Estructuras citoplásmicas afines a mitotracker red cm-h2xros

XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN
Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008
ISSN 1870-8196
Estructuras citoplásmicas afines a mitotracker
red cm-h2xros en entamoeba histolytica
Mario Rodolfo Morales Vallarta
María Porfiria Barrón González
Dinora Janeth Pérez Terrazas
Licet Villareal Treviño
Jorge Armando Verduzco Martínez
Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad Autónoma de Nuevo León
María del Pilar Carranza Rosales
Centro de Investigación Biomédica del Noreste
del Instituto Mexicano del Seguro Social
E– mail: mv_mario2000@yahoo.com.mx
Introducción
Entamoeba histolytica es un parásito microaerofílico intestinal patógeno en humanos
causante de la amibiasis y sus múltiples manifestaciones clínicas, considerada a nivel
mundial como la tercer causa de muerte ocasionada por protozoarios parásitos, afecta
principalmente las regiones tropicales y subtropicales en las zonas donde las condiciones
sanitarias son deficientes e inadecuadas. El protozoario parásito E. histolytica es
considerado un eucariote ancestral por carecer de las características típicas de los
eucariotes, tales como mitocondrias, aparato de golgi, flagelos y retículo endoplásmico
rugoso y citoesqueleto microtubular (Martínez-Palomo,1986).
La presencia de mitocondrias y organelos derivados de mitocondria no se habían
observado previamente en esta amiba; originalmente E. histolytica fue incluida en el grupo
de los Archeozoa debido a la carencia de mitocondrias, sin embargo, análisis filogenéticos
basados en RNA ribosomal han colocado a este parásito en una rama reciente del árbol
eucariota ya que se cree que sus antepasados tuvieron
mitocondrias.
Tal como fue
evidenciado por Clark y Roger en 1995, ellos mostraron evidencia directa de la pérdida
secundaria de la función mitocondrial en E. histolytica, a partir de este microorganismo se
aislaron genes que codifican para proteínas que en otros eucariotes están localizadas en
las mitocondrias, dichas proteínas son la enzima piridin nucleotido transhidrogenasa y las
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chaperoninas cpn60 y la proteína de choque térmico (Hsp -70). Por otra parte Tovar y col
(1999), reportaron la presencia de un organelo de posible origen
mitocondrial en
E.
histolytica y lo denominaron Mitosma. En 1999 Mai y col. hicieron una asociación entre la
proteína Hsp60 de E. histolytica con un organelo derivado de mitocondria al que
denominaron crypton.
En el 2000 Bakatselou y col. reportaron el aislamiento y la
caracterización de un gen que codifica una proteína de choque térmico de tipo
mitocondrial (mt -hsp70) de E. histolytica. En el 2002 Arisue y col. aislaron y secuenciaron
genes que codifican para la proteína de choque térmico de tipo mitocondrial a partir de
protozoarios amitocondriados como Giardia
intestinalis, Entamoeba histolytica y los
microsporidios Encephalitozoon hellem y Glugea plecoglosi. En el 2003 Bakatselou , Beste
y
Clark determinaron la presencia de 3 genes de origen mitocondrial, piridin nucleótido
transhidrogenasa y las chaperoninas cpn60 y hsp70 en otras especies de Entamoeba
sugiriendo que los genes no se adquirieron recientemente por transferencia lateral a través
de otros organismos.
La principal fuente de energía de E. histolytica lo constituyen los carbohidratos, los
cuales son incorporados por la amiba a través de un sistema de transporte específico. La
glucosa es degradada a piruvato por la vía Embden-Meyerhof, en la glucólisis de
Entamoeba es utilizado el pirofosfato inorgánico (PPi) como fuente de energía en varias
reacciones glicolíticas (Mertens E., 1993), aunque generalmente este es considerado como
un producto final del metabolismo. Para la observación de organelos celulares con
afinidad a colorantes específicos a mitocondrias, seleccionamos el colorante MitoTracker
CM-H2XRos el cual es empleado para el estudio de análisis funcional y de morfología de las
mitocondrias.
Este colorante es derivado de clorometil-rosamina el cual se vuelve
fluorescente sólo cuando es oxidado dentro de las células, debido a su potencial de
membrana las mitocondrias funcionales incorporan el colorante y éste se acumula en su
interior, ahí el grupo clorometil reacciona con grupos tiol presentes en péptidos y proteínas
para formar un conjugado que pude ser fijado con aldehídos (De la Monte y Wands,
2001).La importancia de este trabajo radica en que viene a enriquecer el conocimiento
acerca de la biología celular de E. histolytica, a través del aporte de información nueva, tal
como la presencia de estructuras con afinidad a colorantes que tienen una alta
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especificidad a mitocondrias en eucariotes superiores, tales como el MitoTracker Red CMH2Ros, lo cual aportaría evidencias que podrían ser utilizadas para una
caracterización o clasificación de este organismo.
nueva
Por lo cual es posible encontrar
estructuras con afinidad al MitoTracker Red CM-H2Ros, colorante específico a mitocondrias,
en cultivos de Entamoeba.histolytica HM1-IMSS.
Palabras claves: Mitotracker, Mitosomas, Entamoeba histolytica.
Objetivo
Establecer la presencia o ausencia de estructuras con afinidad al MitoTracker Red CMH2Ros colorante específico a mitocondrias, mediante microscopía óptica de campo claro
y de fluorescencia en cultivos axénicos in vitro de Entamoeba histolytica.
Metodología
1. Material biológico. Cepa amibiana HM1-IMSS de Entamoeba histolytica y suero
bovino esteriL.
2. Medios de cultivo.- Se utilizó el medio de
cultivoTYI-S-33 (Diamond, 1978)
Cinéticas de crecimiento de E. histolytica
Se inocularon 2x104 trofozoítos/mL de E. histolytica en tubos de 13 x 100 mm con 5 mL de
medio TYI- S-33, agregando 0.5 mL de suero bovino estéril y 0.05 mL de antibiótico, y se
incubaron a 37°C realizando cuentas cada 24 horas durante 6 días.
Tinción de trofozoítos de E. histolytica con MitoTracker Red CM-H2XRos
1. Se inocularon 2x104 trof/mL de E. histolytica en tubos Leighton (anterior a la esterilización
se le colocó en la base plana un cubreobjetos, el cual sería soporte para la
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proliferación celular), con 5 mL de medio TYI- S-33, 0.5 mL suero bovino estéril, 0.05 mL
de antibiótico y se incubaron a 37°C.
2. Las tinciones de los trofozoítos de E. histolytica se realizaron durante el día 1, 3 y 5 de la
fase de crecimiento; cada día con 5 diferentes concentraciones (500, 250, 150, 100 y
50 nM) de colorante, con la finalidad de establecer la concentración de MitoTracker
Red que produjera la menor fluorescencia del fondo.
3. Se retiró el medio de cultivo TYI-S3-3 de los tubos Leighton.
4. Las células adheridas al tubo se lavaron con PBS.
5. Se agregó el colorante MitoTracker Red CM-H2XRos a 500, 250, 150, 100 y 50 nM,
disuelto en 1 mL de medio de cultivo TYI-S-33 y se incubaron a 37°C.
6. Se retiraron los tubos de la incubadora, se eliminó el colorante con el medio y las células
se lavaron suavemente con PBS, se fijaron con formaldehído al 4% por 20 min, se retiró
el formaldehído y se lavó 3 veces con PBS.
7. Cada cubreobjeto se retiró del tubo Leighton y se colocaron invertidos en un portaobjetos
en medio de montaje especial (Dako Fluorescent Mounting Medio) y posteriormente se
sellaron con esmalte fino.
8. Las laminillas fueron almacenadas a –20°C hasta su observación al microscopio de
fluorescencia.
Tinción con Mito-Tracker Red CM-H2XRos y homogeneización
de trofozoítos de E. histolytica
1. Proceder de igual manera que en el punto III.1
2. Se centrifugaron los tubos a 1000 rpm durante 5 minutos para retirar el medio de cultivo y
el pellet de amibas fue colocado en tubos eppendorf.
3. Se agregó PBS para lavar, se centrifugó a 1000 rpm por5 minutos y se retiró por inversión.
4. Las células fueron incubada a 37°C con MitoTracker Red CM-H2XRos 100 nM por 30 min.
5. Se centrifugaron a 1000 rpm para retirar el colorante.
6. Se agregó PBS para lavar y se centrífugo a 1000 rpm para retirarlo.
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7. Las células fueron lisadas usando un homogenizador de vidrio (270 golpes) en 2 mL de
buffer isotónico. Este paso y los siguientes se llevaron a cabo en un baño de hielo a 4°C.
8. Se colocaron dos gotas del homogeneizado en un portaobjetos; se dejaron secar y se
agregó medio de montaje (Dako fluorescent Mounting Medio).
9. El homogeneizado restante se fijó con formaldehído al 4 % y se almacenó a –20°C al
igual que las laminillas obtenidas.
Fracción 3500 x g del homogeneizado de trofozoítos de E. histolytica
previamente teñidos con MitoTrackerRed CM-H2XRos
1. Proceder de igual manera que en el punto III.1
2. Se centrifugaron los tubos a 1000 rpm durante 5 minutos para retirar el medio de cultivo;
el precipitado se concentró en un solo tubo.
3. Se agregó PBS para lavar, se centrifugó a 1000 rpm por 5 minutos, se retiró el PBS y el
pellet fue colocado en un homogeneizador de vidrio con 2 mL de Buffer isotónico.
4. Las células fueron lisadas usando un homogeneizador de vidrio (270 golpes) en 2 mL de
buffer isotónico. Este paso y los siguientes se llevaron a cabo en un baño de hielo a 4°C.
5. Los extractos se fraccionaron por centrifugación diferencial a 1000 x g durante 5 minutos
para obtener la fracción nuclear.
6. El sobrenadante obtenido se sometió a 3500 x g durante 10 min. para obtener la
fracción mitocondrial (pastilla).
7. Se hicieron preparaciones en medio de montaje (Dako Fluorescent Mounting Medio) y se
observaron por microscopía de fluorescencia.
Microscopía electrónica de la fracción 3500x g delhomogeneizado
de trofozoítos de E. histolytica
Seguir los pasos del 1-7 del punto anterior.
8. La pastilla se lavó 2 veces con Buffer de fosfatos y se fijó con glutaraldehído al 2.5 % por
24 horas a 4°C.
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9. Para retirar el glutaraldehído se lavó 3 veces con Buffer de fosfatos y se agregó buffer de
fosfatos 0.12 M por partes iguales con OsO4, se incubó durante 30 minutos a 4°C.
10. Se centrifugó a 15000 rpm y se eliminó el sobrenadante (OsO4).
11. La muestra se deshidrató en alcoholes al 70, 80, 90, 95 y 100 % durante 5 minutos en
cada uno, repitiendo 2 veces más en alcohol al 100 %.
12. Se agregó Oxido de propileno durante 10 minutos. Este paso se repitió 2 veces.
13. La muestra se incluyó en la resina spurr (Spurr, 1969) y se dejó polimerizar a 65
°C por 24 horas.
14. Se realizaron cortes finos contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo y
fueron analizados en microscopio electrónico.
Resultados
Tinción de trofozoítos de E. histolytica con MitoTracker Red CM-H2XRos
Las tinciones con MitoTracker Red CM-H2XRos 100 nM de los trofozoítos de E. histolytica
resultaron positivos, ya que en el citoplasma de la amiba se observaron algunas estructuras
con afinidad a este colorante, lo cual indica que son MitoTracker positivas (+). La figura 1A
muestra una fotografía al microscopio de fluorescencia en donde pueden observarse
claramente las zonas de fluorescencia intensa localizada en el citoplasma de
E.
histolytica. En algunas amibas se observaron áreas fluorescentes relativamente grandes, los
sitios fluorescentes de afinidad por el MitoTracker presentan tamaños mayores que los
observados en células eucariotas de organismos superiores.
Tinción con MitoTracker Red CM-H2X Ros y homogeneización
de trofozoítos de E. histolytica
La homogeneización de los trofozoítos de E. histolytica se llevó a cabo con el fin de localizar
e identificar las estructuras teñidas con MitoTracker Red CM-H2XRos en los trofozoítos (ver Fig.
1A) por lo que se tiñó previamente con MitoTracker Red CM-H2X Ros para que fuera posible
su visualización a través de microscopía de fluorescencia. En la Fig. 1B es posible observar
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una imagen de contraste de interferencia donde se distinguen restos de membrana que
forman parte del homogeneizado crudo donde se observa además un agregado de
vesículas en la parte central de la fotografía (recuadro). En la Fig. 1C éste mismo agregado
se muestra por microscopía de fluorescencia, y muestra gran afinidad por el colorante a
diferencia de los demás restos celulares los cuales no fluorescen.
Fracción 3500 x g del homogeneizado de trofozoítos de E. histolytica
teñidos previamente con MitoTracker Red CM-H2XRos
La centrifugación a 3500 x g se llevó a cabo con el fin de obtener una fracción mas
concentrada de vesículas con afinidad al MitoTracker. Las Fig. 1D y 1E muestran agregados
de vesículas de esta fracción con afinidad por el colorante MitoTracker Red CM-H2XRos. En
la fracción 3500 x g también se encontraron vesículas aisladas que muestran afinidad al
colorante MitoTracker Red CM-H2XRos. La figura 1F muestra vesículas con fluorescencia en
la membrana y presenta en su interior material que muestra una fuerte fluorescencia y que
guardan correlación con la morfología de algunas vesículas observadas por microscopía
electrónica (ver figuras 1I, 1J y 1K). La figura 1G muestra un campo donde se observa un
agregado de vesículas de tamaños variables, algunas de las cuales contienen otras
vesículas o inclusiones muy fluorescentes en su interior (flecha). En la figura 1H se aprecia la
presencia de dos inclusiones fluorescentes en el interior de una vesícula (flecha).
Microscopía electrónica de la fracción 3500 x g del homogeneizado
de trofozoítos de E. histolytica
La fracción 3500 x g observada a través de microscopía electrónica se realizó con el fin de
b)
conocer acerca de la ultraestructura de las vesículas observadas por microscopía de
fluorescencia. Las fotografías muestran vesículas abundantes de diferentes tamaños,
algunas de ellas formadas por una doble membrana tal y como se observa en la figura 1I y
1J, el diámetro de estas estructuras fue de aproximadamente 1-3 μm. En la figura 1J y 1K
también pueden observarse estructuras membranosas internas que guardan correlación
morfológica con las observadas por microscopía de fluorescencia (ver figura 1F).
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A
B
10μm
C
D
E
b
a
F
G
I
J
b
H
K
c
Fig 1.-A) imágenes de E. histolytica en presencia de mitoTracker Red CM-H2XRos. B-H)
vesículas fluorescentes de E. histolytica en presencia mitoTracker Red CM-H2XRos. I-K)
vesículas observadas al microscopio electrónico de transmisión, el rango de tamaño de las
vesículas fue calculado de 1-3 μm.
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Discusión
Si bien Entamoeba histolytica tuvo una alta afinidad por el colorante MitoTracker Red
CMH2XRos, el patrón de tinción no es igual al que se presenta cuando se tiñen células
eucariotes de organismos superiores.
En el caso de E. histolytica aparecen áreas
fluorescentes más grandes y poco numerosas (de una a cuatro), aunque algunas veces
también se observaron pequeños puntos fluorescentes. La tinción con MitoTracker Red CMH2XRos está basada en la asociación del colorante oxidado (fluorescente) con grupos tiol
presentes en péptidos y proteínas mitocondriales; es posible entonces que estas proteínas,
o semejantes a éstas, posiblemente remanentes de un estado mitocondrial anterior sean
las responsables de la tinción con MitoTracker Red CM-H2XRos.
El patrón de fluorescencia con MitoTracker Red CM-H2XRos en E. histolytica sugiere la
posible presencia de una estructura u organelo con un tamaño considerablemente mayor
que el de una mitocondria típica, lo cual se antojaba improbable por que no hay
referencias de estructuras con características morfológicas de mitocondrias ni aun con
observaciones al microscopio electrónico. Por otra parte, cuando se analizó la fracción
3500 x g del homogeneizado de trofozoítos de E. histolytica se pudo observar la presencia
de vesículas de un rango de tamaño de 1-3 μm, pero además estas usualmente se
encontraban formando agregados, lo cual explica la gran área fluorescente observada en
trofozoítos intactos. Es posible entonces que si estas estructuras afines al MitoTracker Red
CM-H2XRos representan a un solo tipo de organelo, éste se ha formado por un agregado
de vesículas semejantes pero no iguales a como se encuentran asociadas las cisternas del
Golgi.
Por otra parte, la observación al microscopio electrónico confirmó la presencia de
estructuras que guardan correlación con la morfología de las vesículas y agregados
observados por microscopía de fluorescencia. La microscopía electrónica también
demostró la presencia de vesículas con doble membrana, además de que algunas
presentan también estructuras internas de membrana que podrían ser vesículas o septos
de la membrana interna.
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Las enzimas mitocondriales piridina-nucleótido transhidrogenasa y la chaperonina
mitocondrial cpn60 están codificadas en el genoma de E. histolytica y esta última enzima
ha sido identificada en un organelo de este parásito, al cual se le ha dado el nombre de
Mitosoma (Tovar y cols., 1999) y en el cual se ha determinado también la presencia de
DNA de doble hélice (Ghosh y cols., 2000). Estos hallazgos han hecho suponer que el
Mitosoma es un organelo putativo de la mitocondria ya que por otra parte los árboles
filogenéticos basados en el análisis de RNA ribosmal, muestran que Entamoeba histolytica
es un organismo más bien reciente en la escala evolutiva y no ancestral como era
considerado anteriormente. Una situación semejante ocurre en Giardia intestinalis con el
descubrimiento de genes nucleares de un posible ancestro mitocondrial (Tovar J, 2003). Sin
embargo, en estos organismos no se ha reportado ningún estudio con colorantes afines a
mitocondria.
Jorge Tovar (1999) muestra que el Mitosoma se presenta visualmente en número de
uno (una vesícula) por trofozoíto, pero lo encontrado en este trabajo indica que existen un
gran número de vesículas con afinidad al MitoTracker formando agregados. Aunque por
otra parte, las vesículas aquí estudiadas presentan también una doble membrana (véase
Figs. 1I, 1J, 1K) como lo encontrado en mitosomas. En síntesis, los hallazgos de este trabajo
concuerdan con las características del Mitosoma o Crypton en que posee una doble
membrana, pero no concuerdan en el número de vesículas presentes por trofozoítos, ni
con la presencia de vesículas internas. Por otra parte no está determinado si las vesículas
afines al MitoTracker Red CM-H2XRos poseen la chaperonina cpn60 y/o la piridin-nucleótido
transhidrogenasa ni si poseen DNA.
Por lo tanto tampoco está determinado si las
estructuras identificadas en este trabajo corresponden al Mitosoma o Crypton o a un nuevo
organelo o estructura del citoplasma amibiano.
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Conclusiones
1. Existen vesículas citoplasmáticas afines al Mitotracker Red CM-H2XRos en trofozoítos de
Entamoeba histolytica y Entamoeba invadens.
2. Las vesículas citoplásmicas están formadas por una doble membrana y son semejantes
a las descritas por otros autores como Mitosomas, pero difieren en cuanto a que las
descritas en este trabajo presentan vesículas internas que también podrían representar
septos formados por la membrana interna
3. El patrón de tinción de Mitotracker Red CM-H2XRos difiere del marcado con anticuerpos
contra la proteína cpn-60 y contra mitocondrias de células eucariotas de organismos
superiores.
4. Las vesículas teñidas Mitotracker Red CM-H2XRos podrían representar la presencia de un
organelo diferente al Mitosoma.
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