Modelo
0,917482
2
0,458741
Residuo
0,00281786
8
0,000352233
Total
0,9203
10
Total (Corr.)
0,14189
9
R-Cuadrada = 98,0141 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 97,7658 porciento
Error estándar del est. = 0,0187679
Error medio absoluto = 0,0143073
Modelo de Peleg -muestra S3:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados.
Número de iteraciones: 12. Número de llamadas de la función: 37
Resultados de la Estimación
Intervalo Confianza a
95,0%
Error Estándar Asintótico
Parámetro Estimado
Asintótico
Inferior
Superior
k1
144,938
8,5353
125,255
164,62
k2
2,56245
0,0508323
2,44523
2,67966
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Modelo
0,620299
2
0,31015
Residuo
0,000700557
8
0,0000875696
Total
0,621
10
Total (Corr.)
0,137
9
R-Cuadrada = 99,4886 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,4247 porciento
Error estándar del est. = 0,00935786
Error medio absoluto = 0,00632452
Modelo de Peleg -muestra S4:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos.
Número de iteraciones: 12. Número de llamadas de la función: 38
Resultados de la Estimación
Intervalo Confianza a
95,0%
Error Estándar Asintótico
Parámetro Estimado
Asintótico
Inferior
Superior
k1
147,846
11,9022
120,399
175,292
k2
3,12156
0,0787294
2,94001
3,30311
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Modelo
0,450019
2
0,22501
Residuo
0,000880827
8
0,000110103
Total
0,4509
10
Total (Corr.)
0,09369
9
R-Cuadrada = 99,0598 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,9423 porciento
Error estándar del est. = 0,010493
Error medio absoluto = 0,00768996
Modelo de Peleg -muestra S5:
Método de estimación: Marquardt
La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos.
Número de iteraciones: 12
Número de llamadas de la función: 38
Resultados de la Estimación
Parámetro
k1
k2
Estimado
131,018
2,81297
Error Estándar
Asintótico
10,1957
0,0681186
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Modelo
0,557887
Residuo
0,00101278
Total
0,5589
Total (Corr.)
0,11369
Gl
2
8
10
9
Intervalo Confianza a
Asintótico
Inferior
107,506
2,65589
95,0%
Superior
154,529
2,97005
Cuadrado Medio
0,278944
0,000126598
R-Cuadrada = 99,1092 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,9978 porciento
Error estándar del est. = 0,0112516
Error medio absoluto = 0,00788131
Modelo de Peleg -muestra S6:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos.
Número de iteraciones: 11. Número de llamadas de la función: 35
Resultados de la Estimación
Intervalo Confianza a
95,0%
Error Estándar Asintótico
Parámetro Estimado
Asintótico
Inferior
Superior
k1
194,618
10,1284
171,262
217,974
k2
2,63933
0,0517238
2,52005
2,7586
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Modelo
0,517995
2
0,258997
Residuo
0,000505364
8
0,0000631705
Total
0,5185
10
Total (Corr.)
0,13041
9
R-Cuadrada = 99,6125 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,564 porciento
Error estándar del est. = 0,00794799
Error medio absoluto = 0,00570312
Modelo de Peleg -muestra S7:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos.
Número de iteraciones: 11. Número de llamadas de la función: 35
Resultados de la Estimación
Intervalo Confianza a
95,0%
Error Estándar Asintótico
Parámetro Estimado
Asintótico
Inferior
Superior
k1
131,046
7,22075
114,395
147,697
k2
3,17037
0,0518081
3,0509
3,28984
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Modelo
0,460003
2
0,230002
Residuo
0,000396596
8
0,0000495745
Total
0,4604
10
Total (Corr.)
0,09176
9
R-Cuadrada = 99,5678 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,5138 porciento
Error estándar del est. = 0,00704091
Error medio absoluto = 0,00424397
Modelo de Peleg -muestra S8:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados.
Número de iteraciones: 12. Número de llamadas de la función: 37
Resultados de la Estimación
Intervalo Confianza a
95,0%
Error Estándar Asintótico
Parámetro Estimado
Asintótico
Inferior
Superior
k1
141,37
7,40424
124,296
158,445
k2
2,60004
0,045133
2,49597
2,70412
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Modelo
0,612761
2
0,306381
Residuo
0,000538564
8
0,0000673205
Total
0,6133
10
Total (Corr.)
0,13369
9
R-Cuadrada = 99,5972 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,5468 porciento
Error estándar del est. = 0,00820491
Error medio absoluto = 0,00595865
Modelo de Peleg -muestra S9:
Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos.
Número de iteraciones: 12. Número de llamadas de la función: 38
Resultados de la Estimación
Intervalo Confianza a
95,0%
Error Estándar Asintótico
Parámetro Estimado
Asintótico
Inferior
Superior
k1
152,717
16,5203
114,621
190,813
k2
2,86149
0,101821
2,62669
3,09629
Análisis de Varianza
Fuente
Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Modelo
0,509903
2
0,254951
Residuo
0,00189748
8
0,000237185
Total
0,5118
10
Total (Corr.)
0,1118
9
R-Cuadrada = 98,3028 porciento
R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,0906 porciento
Error estándar del est. = 0,0154008
Error medio absoluto = 0,0103629
Cuadro D.18. Datos obtenidos a partir de la determinación de humedad para isotermas
Sal
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
Continúa
Muestra Replica
S1
1
S1
2
S1
3
S3
1
S3
2
S3
3
S1
1
S1
2
S1
3
S3
1
S3
2
S3
3
S1
1
S1
2
S1
3
S3
1
S3
2
S3
3
S1
1
S1
2
S1
3
S3
1
S3
2
S3
3
S1
1
S1
2
S1
3
S3
1
S3
2
S3
3
S1
1
S1
2
S1
3
S3
1
S3
2
S3
3
S1
1
S1
2
S1
3
S3
1
S3
2
PF
30,0030
31,1290
28,1813
26,2824
33,4471
32,1985
32,2699
30,5320
30,9785
45,6932
30,7615
29,5057
32,9210
29,4955
33,7078
45,5405
29,6185
31,3372
45,3794
34,7663
32,3725
32,5126
30,5421
29,4663
31,8649
28,2011
28,3917
29,7752
29,3826
40,0884
30,3628
33,2121
31,7779
34,6965
29,3924
29,6248
28,7808
29,7107
31,4875
30,1737
28,5688
PF + Mh
30,9734
32,0686
29,1432
27,0473
34,1265
32,8481
33,2368
31,5605
32,0245
46,7730
31,5513
30,5317
34,1219
30,5475
34,4505
46,5603
30,5894
32,0016
46,1540
35,5786
33,3911
33,2229
31,2794
30,3086
33,2896
29,4654
29,4714
30,4015
30,3048
40,8133
30,9332
33,7748
32,4550
35,1636
29,6860
29,9305
29,3992
30,2161
32,0714
30,6801
29,1385
P Mh
0,9704
0,9396
0,9619
0,7649
0,6794
0,6496
0,9669
1,0285
1,0460
1,0798
0,7898
1,0260
1,2009
1,0520
0,7427
1,0198
0,9709
0,6644
0,7746
0,8123
1,0186
0,7103
0,7373
0,8423
1,4247
1,2643
1,0797
0,6263
0,9222
0,7249
0,5704
0,5627
0,6771
0,4671
0,2936
0,3057
0,6184
0,5054
0,5839
0,5064
0,5697
PF + Ms
30,9437
32,0432
29,1162
27,0268
34,1107
32,8332
33,1783
31,5074
31,974
46,7181
31,5104
30,4773
33,9952
30,4386
34,3711
46,4418
30,4882
31,9335
46,0578
35,4813
33,2697
33,1371
31,1888
30,2101
33,1167
29,3044
29,3358
30,3188
30,1899
40,7035
30,8183
33,6613
32,3215
35,0727
29,6291
29,8722
29,2722
30,1141
31,9485
30,5786
29,0292
P Ms
0,9407
0,9142
0,9349
0,7444
0,6636
0,6347
0,9084
0,9754
0,9955
1,0249
0,7489
0,9716
1,0742
0,9431
0,6633
0,9013
0,8697
0,5963
0,6784
0,715
0,8972
0,6245
0,6467
0,7438
1,2518
1,1033
0,9441
0,5436
0,8073
0,6151
0,4555
0,4492
0,5436
0,3762
0,2367
0,2474
0,4914
0,4034
0,461
0,4049
0,4604
Continuación
7
8
8
8
8
8
8
1
1
1
S3
S1
S1
S1
S3
S3
S3
S7
S7
S7
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
36,4300
28,7333
32,3760
29,8696
34,6861
33,0056
29,5983
34,6979
30,3630
40,0887
37,0374
29,2207
33,0181
30,2903
35,0462
33,5026
29,9057
38,0454
34,1760
44,5223
0,6074
0,4874
0,6421
0,4207
0,3601
0,4970
0,3074
3,3475
3,8130
4,4336
36,9109
29,0851
32,8387
30,1764
34,9448
33,3675
29,8198
37,8935
34,0013
44,3213
0,4809
0,3518
0,4627
0,3068
0,2587
0,3619
0,2215
3,1956
3,6383
4,2326
1
S8
1
30,1742
32,0592
1,8850
31,9902
1,8160
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Continúa
S8
S8
S9
S9
S9
S7
S7
S7
S8
S8
S8
S9
S9
S9
S7
S7
S7
S8
S8
S8
S9
S9
S9
S7
S7
S7
S8
S8
S8
S9
S9
S9
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
29,5108
29,6269
31,4880
32,2739
33,0060
31,8655
28,3939
32,5143
32,3761
28,5690
29,7764
29,6201
28,2031
33,2138
32,3731
33,4550
28,7212
29,3936
31,7791
33,7080
31,3384
30,0087
30,7652
29,8700
29,7113
31,3102
36,0842
30,5440
32,9224
30,5339
29,4955
34,7675
31,1263
30,7816
34,0805
35,0642
34,9349
35,9112
32,9919
35,9741
34,5869
30,6243
31,8712
32,5186
30,2762
35,3297
36,6538
37,0944
31,7505
31,5564
33,8022
36,2486
33,4882
32,6505
32,7866
34,8614
34,0364
35,0181
38,3040
33,8174
35,1919
34,4135
32,3410
38,3972
1,6155
1,1547
2,5925
2,7903
1,9289
4,0457
4,5980
3,4598
2,2108
2,0553
2,0948
2,8985
2,0731
2,1159
4,2807
3,6394
3,0293
2,1628
2,0231
2,5406
2,1498
2,6418
2,0214
4,9914
4,3251
3,7079
2,2198
3,2734
2,2695
3,8796
2,8455
3,6297
31,0664
30,7426
33,9904
34,9669
34,8616
35,6634
32,7027
35,7526
34,4330
30,4850
31,7227
32,3478
30,1576
35,2058
36,2321
36,7650
31,4786
31,3480
33,6229
36,0088
33,3375
32,4209
32,6308
34,3448
33,5906
34,6390
38,0346
33,4226
34,9200
33,9738
32,0169
37,9852
1,5556
1,1157
2,5024
2,6930
1,8556
3,7979
4,3088
3,2383
2,0569
1,9160
1,9463
2,7277
1,9545
1,9920
3,8590
3,3100
2,7574
1,9544
1,8438
2,3008
1,9991
2,4122
1,8656
4,4748
3,8793
3,3288
1,9504
2,8786
1,9976
3,4399
2,5214
3,2177
Continuación
5
5
5
5
5
5
5
5
5
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
8
8
8
8
S7
S7
S7
S8
S8
S8
S9
S9
S9
S7
S7
S7
S8
S8
S8
S9
S9
S9
S7
S7
S7
S8
S8
S8
S9
S9
S9
S7
S7
S7
S8
S8
S8
S9
S9
S9
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
36,0832
33,7079
31,7774
29,8689
33,2128
31,3378
29,7762
29,5078
31,8644
28,7812
29,6193
32,5134
31,4882
30,5324
32,3759
33,0053
28,5697
30,0080
30,5435
40,0906
28,3934
30,1746
30,3638
32,3733
34,7677
29,6271
32,2775
32,9216
29,7112
29,3937
28,2026
31,3096
34,6987
33,4546
30,7662
29,4954
40,4238
37,3708
35,9626
32,2059
35,0075
33,7829
33,1845
33,4832
36,7980
32,9020
33,6462
36,5166
33,6183
32,6932
34,2916
35,5836
31,8788
33,0439
34,7481
44,5896
31,6125
32,4241
32,3678
34,1536
38,3999
33,7389
34,8877
34,8307
30,9475
31,0778
29,9538
32,9286
36,9100
36,1498
33,5936
31,6822
4,3406
3,6629
4,1852
2,3370
1,7947
2,4451
3,4083
3,9754
4,9336
4,1208
4,0269
4,0032
2,1301
2,1608
1,9157
2,5783
3,3091
3,0359
4,2046
4,4990
3,2191
2,2495
2,0040
1,7803
3,6322
4,1118
2,6102
1,9091
1,2363
1,6841
1,7512
1,6190
2,2113
2,6952
2,8274
2,1868
39,9325
36,9793
35,5238
31,9555
34,7997
33,4977
32,8336
33,0929
36,3391
32,4325
33,1811
36,0747
33,2781
32,3575
33,9960
35,2343
31,4508
32,6976
34,1533
43,9405
31,1419
31,9839
32,0054
33,8048
37,8500
33,1031
34,4635
34,4311
30,6642
30,7188
29,5057
32,5372
36,3981
35,4940
32,9683
31,2037
3,8493
3,2714
3,7464
2,0866
1,5869
2,1599
3,0574
3,5851
4,4747
3,6513
3,5618
3,5613
1,7899
1,8251
1,6201
2,2290
2,8811
2,6896
3,6098
3,8499
2,7485
1,8093
1,6416
1,4315
3,0823
3,4760
2,1860
1,5095
0,9530
1,3251
1,3031
1,2276
1,6994
2,0394
2,2021
1,7083
Cuadro D.19. Datos de contenido de humedad de equilibrio (CHe; g agua / g ms) –
Experiencia de isotermas
CHe (g agua / g ms)
Muestras
Sal
1
1
1
2
2
2
3
3
3
5
5
5
7
7
7
8
8
8
220 °C;
220 °C;
14,1 %MD
0 %MD
Sal
HR (%) aw
S7
ClLi
11,30 0,1130
ClLi
11,30 0,1130
ClLi
11,30 0,1130
Cl2Mg
32,78 0,3278
Cl2Mg
32,78 0,3278
Cl2Mg
32,78 0,3278
Mg(NO3)2
52,89 0,5289
Mg(NO3)2
52,89 0,5289
Mg(NO3)2
52,89 0,5289
Cl2Co
64,92 0,6492
Cl2Co
64,92 0,6492
Cl2Co
64,92 0,6492
ClNa
75,29 0,7529
ClNa
75,29 0,7529
ClNa
75,29 0,7529
ClK
84,34 0,8434
ClK
84,34 0,8434
ClK
84,34 0,8434
S8
0,048
0,048
0,047
0,065
0,067
0,068
0,109
0,100
0,099
0,128
0,120
0,117
0,165
0,169
0,171
0,265
0,297
0,271
220 °C;
7,05 %MD 2,05 %MD
S9
0,038
0,039
0,035
0,075
0,073
0,076
0,107
0,097
0,104
0,120
0,131
0,132
0,243
0,221
0,244
0,344
0,319
0,301
200 °C;
S1
0,036
0,036
0,040
0,063
0,061
0,062
0,075
0,095
0,084
0,115
0,109
0,103
0,178
0,183
0,194
0,322
0,284
0,280
240 °C;
2,05 %MD
S3
0,032
0,028
0,029
0,064
0,054
0,051
0,118
0,115
0,120
0,138
0,146
0,144
0,258
0,253
0,267
0,385
0,388
0,371
0,028
0,024
0,023
0,054
0,055
0,056
0,131
0,116
0,114
0,152
0,142
0,179
0,251
0,237
0,263
0,392
0,373
0,388
Análisis de regresión no lineal-Modelado de las isotermas de adsorción. (Aclaración: Para el ajuste de los
modelos, se utilizó el valor medio de CHe correspondiente a cada muestra).
a-Modelo de GAB para la muestra S8
R
V
V
e
a
a
g
r
r
r
i
i
a
e
a
a
w
Funci
Estim
xm
C
k
M
L
N
N
s
b
b
i
l
l
ón No lí
-------e depend
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ón
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=
= 1
= 0
a
o
0
,
,
n
i
e
e
e
n
a
n
d
l
te: s8 (2°
ientes:
analisis)
estimar: (xm*C*k*aw)/((1-k*aw)*(1-k*aw+C*k*aw))
nes del parámetro inicial:
,05
0
9
étodo de es
a estimació
úmero de it
úmero de ll
timac
n se
eracc
amada
ión: Ma
detuvo
iones:
s de fu
rquardt
debido a
7
nciones:
la
convergencia
de
la
suma
30
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------A
Asintótica
Inter
Parámetro
Estimado
Error Estándar
Infe
---------------------------------------------------------xm
0,0571172
0,0109951
0,022
C
10,0323
13,3457
-32,
k
0,982318
0,0377812
0,86
---------------------------------------------------------A
F
M
R
T
T
n
u
o
e
o
o
á
e
d
s
t
t
l
n
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a
a
i
t
l
d
l
l
s
e
o
u
-
is de Varianza
----------------------Suma de Cu
----------------------0,
os
0,0011
----------------------0,19
(Corr.)
0,05
R
R
E
E
E
A
r
r
s
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C
C
r
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r
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MAPE
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ME
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-
d
d
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o
o
á
o
c
l
= 9
(ad
ndar
luto
o Du
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apt
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536 p
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la M
n-Wat
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o
a
s
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s
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r
r
t
d
o
l
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r
1
5
2
2
a
1
2
2
7
d
9
3
7
7
a
6
3
4
4
j
.
,
0
,
1
e
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0193
,010
9335
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s de Residuos
-------------------------stimación
Validación
,
,
,
0
0
0
0
4
,
,
0
1
5
0
5
0
0
1
0
1
3
5
5
0
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7
1
6
2
0
4509
55
66879
97
de
-----------dos
Gl Cuad
-----------3
0
3
0,0
-----------6
5
9
5
5
5
0
6,756
22
155
r
,
0
-
a
0
0
-
d
6
3
-
o
3
7
-
-M
-86
45
--
porcentaje
,479932
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6
0
-
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8
9
-
s
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1
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-
i
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i
2
3
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-
n
l
o
5
9
8
-
t
o
r
9
7
1
-
b-Modelo de GAB para la muestra S9
R
V
V
e
a
a
g
r
r
r
i
i
a
e
a
a
w
Funci
Estim
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C
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M
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b
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,
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analisis)
estimar: (xm*C*k*aw)/((1-k*aw)*(1-k*aw+C*k*aw))
nes del parámetro inicial:
,05
0
9
étodo de es
a estimació
úmero de it
úmero de ll
timac
n se
eracc
amada
ión: Ma
detuvo
iones:
s de fu
rquardt
debido a
7
nciones:
la
convergencia
de
la
suma
31
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------A
Asintótica
Inter
Parámetro
Estimado
Error Estándar
Infe
---------------------------------------------------------xm
0,0406398
0,00304509
0,03
C
34,1069
46,5504
-114
k
1,02392
0,0126338
0,98
---------------------------------------------------------A
F
M
R
T
T
n
u
o
e
o
o
á
e
d
s
t
t
l
n
e
i
a
a
i
t
l
d
l
l
s
e
o
u
-
is de Varianza
-------------------Suma de
-------------------0
os
0,00
-------------------0
(Corr.)
0,
R
R
E
E
E
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r
r
s
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C
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r
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o
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o
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r
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4
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. = 0
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Lag
j
.
,
0
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1
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,004
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Validación
,
,
,
0
0
0
0
1
,
,
0
0
7
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0
7
0
5
3
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5
7
5
4
1
0
16609
515
15588
7
de
-----------dos
Gl Cuad
-----------3
0
3 0,00
-----------6
5
9
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5
6
0
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5515
,47544
r
,
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-
c-Modelo de GAB para la muestra S3
R
V
V
e
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r
r
r
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9
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amada
ión: Ma
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iones:
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debido a
7
nciones:
la
convergencia
de
las
estim
30
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------A
Asintótica
Inter
Parámetro
Estimado
Error Estándar
Infe
---------------------------------------------------------xm
0,0752455
0,0103464
0,042
C
2,56452
1,06776
-0,83
k
0,972109
0,0216037
0,90
---------------------------------------------------------A
F
M
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Resultados de la Estimación
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Asintótica
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Parámetro
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Infe
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0,0720921
0,0201417
0,0079
C
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2,48979
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k
0,979037
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,009
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0
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0
2
9
6
6
0
81863
6058
9
76802
9
e-Modelo de GAB para la muestra S7. En este caso los datos tuvieron que ser linealizados de la forma:
aw/X=b1+b2*aw+b3*aw^2
con:
xm= (1/(b2^2-4*b1*b3))^0,5;
c= -2/(b2*xm-1);
k= b3+xm/((1/c)-1)
S7
Sal
aw
1
2
3
5
7
8
CHe
0,1130
0,3278
0,5289
0,6492
0,7529
0,8434
0,048
0,067
0,103
0,122
0,168
0,278
aw/Che
2,371
4,917
5,152
5,336
4,473
3,037
A
V
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0,456
20,4867
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-20,2005
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o
0,24
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7
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-9,
---
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----
----
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3
61203 (P=0,0026)
Lag 1 = -0,369696
Resultado:
Constantes
b1
b2
b3
S7
0,305
20,487
-20,201
xm
0,05
c
71,10
k
0,97
2
R
0,9668
Estos valores de Xm, c y k se usaron como valores iniciales para volver a iterar:
Xm
C
K
R2
0,049
23,21
0,972
0,990
f-Modelo de BET para la muestra S8
R
V
V
e
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g
r
r
r
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0
,0
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cuad
93
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------A
Asintótica
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Parámetro
Estimado
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Infe
---------------------------------------------------------xm
0,0538902
0,00661817
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C
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,006
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,
,
,
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0
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Resultados de la Estimación
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Asintótica
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0,0449083
0,00264982
0,036
C
17,6956
18,2894
-40,
n
11,1577
1,86893
5,2
---------------------------------------------------------A
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,01
0
,0
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Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------A
Asintótica
Inter
Parámetro
Estimado
Error Estándar
Infe
---------------------------------------------------------xm
0,0656596
0,00952865
0,035
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3,49728
2,85138
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n
23,5052
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nes del parámetro inicial:
,1
0
,0
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úmero de it
úmero de ll
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n se
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0
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1
e
) =
0081
,005
6477
= -
s de Residuos
-------------------------stimación
Validación
,
,
,
,
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0
0
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0
0
0
0
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9
2
6
68025
964
7329
03
cuad
83
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------A
Asintótica
Inter
Parámetro
Estimado
Error Estándar
Infe
---------------------------------------------------------xm
0,0664035
0,00654092
0,045
C
3,46899
1,61313
-1,6
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20,9645
34,6275
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---------------------------------------------------------A
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o
4
6
-
-M
-25
80
--
e
6
2
-
porcentaje
dio
5
5
-
s
v
r
5
6
2
-
i
a
i
8
4
3
-
n
l
o
7
7
5
-
t
o
r
3
3
9
-
----ótica
s de
-----
-----
Cuadro D.20. Cálculo de errores-Modelado de las isotermas de adsorción
Tabla de medias usadas en el cálculo de errores
Sal
aw
1,00
2,00
3,00
5,00
7,00
8,00
0,113
0,3278
0,5289
0,6492
0,7529
0,8434
y promedio
Xm
Constantes
de GAB C
K
X
Constantes
C
de BET
N
S7
S8
S9
S1
S3
0,048
0,067
0,103
0,122
0,168
0,278
0,131
0,037
0,075
0,103
0,128
0,236
0,321
0,150
0,037
0,062
0,085
0,109
0,185
0,295
0,129
0,030
0,056
0,118
0,143
0,259
0,381
0,165
0,025
0,055
0,120
0,158
0,250
0,384
0,165
0,049
23,21
0,9712
0,044
14,45
13,98
0,057
10,03
0,982
0,054
12,76
22,89
0,041
34,11
1,024
0,045
17,69
11,16
0,072
2,75
0,979
0,065
3,49
23,5
0,075
2,56
0,9721
0,066
3,47
20,96
Muestra S7
Modelo GAB
ABS
(yex-ypre) (yex-ypre)2 (yex-ypre) (yex-yprom)2
0,007
0,000
0,144
0,007
0,001
0,000
0,013
0,004
0,006
0,000
0,057
0,001
-0,008
0,000
0,063
0,000
-0,011
0,000
0,066
0,001
0,009
0,000
0,034
0,022
sumatorias
0,000
0,377
0,035
Modelo BET
ABS
(yex-ypre) (yex-ypre)2 (yex-ypre) (yex-yprom)2
0,016
0,000
0,326
0,007
0,009
0,000
0,140
0,004
0,015
0,000
0,144
0,001
0,002
0,000
0,013
0,000
-0,001
0,000
0,005
0,001
0,006
0,000
0,021
0,022
sumatorias
0,001
0,649
0,035
R2
MPE
R2
MPE
0,990
6,285
0,983
10,818
Muestra S8
Modelo GAB
ABS
(yex-ypre) (yex-ypre)2 (yex-ypre) (yex-yprom)2
0,002
0,000
0,045
0,013
0,005
0,000
0,070
0,006
-0,006
0,000
0,058
0,002
-0,021
0,000
0,166
0,000
0,025
0,001
0,105
0,007
-0,004
0,000
0,012
0,029
sumatorias
0,001
0,455
0,058
Modelo BET
ABS
(yex-ypre) (yex-ypre)2 (yex-ypre) (yex-yprom)2
0,000
0,000
0,010
0,013
0,005
0,000
0,073
0,006
-0,004
0,000
0,044
0,002
-0,020
0,000
0,156
0,000
0,024
0,001
0,102
0,007
-0,007
0,000
0,023
0,029
sumatorias
0,001
0,408
0,058
R2
MPE
R2
MPE
0,980
7,577
0,981
6,795
Muestra S9
Modelo GAB
ABS
2
(yex-ypre) (yex-ypre) (yex-ypre) (yex-yprom)2
-0,001
0,000
0,015
0,008
0,004
0,000
0,059
0,004
-0,003
0,000
0,031
0,001
-0,012
0,000
0,106
0,000
0,008
0,000
0,041
0,003
-0,004
0,000
0,013
0,019
sumatorias
0,000
0,264
0,035
Modelo BET
ABS
2
(yex-ypre) (yex-ypre) (yex-ypre) (yex-yprom)2
0,002
0,000
0,059
0,009
0,002
0,000
0,032
0,005
-0,006
0,000
0,071
0,002
-0,014
0,000
0,124
0,000
0,012
0,000
0,066
0,002
-0,001
0,000
0,004
0,020
sumatorias
0,000
0,357
0,038
R2
MPE
R2
MPE
0,994
4,407
0,990
5,943
Muestra S1
Modelo GAB
ABS
(yex-ypre) (yex-ypre)2 (yex-ypre) (yex-yprom)2
0,009
0,000
0,304
0,018
-0,004
0,000
0,064
0,012
0,006
0,000
0,052
0,002
-0,021
0,000
0,146
0,000
0,017
0,000
0,065
0,009
-0,002
0,000
0,006
0,047
sumatorias
0,001
0,637
0,089
Modelo BET
ABS
(yex-ypre) (yex-ypre)2 (yex-ypre) (yex-yprom)2
0,007
0,000
0,240
0,018
-0,005
0,000
0,081
0,012
0,008
0,000
0,066
0,002
-0,018
0,000
0,124
0,000
0,020
0,000
0,077
0,009
0,000
0,000
0,000
0,047
sumatorias
0,001
0,589
0,089
R2
MPE
R2
MPE
0,990
10,621
0,990
9,814
Muestra S3
Modelo GAB
ABS
(yex-ypre) (yex-ypre)2 (yex-ypre) (yex-yprom)2
0,005
0,000
0,191
0,020
-0,005
0,000
0,091
0,012
0,008
0,000
0,063
0,002
-0,008
0,000
0,050
0,000
0,006
0,000
0,022
0,007
0,001
0,000
0,002
0,048
sumatorias
0,000
0,419
0,089
Modelo BET
ABS
(yex-ypre) (yex-ypre)2 (yex-ypre) (yex-yprom)2
0,002
0,000
0,088
0,020
-0,007
0,000
0,122
0,012
0,009
0,000
0,074
0,002
-0,005
0,000
0,032
0,000
0,008
0,000
0,034
0,007
0,000
0,000
0,001
0,048
sumatorias
0,000
0,349
0,089
R2
MPE
R2
MPE
0,998
6,982
0,997
5,823
Nota D.3. Modo de cálculo de fracción de agua (ww; g agua/g totales) y fracción de sólidos secos (ws; g
solidos secos/g totales); empleados en el modelado de temperatura de transición vítrea.
Dato: CHbs=11,2% entonces: (100 +11,2)g---------------------11,2 g agua
100 g sólidos secos-----------x=100*11,2/111,2 = 10,0719 %
Entonces ww=10,0719/100=0,1007
ws=1-ww=1-0,1007= 0,8993 g sólidos secos/g totales
ws=1-(CHbs/(100 + CHbs))
Cuadro D.21. Datos de contenidos de humedad (CH), y fracciones de agua (ww) y de
sólidos secos (ws), basados en nota D.3.
Muestra
PPF
PPF+MH PPF+MS MH
MS
CH(bh)
CH(bs)
ww
ws
sal3-muestra9 32,3726 32,8535 32,7997 0,4809 0,4271
0,112
0,13
0,112
0,888
sal2-muestra9 30,3626 31,0879 31,0358 0,7253 0,6732
0,07
0,08
0,072
0,928
sal1-muestra9 29,6202
30,26 30,2329 0,6398 0,6127
0,04
0,04
0,042
0,958
sal3-muestra8 33,2121 34,1507 34,0479 0,9386 0,8358
0,11
0,12
0,110
0,890
sal2-muestra8 29,4655 30,3397 30,2659 0,8742 0,8004
0,08
0,09
0,084
0,916
sal1-muestra8 31,1345 31,6836 31,6579 0,5491 0,5234
0,05
0,05
0,047
0,953
sal3-muestra7 44,1681 45,3796 45,2634 1,2115 1,0953
0,10
0,11
0,096
0,904
sal2-muestra7
29,777 30,6788 30,6186 0,9018 0,8416
0,07
0,07
0,067
0,933
sal1-muestra7 29,8701 30,8855 30,8407 1,0154 0,9706
0,04
0,05
0,044
0,956
sal3-muestra3
45,52 46,3312 46,2369 0,8112 0,7169
0,12
0,13
0,116
0,884
sal2-muestra3 40,0902 40,5724 40,5311 0,4822 0,4409
0,09
0,09
0,086
0,914
sal1-muestra3 29,3852 30,1169 30,0821 0,7317 0,6969
0,05
0,05
0,048
0,952
sal3-muestra1 31,3097 32,4231 32,3013 1,1134 0,9916
0,11
0,12
0,109
0,891
sal2-muestra1 28,5253 29,3855 29,319 0,8602 0,7937
0,08
0,08
0,077
0,923
sal1-muestra1 30,7647 31,7031 31,6538 0,9384 0,8891
0,05
0,06
0,053
0,947
PPF: peso del pocillo; PPF+MH: peso del pocillo más peso de la muestra húmeda; PPF+MS: peso del
pocillo mas peso de la muestra seca; MH: muestra húmeda; MS: muestra seca.
Cuadro D22. Datos de lecturas de temperaturas de transición vítrea
Para transición vítrea (Tg; os: onset; mp: midpoint) y actividad acuosa muestras de mate soluble puro y
formulado con diferentes porcentajes de maltodextrina (%MD); obtenidas a diferentes
temperaturas de entrada de aire (Ti).
X1
(Ti;°C)
220
220
220
200
240
220
220
220
200
240
220
220
220
200
240
X2
(%MD;
%p/v)
7,05
0,00
14,10
2,05
2,05
7,05
0,00
14,10
2,05
2,05
7,05
0,00
14,10
2,05
2,05
Muestra
9
8
7
3
1
9
8
7
3
1
9
8
7
3
1
Sal
aw
3
3
3
3
3
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
0,555
0,528
0,52
0,513
0,524
0,461
0,44
0,469
0,425
0,436
0,411
0,416
0,443
0,406
0,404
aw del
desecador
(25°C)
0,5289
0,5289
0,5289
0,5289
0,5289
0,3278
0,3278
0,3278
0,3278
0,3278
0,113
0,113
0,113
0,113
0,113
Tg os (°C)
Tg mp (°C)
14,87
15,38
27,60
12,18
31,60
31,39
30,83
36,25
29,02
34,53
42,88
39,20
52,09
42,82
47,04
28,40
35,92
39,82
22,77
40,39
37,10
37,28
41,26
35,29
41,67
47,33
43,61
60,54
46,97
51,17
Cuadro D.23. Resumen de datos empleados en el modelado de la ecuación de Gordon y
Taylor
Muestra
8
8
8
9
9
9
7
7
7
3
3
3
1
1
1
X1 (°C)
X2 (%MD) aw muestra
220
0
220
0
220
0
0,528
0,44
0,416
15,38
30,83
39,20
0,11
0,08
0,05
0,89
0,92
0,95
220
220
220
220
220
220
200
200
200
240
240
240
0,555
0,461
0,411
0,52
0,469
0,443
0,513
0,425
0,406
0,524
0,436
0,404
14,87
31,39
42,88
27,60
36,25
52,09
12,18
29,02
42,82
31,60
34,53
47,04
0,11
0,07
0,04
0,10
0,07
0,04
0,12
0,09
0,05
0,11
0,08
0,05
0,89
0,93
0,96
0,90
0,93
0,96
0,88
0,91
0,95
0,89
0,92
0,95
7,05
7,05
7,05
14,1
14,1
14,1
2,05
2,05
2,05
2,05
2,05
2,05
Tgos
ww
ws
Cuadro D.24. Análisis de regresión no lineal-Modelo de Gordon y Taylor
a-Modelado G-T para muestra S8
Variable dependiente: Tgos
Variables independientes:
ws
ww
(°C)
Funci
Estim
Tg
k
+ k*ww*(-135))/(ws+k*ww)
inicial:
M
L
N
N
ón a estimar: (ws*Tgs
aciones del parámetro
s = 0,1
= 0,1
étodo de es
a estimació
úmero de it
úmero de ll
timac
n se
eracc
amada
ión: Ma
detuvo
iones:
s de fu
para
rquardt
debido a
4
nciones:
la
muestras
del
convergencia
polvo
de
las
8
estim
13
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------A
Asintótica
Inter
Parámetro
Estimado
Error Estándar
Infe
---------------------------------------------------------Tgs
63,155
8,3387
-42,
k
2,46605
0,589376
-5,0
---------------------------------------------------------A
F
M
R
T
T
n
u
o
e
o
o
á
e
d
s
t
t
l
n
e
i
a
a
i
t
l
d
l
l
s
e
o
u
-
is de Varianza
----------------------Suma de Cu
----------------------271
os
10,
----------------------272
(Corr.)
292
R
R
E
E
E
A
r
r
s
u
C
C
r
r
t
t
u
u
o
o
a
o
a
a
r
r
d
c
dra
dra
Es
ab
íst
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Análisi
------E
n
3
MSE
1
MAE
1
MAPE
7
ME
MPE
-
d
d
t
s
i
e
o
o
á
o
c
l
= 9
(ad
ndar
luto
o Du
ació
6,3
apt
de
de
rbi
n r
271 p
ado p
la E
la M
n-Wat
esidu
o
a
s
e
s
a
r
r
t
d
o
l
centa
a g.l
. = 3
ia =
n = 2
Lag
a
2
7
3
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,
2
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r
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6
6
5
a
5
6
7
1
j
.
,
1
,
1
e
) =
2751
,780
9917
= -
s de Residuos
-------------------------stimación
Validación
0
,
,
0
1
,
7
1
,
,
7
8
1
0
3
2
0
5
0
5
6
6
8
4
4
6
2
4
52185
91
----------dos
Gl Cua
----------2
1
----------3
2
---drad
---13
10
----
o
5
,
-
-M
-6,
72
--
e
4
6
-
92,6543 porcentaje
6
62
9
0,665054
dio
7
6
-
s
v
r
7
2
-
i
a
i
9
2
-
n
l
o
8
6
-
b-Modelado G-T para muestra S9
R
V
V
e
a
a
g
r
r
r
i
i
w
w
e
a
a
s
w
Funci
Estim
Tg
k
M
L
N
N
s
b
b
i
l
l
ón No lí
-------e depend
es indep
n
i
e
e
e
n
a
n
d
l
te: Tgos
ientes:
ón a estimar: (ws*Tgs
aciones del parámetro
s = 0,1
= 0,1
étodo de es
a estimació
úmero de it
úmero de ll
timac
n se
eracc
amada
ión: Ma
detuvo
iones:
s de fu
(°C)
para
polvo
9
+ k*ww*(-135))/(ws+k*ww)
inicial:
rquardt
debido a
4
nciones:
la
convergencia
de
las
estim
13
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------A
Asintótica
Inter
Parámetro
Estimado
Error Estándar
Infe
---------------------------------------------------------Tgs
61,9543
1,90977
37,
k
2,51444
0,147022
0,64
---------------------------------------------------------A
F
M
R
T
T
n
u
o
e
o
o
á
e
d
s
t
t
l
n
e
i
a
a
i
t
l
d
l
l
s
e
o
u
-
is de Varianza
----------------------Suma de Cu
----------------------304
os
0,91
----------------------304
(Corr.)
396
R
R
E
E
E
A
r
r
s
u
C
C
r
r
t
t
u
u
o
o
a
o
a
a
r
r
d
c
dra
dra
Es
ab
íst
orr
Análisi
------E
n
3
MSE
0
MAE
0
MAPE
2
ME
MPE
-
d
d
t
s
i
e
o
o
á
o
c
l
= 9
(ad
ndar
luto
o Du
ació
9,7
apt
de
de
rbi
n r
693 p
ado p
la E
la M
n-Wat
esidu
o
a
s
e
s
a
r
r
t
d
o
l
centa
a g.l
. = 0
ia =
n = 2
Lag
a
4
4
5
,
d
,
7
,
4
r
2
8
1
9
a
3
3
4
7
j
.
,
0
,
1
e
) =
9564
,521
9998
= -
s de Residuos
-------------------------stimación
Validación
,
,
,
0
0
9
5
0
,
,
1
2
0
0
3
4
1
5
0
5
7
2
5
1
0
8
3
1
8
9
3
1
6749
57
----------dos
Gl Cua
----------2
1
----------3
2
9
4
2
9
0
9,5386
3
31
,668219
---drad
---15
0,9
----
o
2
1
-
-M
-2,
47
--
e
1
8
-
porcentaje
dio
1
3
-
s
v
r
6
6
-
i
a
i
8
3
-
n
l
o
8
4
-
c-Modelado G-T para muestra S7
R
V
V
e
a
a
g
r
r
r
i
i
w
w
e
a
a
s
w
Funci
Estim
Tg
k
M
L
N
N
s
b
b
i
l
l
ón No lí
-------e depend
es indep
n
i
e
e
e
n
a
n
d
l
te: Tgos
ientes:
ón a estimar: (ws*Tgs
aciones del parámetro
s = 0,1
= 0,1
étodo de es
a estimació
úmero de it
úmero de ll
timac
n se
eracc
amada
ión: Ma
detuvo
iones:
s de fu
(°C)
para
polvo
7
+ k*ww*(-135))/(ws+k*ww)
inicial:
rquardt
debido a
4
nciones:
la
convergencia
de
las
estim
13
Resultados de la Estimación
---------------------------------------------------------A
Asintótica
Inter
Parámetro
Estimado
Error Estándar
Infe
---------------------------------------------------------Tgs
69,9937
5,48073
0,35
k
2,42771
0,418282
-2,8
---------------------------------------------------------A
F
M
R
T
T
n
u
o
e
o
o
á
e
d
s
t
t
l
n
e
i
a
a
i
t
l
d
l
l
s
e
o
u
-
is de Varianza
----------------------Suma de Cu
----------------------47
os
6,
----------------------478
(Corr.)
308
R
R
E
E
E
A
r
r
s
u
C
C
r
r
t
t
u
u
o
o
a
o
a
a
r
r
d
c
dra
dra
Es
ab
íst
orr
Análisi
------E
n
3
MSE
6
MAE
1
MAPE
3
ME
0
MPE
0
d
d
t
s
i
e
o
o
á
o
c
l
= 9
(ad
ndar
luto
o Du
ació
7,8
apt
de
de
rbi
n r
964 p
ado p
la E
la M
n-Wat
esidu
o
a
s
e
s
a
r
r
t
d
o
l
centa
a g.l
. = 2
ia =
n = 2
Lag
a
8
4
9
,
d
2
8
,
4
r
,
9
1
9
a
7
6
9
6
j
.
,
1
,
1
e
) =
5474
,385
9919
= -
s de Residuos
-------------------------stimación
Validación
,
,
,
,
,
4
3
8
0
0
8
8
9
0
8
9
5
4
3
3
6
0
4
5
3
7
8
4524
821
----------dos
Gl Cua
----------2
1
----------3
2
---drad
---23
6
----
o
9
,
-
-M
-1,
48
--
e
3
9
-
95,7927 porcentaje
7
07
8
0,665127
dio
5
6
-
s
v
r
4
8
-
i
a
i
3
7
-
n
l
o
5
0
-
Cuadro D.25. Cálculo de errores-Modelado de Gordon y Taylor
sal
3
2
1
Aw
y exp
0,555 15,38
0,528 30,83
0,520 39,2
sal Aw
3 0,555
2 0,528
1 0,52
sal Aw
3 0,555
2 0,528
1 0,52
y exp
14,87
31,39
42,88
y exp
27,60
36,25
52,09
ypred
17,04
26,44
41,75
ypred
14,58
29,87
42,24
ypred
28,01
39,66
49,34
Muestra S8 (220°C; 0 %MD)
yexp-ypred yexp-ypred)^2 ABS(yexp-ypred) (yexp-yprom)^2
-1,657
2,745
0,108
171,348
4,387
19,248
0,142
5,570
-2,549
6,496
0,065
115,133
sumatorias
28,489
R2
MPE
0,902
10,502
0,315
292,051
Muestra S9 (220°C; 7,05 %MD)
yexp-ypred yexp-ypred)^2 ABS(yexp-ypred) (yexp-yprom)^2
0,292
0,085
0,020
220,325
1,519
2,307
0,048
2,811
0,638
0,406
0,015
173,361
sumatorias
2,799
R2
MPE
0,993
2,764
0,083
396,497
Muestra S7 (220°C; 14,1 %MD)
yexp-ypred yexp-ypred)^2 ABS(yexp-ypred) (yexp-yprom)^2
-0,410
0,168
0,015
466,981
-3,412
11,645
0,094
148,936
2,753
7,579
0,053
9,623
sumatorias
R2
MPE
19,392
0,969
5,395
0,162
625,540
Cuadro D.26. Datos empleados en el ANOVA de efecto simple del factor X2 (%MD) sobre
la Tgs predicha por el modelo de Gordon y Taylor.
Muestra-sal
8-3
8-2
8-1
9-3
9-2
9-1
7-3
7-2
7-1
X1
X2
220
220
220
220
220
220
220
220
220
Tgs predicha
0
0 -0
7,05
7,05
7,05
14,1
14,1
14,1
61,0
60,3
62,3
63,8
62,7
69,5
66,0
73,1
Tabla ANOVA para Tgspred según X2 (%MD; %p/v)
Análisis de la Varianza
---------------------------------------------------------------------------Fuente
Sumas de cuad.
Gl Cuadrado Medio Cociente-F
P-Val
---------------------------------------------------------------------------Entre grupos
112,1
2
56,0502
10,51
0,016
Intra grupos
26,6583
5
5,33167
---------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
138,759
7
Como pv resultó menor a 0,05, hay diferencias significativas entre las medias de Tgs predichas entre los
niveles del factor X2.
Contraste Múltiple de Rango para Tgspred según X2 (% MD; %p/v)
-------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSD
X2
Frec.
Media
Grupos homogéneos
-------------------------------------------------------------------------------0
2
60,65
X
7,05
3
62,9333
X
14,1
3
69,5333
X
-------------------------------------------------------------------------------Contraste
Diferencias
+/- Límites
-------------------------------------------------------------------------------0 - 7,05
-2,28333
5,41843
0 - 14,1
*-8,88333
5,41843
7,05 - 14,1
*-6,6
4,84639
-------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.