analisis de la presencia de puntos calientes

ANALISIS DE LA PRESENCIA DE PUNTOS CALIENTES (HOT SPOTS)
RECOMBINANTES EN EL GENOMA DE LOS ASTROVIRUS
ZULAY ARIZA ESCAMILLA
PROYECTO DE TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TITULO DE:
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
DIRECTOR:
JUAN CARLOS ULLOA, Ph.D
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C
2009
ANALISIS DE LA PRESENCIA DE PUNTOS CALIENTES (HOT SPOTS)
RECOMBINANTES EN EL GENOMA DE LOS ASTROVIRUS
ZULAY ARIZA ESCAMILLA
APROBADO
INGRID SHULLER Ph.D
DECANA ACADEMICA
JANETH ARIAS PALACIOS, M.Sc
DIRECTOR(A) CARRERAS DE MICROBIOLOGIA
ANALISIS DE LA PRESENCIA DE PUNTOS CALIENTES (HOT SPOTS)
RECOMBINANTES EN EL GENOMA DE LOS ASTROVIRUS
ZULAY ARIZA ESCAMILLA
APROBADO
JUAN CARLOS ULLOA RUBIANO, Ph.D
DIRECTOR (A)
Dr. CLAUDIA CUERVO, M.Sc.,Ph.D(C)
JURADO
NOTA DE ADVERTENCIA
“LA UNIVERSIDAD NO SE HACE RESPONSABLE POR LOS CONCEPTOS EMITIDOS
POR SUS ALUMNOS EN SUS TRABAJOS DE TESIS. SOLO VELARA PORQUE NO
SE PUBLIQUE NADA CONTRARIO AL DOGMA Y A LA MORAL CATÓLICA Y
PORQUE LAS TESIS NO CONTENGAN ATAQUES PERSONALES CONTRA
PERSONA ALGUNA, ANTES BIEN SE VEA EN ELLAS EL ANHELO DE BUSCAR LA
VERDAD Y LA JUSTICIA”
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
TABLA DE CONTENIDO
1. Resumen.
2. Introducción.
3. Estado del arte.
3.1Generalidades sobre los astrovirus.
3.2 Papel de la recombinación sobre los genomas virales.
3.3Analisis previos que predicen posibles recombinaciones génicas entre astrovirus.
4. Formulación del problema y Justificación.
4.1Pregunta de investigación.
4.2Tipo de estudio.
4.3Población.
4.4 Justificación
5. Objetivos.
5.1General.
5.2Específicos
6. Metodología.
6.1Revision y recolección de secuencias génicas de astrovirus indexados en
Genbank.
6.2 Verificación y clasificación de las secuencias.
6.3 Alineamientos múltiples y edición de las secuencias.
6.4 Análisis de Recombinación génica a partir de los alineamientos.
7. Flujograma.
8. Resultados.
8.1 Revisión y clasificación de secuencias génicas de astrovirus indexados en
GenBank.
8.2 Alineamientos.
8.3 Análisis de recombinación génica.
9. Discusión.
10. Conclusiones.
11. Recomendaciones.
12. Bibliografía.
13. Anexos.
13.1 Análisis de recombinación génica del genoma completo de Avastrovirus
13.2 Análisis de recombinación génica del ORF1a de Avastrovirus
13.3 Análisis de recombinación génica del ORF1b de Avastrovirus
13.4 Análisis de recombinación génica del ORF2 de Avastrovirus.
13.5 Análisis de recombinación génica para secuencias del ORF2 de Mamastrovirus
13.6 Análisis de recombinación génica para secuencias del ORF1a de Mamastrovirus
13.7 Análisis de recombinación génica para secuencias del ORF1b de Mamastrovirus
1. RESUMEN
La recombinación es un fenómeno que ha sido previamente estudiado, principalmente en
virus que poseen como material genómico ARN el cual se caracteriza por realizar un
intercambio de segmentos de ARN que componen el genoma viral, como es el caso de
astrovirus (AstVs). Estudios previos han analizado la recombinación y la estrecha relación
evolutiva que se presenta entre astrovirus humanos (HAstVs) y astrovirus porcinos
(PAstVs). En este estudio se determinó si algunos genomas de los astrovirus que infectan
mamíferos y aves pueden sufrir eventos de recombinación. Para ello se llevó a cabo una
clasificación de secuencias de AstVs disponibles en GenBank, posteriormente se
realizaron alineamientos múltiples y finalmente el análisis de recombinación que
determinó la presencia de puntos calientes “Hot Spots’’ a lo largo del genoma de los
astrovirus en los tres marcos de lectura abierta que lo componen.
2. INTRODUCCIÓN
La bioinformatica como disciplina, ha sido diseñada para analizar de manera más eficiente
toda la información biológica; se utiliza para responder preguntas acerca de los genomas
de los organismos y en nuestro caso de los virus, ayudando en la predicción de cambios
generados por la variación génica de estos.
Los constantes cambios que ocurren sobre los genomas virales pueden ser producidos
por varias fuerzas evolutivas como la recombinación, los cuales han permitido que los
virus expresen características que pueden verse reflejadas en su transmisión entre las
distintas especies ( Lukashov,2002 ;Wang, 2001). En el caso de virus con ARN, las
recombinaciones génicas han sido descritas como un mecanismo significativo envuelto en
la dispersión viral, considerándose en algunos casos benéfico para la perpetuación de
estos ( Lukashov,2002 ;Wang, 2001).
Hoy en día se pueden predecir señales de eventos recombinatorios a partir de genomas
virales.
Los paquetes o software disponibles para ejecutar este tipo de análisis se basan en
cálculos estadísticos que detectan a partir de alineamientos múltiples de secuencias
nucleotídicas, aquellas regiones que potencialmente pueden sufrirlos.
Varios reportes han mostrado que existe una relación evolutiva cercana entre los
astrovirus que infectan humanos, felinos y porcinos, principalmente en el marco de
lectura abierta que codifica para la proteína estructural (Lukashov, 2002; Wang, 2001;
Jonassen, 2001). Por otra parte se ha propuesto que la recombinación génica puede estar
involucrada en una posible transmisión inter-especies.
El presente estudio pretendió analizar si los genomas de los astrovirus que infectan tanto
mamíferos como aves podrían estar sujetos a sufrir recombinación génica, evento que
podría implicar un posible mecanismo de dispersión viral.
3. ESTADO DEL ARTE
3.1 Generalidades sobre los Astrovirus (AstVs).
La familia Astroviridae comprende tanto virus humanos como animales y se encuentra
dividida en dos géneros; aquellos que infectan mamíferos (Mamastrovirus), compuesto
por virus humanos (HAstVs), felinos (FAstVs), ovinos (OAstVs), porcinos (PAstVs),
murciélagos (BAstVs), ratones (MAstVs) y bovinos y aquellos que infectan aves
(Avastrovirus) como los astrovirus de patos (DAstVs), pollos (CAstVs), pavos (TAstVs) y el
virus de la nefritis aviar (ANV).
Los astrovirus fueron descritos por primera vez en el año 1975 por Madeley y Cosgrove;
al ser vistos por microscopia electrónica (ME) (Fig1) a partir de la cual se observaron en
forma de estrella con 5 a 6 puntas (Madeley,1975). Así mismo, se caracterizan por ser
virus desnudos, pequeños y redondos cuyo diámetro se encuentra entre los 28 a 32 nm,
presentan un genoma ARN monocatenario (solo posee una cadena) de polaridad positiva
dividido en tres marcos abiertos de lectura (ORFs: Open Reading Frames) denominados
ORF1a, ORF1b y ORF2
(Wang,et al 2001). Los dos primeros ORFs, se encuentran
localizados en los extremos 5’ y codifican proteínas no estructurales, conteniendo
dominios de serinaproteasa y una ARN polimerasa dependiente de ARN que se
encuentran implicadas en la replicación viral. El ORF2 en cambio, se encuentra localizado
en el extremo 3’ y codifica una poliproteína que compone la estructura capsidica.
FIG1: Microfotografía por Microscopia Electrónica (ME) de Astrovirus humanos (McNulty, 1994)
Dado que es un virus que presenta una aparente morfología en forma de estrella y debido
a su tamaño, se ha hecho difícil su detección y por esto se han desarrollado otros
métodos más específicos, sensibles y accesibles basados en las propiedades genómicas
y antigénicas del virus para su diagnóstico. Los métodos más empleados para la
identificación
de
este
virus
incluyen
técnicas
como
ELISA
(Enzimed-linked
Immunoabsorbent Assay), inmunofluorescencia indirecta y RT-PCR (Polimerase Chain
Reaction with Reverse Transcriptase) (Bass et al., 2000).
Los AstVs han sido detectados en diferentes especies animales incluyendo seres
humanos y son reconocidos como uno de los principales agentes virales causantes de
gastroenteritis infantil en todo el mundo, siendo esta la segunda causa común de diarrea
viral entre la población. El periodo de incubación del virus es de 3 a 4 días, los principales
síntomas de la enfermedad causada por estos virus son: diarrea, seguida de náuseas,
vómito, fiebre, malestar general, dolor abdominal, y deshidratación y permanecen de 2 a
3
días
pero
pueden
persistir
hasta
12
días,
sobre
todo
en
individuos
inmunocomprometidos (Méndez et al.,2006), la forma de infección que se presenta por
parte de los AstVs se da por vía oro-fecal y entre las características epidemiológicas
importantes se ha encontrado que afecta principalmente niños con edades inferiores a los
dos años, se encuentra ampliamente distribuido a nivel mundial y pueden llegar a coinfectar con otros virus (Gutiérrez et al., 2005).
3.2 Papel de la recombinación sobre los genomas virales.
Los cambios generados sobre los genomas virales como por ejemplo las recombinaciones
génicas, están determinadas por fuerzas evolutivas que ejercen presiones selectivas que
pueden favorecer la dispersión viral o por el contrario ejercer un efecto deletéreo sobre
estos (Worobey et al.1999). Las fuerzas evolutivas son procesos que rompen el equilibrio
génico de una población, cambian o modifican su composición genética a través del
tiempo y conllevan, por tanto a la evolución. Las recombinaciones génicas y las
mutaciones son un ejemplo claro de lo que son las fuerzas evolutivas.
La recombinación génica es la formación de nuevas combinaciones de fragmentos de
material genético, procedentes de diferentes genomas o diferentes zonas de un mismo
genoma, de esta forma una molécula de ARN aceptora incluye secuencias de una
molécula de ARN donante y genera una nueva molécula.
En el caso de los virus con ARN, las recombinaciones génicas ocurren con una mayor
frecuencia y les sirve en última instancia para especializarse en diversos mecanismos de
transmisión a través de sus huéspedes, generando a su vez nuevos genotipos a través
del intercambio de material genético entre secuencias homólogas, aumentando entonces
la variabilidad genética de dicha población viral (Worobey et al.1999). La recombinación
desempeña un papel significativo en la evolución de los virus con ARN mediante la
generación de variación genética, al reducir la carga mutacional, y mediante la producción
de nuevos virus.
Inicialmente, las recombinaciones pudieron haber tenido una funcionalidad de poco
impacto y sin daños que llegaran a afectar de manera directa a sus huéspedes, pero solo
con el paso del tiempo fueron tomando fuerza y generaron cambios sobre la funcionalidad
biológica desarrollando formas más complejas de supervivencia y causando daño a sus
hospederos (Speroni et al.,2006).
La recombinación entre virus de ARN se da cuando ocurren co-infecciones donde dos
virus similares (homólogos) o diferentes (heterólogos) se replican y dan lugar a la
formación de nuevos viriones cuyo material genético es compartido y por supuesto, puede
conllevar a cambios fenotípicos que pueden definir la infección de nuevos huéspedes.
Adicionalmente, otros estudios han demostrado que los virus son capaces de incorporar
en sus genomas, secuencias de nucleótidos que se encuentran dentro de los hospederos
y que posiblemente introducirán a otra célula que pertenezca a otro huésped diferente; es
así como los virus van ayudando a la evolución, transmitiendo la información genética
entre las diferentes especies (Turner et al,1999).
Existe tanta diversidad en virus ARN que su propia naturaleza recombinatoria imposibilita
una forma exacta de estudio en cuanto a su taxonomía y filogenia; dicha diversidad se
debe a sus altas tasas de mutación y reproducción, a la capacidad de intercambio de
material genético entre sí, a la adquisición de genes de sus células huéspedes y por la
forma y el tamaño de las partículas víricas que componen los virus, pero los avances
científicos y el acceso a nueva información y datos del genoma de los virus han permitido
que métodos como los filogenéticos faciliten la detección de la recombinación presente en
los virus y de esa manera sea más fácil su caracterización, evidenciando la posible
recombinación no solo entre virus de un solo tipo sino entre varios virus que puedan llegar
a estar relacionados (Lukashov et al., 2002).
A medida que los huéspedes evolucionan, así mismo lo hacen los virus. Es de esta
manera como se crea una co-evolución entre estos y se garantiza que si el huésped es
capaz de sobrevivir y de resistir cambios evolutivos y genéticos, de igual manera los virus
obtendrán su supervivencia (Pantin et al., 2005).
3.3 Análisis previos que predicen posibles recombinaciones génicas entre
astrovirus.
Previos análisis filogenéticos han mostrado una estrecha relación entre los astrovirus que
infectan humanos, gatos y cerdos (Hemert, 2007; Jonassen, 2001)
En general, el gen que codifica para la caside (ORF2), ha sido el gen más utilizado para
realizar análisis filogenéticos que han mostrado una estrecha relación evolutiva entre
astrovirus que infectan humanos, felinos y porcinos. Adicionalmente, se ha visto que los
astrovirus que infectan aves no están tan relacionados con los demás, formando un grupo
filogenético diferente entre todos los astrovirus (Lukashov et al 2002).
Lukashov y col., propusieron que los astrovirus pudieron co-evolucionar con sus
huéspedes desde las aves, pasando por las ovejas, cerdos y gatos, hasta llegar a infectar
a los humanos. Este comportamiento evolutivo fue mostrado cuando se analizaron los tres
genes que componen el genoma de los astrovirus (Lukashov et al 2002).
A partir de estas observaciones se ha propuesto que el ancestro más cercano de los
astrovirus que infectan humanos puede ser el astrovirus de gatos (FAstVs) y/o los de
cerdo (PAstVs). Por esto se podría esperar que ocurrieran eventos recombinatorios
significativos entre las secuencias génicas de estos.
4. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
4.1 Pregunta de investigación
¿Existen puntos calientes (hot spots) recombinantes en el genoma de los astrovirus que
infectan mamíferos y aves?
4.2 Tipo de estudio
Trabajo de tipo descriptivo observacional, de corte transversal prospectivo.
4.3 Población
Se entrará a hablar de una población que consiste de 6200 secuencias parciales y totales
del genoma de los AstVs, disponibles en el banco de genes (GenBank) del NCBI (National
Center for Biotechnology Information).http:// www.ncbi.nclm.nih.gov/GenBank/index.html).
4.4 Justificación
No se conoce si puede haber una transmisión de astrovirus inter-especies, así mismo no
se conoce si el genoma de los astrovirus pueden recombinar y si existen posibles sitios
que tienden a sufrir más estos fenómenos como lo son los “Hot Spots” (sitios específicos
del genoma de diferentes especies que son iguales con otras especies diferentes) por tal
razón es importante realizar el análisis para saber si dichos eventos recombinatorios se
están presentando a nivel del genoma de los astrovirus que infectan mamíferos y aves.
5. OBJETIVOS
5.1General
Detectar puntos calientes (hot spots) recombinantes en el genoma de los astrovirus que
infectan mamíferos y aves.
5.2 Específicos
5.2.1 Recolectar y clasificar secuencias nucleotídicas completas que estén disponibles en
GenBank a partir de cada uno de los genes de los astrovirus que infectan mamíferos y
aves.
5.2.2Detectar señales de recombinación génica entre las secuencias nucleotídicas
recolectadas de astrovirus que infectan mamíferos y aves.
6. METODOLOGÍA
6.1 Recolección de secuencias génicas de astrovirus indexadas en GenBank.
Se recolectaron secuencias génicas completas de cada uno de los tres marcos de lectura
abierta (ORF1a, ORF1b, ORF2) que componen el genoma de los AstVs que infectan
mamíferos como (HAstVs, FAstVs, PAstVs, DogAstVs, BAstVs, OAstVs, SAstVs, MAstVs)
y aves, al igual que secuencias del genoma completo a partir de la base de datos del
GenBank
del
NCBI
(National
Center
for
Biotechnology
Information.
(http://www.ncbi.nclm.nih.gov/GenBank/index.html).
6.2 Verificación y clasificación de las secuencias
Todas las secuencias escogidas fueron clasificadas verificando el marco de lectura al que
pertenecían dentro del genoma de los AstVs, teniendo en cuenta la información
proporcionada por la base de datos e igualmente comparadas con otras secuencias
génicas
mediante
el
programa
BLAST
(Basic
Local
Aligment
Search
Tool)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov./blast/Blast.cgi).
6.3 Alineamientos múltiples y edición de las secuencias.
Verificadas las secuencias de AstVs y clasificadas de acuerdo al marco de lectura al que
pertenecen y también si representaban el genoma completo, estas fueron alineadas
usando el programa Clustal W, contenido en el programa MEGA 4.01, el cual se encarga
de alinear las secuencias seleccionadas para poder considerar las semejanzas o
diferencias entre ellas. Posteriormente fueron editadas con base a la distribución
genómica de cada una de ellas.
El genoma de los astrovirus se compone de tres marcos de lectura abierta, donde el
ORF1a comienza desde el nucleótido 200 hasta el nucleótido 2800; el ORF1b que va
desde el nucleótido 2800 hasta 4100 y finalmente el ORF2 que va desde 4200 hasta
6700. Con base en esta división se realizo la edición de las secuencias tomando cada uno
de los genes y cortándolos de acuerdo al rango de la longitud.
6.4 Análisis de recombinación génica a partir de los alineamientos múltiples
realizados.
Cada uno de los alineamientos (ORF1a,ORF1b,ORF2 y secuencias de genoma completo)
fueron incluidos en el programa RDP3 (Recombination Detection Program, versión Beta
3.1) que sirve para detectar señales de recombinación génica basada en la comparación
de tripletas de secuencias de nucleótidos. (Martín et al.,2005). Este a su vez incluye 10
paquetes estadísticos que se pueden aplicar al mismo tiempo (Chimaera, GENECONV,
Bootscanning, LARD, 3Seq, MaxChi Square, Sister Scanning, SiScan, TOPAL DSS y
LDHAT) para la detección de las señales de recombinación, expresando valores
probabilísticos significativos usando un valor máximo de P=0.05 (Martin et al.,2010).
El programa RDP3 utiliza una mezcla de métodos filogenéticos y estadísticos para
identificar la evidencia de los probables sitios de recombinación (Hot Spots) dentro de las
secuencias, de igual forma presenta de forma grafica aquellas regiones que tienen la
mayor probabilidad estadística de sufrir recombinaciones (Heath et al .,2006).
7. DIAGRAMA DE FLUJO
Recolección de secuencias génicas
de astrovirus
(http://www.ncbi.nclm.nih.gov/GenBank/index.html)
Verificación y clasificación de las
secuencias
(http://www.ncbi.nclm.nih.gov/blast/Blast.cgi)
Alineamientos múltiples
en clustal W/Mega 4.01
Edición de las secuencias
Análisis de recombinación
génica (RDP3)
8. RESULTADOS
8.1 Recolección y clasificación de secuencias génicas de AstVs indexadas en
GenBank.
Se recolectaron 15 secuencias del genoma completo de HAstVs, 57 secuencias del ORF2
de HAstVs, 1 secuencia del ORF2 de PAstVs, 1 secuencia del ORF2 de FAstVs, 3
secuencias de DogAstVs,1 secuencia del genoma completo de SAstVs, 1 secuencia del
genoma completo de MAstVs, 4 secuencias del ORF1b de BAstVs, 6 secuencias del
ORF2 de BAstVs, 10 secuencias del genoma completo de BAstVs, 2 secuencias del
ORF2 de TAstVs, 12 secuencias del genoma completo de TAstVs, 2 secuencias del
genoma completo de DAstVs,1 secuencia del genoma completo de CAstVs, una
secuencia del ORF2 de ANV,1 secuencia de genoma completo de ANV. Tabla 1.
Tabla1.Descripcion de las secuencias génicas de Astvs recolectados a partir del
GenBank
Tipo de AstVs
ORF1a
ORF1b
ORF2
Genoma Completo
HAstVs(astrovirus
Humano)
AB009984,AB009985,
AB000283-B000301,
EF138823-EF138831,
AB025801-AB025812
DQ630763,AB013618,
Z33883, Y08632,
Z66541, Z46658,
U15136, S68561,
L06802, AB031030,
AB031031,AB037273,
AB037274, F583300,
AF117209.
Y15938
AY720891, AF141381,
AF260508,L23513,Z257
71, AB308374, L13745,
FJ755402-FJ755405
DQ070852, DQ028633,
DQ344027, Y720892.
PAstVs(astrovirus
FJ755402-FJ755405
DQ070852,DQ028633,
DQ344027, Y720892,
AY720891, AF141381,
AF260508,L23513,Z25771,
AB308374, L13745.
porcino)
AF056197
FAstVs(astrovirus
Felino)
FM213330-FM213332
DogAstVs(astrovirus
de perro)
SAstVs(astrovirus de
Y15937
Y15937
oveja)
AY179509
MAstVs(astrovirus de
raton)
FJ571065FJ571068
BAstVs(astrovirus de
murcielago)
TAstVs(astrovirus de
pavo)
DAstVs(astrovirus de
Y15936, AF20666,
NC_002470.
FJ571069-FJ571074
EU847146-EU847155
AY769615, AY769616
EU143843-EU143851,
Y15936,
AF20666,NC_002470,
FJ434664, NC012437
pato)
CAstVs(astrovirus de
pollo)
NC_00379
AB046864
ANV(astrovirus de la
AB033998
nefritis aviar)
8.2 Alineamientos múltiples con las secuencias recolectadas
Todas las secuencias recolectadas fueron alineadas usando Clustal W incluido en el
programa Mega 4.01 y posteriormente fueron editadas, obteniendo así cada uno de los
fragmentos que componen los tres marcos de lectura abierta (ORF1a ORF1b y ORF2) o
la secuencia del genoma completo.
8.3 Análisis de recombinación génica.
Los alineamientos anteriormente realizados se incluyeron en el programa RDP3 y fueron
analizadas utilizando los 10 paquetes disponibles en el programa bajo condiciones por
defecto para cada uno. Se presentan los posibles sitios donde se presentan los “Hots
Spots’’ recombinantes en el genoma de los AstVs tanto en Mamastrovirus como de
Avastrovirus. Anexos 13.1,13.2,13.3,13.4,13.5,13.6 y13.7.
9. DISCUSIÓN
La obtención y revisión de secuencias génicas de los astrovirus fue posible gracias al uso
de la base de datos NCBI lo cual permitió obtener un total de 119 secuencias de los
astrovirus tanto de mamíferos como de aves gracias al acceso que se tuvo al banco de
genes GenBank del NCBI (National Center For Biotechnology Information).
Al realizar los alineamientos múltiples de las secuencias seleccionadas para el estudio se
buscaron porciones de las secuencias que tuvieran zonas de similitud entre ellas y fue
posible realizar comparaciones con base en las identidades presentes en cada una de
ellas.
Así mismo se excluyeron del estudio aquellas secuencias que presentaron un alto grado
de variabilidad con respecto a otras. En este caso 3 secuencias de HAstVs mostraron alta
variabilidad y por esto fueron excluidas (núm. de acceso FJ402983, AB325804,
FJ222451).
La elaboración de los alineamientos permitió identificar regiones altamente conservadas
presentes en cada uno de los genes de interés como lo fue la región conservada del
ORF2 de los astrovirus, teniendo en cuenta que el ORF2 dentro del genoma de los AstVs
comienza alrededor del nucleótido 4100 y se extiende hasta el nucleótido 6700,Ubicando
entonces la región conservada del la cual se ubica desde el nucleótido 4100 y de igual
modo la región variable del ORF2 que comienza con el aminoácido 416 y que va hasta el
carboxiterminal, por ser muy variable es un dominio muy importante para el ensamblaje
del virus.
La recombinación es un fenómeno que ha sido estudiado en virus que poseen tanto
material ARN como ADN. Dos tipos de intercambio genético operan en virus con ARN, el
primero es un reordenamiento de genes (reassortment) que ocurre en los virus ARN
multipartitas y monopartitas cuya polaridad puede ser positiva, particularmente
intercambiando una o más de sus moléculas ARN que componen el genoma viral, los
AstVs se caracterizan por tener un genoma ARN de polaridad positiva, es decir, aquellos
cuyo genoma actúa como ARN mensajero y por lo tanto son capaces de iniciar un nuevo
ciclo replicativo en ausencia de proteínas virales(ejemplo poliovirus, virus hepatitis C),
llevando a cabo la replicación de su genoma en complejos proteínicos asociados en el
interior de estructuras celulares que contienen membranas (Mendez 2002). Dicha
redistribución se aplica como ejemplo al virus de la influenza A, en donde se muestra el
potencial evolutivo del virus y la importancia de que ocurran estos eventos. (Worobey,
1999). Estos cambios se ven reflejados continuamente en este virus sufriendo desde
pequeños cambios antigénicos, hasta la aparición e introducción de nuevos virus en
poblaciones que antes no se consideraban vulnerables y que generan a su vez
un
aumento en su eficiencia de trasmisión.
El segundo es un mecanismo de recombinación por el cual los virus con ARN tienden a
combinar su genoma que se explica con un modelo propuesto denominado “copy-choice”;
Hasta la fecha, casi todos los estudios sobre los mecanismos de la recombinación de los
virus de ARN han apoyado este modelo presentado originalmente en el caso del virus del
poli o poliovirus (Cooper et al.,1974), este modelo explica como ocurre un salto de la
polimerasa de una plantilla a otra mientras copia el ARN. Bajo este modelo, las “roturas”
en el ARN estarían obligando a la ARN polimerasa a cambiar de molde o de plantilla
restaurando así la continuidad del genoma. Las características de este modelo es que la
recombinación ocurre sólo durante la síntesis de ARN (Pantin-Jackwood,2006).
Es necesario destacar que es la primera vez que se realiza este tipo de estudio con los
AstVs, aunque análisis previos se realizaron con los Picornavirus en los cuales se
incluyeron también secuencias de HAstVs.
Se ha reportado que el gen que codifica para la capside (ORF2) se caracteriza por tener
una alta variabilidad hacia el extremo 3’ (Pantin-Jackwood, 2006; Wang, 2001) y posee
además dos regiones que codifican principalmente tres proteínas donde la primera está
involucrada en el ciclo replicativo del virus tales proteínas son la (VP34,VP25,VP27),
dichos cambios generados a nivel del genoma ocurren con mayor tendencia en la región
variable del ORF2, puesto que es allí donde se encuentran las puntas o las espículas del
virus (Krishna, 2005).Adicionalmente análisis bioinformaticos realizados previamente a la
capside de los AstVs mostro una relación cercana y una alta similitud entre astrovirus
porcinos y astrovirus humanos (PAstVs –HastVs) (Lukashov, 2002; Wang, 2001).
Según Wang (2005) en la región variable del ORF2 se describe una zona que se
comparte entre astrovirus humanos porcinos y felinos (Wang, 2001).
Así mismo estudios filogenéticos realizados se han basado en observar el grado de
similitud que presentan las secuencias proteicas de la capside de los astrovirus tanto de
humanos como de animales y sugieren la posibilidad de una posible transmisión entre
especies, involucrando a los gatos, cerdos y humanos, hipótesis que fue replanteada por
Lukashov y Goudsmit (2002) quienes atribuyen que la introducción de los astrovirus en la
población humana se produjo por la transmisión de una única especie, y que la suma de
cambios a lo largo de la historia evolutiva de estos virus tuvieron lugar fenómenos de
recombinación entre las diferentes especies (Lukashov & Goudsmit,2002).
Diferentes estudios realizados a partir del genoma de los AstVs reportan secuencias
genómicas completas del virus, pero para el caso de astrovirus porcinos se dispone de
una única secuencia del ORF2, y si bien lo reportado por Lukashov y colaboradores
demuestra que los análisis realizados a esta secuencia describen la relación evolutiva con
HAstVs.
A partir de nuestros análisis de recombinación fue posible deducir que los tres marcos de
lectura pueden presentar recombinación y presentan Hot Spots en porciones específicas
de estos.
De acuerdo a los resultados observados en las recombinaciones de los diferentes marcos
de lectura abierta se observó que los sitios que mostraron una mayor probabilidad de
presentar Hot Spots a lo largo del genoma de los AstVs fueron el ORF1b de los
Mamastrovirus que codifica para la polimerasa viral, al igual que la región variable del
ORF2 tanto de Mamastrovirus como de Avastrovirus, en contraste con la región
conservada del ORF2 la cual presento menos eventos de recombinación. Anexos 13.4,
13.5 y 13.7
Las zonas que presentaron mayor significancia en cuanto a posibles puntos calientes o
Hot Spots, pertenecientes a Mamastrovirus y Avastrovirus se representan mediante los
plots o graficas resultado de la posterior recombinación utilizando el programa de RDP,
fueron las regiones comprendidas éntrelos nucleótidos 1440 y 2160 siendo estas las
zonas que tuvieron mayor identidad, pertenecientes a ORF2 de Mamastrovirus, al igual
que las regiones comprendidas éntrelos nucleótidos 5892 y 7800 para el ORF2 de
Avastrovirus y finalmente la región del ORF1b de Mamastrovirus cuyas zonas se
encontraron en las regiones nucleotidicas comprendidas éntre 390 y 781. Anexos
13.4,13.5,13.7.
Sin embargo, no fue posible determinar las recombinaciones utilizando el genoma
completo de los AstVs que infectan mamíferos, debido a su gran longitud y número de
secuencias, porque el equipo utilizado fue incapaz de desarrollar los cálculos.
10. CONCLUSIONES
Se detectaron señales de recombinación en las secuencias nucleotidicas
analizadas de AstVs en los tres marcos de lectura abierta.
Las zonas que presentan posibles “Hot Spots” recombinantes en el ORF1a,
ORF1b y ORF2 son respectivamente las porciones nucleotidicas 2024, 2333 y 550
respectivamente.
Se observó que hacia el 3’del ORF2 podrían encontrarse con mayor frecuencia
los posibles “Hot Spots” recombinantes en el génoma de los AstVs.
11. RECOMENDACIONES
Para estudios posteriores se recomienda utilizar un equipo con un procesador
más rápido, con el fin de determinar con mayor facilidad los resultados esperados.
Analizar si los sitios donde hay posibles “Hot Spots” a lo largo del genoma de
AstVs corresponden a zonas biológicas funcionales.
Se recomienda estudiar aquellas relaciones evolutivas que se puedan llegar a
presentar entre HAstVs (astrovirus humano) con BAstVs (astrovirus de murciélago)
y los cambios que se puedan generar a nivel del genoma de los AstVs.
12. BIBLIOGRAFÍA
Bass D, Qiu S. Proteolytic Processing of the Astrovirus Capsid Department of Pediatrics.
Journal of virology 2000; 74(4): 1810–1814.
Belliot G, Laveran H, Monroe S. Detection and genetic differentiation of human
astroviruses: phylogenetic grouping varies by coding region. Archives of Virology 1997;
142(7):1323–1334.
Cooper A, Steiner-Pryor D, Scotti P, Delong D. On the Nature o f Poliovirus Genetic
Recombinants. Journal of Virology I974; 23: 4r-49
Gutiérrez M, Matiz A, Ulloa J, Alvarado M. Astrovirus (HAstV) como agente causal de
diarrea en niños Colombianos: Siete años de estudio Laboratorio de Virología, Grupo de
Enfermedades Infecciosas. Nova 2005;120(1):1794-2470.
Heath L, Walt E, Varsani , Martin D. Recombination hotspot test. Recombination patterns
in aphthoviruses mirror those found in other picornaviruses. Journal of Virology 2006; 80,
11827-11832.
Jiang B, Monroe S, Koonin E, Stine S, Glass R. RNA sequence of astrovirus: distinctive
genomic organization and a putative retrovirus-like ribosomal frameshifting signal that
directs the viral replicase synthesis. PubMed 1993; 90(22):10539-43.
Krishna N. Identification of structural domains involved in Astrovirus capsid biology. Vir
Immunol 2005; 18(1):17-26.
Lai M. RNA recombination in animal and plant viruses. Microbiological Reviews 1992;6179
Madeley C, Cosgrove B. 28 nm particles in faeces in infantile gastroenteritis. Lancet 1975;
2:451-452.
Martin D, Williamson C, Posada D. RDP2: recombination detection and analysis from
sequence alignments. Bioinformatics 2005; 21: 260-262.
Martin DP, Lemey P, Lott M, Moulton V, Posada D, Lefeuvre P. RDP3: a flexible and fast
computer program for analyzing recombination. Bioinformatics 2010; 26, 2462-2463.
Martos S. Dinámica evolutiva de virus RNA tesis doctoral. Facultad de ciencias.
Departamento de biología molecular, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, 2008,
120p.
Mendez E, Arias C. Clinical Virology Tercera edición. ASM Press. EE.UU.2006;
29(1):981–1000.
Pantin-Jackwood M, Spackman E, Woolcock P. Phylogenetic analysis of turkey
astroviruses reveals evidence of recombination. Virus genes 2005; 32:187-192.
Speroni S, Rohayem J, Nenci S, Bonivento D, Robel I, Barthel J, Luzhkov VB, Coutard B,
Canard B, Mattevi A. Structural and biochemical analysis of human pathogenic astrovirus
serine protease at 2.0 A resolution. Journal of Molecular Biology. 2006; 387(5):1137-52.
Turner P, Burch C, Hanley K, Chao L. Hybrid frequencies confirm limit to coinfection in the
RNA bacteriophage 6. Journal of Virology 1999; 73(3): 2420-2424.
Lukashov V, Goudsmit J. Evolutionary relationships among Astroviridae Journal of General
Virology 2002; 83: 1397-1405.
Wang QH, Kakizawa J, Wen LY, Shimizu M, Nishio O, Fang ZY, Ushijima H. Genetic
analysis of the capsid region of astroviruses. Journal of medical virology 2001;64(3):24555.
Worobey M, Holmes E. Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses. Journal of
General Virology 1999; 80: 2535–2543.
Consulta páginas web
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ consulta realizada el 1 de Agosto/2009
http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/.../sec_18.htm - / XIV el origen de
los virus /consulta realizada el 1 de Agosto/2009.