Eficiencia antioxidante de extractos fenolicos de soja fermentada Romero, Ana M. - Doval, Mirtha M. - Sturla, Mario A. - Andreo, Alejandra I. - Judis, María A. Facultad de Agroindustrias -UNNE. Cdte. Fernández 755 - (3700) Pcia. R. Sáenz Peña - Chaco - Argentina. Teléfono/Fax: +54 (3732) 420137 E-mail : judis@fai.unne.edu.ar ANTECEDENTES La oxidación de lípidos influye tanto en la calidad sensorial como en la nutricional de los alimentos y puede llegar a producir sustancias tóxicas. El mecanismo de acción responsable de la oxidación de lípidos se inicia con la formación de radicales libres. Es una reacción en cadena que puede ser descripta en etapas de iniciación, propagación y procesos de terminación. Esta reacción puede retardarse o inhibirse mediante la incorporación de antioxidantes. Los antioxidantes sintéticos más frecuentemente utilizados son los compuestos butilhidroxianisol (BHA) y butilhidroxitolueno (BHT), pero hay un gran interés en el empleo de antioxidantes extraídos de fuentes naturales o ingredientes que los contengan para desarrollar tal función (Cuvelier et al, 1990). Principios antioxidantes producidos durante la fermentación en la preparación del natto, un tradicional alimento japonés obtenido de semillas de soja fermentadas, han sido reportados previamente, probándose su efectividad sobre modelos de ácidos grasos insaturados y tejidos biológicos. Dicho efecto antioxidante fue atribuido a la acción de compuestos del tipo de polifenoles, presentes en los extractos crudos (Hattori et al, 1994). Entre estos compuestos podemos mencionar a los isoflavonoides y flavonoides que se encuentran generalmente en forma de glicósidos, a los ácidos fenólicos y a los fenoles simples. Los mismos actúan generalmente como capturadores y estabilizadores de radicales libres, pudiendo producir quelación de metales aquellos que poseen en su estructura grupos carboxílicos. También han sido reportados trabajos que atribuyen su acción antioxidante a la inhibición de enzimas prooxidantes como la lipooxigenasa (Decker, 1995). Investigaciones tempranas han demostrado que varias especias, como el romero y la salvia, son potentes antioxidantes debido a su contenido en polifenoles, pero la mayor objeción contra el uso de las mismas para tal fin en los alimentos es el característico aroma que dan a los productos, lo que limita la cantidad que puede ser adicionada. (Madsen and Bertelsen, 1995). El objetivo de nuestro trabajo fue medir la eficiencia antioxidante del extracto crudo de porotos de soja fermentados con Saccharomyces cerevisiae (ATCC 32052), sobre un sistema modelo grasa de cerdo y determinar el contenido de polifenoles totales del mismo. MATERIALES Y METODOS Preparación del extracto crudo de soja fermentada: Las semillas de soja, obtenidas de un semillero de la zona, fueron maceradas en agua a temperatura ambiente durante 24 horas y luego esterilizadas en autoclave a 1 atm. de presión por 1 hora. El sustrato obtenido, fue fermentado utilizando la técnica del precultivo con Saccharomyces cerevisiae (ATCC 32052) durante 24 horas. El producto resultante fue extraído con etanol 96° en una relación 1: 1 y concentrado al vacío a una temperatura menor a los 50 °C. Determinación del contenido de compuestos fenólicos totales: Los compuestos fenólicos fueron medidos colorimétricamente con el reactivo de Folin-Ciocalteu usando fenol grado analítico como estándar a 725 nm en un espectrofotómetro BECKMAN DU-600. La curva de calibración fue preparada usando concentraciones del estándar entre 0 y 552 mg/l. El total de fenoles fue expresado en mg por gramo de extracto seco (Schwarz et al, 2001). Sistema modelo: El sistema modelo grasa de cerdo fue preparado a partir del tocino dorsal de cerdo de raza DUROC de aproximadamente 9 meses de edad, el que fue picado y fundido a 60 °C bajo atmósfera de nitrógeno (Chávez et al, 1998) en un Rotavapor BÜCHI® R 114. Se distribuyeron, en recipientes abiertos, muestras de 20 g manteniendo una relación superficie:masa fue de 1,56 cm2/g. Con el objeto de acelerar el proceso de oxidación, las mismas fueron colocadas en estufa a 80 °C en condiciones estáticas y de oscuridad. Evaluación de la actividad antioxidante: Para evaluar la actividad antioxidante, fracciones del extracto crudo de soja fermentada fueron adicionados en concentraciones de 0; 0,25; 0,5 y 1 % p/p al sistema modelo. BHA al 0,01 % fue utilizado como control. La oxidación lipídica se llevó a cabo durante 60 horas y el seguimiento de la misma se realizó a través de la determinación cada 12 horas, del valor de peróxidos (VP) según la técnica de la AOCS (1993), expresado en miliequivalentes de peróxido por Kg de grasa, El análisis de los datos fue realizado con el software STATGRAPHICS Plus Profesional Versión B 4.0 para Windows. DISCUSION DE RESULTADOS Eficiencia Antioxidante. Los valores de peróxido obtenidos del seguimiento de la oxidación del sistema modelo grasa de cerdo con y sin antioxidante se pueden apreciar en la Tabla 1. Tabla 1. Evolución de los Valores de Peróxido durante la oxidación Tiempo (horas) BHA 0 12 24 36 48 60 5,00 5,65 6,25 6,07 6,92 7,61 Concentración 0% 0,25% 5,00 66,96 61,69 60,64 86,18 111,71 5,00 59,53 43,47 30,78 78,92 65,56 0,50% 1% 5,00 49,52 35,19 24,33 70,60 44,98 5,00 39,37 35,46 20,77 58,41 42,07 La oxidación lipídica medida a través de la formación de peróxido fue afectada por las concentraciones del extracto crudo adicionado. Aunque el efecto antioxidante se manifestó durante las 60 horas, tiempo que duró la experiencia, el mayor efecto fue observado a las 36 horas con reducción de la oxidación en 49, 60 y 66 % con respecto a la grasa sin aditivos, para las concentraciones de extracto 0,25; 0,5 y 1% respectivamente. Según el análisis de varianza para el mayor efecto antioxidante (36 horas), ambas variables Concentración y Tiempo, como así también la interacción C x T, poseen un efecto significativo a nivel 0,01. Tabla 2. Tabla 2. ANOVA para el Valor de peroxido durante las primeras 36 hs. Fuente de Variación F p C: Concentración 18,56 0.0004 T : Tiempo 17,44 0.0005 CxT 5,91 0.0251 TxT 39,51 0.0000 R-cuadrado = 81,0793 % R-cuadrado ajustado (por g.l.) = 77,096 % La eficiencia antioxidante, para las 36 horas (Fig. 1), fue evaluada teniendo en cuenta el efecto antioxidante de cada una de las concentraciones del extracto como el porcentaje de grasa no oxidada en el sistema modelo con respecto al control de oxidación sin antioxidante, de acuerdo a la siguiente fórmula: Efecto antioxidante = VP control sin antioxidante – VP con antioxidante x 100 VP control sin antioxidante Porcentaje de reducción (%) Efecto Antioxidante 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Concentración (%) Fig. 1. Efecto antioxidante del extracto agregado. De acuerdo a la gráfica de la Fig. 1 en la que se representa el efecto antioxidante como una función de las concentraciones, la mayor eficiencia se obtuvo para la concentración de 0,25 %. Contenido de Polifenoles El contenido de polifenoles totales del extracto crudo fermentado fue de 62,44 mg/ g de extracto deshidratado. La presencia de compuestos del tipo de los polifenoles en extractos fermentados de soja, en alimentos como el natto y tempeh, han sido reportados por Yokota et al ( 1996), quienes atribuyen a dichos compuestos el efecto antiinflamatorio observado en tejido dañados y el efecto protector ejercido contra la degradación oxidativa en células. CONCLUSIONES En este estudio, los resultados observados nos permiten inferir que en las condiciones ensayadas, la concentración más eficiente del extracto obtenido de porotos de soja fermentados, en cuanto a su actividad antioxidante, fue la menor concentración adicionada al sistema modelo. Con respecto al contenido de polifenoles determinado, si bien la actividad antioxidante del extracto estaría relacionada con la presencia de estos compuestos, la identificación de los principios activos y desarrollo de métodos de extracción más eficaces, sería de importancia relevante si el objetivo es lograr el uso óptimo de antioxidantes desde fuentes naturales para diferentes tipos de alimentos. BIBLIOGRAFIA AOCS. Sampling and Analysis of Commercial Fats and Oils. Peroxide Value Official Methods Cd 8-53. Ed Firestone .Champaign, IL. (1993). Cuvelier, M.E; Berset, C. and Richard H. Use of a new test for determining comparative antioxidative activity of Butylated hidroxyanisole, Butylated hidroxytoluene, alpha- and gamma- tocopherols and extracts from rosemary and sage. Sciences des Aliments. 10: 797-806 (1990) Chávez M; Tymoschuk, A; Coutaz V. y Luna J.. Actas de II Congreso Iberoamericano de Ingeniería en Alimentos. VIII, 22 (1998). Decker, Eric. A. The Role of Phenolics, Conjugated Linoleic Acid, Carnosine, and Pyrroloquinoline Quinone as Nonessential Dietary Antioxidants. Nutrition Reviews. 53 (3) : 49-58. (1995). Hattori,T.; Ohishi,H.; Yokota, T; Ohoami, H. and Watanabe, K. Antioxidative Effect of Crude Antioxidant Preparation from Soybean Fermented by Bacillus natto. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie. 28:135-138 (1995). Madsen, H and Bertelsen, G. Spices as antioxidants. Trends in Science and Technology . 6:271-277 (1995). Schwarz, K; Bertelsen, G; Nissen, L; Gardner, P; Heinonen, M; Hopia, A; Huynh-Ba, T; Lambelet, P; McPhail, D; Skibsted, L and Tijburg, L. Investigation of plants extracts for the protection of processed food against lipid oxidation. Comparison of antioxidant assays based on radical scavenging, lipid oxidation and analysis of the principal antioxidant compounds. European Food Research and Technology. 212: 319-328 (2001). Yokota,T.;Hattori,T.;Ohishi,H.;Ohami,H and Watanabe, K.. 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