Modelo dinámico para el crecimientro de bacterias lácticas sobre

Resumen: E-072
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Modelo dinámico para el crecimientro de bacterias lácticas
sobre emulsiones cárnicas
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2
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Cayré, María E. - Vignolo, Graciela - Garro, Oscar
1.Facultad de Agroindustrias, UNNE. Cte Fernández 755 (3700)- Sáenz Peña, Chaco.
e-mail: ecayre@fai.unne.edu.ar
2.CERELA – CONICET, Chacabuco 145 (3400), Tucumán.
ANTECEDENTES
El crecimiento microbiano en los alimentos está gobernado por la acción simultánea de diferentes factores físicos y
químicos limitantes, la capacidad de sobrevivir e iniciar el crecimiento de cada tipo de microorganismo se ve influida
por la acción conjunta de los mismos. Por este motivo resulta difícil evaluar la respuesta microbiológica en sistemas
reales y complejos como son los alimentos.
La microbiología predictiva de alimentos, de gran crecimiento en los últimos años, constituye un enfoque
interdisciplinario en el que se conjugan la microbiología, la matemática, la estadística y la tecnología de alimentos, con
el objeto de describir, por medio de ecuaciones matemáticas, el comportamiento de los microorganismos frente a
combinaciones de condiciones ambientales definidas y controladas. De esta capacidad de describir, surge la posibilidad
de predecir la respuesta fisiológica de los microorganismos sobre la base de parámetros físico-químicos relevantes.
En la actualidad existen muchos modelos matemáticos que permiten predecir el crecimiento de un amplio rango de
microorganismos patógenos y alteradores de alimentos bajo distintas combinaciones de factores ambientales,
intrínsecos y extrínsecos. El modelado matemático es realizado, generalmente, asumiendo condiciones constantes para
determinar los valores de los parámetros cinéticos de crecimiento. Varios de estos modelos muestran el efecto de la
temperatura sobre los parámetros cinéticos de crecimiento de distintos microorganismos y han sido construidos sobre la
suposición de que la temperatura se mantiene constante en el tiempo (Gianuzzi, et al., 1998; Devlieghere et al., 1998,
Aggelis et al., 1998, Augustin and Carlier, 2000).
Sin embargo, condiciones tales como temperatura, pH o composición de la atmósfera gaseosa no se mantienen
constantes durante el almacenamiento refrigerado de los alimentos (Labuza and Taoukis, 1992). Debido a este hecho, en
la actualidad el modelado matemático está orientado a la obtención de modelos dinámicos, es decir, modelos que
permitan predecir la seguridad o vida útil de los alimentos bajo condiciones fluctuantes. Uno de los factores que más
fluctúa es la temperatura de almacenamiento y es el más investigado (Fu et.al., 1991; Dickson et.al.,1992; Li and
Torres, 1993; Roos and McMeekin, 1994; Baranyi et.al., 1995; Van Impe et.al., 1995; Sovoleva et.al., 2001).
Por lo tanto, para que los modelos puedan ser aplicables a alimentos almacenados en condiciones reales, es decir, en
condiciones donde la temperatura u otros factores cambian con el tiempo es necesario considerar, dentro del modelo, el
efecto de los cambios de las variables externas sobre el crecimiento microbiano a fin de obtener predicciones más
precisas en cuanto a la inocuidad y vida útil de los mismos.
El objetivo del presente trabajo fue generar los datos necesarios para la construcción de un modelo dinámico y
proponer un modelo dinámico que permita analizar la influencia de las fluctuaciones de la temperatura de
almacenamiento sobre el crecimiento de bacterias lácticas en emulsiones cárnicas cocidas.
MATERIALES Y MÉTODOS
a-Muestras y Ensayos Microbiológicos
Se utilizaron muestras de emulsiones cárnicas cocidas (salchichas) suministradas por una industria local las cuales
fueron envasadas al vacío en película plástica con permeabilidad al oxígeno de 70 cm3/m2/24h/1atm usando
envasadora RAPI-VAC S-750 y almacenadas bajo condiciones estáticas a 0, 8 y 15 ºC durante 60 días. Periódicamente
se tomaron muestras a partir de las cuales se determinó el número de Unidades Formadoras de Colonias por gramo
(UFC / g) de bacterias lácticas por siembra sobre agar MRS. Los ensayos se realizaron por triplicado.
b- Modelado del crecimiento microbiano en función del Tiempo
Las curvas de crecimiento a cada temperatura se generaron por ajuste de los datos experimentales a la ecuación
modificada de Gompertz (Zweitering et al., 1990) cuya expresión matemática es:

 µ *e

y = a * exp(− exp(b − ct )) = A * exp − exp max (λ − t ) + 1 
 A


(1)
Donde
y = log
N
, con N0 = Número de microorganismos al tiempo t=0 y, N = número de microorganismos al tiempo t=t
N0
a = A = máxima población alcanzada
(2)
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c=
µ maxe
b=
µ max e
A
A
,con µmax = máxima velocidad específica de crecimiento [días-1] y, e = exp(1)
(3)
λ + 1 , con λ= tiempo de latencia [días]
(4)
c- Modelado del Crecimiento Microbiano en función de la Temperatura
Los valores de µmax obtenidos a cada temperatura fueron ajustados al modelo de raíz cuadrada (Ratkowsky et.al., 1982)
cuya expresión es:
µ max = m * (T − Tmin )
(5)
donde Tmin es la temperatura mínima teórica para el crecimiento, T es la temperatura de almacenamiento en ºC y m es un
parámetro.
Para modelar el efecto de la temperatura sobre el tiempo de latencia se utilizó la siguiente ecuación:
ln (λ ) = p + q * T
(6)
donde p y q son parámetros a ser estimados y T es la temperatura de almacenamiento en ªC.
d- Modelo Dinámico para el Crecimiento Microbiano
Se utilizó la metodología propuesta por Van Impe et.al . (1995). De acuerdo a esta metodología derivando la ecuación
(1) se obtiene:
dy
= a(exp(− exp(b − ct )))(− exp(b − ct ))(− c )
dt
a
dy
= cy ln 
dt
 y
(7)
Con el objeto de solucionar los inconvenientes presentados por la ausencia del parámetro b en la expresión (7) y el
problema numérico al considerar como condición inicial para la integración el valor y=0, los autores definieron la
siguiente variable:
n = ln( N )
y = n − ln ( N 0 )
dy dn
=
dt
dt
 a 
dn

= c(n − n0 ) ln
−
n
n
dt
0 

Usando como condición inicial:
(8)
n(t = 0 ) = n0 + a exp(− exp(b ))
De esta manera y considerando las expresiones (2), (3), (4), (5) y (6) la ecuación diferencial (8) permite analizar el
comportamiento de la población microbiana bajo condiciones de temperatura variable.
e- Métodos Estadísticos y Numéricos
Los datos experimentales se ajustaron a los modelos utilizando el método de mínimos cuadrados y algoritmo
Marquardt para regresión lineal y no lineal respectivamente usando STATGRAPHICS Plus version 4.0. Los valores
residuales se analizaron a fin de determinar si se cumplen las hipótesis estadísticas que permiten el uso correcto de
modelos.
Se utilizó análisis de varianza (ANOVA) y Test de Tukey para determinar la significancia de la influencia de la
temperatura sobre los parámetros cinéticos de crecimiento.
La integración de la ecuación diferencial (8) se realizó con el método de Runge-Kutta usando Matlab Versión 5.3.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El crecimiento de bacterias lácticas sobre emulsiones cárnicas cocidas envasadas al vacío y almacenadas a 0, 8 y 15°C
fue monitoreado durante un período de 60 días. Los recuentos obtenidos fueron usados para estimar el tiempo de
latencia y la velocidad máxima de crecimiento por ajuste de los valores experimentales a la ecuación (1). En todos los
casos, el modelo explicó un alto porcentaje de la variación de los recuentos con el tiempo (0,96≤ R2≤ 0,99).
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1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1,5
p= 1,04
q=-0,11
R2=0,95
1
ln(λ)
(µ max)^1/2
El análisis de varianza mostró una significativa influencia (Pv<0,05) de la temperatura de almacenamiento sobre los
parámetros cinéticos. Cuanto mayor es la temperatura, mayor es la velocidad máxima de crecimiento y menor el tiempo
de latencia del grupo de bacterias lácticas.
En la Figura 1 (a) y (b) se muestra el ajuste de los parámetros cinéticos de crecimiento µmax y λ a las ecuaciones (5) y
(6) respectivamente. En ambos casos, los modelos fueron estadísticamente adecuados para describir los datos.
m= 0,062
Tmin=-6,7
R2=0,97
0,5
0
-0,5
-1
0
5
10
15
0
5
Temperatura (°C)
10
15
Temperatura (°C)
Figura 1. Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre los parámetros cinéticos µmax (a) y λ (b) estimados para
bacterias lácticas creciendo en emulsiones cárnicas cocidas envasadas al vacío.
Por combinación de las ecuaciones (5) y (6) con la (1) se obtiene un modelo explícito que permite obtener, para
cualquier temperatura entre 0 y 15°C, una curva de crecimiento. Sin embargo, los valores predichos por este modelo
sólo son válidos cuando la temperatura es mantenida en un valor constante. El modelo no es aplicable bajo condiciones
de temperatura variable puesto que provoca discontinuidades en la curva de crecimiento que biológicamente no son
posibles (Van Impe et.al., 1995). Esta situación está ejemplificada en los resultados de la simulación presentados en la
Figura 2. Para la simulación se usaron los datos obtenidos en los ensayos bajo condiciones isotérmicas y un perfil de
temperatura variando en el tiempo entre 0 y 8°C y luego regresa a 0°C.
8
log(N/No)
6
4
2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
8
T (ºC)
6
4
2
0
0
10
20
30
40
tiempo (dias)
50
60
Figura 2. Predicciones del modelo explícito y dinámico para el crecimiento de bacterias lácticas sobre emulsiones
cárnicas cocidas bajo condiciones no isotérmicas.
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Curvas de crecimiento predichas por el modelo explícito a temperatura constante de 0 y 8°C (…), Predicciones del
modelo explícito(─) y dinámico (-- --) para el perfil tiempo- temperatura propuesto.
En la figura puede observarse que cuando la temperatura cambia el modelo explícito predice un cambio instantáneo en
el tamaño de la población lo cual evidencia que este modelo no puede explicar de forma adecuada los cambios en la
población microbiana cuando la temperatura cambia en el tiempo. Por ejemplo cuando pasa de 0 a 8°C el modelo pasa
al valor que le correspondería como si hubiese permanecido todo el tiempo a 8°C y sigue la curva de esa temperatura.
Y cuando la temperatura regresa al valor inicial de 0°C , el modelo predice una disminución del número de células al
valor que debería tener si hubiese permanecido todo el tiempo a 0°C. Este comportamiento claramente no se condice
con la realidad, ya que los microorganismos formados no pueden “aparecer” y “desaparecer” en un instante de tiempo.
La curva predicha por el modelo dinámico (Fig. 2), integrado por métodos numéricos, si tiene un comportamiento que
se condice con la realidad práctica: ante un aumento de temperatura , se puede observar un aumento en la velocidad de
crecimiento y viceversa, cuando la temperatura disminuye se verifica una disminución de la velocidad de crecimiento.
Es decir en todo el intervalo considerado el número de microorganismos es una función continua del tiempo.
En conclusión el modelo dinámico utilizado responde en forma realística porque tiene en cuenta la historia previa de la
población que se está modelando.
REFERENCIAS
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a raw cured meat product stored at 3°C and at 12°C in air. Int. J. Food Microbiol. 43: 39-52.
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type model including interactions between environmental factors. Int. J. Food Microbiol. 56:53-70.
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changing temperature. Int. J. Food Microbiol. 27: 61-75.
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growth of lactobacillus sake in modified atmosphere. Int. J. Food Microbiol. 41:231-238.
• Dickson, J.S., Siragusa, G.R. and Wray, J.E. Jr. (1992) predicting the growth of Salmonella typhimirium of beef by
using the temperature function integration technique. Appl. Environ. Mocrobiol. 58: 3482-3494.
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refrigerated beef stored at different temperatures. Int. J. Food Microbiol. 39: 101-110.
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chilled foods: a review. J. Food Prot., 55-74.
• Li, K.Y. and Torres, J.A. (1993) Microbial growth estimation in liquid media exposed to temperature fluctuations. J.
Food Sci. 58:644-648.
• Ratkowsky, D.A., Olley, J, McMeekin, T.A. and Ball, A. (1982) relationship betwen temperature and growth rate of
bacterial cultures. J. Bacteriol.149:1-5.
• Roos, T. and McMeekin, T.A. (1994) Predictive microbiology. Int. J. Food Microbiol. 23: 241-246.
• Sovoleva, T.K., Filippov, A.E., Pleasants, A.B., Jones, R.J. and Dykes, G.A. (2001) Stochastics modeling of the
growth of a microbial population under changing temeparture regimes. Int. J. Food Microbiol. 64: 317-323
• Van Impe, J.F., Nicolaï, B.M., Schellekens, M., Martens, T. and De Baerdemaeker, J. (1995) Predictive
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