1. Resumen El sistema radical del arándano (Vaccinium corymbosum L.) es superficial, fibroso, de poca extensión y se compone de finas raicillas. Debido a que la raíz está desprovista de pelos radicales, son las raices jóvenes las que efectúan la labor de absorción. Las células epidermales de estas raices son las que bajo condiciones naturales se encuentran invadidas por hongos micorríticos. Se plantea que a partir de la inoculación de plantas de arándano con hongos micorríticos en vivero, se genera un mayor crecimiento vegetativo y radical, producto de la simbiosis, acortando el período de permanencia de las plantas en vivero. Durante la temporada primavera-verano de 2005-2006, en la estación experimental La Palma de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso se realizo un ensayo donde se inocularon plantas de arándano alto (Vaccinium corymbosum L.) variedad O’Neal micropropagadas y propagadas por estaca de seis meses de edad con tres tipos de micorrizas para evaluar su efecto sobre el desarrollo en vivero. La inoculación se efectuó en el momento del trasplante a la bolsa definitiva con micorrrizas ericoides, vesículo arbusculares y provenientes de la rizósfera de una plantación adulta de arándano. Las plantas se dispusieron en un invernadero midiéndose cada 15 días parámetros de crecimiento vegetativo. Luego de 6 meses, se realizó un análisis destructivo de las plantas determinando el tipo y porcentaje de infección micorrítica junto con la cuantificación del crecimiento radical. Las tres fuentes de inóculo fueron capaces de desarrollar micorrizas con las raíces de las plantas. Al inocular plantas de arándano con micorrizas ericoides, existen diferencias significativas entre los tipos de plantas utilizados, siendo las micropropagadas las que presentan el mayor largo y diámetro de brotes respecto a las propagadas por estaca. Las plantas micropropagadas con micorrizas ericoides presentaron un mayor desarrollo para todas las variables medidas respecto a los otros tratamientos, sin embargo presentan uno de los menores porcentajes de infección micorrítica, lo cual sugiere que aún con un bajo de infección la micorriza es capaz de desarrollar un mayor crecimiento. Summary The radical system of blueberry (Vaccinium corymbosum), is superficial, fibrous, of little fine extension and it is made up of fines roots. Because the root is lacking of radical hairs, they are the young roots those that carry out the absorption work. The epidermals cells by these roots are those that under natural conditions are invaded by mychorrizae fungis. One considers that from the inoculation of plants of blueberry whith mychorrizae fungi in breeding ground, a greater vegetative and radical growth is generated, product of the symbiosis, shortening the period of permanence of the plants in breeding groun. During the season spring-summer of 2005-2006, in the experimental station The Palm of the Pontificia University of Valparaiso, Highbush blueberry plants were inoculated (Vaccinium corymbosom L), the O´Neal variety, micro propagated and propagated by six months old cuttings with three types of micorrizae for evaluate their effect on the nursery development. The inoculation was made in the moment of the transplant to the definitive bag with micorriza ericoids, vesicular arbusculars which came from the rizosfera of an adult plantation of blueberry. The plants were prepared in a greenhouse and they were measured in a 15 day parameter of vegetative growing. After 6 months, a destructive analysis was performed on the plants determining the type and the percentage of the micorritical infection next to the quantize of the radical growing. The three sources of the innoculum were capables of develop micorriza with the roots of the plants. When you inoculate blueberry plants with micorriza ericoid, they are significant differences between the types of plants used, being the micropropagated which present the largest diameter of shoots regarding the propagated by cutting. The micropropagated plants with micorriza ericoid present a bigger development for all the measure variables respect to the others treatments , however they present one of the smallest percentages of micorritical infection, which suggest that with that level of infection the micorriza is capable of developing a bigger growing. 2. Introducción Como productores de fruta fresca de exportación, Chile tiene un basto reconocimiento internacional llegando a más de 100 países con 75 especies diferentes. La industria frutícola de Chile lidera la exportación dentro del hemisferio sur, siendo el tercer sector más importante en la economía nacional (CFFA, 2006). Una de las principales ventajas de la industria es la producción de fruta en contraestación respecto al hemisferio norte, donde se ubican los mercados más importantes para Chile. Esto se enriquece con las condiciones climáticas adecuadas de las zonas productoras y las barreras fitosanitarias naturales propias del país. El arándano (Vaccinium corymbosum) fue introducido a Chile en la década del 80 concentrando sus plantaciones entre la VII y X Región debido a los requerimientos agroclimáticos de la especie y al incentivo de la actividad frutícola de la zona. Sin embargo, en los últimos años se ha producido una expansión del cultivo llegando hacia la zona centro norte, donde las condiciones climáticas dan la posibilidad de producir fruta temprana alcanzando mayores precios en el mercado. El avance del sector productivo del arándanos hacia la zona centro norte, presupone la necesidad de contar con variedades que se adapten de mejor manera a la oferta ambiental como también a las condiciones de suelo (Buzeta, 1997). El cultivo de arándano se ha desarrollado ampliamente en los últimos diez años gracias a los factores señalados anteriormente. En 1995, Chile contaba con 1000 ha plantadas, incrementándose en un 400% al año 2005. Como productor de arándanos, el país lidera el hemisferio sur y ocupa el quinto lugar en el ranking mundial (CFFA, 2006). Actualmente, dentro de la exportación de frutas frescas, es la especie que entrega mayor rentabilidad en cuanto al retorno (FOB/kg) y se muestra como uno de los cultivos con mayores proyecciones económicas (ODEPA, 2006). El arándano, es un frutal menor nativo del hemisferio norte perteneciente a la familia Ericaceae. El sistema radical del arándano es superficial, fibroso, de poca extensión y se compone de finas raicillas. Debido a que la raíz está desprovista de pelos radicales, son las raíces jóvenes las que efectúan la labor de absorción. Las células epidermales de estas raíces bajo condiciones naturales, se encuentran invadidas por los hongos micorríticos. Estos hongos pertenecen a las llamadas micorrizas ericoides, simbiontes específicos de la familia del arándano (Muñoz, 1988). Las micorrizas ericoides constituyen una categoría especial para las plantas de la familia Ericaceae, tanto desde el punto de vista morfológico como funcional, ya que intervienen en el metabolismo del nitrógeno y no solamente del fósforo como ocurre con otras micorrizas (Muñoz,1998). En la actualidad, las plantas de arándano son propagadas indistintamente por medio de estacas o mediante micropropagación. En ambos casos, uno de los principales inconvenientes es el largo período de permanencia de las plantas en el vivero a la espera de obtener suficiente desarrollo para asegurar su adaptación en el terreno de plantación. El proceso de multiplicación puede tomar normalmente hasta 24 meses, lo que se traduce en el aumento de los costos de producción. El proceso de crecimiento de las plantas, posterior a su enraizamiento, constituye el período más largo en vivero y presenta el mayor porcentaje de pérdidas. Se estima que el estudio e implementación de tecnologías para acortar este proceso y lograr una planta más desarrollada para establecerse en el campo, constituirá un aporte muy significativo para el desarrollo de esta especie en la zona centro norte del país. En este sentido, esta investigación propone evaluar las potencialidades de introducir la micorrización en vivero. En base a los antecendentes entregados, la hipótesis de este estudio considera una premisa biológica que señala que a partir de la inoculación de plantas de arándano con hongos micorríticos en vivero, se genera un mayor crecimiento vegetativo y radical, producto de la simbiosis. Esto se traduciría en un menor período de permanencia de las plantas en el vivero. El objetivo general del estudio es evaluar el efecto de la micorrización en plantas de arándano sobre el desarrollo en vivero. Los objetivos específicos de este estudio son: Determinar si los tipos de hongos utilizados son capaces de formar micorrizas en plantas de arándano micropropagadas y propagadas por estaca en vivero. Determinar el efecto de tres tipos de micorrizas (ericoides, vesículo arbusculares y obtenidas de la rizosfera de una plantación adulta de arándano), en el crecimiento vegetativo de plantas de arándano micropropagadas y propagadas por estaca en vivero. Determinar el efecto de tres tipos de micorrizas, en el crecimiento radical de plantas de arándano micropropagadas y propagadas por estaca en vivero. Determinar la capacidad de infección de las micorrizas evaluadas. Evaluar la relación entre la magnitud de la micorrización y el desarrollo vegetativo y radical de las plantas de arándano. 3. Revisión bibliográfica 3.1 Importancia del cultivo El arándano conocido internacionalmente como “blueberry”, es un frutal que en los últimos años ha logrado posicionarse como un fruto de importancia. Ha contribuido a este desarrollo por lo menos, dos grandes fuerzas. Por una parte las características nutricionales del fruto, rico en vitaminas, minerales, bajas calorías y recientemente descubierta su alta proporción de antioxidantes, todo lo cual le hacen un fruto apetecible, dado los nuevos gustos de los consumidores de mercados altamente exigentes, de preferir alimentos “sanos” y que contribuyan a una mejor salud. Esta imagen de producto “sano” se potencia con la alta proporción de la producción mundial que es generada por frutales en estado silvestre. Finalmente otra característica particular de este fruto que lo hacen único, es su sabor agridulce. En resumen, las características propias del fruto es una fuerza importante que explicaría su expansión en el mercado mundial (Cerda, 2004). 3.1.1 Situación internacional A nivel mundial Estados Unidos es el principal productor, consumidor, exportador e importador de arándanos del mundo y junto con Canadá abarcan el 90% del área productiva total, seguidos de Chile (que fue pionero en el cultivo del arándano en el hemisferio sur), Argentina, Nueva Zelanda, Australia y Sudáfrica. Los principales países productores europeos son: Francia, Holanda, Alemania, Polonia y España (INFOAGRO, 2006). Estados Unidos es un mercado capaz de demandar sobre las 250.000 toneladas anuales. Este mercado de más de 270 millones de habitantes, posee muy arraigada en sus costumbres el consumo de esta fruta. Esto explica que Estados Unidos haya representado el 84,6% de la producción mundial para el año 2001. La importancia de Estados Unidos se ha mantenido similar en la última década, si se considera que el año 1990 representaba el 87% de la producción mundial (Cerda, 2004). Los principales consumidores de este fruto son: Estados Unidos con un consumo del 83 %, Europa con un 14 % y Oriente con un 3%. Respecto a la superficie plantada el hemisferio norte cuenta con 31.145 ha que corresponden al 86% de la superficie mundial. El hemisferio sur posee 5.085 ha que corresponden al 14 % (Vial y Allende, 2005). 3.1.2 Situación nacional El arándano fue introducido a Chile a principio de la década de los ochenta por el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA), ante la necesidad de diversificar la fruticultura de exportación del país y con el propósito de incorporar a la agricultura intensiva zonas que eran ocupadas con cultivos de baja rentabilidad. A partir de 1989, la superficie plantada en Chile registró un rápido incremento orientado a la exportación en fresco hacia Norteamérica. Los buenos resultados económicos obtenidos motivaron a los agricultores a producir esta fruta, iniciando plantaciones en la zona Centro-sur y Sur del país (Buzeta, 1997). A raíz del buen resultado obtenido con el uso de nuevas variedades de menor requerimiento de frío invernal, adaptadas a la oferta climática de la zona centro-norte, se ha generado un creciente interés por realizar nuevas inversiones al norte de la Región Metropolitana, observándose a la fecha plantaciones de reciente data en las localidades de San Felipe, Catemu, Putaendo, Casablanca, Hijuelas, Cabildo, Petorca e Illapel en la IV región (Canales, 2006).* En el Cuadro 1 se presenta la situación de las plantaciones en la zona centro-norte, centro-sur y sur del país: * Cristián Canales Gaete. 2006 Ing. Agr. Profesor área fruticultura. Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Cuadro 1: Situación plantaciones nacionales de arándano (Vial y Allende, 2005). Fuente: Vial y Allende (2005) 3.2 Descripción de la especie El arándano o “blueberry” (Vaccinium corymbosum), es un frutal menor nativo de Norteamérica y considerado dentro del grupo de los “berries”; perteneciente a la familia de las Ericáceas (Buzeta, 1997). Los miembros de esta familia se caracterizan por crecer naturalmente en suelos ácidos y se distribuyen en todo el mundo. Otros miembros de esta familia son los rododendros y azaleas. El arándano pertenece a la subfamilia vacciniadeae, tribu vaccinieae, género vaccinium y subgénero Cyanococcus (cyano=azul y coccus= berry) (Gough, 1994). El género Vaccinium presenta más de 26 especies descritas, sin embargo, sólo tres son consideradas con importancia comercial: Vaccinium angustifolium (arándano bajo o “lowbush”), V. ashei R (ojo de conejo o “rabbiteye”) y V. corymbosum L. (arándano alto o “highbush”) (Muñoz, 1998). El arándano alto, primer cultivar introducido, proviene de una selección del V. corymbosum y V. austral, es una planta tetraploide, que puede alcanzar una altura de hasta 2,5 m. En la actualidad éste es el tipo más cultivado, ya que es el que logra producir la mejor calidad de fruta en cuanto a tamaño y sabor. Posee tallos erectos, no rizomatosos y una raíz fibrosa que no penetra suelos pesados; el período de desarrollo del fruto es corto, en relación con el arándano “ojo de conejo”, alcanzando hasta 90 días desde la floración a la maduración de la fruta, que se produce desde fines de enero a fines de marzo (Buzeta, 1997). El arándano “ojo de conejo”, Vaccinium ashei, es una especie hexaploide, que puede alcanzar alturas de hasta 6 metros, pero con un manejo de poda se mantiene a una altura inferior a 3 metros. Su cultivo ha ganando en popularidad por su tolerancia a pH de suelo más básico, mayor resistencia a la sequía, mayor producción, fruta de mejor conservación en postcosecha y menor requerimiento de horas frío. A diferencia del arándano alto, tiene auto-esterilidad, por lo que es necesario intercalar dos cultivares de floración simultánea para obtener polinización cruzada. El período de desarrollo del fruto varía entre 90 a 120 días, dependiendo de los diversos cultivares mejorados que de esta especie se conocen (Buzeta, 1997 y Muñoz, 1998). Arándano “bajo”, Vaccinium angustifolium, es una especie diploide, silvestre, de tallos rizomatosos; con plantas que van de 15 a 45 cm de alto, de frutos pequeños, pero muy apreciados por la industria conservera por su peculiar aroma y sabor. Crece en latitudes boreales del norte de EE.UU. y del sur de Canadá y el número de variedades es reducido (Buzeta, 1997). 3.3 Botánica Los arándanos son plantas leñosas, perennes y de larga vida (alrededor de 20 años los arándanos arbusto alto y bajo y 30 años los ojo de conejo). Dependiendo de la especie, pueden alcanzar alturas que van desde unos pocos centímetros hasta los 7 m. Aquellos que no alcanzan alturas superiores a 1 m, por lo general forman colonias extensas debido a la habilidad de las raíces rizomatosas de emitir brotes vegetativos. Las especies mayores de 1,5 m, por el contrario, no tienen rizomas, pero la raíz tiene la capacidad de emitir brotes adventicios, por lo que generalmente están desprovistos de un tronco único y mas bien forman coronas de brotes múltiples (Muñoz, 1988). El sistema radical está compuesto de finas raicillas, es superficial, fibroso y de poca extensión. La raíz esta desprovista de pelos radicales, de modo que son las raíces jóvenes las que efectúan la labor de absorción. Estas tienen un diámetro de hasta 75 micrones y contienen hasta tres corridas de células epidermales, sin embargo, la mayoría de estas tiene solo una corrida. Son estas células las que, bajo condiciones naturales, se encuentran invadidas por los hongos micorríticos con los cuales esta especie está comúnmente asociada. Estos hongos pertenecen a las llamadas micorrizas ericoides, que constituyen una categoría especial, tanto desde el punto de vista morfológico como funcional, ya que intervienen principalmente en el metabolismo del nitrógeno y no solamente del fósforo como ocurre con la mayoría del resto de las micorrizas. El hongo más frecuente asociado al arándano cultivado es Hymenoscyphus ericae (=Pezizella ericae) (Muñoz, 1998). En suelos bien aireados, el principal factor que influye en la distribución radical pareciera ser la humedad del suelo. Factores que aumentan o conservan ésta, tales como el “mulch” y la incorporación de materia orgánica, pueden aumentar la distribución radicular generando un mayor crecimiento de las plantas (Muñoz, 1988). Las hojas son simples, se distribuyen en forma alterna en la ramilla, varían entre 1 a 8 cm en el largo y la forma puede ir de ovada a lanceolada. Tienen color verde pálido y en otoño desarrollan una pigmentación rojiza. Posee estomas solamente en el envés de las hojas y se encuentran en densidades de 300 por mm2 (Buzeta, 1997). La flor del arándano está compuesta por un ovario unido al cáliz; tiene entre cuatro a cinco celdas con uno o más óvulos en cada lóculo; el pistilo consiste en un tubo filiforme que termina en un estigma pequeño no modificado. La flor tiene entre ocho a diez estambres insertos en la base de la corola. Florece generalmente en racimos axilares pero también se pueden dar en forma terminal (Buzeta, 1997). Las flores son perfectas y epígenas, están dispuestas en racimos que emergen de yemas simples laterales de ramillas hacia la parte lateral del brote, se diferencian en verano al mismo tiempo que se agrandan, en dirección basipetala (Gil, 2000). La diferenciación se manifiesta por un abultamiento notorio de las yemas, las que se recubren de escamas color café, fácilmente distinguibles de las yemas axilares vegetativas (Muñoz, 1988). En otoño ya son distinguibles las partes florales. La diferenciación del polen y óvulos ocurre al reiniciarse el crecimiento en primavera, lo que toma entre ocho a nueve meses (Gil, 2000). La floración ocurre sobre yemas que se diferencian al inicio del otoño, generalmente cuando se detiene el crecimiento vegetativo, probablemente en respuesta al fotoperíodo (Muñoz, 1988). Normalmente, se forma una inflorescencia por nudo, pero en brotes medianamente gruesos pueden formarse dos. El número de nudos florales en un brote, como el número de flores por inflorescencia, son características de cada variedad (Gil, 2000). El día largo de 16 horas, promueve el crecimiento vegetativo, pero evita el desarrollo de yemas florales, el cual es máximo bajo un fotoperíodo de ocho horas por seis semanas, tanto en arándano alto como bajo y ojo de conejo (Gil, 2000). El fruto corresponde a una baya casi esférica que varia en tamaño desde 0.7 a 1.5 cm de diámetro dependiendo de la variedad; su color va desde azul claro hasta un negro intenso, posee secreciones cerosas que le dan una terminación atractiva. El fruto puede poseer hasta 100 semillitas pequeñas ubicadas al interior del endocarpio. Característica del fruto es su cicatriz, donde comercialmente, se busca que sea pequeña y seca. Además se busca que el fruto sea firme, esto relacionado con el groso de la epidermis (Buzeta, 1997 y Muñoz, 1998). 3.4 Propagación La propagación de esta especie se puede realizar por medio de hijuelos, mediante el enraizamiento de estacas o usando técnicas de micropropagación in vitro (Muñoz, 1988). La propagación de estacas puede ser realizada usando material ya lignificado o estacas leñosas, obtenidas antes de la brotación primaveral con yemas que han cumplido su requisito de frío; o estacas herbáceas, ramillas que se encuentran aun con hojas, obtenidas en el mes de noviembre antes de la inducción de las yemas. Debido a la existencia de hojas este método de propagación debe contar con sistemas que eviten la deshidratación de las estacas (Muñoz, 1988). La propagación por estacas pareciera ser fácil, pero en la práctica tiene una serie de dificultades, que se traducen en una bajo rendimiento en el enraizamiento o en la propagación de enfermedades indeseables para el cultivo. En general las especies ojo de conejo son mas fáciles de enraizar que las de arándano alto (Muñoz, 1988). Las estacas leñosas deben recolectarse justo antes que comience la brotación en primavera y que hallan cumplido su requisito de frío, si se toman antes se deben almacenar a 4-7° C dentro de bolsas plásticas selladas y sin aire, hasta cumplir con su requisito de frío. Las ramillas deben tener un grosor de 5-7 mm y una longitud aproximada de 12 cm con una constitución de tres a cinco yemas. (Muñoz, 1988). Éstas se deben proteger de la luz directa del sol y estar en un ambiente de alta humedad relativa (Gough, 1994). El prolongado período de propagación y crecimiento constituye un aspecto problemático en esta especie. Las estacas enraizadas deben permanecer en la cama de propagación hasta el invierno siguiente, por un período de seis a ocho meses, para luego pasar en una etapa de vivero de uno a dos años antes de su plantación en el terreno definitivo. En general se recomienda utilizar plantas bien desarrolladas de tres años, ya que ellas tienen un crecimiento más rápido en terreno y la sobrevivencia es mayor (Muñoz, 1988). En el caso del cultivo de tejidos, modalidad de propagación ampliamente utilizada en el país, el material vegetal inicial es una yema axilar, la cual es activada al crecimiento mediante los reguladores de crecimiento de un medio nutritivo completo que está contenido en un tubo de ensayo. Después de dos a cuatro meses se obtiene un brote de cuatro a cinco cm de largo, el cual es seccionado en microestacas de una yema y luego transferidos a nuevos tubos de ensayo. Después del tercer repique, estos brotes son transferidos a un medio de cultivo inductor de raíces. Una vez que estas últimas se han obtenido, se procede a transferir el brote a una maceta, mantenida en condiciones de temperatura y humedad controladas, en la cual la plántula deberá permanecer al menos un año antes de ser llevada a terreno definitivo (Sudzuki, 1993). En cuanto a la fertilización en la fase de vivero, Buzeta, (1997), señala que es un manejo indispensable, sobre todo cuando se usan medios inertes como la turba. No obstante, en la actualidad no existen recomendaciones de dosis probadas para satisfacer las necesidades de las plantas en la etapa de enraizamiento y posterior desarrollo en bolsa. Por otra parte Gough (1994), señala que los fertilizantes foliares presentan un gran potencial para fertilizar esta especie. Los sustratos se seleccionan por sus cualidades físicas y sanitarias, corrigiéndose el pH si es necesario. Un buen sustrato de multiplicación debe reunir las siguientes características: una buena porosidad que facilite la evacuación del agua en exceso, buena aireación, una excelente capacidad de retención, ser estable de manera que no comprometa el desarrollo de las raices jóvenes y ,sin duda, que sea irreprochable en el plano sanitario (Boutherin, 1994). Una de las características que afectan la porosidad y aireación de los sustratos es el tamaño y forma de los tipos de partículas que lo componen, así como también, la uniformidad de las mezclas. Por esto, en el caso particular del arándano, se deben evitar sustratos extremadamente finos y tender al uso de sustratos orgánicos como la turba o corteza de pino molida con martillo de molino, así como mezclas de arena homogéneas que no contengan tamaños finos y gruesos que en combinación generan mezclas duras (Soto, 1993). 3.5 Aspectos generales de las micorrizas Existe una región del suelo definida como rizosfera donde se ponen de manifiesto numerosas interacciones entre las raíces de la planta y los microorganismos del suelo, especialmente bacterias y hongos. Muy probablemente, de todas las interacciones entre plantas y microorganismos, la de mayor proyección nutricional sea la que se presenta entre las raíces y los hongos del suelo, en forma de mutualismo que se conoce como micorriza. A diferencia de lo que sucede con la fijación biológica de nitrógeno, donde sólo unas pocas familias, principalmente leguminosas, presentan la asociación simbiótica, se ha observado micorrizas en más del 80% de las especies estudiadas, incluyendo prácticamente todas las plantas de interés agrícola y forestal (Azcon-Bieto y Talon, 2000). El mutualismo supone una relación beneficiosa para los dos organismos implicados, y tanto el hongo como la planta se ven favorecidos por la asociación: el hongo coloniza la raíz de la planta y le proporciona nutrientes minerales y agua que extrae del suelo por medio de su red externa de hifas, mientras que la planta suministra al hongo sustratos energéticos y carbohidratos que elabora a través de la fotosíntesis (Herrera, 2003). Muchas comunidades de árboles no crecerían sin la ayuda de las micorrizas, como sucede en numerosos suelos poco fértiles o en árboles crecidos en terrenos que no son los suyos originarios, como es el caso de árboles europeos introducidos en América, que no crecen hasta que no son inoculados con los hongos tomados de sus suelos originarios (Azcon-Bieto y Talon, 2000). 3.6 Tipos de micorrizas Harley y Smith (1983), clasifican las micorrizas según el tipo y sus características principales estableciendo un paralelo con la denominación clásica de endo y ectomicorrizas. La descripción se presenta en la Cuadro 2. Cuadro 2: Tipos de micorrizas y sus características. Tipo Ectomicorriza Estructura característica Manto de hifas rodeando la raíz; red de Hartig (hifas conectadas de crecimiento Tipo de hongo Planta hospedera (general) Basiodiomicetes, Árboles, arbustos Ascomicetes y de gimnospermas Ficomicetes y Angiospermas. intercelular en el interior de la corteza radical). Ectendomicorriza Puede existir manto aunque no necesariamente; red de Hartig; espirales de hifa en las células de la raíz. Micorriza Manto; red de Hartig; arbutoide espirales de hifas en las (endomicorriza) células de la raíz. Micorriza Manto hifal; red de Hartig; monotropoide haustorio sin ramificar; (endomicorriza) micelio descolorido. Micorriza ericoide Sin manto ni red de Hartig; (endomicorriza) espirales de hifa en las células de la raíz. Micorriza orquidioide (endomicorriza) Micorrizas arbusculares (endomicorriza) Basiodiomicetes Árboles, arbustos y Ascomycetes de Gimnospermas y Angiospermas. Basiodiomicetes Sólo Ericales Basiodiomicetes Sólo Monotropaceas Ascomicetes Sólo Ericales (Basiodiomicetes en algunos casos) Sólo Orquidáceas Sin manto ni red de Hartig; Basidiomicetes espirales de hifas en las células de la raíz; haustorio sin ramificar; micelio descolorido. Sin manto ni red de Hartig; Zigomicetes Árboles, arbustos, espirales de hifas en las gramíneas y células; haustorio ramificado plantas en su extremo (arbúsculo). herbaceas; plantas inferiores (algas y helechos) de los Briofita y Pteridofita 3.7 Descripción micorrizas vesículo arbusculares En cuanto a las estructuras formadas, el tipo de colonización y la cantidad de especies vegetales y fúngicas implicadas, se puede decir que las micorrizas arbusculares son las de mayor importancia y las que más ampliamente se encuentran distribuidas (tanto a nivel geográfico como dentro del reino vegetal) (Herrera, 2003). Se caracterizan porque producen a lo largo de su ciclo de vida unas estructuras conocidas como arbúsculos (en todos los casos) y vesículas (en la mayoría de ellos). Las vesículas son estructuras globosas e irregulares que actúan como órganos de reserva de lípidos. Los arbúsculos son las estructuras responsables de la transferencia bidireccional de nutrientes entre los simbiontes, realizada en la interfase planta-hongo producida a este nivel (Francl, 1993 citado por Herrera, 2003). Vega y Muñoz, (1994) a partir de una prospección de plantas de arándano en la localidad de Entre Lagos X Región de Chile, describen la presencia en forma ocasional de esporas o vesículas intracelulares de diámetro y cantidad variable, que probablemente, correspondan a estructuras propias de micorrizas vesículo-arbusculares que cumplen funciones de almacenamiento o resistencia, por lo que sería esperable encontrarlas con mayor frecuencia en otoño. 3.8 Descripción micorrizas ericoides Las plantas de la familia Ericaceae, se caracterizan por establecer simbiosis con un tipo particular de micorrizas, llamadas micorrizas ericoides, que le confieren a las plantas de esta familia la habilidad de colonizar suelos nutricionalmente pobres y poco evolucionados. Algunas ericáceas cultivadas, como los arándanos, las azaleas y los rododendros, también son capaces de establecer simbiosis micorríticas, lo que les confiere importantes ventajas en cuanto al aprovechamiento de los nutrientes del suelo (Vega y Muñoz, 1994). 3.8.1 Desarrollo de la simbiosis La infección se inicia con la formación de una red poco compacta de hifas sobre la superficie de la raíz, penetrando a través o entre las paredes celulares. La penetración de la pared celular ocurre por una combinación de procesos enzimáticos y presión física, aunque no se forma un apresorio. En este momento se establecen relaciones de compatibilidad y ambos simbiontes muestran una intensa actividad celular (BonfanteFasolo et al., 1979). La hifa infectiva es levemente dilatada, dando origen a la hifa intracelular, la cual es más fina y septada. Una vez dentro de la célula cortical, la hifa prolifera extensivamente y el plasmalema del huésped se invagina envolviendo totalmente al hongo (Bonfante-Fasolo, 1981). La célula huésped parece ejercer algún control sobre la actividad del hongo, ya que no se produce una dispersión lateral a partir de una célula colonizada y cada célula constituye una unidad de infección compuesta por un ordenamiento espiralado o “nudo” de hifas. A su vez, la infección fungal está limitada generalmente a la capa más externa y en ocasiones únicas, de células corticales, y en ningún caso penetra la endodermis (Bonfante-Fasolo, 1981). Dado que en la simbiosis el plasmalema del huésped siempre está rodeado por la hifa, se genera una membrana que desempeña un rol decisivo en la especificidad, establecimiento y control de este tipo de asociación, especialmente en la fase biotrófica de la infección (Bonfante-Fasolo y Martinengo, 1984). El grado de infección del sistema radical es afectado por factores externos que le imprimen una variación estacional, que depende en parte de la formación y crecimiento de nuevas raíces. De éste modo, en primavera la infección es reducida, incrementándose hacia el final del período de crecimiento de la planta. En invierno, se ha observado la presencia de hifas vivas dentro de las células huésped o en células vacías, aunque esto depende más de la condición de perenne o caducifolia de la planta huésped (BonfanteFasolo, 1981). 3.8.2 Aspectos nutricionales Cada tipo de micorriza está característicamente asociado a un grupo específico de condiciones edáficas, donde las diferencias funcionales de los primeros han sido seleccionadas en respuesta a las limitaciones nutricionales particulares del hábitat; de este modo, la infección juega un rol fundamental en el ecosistema (Read, 1983). Las micorrizas ericoides asisten a un amplio espectro de plantas del orden Ericales en la adquisición del nitrógeno. El hábitat de la planta varía considerablemente, pero la mayoría de los suelos está caracterizado como bajo en nutrientes, particularmente de nitrógeno disponible. Muchos hongos incluyendo los que forman micorrizas ericoides, son aptos para asimilar tanto el amonio como el nitrato obtenidos desde la solución del suelo. Experimentos in vitro han mostrado que el número de aminoácidos, péptidos y proteínas pueden ser utilizadas por el hongo ericoide como fuentes de nitrógeno (Peterson et al., 2004). Las interacciones dentro del ecosistema que permiten el predominio de vegetación con micorrizas ericoides, están restringidas en forma casi exclusiva a suelos en que el grueso de los nutrientes se encuentran en forma orgánica, con muy baja disponibilidad para la planta. En estas condiciones, los tejidos del vegetal poseen una baja concentración de N y P, y un bajo contenido de proteinas. El carbono es fijado en metabolitos secundarios, tales como ácidos alifáticos y polifenólicos, como también en lignina, acumulándose de preferencia en las hojas. La materia orgánica producida por los residuos vegetales posee pocos nutrientes orgánicos e inorgánicos fácilmente solubles; el N se encuentra precipitado como complejos estables de polifenol proteinas, existe una alta relación C:N y el pH es bajo. Stribley y Read (1980), concluyen que las formas orgánicas simples de N y P pueden ser aprovechadas por las plantas ericaceas cuando poseen una condición micorrizada (Read, 1983). Hymenoscifus ericae, el endófito más común en el orden de las ericales, produce una proteinaza extracelular con muy bajo pH óptimo (pH 2,2). Además el hongo es capaz de degradar compuestos fenólicos solubles y lignina. De interés particular es el hecho que al hongo ericoide micorrizal, le es posible utilizar el polímero quitina como su única fuente de nitrógeno. Una importante fuente de quitina para este hongo, podría ser la biomasa de las paredes de hifas de micorrizas necróticas, hifas de otro hongo y restos de insecto en el suelo (Peterson et al., 2004). En general, las micorrizas ericoides tienen un efecto significativo en el aporte de N, P y S, no muestran en el caso del arándano variaciones importantes en el aporte de otros elementos, dado que las concentraciones que la planta posee se mantienen dentro de los rangos de suficiencia para esta especie frutal (Reich et al., 1982). 3.8.3 Efecto de la micorrización en el crecimiento y rendimiento de las plantas Existen datos experimentales que confirman que en general las micorrizas ericoides promueven el crecimiento de la planta huésped (Powel y Bates, 1981; Powel, 1982; Read, 1983;1987), aunque el beneficio en el caso de plántulas de arándano, depende del nivel de fertilidad de la mezcla de propagación. En cuanto a plantas de arándano creciendo en campo, aquellas distribuidas en el rango de suelos nativos para estas especies, es normal que se encuentren casi siempre en simbiosis (Reich et al., 1982), condición que no ocurre en lugares plantados con estos frutales y que con anterioridad tenían cultivos hortícolas con aplicaciones de funguicidas, (Boyer et al., 1982), o en aquellos en que nunca han existido plantas ericaceas, (Powel y Bates, 1981). En este último caso, la inoculación con micorrizas ericoides incrementa significativamente el rendimiento de fruta, lo que se traduce a su vez en un mayor ingreso por hectárea, como es el caso de Nueva Zelanda que fue reportado por Read (1987). Una situación diferente sucede con la etapa de vivero de las plantas, la cual se realiza en su gran mayoría con sustratos inertes y esterilizados, donde la presencia de microorganismos benéficos se elimina o reduce considerablemente. Un estudio realizado en Nueva Zelanda, reveló que al usar sustrato esterilizado en el vivero no se produjo colonización de raíces por micorrizas durante los 24 meses que duró esta etapa de crecimiento (Powel y Bates, 1981). Sin embargo, Reich et al. (1982) indica que no siempre las especies de Vaccinium responden favorablemente a la colonización micorrítica, situación que puede estar dada por varios factores en los que se debe poner atención, entre ellos, que las respuestas a la micorrización son más significativas en campo que en condiciones de invernadero y que el grado de micorrización puede decrecer al aumentar los niveles de fertilización. 3.8.4 Otros efectos de la micorrización Se ha observado que la simbiosis puede otorgar cierta protección a la planta frente a hongos patógenos. Esta protección frente a patógenos se da principalmente porque los hongos micorriticos se encuentran ocupando células de la raiz y cuando el hongo patógeno quiere ingresar a esta no encuentra un sitio disponible. Esto en el caso de raíces altamente micorrizadas.(Vega, 2005)* Vegh et al (1979) reporta que la incidencia de Phytophtora sp. es menor en plantas micorrizadas. Por otra parte, la micorrizas ericoides proporcionan una resistencia a metales pesados en plantas de los géneros Calluna, Vaccinium y Rhododendron utilizando altas concentraciones de Cu y Zn. La resistencia al Cu, Zn y Al, permiten a la planta poder colonizar suelos derivados de residuos de la minería proporcionando una gran ventaja ecológica a la planta micorrizada (Read, 1983). El mecanismo de esta tolerancia está ubicado a nivel radicular, ya que se sugiere que la matriz interfacial de la simbiosis proporciona abundantes sitios de adsorción para iones di y trivalentes, en cambio para otros, incrementa la permeabilidad (Read, 1983). 4. Materiales y métodos. 4.1 Lugar y época del experimento * Alexis R. Vega Morend. 2005. Ing. Agr. Mg. Sc. Ph. D. Profesor Área Frutales Menores y Ecofisiología. Facultad de Agronomía. Universidad Mayor. El ensayo se realizó en la temporada primavera-verano de 2005-2006, desde octubre del 2005 hasta el mes de mayo del 2006. Se desarrolló en un invernadero ubicado en la Estación Experimental La Palma de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, ubicada en La Palma s/n, Quillota, Provincia de Quillota, V región, Chile. 4.2 Materiales e instrumentos • 60 plantas de arándano (Var. O’Neal) micropropagadas. • 60 plantas de arándano (Var. O’Neal) propagadas por estaca. • 120 bolsas de polietileno negras (volumen de 3 l). • 360 litros de sustrato (mezcla de acícula de pino, aserrín y suelo). • Parrillas acondicionadas para ensayos con micorrizas. • Inóculo de micorrizas de campo (suelo rizosférico), micorrizas Vesículo Arbusculares (VA) y micorrizas Ericoides. • Data Loger para medir temperatura. • Regla y pie de metro. 4.3 Metodología del ensayo La técnica consistió en inocular plantas de arándano en sus primeras etapas de crecimiento con tres tipos de micorrizas. Los hongos micorríticos colonizarán en mayor medida las raíces finas de la planta, por esto es necesario que la mayoría de las raíces estén en tal estado. (Vega, 2005)*. Para lograr este objetivo, se utilizaron plantas de seis meses inoculándolas en el momento del transplante desde contenedores para las plantas micropropagadas o desde las camas calientes para las propagadas por estaca a la bolsa definitiva. Se trabajó con la variedad O’ Neal, que comercialmente se considera como una de las más promisorias para las condiciones edafoclimáticas de la región centro norte de Chile, dado su menor requerimiento de horas frío. * Alexis R. Vega Morend. 2005. Ing. Agr. Mg. Sc. Ph. D. Profesor Área Frutales Menores y Ecofisiología. Facultad de Agronomía. Universidad Mayor. Se utilizaron tres fuentes de inóculo (micorriza ericoide, micorriza vesículo arbuscular y provenientes de la rizósfera de una plantación adulta de arándano), y dos tipos de plantas (micropropagadas y propagadas por estaca). Para efectuar la inoculación con micorrizas ericoides se utilizaron 20 ml de inóculo por planta. Este quedó en íntimo contacto con las raíces de la planta, efectuándose en el momento del transplante a la bolsa definitiva de 3 litros. El inóculo que se utilizó es distribuido en Chile por la empresa BIOTRITÓN S.A y se identifica comercialmente como MYCOSYM TRI-TON (Hymenoscyfus ericae). El segundo tipo de inóculo fue del tipo micorrizas vesículo arbusculares nativas, aisladas de muestras de suelo de la V región de Chile. Este fue aportado por el laboratorio de micorrizas de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Se planteó esta alternativa porque con frecuencia las micorrizas vesículo arbusculares aparecen asociadas a las ericaceas en unión con hongos ericoides y se estima que también juegan un papel significativo en la simbiosis. Se utilizaron 20 ml de inóculo por planta. La tercera fuente de inóculo es la utilizada popularmente en el campo. Consistió en obtener suelo desde la rizosfera de una plantación adulta de arándano para posteriormente inocular las plantas nuevas. Para estos efectos, se obtuvo desde un huerto de arándano de ocho años (variedad O’ Neal), de la localidad de Cabildo V región. El inóculo se extrajo desde la rizosfera de las plantas en tres puntos equidistantes, a una profundidad entre 5 a 20 cm. Se utilizaron 20 ml de este inóculo por planta. En este caso, se caracterizó el tipo de micorrizas que contenía la muestra mediante la tinción de raíces y la observación en microscopio. De esta manera, se determinó que las raíces presentaban principalmente colonización de hongos micorriticos del tipo ericoide. Se desconocía el estado infectivo del hongo y la presencia de inóculo en el sustrato que está con las raíces. El sustrato que se utilizó para el llenado de las bolsas definitivas fue una mezcla de aserrín (48 %), acícula de pino (48 %) y suelo (4 %). Este sustrato se sometió a una triple vaporización para eliminar cualquier tipo de inóculo externo al ensayo, ya sea un organismo saprófito, patógeno o algún tipo de hongo que forme micorriza. La vaporización se realizó tres veces en días sucesivos. El sustrato alcanzó una temperatura de 100º C por 1,5 h. Después de la esterilización, se realizó un lavado con agua acidificada a pH 2 (con H2SO4) para lavar el exceso de fósforo y nitrógeno liberado por el proceso de vaporización. (Vega, 2005)* Las plantas se dispusieron en un invernadero de estructura de madera y cobertura de polietileno de 32 m de largo y 7 m de ancho. Se mantuvieron sobre mesas con rejilla de metal y para eliminar las posibilidades de contaminación por el agua de riego separadas a 50 cm. Se regaron periódicamente con regadera manual en base a la humedad del sustrato, llegando en los meses de máxima demanda a realizarse tres riegos semanales (diciembre y enero). Fueron fertilizadas con mínimas dosis de nutrientes para no enmascarar el efecto de las micorrizas. Esta se inició un mes después del transplante con 0,1 g/l de urea, incorporándose 300 ml de la solución por planta cada 15 días. Desde el segundo mes en adelante, las plantas recibieron 1 g/l de urea, incorporándose 500 ml por planta cada 10 días. Se instaló un registrador para medir temperatura dentro del invernadero, obteniendo un registro de las temperaturas máximas y mínimas diarias. Con estos datos se realizaron curvas de grados días acumulados, para establecer un paralelo con las curvas de crecimiento. 4.4 Variables cuantificadas Se midieron parámetros de crecimiento vegetativo cada 15 días. El crecimiento radicular fue cuantificado una vez terminado el ensayo mediante un análisis destructivo de las muestras. En ese momento, se identificó el tipo de micorriza presente y se cuantifico la infección micorrítica. * Alexis R. Vega Morend. Ing. Agr. Mg. Sc. Ph. D. Profesor Área Frutales Menores y Ecofisiología. Facultad de Agronomía. Universidad Mayor. 4.4.1 Crecimiento vegetativo Estos parámetros fueron determinados cada 15 días, partiendo con una medición al momento del transplante y la inoculación con micorrizas. Los parámetros que se midieron fueron: largo de brotes de cada planta incluyendo secundarios generados en la misma temporada desde la base, diámetro de brotes incluyendo secundarios generados en la misma temporada medidos a 2 cm desde la base. También se determinó el número de anticipados, es decir, brotes secundarios generados la misma temporada de crecimiento y número de rebrotes desde la base de la planta (corona). 4.4.2 Crecimiento radical Para cuantificar el crecimiento radical, se realizó una evaluación destructiva al final del ensayo donde se midió el peso seco de raíces. Para determinar esta variable, se utilizaron cinco plantas por tratamiento. 4.4.3 Medición del grado de infección micorrítica Para determinar el tipo de micorriza y cuantificar la micorrización, las raíces fueron teñidas mediante una combinación de las técnicas descritas por Kormanik et al. (1980) y Boyer et al. (1982); modificadas por Vega y Muñoz, (1994). Para ello se lavaron las raices para eliminar el sustrato adherido. Luego se cortaron en trozos de 1 cm de largo. Estos fragmentos se dispusieron en tubos de ensayo donde se aplicó en primer termino KOH (2.5%) por un día a 17ºC. Pasado este tiempo se enjuagaron tres veces en agua destilada. Luego se cubrieron con H2O2 durante 15 minutos a 17ºC. Posteriormente se enjuagaron en agua destilada, y posteriormente se cubrieron con HCL (1%) por un lapso de un día a 17ºC. Los fragmentos de raices se enjuagaron tres veces en agua destilada y luego se cubrieron con azul de tripan por un lapso de un día a 17ºC. Finalmente las raices se enjuagaron una vez en agua destilada y se cubrieron con lactoglicerina (50% glicerina, 25% de ácido láctico y 25% agua destilada) para preservarlas. 4.4.3.1 Porcentaje de infección micorritica Los análisis correspondientes a los hongos formadores de micorrizas : ericoides y arbusculares se realizaron en el Laboratorio de Micorrizas de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. El porcentaje de infección micorrítica se determinó por medio de la metodología descrita por Vega y Muñoz (1994), utilizando la técnica del transecto lineal. Esta consistió en distribuir aproximadamente 1,5 g de raíces teñidas en una placa Petri de 8 cm de diámetro, donde se observaron al microscopio (100x) 100 intersecciones entre la cruz central del ocular con las raíces, determinándose si en dichas intersecciones existía o no infección. La placa Petri fue recorrida en líneas rectas paralelas, con una separación de medio campo de observación. Se realizó tres veces por muestra reordenando la disposición de las raíces antes de cada recuento para que la medición fuera más representativa y con un menor error. 4.4.4 Número de esporas en 100 g de suelo seco para micorrizas vesiculo arbusculares Esta variable se determinó para los tratamientos con micorrizas vesiculo arbusculares y con micorrizas provenientes de una plantación adulta de arándanos, debido a que se espera que en estos tratamientos se encuentren dichas estructuras. Para la determinación del número de esporas, se siguió el método descrito por Gerdeman y Nicolson (1963). Para ello, se tomó una muestra representativa de 50 g de suelo proveniente de las plantas anteriormente seleccionadas. Este suelo fue depositado en un jarro al cual se agregó agua y se procedió a su agitación. Luego de algunos minutos, el agua mezclada con el sustrato fue vaciada en tamices de 425 µm, 106 µm y 53 µm. Lo que quedó en el tamiz de menor diámetro, se vació en tubos de centrifugación a los cuales se les agregó 20 cc de sacarosa y centrifugándolos a 3000 rpm. Luego de cinco minutos, fueron sacados y se extrajo la capa oleosa que quedó lavando el tamiz de 53 µm. Luego se depositó en una placa Doncaster y se procedió al conteo de esporas bajo la lupa. Paralelamente, se tomó una muestra de 10 g de suelo, se pesó y se secó en la estufa por 24 hr a 105ºC. Posteriormente , se sacó y se volvió a pesar para obtener el peso de suelo seco. Este valor se dividió por 10 y se obtuvo un factor, que al multiplicarlo por el número de esporas, entregó el número de esporas presentes en 100 g de suelo seco. 4.5 Diseño estadístico Se utilizó un diseño estadístico de bloques completamente al azar (BCA). La variable bloqueada fue la temperatura ya que fue la que mostró las mayores variaciones a medida que las plantas se alejaban de la ventana del invernadero. Se dispusieron cinco bloques y la unidad experimental fue el promedio de tres plantas de arándano variedad O’Neal en bolsa de polietileno negras con capacidad para 3 l. El diseño del experimento se presenta en el Anexo 1. Los tratamientos se obtuvieron de la combinatoria de los factores de variación. Estos fueron el tipo de micorriza utilizado en cuatro niveles (micorriza ericoide, vesículo arbuscular, obtenidas de la rizósfera de una plantación adulta de arándano y sin micorriza) y el tipo de planta con dos niveles (micropropagada y propagada por estaca). Para llevar a cabo cualquier análisis de varianza, es necesario que la información bajo análisis cumpla las suposiciones de normalidad, homogeneidad e independencia para garantizar las inferencias, haciéndolas confiables y significativas, pues los estadísticos definidos están basados en la distribución normal. Para efectos de este estudio, se utilizó el test de Shapiro Wilks para verificar la normalidad de los datos y la prueba de Hartley para la homogeneidad, las que se detallan en anexo 2. La independencia estuvo garantizada por las condiciones del experimento (plantas en bolsa, dispuestas en parrillas acondicionadas para ensayos con micorrizas, contemplando las distancias apropiadas para que no existiera contaminación cruzada). Las comparaciones múltiples de medias realizadas fueron las de Tuckey, pues este test se adecuó a las condiciones del diseño en estudio al ser un diseño balanceado (igual número de réplicas), este test se utiliza para comparar las discrepancias entre las medias y poder concluir (Douglas y Montgomery, 2002). 5. Resultados y discusión 5.1 Largo de brotes A continuación, se presentan los resultados para la variable largo de brotes. (Cuadro 3). Cuadro 3: Longitud (cm) de brotes arándano, inoculados con micorrizas. TRATAMIENTO MEDIA LARGO BROTES GRUPOS (cm) HOMOGENEOS Estaca + M. ericoide 356.8 a Estaca testigo 363.73 ab Micropropagada + M. vesículo arbuscular 371.93 ab Estaca + M. suelo rizosférico Estaca + M. vesículo arbuscular Micropropagada + M. suelo rizosférico Micropropagada testigo Micropropagada + M. ericoide 373.60 392.40 415.87 422.67 452.33 ab ab ab ab b Tukey 95% confianza. Letras distintas indican diferencias significativas. En la Cuadro 3, se observa que las diferencias entre los tratamientos se dieron solamente entre las plantas micropropagadas con micorriza ericoide y las plantas propagadas por estaca con la misma micorriza. Las primeras obtuvieron el mayor largo de brotes (sumatoria de todos los brotes de la planta) y las segundas tuvieron el menor desarrollo para esta variable. Para el resto de los tratamiento no se observaron diferencias. Algunos estudios han demostrado un incremento en el crecimiento de brotes en plantas ericaceas inoculadas con micorriza ericoide cuando han crecido in vitro, pero, al situar las plantas en invernadero, luego del transplante, los beneficios obtenidos por esto no causan diferencia (Starrett et al., 2002). Starrett (2003), al trabajar con plantas micropropagadas de arándano (variedad Bleucrop) en vivero, no encontró diferencias en el crecimiento de brotes entre plantas inoculadas con micorriza ericoide respecto a las plantas no inoculadas. La falta de respuesta en el crecimiento en plantas colonizadas por micorrizas ericoides es atribuida al hecho de que si los nutrientes adecuados están presentes, los beneficios de la micorrización pueden no ser evidentes enmascarando su efecto. Powell y Bagyaraj (1984), utilizando estacas de madera dura de arándano (variedades Dixi y Stanley) siguiendo la inoculación con micorrizas ericoides (5 mg/planta), demuestran que estas no tienen un efecto significativo en el crecimiento en vivero. Este hecho es atribuido a que estas estacas al tener una alta cantidad de reservas de carbohidratos no son tan dependientes de la micorrización para su crecimiento. Los mismos autores al realizar ensayos con estacas de madera dura con la variedad Jersey inoculadas con micorriza ericoide (50 mg/planta), encuentran un efecto adverso el crecimiento del largo del brote respecto a los controles. Este hecho es posiblemente causado debido a que niveles supraóptimos de inóculo pueden tener efectos patogénicos. La micorriza ericoide al ser específica de la familia Ericaceae tiene efecto sobre el crecimiento a diferencia de las micorrizas vesículo arbusculares. Éstas últimas se han encontrado asociadas a estas plantas aunque su incidencia en el crecimiento no es significativo. A continuación, se presenta la Figura 1 donde se muestra la diferencia a nivel visual entre las plantas micropropagadas y propagadas por estaca con micorriza ericoide. Figura 1: Planta de arándano micropropagada con micorriza ericoide v/s planta de arándano propagada por estaca con micorriza ericoide. 5.2 Diámetro de brotes En la Cuadro 4, se presentan los resultados para la variable diámetro de brotes medidos a 2 cm desde la base de las plantas de arándano. Cuadro 4: Diámetro (cm) de brotes de arándano, inoculados con micorrizas. TRATAMIENTO Micropropagada + M. suelo rizosférico Estaca + M. ericoide Estaca + M. suelo rizosférico Micropropagada + M. vesículo arbuscular Estaca testigo Micropropagada testigo Estaca + M. vesículo arbuscular Micropropagada + M. ericoide MEDIA DIÁMETRO BROTES (mm) 34.35 35.91 35.92 37.06 37.09 38.72 39.31 43.24 Tukey 95% confianza. Letras distintas indican diferencias significativas. GRUPOS HOMOGENEOS a a a ab ab ab ab b El efecto de las micorrizas en el desarrollo del diámetro de las plantas se da entre las plantas micropropagadas con micorriza ericoide y las plantas propagadas por estaca con la misma micorriza. Este es el mismo efecto que se dio para la variable largo, aunque en este caso, además se diferencian de los tratamientos de las plantas con micorriza proveniente del suelo rizosférico de una plantación adulta de arándano (micropropagadas y propagadas por estaca). Cuando se aplican micorrizas provenientes de la rizósfera de una plantación adulta de arándano, independiente del tipo de plantas que se utilice, presentan un menor desarrollo comparadas con las plantas micropropagada con micorriza ericoide. Este efecto puede ser atribuido a diversos factores y aunque se conoce que este inóculo presenta principalmente infección micorritica del tipo ericoide en las raíces, se desconoce si realmente las micorrizas están activas para la infección, como también el contenido micorrizal del sustrato que se extrajo. Por otra parte, podría contener algún organismo patógeno que pudiera reducir el desarrollo de las plantas inoculadas. Powell y Bagyaraj, (1984) demuestran que al utilizar un inóculo obtenido desde la rizósfera de plantas de arándano locales (Nueva Zelanda), logran un mayor desarrollo de las plantas respecto a un inóculo de raza pura de Pessizella ericae obtenido en el Reino Unido. Sin embargo, plantean la existencia de problemas prácticos al utilizar este tipo de inoculo, ya que existe la posibilidad de que puedan alojar algún patógeno. Es por esto que sugieren aislar las razas Neocelandesas de hongo ericoide micorrizal y testearlas para ver la respuesta simbiótica con el arándano. En estudios no publicados, los autores han aislado estos hongos probando ser más efectivas que Pessizela ericae en pruebas de campo y vivero. En la Figura 2, se muestra la evolución del crecimiento cuantificado para el diámetro de los brotes. Los valores corresponden a la sumatoria de los diámetros de todos los brotes de la planta medida, incluyendo secundarios. Además, se presenta una curva de acumulación de días grado, para ser comparada con las curvas de crecimiento. Testigo micropropagada Testigo estaca 1400 1000 800 25 20 600 15 10 400 200 5 0 Dias grado acumulados 1200 35 30 Micropropagada vesículo arbuscular Estaca vesículo arbuscular Micropropagada eicoide Estaca ericoide Micropropagada suelo rizosférico Estaca suelo rizosférico Dias grado 15-Abr 01-Abr 15-Mar 01-Mar 15-Feb 01-Feb 17-Ene 02-Ene 17-Dic 01-Dic 0 17-Nov mm de brotes de arándano 45 40 Fecha Figura 2: Evolución del crecimiento en diámetro de brotes de las plantas de arándano y acumulación de días grado durante la temporada de crecimiento. Durante el primer mes, el aumento del diámetro de los brotes fue prácticamente nulo. Esta situación fue provocada por el estrés de transplante, período en que las plantas no evidenciaron crecimiento y se visualizaron afectadas negativamente (decaídas). Este factor fue más significativo en las plantas propagadas por estaca debido a que se transplantaron a raíz desnuda perdiendo raíces en el proceso. Las plantas micropropagadas, al estar contenida en recipientes con sustrato (speedling), fueron menos afectadas por éste factor. A partir de la segunda quincena de enero, cuando las plantas acumularon 581 días grado y pasaron dos meses desde la inoculación y transplante simultáneo, el crecimiento evidenció ser más acelerado sin diferencias significativas entre los tratamientos. Esta situación se mantuvo hasta el 1º de marzo, donde las plantas aumentaron la tasa de crecimiento, para continuar así por un mes. El momento de inicio de este fenómeno fue cuando las plantas acumularon 906 días grado. El crecimiento tendió a estabilizarse sin que disminuyera la tasa de acumulación de días grado desde el 1º de abril en adelante. Esto sugiere que la disminución del crecimiento estuvo asociada al fotoperíodo más que a la acumulación de días grado. Las plantas acumularon un total de 1267 días grado en toda la temporada de crecimiento medido hasta el 15 de abril de 2006. Ademas las plantas hacia fines de la temporada acumulan reservas y cesan el crecimiento visible. La tasa de crecimiento de brotes decae y, finalmente cesa por fenómenos correlativos, tales como competencias e inhibiciones relacionadas con hojas, engrosamiento del tallo, nuevos brotes anticipados, nuevos tejidos de ramas, crecimiento de raíces y fruta y por condiciones ambientales desfavorables como baja de temperatura y acortamiento de los días. El fotoperíodo, la longitud del día y calidad de la luz, afecta el crecimiento de brotes. Las especies frutales son de día largo. En condiciones de alto vigor el cese del crecimiento puede ser tarde en otoño. El arándano puede tener hasta cinco flujos en una temporada por aborto de la yema terminal o “punta negra” (Gil, 2000). 5.3 Rebrotes Debido al hábito de crecimiento de las plantas de arándano, que se caracteriza por emitir brotes desde una corona generando los renuevos para cada temporada, estos cobran gran importancia y son un parámetro de calidad a la hora de elegir una planta. Se presentan los resultados para la variable rebrotes desde la corona en la Cuadro 5. Cuadro 5: Rebrotes desde la corona en plantas de arándano, inoculadas con micorrizas. TRATAMIENTO Estaca + M. ericoide Estaca + M. suelo rizosférico Estaca + M. vesículo arbuscular Estaca testigo Micropropagada + M. suelo rizosférico Micropropagada +M. vesículo arbuscular Micropropagada testigo Micropropagada + M. ericoide MEDIA REBROTES (Nº) 1.6 1.8 2 2.4 2.4 2.8 3.4 4 GRUPOS HOMOGENEOS a a ab ab ab abc bc c Tukey 95% confianza. Letras distintas indican diferencias significativas. Las plantas micropropagadas presentaron mayor número de rebrotes que las plantas propagadas por estaca. Por otra parte, las plantas micropropagadas inoculadas con micorrizas ericoides aumentaron el número de rebrotes en comparación con las plantas micropropagadas con inóculo de micorrizas provenientes de suelo rizosférico. Respecto a plantas propagadas por estaca, la emisión de rebrotes fue menor cuando se utilizaron los inóculos de micorrizas ericoides y suelo rizosférico. Cuando el hongo ingresa a la raíz, en un primer momento, puede retrasar el crecimiento ya que genera un gasto de energía, posteriormente manifiesta el beneficio de la simbiosis. En la Figura 3, se observan los rebrotes de las plantas micropropagadas con micorrizas ericoide. Figura 3: Rebrotes desde la corona en planta de arándano micropropagadas, inoculadas con micorrizas ericoides. 5.4 Anticipados A continuación, se presentan los resultados para la variable número de anticipados. (Cuadro 6). Cuadro 6: Número de anticipados en plantas de arándano, inoculadas con micorrizas. TRATAMIENTO Estaca testigo Estaca + M. vesículo arbuscular Estaca + M. ericoide MEDIA ANTICIPADOS (Nº) 6.2 6.4 7.6 GRUPOS HOMOGENEOS a ab ab Estaca + M. suelo rizosférico Micropropagada + M. vesículo arbuscular Micropropagada + M. suelo rizosférico Micropropagada testigo Micropropagada + M. ericoide 7.8 7.8 9.8 10.4 10.6 ab ab ab ab b Tukey 95% confianza. Letras distintas indican diferencias significativas. Los anticipados son brotes secundarios generados en la misma temporada en la que el brote primario ha crecido. Son un índice del vigor de las plantas, emitiéndose en el segundo “flush” de crecimiento vegetativo y acompañándose de rebrotes desde la corona. Las plantas micropropagadas siempre presentaron un número mayor de anticipados que las plantas propagadas por estaca. La diferencia en el número de anticipados se dio principalmente entre las plantas micropropagadas con inóculo de micorriza ericoide y las plantas testigo propagadas por estaca, siendo las primeras las que los presentaron en mayor número. Sin embargo, no existe efecto de inocular con micorriza ericoide respecto a las testigo en plantas micropropagadas. En la Figura 4, se presenta el comportamiento de los anticipados en la temporada de crecimiento y la curva de acumulación de días grado para visualizar su relación con la emisión de estos brotes. 1400 10 1200 1000 8 800 6 600 4 400 01-04-2006 15-03-2006 0 01-03-2006 0 15-02-2006 200 01-02-2006 2 Testigo micropropagada Dias grado acumulados 12 17-01-2006 Nºanticipados por planta de arándano Micropropagada ericoide Testigo estaca Micropropagada vesículo arbuscular Estaca vesículo arbuscular Estaca ericoide Micropropagada suelo rizosférico Estaca suelo rizosférico Días grado Fecha Figura 4: Emisión de anticipados durante la temporada de crecimiento en plantas de arándano inoculadas con micorrizas. Las plantas comenzaron a emitir anticipados desde el 15 de febrero de 2006 cuando las plantas habían acumulado 789 días grado. Además, se pudo observar el segundo “flush” vegetativo. Las plantas continuaron emitiendo brotes secundarios por 15 días en forma acelerada. Si existe vigor en el brote, las yemas laterales que se encuentran alejadas del ápice brotan anticipadamente en la misma temporada de crecimiento del brote primario. Los brotes anticipados a su vez, se comportan como el primario y, con gran vigor, generan anticipados de segundo orden y así, sucesivamente, hasta un grado cuaternario. Esto ha sido aprovechado en la formación de árboles recién plantados (Gil, 2000). En la Figura 5, se puede observar el crecimiento alcanzado por las plantas micropropagadas inoculadas con micorrizas ericoides respecto a la emisión de anticipados. Figura 5: Disposición de anticipados en el brote de la temporada de las plantas de arándano micropropagadas con micorriza ericoide. La emisión de anticipados de las plantas micropropagadas con micorriza ericoide fue mayor respecto a otros tratamientos emitiendo anticipados de mayor longitud. Otra característica observable fue la gran cantidad de anticipados en las plantas llegando a tener hasta seis anticipados por brote y un total de 22 en algunas plantas. Una planta con anticipados refleja que tuvo un desarrollo sostenido durante la temporada de crecimiento. Esta diferencia se debe a que la simbiosis generada con esta inoculación beneficia a la planta en cuanto a su capacidad para absorver iones no disponibles sin infección micorrítica. 5.5 Peso seco de raíces A continuación, se presentan los resultados para la variable peso seco de raíces. (Cuadros 7) Cuadro 7: Peso seco de raíces de plantas de arándano, inoculadas con micorrizas. TRATAMIENTO Estaca + M. suelo rizosférico Estaca testigo Micropropagada + M. suelo rizosférico Micropropagada testigo Estaca + M. vesículo arbuscular Estaca + M. ericoide Micropropagada + M. vesículo arbuscular Micropropagada + M. ericoide MEDIA PESO SECO RAÍCES (g) 24.88 26.53 27.14 28.57 29.56 30.15 30.92 35.82 GRUPOS HOMOGENEOS a a ab ab ab ab ab b Tukey 95% confianza. Letras distintas indican diferencias significativas. Las diferencias entre los tratamientos se dieron entre las plantas micropropagadas con micorriza ericoide y las plantas propagadas por estaca con micorriza de suelo rizosférico y testigo. Las primeras presentaron el mayor peso. Sin embargo, las plantas micropropagadas con micorrizas ericoides fueron similares a las plantas micropropagadas con micorriza de suelo rizosférico y testigo. Esto nos indica que el principal factor que influyó en el desarrollo del peso de raíz fue el tipo de plantas más que el tipo de micorriza inoculado. En un ensayo donde se enraizaron y establecieron plantas de arándano de las variedades Northland y Jersey con dos tipos de micorrizas ericoides (Pezizella ericae Read y Oidiodendron grisseum Robak), se pudo visualizar que estas disminuyeron el crecimiento del brote sin afectar las raíces. Por otra parte, cuando la inoculación se realizó con selecciones indígenas de micorrizas ericoides (Abb5 y Abb 15), el desarrollo de la raíz fue reducido sin efecto en los brotes. Lareau, (1985). Las plantas que tuvieron menor desarrollo del peso de raíz fueron las propagadas por estaca con micorriza proveniente de suelo rizosférico y testigo, respecto a las plantas micropropagadas con micorriza ericoide. Las plantas propagadas por estaca tuvieron un estrés de transplante mayor debido a la pérdida de raíces en este proceso. Si a esto se le agrega un inóculo de micorrizas provenientes de la rizosfera de una plantación adulta de arándano, donde la posibilidad de transmitir alguna enfermedad a las raíces es muy elevada tratándose de la misma especie y hasta de la misma variedad, la hace una técnica muy riesgosa para la producción comercial de plantas restándole confianza a los compradores a la hora de elegir estas plantas. A continuación se presenta la Figura 6, donde se visualiza la diferencia en el desarrollo radicular entre las plantas micropropagadas con micorriza ericoide y las plantas propagadas por estaca con micorrizas de suelo rizosférico. Figura 6: Raíces de planta de arándano micropropagada con micorriza ericoide v/s planta propagada por estaca con micorriza proveniente de suelo rizosférico. 5.6 Porcentaje de infección micorrítica A continuación se presentan los resultados para la variable porcentaje de infección micorrítica (Cuadro 8). Cuadro 8: Porcentaje de infección micorrítica en raíces de plantas de arándano, inoculadas con micorrizas. TRATAMIENTO MEDIA % GRUPOS Estaca testigo Micropropagada + M. ericoide Micropropagada + M. vesículo arbuscular Estaca + M. ericoide Micropropagadas testigo Micropropagadas + M. suelo rizosférico Estaca + M. suelo rizosférico Estaca + M. vesículo arbuscular COLONIZACIÓN 42.6 52.2 56.6 60.6 62 72 78.6 81.2 HOMOGENEOS a ab abc abc abc bc bc c Tukey 95% confianza. Letras distintas indican diferencias significativas. A través de esta variable, se logró cuantificar la micorrización, identificar el tipo de micorriza presente y establecer diferencias. Para los tratamientos inoculados con micorrizas vesículo arbusculares, la mayor parte de la colonización correspondió a este tipo de micorriza detectándose en menor medida infección micorrizal del tipo ericoide. En cambio, la infección para el resto de los tratamientos correspondió principalmente a micorrizas del tipo ericoide. En los tratamientos inoculados con suelo rizosférico, la infección principal fue de micorrizas ericoides, aunque se detectaron vesículas y arbúsculos de micorrizas vesículo arbusculares. Las plantas testigo fueron principalmente colonizadas por micorrizas ericoides. Esto muestra que aunque se tomaron todas las medidas para eliminar la presencia de inóculos externos, igualmente presentaron colonización de las raíces. Las principales causas atribuibles a la presencia de hongos micorríticos en estos tratamientos son el sustrato de la cama de propagación para las plantas propagadas por estaca, y el sustrato de los contenedores para las plantas micropropagadas. Estos son sustrato esterilizados, pero el hongo es capaz de sobrevivir a estas condiciones. Las plantas propagadas por estaca con micorriza vesículo arbusculares fueron las que presentaron la mayor colonización (81,2%), y son las que tuvieron diferencias significativas respecto a las plantas micropropagadas con micorriza ericoide y las plantas propagada por estaca testigo con un 52,2% y 42,6% de colonización respectivamente . Además, se observaron diferencias entre las plantas con micorrizas provenientes de suelo rizosférico (micropropagadas y propagadas por estaca) y las plantas propagadas por estaca testigo, siendo las primeras las que tuvieron una mayor colonización. Vega y Muñoz (1994), en una prospección de micorrizas entre la VII y XI regiones encontraron en ericaceas nativas presencia de micorrizas ericoides, y en baja frecuencia micorrizas vesículo arbusculares. La presencia de micorrizas ericoides en arándano alto en Chile fue alta. En este estudio, el 100% de las plantas muestreadas poseían un porcentaje de infección alto, siendo en promedio de 60,7% en plantas de un año, 65,9% en plantas de seis años y 73,2% en plantas de 9 años. Todas estas plantas provenían de cultivo in vitro, sin inoculación en vivero, por lo que suponen que los suelos chilenos poseen un alto potencial de inóculo, lográndose elevadas infecciones en los primeros años de vida del cultivo. Powell y Bates (1981) en estudios realizados en Nueva Zelanda, lograron detectar sólo a los 15 años el 100% de plantas de Vaccinium con micorrizas, con un porcentaje de infección máximo de 36%. El hecho de que las plantas micropropagadas con micorriza ericoide tengan uno de los valores mas bajos respecto a la colonización nos sugiere lo siguiente. Este tratamiento a lo largo del análisis de todas las variables medidas (largo y diámetro de brotes, número de rebrotes y anticipados y peso seco y fresco de raíces), siempre obtuvo los valores más altos por lo que fue el tratamiento más exitoso. Al evaluar la variable porcentaje de infección, nos indica que con ese nivel el hongo ya es capaz de ejercer una acción beneficiosa para la planta. Las plantas propagadas por estaca con micorriza vesículo arbuscular que presentaron la mayor colonización no presentaron un crecimiento mayor. Esto nos sugiere que este inóculo al no ser especifico para el arándano no ejerce un beneficio real a la planta. Respecto a los tratamientos inoculados con suelo rizosférico proveniente de una plantación adulta de arándano, en los dos tipos de plantas, tuvieron una alta infección de la raíz diferenciándose de las plantas propagadas por estaca testigo. Esto nos sugiere que al inocular plantas de estaca con suelo rizosférico se aumenta la colonización de la raíz, por lo que estos hongos infectan las raíces con una mayor facilidad. Este hecho no se demuestra en un mayor crecimiento, ya que puede ser que estos hongos que están entrando en la raíz no sean realmente específicos o bien el efecto se pueda vitalizar en etapas posteriores. Scagel (2005), inocula plantas de arándano de siete cultivares distintos con un aislado ericoide micorrizal con fertilizantes orgánicos e inorgánicos, observando que las plantas control tienen una baja colonización (< 15%), independiente de la fuente de fertilizante. La colonización en las plantas inoculadas fue del 15-30 %. La colonización fue típicamente alta cuando las plantas habían crecido con fertilizante orgánico. La colonización generalmente incremento el crecimiento de la planta, pero disminuyó la relación raiz:brotes, independiente del fertilizante usado. Sin el inóculo, sin embargo, algunos cultivares fertilizados con fertilizante orgánico tuvieron menos crecimiento y menores concentraciones de N, K, S y Cu que las fertilizadas con fertilizante inorgánico. Los resultados sugieren que la disponibilidad de nutrientes puede influenciar la colonización y la respuesta al crecimiento, sin embargo, aspectos de especificidad del huésped respecto al hongo y la disponibilidad de inóculo juegan un rol importante en la colonización por micorrizas ericoides en la producción de plantas en vivero. 5.7 Número de esporas/100 g suelo seco para micorrizas vesículo arbusculares. Se midió la cantidad de esporas /100 g de suelo seco para los tratamientos donde estaban involucradas. Estos tratamiento fueron las inoculadas con micorrizas vesículo arbusculares y micorrizas de un inóculo proveniente de la rizósfera de una plantación adulta de arándano. Los resultados se presentan en el Cuadro 9. Cuadro 9: Cantidad de esporas de hongos micorríticos/100 g de suelo seco, en tratamientos con inóculo de micorrizas vesículo arbusculares. TRATAMIENTO MEDIA ESPORAS /100 g Estaca + M. vesículo arbuscular Micropropagada + M. suelo rizosférico Estaca + M. suelo rizosférico Micropropagada + M. vesículo arbuscular 60.6 98.8 108.2 151.2 GRUPOS HOMOGENEOS a a a a Tukey 95% confianza. Letras distintas indican diferencias significativas. Al analizar las respuestas se puede apreciar que no existen diferencias significativas entre los tratamientos. 6. Conclusiones Se logró micorrizar plantas de arándano micropropagadas y propagadas por estaca a nivel de vivero, mediante la inoculación con micorrizas ericoides, micorrizas vesículo arbusculares y micorrizas de suelo rizosférico proveniente de una plantación adulta de arándano. Al inocular plantas de arándano con micorrizas ericoides existen diferencias significativas entre los tipos de plantas utilizados, siendo las micropropagadas las que presentan el mayor largo y diámetro de brotes respecto a las propagadas por estaca. Cuando se inoculan plantas con suelo rizosférico proveniente de una plantación adulta de arándano, independiente del tipo de planta utilizada, muestran un menor desarrollo del diámetro de brotes respecto a las plantas micropropagadas con micorrizas ericoides. Las plantas micropropagadas presentan un mayor número de rebrotes y anticipados respecto a las plantas propagadas por estaca independiente del tipo de inóculo utilizado. Las plantas micropropagadas presentan una mayor emisión de rebrotes cuando se inoculan con micorrizas ericoides respecto a las inoculadas con micorrizas provenientes de la rizosfera de una plantación adulta de arándano. Respecto al porcentaje de infección micorrítica, existen diferencias significativas entre las plantas propagadas por estaca con micorriza vesículo arbuscular. Cuando se inoculan plantas de arándano con suelo rizosférico (micropropagadas y propagadas por estaca) se logra una mayor micorrización. Las plantas propagadas por estaca con micorriza vesículo arbuscular presentan la mayor infección micorrítica. Las plantas micropropagadas con micorriza ericoide presentaron un mayor desarrollo pese a mostrar uno de los menores porcentajes de infección micorrítica. 7. Literatura citada Azcon-Bieto, J., y M. Talón. 2000. Fundamentos de fisiología celular. Capitulo 15. Barcelona, Ediciones Universitarias. 522 p. Bonfante-Fasolo, P., G. Berta., and V. Gianizzi-Pearson. 1979. Ultraestructural aspects of endomicorrhiza in the Ericaceae. I. Aturally infected hair roots of Calluna vulgaris L. Hull. New Phytologist, 83: 739-744. Bonfante-Fasolo, P. 1981. 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Hipótesis de Interés: H0 : Los datos provienen de una distribución Normal (µ , σ2). H1 : Los datos no provienen de una distribución Normal (µ , σ2). Estadístico de Prueba: W = b2 / [(n-1)*S2] ; b = ∑ (׀Yik – Yij * ׀Valor de Tabla) Región de Rechazo: RC: { W / Wc > Wα (n)} 2. Prueba Hartley de Homogeneidad Prueba utilizada para verificar la homogeneidad de varianza. Los percentiles se encuentran tabulados en tabla Hartley del Libro: Diseño de Experimentos. Hipótesis de Interés: H0 : Existe homogeneidad de varianza. H1 : No existe homogeneidad de varianza. Estadístico de Prueba: H = S2MAYOR / S2MENOR Región de Rechazo: RC: { H / Hc > Hα (t , MÁX(ri)-1} Las resultados a las pruebas de supuestos obtenidas para cada variable se encuentran a continuación: Distribución normal ajustada Variable Media DE ShapiroWilks valor p Hartley valor p Anticipados 8,258 4,016 0,06 p > 0,05 Rebrotes 2,533 1,372 0,052 p > 0,05 Largo 393,667 82,888 0,174 p > 0,05 Diámetro 37,565 7,178 0,517 p > 0,05 Anexo 1: Diseño del experimento. Anexo 3: Tablas andeva Fuente de variación (largo) Bloques Factor A Factor B AxB Error Total Suma de cuadrados 21748.7 2523.5 19416.8 17593.6 59167.2 120449.8 Grados libertad 4 3 1 3 28 39 Cuadrado medio 5437.7 841.17 19416.8 5864.53 2113.11 Fuente de variación (diámetro) Bloques Factor A Factor B AxB Error Total Suma de cuadrados 273.51 103.64 16.59 143.55 174.36 831.89 Grados libertad 4 3 1 3 28 39 Cuadrado medio 68.38 34.55 16.59 47.85 6.23 Fuente de variación (rebrotes) Bloques Factor A Factor B AxB Error Total Suma de cuadrados 1.4 4.1 14.4 5 13 37.9 Grados libertad 4 3 1 3 28 39 Cuadrado medio 0.35 1.37 14.4 1.67 0.46 Fuente de variación (anticipados) Bloques Factor A Factor B AxB Error Total Suma de cuadrados 14.65 23.28 70.23 11.27 125.35 244.78 Grados libertad 4 3 1 3 28 39 Cuadrado medio 3.66 7.76 70.23 3.76 4.48 Coeficiente-F 2.57 1.04 24.08 2.67 Coeficiente-F 6.5 2.53 1.21 3.58 Coeficiente-F 0.75 2.73 28.8 7.23 Coeficiente-F 0.82 2.31 20.88 3.34 p-valor 0.06 0.41 0.0004 0.03 p-valor 0.0008 0.11 0.29 0.0071 p-valor 0.6 0.09 0.0002 0.0001 p-valor 0.52 0.13 0.0006 0.01 Fuente de variación (peso fresco) Bloques Factor A Factor B AxB Error Total Suma de cuadrados 608.32 1033.68 570.40 303.05 2702.16 5217.61 Grados libertad 4 3 1 3 28 39 Cuadrado medio 152.08 344.56 570.40 101.02 96.51 Fuente de variación (peso seco) Bloques Factor A Factor B AxB Error Total Suma de cuadrados 165.79 1033.68 570.40 303.52 3144.22 5217.61 Grados libertad 4 3 1 3 28 39 Cuadrado medio 41.45 344.56 570.40 101.02 112.29 Fuente de variación (% de infección) Bloques Factor A Factor B AxB Error Total Suma de cuadrados 1105.6 3439.48 255.03 2484.08 4694.8 11979 Grados libertad 4 3 1 3 28 39 Cuadrado medio 276.4 1146.49 255.03 828.03 167.67 Fuente de variación (esporas/100g suelo seco) Bloques Factor A Factor B AxB Error Total Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio 12025.7 28.8 8241.8 12500 77527.7 110324 4 1 1 1 12 19 3006.43 28.8 8241.8 12500 6460.66 Coeficiente-F p-valor 1.58 5.61 9.29 2.82 0.21 0.01 0.01 0.02 Coeficiente-F p-valor 2.29 5.61 9.29 3.09 Coeficiente-F 1.65 4.81 1.07 5.26 Coeficiente-F 0.47 0.00 1.06 1.07 0.08 0.01 0.01 0.02 p-valor 0.19 0.02 0.32 0.0006 p-valor 0.76 0.95 0.36 0.39 Anexo 4: Caracterización del sustrato. Sustrato: Mezcla aserrín (48%), acícula de pino (48%) y suelo (2%). Da (g/cc) : 0.32 PH : 4.44 Ce (ds/m) : 1.53 Materia orgánica (%) : 39.6 Nitrógeno disponible (ppm) : 41.7 Fósforo disponible (ppm) : 56.5 Potasio de intercambio (ppm) : 195 Calcio (meq/100 g) : 11.1 Magnesio (meq/100 g) : 6.25 Zinc (ppm) : 16.2 Manganeso (ppm) : 414 Fierro (ppm) : 124 Cobre (ppm) : 3.32 Boro (ppm) : 2.62 Sodio (meq/100 g) : 1.16 R.A.S : 1.17 Relación C:N : 78.6