metodo de conservar alimentos usando gases nobles.

k OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS 19 k 2 112 983 kInt. Cl. : A23L 3/3445, A23L 3/3409 11 Número de publicación: 6 51 ESPAÑA A23B 7/152, A23B 4/16 A23B 5/10, A23B 9/18 A23B 9/22, A23D 9/06 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA 12 kNúmero de solicitud europea: 93908882.9 kFecha de presentación : 31.03.93 kNúmero de publicación de la solicitud: 0 586 690 kFecha de publicación de la solicitud: 16.03.94 T3 86 86 87 87 k 54 Tı́tulo: Método de conservar alimentos usando gases nobles. k 30 Prioridad: 03.04.92 US 863172 27.11.92 US 982464 27.11.92 US 982492 pour l’Etude et l’Exploitation des Procedes Georges Claude 75, Quai d’Orsay 75321 Paris Cédex 07, FR k 72 Inventor/es: Spencer, Kevin C. y k 74 Agente: Elzaburu Márquez, Fernando 45 Fecha de la publicación de la mención BOPI: 16.04.98 45 Fecha de la publicación del folleto de patente: 16.04.98 ES 2 112 983 T3 k 73 Titular/es: L’Air Liquide, Société Anonyme Aviso: k Rojak, Patricia A. k En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid ES 2 112 983 T3 DESCRIPCION Fundamentos de la invención 5 Campo de la invención La presente invención se refiere a un método de conservar vegetales utilizando gases nobles. Descripción de los fundamentos 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 La capacidad de los gases nobles helio (He), neón (Ne), argón (Ar), kriptón (Kr), xenón (Xe) y radón (Ra) a entrar en combinación quı́mica con otros átomos es extremadamente limitada. Generalmente, sólo kriptón, xenón y radón han sido inducidos a reaccionar con otros átomos, que son altamente reactivos tales como flúor y oxı́geno, y los compuestos ası́ formados son explosivamente inestables. Véase Advanced Inorganic Chemistry, por F.A. Cotton y G. Wilkinson (Wiley, 3a¯ edición). Sin embargo, aun cuando los gases nobles son, en general, quı́micamente inertes, se sabe que el xenón exhibe ciertos efectos fisiológicos, tales como anestesia. Otros efectos fisiológicos han sido observados también con otros gases inertes tales como nitrógeno que, por ejemplo, causa como es sabido narcosis cuando se utiliza a presión elevada en inmersión profunda en el mar. Se ha consignado en el documento U.S. 3.183.171 de Schreiner que el argón y otros gases inertes pueden influir en la velocidad de crecimiento de los hongos, y se sabe que el argón mejora la conservación del pescado marino o los mariscos comestibles. Documentos U.S. 4.946.326 de Schvester, J.P. 52.105.232, J.P. 80002271 y JP 77027699. Sin embargo, la carencia fundamental de comprensión de estas observaciones hace que sea difı́cil, si no imposible, interpretar dichos resultados. Además, el significado de tales observaciones se ve aun más oscurecido por el hecho de que en estos estudios se utilizaros mezclas de muchos gases, con inclusión de oxı́geno. Adicionalmente, algunos de estos estudios se condujeron a presiones hiperbáricas y a temperaturas de congelación. A dichas presiones elevadas, es probable que los resultados observados fueron causados por el deterioro de los componentes celulares y de las enzimas propiamente dichas debido a la presión. Por ejemplo, desde 1964 a 1966, Schreiner documentó los efectos fisiológicos de los gases inertes particularmente en lo referente a efectos anestésicos y en estudios relacionados con el desarrollo de atmósferas de recipientes adecuados para inmersión profunda en el mar, submarinos y naves espaciales. Los resultados de este estudio se resumen en tres informes, cada uno de los cuales lleva el tı́tulo: “Technical Report. The Physiological Effects of Argon, Helium and the Rare Gases”, preparado por la Oficina de Investigación Naval, Departamento de la Armada. Contract Nonr 4115(00), NR: 102-597. Se han publicado tres sumarios y resúmenes posteriores de este estudio. Un resumen, “Inert Gas Interactions and Effects on Enzymatically Active Proteins”, Fed. Proc. 26:650 (1967), restablece la observación de que los gases nobles y otros gases inertes producen efectos fisiológicos a presiones parciales elevadas en animales intactos (narcosis) y en sistemas celulares microbianos y de mamı́feros (inhibición del crecimiento). Un segundo resumen, “A Possible Molecular Mechanism for the Biological Activity of Chemically Inert Gases”, en: Intern. Congr. Physiol. Sci., 23rd, Tokio, restablece la observación de que los gases inertes exhiben actividad biológica a diversos niveles de organización celular a presiones elevadas. Asimismo, un sumario de los efectos biológicos generales de los gases nobles fue publicado por Schreiner, en el cual se restablecen los resultados principales de su investigación anterior. “General Biological Effects of the Helium-Xenon Series of Elements”, Fed. Proc. 27:872-878 (1968). Sin embargo, en 1969, Behnke et al refutaron las conclusiones principales de Schreiner. Behnke et al llegaron a la conclusión de que los efectos consignados anteriormente por Schreiner son irreproducibles y son únicamente resultado de la presión hidrostática, es decir, que no son demostrables en absoluto efectos de los gases nobles sobre las enzimas. “Enzyme Catalyzed Reactions as Influenced by Inert Gases at High Pressures”. J.Food Sci.34:370-375. En esencia, los estudios de Schreiner se basaban en la hipótesis de que los gases quı́micamente inertes compiten con las moléculas de oxı́geno por los sitios celulares y que el desplazamiento del oxı́geno depende de la relación de las concentraciones de oxı́geno a gas inerte. Esta hipótesis no fue nunca demostrada, dado que los máximos efectos observados (únicamente se observaron efectos inhibidores) fueron observados con óxido nitroso y se encontró que eran independientes de la presión parcial de oxı́geno. Además, 2 ES 2 112 983 T3 la inhibición observada fue solamente 1,9% de inhibición por cada atmósfera de óxido nitroso añadido. 5 10 15 Con objeto de refutar el trabajo anterior de Schreiner, Behnke et al ensayaron independientemente el efecto de las presiones hidrostáticas elevadas sobre las enzimas, y trataron de reproducir los resultados obtenidos por Schreiner. Behnke et al encontraron que el incremento de la presión gaseosa de nitrógeno o argón más allá de la necesaria para observar una ligera inhibición de quimotripsina, invertasa y tirosinasa no causaba aumento adicional alguno en la inhibición, en contraste directo con el descubrimiento de Schreiner. Los descubrimientos de Benhke et al pueden explicarse por simple inhibición hidrostática inicial, que se anula al estabilizarse la presión. Claramente, los descubrimientos no pueden explicarse por la interdependencia O2 quı́mico/gas inerte como fue propuesto por Schreiner. Benhke et al llegaron a la conclusión de que los gases inertes a alta presión inhiben la tirosinasa en sistemas no fluidos (por ejemplo, gelatina) por reducir la disponibilidad de oxı́geno, más bien que por alterar fı́sicamente la enzima. Esta conclusión está en contraste directo con los descubrimientos de Schreiner. Además de la refutación por Benhke et al, los resultados consignados por Schreiner son difı́ciles, si no imposibles de interpretar también por otras razones. 20 En primer lugar, todos los análisis se realizaron a presión muy elevada, y no fueron controlados en cuanto a los efectos de la presión hidrostática. En segundo lugar, en muchos casos no se observó diferencia significativa alguna entre los diversos gases nobles, ni entre los gases nobles y el nitrógeno. 25 30 En tercer lugar, el conocimiento del modo de acción e inhibición de las enzimas era muy deficiente en el tiempo en que se realizaron estos estudios, como lo eran las purezas de las enzimas utilizadas. Es imposible estar seguro de que no se produjo confusión de las actividades enzimáticas o que las medidas se realizaron con un grado de resolución suficiente para clasificar diferentes gases en cuanto a efectividad. Adicionalmente, cualquier modo de acción especı́fico podrı́a explicarse únicamente como hipótesis no demostrable. En cuarto lugar, no se controlaron las diferencias de solubilidad entre los diversos gases, ni se consideraron en el resultado. 35 En quinto lugar, todos los ensayos se llevaron a cabo utilizando presiones elevadas de gases inertes superpuestas a 1 atmósfera de aire, proporcionando ası́ un control inadecuado de la tensión de oxı́geno. En sexto lugar, todos los efectos de los gases consignados son únicamente inhibiciones. 40 En séptimo lugar, no todos los procedimientos empleados en el trabajo han sido descritos plenamente, y pueden no haber sido controlados experimentalmente. Además, las largas demoras después de la iniciación de la reacción enzimática impidieron seguir el curso completo de la reacción, con la pérdida resultante de las tasas de cambio observables máximas. 45 En octavo lugar, los intervalos de datos consignados presentan alta variabilidad basada en un pequeño número de observaciones, lo que excluye su valor significativo. En noveno lugar, los niveles de inhibición observados son muy pequeños incluso a presiones altas. 50 En décimo lugar, los estudios que consignaban una dependencia de la concentración de enzima no proporcionan cifras significativas utilizables. 55 60 En undécimo lugar, todos los informe de potencial inhibidor de los gases inertes a bajas presiones, es decir, menores que 203 kPa (menores que 2 atm.), se postulan sobre la base de lı́neas extrapoladas a partir de medidas a alta presión, no sobre datos reales. Por último, merece la pena reiterar que los resultados de Benhke et al contradicen los consignados por Schreiner en varios aspectos cruciales, principalmente que los efectos de la presión elevada son pequeños y que los efectos hidrostáticos, que no fueron controlados por Schreiner, son la causa primaria de las conclusiones incorrectas obtenidas en dichos estudios. 3 ES 2 112 983 T3 Adicionalmente, aunque fue consignado por Sandhoff et al, FEBS Letters, vol. 62 N◦ 3 (marzo, 1976) que xenón, óxido nitroso y halothane aumentan la actividad de la sialidasa constituida por partı́culas, dichos resultados son cuestionables debido a las enzimas altamente impuras utilizadas en este estudio y son debidos probablemente a oxidasas inhibidoras existentes en las partı́culas. 5 Para resumir las patentes y publicaciones anteriores y mencionar otras relacionadas con esta materia, se indica lo siguiente. 10 Benhke et al (1969), describen que las reacciones catalizadas por enzimas están influenciadas por los gases inertes a presiones elevadas. J. Food Sci. 34: 370-375. Schreiner et al (1967), describen interacciones de los gases inertes y efectos sobre proteı́nas enzimáticamente activas. Resumen N◦ 2209. Fed. Proc. 26:650. 15 Schreiner, H.R. (1964), Technical Report, describe los efectos fisiológicos de argón, helio y los gases raros. Contract Nonr 4115 (00), NR: 102-597. Oficina de Investigación de la Armada, Washington, D.C. Schreiner, H.R. (1965), Technical Report, describe los efectos fisiológicos de argón, helio y los gases raros. Contract Nonr 4115 (00), NR: 102-597. Oficina de Investigación de la Armada, Washington, D.C. 20 Schreiner, H.R. (1966), Technical Report, describe los efectos fisiológicos de argón, helio y los gases raros. Contract Nonr 4115 (00), NR: 102-597. Oficina de Investigación de la Armada, Washington, D.C. 25 30 35 40 45 50 55 60 Doebbler, G.F. et al, Fed. Proc. Vol. 26, p. 650 (1967) describe el efecto de la presión o de la tensión reducida de oxı́geno sobre varias enzimas diferentes utilizando los gases Kr, Xe, SF6 , N2 O, He, Ne, Ar y N2 . Todos los gases se consideraron iguales en su efecto. Kolten at al, Undersea Biomed Res. 17(4), 297-304 (1990) describen el efecto combinado de helio y oxı́geno con la presión elevada sobre la enzima glutamato-descarboxilasa. Es interesante que únicamente se observó el efecto inhibidor hiperbárico tanto de helio como de oxı́geno y el efecto inhibidor quı́mico del oxı́geno. Sin embargo, en la actualidad, se sabe que las actividades de las enzimas pueden ser inhibidas de diversas maneras. Por ejemplo, muchas enzimas pueden ser inhibidas por venenos especı́ficos que pueden estar relacionados estructuralmente con sus sustratos normales. Alternativamente, se sabe que muchos reactivos diferentes son desactivadores especı́ficos de enzimas diana. Estos reactivos causan generalmente modificación quı́mica en el sitio activo de la enzima induciendo pérdida de actividad catalı́tica, desactivación irreversible dirigida al sitio activo o marcación de la afinidad. Véase Enzymatic Reaction Mechanisms, por C. Walsh (W.H. Freeman & Co.,1979). Alternativamente, se sabe que ciertas secuencias multi-enzimáticas son reguladas por enzimas particulares conocidas como enzimas reguladoras o alostéricas. Véase Bioenergetics, por A.L. Leninger (Benjamin/Cummings Publising Co., 1973). El envasado con gas de los alimentos para conservación es bien conocido, y una descripción general de esta técnica puede encontrarse en A.L. Brody, Controlled/Modified Atmosphere/Vacuum Packaging of Foods, Food & Nutrition Press, Trumbull, CT 01989. Una descripción de los parámetros importantes de percepción de calidad por el consumidor se presenta en J.J. Jen, Quality Factors of Fruits and Vegetables, Chemistry and Technology, ACS Symposium Series N◦ 405, American Chemical Society, Washington, D.C., 1989, y una descripción de las reacciones bioquı́micas y quı́micas importantes en los alimentos puede encontrarse en N.A. Michael Eskin, Biochemistry of Foods, second ed., Academic Press, Nueva York, NY, 1990. Es evidente, por estas fuentes bibliográficas, que una gran preponderancia de las metodologı́as modernas y pasadas de envasado con gas se han basado fundamentalmente en el uso de dióxido de carbono, nitrógeno y oxı́geno, aislados o en mezclas. Generalmente, se utiliza nitrógeno como gas de inertización o no reactivo, para desplazar al oxı́geno a fin de impedir la oxidación o limitar la respiración. Generalmente, se utiliza dióxido de carbono como microbicida o agente microbiostático, o como en el caso de ciertas bebidas, para proporcionar un efecto efervescente. El dióxido de carbono se utiliza a menudo como gas de inertización. Generalmente se utiliza oxı́geno como tal o como el componente activo en la inclusión de aire para permitir la respiración aerobia o para impedir el desarrollo de condiciones anaerobias que podrı́an permitir el crecimiento de microgérmenes patógenos. Por ejemplo, el documento U.S. 4.454.723 describe un remolque refrigerado enfriado por agua de as4 ES 2 112 983 T3 persores con liberación concomitante de nitrógeno inertizador procedente de una fuente criogénica, para inertizar la respiración de productos agrı́colas. 5 El documento CH 573848 describe también la actividad inertizadora del nitrógeno en la preparación de envases de café. Irisawa, 1974, describe el uso de una atmósfera de nitrógeno o nitrógeno lı́quido en la conservación de fresas, salmón y pescado en general. 10 Kocys y Veskevicius, 1970, describen el almacenamiento en nitrógeno. Lapin y Koburger, 1974, describen el almacenamiento de camarones en N2 , demostrando una represión mejorada de las bacterias. 15 Moor, 1984, describe el almacenamiento de cebada para malterı́as en una atmósfera de N2 . Niu y Su, 1969, describen el almacenamiento eficaz de plátanos en N2 . 20 Lebedeva et al, 1984, describen la utilidad del nitrógeno en el almacenamiento de semillas de girasol conservadas en atmósfera de nitrógeno debido a un cambio en el metabolismo oxidante, es decir en los ritmos de respiración. 25 El documento U.S. 4515266 ilustra la importancia del tipo de envase en las aplicaciones de envasado con gas. Se utiliza en el envasado una pelı́cula de barrera alta de envasado con atmósfera modificada, y se introduce en el envase una atmósfera conservante. La esencia del proceso de envasado es que el mismo permite que se introduzcan gases conservantes, tales como nitrógeno gaseoso para inertización, pero al mismo tiempo impide la entrada de aire en el envase que podrı́a permitir el contacto del oxı́geno con los alimentos y podrı́a causar luego oxidación degradante del producto alimenticio. 30 35 40 45 50 El documento U.S. 4522835 muestra que los gases cuyas moléculas contienen oxı́geno pueden ser a menudo reactivos en sistemas de alimentos, incluyéndose aquı́ oxı́geno, dióxido de carbono y monóxido de carbono. Se reivindica la conservación del color en las aves de corral y el pescado por reducción del contenido de oxı́geno con objeto de producir mioglobina/ hemoglobina frente a los estados oxidados ordinarios de oximioglobina/hemoglobina, y adición final de monóxido de carbono para producir carboximioglobina/carboxihemoglobina, con almacenamiento posterior bajo dióxido de carbono para mantener el color ası́ mejorado. Es posible el almacenamiento bajo nitrógeno inerte, como lo es la reoxidación ulterior empleando oxı́geno. El documento EP 354337 reivindica el uso de dióxido de carbono como agente antibacteriano en la conservación de alimentos. El documento SU 871363 ilustra la complejidad de las metodologı́as de envasado con gas, dado que a menudo se recomiendan regı́menes especı́ficos de preparación y aplicaciones del gas. Esta patente describe el almacenamiento de ciruelas en mezclas de nitrógeno, oxı́geno y dióxido de carbono en tres pasos separados. Primero, 2-2,5 semanas o 0◦ C en 78-82% nitrógeno + 10-12% oxı́geno + 8-10% dióxido de carbono; segundo, durante las dos 2,5-3 semanas siguientes a -1◦ C en 93-95% nitrógeno + 3-5% de oxı́geno + 2-4% de dióxido de carbono; tercero, el resto del perı́odo de almacenamiento a -2◦C en 90-92% nitrógeno + 2,5-3,5% de oxı́geno + 4,5-5,5% de dióxido de carbono. El método reivindica 99,4 frente a 91-94% de estado satisfactorio después de 151 dı́as. Este aumento marginal puede considerarse debido fundamentalmente a una regulación más eficaz del intercambio respiratorio de gases entre oxı́geno y dióxido de carbono, en el cual el nitrógeno no juega papel real alguno excepto como gas portador de unión inerte, no reactivo. 55 El documento SU 1245284 refuerza dichos conceptos de tratamiento. En dicho documento, las cerezas se conservan mejor bajo una mezcla limitante de la respiración de 5-8% dióxido de carbono + 4,5-5,5% oxı́geno + el resto de nitrógeno. Es importante que el fruto se arranque en la etapa de maduración correcta, y se mantenga enfriado entre 0 y -1◦ C, para reducir asimismo la respiración. 60 Los documentos WO 9015546, CA 2019602, y AU 9059469 describen todos ellos la importancia del estado crı́tico de los alimentos, es decir, la fase de maduración del producto inducida por etileno. Cada uno de dichos documentos describe la conservación mejorada del alimento en un procedimiento que utiliza dos separadores de gases, en el primero de los cuales se separan los gases no deseados, tales como etileno, 5 ES 2 112 983 T3 oxı́geno, dióxido de carbono y vapor de agua, y en el segundo, se suministra el gas conservante (inerte o mezcla respiratoria). 5 10 El documento JP 55029426 utiliza una mezcla compleja de 20-99,5% nitrógeno y/o dióxido de carbono + 80-0,5% vapor de etanol en la cual el oxı́geno residual es 10%. En un envase impermeable, se reivindica que esta mezcla impide el crecimiento de hongos formadores de sustancias pegajosas. Burgheimer et al, 1967, proporcionan pruebas de los cambios quı́micos que se producen durante la exposición al oxı́geno, y en este caso espinacas en aire frente a una atmósfera controlada de nitrógeno sufren cambios degradantes considerables en contenidos de vitamina C y ácido ascórbico. Análogamente, Consignado et al, 1976, comparan el contenido de azúcar de los cocos almacenados en aire frente a nitrógeno, y encuentran que, sorprendentemente, el contenido de azúcar no está correlacionado con la disponibilidad de oxı́geno para la respiración. 15 20 Ası́ pues, es evidente que los gases oxı́geno, dióxido de carbono y nitrógeno solos o en mezclas tienen los efectos bien demostrados de oxidación, actividad antimicrobiana, e inertización respectivamente. Es también evidente que el balance de dichos gases en una atmósfera superpuesta sobre sistemas vivos puede deprimir la respiración y la producción o el mantenimiento resultantes de parámetros quı́micos y otros parámetros de calidad de los alimentos de maneras básicas y bien comprendidas. Es también evidente que los gases oxidantes y reactivos tendrán efectos destructivos sobre los sistemas quı́micos y biológicos. 25 Aunque se ha publicado bibliografı́a que describe el uso de argón para el envasado, esta bibliografı́a describe generalmente que el gas es completamente inerte y equivalente al nitrógeno o a los otros gases dobles en su falta de reactividad. 30 Está también claro por las citas bibliográficas siguientes que el argón se describe o se utiliza tı́picamente como gas inerte o no reactivo equivalente no sólo al nitrógeno y a los otros gases nobles, sino que dióxido de carbono, óxido nitroso e hidrógeno, ası́ como otros gases se consideran asimismo inertes. Este es particularmente el caso para los sistemas de envasado con gas para alimentos. Por ejemplo, el documento JP 2010077 describe el uso de una fuente mixta de gases para suministrar a un producto envasado con gas una mezcla de nitrógeno:dióxido de carbono:etileno 60:30:1 en la cual la pequeña cantidad de argón presente es inerte. 35 Asimismo, el documento 3058778 (89192663) describe el almacenamiento y la maduración de bebidas alcohólicas en un espacio de cabeza con argón. El deterioro puede evitarse y la maduración puede promoverse o retardarse regulando la densidad de envasado del argón. La utilidad del argón reside en su desplazamiento del oxı́geno, es decir, en la inertización. 40 El documento JP 58101667 (88019147) describe el cierre hermético de bebidas cı́tricas en envases a presión utilizando un gas inerte tal como argón, de tal modo que se desprendan burbujas en la apertura, las cuales se adhieren luego a la pulpa. 45 50 55 El documento JP 60134823 describe un procedimiento por el cual el envasado de alimentos lı́quidos se realiza introduciendo un lı́quido estéril en el envase a presión con un gas inerte, que puede ser nitrógeno o argón. El documento JP 62069947 (88051660) describe la conservación a largo plazo de hongos shiitake en la oscuridad en un envase en el que existe una mezcla de nitrógeno:dióxido de carbono:argón:óxido nitroso. El argón se describe en dicho documento como gas inerte. El documento JP 63273435 describe la conservación de castañas asadas en un envase permeable en una mezcla de argón, dióxido de carbono, nitrógeno y óxido nitroso. El envase es permeable al argón, por lo cual no puede tener utilidad alguna. El documento JP 7319947 (730618) reivindica la conservación de zumos de frutas con gases nobles. Sin embargo, el argón, helio y nitrógeno se describen como gases inertes. 60 El documento JP 77027699 describe un procedimiento para congelación y almacenamiento a presión, aplicándose la presión como dióxido de carbono, nitrógeno, argón o hidrógeno, considerándose todos ellos igualmente inertes. 6 ES 2 112 983 T3 El documento U.S. 4054672 (JP 7169757) describe la descongelación de alimentos congelados a una presión de 203-508 kPa (2-5 atmósferas), preferiblemente bajo dióxido de carbono, nitrógeno, helio o argón, siendo todos ellos inertes, no reactivos y no oxidantes. 5 El documento JP 89192663 reivindica la conservación de bebidas alcohólicas con argón, especı́ficamente sake y vino en envases, en los cuales el argón se considera como un gas de inertización excelente debido a su solubilidad mayor que la del nitrógeno. 10 El documento U.S. 3096181 describe un método y aparato para la elaboración de alimentos utilizado en el envase con gas de zumo de tomate o productos alimenticios lı́quidos o concentrados de hortalizas, en los cuales cualquier gas inerte del grupo formado por nitrógeno, argón, kriptón, helio o sus mezclas, son igualmente inertes y útiles a la presión del ambiente o superior, después de la esterilización con vapor de agua. 15 El documento U.S. 3128188 describe cerveza lager Ruh en atmósfera inerte. El documento U.S. 3442657 reivindica la conservación del lúpulo en atmósfera inerte. 20 Los documentos U.S. 3498798 y CA 867629 describen un envase para patatas crujientes que es impermeable y en el cual se utiliza un gas inerte para desplazar el oxı́geno como el paso funcionalmente útil. Se describe que puede utilizarse equivalentemente cualquier gas comprendido entre nitrógeno, dióxido de carbono, argón o neón. 25 El documento U.S. 3535124 describe un procedimiento para conservación de zumos de frutas frescos en un dosificador utilizando dióxido de carbono, en el cual preferiblemente el zumo se pulveriza a través de una atmósfera inerte. 30 El documento U.S. 3587203 describe el envasado con gas de ensalada mixta, cortada y preparada lista para comer, en el que la misma se almacena en una atmósfera inerte con objeto de impedir la alteración de su color por oxidación. El documento U.S. 3715860 describe un método de envasado con gas en el que el paso de un fluido inerte a través de un envase impermeable funciona para eliminar el oxı́geno e impedir el deterioro. 35 El documento U.S. 4152464 describe un método y aparato para esterilizar envases que incluye aplicar cualquier gas inerte en condiciones estériles al interior de un espacio cerrado. 40 El documento U.S. 4205132 describe el almacenamiento de bacterias liofilizadas. El almacenamiento requiere la ausencia completa de oxı́geno, utilizando preferiblemente inertización con argón debido a que el argón comercial contiene comercialmente niveles de oxı́geno muy bajos. El documento U.S. 4229544 describe el almacenamiento de microorganismos vivos en estado latente por envasado con gas en nitrógeno, argón o helio, donde todos ellos son equivalentes. 45 El documento U.S. 4391080 describe una máquina de envasado con gas en la cual la esencia de la invención es el llenado del envase mediante la máquina con gas inerte estéril. 50 El documento U.S. 4524082 describe la preparación de clara de huevo concentrada o productos de huevo entero salados en atmósferas inertes. El documento U.S. 4627336 describe también un aparato para envasado con gas que requiere el lavado abundante con gases inertes para reemplazar el aire. 55 En el documento U.S. 4803090, que se refiere a la preparación de buñuelos de queso en aceite caliente, no se indicó que gases inertes diferentes den lugar a diferencia alguna en el producto. Asimismo, el documento U.S. 4835937 describe un procedimiento para envasado de alimentos que implica lavado abundante y llenado con gas inerte. 60 Un procedimiento similar se reivindica en el documento U.S. 4870801. 7 ES 2 112 983 T3 El documento U.S. 4901887 reivindica un dosificador de bebidas que está presurizado con un gas inerte. 5 En el documento U.S. 4919955, se describe un método de envasado con gas para carne en el cual se utiliza gas inerte para envasar y almacenar la carne, y en una etapa posterior se añade oxı́geno al envase para permitir la oxigenación de la mioglobina a fin de producir un color rojo. La refrigeración de alimentos por inyección directa de gases se describe en los documentos DE 2147880, ZA 7106193, FR 2107946 y GB 1371027, en los cuales se puede utilizar 10 cualquiera de nitrógeno, oxı́geno, argón o incluso aire, de manera equivalente. 15 Los documentos DE 2736282, WO 7900092, HU H2477, GB 2021070, DD 137571 y EP 6888, describen un sistema de carga de camiones cisterna para transporte de cerveza que utiliza un gas inerte constituido por cualquiera de dióxido de carbono, nitrógeno o gas noble. En los documentos EP 146510, SE 8306164, N◦ 8404468, FI 8404402 y DK 8405347 se reivindica un procedimiento para extrusión de alimentos porosos por compresión, calentamiento y extrusión en una atmósfera de gas inerte, p.ej. nitrógeno o dióxido de carbono, 20 Los documentos EP 289777, AU 8814003, JP 1020056, US 4895729 reivindican el envasado de trozos de fruta frescos, cortados o segmentados por lavado abundante con un gas que contiene O2 , cierre hermético, choque frı́o, y refrigeración, donde la mezcla preferida es 5-50% oxı́geno, siendo el resto cualquier gas inerte del grupo formado por nitrógeno, helio, argón o hidrógeno. 25 Los documentos BE 881368, DE 2903300, NL 8000353, GB 2042320, FR 2447155, US 4289148, CA 1127037, CH 642519, NL 77974 e IT 1130237 describen la mejora de la capacidad de envasado del tabaco por aplicación de presión utilizando nitrógeno o argón, seguido por calentamiento. 30 35 40 La presurización de alimentos por medio de calor en condiciones estériles, seguido por envasado con gas inerte se reivindica en el documento EP 368603, utilizando nitrógeno o dióxido de carbono. Los factores de importancia son los contenidos de agua y oxı́geno. El documento ES 8500634 describe un método de vinificación sin utilización de conservantes, en el que se emplea gas inerte o no reactivo para desplazar el oxı́geno a fin de evitar el crecimiento de microbios aerobios. Se consideran igualmente útiles cualquiera de los gases nitrógeno, dióxido de carbono, o gases nobles. Los documentos GB 1331533, FR 2089899, BE 765637, DE 2031068 y CH 522734 describen un método de mejora de las propiedades de conservación de bebidas alcohólicas producidas por fermentación que impide la acción destructiva del oxı́geno por desplazamiento del oxı́geno durante o después de la fermentación y/o en cualquier etapa del procedimiento y/o durante el almacenamiento, preferiblemente en atmósfera de nitrógeno, pero pueden utilizarse Ar u otros gases nobles, siendo todos ellos equivalentemente inertes. 45 El documento IT 1190200 describe el uso de una atmósfera de gas inerte sobre productos agrı́colas con objeto de impedir el ataque por microorganismos aerobios. 50 El documento SU 249965 describe el almacenamiento de carne curada en salmuera, p.ej. jamón, p.ej. en atmósfera de Ar, como un procedimiento de inertización. El documento SU 825619 describe un depósito para almacenamiento de vino en atmósfera de gas inerte con controles de llenado. Primeramente se llena el depósito con dióxido de carbono, y se introduce luego el vino mediante una bomba o pulverizador de gas inerte. 55 Los documentos WO 8600503, DE 3425088, Au 8546026, EP 189442 y DE 3448380, describen todos ellos el uso de gas en el calentamiento de productos alimenticios lı́quidos mientras que se mantiene la presión para evitar la pérdida de aroma e impedir la ebullición. Para productos de leche y café, especialmente un gas inerte y no reactivo tal como nitrógeno o un gas noble. 60 El documento FR 2225095 describe el envasado con gas de café tostado, en el cual el café se desgasifica en un gas inerte y no reactivo, preferiblemente dióxido de carbono, durante 12-48 horas, se llenan 8 ES 2 112 983 T3 con el café envases impermeables, se hace un vacı́o parcial de 50-90%, seguido por inyección de un gas conservante, en el que puede utilizarse equivalentemente argón o nitrógeno a una presión preferiblemente menor que 101 kPa (< 1 atm). La eficacia de dicha inertización se reivindica como una mejora de 10 veces en la vida útil. 5 En el documento FR 2621224 para pulpa de aguacate o de otros tipos, se reivindica la molienda en gas inerte, seguida por adición de otros productos lı́quidos saborizantes para alimentos. 10 El almacenamiento de mantequilla refrigerada en atmósfera de gas inerte se reivindica en el documento FR 2642275, en el que el gas puede ser nitrógeno u otros gases. Rzhavskaya, 1967, describe la utilidad del nitrógeno en la evitación de la oxidación de grasas de ballena debido al desplazamiento del oxı́geno. 15 Shejbal, 1979a,b, describe el uso de nitrógeno en la conservación de cereales y semillas oleaginosas por inertización. Terebulina et al, 1983, describen, la oxidación de lı́pidos del arroz en aire, afirmando que es controlable por desplazamiento del oxı́geno a fin de impedir la respiración y oxidación. 20 Corey et al, 1983, al abordar cuestiones de almacenamiento, midieron las velocidades de difusión del nitrógeno y el dióxido de carbono a través del pepino y encontraron que el dióxido de carbono era tres veces más soluble que el nitrógeno. Se determinó que la solubilidad era el factor crı́tico en la elección de la atmósfera de almacenamiento. Se utilizó argón como control de gas inerte. 25 Fullerton et al, 1982, demuestran la mejora en el almacenamiento de alimentos de origen animal en atmósfera de argón como agente de inertización debido a su solubilidad y ausencia de contenido de oxı́geno. 30 Pichard et al, 1984, ensayaron las enzimas de bacterias, especı́ficamente proteasas de Pseudomonas en atmósfera de monóxido de carbono, dióxido de carbono y nitrógeno. Aire y Ar como mezcladores y controles. Se encontró que únicamente el dióxido de carbono tenı́a efectos, los cuales eran antagónicos dependiendo de la proteasa sobre la que se midieran, y se encontró especı́ficamente que el argón no tenı́a efecto alguno sobre estas enzimas. 35 40 Zee et al, 1984, estudiaron los efectos del monóxido de carbono, dióxido de carbono y nitrógeno sobre el crecimiento bacteriano en la carne bajo envasado con gas. Dichos autores utilizaron argón como control absolutamente inerte. Se encontró que el argón y el nitrógeno eran equivalentes en la inhibición de los organismos anaerobios, y actuaban como agentes de inertización en la inhibición de los agentes aerobios. Especı́ficamente, se cultivaron cuatro agentes aerobios estrictos, tres anaerobios, y doce anaerobios facultativos aislados de la carne en atmósfera de dióxido de carbono, argón, nitrógeno y monóxido de carbono, en los cuales el argón era “inerte” y contenı́a 10-70% de nitrógeno, dióxido de carbono o monóxido de carbono. Se encontró que el efecto de Ar era debido estrictamente a los gases con los cuales se mezclaba. 45 En el área médica, los gases dobles se describen como útiles en la conservación de órganos, células y tejidos vivos, debido fundamentalmente a la elevado solubilidad y penetrabilidad de dichos gases. Por ejemplo, Ikegami et al., 1979, comparan la motilidad y viabilidad del semen en nitrógeno, argón, helio y dióxido de carbono, siendo sumamente importantes los factores técnicos. 50 El documento SU 507187 describe la conservación mejorada de trasplantes óseos en una mezcla de argón y formalina. La función del argón se reivindica como de inertización. 55 En el documento U.S. 4088754, se describe la conservación de órganos aislados en la cual helio o nitrógeno o helio + xenón o helio + xenón + hexafluoruro de azufre se comportan de modo igualmente satisfactorio en la conservación de tejidos bajo refrigeración. Se describen resultados similares en los documentos de Voss et al., 1970; SU 1289477; Ruile at al., 1971; Braun et al., 1973 (para congelación); Poppert et al., 1973. En el último, se describe la conservación de órganos en xenón hiperbárico. 60 Ası́ pues, es evidente por lo anterior que el argón está considerado y ha sido descrito claramente tanto en citas de patentes como de bibliografı́a general como un gas inerte y no reactivo, capaz de afectar a los sistemas biológicos, tales como productos alimenticios, tejidos médicos, reacciones quı́micas, enzimas, y parámetros de almacenamiento de alimentos únicamente por medio del desplazamiento de gases más 9 ES 2 112 983 T3 activos, tales como el oxı́geno. Ası́ pues, el argón ha sido considerado convencionalmente como el equivalente del nitrógeno como un gas inerte y no reactivo, y se distingue actualmente para uso en la industria alimentaria exclusivamente sobre la base de factores comerciales tales como coste, disponibilidad, y pureza. 5 Si bien se conocen un pequeño número de citas bibliográficas en las cuales se ha sugerido incluso que el argón y otros gases nobles pueden tener propiedades singulares para su aplicación a sistemas biológicos o alimentos, cada una de estas citas es diferente y fracasan claramente en lo que se refiere a exponer o incluso sugerir las conclusiones en las que se apoya la presente invención. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Por ejemplo, los documentos JP 52105232, (80002271), y 1059647 describen el uso de una mezcla de gases que contiene argón para la conservación de castañas asadas por retardación del crecimiento de mohos anaerobios, y amplı́a esta conservación para incluir tortas de arroz, pan, y pasteles en 80-20:30:70 de argón:dióxido de carbono, describiendo que esto impide el crecimiento de mohos y microorganismos anaerobios. Sin embargo, los datos proporcionados son contradictorios en sı́ mismos, sosteniendo que ni los niveles altos ni los bajos de argón tienen efectos, pero que los valores intermedios sı́ lo hacen, en un sencillo experimento en el cual no se presentan datos significativos, ni se condujeron ensayos o controles para los niveles de oxı́geno, y no se proporcionó demostración alguna del carácter anaerobio descrito de los mohos ensayados. De hecho, los datos no demuestran mejora para el argón, y pueden interpretarse como simple proposición de la sustitución de nitrógeno por argón como gas inerte y no reactivo. El documento JP 55111755 describe la conservación de cereales u hortalizas en nitrógeno + dióxido de carbono, que contiene óptimamente también helio o argón (1-10, preferiblemente 4-6% en la mezcla) en 5-70% dióxido de carbono en 95-30% nitrógeno. Esta descripción se hace para permitir la inclusión de gases nobles como contaminantes en otros gases, pese a lo cual el beneficio descrito de los gases nobles es imposible de demostrar dado que la reducción del contenido del gas noble en la mezcla no puede mejorar y no mejora el posible beneficio. Adicionalmente, la mejora descrita en el almacenamiento de cereales y hortalizas (arroz, cebollas, patatas) conservados durante largos perı́odos se manifestaba en sı́ misma por la supresión de la gemación. Se describe especı́ficamente que el argón y el helio favorecen el color y el brillo. A los niveles descritos no es posible mejora alguna, e incluso la repetición de estos experimentos no puede demostrar ningún efecto. Adicionalmente, Manchon, 1978, estudió la conservación de pan y artı́culos de reposterı́a en envasado en atmósfera controlada. Se obtuvieron resultados deficientes utilizando nitrógeno o argón o nitrógeno + dióxido de carbono. Se obtuvieron resultados satisfactorios utilizando óxido nitroso u óxido de etileno + dióxido de carbono. Sin embargo, el óxido nitroso es un gas reactivo, y los experimentos llevados a cabo como se ha descrito podı́an haber demostrado solamente que el argón es inerte y no reactivo. La patente de EE.UU. 3.183.171 describe la represión del crecimiento de hongos por gases nobles. En particular, se utilizaron mezclas de dióxido de carbono, monóxido de carbono, oxı́geno, vapor de agua, o nitrógeno con helio, xenón, kriptón, neón, argón o una mezcla de éstos, o un fracción de gases nobles que constituı́a entre 3 y 95 por ciento. La inhibición del ritmo de crecimiento se describe para la mayorı́a de las mezclas que contienen argón, xenón, kriptón, o neón, mientras que se reivindica un aumento del ritmo de crecimiento cuando se añade helio aciertas mezclas. Los datos, muy limitados, se obtuvieron exclusivamente para Neurospora crassa, como aumento de la longitud de las hifas a lo largo del tiempo. La patente de EE.UU. 3.183.171 está basada en datos presentados para Neurospora crassa. Esta patente no demostraba que el crecimiento de las hifas sea equivalente al crecimiento del organismo. En contraste, de acuerdo con la presente invención, como se describirá más adelante en esta memoria, se ha descubierto que las enzimas responsables del crecimiento fúngico son inhibidas, y es evidente que los datos de la patente de EE.UU. 3.183.171 describen efectos para la represión del crecimiento de las hifas y no para la represión enzimática del crecimiento del microorganismo. Ası́ pues, no es posible a partir de la patente de EE.UU. 3.183.171 que los expertos entiendan que es posible una represión eficaz del crecimiento microbiano con gases nobles. 55 Como prueba de ello, se indicará que no se ha presentado solicitud alguna de utilidad práctica en la represión del crecimiento microbiano con gases nobles en los 25 años transcurridos. 60 La aplicación de helio y de presiones elevadas de diversos gases nobles han sido descritas como condiciones que afectan al crecimiento de bacterias (Fenn y Marquis, 1968, Thom y Marquis, 1979, Hegeman y Featherstone, 1979); protozoos (Sears et al, 1964), células de mamı́fero (Bruemmer et al., 1967; Schreiner 1964, 1965, 1966 Nonr) y germinación de esporas bacterianas (Enfors y Molin, 1977). Estos resultados se 10 ES 2 112 983 T3 citan en Schreiner, 1968 y Behnke et al, 1969). Sin embargo, todos estos informes proporcionan resultados poco concluyentes y son difı́ciles de interpretar. 5 El uso de óxido nitroso se describe en el documento US 3398001, en el que durante la preparación y el envasado de aguacates congelados, congelación en óxido nitroso o nitrógeno, seguida por envasado en nitrógeno utilizando un nivel de oxı́geno < 2%, dio resultados de conservación satisfactorios. 15 Un procedimiento de tratamiento en dos pasos para frutas y hortalizas frescas se describe en el documento EP 0422995 en el cual óxido nitroso (10-100%) en mezcla con oxı́geno y/o dióxido de carbono se aplica a hortalizas durante cierto perı́odo de tiempo en una primera fase de tratamiento, seguido por una aplicación separada en segunda fase de una mezcla de gases que contiene óxido nitroso (10-99%) mezclado con oxı́geno o dióxido de carbono o nitrógeno que, por acción del óxido nitroso, confiere luego conservación. Se describe claramente que el nitrógeno o el argón son gases igualmente inertes y no reactivos que pueden utilizarse con toda libertad para complementar en volumen cualquier mezcla de gases dada sin efecto alguno. 20 Se ha demostrado que el óxido nitroso previene la formación de etileno y proporciona actividad fungistática significativa. Por ejemplo, se presentan claramente datos en el documento FR 2191850 que demuestran la disolución eficaz de óxido nitroso en el fruto/hortaliza, con lo cual puede estar presente cierto efecto. 10 25 30 35 40 Los documentos EP 0422995, AU 9063782, CA 2026847, ZA 9005704, FR 2652719, BR 9004977, JP 03206873 y PT 95514, describen cada uno un tratamiento en dos pasos para conservar hortalizas frescas por exposición, a temperatura de refrigeración, a una atmósfera de óxido nitroso y/o argón (se reivindica especı́ficamente que otros gases nobles son inertes) y óptimamente oxı́geno. Mezclas utilizadas diversamente incluyen tı́tulos elevados de óxido nitroso, oxı́geno, dióxido de carbono o nitrógeno. Para el envasado, se describe una membrana semipermeable que tiene una capacidad deficiente para retener argón. No se hizo, sin embargo, control alguno en los experimentos en cuanto a dióxido de carbono, oxı́geno, nitrógeno o argón, y no puede atribuirse acción alguna evidente a ningún gas a excepción del óxido nitroso. La esencia de cada una de estas descripciones se refiere a un procedimiento de tratamiento en dos pasos, no simple envasado en gas, en el cual el óxido nitroso o argón aplicado interfiere directamente con la producción de etileno por la fruta (se ensayaron tomates). Se reivindica que el argón tiene utilidad especı́fica a este respecto; sin embargo, es evidente por los datos presentados que el único efecto del argón es desplazar el oxı́geno de los tejidos de la fruta y limitar por consiguiente la respiración y por tanto la producción de etileno. Los datos esenciales presentados en la figura pretenden demostrar una diferencia en la producción de etileno de aire, nitrógeno, argón y óxido nitroso que es precisamente idéntica a sus diferencias en solubilidad en el fruto (datos suministrados en el documento EP 0422955 y más adelante). De hecho, esto ha sido demostrado por duplicación del experimento anterior, en el cual se realizaron controles adecuados de solubilidad por inclusión de otros gases, y se encontró que la depresión del etileno se explica completamente por el desplazamiento de oxı́geno. Se presentan datos en la figura 1 de la presente memoria descriptiva. 45 Ası́ pues, las descripciones anteriores de usos de argón en el tratamiento de alimentos demuestran únicamente la inercia o carencia de reactividad del argón, y confirman simplemente su capacidad como gas no reactivo para desplazar el aire. 50 55 60 La adición de argón a una mezcla conocida de dióxido de carbono + oxı́geno se reivindica en los documentos de Schvester & Saunders, US 4946326, EP 346201, PT 90762, AU 8936152, DK 8902755, BR 8902636, JP 2053435, ZA 8904258 como eficaz en la conservación de peces y mariscos comestibles a 4◦ C. La mezcla comprende, en presión parcial, 5-68% de dióxido de carbono + 5-20% de oxı́geno + 27-45% de argón (preferiblemente 50:20:30 dióxido de carbono:oxı́geno:argón). El texto describe la mezcla como ralentizadora de las reacciones enzimáticas y quı́micas en la superficie y en el interior de los productos de pescado y mariscos comestibles, ası́ como el crecimiento de ciertos microorganismos tales como hongos. No se presenta ningún dato de este tipo, y no se hace reivindicación alguna de ello. Otros estudios acerca de dichas mezclas y de tales productos encuentran resultados opuestos. Los resultados descritos no son generalmente reproducibles, y, de hecho, son debidos totalmente al control cuidadoso de la higiene del tratamiento, y a los efectos del dióxido de carbono sobre los microbios. Los resultados presentados no son en general significativos y no controlan los efectos conocidos 11 ES 2 112 983 T3 del dióxido de carbono, oxı́geno y nitrógeno solos o en mezclas sin gases nobles. Claramente, por los datos descritos no es evidente que ningún efecto observado sea debido de hecho al argón o a la mezcla especı́fica reivindicada. Racionalmente, se puede llegar a la conclusión de que los efectos se deben a los otros componentes solos o en combinación parcial. 5 10 Además, el documento EP 354337 describe un efecto de dióxido de carbono sobre sistemas bacterianos. Dichos efectos son ampliamente conocidos y están comprendidos como debidos al efecto depresivo del dióxido de carbono sobre los procesos respiratorios ordinarios, que no pueden interpretarse como especı́ficamente antienzimáticos. Los resultados observados en el documento 4946326 pueden ser atribuidos en gran parte a la simple depresión de la respiración por el dióxido de carbono. Adicionalmente, el documento JP 89/192663 describe el uso de argón como gas inerte en el almacenamiento de licores, mientras que el documento JP 88/51660 describe el uso de argón como gas inerte en el almacenamiento de hongos y setas comestibles. 15 El documento JP 87/108025 describe el uso de un gas mixto que incluye nitrógeno, dióxido de carbono, argón y óxido nitroso para almacenar castañas asadas. 20 25 30 35 40 El documento JP 70/66269 describe el método de tratamiento de zumo de naranja, limón, mixto y de piña, y para conservar dichos zumos por disolución de gases inertes o no reactivos, tales como nitrógeno, argón y helio en el zumo hasta un nivel de saturación. La patente de EE.UU. N◦ 3.183.171 describe la preparación de salchichas utilizando argón. Sin embargo, esta patente no describe ni sugiere el uso de las mezclas gaseosas de la presente invención en la conservación de la frescura de las hortalizas. El documento Derwent Abstract N◦ 85-181496 describe un método de envasado de alimentos tales como queso, frutas frescas, carnes elaboradas, pescado fresco y hortalizas frescas con un gas constituido por 50-100% de dióxido de carbono más nitrógeno, argón, kriptón, xenón u oxı́geno. La atmósfera de esta referencia no describe, por consiguiente, una atmósfera gaseosa constituida especialmente por 80% a 95% en volumen de argón gaseoso como se reivindica en esta memoria. La referencia titulada “Optimization des Conditions d’entreposage des échantillons de fromage en laboratoire à l’aide d’analyses chimiques”, MILCHWIRTSCHAFTLICHEFORSCHUNG, vol. 21, n◦ 1, 1992, páginas 6-11, COLLOMB et al., describe queso confinado en una atmósfera de gas protector constituido por argón o dióxido de carbono para mejor conservación del queso. Sin embargo, esta referencia no describe la conservación de hortalizas utilizando las mezclas gaseosas de la presente invención. En los resúmenes de patentes de Japón, vol. 8, n◦ 30, (C-209) 08/02/1984 se describe un método para reproducir el sabor y esterilizar licor de cacao, licor que se obtiene convencionalmente de los granos de cacao. El licor de cacao se introduce en un envase con un gas inerte tal como nitrógeno, argón o dióxido de carbono. Por consiguiente, esta referencia no describe el procedimiento de la presente invención para conservar hortalizas utilizando las mezclas gaseosas que se reivindican en esta memoria. 50 Ası́ pues, existe en general un considerable volumen de bibliografı́a referente al envasado con gas o la saturación con gas de alimentos. Parte de esta bibliografı́a se refiere al uso de gases nobles y gases inertes en el envasado de alimentos, utilizando dichos gases como gases de inertización o no reactivos equivalentes al nitrógeno. Sin embargo, serı́a extremadamente ventajoso que se dispusiera de medios por los cuales las sustancias alimenticias pudieran conservarse directamente y no indirectamente por mero desplazamiento del oxı́geno. 55 Serı́a particularmente ventajoso disponer de medios por los cuales ciertas sustancias alimenticias extensamente utilizadas y particularmente aromáticas tales como el queso y el chocolate pudieran conservarse directamente y no indirectamente por mero desplazamiento de oxı́geno, a fin de mejorar el aroma y sabor de las mismas. 45 Sumario de la invención 60 De acuerdo con ello, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para conservar hortalizas utilizando al menos un gas noble. Es también un objeto de la presente invención proporcionar diversas mezclas gaseosas para efectuar 12 ES 2 112 983 T3 el método anterior. 5 Adicionalmente, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para inhibir las enzimas que hacen que se desarrollen organismos microbianos en el interior de las hortalizas y/o en la superficie de las mismas. Es también un objeto de la presente invención proporcionar un método para inhibir las enzimas producidas por las hortalizas que causan la degradación de las mismas. 10 Además, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para inhibir las enzimas secretadas por los microorganismos de la pudrición y/o sobre las hortalizas. Adicionalmente, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para inhibir las enzimas en el interior y/o en las superficies de las hortalizas. 15 Es también un objeto de la presente invención proporcionar un método para conservar el color y/o aspecto de las hortalizas. 20 Asimismo, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para inhibir las reacciones de oxidación quı́mica no enzimáticas de las hortalizas. Además, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para inhibir las reacciones de degradación oxidante quı́mica en las hortalizas. 25 30 Es también un objeto de la presente invención inhibir la degradación por oxidación del color en las hortalizas. Además, es también un objeto de la presente invención proporcionar un método para conservar las hortalizas sin utilizar tecnologı́as que den como resultado cambios indeseables en las hortalizas, tales como cambios organolépticos, reológicos, microbiológicos y nutritivos. De acuerdo con ello, los objetos anteriores y otros que se harán más evidentes a la vista de descripción que sigue se proporcionan por un método de conservación de las hortalizas por contacto de las mismas con un gas noble, una mezcla de gases nobles o una mezcla gaseosa que contiene al menos un gas noble. 35 Breve descripción de los dibujos La figura 1 ilustra el cambio de peso de los tomates a la temperatura ambiente debido a la absorción de gas para diferentes gases. 40 La figura 2 ilustra el efecto de diferentes gases como se indica en la enzima tirosinasa a 25◦ C. La figura 3 ilustra el efecto de atmósferas de gases nobles sobre el crecimiento de A. alternata. 45 La figura 4 ilustra el efecto de atmósferas de gases nobles sobre el crecimiento de E. coli. La figura 5 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la vida de almacenamiento de las manzanas. 50 La figura 6 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para las zanahorias almacenadas a la temperatura ambiente. La figura 7 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para las zanahorias almacenadas a la temperatura ambiente. 55 La figura 8 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para las zanahorias almacenadas a la temperatura ambiente. 60 La figura 9 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para filetes de pescado refrigerados. La figura 10 lustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para 13 ES 2 112 983 T3 filetes de pescado refrigerados. La figura 11 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para judı́as verdes refrigeradas. 5 La figura 12 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para judı́as verdes refrigeradas. 10 La figura 13 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para judı́as verdes refrigeradas. La figura 14 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para judı́as verdes almacenadas a la temperatura ambiente. 15 La figura 15 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para judı́as verdes almacenadas a la temperatura ambiente. La figura 16 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para la lechuga a la temperatura ambiente. 20 La figura 17 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para la lechuga a la temperatura ambiente. 25 La figura 18 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para ensalada mixta refrigerada. La figura 19 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para camarones refrigerados. 30 La figura 20 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para camarones refrigerados. La figura 21 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para eperlano refrigerado. 35 La figura 22 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para eperlano refrigerado. 40 La figura 23 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para fresas a la temperatura ambiente. La figura 24 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para fresas a la temperatura ambiente. 45 La figura 25 ilustra el efecto de diferentes atmósferas como se indica sobre la carga microbiana para fresas a la temperatura ambiente. La figura 26 ilustra un procedimiento para fabricar queso azul. 50 La figura 27 ilustra un método para fabricar queso cheddar. La figura 28 ilustra un procedimiento para fabricar queso mozzarella. La figura 29 ilustra un procedimiento para fabricar requesón. 55 La figura 30 ilustra el efecto del argón a temperaturas diferentes sobre el sistema cuajo/leche desnatada. 60 La figura 31 ilustra el efecto del oxı́geno a temperaturas diferentes sobre el sistema cuajo/leche desnatada. La figura 32 ilustra el efecto del nitrógeno sobre el sistema cuajo/leche desnatada a temperaturas 14 ES 2 112 983 T3 diferentes. La figura 33 ilustra el efecto de la presente invención en la mejora del sistema cuajo/leche desnatada a 30◦ C. 5 La figura 34 ilustra el efecto de los gases de la presente invención en la mejora del sistema cuajo/leche desnatada a 35◦ C. Descripción detallada de las realizaciones preferidas 10 15 20 25 De acuerdo con la presente invención, su ha descubierto sorprendentemente que el argón y los otros gases nobles, xenón, kriptón, neón y helio, poseen propiedades profundas y significativas en la mejora de la conservación de las hortalizas en aplicaciones de envasado con gas. Estas mejoras se manifiestan a todos los niveles, con inclusión de los niveles quı́mico, enzimático, microbiológico y de percepción de la calidad por el consumidor. A la vista de la descripción que sigue, estará clara ahora para los expertos que la presente invención tiene amplia utilidad y aplicación en la conservación de hortalizas. Cuando se compara con el uso de atmósferas convencionales modificadas con nitrógeno/oxı́geno/dióxido de carbono, la introducción de gases nobles en el ambiente gaseoso de las hortalizas envasadas proporciona la prolongación de la vida de almacenamiento de dichos productos perecederos de manera sorprendente. Los gases y mezclas gaseosas de la presente invención actúan al menos de tres maneras: 1) por represión de las enzimas endógenas (originadas por el producto) y exógenas (originadas por el procedimiento y de origen microbiano) responsables de la degradación de las hortalizas, 2) por represión del crecimiento de los microorganismos de la pudrición, y 3) por represión de las oxidaciones quı́micas y otras reacciones quı́micas. Lo que se describe más adelante en esta memoria representa un avance fundamental en la represión del crecimiento microbiano afı́n a la conservación de las hortalizas y secundario para una demostración amplia de la inhibición de las enzimas reguladores del crecimiento. 30 35 40 45 La presente invención proporciona un método por el cual cualquier alimento de origen vegetal puede ponerse en contacto con cualquiera de argón y los otros gases nobles xenón, kriptón, neón y helio durante el envasado o el almacenamiento, preferiblemente envasado con gas o almacenamiento en atmósfera controlada. El presente método proporciona un método sorprendentemente satisfactorio de conservación como se evidencia por la represión excelente de las reacciones quı́micas degradantes y reacciones de oxidación, represión de las reacciones enzimáticas degradantes y oxidantes, y represión de la degradación de los parámetros importantes de percepción de la calidad por el consumidor. La presente invención proporciona la primera demostración de que los gases nobles y mezclas basadas en gases nobles aumentan significativamente y de modo totalmente sorprendente la vida de almacenamiento de una gran diversidad de productos alimenticios vegetales por acción concertada sobre los parámetros de degradación quı́mica, bioquı́mica y microbiana. A lo largo de ensayos empı́ricos extensos de numerosos parámetros de la degradación, con inclusión de la actividad enzimática procedente del interior del producto alimenticio vegetal, de aplicación externa durante la elaboración, de secreción microbiana, con inclusión de la tasa de crecimiento microbiano, y que incluyen procesos quı́micos oxidantes y ciertos otros procesos, se ha descubierto sorprendentemente que los gases nobles o mezclas que contienen gases nobles pueden inhibir la totalidad de los efectos indicados anteriormente. Se ha descubierto, adicionalmente, que los gases nobles o mezclas que contienen gases nobles pueden inhibir la totalidad de los efectos anteriores, incluso cuando se aplican a bajas presiones o en solución. 50 Ası́ pues, la presente invención proporciona, en parte, un método de envasado con gas de alimentos de origen vegetal utilizando gases nobles o de almacenamiento de alimentos vegetales bajo gases nobles, solos o en mezclas. La invención proporciona también un método para la conservación mejorada de dichos alimentos. 55 La presente invención tiene, ası́ pues, aplicabilidad extensa para cualquier problema o condición relacionada con el almacenamiento o la elaboración de productos vegetales en el que sea deseable la limitación de la degradación, oxidación, pudrición o deterioro del alimento. 60 De acuerdo con la presente invención, la expresión “gas noble” significa neón, kriptón, argón o xenón. Cualquiera de estos gases puede utilizarse aisladamente o en combinación entre ellos. Debido a su baja solubilidad en agua y su alta volatilidad, sin embargo, preferiblemente no se utiliza helio. El radón no es 15 ES 2 112 983 T3 5 10 utilizable generalmente debido a que es peligrosamente radiactivo. Sin embargo, cualquier gas o mezcla gaseosa con inclusión de nitrógeno, oxı́geno, dióxido de carbono, óxido nitroso, monóxido de carbono, o combinaciones de estos gases, puede utilizarse como gases suplementarios o “gases portadores” en la atmósfera utilizada. Particularmente, puede utilizarse helio como gas noble o gas portador. La composición de la mezcla gaseosa apropiada para utilización se determina por la naturaleza del producto o procedimiento a regular, su flora de pudrición más común y el material de envasado de elección. Dependiendo de sus niveles de concentración y de sus propiedades fı́sicas, los presentes gases y mezclas gaseosas pueden inhibir las enzimas microbianas, tanto endógenas como exógenas. Los presentes gases y mezclas gaseosas inhiben también las otras enzimas presentes en el producto, es decir, enzimas endógenas y enzimas introducidas durante la elaboración del producto. Los presentes gases y mezclas gaseosas inhiben también la oxidación quı́mica y ciertos otros procesos quı́micos degradantes. La combinación de las inhibiciones mencionadas anteriormente mejora de modo sorprendente la vida de almacenamiento del producto. 15 20 En el caso de los productos vivos, tales como productos de consumo hortı́colas frescos, es necesario un nivel mı́nimo de oxı́geno para permitir la respiración y evitar la fermentación anaerobia del producto, responsable de la generación de sabores desagradables. En otros productos, el oxı́geno causa significativamente degradación por oxidación que produce cambios de color indeseables y otros cambios esenciales. La adición de gases nobles a las atmósferas que contienen oxı́geno altera significativamente el efecto resultante del oxı́geno. Adicionalmente, sin embargo, la presente invención puede utilizarse también para reprimir el crecimiento de microorganismos sobre las hortalizas. 25 La presente invención proporciona también un método de mantenimiento o mejora del sabor, la textura, el color o el aspecto de las hortalizas. 30 En particular, la presente invención proporciona un método para mantener especı́ficamente o mejorar el color de las hortalizas, tales como hortalizas que tienen colores vivos, tales como rojo, amarillo, verde, anaranjado y púrpura. Por ejemplo, el color rojo de los rábanos o el color verde de las judı́as o del brécol puede conservarse de acuerdo con la presente invención. 35 Además, la presente invención proporciona también un método de conservación o mantenimiento de compuestos pigmentados, tales como carotenoides, flavonoides, antocianinas o clorofila, sea en hortalizas existentes naturalmente, hortalizas sintéticas u hortalizas pigmentadas con estos compuestos o los compuestos propiamente dichos. 40 Adicionalmente, la presente invención proporciona un método de inhibir el crecimiento de las bacterias aerobias y anaerobias, levaduras, mohos y/u hongos sobre los vegetales. 45 Generalmente, de acuerdo con la presente invención, las presiones utilizadas están comprendidas entre valores próximos al vacı́o, es decir, 1,0 x 10−6 Pa (10−8 torr), hasta 10.130 kPa (100 atmósferas). Sin embargo, generalmente se prefiere utilizar una presión comprendida entre 0,1 y 300 kPa (0,001 a 3 atmósferas). Adicionalmente, puede utilizarse una gama de temperaturas de 0◦ C a 120◦C. Por regla general, la presente invención se puede utilizar para conservar todo tipo de hortalizas. Ejemplos detallados de la invención 50 I. Protocolos de ensayo preliminares y resultados: Ensayo de represión de la actividad enzimática 55 60 Cubetas herméticamente cerradas que contenı́an enzimas representativas de los procesos de degradación de los productos alimenticios y de hecho importantes en tales procesos se purgaron a fondo y se llenaron con los gases de ensayo. La inyección de soluciones sustrato gasificadas inició las reacciones, las cuales se condujeron generalmente en condiciones óptimas. Estas se observaron colorimétricamente por barrido UV/frente a espectrofotometrı́a. Todos los controles se realizaron para oxı́geno, nitrógeno y dióxido de carbono. Se emplearon una gama de temperaturas y presiones. Se adjunta como apéndice un protocolo ilustrativo. Los resultados se expresaron en tiempo real, y se transformaron para calcular las diferencias de rendimiento y velocidad de la reacción. Se ensayaron de este modo más de 50 enzimas ilus16 ES 2 112 983 T3 trativas. Las enzimas seleccionadas para examen a partir de diversos productos se ensayan exactamente de la misma manera, pero siempre en términos de actividad relativa en comparación con la del mismo producto en aire u otro gas o mezcla gaseosa de control. 5 Los resultados que se consideran más adelante muestran el efecto inhibidor de los gases nobles sobre la tirosinasa. Ensayos del producto: enzimas, oxidación quı́mica, crecimiento microbiano y parámetro de preferencia del consumidor 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Se ensayaron muchos productos diferentes en una amplia diversidad de temperaturas y presiones, tratamientos de envasado y manipulación posterior al envasado. En el experimento general, bolsas estériles de pelı́cula impermeable se llenaron con productos alimenticios recién obtenidos bajo regı́menes de manipulación recomendados. Cada uno de ellos se purgó luego a fondo con la mezcla gaseosa a ensayar. Después de ser cerrada herméticamente, la bolsa se trató con posterioridad por cocción, almacenamiento en frı́o u otro parámetro, o no se trató de modo alguno. La bolsa herméticamente cerrada se almacenó a la temperatura ambiente, en frı́o, o a temperatura de congelación, y se muestreó periódicamente para recuentos de microorganismos (totales, aerobios, anaerobios, Pseudomonas, Lactobacilli). Se estudió también en cuanto a deterioro observable y se registró. Algunas muestras se sometieron a análisis quı́mico apropiado. Otras se muestrearon en cuanto a actividades de enzimas especı́ficas como anteriormente. En conjunto, el experimento medio consistió en el muestreo replicado del producto que se ensayaba en cuanto a recuentos microbianos, identificaciones microbianas, actividades enzimáticas, oxidación quı́mica, alteración del color, cambios de olor y/o sabor, y concentraciones finales de dióxido de carbono y oxı́geno. Los microbios y las enzimas conocidos como importantes en la degradación de cada producto individual se seleccionaron para examen y se registraron a partir de la bibliografı́a. Los resultados que siguen muestran los resultados de envasado con gas para bolsas sencillas conformadas a vacı́o, expresados para 11 parámetros de degradación observable. Los gases ensayados son: I-IX y se identifican en la clave. Adicionalmente, se tomaron muestras microbianas y se extendieron en placas, después de lo cual se registraron las actividades enzimáticas ilustrativas. En este experimento particular, se prepararon envases replicados de manzanas en porciones, plátanos, zanahorias, tomates, judı́as verdes, fresas, tajadas de carne cortada y pescado fresco entero. Cada producto se limpió en agua en condiciones estándar para preparación de alimentos, se envasó en una máquina envasadora de tipo vacı́o-gas, y se ensayó como anteriormente. Se proporciona una hoja sumario de los efectos de los gases nobles para este experimento a la vista de los parámetros observables. Se proporcionan también un gráfico sumario para las manzanas y otro para las tajadas de carne, que demuestran claramente que, tanto la vida media de las manzanas como la de las tajadas de carne puede ser prolongada por los gases nobles. Ensayo de velocidad de crecimiento microbiano Se ensayaron 26 microorganismos bajo al menos 105 mezclas que contenı́an gases nobles, y bajo 8 controles. Los controles eran 100% aire, 100% dióxido de carbono, 100% nitrógeno, 100% oxı́geno, y mezclas de envasado con gas utilizadas comúnmente, constituidas por diversas fracciones de nitrógeno, oxı́geno, y dióxido de carbono. Estas últimas horquillan el intervalo de mezclas gaseosas de aplicación común. Las mezclas de ensayo estaban constituidas por una serie de mezclas de dos componentes (“A” + “B”) de Ar, Xe, Kr y Ne, en las cuales cada gas constituı́a el 0,1, 1,0, 5,0 o 100% del componente “A”, se utilizó luego otro gas noble para constituir el resto del componente “A”, y se añadió luego esta primera mezcla de componente “A” a un gas base que constituı́a el segundo componente “B” en las proporciones 100:0, 95:5, 90:10 o 50:50. Los gases base eran diversos, pero en la mayorı́a de los casos eran argón; oxı́geno; nitrógeno; o mezclas de nitrógeno, dióxido de carbono y oxı́geno en proporciones utilizadas comúnmente en el envasado con gas. Ası́, una mezcla gaseosa tı́pica podrı́a ser Ar:Xe 99:1 (componente “A”) 95% del total, con aire (componente “B”) 5% del total. Ası́ pues, se ensayaron un número muy grande de mezclas de gases para actividad contra los microorganismos. 55 60 Cada uno de los microorganismos se extendió en placas después de dilución en serie para dar como resultado el crecimiento de colonias individuales en condiciones estériles. Se emplearon cultivos estándar de la ATCC y se mantuvieron como se recomienda. Los ensayos se condujeron por inoculación de viales de suero de 125 cm3 preparados con 25 cm3 de medios apropiados después que cada vial se habı́a sometido a un vacı́o moderado y se habı́a purgado concienzudamente con nitrógeno para eliminar todos los gases residuales, después de lo cual se habı́a purgado a fondo con el gas de ensayo. Se realizaron ensayos de control apropiados para esterilidad y condiciones óptimas de crecimiento. Se efectuaron medidas diarias del 17 ES 2 112 983 T3 recubrimiento del área de las placas de crecimiento, reforzadas por recuentos menos frecuentes de células totales. Los resultados se interpretaron como crecimiento/dı́a frente al aire, crecimiento total/aire para los microorganismos aerobios, y frente a atmósferas apropiadas para los microorganismos anaerobios. Se realizaron también medidas periódicas de los niveles de dióxido de carbono y oxı́geno en los viales. 5 10 Los resultados que se presentan más adelante muestran los recuentos diarios para un vial de Alternaria alternata, y comparaciones gráficas de área de crecimiento para una serie de gases en el caso de A. alternata y una serie para el caso de Escherichia coli. Los resultados demuestran claramente efectos selectivos de diferentes gases en la inhibición del crecimiento de cada especie. Los resultados son generalizables para todos los gases, pero cada especie varia en su tolerancia de las cantidades cuantitativas de gas. Los gases son también, con claridad, diferencialmente eficaces dependiendo de su composición fraccionaria en una mezcla, es decir que mezclas diferentes de gases presentan diferentes efectos sobre el mismo microorganismo. Estas mezclas muestran efectos que son sinérgicos respecto a la actividad aditiva de sus componentes. 15 Es importante comprender que un numero muy grande de parámetros contribuyen a la variación de los resultados obtenidos en estos ensayos, con inclusión de la concentración de oxı́geno, dióxido de carbono, temperatura del vapor de agua y concentraciones de sal, por ejemplo. 20 Ejemplos detallados de la invención Resultados de los ensayos empı́ricos en gran escala: Reacciones quı́micas 25 30 Para las reacciones quı́micas de oxidación, se ha concentrado que los gases nobles inhiben fuertemente la oxidación, generalmente en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He, teniendo utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno, mientras que el nitrógeno no tiene capacidad alguna de este tipo, excepto en el simple desplazamiento del oxı́geno. Otras especies señaladas tales como dióxido de carbono son reactivamente destructivas. Efecto de los gases sobre las enzimas 35 40 Las enzimas, tanto endógenas del producto como secretadas por los microorganismos encontrados en el producto, son inhibidas fuertemente a menudo por los gases nobles. El efecto de los gases nobles se resume por la clase siguiente. Un ejemplo de esta inhibición tiene lugar en la inhibición muy fuerte de las oxidadas. La Tabla siguiente resume la inhibición máxima de la actividad de las enzimas conseguida con diversos gases nobles en condiciones de almacenamiento también diversas. Clase I. Oxidorreductasa (EC 1) Tirosinasa EC 1.14.18.1 45 50 55 · a 25◦ C y condiciones de reacción óptimas, saturación simple de la solución con gas: Gas Resultado Xe Kr Ar Ne Mezcla 90:10 Xe:Kr Ar:Xe 99:1 N2 CO2 -73% (inhibición frente al aire) -73% -60% -46,7% -50% -70% 0% 0% 60 18 ES 2 112 983 T3 Glucosa-oxidasa EC 1.1.3.4 5 10 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne -91,6% (inhibición) -92,7% -85,8% -61,7% Clase II. Transferasas (EC 2) Inhibidas por los gases dobles dependiendo de las caracterı́sticas de su sitio activo. Gamma-glutamil-transpeptidasa EC 2.3.2.2 15 20 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne -7% (inhibición) -8% -5% -3% Aspartato-aminotransferasa (EC 2.6.1.1) 25 30 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne -17% (inhibición) -82% -17% -12% Clase III: Hidrolasas (EC 3) Lipasa EC 3.1.1.3 35 Exhibió hasta -20% de inhibición con argón y gases nobles. Proteasa (α-quimotripsina EC 3.4.21.1) 40 Exhibió hasta -20% de inhibición con argón y gases nobles, dependiendo de la temperatura. Con lipasa 45 50 Gas Resultado Xe Kr Ne Ar -25,6% -25% -15% -18% Clase IV: Liasas (EC 4) Citrato-sintasa EC 4.1.3.7 55 Exhibió una inhibición máxima de -27% a 25◦ C cuando se midió como una reacción acoplada con todos los gases. Clase V: Isomerasas (EC 5) 60 Ar Mezcla 90:10 Xe:Kr -37% -6,3% 19 ES 2 112 983 T3 Fosfoglucosa-isomerasa 5 Gas Resultado Xe Ne -61% -45% Clase VI: Ligasas (sintetasas)(EC 6) 10 Acetil-CoA-sintetasa EC 6.2.1.1 15 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne -18% -16% -75% -15% Factores de calidad de frutos y hortalizas 20 I. Frutos y hortalizas elaborados ligeramente: Los ejemplos son rodajas de manzana y lechuga en tiras, frescas. · Factores de calidad: 25 30 color sabor textura aspecto · La importancia relativa de estos tres factores varı́a de unos productos a otros. · calidad microbiológica 35 40 45 50 55 60 · calidad nutritiva a. Sabor: es el factor de calidad más difı́cil de mantener. · Mantener la calidad del aroma original · Evitar el desarrollo de sabores desagradables Las enzimas implicadas en la formación de sabores desagradables en los frutos y hortalizas parecen ser peroxidasas y lipoxigenasas. b. Textura: factor de calidad que diferencia los alimentos frescos de los elaborados. · Frutas y hortalizas frescas: “crujiente”, “consistente: alta “turgencia” · Alimentos elaborados: “blando”, “masticable”. Las operaciones de elaboración dan como resultado la pérdida de turgencia. Las reacciones catalizadas por enzimas causan la despolimerización de las membranas celulares y las paredes de las células. Pérdida de textura: · pectinesterasa · poligalacturonasa · pectin-metil-esterasa · galacturonasa c. Aspecto: La alteración del color de los frutos y hortalizas elaborados ligeramente es a menudo el factor que determina su vida de almacenamiento. Las reacciones catalizadas por enzimas que convierten compuestos fenólicos, tales como flavonoides, y derivados del ácido clorogénico en melaninas pardas son las causas principales de la alteración del color de los frutos y hortalizas elaborados ligeramente. Cuando los productos se pelan o cortan, se pierde la compartimentación celular, las enzimas y los sustratos entran en contacto entre sı́, y se produce la alteración del color. El dióxido de carbono puede influir en el metabolismo fenólico. 20 ES 2 112 983 T3 5 10 15 20 Degradación de la clorofila: pérdida del color verde atractivo. A medida que se degrada la clorofila, los carotenoides quedan expuestos, dando lugar a un amarilleo de los productos. La importancia del color en las hortalizas verdes se demuestra en patrones de calidad USDA en los cuales se asigna al color una proporción tan alta como el 60% del registro total de calidad. Las clorofilasas existentes naturalmente pueden convertir las clorofilas en clorofı́lidos solubles en agua, pero no alteran significativamente el color verde. Las condiciones ácidas pueden convertir las clorofilas en feofitinas. Las feofitinas tienen color pardo y son normalmente indeseables en la mayorı́a de los alimentos. La pérdida del color verde en las hortalizas frescas es un problema importante en ciertas operaciones de elaboración térmica. Los carotenoides más importantes en la impartición de color a los frutos y hortalizas son derivados de α- y β-carotenos y licopeno. Debido a su naturaleza insaturada, los mismos son generalmente sensibles a la oxidación. Los carotenos son importantes para la nutrición, el sabor y el aspecto, como precursores de la vitamina A, precursores de algunas materias volátiles que confieren sabor y como pigmentos. La lipoxigenasa parece catalizar la oxidación directa de ciertos ácidos grasos insaturados con el blanqueo simultáneo de los carotenoides. Los carotenoides son sensibles también a oxidaciones no enzimáticas con pérdida simultánea de color. Puede esperarse que un nivel bajo de oxı́geno y una humedad relativa elevada preserven los carotenos. Los carotenoides son extremadamente sensibles a la oxidación no enzimática en frutos y hortalizas deshidratados, dado que el agua actúa como barrera para la difusión del oxı́geno. Antocianinas: compuestos flavonoides, de base fenólica, solubles en agua. 25 Rojos a pH bajo Incoloros a pH intermedio Azules a pH más alto 30 35 40 45 50 55 Las polifenol-oxidasas pueden degradar las antocianinas en presencia de otros compuestos fenólicos tales como catecol o ácido clorogénico. d. Cualidad nutritiva: Degradación del ácido ascórbico 1 a 4% de oxı́geno ralentiza generalmente la degradación del ácido ascórbico, probablemente por prevención de la oxidación (lechuga, judı́as verdes, manzanas). El dióxido de carbono elevado puede acelerar la degrada ción del ácido ascórbico. e. Cualidad microbiana: · Gérmenes patógenos de las plantas: Botrytis (fresas) Monolinia Geotrichum candidum Aspergillus Aspergillus flavus Penicillium · Gérmenes patógenos para los seres humanos: Clostridium botulinum (hongos y setas comestibles envasados) Listeria monocytogenes (incrementada por CO2 elevado) en las hortalizas frescas Aeromonas hydrophila (productos refrigerados MA) Es importante observar que el bajo contenido de oxı́geno o el contenido elevado de dióxido de carbono pueden causar un metabolismo fermentativo que conduce a la acumulación de etanol y acetaldehı́do. Actividad respiratoria: · Frutos crı́ticos: 60 · Manzanas · Plátanos 21 ES 2 112 983 T3 · Frutos no crı́ticos: · Fresas 5 En general, en la sección siguiente, se analizan diversos productos en cuanto a los parámetros de su conservación. Las secciones A-D representan los cuatro parámetros de la pudrición: microbios, enzimas, reacciones quı́micas y parámetros de calidad para la percepción por el consumidor: las secciones E-H son las respuestas proporcionadas para cada una de las secciones A-D, respectivamente. 1. Producto: zanahorias 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 A. Lista de microorganismos: Microorganismos de la pudrición Erwinia carotovora (pudrición blanda bacteriana) Erwinia carotovora (Jones), Holanda Pseudomónadas similares a Pseudomonas marginalis (pudrición blanda bacteriana) Botrytis cinerea (pudrición por moho de gramı́neas) B. cinerea Pers. ex Fr. Geotrichum candidum (pudrición ácida (pudrición blanda aguanosa)) Rhizopus stolonifer (pudrición blanda de Rhizopus) Sclerotinia sclerotiorum (pudrición blanda aguanosa) S. sclerotiorum (Lib.) de Bary B. Lista de enzimas: Enzimas endógenas: Peroxidasa EC 1.11.1.7 La zanahoria tiene una actividad de peroxidasa intermedia. Catalasa EC 1.11.1.6 Causa sabor desagradable. Existe una correlación entre la estabilidad al almacenamiento de las hortalizas y la actividad de catalasa y peroxidasa. La zanahoria tiene una actividad alta de catalasa. Fenolasa EC 1.10.3.1 ACC-sintasa Factor primario que controla la velocidad de biosı́ntesis de etileno Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 La actividad puede aumentar la producción de etileno La oxidación por lipoxigenasa puede blanquear los carotenoides. Complejo de celulasas: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa Enzimas de microorganisnos: 60 Lacasa EC 1.10.3.2 Endopoligalacturonasa EC 3.2.1.15 (extracelular) 22 ES 2 112 983 T3 C. Lista de reacciones quı́micas de importancia: Degradación de los carotenoides durante la elaboración y el almacenamiento: naturaleza insaturada → sensible a isomerización y oxidación 5 D. Parámetros de calidad de importancia: El etileno inducı́a la formación de isocumarinas amargas en las zanahorias. 10 α-carotenos β-carotenos E. Tabla I. Efecto de los gases sobre los microbios: 1. Microensayos 15 a. Erwinia carotovora (ATCC 15713) Mezclas de 95% de gas en aire 20 100% 0% 2% 95% CO2 95% N2 95% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 25 30 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Kr 99:1 95% Ar:Ne 99:1 24% 20% 18% Mezclas de 90% de gas en aire 100% 0% 2% 90% CO2 90% N2 90% Ar 35 Las tres mejores mezclas de gases: 90% Ar:Xe 99:1 90% Ar:Kr 99:1 90% Ar:Ne 99:1 40 45 21% 20% 16% Mezclas de 50% de gas en aire 100% 0% 0% 50% CO2 50% N2 50% Ar Otras mezclas de gases óptimas: 50% Kr 50 12% b. Pseudomonas marginalis (ATCC 10844) Mezclas de 95% de gas en aire 55 100% 93% 100% 95% CO2 95% N2 95% Ar Las tres mejores mezclas de gas: 60 95% Ar:Ne 99:1 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 100% 100% 100% 23 ES 2 112 983 T3 Mezclas de 90% de gas en aire 5 100% 81% 85% 90% CO2 90% N2 90% Ar Las tres mejores mezclas de gas: 10 90% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 90% Ar:Xe 95:5 90% Ar:Ne 95:5 100% 43% 43% Mezclas de 50% de gas en aire 15 100% 0% 10% 50% CO2 50% N2 50% Ar Las tres mejores mezclas de gas: 20 25 50% Ar:Kr 99:1 50% Ar:Ne 95:5 50% Xe 11% 9% 16% Tabla 1b. Efecto de los gases sobre los microorganismos totales a partir de las pruebas de producto. Aerobios: Mezcla gas/gas: 30 1. CO2 2. Ar 3. (Ar:Kr):O2 % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 [9:1]:9 24% 33% 17% 35 Anaerobios: Mezcla gas/gas: 40 45 1. 2. 3. 4. 5. Aire Ar (Ar:Kr):O2 (Ar:Ne):CO2 (Ar:Ne):O2 % Inhibición comparada con 100% CO2 % 100 100 [9:1]:9 [9:1]:9 [9:1]:9 31% 9% 42% 32% 33% Levaduras: 50 Mezcla gas/gas: 1.CO2 2. Ar % Inhibición comparada con 100% aire % 100 10 35% 49% 55 Mohos: Mezcla gas/gas: 60 1. CO2 2. Ar 3. Ar:CO2 % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 9:1 3% 20% 17% 24 ES 2 112 983 T3 F. Efecto de los gases sobre las enzimas: Clase I: Oxidorreductasa (EC 1) Tirosinasa EC 1.14.18.1 5 10 15 · a 25◦ C y en condiciones de reacción óptimas, saturación simple de la solución con gas: Gas Resultado Xe Kr Ar Ne 90:10 Xe:Kr Ar:Xe 99:1 -73% (inhibición) -73% -60% -46,7% -50% -70% Glucosa-oxidasa EC 1.1.3.4 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne -91,6% (inhibición) -92,7% -85,8% -61,7% G. Efecto de los gases sobre las reacciones quı́micas: Para las zanahorias, la oxidación de los componentes de color se inhibe y las oxidaciones quı́micas degradantes se inhiben también fuertemente. Por ejemplo: 1. Color: los carotenoides que son más importantes en la impartición del color a los frutos son derivados de α- y β-carotenos y licopeno. Debido a su naturaleza insaturada, son generalmente sensibles a la oxidación. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Los carotenoides son extremadamente sensibles a la oxidación no enzimática en frutas y hortalizas deshidratadas (el agua actúa como barrera para la difusión del oxı́geno). 2. Oxidación quı́mica degradante: Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 La lipoxigenasa parece catalizar la oxidación directa de ciertos ácidos grasos insaturados con el blanqueo concomitante de los carotenoides. Los carotenoides son también sensibles a las oxidaciones no enzimáticas con pérdida concomitante de color. Se ha encontrado que el color puede mantenerse más allá del punto en el que el producto se vuelve microbiológicamente incuestionable. Peroxidasa EC 1.11.1.7 Decoloración de las antocianinas Nota: véase anteriormente el efecto de los gases sobre las enzimas para cuantificación del efecto inhibidor de los gases nobles sobre las enzimas. H. Sumario: Por regla general, la exposición de las zanahorias a los gases y mezclas gaseosas de la presente invención da como resultado la mejora del color. Las reacciones de oxidación y las reacciones de las oxidasas se reprimen. En general, se utilizan preferiblemente mezclas binarias de Ar:Ne en la cantidad relativa de 80 a 99% en volumen de Ar y 1 a 20% en volumen de Ne. Más preferiblemente, se utiliza 85 a 97% en volumen de Ar y 3 a 15% en volumen de Ne. Muy preferiblemente, se utiliza 95% en volumen de Ar y 5% en volumen de Ne. Adicionalmente, puede utilizarse hasta 10% en volumen de O2 , aire y CO2 . 25 ES 2 112 983 T3 2. Producto: Judı́as verdes refrigeradas: A. Lista de microorganismos: Microorganismos de la pudrición 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Corynebacterium flacuumfaciens [marchitamiento bacteriano] Corynebacterium michiganese [cancro bacteriano] Erwinia carotovora [pudrición blanda bacteriana] Pseudomónadas similares a Pseudomonas marginalis [pudrición blanda bacteriana] Pseudomonas phaseolicola [tizón de halo] Xanthomonas phaseoli [tizón común] Botrytis cinerea [pudrición por moho gris] Colletotrichum coccodes [antracnosis (moteado)] Geotrichum candidum [pudrición ácida(pudrición blanda aguanosa)] Rhizopus stolonifer [pudrición blanda de Rhizopus] B. Lista de enzimas: Enzimas endógenas: ACC-sintasa factor fundamental que controla la tasa de biosı́ntesis de etileno Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 la actividad puede aumentar la producción de etileno Clorofilasa EC 3.1.1.14 Peroxidasa complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa 50 Enzimas de microorganismos: Lacasa EC 1.10.3.2 (Botrytis cinerea) Endopoligalacturonasa EC 3.2.1.15 (extracelular, Rhizopus stolonifer) 55 C. Lista de reacciones quı́micas de importancia: D. Parámetros de calidad de importancia: 60 · Retención de ácido ascórbico · Retención de clorofila 26 ES 2 112 983 T3 E. Tabla I. Efecto de los gases sobre los microbios: 1. Microensayos: a. Erwinia carotovora (ATCC 15713) 5 Mezclas de 95% de gas en aire 10 100% 0% 2% 95% CO2 95% N2 95% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 15 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Kr 99:1 95% Ar:Ne 99:1 24% 20% 18% Mezclas de 90% de gas en aire 20 100% 0% 2% 90% CO2 90% N2 90% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 25 90% Ar:Xe 99:1 90% Ar:Kr 99:1 90% Ar:Ne 99:1 21% 20% 16% Mezclas de 50% de gas en aire 30 35 100% 0% 0% 50% CO2 50% N2 50% Ar Otras mezclas de gases óptimas: 50% Kr 12% b. Pseudomonas marginalis (ATCC 10844) 40 45 Mezclas de 95% de gas en aire 100% 93% 100% 95% CO2 95% N2 95% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 50 95% Ar:Ne 99:1 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 100% 100% 100% Mezclas de 90% de gas en aire 55 100% 81% 85% 90% CO2 90% N2 90% Ar Las tres mejores mezclas de gases 60 90% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 90% Ar:Xe 95:5 90% Ar:Ne 95:5 100% 43% 43% 27 ES 2 112 983 T3 Mezclas de 50% de gas en aire 5 100% 0% 10% 50% CO2 50% N2 50% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 10 50% Ar:Kr 99:1 50% Ar:Ne 95:5 50% Xe 11% 9% 16% Tabla 1b. Efecto de los gases sobre los microorganismos totales de las pruebas de producto. 15 Aerobios: Mezcla gas/gas: 20 1. CO2 2. Ar 3. [Ar:Kr]:CO2 % Inhibición comparada con 100% aire: % 100 100 [9:1]:9 26% 11% 32% Anaerobios: % Inhibición comparada con 100% CO2 25 Mezcla gas/gas: 30 1. Aire 2. Ar 3. [Ar:Kr]:O2 % 100 100 [9:1]:9 66% 61% 31% Levaduras: 35 40 Mezcla gas/gas: 1. 2. 3. 4. CO2 Ar Ar:CO2 Ar:Kr % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 9:1 9:1 55% 20% 41% 20% Mohos: % Inhibición comparada con 100% aire 45 Mezcla gas/gas: 50 55 1. CO2 2. Ar 3. Ar:Kr % 100 100 9:1 2% 25% 31% F. Tabla II. Efectos de los gases sobre las enzimas: Clase I. Oxidorreductasa (EC 1) Tirosinasa EC 1.14.18.1 · a 25◦ y condiciones de reacción óptimas, saturación simple de la solución con gas: 60 28 ES 2 112 983 T3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne 90:10 Xe:Kr Ar:Xe 99:1 -73% (inhibición) -73% -60% -46,7% -50% -70% Glucosa-oxidasa EC 1.1.3.4. Gas Resultado Xe Kr Ar Ne -91,6% (inhibición) -92,7% -85,8% -61,7% Clase III. Hidrolasas (EC3) Lipasa EC 3.1.1.3 Exhibió hasta -20% de inhibición con argón y gases nobles. Proteasa (α-quimotripsina EC 3.4.21.1) Exhibió hasta -20% de inhibición con argón y gases nobles, dependiendo de la temperatura. G. Efecto de los gases sobre las reacciones quı́micas: Para las judı́as verdes, la oxidación de los componentes de color se inhibe y las oxidaciones quı́micas degradantes se inhiben también fuertemente. Por ejemplo: 1. Color: La oxidación de la clorofila es el cambio de color primario. A medida que la clorofila se degrada, los carotenoides quedan expuestos, dando lugar a un amarilleo de los productos. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe> Kr>Ar>Ne>He teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Degradación del ácido ascórbico: el mantenimiento de un mı́nimo de 1 a 4% de O2 ralentiza generalmente la degradación del ácido ascórbico por evitación de la oxidación. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Los niveles elevados de CO2 aceleran la degradación del ácido ascórbico. Se ha encontrado que el color puede mantenerse mucho más allá del punto en el que el producto se vuelve microbiológicamente incuestionable. 2. Oxidaciones quı́micas degradantes: La actividad de lipoxigenasa EC 1.13.11.12 puede aumentar la producción de etileno Clorofilasa EC 3.1.1.14 Peroxidasa complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa Nota: Véase anteriormente el efecto de los gases sobre las enzimas para cuantificación del efecto inhibidor de los gases nobles sobre las enzimas. H. Sumario: Por lo general, las mezclas de Ar:Kr o Xe en cantidades relativas de 80-95:5-20% en volumen son preferibles. De modo más preferible se utilizan cantidades relativas de 85-95:5-15% en volumen. Es todavı́a más preferible utilizar una mezcla de Ar:Kr o Xe en proporciones 9:1 con relación a porcentaje en volumen. No obstante, si cualquiera de las mezclas anteriores, generalmente 1-15% en volumen de O2 , preferiblemente 2-10% en volumen de O2 se incluye. 29 ES 2 112 983 T3 3. Producto: Judı́as verdes, temperatura ambiente A. Lista de microorganismos: Microorganismos de la pudrición 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Corynebacterium flacuumfaciens [marchitamiento bacteriano] Corynebacterium michiganese [cancro bacteriano] Erwinia carotovora [pudrición blanda bacteriana] Pseudomónadas similares a Pseudomonas marginalis [pudrición blanda bacteriana] Pseudomonas phaseolicola [tizón de halo] Xanthomonas phaseoli [tizón común] Botrytis cinerea [pudrición por moho gris] Colletotrichum coccodes [antracnosis (moteado)] Geotrichum candidum [pudrición ácida [pudrición blanda aguanosa]] Rhizopus stolonifer [pudrición blanda de Rhizopus] B. Lista de enzimas: Enzimas endógenas: ACC-sintasa factor fundamental que controla la velocidad de biosı́ntesis de etileno Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 la actividad puede incrementar la producción de etileno Clorofilasa EC 3.1.1.14 Peroxidasa complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa 50 Enzimas de microorganismos: Lacasa EC 1.10.3.2 (Botrytis cinerea) Endopoligalacturonasa EC 3.2.1.15 (extracelular de Rhizopus stolonifer) 55 C. Lista de reacciones quı́micas de importancia: D. Parámetros de calidad de importancia: 60 · Retención de ácido ascórbico · Retención de clorofila 30 ES 2 112 983 T3 E. Tabla I. Efecto de los gases sobre los microbios: 1. Microensayos: a. Erwinia carotovora (ATCC 15713) 5 Mezclas de 95% de gas en aire 10 100% 0% 2% 95% CO2 95% N2 95% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 15 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Kr 99:1 95% Ar:Ne 99:1 24% 20% 18% Mezclas de 90% de gas en aire 20 100% 0% 2% 90% CO2 90% N2 90% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 25 90% Ar:Xe 99:1 90% Ar:Kr 99:1 90% Ar:Ne 99:1 21% 20% 16% Mezclas de 50% de gas en aire 30 35 100% 0% 0% 50% CO2 50% N2 50% Ar Otras mezclas de gases óptimas: 50% Kr 12% b. Pseudomonas marginalis (ATCC 10844) 40 45 Mezclas de 95% de gas en aire 100% 93% 100% 95% CO2 95% N2 95% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 50 95% Ar:Ne 99:1 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 100% 100% 100% Mezclas de 90% de gas en aire 55 100% 81% 85% 90% CO2 90% N2 90% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 60 90% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 90% Ar:Xe 95:5 90% Ar:Ne 95:5 100% 43% 43% 31 ES 2 112 983 T3 Mezclas de 50% de gas en aire 5 100% 0% 10% 50% CO2 50% N2 50% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 10 50% Ar:Kr 99:1 50% Ar:Ne 95:5 50% Xe 11% 9% 16% Tabla 1b. Efecto de los gases sobre los microorganismos totales de las pruebas de producto. 15 Aerobios: Mezcla gas/gas: 20 1. CO2 2. Ar 3. Ar:Ne % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 9:1 10% 2% 2% Levaduras: % Inhibición comparada con 100% aire 25 Mezcla gas/gas: 30 35 1. 2. 3. 4. CO2 Ar (Ar:Ne):O2 (Ar:Ke):CO2 45 100 100 (9:1):9 (9:1):9 19% 10% 10% 9% Mohos: Mezcla gas/gas: 40 % 1. 2. 3. 4. CO2 Ar (Ar:Ne):CO2 Ar:O2 % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 [9:1]:9 9:1 3% 15% 9% 1% F. Efectos de los gases sobre las enzimas: Clase I: Oxidorreductasa (EC 1) Tirosinasa EC 1.14.18.1 · a 25◦ y condiciones de reacción óptimas, saturación simple de la solución con gas: 50 Gas Resultado 55 Xe Kr Ar Ne 90:10 Xe:Kr Ar:Xe 99:1 -73% (inhibición) -73% -60% -46,7% -50% -70% 60 32 ES 2 112 983 T3 Glucosa-oxidasa EC 1.1.3.4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne -91,6% (inhibición) -92,7% -85,8% -61,7% Clase III. Hidrolasas (EC3) Lipasa EC 3.1.1.3 Exhibió hasta -20% de inhibición con argón y gases nobles. Proteasa (α-quimotripsina EC 3.4.21.1). Exhibió hasta -20% de inhibición con argón y gases nobles, dependiendo de la temperatura. G. Efecto de los gases sobre las reacciones quı́micas: Para las judı́as verdes, se inhibe la oxidación de los componentes que confieren color y se inhiben también fuertemente las oxidaciones quı́micas degradantes. Por ejemplo: 1. Color: la oxidación de la clorofila es el cambio de color primario. A medida que se degrada la clorofila, los carotenoides quedan expuestos, dando lugar a un amarilleo de los productos. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe>Kr>Ar>Ne> He, teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Degradación del ácido ascórbico: el mantenimiento de un mı́nimo de 1 a 4% de oxı́geno ralentiza generalmente la degradación del ácido ascórbico por evitación de la oxidación. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He, teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Los niveles elevados de dióxido de carbono aceleran la degradación del ácido ascórbico. Se ha encontrado que el color puede mantenerse más allá del punto en el que el producto se hace microbiológicamente incuestionable. 2. Oxidaciones quı́micas degradantes: La actividad de la lipoxigenasa EC 1.13. 11.12 puede aumentar la producción de etileno. Clorofilasa EC 3.1.1.14 Peroxidasa complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa Nota: véase efecto de los gases sobre las enzimas, anterior, para cuantificación del efecto inhibidor de los gases nobles sobre las enzimas. H. Sumario: Generalmente, las mezclas más eficaces son las que se han descrito en la sección previa para las judı́as verdes, con inclusión de gases, mezclas de gases y cantidades relativas de cada uno de ellos. 4. Producto: Lechuga 55 60 A. Lista de microorganismos: Microorganismos de la pudrición Erwinia carotovora (pudrición blanda bacteriana) Pseudomónadas similares a Pseudomonas marginalis (pudrición blanda bacteriana) Pseudomonas marginalis (Brown) Stevens (fango lateral) 33 ES 2 112 983 T3 5 Pseudomonas cichorii (manchas anulares bacterianas) Botrytis cinerea (pudrición por moho gris) B. cinerea Pers. ex Fr. Geotrichum candidum (pudrición ácida (pudrición blanda aguanosa)) B. Lista de enzimas: Enzimas endógenas: 10 15 20 ACC-sintasa factor primario controlador de la tasa de biosı́ntesis de etileno Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 su actividad puede aumentar la producción de etileno Clorofilasa EC 3.1.1.14 Peroxidasa complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa: Enzimas de microorganismos: 25 Lacasa EC 1.10.3.2 (Botrytis cinerea) C. Lista de reacciones quı́micas de importancia: D. Parámetros de calidad de importancia: 30 35 40 · Textura · aspecto · La degradación del ácido ascórbico está asociada con el marchitamiento en las hortalizas hojosas verdes. El caroteno es un precursor de la vitamina A. Los carotenos están sometidos a oxidación y a degradación asociada con el marchitamiento de las hortalizas hojosas. Amarilleo de las hortalizas hojosas (lechuga) durante la senescencia: pérdida de clorofila. E. Tabla I. Efecto de los gases sobre los microbios: 1. Microensayos: a. Erwinia carotovora (ATCC 15713) 45 Mezclas de 95% de gas en aire 100% 0% 2% 95% CO2 95% N2 95% Ar 50 55 Las tres mejores mezclas de gases: 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Kr 99:1 95% Ar:Ne 99:1 24% 20% 18% Mezclas de 90% de gas en aire 60 100% 0% 2% 90% CO2 90% N2 90% Ar 34 ES 2 112 983 T3 Las tres mejores mezclas de gases: 5 90% Ar:Xe 99:1 90% Ar:Kr 99:1 90% Ar:Ne 99:1 21% 20% 16% Mezclas de 50% de gas en aire 10 100% 0% 0% 50% CO2 50% N2 50% Ar Otras mezclas de gases óptimas: 50% Kr 12% 15 b. Pseudomonas marginalis (ATCC 10844) Mezclas de 95% de gas en aire 20 100% 93% 100% 95% CO2 95% N2 95% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 25 30 95% Ar:Ne 99:1 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 100% 100% 100% Mezclas de 90% de gas en aire 100% 81% 85% 90% CO2 90% N2 90% Ar 35 40 Las tres mejores mezclas de gases: 90% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 90% Ar:Xe 95:5 90% Ar:Ne 95:5 100% 43% 43% Mezclas de 50% de gas en aire 45 100% 0% 10% 50% CO2 50% N2 50% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 50 50% Ar:Kr 99:1 50% Ar:Ne 95:5 50% Xe 11% 9% 16% Tabla b. Efecto de los gases sobre los microorganismos totales de las pruebas de producto. 55 Aerobios: Mezcla gas/gas: 60 1. CO2 2. Ar 3. Ar:O2 % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 9:1 9% 0,4% 0,1% 35 ES 2 112 983 T3 Anaerobios: Mezcla gas/gas: 5 1. Ar 2. Ar:Ne % Inhibición comparada con 100% aire % 100 9:1 16% 7% Levaduras: 10 Mezcla gas/gas: 15 1. CO2 2. Ar 3. Ar:O2 % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 9:1 4% 28% 20% Mohos: 20 25 30 Mezcla gas/gas: 1. 2. 3. 4. 5. CO2 Ar Ar:CO2 Ar:Kr [Ar:Ne]:CO2 % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 9:1 9:1 [9:1]:9 2% 4% 10% 7% 8% F. Efectos de los gases sobre las enzimas: Clase I: Oxidorreductasa (EC 1) Tirosinasa EC 1.14.18.1 · a 25◦ y condiciones de reacción óptimas, saturación simple de la solución con gas: 35 40 45 50 55 60 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne 90:10 Xe:Kr Ar:Xe 99:1 -73% (inhibición) -73% -60% -46,7% -50% -70% Glucosa-oxidasa EC 1.1.3.4 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne -91,6% (inhibición) -92,7% -85,8% -61,7% Clase III. Hidrolasas (EC) Lipasa EC 3.1.1.3. Exhibió hasta -20% de inhibición con argón y gases nobles. Proteasa (α-quimotripsina EC 3.4.21.1) Exhibió hasta -20% de inhibición con argón y gases nobles, dependiendo de la temperatura. 36 ES 2 112 983 T3 5 Clase IV. Liasas (EC4) Citrato-sintasa EC 4.1.3.7 Exhibió inhibición máxima de -27% a 25◦ cuando se midió como una reacción acoplada con todos los gases. 10 G. Efecto de los gases sobre las reacciones quı́micas: Para la lechuga, la oxidación de los componentes de color se inhibe y las oxidaciones quı́micas degradantes se inhiben también fuertemente. Por ejemplo: 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1. Color: la oxidación de la clorofila es el cambio de color primario. A medida que se degrada la clorofila, los carotenoides quedan expuestos, dando lugar a un amarilleo de los productos. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He, teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Degradación del ácido ascórbico: el mantenimiento de un mı́nimo de 1 a 4% de oxı́geno ralentiza generalmente la degradación del ácido ascórbico por evitación de la oxidación. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He, teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Los niveles elevados de dióxido de carbono aceleran la degradación del ácido ascórbico. Los carotenoides que son más importantes en la impartición de color a los frutos son derivados de α- y β-carotenos y licopeno. Debido a su naturaleza insaturada, son generalmente sensibles a la oxidación. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Los carotenoides son extremadamente sensibles a la oxidación no enzimática en frutos y hortalizas deshidratados (el agua actúa como barrera para la difusión del oxı́geno). Se ha encontrado que el color puede mantenerse más allá del punto en el que el producto se vuelve microbiológicamente incuestionable. 2. Oxidaciones quı́micas degradantes: ACC Sintasa Es el factor primario controlador de la tasa de biosı́ntesis de etileno Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 La actividad puede aumentar la producción de etileno Clorofilasa EC 3.1.1.14 Convierte las clorofilas en clorofı́lidos solubles en agua. Las condiciones ácidas pueden convertir las clorofilas en feofitinas. Las feofitinas tienen color pardo y son normalmente indeseables en la mayorı́a de los alimentos. La pérdida de color verde en las hortalizas frescas en un problema importante en ciertas operaciones de elaboración térmicas. Peroxidasa complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa: Nota: Véase anteriormente efecto de los gases sobre las enzimas para cuantificación del efecto inhibidor de los gases nobles sobre las enzimas. H. Sumario: Generalmente, se prefiere una mezcla de Ar:Ne de 80 95:5-20% en volumen, siendo más preferible la mezcla de 90-95:5-10% en volumen. La más preferible de todas es una mezcla de Ar:Ne/95:5. Adicionalmente, pueden utilizarse O2 y CO2 en cantidades de hasta 5% del volumen. 5. Producto: ensalada mixta (ensalada del chef ) 60 · Lechuga (véase anteriormente) · Tomates (véase anteriormente) 37 ES 2 112 983 T3 · Zanahorias (véase anteriormente) · Pepinos · Rábanos 5 · Queso cheddar · Carne; jamón, pavo · Huevos hervidos 10 · Lombarda A. Lista de microorganismos: 15 20 25 30 35 40 45 50 1. Pepinos Microorganismos de la pudrición Erwinia carotovora (pudrición blanda bacteriana) Pseudomónadas similares a Pseudomonas marginalis (pudrición blanda bacteriana) Pseudomonas lachrymans (pudrición angular de las hojas) Botrytis cinerea (pudrición por moho gris) Colletotrichum coccodes (antracnosis (moteado)) Rhizopus stolonifer (pudrición blanda por Rhizopus) 2. Rábanos Microorganismos de la pudrición Erwinia carotovora (pudrición blanda bacteriana) Pseudomónadas similares a Pseudomonas marginalis (pudrición blanda bacteriana) Botrytis cinerea (pudrición por moho gris) Geotrichum candidum (pudrición ácida (pudrición blanda aguanosa)) Rhizopus stolonifer (pudrición blanda por Rhizopus) 3. Queso cheddar 4. Huevos hervidos 5. Lombarda Microorganismos de la pudrición Listeria monocytogenes 6. Lechuga, tomes y zanahorias: véase anteriormente B. Lista de enzimas: 55 60 1. Pepinos Enzimas endógenas Poligalacturonasa EC 3.2.1.15 · Exopoligalacturonasas EC 3.2.1.67 Desesterificación de los galacturonanos de la pared celular seguida por acción de la poligalacturonasa. 38 ES 2 112 983 T3 5 10 15 20 Pectinestersa Está implicada en la preparación del sustrato para las poligalacturonasas Peroxidasa (POD) EC 1.11.1.7 Sabores rancios desagradables. Catalasa EC 1.11.1.6 Sabores adversos Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 Actividad requerida para la producción de aldehı́dos tı́picos del sabor del pepino fresco. ACC-sintasa factor primario controlador de la tasa de biosı́ntesis de etileno Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 su actividad puede aumentar la producción de etileno. complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa 2. Rábanos Enzimas endógenas 25 30 ACC-sintasa factor primario controlador de la tasa de biosı́ntesis de etileno Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 su actividad puede aumentar la producción de etileno. complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa 3. Queso cheddar 35 4. Huevos hervidos 5. Lombarda Enzimas endógenas 40 45 50 ACC-sintasa factor primario controlador de la tasa de biosı́ntesis de etileno Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 su actividad puede aumentar la producción de etileno complejo de celulasa · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa Enzimas de microorganismos: Lacasa EC 1.10.3.2 (Botrytis cinerea, pepinos y rábanos) Endopoligalacturonasa EC 3.2.1.15 (extracelular, Rhizopus stolonifer, pepinos y rábanos) 6. Lechuga, tomates y zanahorias: véase anteriormente 55 C. Lista de reacciones quı́micas de importancia: D. Parámetros de calidad de importancia: Hortalizas hojosas: lechuga y lombarda 60 · Textura · aspecto 39 ES 2 112 983 T3 5 10 La degradación del ácido ascórbico está asociada con el marchitamiento en las hortalizas hojosas frescas. El caroteno es un precursor de la vitamina A. Los carotenos están sometidos a oxidación y degradación asociada con el marchitamiento de las hortalizas hojosas. Tasas de respiración intermedias Zanahorias El etileno indujo la formación de isocumarinas amargas en las zanahorias. Pepinos Deterioro por enfriamiento E. Tabla I. Efectos de los gases sobre los microbios: 1. Microensayos: 15 a. Erwinia carotovora (ATCC 15713) Mezclas de 95% de gas en aire 20 100% 0% 2% 95% CO2 95% N2 95% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 25 30 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Kr 99:1 95% Ar:Ne 99:1 24% 20% 18% Mezclas de 90% de gas en aire 100% 0% 2% 90% CO2 90% N2 90% Ar 35 Las tres mejores mezclas de gases: 90% Ar:Xe 99:1 90% Ar:Kr 99:1 90% Ar:Ne 99:1 40 45 21% 20% 16% Mezclas de 50% de gas en aire 100% 0% 0% 50% CO2 50% N2 50% Ar Otras mezclas de gases óptimas: 50% Kr 50 12% b. Pseudomonas marginalis (ATCC 10844) Mezclas de 95% de gas en aire 55 100% 93% 100% 95% CO2 95% N2 95% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 60 95% Ar:Ne 99:1 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 100% 100% 100% 40 ES 2 112 983 T3 Mezclas de 90% de gas en aire 5 100% 81% 85% 90% CO2 90% N2 90% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 10 90% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 90% Ar:Xe 95:5 90% Ar:Ne 95:5 100% 43% 43% Mezclas de 50% de gas en aire 15 100% 0% 10% 50% CO2 50% N2 50% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 20 25 50% Ar:Kr 99:1 50% Ar:Ne 95:5 50% Xe 11% 9% 16% c. Listeria monocytogenes (ATCC 984) Gases inhibidores óptimos: 30 50% Ar:Ne 99,9:0,1 50% Ar:Ne 99:1 50% Ar:Ne 13% 8% 8% Tabla 1b. Efecto de los gases sobre los microorganismos totales de las pruebas de producto. Aerobios: 35 Mezcla gas/gas: 40 1. CO2 2. Ar 3. [Ar:Ne]:CO2 % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 [9:1]:9 2% 12% 13% Anaerobios: % Inhibición comparada con 100% CO2 45 Mezcla gas/gas: 50 1. 2. 3. 4. Ar Ar Ar:O2 Ar:Ne % 100 100 9:1 9:1 6% 1% 5% 2% Levaduras: 55 Mezcla gas/gas: 60 1. 2. 3. 4. CO2 Ar Ar:Kr [Ar:Ne]:CO2 % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 9:1 [9:1]:9 41 63% 47% 56% 51% ES 2 112 983 T3 Mohos: Mezcla gas/gas: 1. CO2 2. Ar 5 10 % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 4% 2% F. Efectos de los gases sobre las enzimas: Clase I. Oxidorreductasa (EC 1) Tirosinasa EC 1.14.18.1 · A 25◦ y condiciones de reacción óptimas, saturación simple de la solución con gas. 15 20 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne 90:10 Xe:Kr Ar:Xe 99:1 -73% (inhibición) -73% -60% -46,7% -50% -70% Glucosa-oxidasa EC 1.1.3.4 25 30 35 40 45 50 55 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne -91,6% (inhibición) -92,7% -85,8% -61,7% Clase III. Hidrolasas (EC3) Lipasa EC 3.1.1.3 Exhibió hasta 20% de inhibición con argón y gases nobles. Proteasa (α-quimotripsina EC 3.4.21.1) Exhibió hasta -20% de inhibición con argón y gases nobles, dependiendo de la temperatura. Clase IV: Liasas (EC4) Citrato-sintasa EC 4.1.3.7 Exhibió inhibición máxima de -27% a 25◦C cuando se midió como reacción acoplada con todos los gases. G. Efecto de los gases sobre las reacciones quı́micas: Para ensaladas mixtas (ensaladas del chef), la oxidación de los componentes de color se inhibe y las oxidaciones quı́micas degradantes se inhiben también fuertemente. Por ejemplo: · · · · Lechuga (véase anteriormente) Tomates (véase anteriormente) Zanahorias (véase anteriormente) Pepinos Para los pepinos, la oxidación de los componentes de color se inhibe y las oxidaciones quı́micas degradantes se inhiben también fuertemente. 60 42 ES 2 112 983 T3 15 Por ejemplo: 1. Color: la oxidación de la clorofila es el cambio de color primario. A medida que se degrada la clorofila, los carotenoides quedan expuestos, dando lugar a un amarilleo de los productos. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe>Kr>Ar>Ne> He, teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Degradación del ácido ascórbico: el mantenimiento de un mı́nimo de 1 a 4% de oxı́geno ralentiza generalmente la degradación del ácido ascórbico por evitación de la oxidación. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He, teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Los niveles elevados de dióxido de carbono aceleran la degradación del ácido ascórbico. Se ha encontrado que el color puede mantenerse más allá del punto en el que el producto se vuelve microbiológicamente incuestionable. 2. Oxidaciones quı́micas degradantes: 20 Poligalacturonasa EC 3.2.1.15 · Exopoligalacturonasas EC 3.2.1.67 Desesterificación de los galacturonanos de la pared celular seguida por acción de las poligalacturonasas. 5 10 Pectinesterasa Está implicada en la preparacióndel sustrato para las poligalacturonasas 25 Peroxidasa (POD) EC 1.11.1.7 Sabores rancios desagradables. Catalasa EC 1.11.1.6 Sabores adversos 30 35 40 45 50 55 60 Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 Actividad requerida para la producción de los aldehı́dos tı́picos del sabor de los pepinos frescos. ACC-sintasa factor primario controlador de la tasa de biosı́ntesis de etileno. complejo de celulasa · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa Nota: Véase anteriormente efecto de los gases sobre las enzimas para cuantificación del efecto inhibidor de los gases nobles sobre las enzimas. · Rábanos Para los rábanos, la oxidación de los componentes de color se inhibe y las oxidaciones quı́micas degradantes se inhiben también fuertemente Por ejemplo: 1. Color: los cambios de color primarios son la oxidación de las antocianinas desde rojo púrpura a blanquecino y la oxidación de los flavonoides de rojo brillante a pardo. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación tanto de las antocianinas como de los flavonoides en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Se ha encontrado que el color puede mantenerse más allá del punto en el que el producto se vuelve microbiológicamente inaceptable. 2. Oxidaciones quı́micas degradantes: ACC-sintasa factor primario controlador de la tasa de biosı́ntesis de etileno 43 ES 2 112 983 T3 Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 La actividad puede aumentar la producción de etileno 5 10 15 20 25 30 35 complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa Nota: Véase anteriormente efecto de los gases sobre las enzimas para cuantificación del efecto inhibidor de los gases nobles sobre las enzimas. 2. Oxidaciones quı́micas degradantes: Nota: Véase anteriormente efecto de los gases sobre las enzimas para cuantificación del efecto inhibidor de los gases nobles sobre las enzimas. · Jamón, pavo (véase anteriormente) · Huevos hervidos 1. Color: para los huevos hervidos duros, la oxidación de los componentes de color se inhibe y las oxidaciones quı́micas degradantes se inhiben también fuertemente. Se ha encontrado que el color puede mantenerse más allá del punto en el que el producto se vuelve microbiológicamente incuestionable. 2. Oxidaciones quı́micas degradantes: Nota: Véase anteriormente efecto de los gases sobre las enzimas para cuantificación del efecto inhibidor de los gases nobles sobre las enzimas. · Lombarda Para la lombarda, se inhibe la oxidación de los componentes de color y las oxidaciones quı́micas degradantes se inhiben también fuertemente. Por ejemplo: 1. Color: los cambios de color primarios son la oxidación de las antocianinas desde rojo púrpura a blanquecino y la oxidación de los flavonoides de rojo brillante a pardo. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación tanto de las antocianinas como de los flavonoides en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Se ha encontrado que el color puede mantenerse más allá del punto en el que el producto se vuelve microbiológicamente incuestionable. 2. Oxidaciones quı́micas degradantes: ACC-sintasa factor primario controlador de la tasa de biosı́ntesis de etileno 40 45 50 Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 su actividad puede aumentar la producción de etileno complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa Nota: Véase anteriormente efecto de los gases sobre las enzimas para cuantificación del efecto inhibidor de los gases nobles sobre las enzimas. H. Sumario: Generalmente, las mezclas de Ar:Kr:O2 o Ar:Ne:CO2 funcionan satisfactoriamente en cantidades relativas de (8-9,5:2-0,5):5-10% de cada uno. Más preferiblemente, sin embargo, se utilizan cantidades relativas de (9:1):9%. 55 6. Producto: hongos y setas comestibles A. Lista de microorganismos: Clostridium botulinum 60 B. Lista de enzimas: Enzimas endógenas 44 ES 2 112 983 T3 5 10 15 Polifenol-oxidasa (PPO) EC 1.14.18.1 ACC-sintasa factor primario controlador de la tasa de biosı́ntesis de etileno Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 su actividad puede aumentar la producción de etileno reacción enzimática de pardeo: · Tirosinasa EC 1.14.18.1 inicia la reacción de pardeo · Catecol-oxidasa EC 1.10.3.2 Lacasa EC 1.10.3.1 C. Lista de reacciones quı́micas de importancia: compuestos fenólicos → melaninas pardas D. Parámetros de calidad de importancia: 20 25 30 · Pardeo enzimático: Tirosinasa Catecol-oxidasa · El almacenamiento en 0% de O2 inhibe la actividad de la catecol-oxidasa y el pardeo. · Pardeo enzimático: Tirosinasa y luego catecol-oxidasa E. Tabla I. Efecto de los gases sobre los microbios: Como para otras hortalizas. F. Efecto de los gases sobre las enzimas: Clase I. Oxidorreductasa (EC 1) Tirosinasa EC 1.14.18.1 · a 25◦ y condiciones de reacción óptimas, saturación simple de la solución con gas: 35 40 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne 90:10 Xe:Kr Ar:Xe 99:1 -73% (inhibición) -73% -60% -46,7% -50% -70% Glucosa-oxidasa EC 1.1.3.4 45 50 55 60 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne -91,6% (inhibición) -92,7% -85,8% -61,7% G. Efecto de los gases sobre las reacciones quı́micas: Para los hongos y setas comestibles, la oxidación de los componentes de color se inhibe y las oxidaciones quı́micas degradantes se inhiben también fuertemente. Por ejemplo: 1. Color: los cambios de color en los hongos y setas comestibles se deben a la oxidación de compuestos fenólicos a melaninas pardas. Se ha encontrado que lo gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He, teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. 45 ES 2 112 983 T3 aire compuestos fenólicos −→ melaninas pardas 5 10 Se ha encontrado que el color puede mantenerse más allá del punto en el que producto se vuelve microbiológicamente incuestionable. 2. Oxidaciones quı́micas degradantes: Pardeo enzimático: Tirosinasa Catecol-oxidasa · El almacenamiento en 0% de O2 inhibe la actividad de la catecol-oxidasa y el pardeo. Nota: Véase anteriormente efecto de los gases sobre las enzimas para cuantificación del efecto inhibidor de los gases nobles sobre las enzimas. G. Tabla III. Efecto de los gases sobre las reacciones quı́micas: 15 20 H. Sumario: Generalmente, se observan mejoras fundamentales de color en los hongos y setas comestibles con mezclas gaseosas constituidas por 3-97% en volumen de Ar y 17-3% en volumen de uno cualquiera de Ne, Kr, Xe o cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente, sin embargo, es deseable utilizar 5-90% en volumen de Ar y 90-5% en volumen de uno cualquiera de Ne, Kr, Xe o cualquiera de sus combinaciones. 7. Producto: tomates 25 30 35 40 45 50 55 60 A. Lista de microorganismos: Microorganismos de la pudrición Erwinia carotovora (pudrición blanda bacteriana) Erwinia carotovora (Jones) Holanda Pseudomónadas similares a Pseudomonas marginalis (pudrición blanda bacteriana) Pseudomonas tomato (moteado bacteriano) Xanthomonas vesicatoria (manchas bacterianas) Alternaria tenuis Auct. (pudrición por Alternaria) Alternaria alteria Botrytis cinerea (pudrición por moho gris) B. cinerea Pers. ex Fr. Colletrotrichum coccodes (antracnosis (moteado)) Fusarium Geotrychum candidum (pudrición ácida (pudrición blanda aguanosa)) G. candidum Link ex Pers. Phytophtora spp. (pudrición por Phytophtora (tizón + pudrición)) Rhizopus stolonifer (pudrición blanda por Rhizopus) 0.3.2 (Botrytis cinerea)) R. stolonifer (Ehr. ex Fr.) Vuill. 46 ES 2 112 983 T3 B. Lista de enzimas: Enzimas endógenas 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Citoquinin-nucleosidasas en el fruto del tomate maduro. Este sistema de enzimas juega cierto papel en el metabolismo de las citoquininas en los tomates. Pueden actuar para regular la acumulación de citoquininas activas (que gobiernan los procesos de crecimiento, maduración y senescencia). ACC-sintasa Factor primario controlador de la tasa de biosı́ntesis de etileno Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 Su actividad puede aumentar la producción de etileno. Implicada en la biogénesis del sabor. La oxidación por lipoxigenasa puede blanquear los carotenoides. Aumento de materias volátiles durante la maduración. Poligalacturonasas EC 3.2.1.15 (PG I y PG II) en los tomates maduros. Hidrólisis de los enlaces glicosı́dicos en la protopectina durante la maduración. Solubilización del ácido urónico de las paredes celulares del tomate exentas de pectinesterasa. La PG II es aproximadamente dos veces más eficaz que PG I en la solubilización de las paredes celulares. La poligalacturonasa escinde los pectatos aleatoriamente, en primer lugar a oligogalacturonatos y finalmente a ácido galacturónico, pero la tasa de hidrólisis desciende rápidamente con la disminución de la longitud de la cadena. · Endopoligalacturonasa EC Papel fundamental en los tomates rojos maduros. Pectinesterasa EC 3.1.1.11 Desesterificación de la pectina: actúa tanto en los extremos reductores como en los loci interiores en las cadenas de pectina altamente esterificadas. La acción de la pectinesterasa tiene que preceder a la degradación de la pectina por la poligalacturonasa, y de este modo la PE podrı́a ejercer regulación sobre el proceso de ablandamiento del fruto. Los tomates son una fuente particularmente rica de la enzima. La actividad es alta en los tomates verdes y aumenta aproximadamente cuatro veces durante la maduración. Celulasa EC 3.2.1.4 Degrada la carboximetilcelulosa. La celulasa puede estar implicada no solamente en la maduración del tomate, sino también en el agrandamiento de las células durante el desarrollo del fruto. complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa Peroxidasas EC 1.11.1.7 Las actividades de las peroxidasas aumentan continuamente a lo largo del desarrollo del fruto. La función fisiológica de las peroxidasas en los procesos de maduración del fruto parece consistir en la degradación de la auxina. Se ha demostrado que el etileno, como hormona vegetal, desencadena una diversidad de procesos de maduración tales como la estimulación de la actividad de la poligalacturonasa en los tomates. Enzimas de microorganismos: Endopoligalacturonasa EC 3.2.1.15 (extracelular, Rhizopus stolonifer) Lacasa EC 1.1 β-galactosidasa Pérdida de galactosa de las paredes celulares durante la maduración. 47 ES 2 112 983 T3 C. Lista de reacciones quı́micas de importancia: Degradación de los carotenoides durante la elaboración y el almacenamiento: naturaleza insaturada −→ susceptible a la isomerización y oxidación. 5 D. Parámetros de calidad de importancia: Licopeno La lipoxigenasa aumenta las materias volátiles durante la maduración del fruto. 10 E. Tabla I. Efectos de los gases sobre los microbios: 1. Microensayos a. Alternaria alternata (ATCC 13963) 15 Mezclas de 95% de gas en aire 100% 44% 50% 95% CO2 95% N2 95% Ar 20 Otras mezclas de gases óptimas 95% Ne 50% Mezclas de 90% de gas en aire 25 30 100% 15% 23% 90% CO2 90% N2 90% Ar Otras mezclas de gases óptimas 90% Ar:Xe 95:5 24% b. Erwinia carotovora (ATCC 15713) 35 40 Mezclas de 95% de gas en aire 100% 0% 2% 95% CO2 95% N2 95% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 45 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Kr 99:1 95% Ar:Ne 99:1 24% 20% 18% Mezclas de 90% de gas en aire 50 100% 0% 2% 90% CO2 90% N2 90% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 55 90% Ar:Xe 99:1 90% Ar:Kr 99:1 90% Ar:Ne 99:1 21% 20% 16% Mezclas de 50% de gas en aire 60 100% 0% 0% 50% CO2 50% N2 50% Ar 48 ES 2 112 983 T3 Otras mezclas de gases óptimas: 50% Kr 12% 5 c. Pseudomonas marginalis (ATCC 10844) Mezclas de 95% de gas en aire 10 100% 93% 100% 95% CO2 95% N2 95% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 15 20 95% Ar:Ne 99:1 95% Ar:Ne 95:5 95% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 100% 100% 100% Mezclas de 90% de gas en aire 100% 81% 85% 90% CO2 90% N2 90% Ar 25 Las tres mejores mezclas de gases: 90% Ar:Xe/Kr 99,9:0,1 90% Ar:Xe 95:5 90% Ar:Ne 95:5 100% 43% 43% 30 Mezclas de 50% de gas en aire 35 100% 0% 10% 50% CO2 50% N2 50% Ar Las tres mejores mezclas de gases: 40 50% Ar:Kr 99:1 50% Ar:Ne 95:5 50% Xe 11% 9% 16% Tabla 1b. Efecto de los gases sobre los microorganismo totales de las pruebas de producto. 45 Aerobios: Mezcla gas/gas: 50 1. CO2 2. Ar % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 92% 96% Anaerobios: 55 60 Mezcla gas/gas: 1. Aire 2. Ar 3. [Ar:Ne]:CO2 % Inhibición comparada con 100% CO2 % 100 100 [9:1]:9 49 34% 22% 35% ES 2 112 983 T3 Levaduras: Mezcla gas/gas: 5 10 1. CO2 2. Ar 3. (Ar:Kr):CO2 100 100 [9:1]:9 80% 38% 56% Mohos: Mezcla gas/gas: 15 % Inhibición comparada con 100% aire % 1. 2. 3. 4. 5. CO2 Ar Ar:Kr Ar:Ne (Ar:Ne):CO2 % Inhibición comparada con 100% aire % 100 100 9:1 9:1 [9:1]:9 62% 51% 56% 55% 72% 20 F. Efectos de los gases sobre las enzimas: Clase I. Oxidorreductasa (EC 1) Tirosinasa EC 1.14.18.1 25 30 35 · A 25◦ y condiciones de reacción óptimas, saturación simple de la solución con gas: Gas Resultado Xe Kr Ar Ne 90:10 Xe:Kr Ar:Xe 99:1 -73% (inhibición) -73% -60% -46,7% -50% -70% Glucosa-oxidasa EC 1.1.3.4 40 45 50 55 60 Gas Resultado Xe Kr Ar Ne -91,6% (inhibición) -92,7% -85,8% -61,7% Clase III. Hidrolasas (EC3) Lipasa EC 3.1.1.3 Exhibió hasta -20% de inhibición con argón y gases nobles. Proteasa (α-quimotripsina EC 3.4.21.1) Exhibió hasta -20% de inhibición con argón y gases nobles, dependiendo de la temperatura. Clase IV: Liasas (EC4) Citrato-sintasa EC 4.1.3.7 Exhibió una inhibición máxima de -27% a 25◦C cuando se midió como reacción acoplada con todos los gases. G. Efecto de los gases sobre las reacciones quı́micas: Para los tomates, la oxidación de los componentes de color se inhibe y las oxidaciones quı́micas degradantes se inhiben también fuertemente. 50 ES 2 112 983 T3 Por ejemplo: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. Color: los carotenoides que son más importantes en la impartición del color a los frutos son derivados de α- y β-carotenos y licopeno. Debido a su naturaleza insaturada, son generalmente sensibles a la oxidación. Se ha encontrado que los gases nobles afectan a la oxidación en el orden Xe>Kr>Ar>Ne>He teniendo una utilidad positiva y singular en la prevención de la oxidación incluso en presencia de oxı́geno. Los carotenoides son extremadamente sensibles a la oxidación no enzimática en frutas y hortalizas deshidratadas (el agua actúa como barrera para la difusión del oxı́geno). Se ha encontrado que el color puede mantenerse más allá del punto en el que el producto se vuelve microbiológicamente incuestionable. 2. Oxidaciones quı́micas degradantes: Citoquinin-nucleosidasas en el fruto del tomate maduro. Este sistema enzimático juega cierto papel en el metabolismo de las citoquininas en los tomates. Puede actuar para regular la acumulación de citoquininas activas (que gobiernan los procesos del crecimiento, maduración y senescencia). ACC-sintasa Factor primario controlador de la tasa de biosı́ntesis de etileno Lipoxigenasa EC 1.13.11.12 Su actividad puede aumentar la producción de etileno. Implicada en la biogénesis del sabor. La oxidación por la lipoxigenasa puede blanquear los carotenoides. Aumenta las materias volátiles durante la maduración. Poligalacturonasas EC 3.2.1.15 (PG I y PG II) en los tomates maduros. Hidrólisis de los enlaces glicosı́dicos en la protopectina durante la maduración. Solubilización del ácido urónico de las paredes celulares del tomate exentas de pectinesterasa. La PG II es aproximadamente dos veces más eficaz que PG I en la solubilización de las paredes celulares. La poligalacturonasa escinde los pectatos aleatoriamente, en primer lugar a oligogalacturonatos y finalmente a ácido galacturónico, pero la tasa de hidrólisis desciende rápidamente con la disminución de la longitud de la cadena. · Endopoligalacturonasa EC Papel fundamental en los tomates rojos maduros. Pectinesterasa EC 3.1.1.11 Desesterificación de la pectina: actúa tanto en los extremos reductores como en los loci interiores en las cadenas de pectina altamente esterificadas. La acción de la pectinesterasa tiene que preceder a la degradación de la pectina por la poligalacturonasa, y de este modo la PE podrı́a ejercer regulación sobre el proceso de ablandamiento del fruto. Los tomates son una fuente particularmente rica de la enzima. La actividad es alta en los tomates verdes y aumenta aproximadamente cuatro veces durante la maduración. Celulasa EC 3.2.1.4 Degrada la carboximetilcelulosa. La celulasa puede estar involucrada no solamente en el ablandamiento del tomate, sino también en el agrandamiento de las células durante el desarrollo del fruto. complejo de celulasa: · EC 3.2.1.4 · EC 3.2.1.21 degradación de la celulosa Peroxidasas EC 1.11.1.7 Las actividades de las peroxidasas aumentan continuamente a lo largo del desarrollo del fruto. La función fisiológica de la peroxidasa en los procesos de maduración del fruto parece consistir en la degradación de la auxina. 51 ES 2 112 983 T3 Nota: Véase anteriormente efecto de los gases sobre las enzimas para cuantificación del efecto inhibidor de los gases nobles sobre las enzimas. 5 Adicionalmente, se llevó a cabo el experimento que se ha descrito anteriormente para demostrar el efecto de diferentes gases utilizados en el envasado con gas sobre diversos alimentos. Los resultados se describen a continuación. Experimento 10 Diversos alimentos, tales como manzanas, plátanos, zanahorias, tomates, judı́as verdes, fresas, tajadas de carne y pescado se sometieron a envasado con gas utilizando diversos gases. Los gases utilizados se describen en la tabla A a continuación, mientas que los resultados del tratamiento al cabo de una semana se describen en las Tablas B y C más adelante. 15 TABLA A Experimento de envasado con gas sobre diversos productos de consumo Tratamientos I II III IV V VI VII VIII IX 20 25 100 N2 100 Ar 95% Ar + 90% Ar + 100% Xe 95% Ar + 90% Ar + 100% Kr 100% aire 30 35 5% Xe 5% Xe + 5% O2 5% Kr 5% Kr + 5% O2 TABLA B I II III IV V VI VII VIII IX Manzanas 1 9 1 9 1 8 1 8 1 8 1 9 1 9 1 9 1 8 Plátanos 5 8 9 5 8 5 8 5 8 9 5 8 10 5 8 5 8 ∗ 8 9 10 8 9 Zanahorias 9 11 9 6 9 11 6 9 6 9 11 6 9 11 9 6 9 9 Tomates 1 1 1 1 1 4 1 4 1 Judı́as Verdes 6 8 4 6 2 4 6 8 2 4 8 10 2 6 8 1 6 8 1 Fresas 6 11 1 6 1 6 6 6 6 6 Tajada de carne 6 8 6 8 6 8 6 8 6 8 6 8 6 8 6 8 6 6 Pescado 4 6 6 6 5 6 4 6 9 5 6 6 6 5 6 40 45 50 55 60 52 ES 2 112 983 T3 Clave = 1. Ausencia de cambios 2. Crecimiento de moho 5 3. Blandura 4. Crecimiento bacteriano 5. Resquebrajamiento 10 6. Humedad (producción de zumo) 7. Acorchado 8. Pardeo 15 9. Secado 10. Pudrición 20 11. Expansión en forma de bolsa ∗ El plátano se resquebrajó durante el envasado TABLA C 25 30 Tratamiento con menos deterioro al cabo de una semana Tratamiento con deterioro máximo al cabo de una semana Manzanas V - Pardeaban y se secaban muy lentamente; no se observó crecimiento alguno I - se observó algo de pudrición Plátanos VII - Algunos todavı́a amarillos y cantidad mı́nima de zumo secretada I - se despellejaron, ennegrecieron y reblandecieron muy pronto Zanahorias VII - Cantidad mı́nima de secado VIII - Muy mohosas al cabo de una semana Tomates VII - Cantidad mı́nima de moho en el núcleo al cabo de una semana; ausencia de secreción de zumo V - Cantidad máxima de moho en el núcleo; la piel se agrietaba y secretaban gran cantidad de zumo Judı́as verdes VII - se mantuvieron muy verdes a lo largo del máximo perı́odo de tiempo IV - muy mohosas al cabo de una semana Fresas II - Retenı́an su zumo durante las observaciones VII - se observó algo de moho al cabo de una semana Tajada de carne IX - pardeó y se secó con gran lentitud V - se observó gran cantidad de moho al cabo de una semana Pescado VII - cantidades mı́nimas de moho y pudrición observadas. Mantenı́an la mayor parte de su jugo VIII - se observó gran cantidad de moho y pudrición 35 40 45 50 55 60 Generalmente, cualquiera de los métodos de la presente invención puede utilizar un gas noble, mezcla de gases nobles o mezcla que contenga al menos un gas noble y que contenga también uno o más gases adicionales, tales como nitrógeno, oxı́geno, aire, dióxido de carbono, óxido nitroso o monóxido de carbono 53 ES 2 112 983 T3 o cualquier condición de los mismos. Adicionalmente, la presente invención contempla de modo especı́fico el uso de mezclas discontinuas de gases, tales como aproximadamente 90:10 (Kr/Xe). 5 Asimismo, la presente invención contempla también de modo especı́fico el uso de mezclas de aire desoxigenado, es decir que tengan por regla general menos de aproximadamente 15% en volumen, de modo preferible menos de aproximadamente 10% en volumen en aire y al menos un gas noble en una cantidad suficiente para contrarrestar el efecto oxidante del oxı́geno contenido en ellas. 10 Por regla general, los presentes gases y mezclas de gases exhiben una vida de almacenamiento incrementada de los alimentos a las temperaturas del ambiente, o a temperaturas de refrigeración, congelación o cocción, tales como desde aproximadamente -190◦C a aproximadamente 260◦C. 15 Además, el efecto de la presente invención puede obtenerse en asociación con el envasado a vacı́o, incorporándose después de ello la atmósfera de que se trate. Se ha demostrado que los presentes gases o mezclas de gases aumentan la vida de almacenamiento de estos productos cuando se elaboran a alta presión de estas atmósferas y se estabilizan luego a 1 atm. 20 Los presentes gases o mezclas de gases son eficaces cuando el gas noble o la mezcla de gases nobles se disuelve en un lı́quido anteriormente, durante o después de la elaboración. 25 Los presentes gases o mezclas de gases son eficaces cuando el gas noble o la mezcla de gases nobles se añade como un lı́quido, especialmente durante una congelación bajo gas licuado. 30 Los presentes gases o mezclas de gases actúan para reprimir la actividad de enzimas importantes en la degradación de los productos alimenticios, con inclusión de enzimas endógenas del alimento, endógenas del metabolismo microbiano, aplicadas exógenamente durante la elaboración del alimento, y secretadas exógenamente por el microorganismo. Los presentes gases o mezclas de gases actúan para reprimir la oxidación de los productos alimenticios. 35 40 45 50 55 60 Los presentes gases o mezclas de gases actúan para incrementar la vida de almacenamiento de los productos alimenticios tanto si éstos son frescos, sin tratar, sin elaborar, elaborados, cocinados, ahumados, enlatados o salados. La presente invención es eficaz cuando se utiliza cualquier medio que permita el contacto entre el gas y el producto alimenticio, con inclusión de: lavado abundante; inyección, borboteo; aplicación de vacı́o seguida por lavado abundante con gas; presurización, introducción en un envase impermeable o semipermeable cubierto con pelı́cula o conformado que contenga el producto y cerrado herméticamente; lavado continuo abundante con gas a través de, por encima de, o alrededor de un producto alimenticio; en condiciones sépticas o estériles; en los cuales el envase está presurizado o no; en los cuales el envase es de tipo a granel, de transporte o para uso individual; en los cuales el envase es una bolsa conformable, una bolsa inyectable, una bolsa susceptible de cierre hermético, una bandeja conformable, una bandeja o bolsa conformable a vacı́o, una bandeja o bolsa conformable por calentamiento, o una bandeja cubierta con pelı́cula; en los cuales el envase se congela, se refrigera o se guarda a la temperatura ambiente, o se cocina posteriormente. Por regla general, la presente invención proporciona un procedimiento para reprimir las enzimas que causan el crecimiento de microbios en los alimentos y/o los alimentos por puesta en contacto de dichos alimentos con gas noble y/o mezclas de gases nobles y/o mezclas que contienen gases nobles. Un procedimiento para reprimir las enzimas “producidas por el propio alimento que causan degradación de dichos alimentos por contacto de dicho alimento con un gas noble y/o mezclas que contienen gases nobles. Un procedimiento para reprimir las enzimas secretadas por los microorganismos de la pudrición en el interior y/o en la superficie de los alimentos por puesta en contacto de dichos alimentos con un gas noble y/o mezclas de gases nobles y/o mezclas que contienen gases nobles. Un procedimiento para reprimir las enzimas en el interior y/o en la superficie de los alimentos por 54 ES 2 112 983 T3 puesta en contacto de dichos alimentos con un gas noble y/o mezclas de gases nobles y/o mezclas que contienen gases nobles. 5 10 Un procedimiento para conservar el color y/o el aspecto de un producto alimenticio por puesta en contacto de dicho alimento con un gas noble y/o mezclas de gases nobles y/o mezclas que contienen gases nobles. Un procedimiento para reprimir las reacciones de oxidación quı́mica no enzimáticas de un producto alimenticio por puesta en contacto de dicho alimento con un gas noble y/o mezcla de gases nobles y/o mezclas que contienen gases nobles. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 55 ES 2 112 983 T3 REIVINDICACIONES 5 10 1. Un procedimiento para conservar hortalizas seleccionadas del grupo constituido por zanahorias, judı́as verdes, lechuga, ensalada del chef, hongos y setas comestibles, tomates y sus mezclas, que se caracteriza por poner en contacto dicha hortaliza o mezcla de las mismas con una mezcla de gases, estando la mezcla de gases de acuerdo con lo siguiente: Alimento Mezclas de gases Zanahorias Se utilizan preferiblemente mezclas binarias de Ar:Ne en la cantidad relativa de 80 a 99% en volumen de Ar y 1 a 20% en volumen de Ne, más preferiblemente, 85 a 97% en volumen de Ar y 3 a 15% en volumen de Ne, muy preferiblemente, 95% en volumen de Ar y 5% en volumen de Ne, en las cuales se puede utilizar adicionalmente hasta 10% en volumen de O2 , aire o CO2 . Judı́as verdes Son preferibles mezclas de Ar:Kr o Xe en cantidades relativas de 80-95:5-20% en volumen, más preferiblemente, cantidades relativas de 85-95:5-15% en volumen, más preferiblemente una mezcla de Ar:Kr o Xe de 9:1 relativa en % en volumen, en las cuales se incluye aproximadamente 1-15% en volumen de O2 , preeriblemente 2-10% en volumen de O2 . Lechuga Es preferible una mezcla de Ar:Ne de 80-95: 5-20% en volumen, siendo más preferible la mezcla de 90-95:5-20% en volumen, siendo la más preferible de todas una mezcla de Ar:Ne/95:5, en la cual se pueden utilizar adicionalmente O2 y CO2 en cantidades de hasta 5% en volumen. Ensalada mixta Una mezcla de Ar:Kr:O2 o Ar:Ne:CO2 se comporta satisfactoriamente en cantidades relativas de (8-9,5:2-0,5):5-10% de cada uno, utilizándose más preferiblemente cantidades relativas de (9:1):9%. Hongos y setas comestibles Mezclas de 3-97% en volumen de Ar y 17-3% en volumen de uno cualquiera de Ne, Kr, Xe o cualquiera de sus combinaciones, más preferiblemente 5-90% en volumen de Ar y 90-5% en volumen de uno cualquiera de Ne, Kr, Xe o cualquiera de sus combinaciones. Tomates 90 por ciento en volumen de Ar; 5 por ciento en volumen de Kr; 5 por ciento en volumen de O2 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2. El procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado adicionalmente por el hecho de que dicha mezcla de gases incluye un gas portador seleccionado del grupo constituido por oxı́geno, nitrógeno, aire, dióxido de carbono y sus mezclas. 3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado adicionalmente por efectuarse a una temperatura comprendida entre 0◦ C y 40◦ C. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, caracterizado adicionalmente por el hecho de que la temperatura está comprendida entre 10◦ C y 30◦ C. 60 5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado adicionalmente porque dicha mezcla de gases se encuentra a una presión menor que 10 atmósferas (1013 kPa). 56 ES 2 112 983 T3 6. El procedimiento de la reivindicación 5, caracterizado adicionalmente porque dicha mezcla se encuentra a una presión menor que 3 atmósferas (304 kPa). 5 7. El procedimiento de la reivindicación 6, caracterizado adicionalmente porque dicha mezcla de gases se encuentra a una presión comprendida entre 1 y 2 atmósferas (101 y 202 kPa). 8. El procedimiento de la reivindicación 7, caracterizado adicionalmente porque dicha mezcla de gases se encuentra a una presión de 1 atmósfera (101 kPa). 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada reserva. 57 ES 2 112 983 T3 58 ES 2 112 983 T3 59 ES 2 112 983 T3 60 ES 2 112 983 T3 61 ES 2 112 983 T3 62 ES 2 112 983 T3 63 ES 2 112 983 T3 64 ES 2 112 983 T3 65 ES 2 112 983 T3 66 ES 2 112 983 T3 67 ES 2 112 983 T3 68 ES 2 112 983 T3 69 ES 2 112 983 T3 70 ES 2 112 983 T3 71 ES 2 112 983 T3 72 ES 2 112 983 T3 73 ES 2 112 983 T3 74 ES 2 112 983 T3 75 ES 2 112 983 T3 76 ES 2 112 983 T3 77 ES 2 112 983 T3 78 ES 2 112 983 T3 79 ES 2 112 983 T3 80 ES 2 112 983 T3 81 ES 2 112 983 T3 82 ES 2 112 983 T3 83 ES 2 112 983 T3 84 ES 2 112 983 T3 85 ES 2 112 983 T3 86 ES 2 112 983 T3 87 ES 2 112 983 T3 88 ES 2 112 983 T3 89 ES 2 112 983 T3 90 ES 2 112 983 T3 91

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