modalidades y tipos de sondas. Aplicaciones principales. Dr

Técnicas de hibridación
Concepto, modalidades
y tipos de sondas
Aplicaciones principales
Federico Rojo
Fundación Jiménez Díaz
Guión de la presentación
• Alteraciones estructurales del DNA y
cáncer
• Hibridación in situ: concepto y tipos de
sondas
• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y
predicción
• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones
y de alteraciones numéricas
Guión de la presentación
• Alteraciones estructurales del DNA y
cáncer
• Hibridación in situ: concepto y tipos de
sondas
• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y
predicción
• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones
y de alteraciones numéricas
Alteraciones estructurales del DNA en cáncer
Cell extrinsic mechanisms:
• Radiation
• Topoisomerase inhibitors
• Oxidative stress
• Toxic agents
• Viruses
Proto-oncogene / Supressor gene
Chromosome
Cell intrinsic mechanisms:
• Aberrant DNA-repair mechanisms
• Non-canonical DNA
• Fragile sites
• Transcriptional stress
Unbalanced
translocation
Point mutation
Gene gain,
amplification
Balanced
translocation
Chromosomal translocation
Proto-oncogene / Supressor gene
Chromosome
Local rearrangement
Deletion
Local rearrangement
Inversion
Isochromosome,
ring chromosome
Alteraciones estructurales del DNA en cáncer
Holland, AJ & Cleveland, DW. Nat Med 2012
Guión de la presentación
• Alteraciones estructurales del DNA y
cáncer
• Hibridación in situ: concepto y tipos de
sondas
• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y
predicción
• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones
y de alteraciones numéricas
Concepto de la hibridación in situ
Hibridación con sondas radiactivas (John, 1969)
Hibridación fluorescente (Pinkel, 1986) para marcado de cromosomas y de
cambios en genes
La base de las técnicas de
hibridación de DNA
Estrategias para el estudio de alteraciones
cromosómicas:
Hibridación in situ de DNA
1. Desnaturalización de las sondas de DNA
2. Desnaturalización del molde de DNA
(cromosoma)
3. Annealing (renaturalización, hibridación de
las pruebas)
4. Lavado de posthibridación, astringencia
(SCC, formamida)
5. Contratinción de los núcleos (DAPI, PI)
Hibridación in situ de fluorescencia
Sondas específicas de locus, centroméricas y
teloméricas
Gene-specific probes
Centromeric probes
Normal
Abnormal
Telomeric probes
Sondas de fusión (fusion-probes) y de
separación (break-apart / split-probes)
Estrategias para el estudio de alteraciones
cromosómicas: Hibridación in situ
FISH
Rhodamine
/ Texas redlabeled
DNA probe
CISH
FITClabeled
DNA
probe
Texas
redlabeled
DNA
probe
Anti-Texas
red
conjugated
with AP
Chromogenic
detection
Hoff, K et al. Anat Pathol 2010
SISH
FITClabeled
DNA
probe
Anti-FITC
conjugated
with HRP
Chromogenic
detection
DNPlabeled
DNA
probe
Anti-DNP
conjugated
with HRP
Silver
acetate
detection
DNPlabeled
DNA
probe
Anti-DNP
conjugated
with AP
Chromogenic
detection
Estrategias para el estudio de alteraciones
cromosómicas: Hibridación in situ de DNA
Aplicaciones
• Detección de aneuploidia
• Cromosomas en metafase
• Análisis de centrómeros
• Núcleos en interfase
• Estudio de cromosomas
• Tejidos fijados
• Análisis de genoma completo (pintado
cromosómico)
• Células en cultivo
• Identificación de traslocaciones
• Detección de genes
• Estudio de microdeleciones
• Determinación de amplificación y
deleción génica
Estrategias para el estudio de alteraciones
cromosómicas:
Hibridación in situ de RNA (mRNA y miRNA)
Estrategias para el estudio de
alteraciones cromosómicas:
Cariotipo espectral, m-FISH
5
5
6
6
3
1
9
2
13
X
14
1
der(1)t(1;5)
der(2)t(1;2)
B6-15
B6-1, B6-15
9
X
der(3)t(X;3)
HT29, C7-1, C7-15
der(5)t(5;13)
der(6)t(6;14)
HT29, C7-1, C7-15
HT29, C7-1, C7-15
12
der(6)t(X;6;9)
B6-1, B6-15
5
15
9
9
X
X
9
ins(X;9)
HT29
13
7
14
6
9
der(9)t(X;6;9)
C7-15
der(12)t(7;12)
B6-15
der(13)t(5;13)
HT29, C7-1
der(14)t(6;14)
HT29, C7-1, C7-15
dup(19p)
C7-1, C7-15
Estrategias para el estudio de
alteraciones cromosómicas:
Hibridación Genómica Comparada (CGH)
- muestra cambios del número de copias de secuencias de DNA (pérdidas, ganancias y amplificaciones),
pero no detecta traslocaciones balanceadas.
- puede utilizarse tanto tejido fresco como fijado en formol y su sensibilidad es afectada por el porcentaje
de células tumorales de la muestra.
Estrategias para el estudio de
alteraciones cromosómicas:
Hibridación Genómica Comparada (CGH)
Guión de la presentación
• Alteraciones estructurales del DNA y
cáncer
• Hibridación in situ: concepto y tipos de
sondas
• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y
predicción
• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones
y de alteraciones numéricas
Traslocaciones en procesos linfoproliferativos
Traslocaciones en sarcomas
Jain, S et al. Int J Clin Exp Pathol 2010
Síndromes hereditarios asociados a sarcomas
en edad pediátrica
Slater, O & Shipley, J. J Clin Pathol 2007
Guión de la presentación
• Alteraciones estructurales del DNA y
cáncer
• Hibridación in situ: concepto y tipos de
sondas
• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y
predicción
• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones
y de alteraciones numéricas
Sarcoma sinovial:
Traslocación (X;18)(p11;q11)
Sarcoma sinovial:
Traslocación (X;18)(p11;q11)
Before translocation
Chromosome X
Chromosome 18
Jefferson T, D Mol Pathol, 2005
After translocation
Sarcoma sinovial:
Traslocación (X;18)(p11;q11)
Sarcoma sinovial:
Traslocación (X;18)(p11;q11)
Amary, MFC et al. Mod Pathol 2007
Sarcoma sinovial:
Traslocación (X;18)(p11;q11)
Normal
Abnormal
SYT 3’
SYT 5’
Targetable genes in NSCLC
Oxnard, GR et al. J Clin Oncol 2013
Traslocación de ALK en cáncer de pulmón
Doebele RC et al. Clin Cancer Res 2012
Traslocación de ALK en cáncer de pulmón
Doebele RC et al. Clin Cancer Res 2012
Traslocación de ALK en cáncer de pulmón
- Evaluación de > 50 células
- Separación de señales: la distancia entre ambas equivale al diámetro de
una señal o se detecta únicamente la señal 3’
- > 15% de las células con alteración
ALK-3’
ALK-5’
Lindeman, NI et al. Arch Pathol Lab Med. 2013
Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial
en lesiones melánicas cutáneas
Gerami, P et al. Am J Surg Pathol 2009
Bastian, BC et al. Am J Pathol 2003
Bastian, BC et al. Cancer Res 1998
North, JP et al. Am J Surg Pathol 2014
Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial
en lesiones melánicas cutáneas
Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial
en lesiones melánicas cutáneas
RREB1
CCND1
MYB
CEP6
Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial
en lesiones melánicas cutáneas
% núcleos con incremento del gen RREB1: 57% (> 29%)
80
% núcleos con ganancia relativa del gen RREB1: 73% (> 55%)
% núcleos con incremento del gen CCND1: 6%
Número de células
70
(> 38%)
% núcleos con pérdida relativa del gen MYB: 55% (> 40%)
60
50
CEP6
40
MYB
30
REBB1
CCDN1
20
10
0
0
1
2
3
Número de señales por núcleo
4
5
Mensajes finales
Las técnicas de hibridación in situ permiten
determinar alteraciones estructurales del
DNA (y el estudio de RNA)
Utilidad diagnóstica, pronóstica y predictiva
de respuesta