Anti-HBcAg Total - WAMA Diagnóstica

MS 10310030131
BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA
1. Lee, W.M.: Hepatitis B Viral Infection. N Engl J Med, 337 (24): 1733-1743, 1997.
2. Vyas, G.N. and Yen, T.S.B.: Hepatitis B Virus. In: Spencer, S. editor. Viral Hepatitis Diagnosis, Therapy,
and Prevention. Human Press, New Jersey, 35-63, 1999.
3. Fagan, E.A. and Harrison, T.J.: Hepatitis B (HBV) and Hepatitis D (HDV, delta) Viruses. In Viral Hepatitis.
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4. Dufour D.R., Lott, J.A., Nolte, F.S., Gretch, D.R., Koff, R.S., Seeff, L.B.: Diagnosis and monitoring of
hepatic injury. I. Performance characteristics of laboratory tests. Clin Chem, 46(12): 2027-2049, 2000.
5. Turgeon, M.L.: Viral Hepatitis. Immunology & Sorology In Laboratory Medicine, 3rd Ed., Mosby: 283307, 2003.
6. Zhang, B.H., Yang, B.H., and Tang, Z.Y.: Randomized controlled trial of screening for hepatocellular
carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol, 130(7): 417-422, 2004.
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Asian/Pacific Islander populations--New York City, 2005. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 55(18): 505509, 2006b.
8. Lok, A.S., McMahon, B.J.: Chronic hepatitis B. Hepatology, 45:507, 2007.
Imuno-Elisa
Anti-HBcAg Total
Kit para determinação qualitativa de Anticorpos Anti-Antígeno Core Total da Hepatite B no
soro ou plasma humano, por enzimaimunoensaio (ELISA).
Kit for the qualitative detection of Total Hepatitis B Core Antibody (HBcAb) in human serum or
plasma, by Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Kit para determinación cualitativa de Anticuerpos Anti-Antígeno Core Total de la Hepatitis B
en suero o plasma humano, por enzimainmunoensayo (ELISA).
REF
415096-E - 96 determinações / determinations / determinaciones
REF
415192-E - 192 determinações / determinations / determinaciones
WAMA Diagnóstica
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Edição I: Rev. 09/2012
01
PORTUGUÊS
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
O vírus da hepatite B (HBV) pertence à família Hepadnaviridae, que compreende uma série de vírus
hepatotrópicos. Ele apresenta uma estrutura externa ou superficial (antígeno de superfície - HBsAg) e outra
interna denominada centro ou “core” (HBcAg). Há também uma fração antigênica, oriunda da parte central,
denominada antígeno “e” (HBeAg). No soro de pacientes infectados podem-se observar duas formas: uma
partícula completa (partícula de Dane) com 42 nm de diâmetro e nucleocapsídeo de 27 nm, que é indicativa
de replicação viral, cujo marcador é a presença do HBeAg, e partículas esféricas ou tubulares de 22 nm de
diâmetro, constituídas apenas pelo envelope viral. O principal antígeno do envelope é o HBsAg, enquanto no
core são encontrados o HBcAg e o HBeAg.
Anti-HBcAg Total é detectado em todos os pacientes com infecção aguda ou crônica pelo vírus B da hepatite.
Na ausência do HBsAg, a presença do Anti-HBcAg-IgM confirma o diagnóstico de hepatite B aguda recente,
enquanto sua ausência exclui o diagnóstico. Como o HBsAg pode formar imunocomplexos com os anticorpos
produzidos (anti-HBsAg), ele pode desaparecer do soro de até 50% de pacientes sintomáticos. Portanto,
durante esta fase o indicador de infecção pelo vírus B da hepatite é o anti-HBcAg. O tempo entre o
desaparecimento do antígeno HBsAg e o aparecimento do anticorpo anti-HBsAg, conhecido como janela
imunológica ou fase antígeno “escondido” da hepatite B, pode ser de poucas semanas, vários meses ou um
ano e, durante este tempo, o anti-HBcAg pode ser o único marcador sorológico da hepatite B.
Anti-HBcAg Total tem também sido utilizado em bancos de sangue para identificar doadores onde ele está
presente como o único marcador sorológico de hepatite B.
O Imuno-ELISA Anti-HBcAg Total da WAMA é um teste imunoenzimático por competição, fase sólida,
que utiliza proteínas recombinantes da região do core do vírus B (HBcAg) para detectar a presença de
anticorpos anti-HBcAg Total no soro ou plasma humano, com a finalidade de identificar indivíduos com
infecção recente ou pregressa da hepatite B.
PRINCÍPIO DO MÉTODO
As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com antígenos recombinantes do core do vírus B (fase
sólida). Amostras de soro ou plasma contendo anticorpos anti-HBcAg adicionadas às cavidades e um conjugado
anti-HBcAg marcado com peroxidase competem entre si para ligação aos sítios limitados da fase sólida. Após a
incubação, os reagentes não ligados são removidos por lavagem. Um substrato (TMB + peróxido de hidrogênio
uréia) é adicionado, o qual desenvolverá cor azul nas cavidades onde a enzima peroxidase estiver presente. A
intensidade da cor é proporcional à quantidade de conjugado ligado e, consequentemente, à menor presença de
anti-HBcAg presente na amostra. A adição de uma solução ‘‘stop‘‘ ácida para bloqueio da reação enzimática
mudará a cor da solução para amarela. A absorbância é então medida a 450 nm. A concentração do anticorpo
anti-HBcAg é inversamente proporcional a intensidade da cor da reação.
APRESENTAÇÃO DO KIT
R E F 415096-E - 96 determinações
1. Microplaca com cavidades cobertas com antígeno recombinante do HBcAg (12 tiras removíveis com 8
cavidades cada)
2. Solução de lavagem - 20 x concentrada (1 x 30 ml)
3. Conjugado anti-HBcAg marcado com peroxidase (1 x 6,5 ml)
4. Substrato Cromógeno – Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (1 x 7,0 ml)
5. Substrato Cromógeno – Solução B (TMB) (1 x 7,0 ml)
6. Solução Stop (1 x 7,0 ml)
7. Soro Controle Negativo (1 x 1 ml)
8. Soro Controle Positivo (1 x 1 ml)
9. Instruções para uso
415192-E - 192 determinações
1. Microplacas com cavidades cobertas com antígeno recombinante do HBcAg (24 tiras removíveis com 8
cavidades cada)
2. Solução de lavagem - 20 x concentrada (2 x 30 ml)
3. Conjugado anti-HBcAg marcado com peroxidase (2 x 6,5 ml)
4. Substrato Cromógeno – Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (2 x 7,0 ml)
5. Substrato Cromógeno – Solução B (TMB) (2 x 7,0 ml)
REF
18
11. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para
mantener las mismas condiciones del test.
12. No usar reactivos después de la fecha de validez.
13. Descartar el material conforme a las reglamentaciones locales.
Seguir las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en la conservación, manipulación y descarte de los
materiales.
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HEPATITIS B – Interpretación de los Marcadores
SIGNIFICADO
MARCADOR
HBsAg
Es el primer marcador que aparece en la hepatitis B. Disminuis dentro de 6 meses.
Su presencia durante más de 6 meses indica hepatitis crónica.
Anti-HBsAg
Su presencia indica inmunidad al VHB. Presente después de la desaparición de HBsAg.
Está presente sólo en los individuos vacunados.
Anti-HBcAg Total
Su presencia significa una infección reciente o pasada por VHB.
Necesidad de otros marcadores para caracterizar la etapa de la enfermedad.
Anti-HBcAg IgM
Indica infección reciente. Se puede encontrar en hasta 32 semanas después de la infección.
HBeAg
Se trata de un marcador de la replicación viral. Su presencia indica infectividad alta.
En las cepas mutadas pre-core (que no producen la proteína "e") pueden estar ausentes,
aunque la replicación viral a continuar, y en consecuencia su alta infectividad.
Anti-HBeAg
Indica el final de la fase de replicación viral. Aparece después de la desaparición de HBeAg.
HEPATITIS B – Interpretación de los Resultados Serológicos**
Interpretación HbsAg
Anti-HBsAg
Anti-HBcAg
Total
Anti-HBcAg
IgM
HBeAg
Anti-HBeAg
No Inmune
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
Infección Reciente
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)
(-)
Inicio
Convalecencia
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
Inmune - Reciente
Infección Pasada
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(+)
Inmune - Infección
Pasada
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
Inmune - Infección
Pasada
(-)
(-)*
(+)
(-)
(-)
(-)
Inmune – Uso de
Vacuna
(-)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
* El anti-HBsAg puede ser indetectable por las pruebas serológicas de infección previa después de mucho tiempo.
** Perfiles serológicos atípicos se pueden encontrar en el curso de la infección por VHB.
TÉRMINO DE GARANTÍA
WAMA Diagnóstica garantiza el cambio de este conjunto diagnóstico, siempre y cuando esté dentro del plazo
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02
RESULTADO
Verdaderos
Positivos
70
Falsos
Positivos
1
Verdaderos
Negativos
229
Falsos
Negativos
0
Sensibilidad
(%)
100
Especificidade
(%)
99,57
ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
No se observó reacción cruzada con sueros de pacientes infectados por el virus de la hepatitis A, vírus de la
hepatitis C, HIV, citomegalovírus y Treponema pallidum.
Durante las pruebas, no hay efecto "Hook" en las concentraciones elevadas de anticuerpos se observaron ni
interferencia de factor reumatoide hasta la concentración 2000 U/ml fue verificado.
Las características de rendimiento de la prueba no es afectada por las altas concentraciones de bilirrubina y
hemoglobina.
PRECISIÓN DEL TEST
a. Precisión Intraensayo
La precisión intra-ensayo se determinó mediante el ensayo de 2 muestras de suero positivos, una alta y
replica bajo, en 6 replicas.
Muestras
Positivas
Número de Veces
Alta
Baja
06
06
Promedia de las
Absorbancias
0,026
0,140
Desviación
Estándar
0,0007
0,0014
CV
(%)
2,83
1,01
b. Precisión Interensayo
La precisión inter-ensayo se determinó analizando 1 muestra de suero positivos y una muestra de suero
negativa para seis carreras diferentes.
Muestras
Positivas
Positivo
Negativo
Número de Veces
06
06
Promedia de las
Absorbancias
0,027
1,303
Desviación
Estándar
0,0006
0,0015
CV
(%)
2,36
0,117
LIMITACIONES DE USO
Ÿ La prueba Imuno-ELISA Anti-HBcAg Total de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta
sensibilidad y especificidad. Es de destacar también que los anticuerpos pueden ser indetectables en las
etapas iniciales de la enfermedad y en algunos individuos inmunosuprimidos.
ŸResultados repetidamente reactivos siempre se deben interpretar con información clínica del paciente y los
resultados de otras pruebas de laboratorio.
ŸEjemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no reactivo.
ŸDebido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a diversas
razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado inadecuado.
ŸLa prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
1. Los reactivos deben conservarse entre 2 – 8 ºC.
2. La fecha de validez corresponde al último día del mes señalado en la etiqueta de los frascos y de la caja del kit
3. Se debe evitar exponer los reactivos a temperaturas elevadas, así como directamente al sol.
4. No congele cualquier reactivo, pues esto causará deterioro irreversible.
5. Lo Imuno-ELISA Anti-HBcAg de WAMA contiene material de origen humano, que se pusieron a prueba
con resultados negativos para anticuerpos anti-HIV I e II, antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg)
(excepto el Suero Control Positivo) y anti-HCV. Debido a que ninguna prueba puede ofrecer completa
seguridad, a falta de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de todos los
reactivos como materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos
materiales.
6. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes.
7. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente (20 – 25 ºC) antes de iniciar los tests
8. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma inmediata
después de su uso.
9. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo.
10. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación.
6. Solução stop (2 x 7,0 ml)
7. Soro Controle Negativo (2 x 1,0 ml)
8. Soro Controle Positivo (2 x 1,0 ml)
9. Instruções para uso
PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES
Ÿ MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a
temperatura ambiente (20-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado,
com dissecante, e mantidas entre 2-8 ºC.
ŸTAMPÃO DE LAVAGEM 20 x concentrado (2): tampão salino-fosfato (PBS), pH 7,4, contém tween 20
como detergente. Diluir o volume do concentrado completando para 570 ml com água destilada ou
deionizada. Se houver presença de cristais no tampão concentrado, eles devem ser dissolvidos a 37 ºC antes
da diluição. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente
350µl do tampão diluído. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar.
ŸCONJUGADO Anti-HBcAg MARCADO COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC
até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura
ambiente (20-25 ºC) antes de usar.
ŸSUBSTRATO CROMÓGENO – SOLUÇÃO A (PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO URÉIA) (4): estabilizado e
pronto para uso. Estável entre 2-8 °C até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não
congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar.
Ÿ SUBSTRATO CROMÓGENO – SOLUÇÃO B (TMB) (5): solução estabilizada de tetrametilbenzidina.
Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não
congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não
carcinogênico.
ŸSOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4) 1,0 M. Manusear com cuidado. É
corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a
temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do
frasco.
ŸSORO CONTROLE NEGATIVO (7): soro humano negativo para Anti-HBcAg. Pronto para uso. Usar puro,
ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco.
ŸSORO CONTROLE POSITIVO (8): soro humano positivo para Anti-HBcAg. Pronto para uso. Usar puro, ou
seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco.
Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade
descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2 - 8ºC).
AMOSTRAS
Usar amostra de soro ou plasma livre de hemólise, lipemia e contaminação.
A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser
mantidas no freezer a -20 ºC. Amostras congeladas devem ser homogeneizadas antes do teste. Evitar
formação de espuma.
Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos, pois isto pode causar falsos resultados. Não usar
amostras inativadas.
MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO
ŸMicropipeta (50 µl) e ponteiras.
ŸÁgua destilada ou deionizada para diluição do tampão de lavagem.
ŸAgitador de microplaca.
ŸIncubador com temperatura de 37 ºC.
ŸLeitora de microplaca com filtro de 450 nm.
ŸPapel absorvente.
ŸRecipiente para descarte de material.
PROCEDIMENTO
IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de
onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do “blank” deve ser
desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm.
1. De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 3 cavidades para o soro controle
negativo (7) e 2 cavidades para o soro controle positivo (8). Usar 1 cavidade para o “blank”, o qual conterá
03
somente 50 µl do substrato cromógeno – Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno – Solução B (5).
2. Dispensar 50 µl dos soros controles positivo e negativo (sem diluir) conforme o estabelecido no item 1.
Dispensar 50 µl das amostras nas outras cavidades a serem testadas. Usar ponteiras individuais para
cada pipetagem, evitando com isso contaminação.
3. Dispensar 50 µl do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no “blank”.
4. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por vibração mecânica (agitador
de placa) por 30 segundos.
5. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37 ºC por 60 minutos.
6. Descartar o conteúdo da placa dentro de um recipiente contendo solução desinfetante, tendo o cuidado de
evitar contaminação entre as cavidades.
7. Lavar a placa 5 vezes com a solução de lavagem diluída (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos).
Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350 µl de solução de lavagem diluída (2) em cada cavidade,
aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 4 vezes este procedimento (total de 5
ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática.
ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do
ensaio.
8. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido
residual.
9. Dispensar 50 µl do substrato cromógeno – Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno – Solução B (5)
em cada cavidade da microplaca, inclusive no “blank”. Haverá o desenvolvimento de cor azul onde a enzima
peroxidase estiver presente. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por
agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos.
10. Incubar a 37 °C por 15 minutos, protegendo da luz.
11. Bloquear a reação dispensando 50 µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca, inclusive no
“blank”. A cor da solução mudará para amarela. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas
bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos.
12. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o “blank” do substrato,
dentro de 5 minutos.
16
A
B
C
D
E
F
G
H
EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA
1
2
3
4
.....
.....
Blank
A3
Controle Neg.
A4
Controle Neg.
A5
Controle Neg.
A6
Controle Pos.
A7
Controle Pos.
A1
A2
12
CÁLCULOS DE LOS RESULTADOS
Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene restando
de la lectura de la D.O. el valor del blank. Si dupla longitud de onda dual se utiliza, lo "blanco" se omite, y por
lo tanto las lecturas de D.Os. se utilizan sin sustracción.
Si más de una placa que se utiliza debe ser considerado por separado para el cálculo y la interpretación de los
resultados.
Determinar el valor del Cut-off:
Cut-off = promedio de la D.O. de los Controles Negativos x 0,5
Atención: Si el valor de D.O. en uno de los controles negativos no atender la pista del control especificado
para validar el ensayo, la D.O. de este control debe ser desechada. Si más de un control negativo no pasó, la
prueba debe considerarse inválida y deberá repetirse.
Ejemplo: Valor de las D.Os. de los Controles Negativos = 1,700 – 0,790 – 1,710
NOTA: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de
onda de 630 nm é recomendado quando disponível.
IMPORTANTE:
• O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão
leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas.
• A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada.
• O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos.
RESUMO DO PROCEDIMENTO
1. Pipetar 50 µl da amostra, controle negativo (7) (3 cavidades) e controle positivo (8) (2 cavidades) na
microplaca.
2. Pipetar 50 µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto “blank”.
3. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar a 37 ºC por 60 minutos.
4. Descartar o conteúdo da placa e lavar 5 vezes com solução de lavagem (2)
5. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual.
6. Pipetar 50 µl do substrato cromógeno – Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno – Solução B (5) em
cada cavidade da placa, inclusive no “blank”. A cor da solução fica azul onde houver peroxidase.
7. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar no escuro a 37 °C por 15 minutos.
8. Pipetar 50 µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca, inclusive no “blank”. A cor da solução
ficará amarela.
9. Homogeneizar por 30 segundos.
10. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o “blank” dentro de 5 minutos.
Entonces, D.O. de 0,790 deve ser desechada y la promedia de D.O. de los controles negativos es
(1,700 + 1,710)/2 = 1,705
Entonces, Cut-off = 1,705 x 0,5 = 0,852
VALIDACIÓN DEL TEST:
El test es válido si:
ŸLa D.O. del "blank", que contiene solamiente los Sustrato Cromógeno A y B y Solución Stop, es inferior que
0,080 a 450 nm.
ŸLo valor de la D.O. de los controles negativos deben ser igual o mayor a 0,800 a 450/630 nm o a 450 nm
después de sustraer el "blank".
ŸLo valor de la D.O. de los controles positivos deben ser inferior a 0,100 a 450/630 nm o a 450 nm después
de sustraer el "blank".
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Dividir lo valor de D.O. de la muestra de paciente por lo valor de Cut-off. Lo test es considerado:
REACTIVO
: valor igual o menor que 0,9.
DUDOSO (Borderline)
: valor está entre 0,9 y 1,1.
NO REACTIVO
: valor mayor que 1,1.
ADVERTENCIA: ES SIEMPRE RECOMIENDADO REPETER LO TEST EN LAS MUESTRAS REACTIVAS.
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST
En un estudio de 300 muestras de suero y plasma obtenidas de un laboratorio de referencia, de los cuales 70
eran positivos y 230 negativos se determinó la sensibilidad y la especificidad de lo kit Imuno-ELISA antiHBcAg da WAMA.
Sensibilidad = Verdaderos Positivos / (Verdaderos Positivos + Falsos Negativos) x 100
Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos) x 100
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onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser
descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm.
1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, usar 3 pocillos para el suero control
negativo (7) y 2 pocillos para el suero control positivo (8). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá
solamente 50μl delsustrato cromógeno – Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno – Solución B (5).
2. Dispensar 50μl de los sueros controles positivo y negativo (sin diluir) conforme a lo establecido en el ítem
1. Dispensar 50μl de las muestras en los otros pocillos que serán testeados. Usar puntas de pipeta
individuales para cada pipeteado, evitando la contaminación.
3. Dispensar 50μl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank.
4. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración
mecánica (agitador de placa) por 30 segundos.
5. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37 ºC por 60 minutos.
6. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante, teniendo cuidado de evitar
la contaminación entre pocillos.
7. Lavar la placa 5 vezes con la solución de lavado diluida (2) (ver Preparación y Estabilidad de los
Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado diluida (2) en cada
pocillo, esperar 30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 4 veces este procedimiento (total
de 5 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual.
ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de
lavado sean adecuados.
8. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier
residuo líquido.
9. Dispensar 50μl del sustrato cromógeno – Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno – Solución B (5) en
cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Aparecerá un color azul donde esté presente la enzima
peroxidasa. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por
vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos.
10. Incubar a 37 °C por 15 minutos, protegerlo de la luz.
11. Bloquear la reacción dispensando 50μl de la solución Stop (6) en cada pocillo de la microplaca, inclusive
el blank. La solución se tornará amarilla. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los
bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos.
12. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del
sustrato, en un plazo de 5 minutos.
NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de
onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible.
IMPORTANTE:
• El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a lecturas
inexactas o absorbancias falsamente elevadas.
• Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio.
• El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos.
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO
1. Pipetear 50μl de la muestra, control negativo (7) (3 pocillos) y control positivo (8) (2 pocillos) en la
microplaca.
2. Pipetear 50μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank..
3. Mezclar durante 30 segundos y se incuban a 37 ° C durante 60 minutos.
4. Descartar el contenido de la placa y lavar 5 veces con tampón de lavado (2)
5. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido.
6. Dispensar 50μl del sustrato cromógeno – Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno – Solución B (5) en
cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank (debese contener solamiente estes reactivos). El color de la
solución se volverá azul donde sea detectada la presencia de peroxidasa.
7. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar en la oscuridad a 37 °C por 15 minutos.
8. Pipetear 50μl de la Solución Stop (6) en cada pocillo de la microplaca. El color de la solución se volverá
amarillo.
9. Homogeneizar por 30 segundos.
10. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank, en un
plazo de 5 minutos.
04
A
B
C
D
E
F
G
H
EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA
1
2
3
4
.....
.....
Blank
A3
Controle Neg.
A4
Controle Neg.
A5
Controle Neg.
A6
Controle Pos.
A7
Controle Pos.
A1
A2
12
CÁLCULOS DOS RESULTADOS
Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo
da leitura da D.O. do “blank”. Se duplo comprimento de onda é usado o “blank” é omitido e, portanto, as
leituras das D.Os. são usadas sem subtração.
Se mais do que uma microplaca é utilizada elas deveriam ser consideradas separadamente para cálculos e
interpretação dos resultados.
Determinar o valor do Cut-off:
Cut-off = média das D.Os. dos Controles Negativos x 0,5
Atenção: Se o valor da D.O. de um dos controles negativos não atender a faixa controle especificada para
validação do teste, a D.O. deste controle deve ser descartada. Se mais do que um controle negativo não
atender, o teste deve ser considerado inválido e deve ser repetido.
Exemplo: Valor das D.Os. dos Controles Negativos = 1,700 – 0,790 – 1,710
Então, D.O. de 0,790 deve ser descartada e a média da D.O. dos controles negativos é
(1,700 + 1,710)/2 = 1,705
Portanto, Cut-off = 1,705 x 0,5 = 0,852
VALIDAÇÃO DO TESTE:
O teste é válido se:
ŸA D.O. do “blank”, que contém somente Substrato Cromógeno A e B e Solução Stop é menor do que 0,080 a
450 nm.
ŸO valor da D.O. dos controles negativos é igual ou maior do que 0,800 a 450/630 nm ou a 450 nm após
subtrair o “blank”.
ŸO valor da D.O. dos controles positivos é menor do que 0,100 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o
blank.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Dividir o valor da D.O. da amostra do paciente pelo valor do Cut-off. O teste é considerado:
REAGENTE
: se valor igual ou menor do que 0,9.
DUVIDOSO (Borderline)
: se valor entre 0,9 e 1,1.
NÃO REAGENTE
: se valor maior do que 1,1.
ATENÇÃO: É SEMPRE RECOMENDADO REPETIR O TESTE NAS AMOSTRAS REAGENTES.
SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE
Em um estudo realizado com 300 amostras de soro e plasma obtidas de um Laboratório de referência, das
quais 70 eram positivas e 230 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit ImunoELISA anti-HBcAg Total da WAMA.
Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100
Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100
05
14
RESULTADO
Verdadeiros
Positivos
70
Falsos
Positivos
1
Verdadeiros
Negativos
229
Falsos
Negativos
0
Sensibilidade
(%)
100
Especificidade
(%)
99,57
ESPECIFICADADE ANALÍTICA
Não foi observada reação cruzada em soros de pacientes infectados por vírus da hepatite A, vírus da hepatite
C, HIV, citomegalovírus e Treponema pallidum.
Durante os testes realizados, nenhum efeito “Hook” para altas concentrações de anticorpos foi observado
nem interferência com fator reumatoide até a concentração de 2000 UI/mL foi verificada.
A performance característica do teste não é afetada por concentrações elevadas de bilirrubina e
hemoglobina.
PRECISÃO DO TESTE
a. Precisão Intra-Ensaio
A precisão intra-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros positivos, uma alta e outra baixa, em
06 replicatas.
Amostras
Positivas
Alta
Baixa
Número de Vezes
06
06
Média das
Absorbâncias
0,026
0,140
Desvio
Padrão
0,0007
0,0014
CV
(%)
2,83
1,01
b. Precisão Inter-Ensaio
A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 1 amostra de soros positivos e 1 amostra de soro
negativo em 6 diferentes corridas.
Amostras
Positivas
Alta
Baixa
Número de Vezes
06
06
Média das
Absorbâncias
0,027
1,303
Desvio
Padrão
0,0006
0,0015
CV
(%)
2,36
0,117
LIMITAÇÕES DE USO
Ÿ O teste Imuno-ELISA Anti-HBcAg Total da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta
sensibilidade e especificidade. Ressalta-se também que os anticorpos podem ser indetectáveis nos estágios
iniciais da doença e em alguns indivíduos imunossuprimidos.
Ÿ Resultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do
paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais.
Ÿ Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não
reagentes.
ŸDevido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados positivos podem ocorrer devido a várias
razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem.
ŸA prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste.
PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS
1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 – 8 ºC.
2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit.
3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol.
4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível.
5. O Imuno-ELISA Anti-HBcAg da WAMA contém materiais de origem humana, os quais foram testados,
com resultados negativos para anticorpos anti-HIV I e II, antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg)
(exceto o Soro Controle Positivo) e anti-HCV. Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa
segurança, na ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar todos os reagentes
como materiais potencialmente infecciosos, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais.
6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes.
7. Deixar os reagentes adquirir a temperatura ambiente (20 – 25 ºC) antes de iniciar os testes.
8. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso.
9. Não deixar as cavidades da microplaca secar durante o ensaio.
10. Evitar repetidas pipetagens dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação.
11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as
4. Sustrato Cromógeno – Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (2 x 7,0 ml)
5. Sustrato Cromógeno – Solución B (TMB) (2 x 7,0 ml)
6. Solución Stop (2 x 7,0 ml)
7. Suero Control Negativo (2 x 1,0 ml)
8. Suero Control Positivo (2 x 1,0 ml)
9. Instrucciones de uso
PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS
ŸMICRO PLACA (1): Retirar del envelope la cantidad de tiras que se utilizarán y dejar que alcancen la
temperatura ambiente (20-25 ºC). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con
disecante, y deben mantenerse entre 2-8 ºC.
Ÿ SOLUCIÓN DE LAVADO 20 X concentrado (2): tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4, conteniendo
Tween 20 como detergente. Diluir el volumen del concentrado completando 570 ml con agua destilada o
desionizada. Si hay cristales en el tampón concentrado, deben disolverse a 37° C antes de la dilución..
Durante cada ciclo de lavado, se debe completar cada pocillo con aproximadamente 350 ul del tampón.
Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar
Ÿ CONJUGADO Anti-HBcAg MARCADO CON PEROXIDASA (3): listo para usar. Estable entre 2-8 ºC
hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la
temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar
ŸSUBSTRATO CROMÓGENO – SOLUCIÓN A (PERÓXIDO DE HIDRÓGÊNO UREIA) (4): estabilizado y
listo para usar Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No
congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar
ŸSUSTRATO CROMÓGENO – SOLUCIÓN B (TMB) (5): solución estabilizada de tetrametilbenzidina Listo
para usar. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar.
Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar La TMB no es ni mutagénica ni
carcinogénica.
ŸSOLUCIÓN STOP (6): listo para usar. Contiene ácido sulfúrico (H2SO4) 1,0 M. Manipular con cuidado. Es
corrosivo. En caso de contacto con la piel lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance la
temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar Estable hasta la fecha de vencimiento impresa en la
etiqueta del frasco.
ŸSUERO CONTROL NEGATIVO (7): suero humano negativo para Anti-HBcAg. Listo para usar. Usar puro,
en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del
frasco.
ŸSUERO CONTROLE POSITIVO (8): suero humano positivo para Anti-HBcAg. Listo para usar. Usar puro,
en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del
frasco.
Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de
vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2 - 8ºC).
MUESTRAS
Usar muestras de suero libres de hemólisis, lipemia y contaminación.
Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Durante un período mayor,
deben guardarse en freezer a -20 ºC. Las muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test.
Evite la formación de espuma.
Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. No
usar muestras inactivadas.
ŸMATERIAL NECESARIO, NO SUMINISTRADO
ŸMicropipeta (50μl) y puntas de pipeta.
ŸAgua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado.
ŸAgitador de microplaca.
ŸIncubadora con una temperatura de 37 º C
ŸLector de micro placa con filtro de 450 nm
ŸPapel absorbente.
ŸRecipiente para descarte de material.
PROCEDIMIENTO
IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de
13
ESPAÑOL
IMPORTANCIA CLÍNICA
El virus de la hepatitis B (HBV) pertenece a la familia Hepadnaviridae, que incluye una serie de virus
hepatotrópicos. Cuenta con una estructura externa o superficial (antígeno de superficie - HBsAg) y otra
interna denominada centro o “core” (HBcAg). También hay una fracción antigénica, oriunda de la parte
central, denominada antígeno “e” (HBeAg). En sueros de pacientes infectados se pueden observar dos
formas: una partícula completa (partícula de Dane) con 42 nm de diámetro y nucleocápside de 27 nm,
indicativo de la replicación viral, cuyo marcador es la presencia del HBeAg, y partículas esféricas o tubulares
de 22 nm de diámetro, constituidas sólo por la envoltura viral. El principal antígeno de la envoltura es el
HBsAg, mientras que en el core se encuentran el HBcAg y el HBeAg.
El Anti-HBcAg Total se detecta en todos los pacientes con infección aguda o crónica por el virus B de la
hepatitis. En ausencia del HBsAg, la presencia del Anti-HBcAg-IgM confirma el diagnóstico de hepatitis B
aguda reciente, mientras que su ausencia excluye el diagnóstico. Como el HBsAg puede formar
inmunocomplejos con los anticuerpos producidos (anti-HBsAg), puede desaparecer del suero de hasta
50%de pacientes sintomáticos. Por tanto, durante esta fase el indicador de infección por el virus B de la
hepatitis es el anti-HBcAg. El tiempo entre la desaparición del antígeno HBsAg y la aparición del anticuerpo
anti-HBsAg, conocido como ventana inmunológica o fase antígeno “escondido” de la hepatitis B, puede ser
de pocas semanas, varios meses o un año y, durante este tiempo, el anti-HBcAg puede ser el único marcador
serológico de la hepatitis B.
El Anti-HBcAg Total también ha sido utilizado en bancos de sangre para identificar donantes donde se
encuentra presente como el único marcador serológico de hepatitis B.
El Imuno-ELISA Anti-HBcAg Total de WAMA es un test inmunoenzimático por competición, fase sólida,
que utiliza proteínas recombinantes de la región del core del virus B (HBcAg) para detectar la presencia de
anticuerpos anti-HBcAg Total en suero o plasma humano, con la finalidad de identificar individuos con
infección reciente o anterior de hepatitis B.
06
mesmas condições do teste.
12. Não usar reagentes após a data de validade.
13. Descartar o material conforme regulamentações locais.
Utilizar a Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais.
HEPATITE B – Interpretação dos Marcadores
HBsAg
É o primeiro marcador que aparece na hepatite B. Declina em até 6 meses.
Sua presença por mais de 6 meses indica hepatite crônica.
Anti-HBsAg
Sua presença indica imunidade ao HBV. Presente após o desaparecimento do HBsAg.
Está presente isoladamente em indivíduos vacinados.
Anti-HBcAg Total
Sua presença significa infecção recente ou pregressa pelo HBV. Necessita de outros
marcadores para caracterizar a fase da doença.
Anti-HBcAg IgM
Indica infecção recente. Pode ser encontrado em até 32 semanas após a infecção.
HBeAg
É marcador de replicação viral. Sua presença indica alta infecciosidade. Em cepas com
mutação pré-core (não produtoras da proteína “e”) pode estar ausente, embora a replicação
viral continue e, consequentemente, sua alta infecciosidade.
Anti-HBeAg
Indica o fim da fase de replicação viral. Surge após desaparecimento do HBeAg.
HEPATITE B – Interpretação dos Resultados Sorológicos**
PRESENTACIÓN DEL KIT
R E F 415096-E - 96 determinaciones
1. Microplaca con pocillos recubiertos con antígeno recombinante HBcAg (12 tiras extraíbles, con 8 pocillos
c/u).
2. Solución de lavado - 20 x concentrada (1 x 30 ml)
3. Conjugado anti-HBcAg marcado con peroxidasa (1 x 6,5 ml).
4. Sustrato Cromógeno – Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (1 x 7,0 ml)
5. Sustrato Cromógeno – Solución B (TMB) (1 x 7,0 ml)
6. Solución Stop (1 x 7,0 ml)
7. Suero Control Negativo (1 x 1 ml)
8. Suero Control Positivo (1 x 1 ml)
9. Instrucciones de uso
R E F 415192-E - 192 determinaciones
1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígeno recombinante HBcAg (24 tiras extraíbles, con 8 pocillos
c/u).
2. Solución de lavado - 20 x concentrada (2 x 30 ml)
3. Conjugado anti-HBcAg marcado con peroxidasa (2 x 6,5 ml).
Anti-HBcAg
Total
Anti-HBcAg
IgM
HBeAg
Anti-HBeAg
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)*
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
HbsAg
Anti-HBsAg
Não Imune
(-)
(-)
(-)
Infecção Recente
(+)
(-)
(+)
Início
Convalescência
(-)
(-)
(+)
Imune – Infecção
Passada Recente
(-)
(+)
Imune – Infecção
Passada
(-)
Imune – Infecção
Passada
Imune – Uso de
Vacina
Interpretação
PRINCIPIO DEL MÉTODO
Los pocillos de la placa de microtitulación se recubren con antígenos recombinantes del core del virus B (fase
sólida). Muestras de suero o plasma que contienen anticuerpos anti-HBcAg adicionadas a los pocillos y un
conjugado anti-HBcAg marcado con peroxidasa compiten entre si para ligación a los sitios limitados de la
fase sólida. Después de la incubación, los reactivos no ligados se eliminan mediante lavado. Un sustrato
(TMB + peróxido de hidrogênio urea) es adicionado, el cual revelará un color azul en los pocillos donde la
enzima peroxidasa esté presente. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de conjugado ligado y,
consecuentemente, la menor presencia de anti-HBcAg en la muestra. La adición de una solución stop ácida
para bloquear la reacción enzimática le dará un color amarillo a la solución. Entonces, la absorbancia se mide
a 450 nm. La concentración del anticuerpo anti-HBcAg es inverso a la intensidad del color de la reacción.
SIGNIFICADO
MARCADOR
* O anti-HBsAg pode estar em níveis indetectáveis pelos testes sorológicos em infecção pregressa após longo tempo.
** Perfis sorológicos atípicos podem ser encontrados no curso da infecção pelo HBV.
TERMO DE GARANTIA
A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do
prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução,
manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas
no desempenho do kit sob essas condições.
07
12
ENGLISH
HEPATITIS B - Interpretation of Markers
MEANING
MARKER
SUMMARY
The Hepatitis B Virus (HBV) belongs to the Hepadnaviridae family, which makes it a hepatotrophic virus. It
has an external or superficial structure (surface antigen - HBsAg), and another core (HBcAg). There is also
an antigenic fraction, which grows from the core, called “e” antigen (HBeAg). In serum of infected patients
one can observe two types of structures: a complete particle (Dane's particle), which is 42 nm in diameter
and has a nucleocapside of 27 nm, which is an indication of viral replication through the HBeAg marker, and
spherical or tubular particles of 22 nm in diameter, made out of the viral envelope. The main antigen of the
envelope is the HBsAg, while in the core is HBcAg and HBeAg.
Total anti-HBcAg is detected in all patients with acute infection or chronic by the hepatitis-B virus. In the
absence of HBsAg, the presence of Anti-HBc Ag-IgM confirms the diagnosis of recent acute hepatitis B, while
its absence rules out the diagnosis. As the HBsAg can form complexes with the produced antibodies (antiHBsAg), it may disappear from the serum in up to 50% of symptomatic patients. Therefore, during this
phase the infection indicator by the hepatitis B virus of is the anti-HBcAg. The time between the
disappearance of the HBsAg antigen and the appearance of antibody anti-HBsAg, known as immunological
window or "hidden" antige phase of hepatitis B, may be a few weeks, several months or a year and during
this time, the anti-HBcAg may be the only serologic marker of hepatitis B.
Total anti-HBcAg has also been used in blood banks to identify donors where it is present as the only
serologic marker of hepatitis B.
The Imuno-ELISA anti-HBcAg Total of WAMA is an immunoenzymatic test by competition, solid phase,
which uses recombinant proteins from the core region of the B virus (HBcAg) to detect the presence of Total
anti-HBcAg antibodies in the human serum or plasma, with the purpose of identifying individuals with recent
or previous infection of hepatitis B.
PRINCIPLE OF THE METHOD
The microtiter wells of the plate are covered with the recombinant antigens of the B virus core (solid phase).
Samples of serum or plasma containing anti-HBcAg antibodies added to the cavities and a anti-HBcAg
conjugate marked with peroxidase compete among themselves to bind to the limited sites limited from the
solid phase. After the incubation the unbound reagent is removed by washing. A substrate (TMB + hydrogen
peroxyde) is added, which will develop a blue coloration on the cavities when the peroxidase enzyme is
present. The intensity of the color is proportional to the quantity ofbound conjugate and, consequently, to
the smaller quantity of anti-HBcAg (HBcAb) in the specimen. The addition of an acidic stop solution to block
the enzymatic reaction will change the coloration of the solution to yellow. The absorbance is then measured
at 450 nm. The concentration of Anti-HBcAg (HBcAb) antibody is inversely proportional to the intensity of
the color of the reaction.
KIT PRESENTATION
R E F 415096-E - 96 determinations
1. Microplate with wells coated with recombinant HBcAg antigen (12 removable strips with 8 wells each)
2. Wash Solution – concentrated 20x (1 x 30 mL)
3. anti-HBcAg conjugate tagged with peroxidase (1 x 6.5 mL)
4. Chromogen Substrate – Solution A (Hydrogen Peroxide) (1 x 7.0 mL)
5. Chromogen Substrate – Solution B (TMB) (1 x 7.0 mL)
6. Stop Solution (1 x 7.0 mL)
7. Negative Serum Control (1 x 1 mL)
8. Positive Serum Control (1 x 1 mL)
9. Instructions for use
R E F 415192-E - 192 determinations
1. Microplates with wells coated with recombinant HBcAg antigen (24 removable strips with 8 wells each)
2. Wash Solution – concentrated 20x (2 x 30 mL)
3. anti-HBcAg conjugate tagged with peroxidase (2 x 6.5 mL)
4. Chromogen Substrate – Solution A (Hydrogen Peroxide) (2 x 7.0 mL)
5. Chromogen Substrate – Solution B (TMB) (2 x 7.0 mL)
6. Stop Solution (2 x 7.0 mL)
HBsAg
It is the first marker that appears in hepatitis B. Declines in up to 6 months.
Its presence for more than 6 months indicates chronic hepatitis.
Anti-HBsAg
Its presence indicates immunity to HBV. Present after the disappearance of HBsAg.
Is this present by itself in vaccinated individuals.
Anti-HBcAg Total
Its presence indicates recent or previous infection by HBV.
Need other markers to characterize the phase of the disease.
Anti-HBcAg IgM
Indicates recent infection. Can be found up to 32 weeks after infection.
HBeAg
It is a marker of viral replication. Its presence indicates the high infectivity.
In strains with pre-core mutation (does not produce protein "e") may be absent,
although the viral replication continues and, consequently, its high infectivity.
Anti-HBeAg
Indicates the end of the viral replication stage. Comes after the disappearance of HBeAg.
HEPATITIS B - Interpretation of Serological Results **
Anti-HBcAg
Total
Anti-HBcAg
IgM
HBeAg
Anti-HBeAg
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)*
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
HbsAg
Anti-HBsAg
Not immune
(-)
(-)
(-)
Recent infection
(+)
(-)
(+)
Beginning
Convalescence
(-)
(-)
(+)
Immune - Recent
Previous Infection
(-)
(+)
Immune - Previous
Infection
(-)
Immune - Previous
Infection
Immune use of vaccine
Interpretation
* The anti-HBsAg can be at undetectable levels by serological tests in prior infection after a long time.
** Atypical Serologic Profiles can be found in the course of infection with HBV.
WARRANTY
WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date
and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and
storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits
under these conditions.
11
08
PRECISION OF THE TEST:
a. Intra-Assay Precision
The intra-assay precision was determined by assaying 2 samples of positive sera, one high and one low in 06
replicates.
Positive
Samples
Number of times
High
Low
06
06
Average of
Absorbances
0,026
0,140
Deviation
Standard
0,0007
0,0014
CV
(%)
2,83
1,01
b. Inter-Assay Precision
The inter-assay precision was determined by assaying 1 sample of positive serum and 1 sample of negative
serum in 6 different runs.
Positive
Samples
Number of times
High
Low
06
06
Average of
Absorbances
0,027
1,303
Deviation
Standard
0,0006
0,0015
CV
(%)
2,36
0,117
LIMITATIONS OF USE
ŸThe test Imuno-ELISA Anti-HBcAg Total from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity
and specificity. Also note that that the antibodies may be undetectable in the initial stages of the disease and
in some immunosuppressed individuals.
ŸResults repeatedly reactives must always be interpreted with the clinical information of the patient and with
other laboratory test results.
ŸReactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive.
ŸDue to the high sensitivity of ELISA tests, false positive results may occur due to various reasons, many of
which are related, but not limited to, improper washing step.
7. Negative Serum Control (2 x 1 mL)
8. Positive Serum Control (2 x 1 mL)
9. Instructions for use
REAGENT PREPARATION AND STABILITY
ŸMICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room
temperature (20 – 25°C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope, with
desiccant, and kept at 2 – 8°C.
ŸWASH SOLUTION (20x Concentrated) (2): Phosphate buffered Saline (PBS), pH 7.4, containing Tween
20 as detergent. Dilute the volume of the concentrate, filling it to 570 ml with distilled or deionized water. If
crystals are formed in the concentrated diluent, they must be dissolved at 37°C before the dilution is made.
During each wash cycle, each well must be washed completely with approximately 350µl of the diluted wash
solution. Allow it to reach room temperature (20 – 25°C) before using it.
ŸAnti-HBcAg CONJUGATE TAGGED WITH PEROXIDASE (3): ready to use. Stable at 2 – 8°C up to the
expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 – 25°C) before
using it.
ŸCHROMOGEN SUBSTRATE – SOLUTION A (UREA HYDROGEN PEROXIDE) (4): stabilized and ready
for use. Stable at 2 – 8°C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room
temperature (20 – 25°C) before using it.
ŸCHROMOGEN SUBSTRATE – SOLUTION B (TMB) (5): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine.
Ready to use. Stable at 2 – 8 °C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach
room temperature (20 – 25°C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic.
ŸSTOP SOLUTION (6): ready to use. Contains 1.0 M Sulfuric Acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive.
On skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room temperature (20 –
25°C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle.
ŸNEGATIVE SERUM CONTROL (7): negative human serum to Anti-HBcAg. Ready to use. Use it as is (do
not dilute it). Stable at 2 – 8°C up to the expiration date printed on the bottle.
ŸPOSITIVE SERUM CONTROL (8): human serum positive to Anti-HBcAg. Ready to use. Use it as is (do not
dilute it). Stable at 2 – 8°C up to the expiration date printed on the bottle.
ŸThe prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test.
PRECAUTIONS AND WARNINGS
1. The reagents should be kept between 2 - 8 ºC.
2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box.
3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight.
4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage.
5. The Imuno-ELISA anti-HBcAg from WAMA contains materials of human origin, which have been
tested, with negative results for anti-HIV I and II antibodies, Hepatitis B surface antige virus (HBsAg)
(except in the positive serum control) and anti-HCV. However, as no diagnostic method offers complete
safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to deal with all the reagents as
potentially infectious materials, as well as having the disposing these materials.
6. Do not use reagents or microplates fof different batches.
7. Allow the reagents to reach the room temperature (20 -25ºC) before starting the test.
8. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use.
9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test.
10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination.
11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same
test conditions.
12. Do not use the reagent after the expiration date.
13. Discard the material following local regulations.
14. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials.
Note: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration date described on
the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 °C).
SPECIMENS
Use serum or plasma specimens not hemolysed, lipemic or contaminated.
The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 ° C for 48 hours. For long-term storage, serum or
plasma must be kept in the freezer at – 20ºC. Frozen specimens must be homogenized before testing. Avoid
making foam.
Avoid repeated freezing and thawing as this may lead to false results. Do not use inactivated specimens.
MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED
ŸMicropipettes (50µl) and tips
ŸDistilled and deionized water for the dilution of the wash solution.
ŸMicroplate shaker.
ŸIncubator at 37 °C.
ŸELISA plate reader with 450nm filter.
ŸAbsorbent paper.
ŸContainer for material disposal
PROCEDURE
IMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is
recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded, since it should be
used only when using a 450 nm single filter.
1. In accordance with the plan established plan for the plate distribution, use 3 wells for the serum negative
control (7) and 2 wells for the serum positive control (8). Use one cavity well for the blank, which will only
have 50µl of the chromogen substrate – solution A (4), and 50µl of chromogen substrate – solution B (5).
2. Pipete 50µl of the positive serum control and negative serum control (without diluting them) as instructed
in step 1. Pipete 50 µl of the samples to be tested into the other microplate wells. Use individual tips for
each sample, to avoid contamination.
09
10
3. Pipete 50 µl of the conjugate (3) in all the cavity wells, except on the blank.
4. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or use a
microtiter plate shaker.
5. Cover the plate with adhesive foil and incubate at 37° C for 60 minutes.
6. Discard the contents of the plate into a container with disinfecting solution carefully, to avoid
contamination between the cavities.
7. Wash the plate 5 times with diluted Wash Solution (2) (see Preparation and Stability of Reagents).
Aspirate the contents of the plate, dispense 350µl of diluted Wash Solution (2) in each well, wait 30 seconds,
and empty the contents of the wells. Repeat this procedure 4 times (total of 5 cyclos). We recommend using
a microplate washer (manual or automatic).
WARNING: The correct washing procedure is essential for good performance of the test.
8. After the last wash, turn the plate over and tap it dry on absorbent paper to remove any residual liquid.
9. Pipette 50 µl of chromogen substrate – Solution A (4) and 50 µl of chromogen substrate - Solution B (5) in
each well of the microplate, including the blank. A blue color will develop wherever the peroxidase enzyme is
present. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter
plate shaker for 30 seconds.
10. Incubate at 37° C for 15 minutes, protecting from light.
11. Block the reaction by dispensing 50 µl of Stop Solution (6) in each well of the microplate, including the
blank. The solution will change the color to yellow. Gently homogenize the samples, by holding the plate on
the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds.
12. Read the absorbance (O.D.) in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank of the substrate,
within 5 minutes.
CALCULATION OF RESULTS
Determine the optical density (OD) for each test and control serum. whose the final value is obtained by
subtracting the blank from the OD. If double wavelength is used, the blank is ommited, therefore, the the
O.D readings are used without subtracting.
If more than one microplate is used they should be considered separately for calculation and interpretation
of results.
To determine the Cut-off value:
Cut-off = average OD of Negative Control x 0.5
Warning: If the value of OD one of negative controls does not fall within the control range specified in the
test validation, the OD of this this control should be discarded. If more than one negative control does not
meet the specification, the test should be considered invalid and must be repeated.
Example: OD value of the of negative controls = 1.700 - 0.790 - 1.710
Then, the OD of 0.790 must be discarded and the average of OD of negative controls is
(1.700 + 1.710 ) /2 = 1.705
Therefore, Cut-off = 1.705 x 0.5 = 0.852
TEST VALIDATION:
NOTE: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm
is recommended when available.
ŸThe test is valid if:
ŸThe O.D. of the blank,which contains only Substrate Chromogen A and B and the Stop Solution is less than
IMPORTANT:
• The wash procedure is critical for the performance of the test. Insufficient washing will result in inaccurate
readings or falsely elevated absorbance.
• Performing the tests in duplicate, though not required, is recommended.
• The pipetting time for the specimens and controls should not exceed 30 minutes.
Ÿ The O.D. value of the negative controls must be less than 0.800 at 450/630 nm or at 450 nm after
0.080 at 450 nm.
SUMMARY OF THE PROCEDURE
1. Pipette 50µl of sample, negative control (7) (3 wells) and positive control (8) (two cavities) into the
microplate.
2. Pipette 50µl of enzyme conjugate (3) in each well of the plate, except blank.
3. Mix for 30 seconds and incubate at 37° C for 60 minutes.
4. Discard the contents of the plate and wash it 5 times with wash solution (2)
5. Completely discard the contents of the last wash, removing any residual liquid.
6. Pipette 50µl of Chromogen Substrate - Solution A (4) and 50µl of Chromogen Substrate - Solution B (5) in
each well of the plate, including the blank (which should contain only these reagents). The color of the
solution turns blue wherever there is peroxidase.
7. Mix for 30 seconds and incubated in the dark at 37° C for 15 minutes.
8.Pipette 50µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate. The color of the solution will turn yellow.
9. Mix for 30 seconds.
10. Read the O.D. in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank within 5 minutes.
A
B
C
D
E
F
G
H
EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPILATE
1
2
3
4
.....
.....
Blank
A3
Neg. Coltrol
A4
A5
Neg. Control
A6
Neg. Control
A7
Pos. Control
Pos. Control
A1
A2
subtracting the blank.
ŸThe O.D. value of the positive controls is less than 0.100 at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the
blank.
INTERPRETATION OF THE RESULTS
Divide the OD value of the patient sample by the Cut-off value. The test is considered:
REACTIVE
: if the value is equal or less than 0.9.
INDETERMINATE (Borderline) : if value is between 0.9 and 1.1.
NOT REACTIVE
: if value is greater than 1.1.
WARNING: IT IS ALWAYS RECOMMENDED REPEAT THE TEST IN THE REACTIVE SAMPLES.
SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TEST
In a study conducted with 300 samples of serum and plasma obtained from a reference laboratory, of which
70 were positive and 230 negative, the sensitivity and specificity were determined for the Imuno-ELISA antiHBcAg Total from WAMA.
Sensitivity = True Positive / (True Positive + False Negative) x 100
Specificity = True Negative / (True Negative + False Positive ) x 100
RESULTS
True
Positives
70
False
Positives
1
True
Negatives
229
Falses
Negatives
0
Sensitivity
(%)
100
Especificity
(%)
99,57
12
ANALYTICAL SPECIFICITY
There was no cross-reaction in sera from infected patients by the hepatitis A virus, hepatitis C virus, HIV,
Cytomegalovirus and Treponema pallidum.
During the tests, no "Hook" effect for high concentrations of antibodies was observed nor interference with
rheumatoid factor up to 2000 U/mL.
The performance characteristic of the test is not affected by high concentrations of bilirubin and hemoglobin.