Proteinas a gran escala.pptx

Expresión de Proteínas
Gran Escala
—  En 2000 NIH (National Institute of Health)
—  Protein Structure Initiative ( Proteínas humanas)
—  Base de datos tiene mas de 33.000 secuencias proteícas (5%)
—  Principal Objetivo: Modelar estructuras proteícas desconocidas
basándose en comparaciones estructurales.
Proteínas como productos
biológicos
—  Fabricación de cerveza y vino (fermentación)
—  Depende de enzimas producidas por la levadura
—  Producción de quesos
—  Gracias a la bioingeniería, la fuente de proteínas usada
actualmente procede de bacterias manipuladas
—  Aunque se conocía desde la antigüedad no fue hasta 1970
que fue posible producir proteínas concretas a demandas.
—  Muchas de las aplicaciones hoy en día dependen de
enzimas.
—  Innumerables industrias se basan en la degradación de
grandes moléculas (despolimerización)
—  Amilasas- hidrolizan CHO’s
—  Proteasas- descomponen proteínas
—  Lipasas- degradan grasas
—  Quimosinas son importante en la producción de alimentos y
bebidas.
—  Hormonas- Mensajeros quimicos
—  Anticuerpos- Protegen a los organismos de enfermedades
Aplicaciones
—  Producción de un fármaco biotecnológico
—  Aplicaciones médicas
—  Procesamiento de alimentos
—  Textiles y artículos de cuero
—  Detergentes
—  Manufactura y reciclaje de papel
—  Adhesivos
—  Biosoluciones
Producción de un fármaco
biotecnológico
—  Anticuerpos monoclonales
—  Proteínas sanguíneas
—  No se producen por síntesis como es el caso de un
producto químico donde se adicciona un componente
cada vez.
—  Se producen mediante fermentación microbiana o
cutivos de células
Estructuras de las proteínas
—  Cadenas de aminoácidos (a.a.)
—  Peso molecular
—  Carga de proteína
—  Capacidad de interacción es clave para la actividad
biológica.
—  Proteínas pueden tener cuatro niveles de organización
estructural (dependiendo de la secuencia química
específica de sus subunidades de a.a.)
Estructura Primaria
—  Es la secuencia de una cadena de a.a.
Estructura Secundaria
—  Es cuando la secuencia de a.a. se pliegan o giran en
puntos concretos, se une mediante enlaces de
hidrógeno en una o dos formas estructurales.
—  Alfa hélice y láminas plegadas beta.
Estructura terciaria
—  Se produce cuando ciertas atracciones están presentes
entre hélices alfa y láminas beta, obteniendo una
estructura tridimensional única.
Estructura cuaternaria
—  Es una proteína compuesta por más de una cadena de
a.a., cada una de las cuales participa en la forma
tridimensional final.
Plegamiento de proteína
—  Todo lo que importa de una proteína (su estructura,
función) depende del plegamiento.
—  Ej. Anemia
—  Alzheimer- Las placas que aparecen en la enfermedad se
acumulan por que la proteína mal plegada no puede ser
degradada por las enzimas de las células cerebrales.
—  Fibrosis quística
—  Enfermedad de las vacas locas
—  Muchas formas de cáncer
—  Infartos cardiácos
Glucosilación
—  Se añaden hidratos de carbono en lugares específicos de
las proteínas.
—  Puede afectar la actividad, la solubilidad y la
orientación, inclusive puede alargar la vida activa
Ingeniería de proteínas
—  Inducción de mutaciones aleatorias en genes y selección
de organismos con el producto proteíco con la máxima
actividad.
—  Ej. Organismos seleccionados que toleran concentración
de Cianuro superior a 1.0 M.
—  La evolución molecular dirigida precisa la introducción
de cambios específicos en las secuencias de nucleótidos
de un gen concreto.
Producción de Proteínas
—  Proceso largo y laborioso
—  Cada fase tiene muchos métodos de producción para
elegir.
—  Upstream processing- Incluye la expresión de la
proteína en la célula
—  Downstream processing- La proteína primero se separa
luego se comprueba pureza y capacidad funcional y por
último se desarrolla un medio estable para preservar la
proteína.
Expresión de Proteína :
Primera fase
—  Selección de la célula que se usará como fuente de
proteína
— 
— 
— 
— 
Microorganismos- Los más atractivos
Hongos
Células animales
Células vegetales
Los microorganismos
—  Son los más atractivos
— 
— 
— 
— 
Procesos de fermentación son bien conocidos
Pueden cultivarse en grandes escalas en poco tiempo
Se pueden alterar genéticamente
Se pueden usar varios métodos de tecnología de DNA
recombinante para aumentar la producción de una
proteína microbiana.
—  Um método es introdcucir copias adicionales del gen en la
célula huésped.
—  Otro método es introducción del gen en el organismo cuando
es colocado un control de expresión
Hay limitaciones….
—  Las proteínas generadas se producen en forma de
proteína de fusión, lo que significa que la proteína está
unida a una proteína bacteriana.
—  La mayoría de ls proteínas sintetizadas naturalmente
son intracelulares. La proteína se acumula en forma
insoluble en cuerpos de inclusión.
—  Limitaciones en el uso de microorganimos:
—  Procariotas son incapaces de llevar algunos procesos
(Glucosilación)
Hongos
—  Son fuentes de muchas proteínas usadas en productos
como los alimentos (pan) y cerveza .
—  Las proteínas naturales de algunos hongos se utilizan
como fuente de alimentos como la levadura.
—  Son eucariotas y pueden realizar algunas modificaciones
transcripcionales y pueden plegar proteínas humanas
correctamente.
Plantas
—  Células vegetales también pueden ser un lugar de
expresión proteíca.
—  85% de los fármacos actuales se pueden encontrar en
plantas.
—  Ej papaína (enzima proteolítica)- agente ablandador de
carne.
—  Limitación: No todas las proteínas pueden ser expresadas en
una planta.
—  Pared celular dificulta proceso de extración de proteínas.
Sistema de células de mamíferos
—  Requisitos nutricionales son más complejos que otros
organismos.
—  Células crecen más lentas y se necesitan más células
para sembrar en bioreactores.
—  Problemas de Contaminación.
—  A pesar de todas estas dificultades en muchos casos las
células animales siguen siendo la mejor opción y en
ocasiones la única, para ciertos productos.
Sistemas de producción en
animales
—  Las células en cultivo no son la única opción cuando se
usan células animales, en algunos casos los productores
son animlaes vivos.
—  Ej anticuerpos monoclonales (ratones)
—  Se inyecta antígeno a ratón y este secreta anticuerpo deseado.
—  Ej leche o huevos de animales transgénicos- Estos
productos de animales contienen las proteínas del gen
recombinante introducido y puede purificarse de las
proteínas de estos productos.
Sistema de Insectos
—  Se usan técnicas que usan larvas de insectos.
—  Baculovirus (virus que infectan insectos) se están
usando como vehículos para insertar DNA que haga que
las células del insecto produzcan proteínas deseadas.
Bioreactores
—  Los sistemas de cultivo celulares de gran volumen se
realizan en un sistema cerrado y estéril hasta que se
recogen los productos.
—  Dentro del sistema se mantienen condiciones de
oxígenos (gases), temperatura y pH.
Una vez producida una
proteína empieza el
Downstream Processing
Métodos de purificación de
proteínas
—  Primer paso recoger proteína
—  Si la proteína es intracelular, se recoge toda la célula si
es extracelular, la proteína se excreta al medio de
cultivo, que se recoge.
Preparación de Extracto para
purificación
—  Proteína es intracelular
—  Lisis celular
—  Métodos físicos y químicos
—  Variación en temperaturas
—  Uso de detergetes
—  Uso de ultrasonidos
—  Molición con bolas de cristal
Separación de los componentes del
extracto (Concentración Inicial del
producto)
—  Concentración puede ser lograda induciendo la
precipitación usando sales ( Sulfato de amonio) o
solventes (etanol, acetona ó dietil éter).
—  En industria problema con sulfato.
—  El precipitado es colectado (centrifugación, filtración)
y redisuelto en un pequeño volumen de buffer.
Métodos de separación
—  Centrifugación -Separa las moléculas. Con esta técnica
las proteínas pueden aislarse en una sola capa.
—  También se pueden usar filtros de distintos tipos y
tamaños para separar proteínas
—  En la filtración por membrana se usan fibras de nylon o
otro material sintético para eliminar todos los restos
celulares de la solución.
—  La microfiltración elimina los precipitados y las
bacterias.
Ultrafiltración
—  El método más común actualmente para lograr
concentrar el producto inicial.
—  Las membranas para estos procesos son lo
suficientemente pequeños para retener proteínas de
bajo peso molecular.
—  Las membranas de ultrafiltración con una masa
molecular de retención de 1 a 300 kDa están disponibles
comercialmente.
Ultrafiltración
—  Ultrafiltros son de acetato de celulosa o nitrato de
celulosa.
—  Requisito para la manufactura de estos filtros es que el
material utilizado tenga bajas propiedades de absorción
por proteínas.
Ultrafiltración
—  Este método se ha convertido en uno prominete para
la concentración de proteínas por varias razones:
—  Tiene pocos efectos adversos sobre la bioactividad
de las moléculas de proteína.
—  Tasas altas de recuperación con más de 99 %.
—  Tiempos de procesamiento rápidos, en comparación
con otros métodos de concentración.
—  Se requiere poco equipo auxiliar .
Purificación
Cromatográfica
Pasos iniciales en todo proceso de
purificación (liberan la proteína de
la célula)
Purificacion cromatografica
—  Una vez la proteína es recobrada de su fuente y
concentrada debe ser purificada.
—  La purificación es lograda por cromatografías por
columna.
—  Se refiere a la separación de diferentes tipos de
proteínas :
—  Se compone de dos fases:
—  Una fase sólida estacionaria
—  Una fase móbil
—  La mayoría de las cromatografías son de
naturaleza de absorción.
—  Retención selectiva
Cromatografía de Columna
—  Se refiere a la separación de diferentes tipos de
proteínas de acuerdo a diferencias en fases. Una fase
sólida y una fase movil.
Características de proteínas
—  Tamaño
—  Forma
—  Carga
—  La presencia de grupos hidrofóbicos
—  Habilidad para unirse a varios ligandos
—  La combinación de dos a cuatro técnicas diferentes es empleada
en un proceso típico de downstream. Flitración en gel y
cromatografía de intercambio iónico son las más comunes.
—  Estos procesos son usualmente controlados por computadoras.
Las columnas cromatográficas son de acero inoxidable.
—  Separación de procesos cromatográficos es efectuado
generalmente a presiones bajas.
Técnica
Base de separación
Intercambio iónico
Diferencias en la carga de la
superficie de la proteína a un pH.
Filtración de gel
Diferencia en masa y forma de
diferentes proteínas
Afinidad
Basada en la interación entre una
proteína y un ligando apropiado.
Interación hidrofóbica
Diferencias en la hidrofobicidad
de la superficie de la proteína.
“Chromatofocusing”
Separa proteínas en base a su
punto isoeléctrico.
Cromatografía por exclusión de tamaño
(gel filtration)
Cromatografía por exclusión de
tamaño (gel filtration)
—  Separa en base a formas y tamaño.
—  Se logra la separación percolando la solución de la proteína
através de una columna empacada con una matriz porosa en gel
en forma de cuentas (beads).
—  Proteínas grandes son eludidas. Las proteínas más pequeñas no
son retenidas por tiempo igual. Mientras más pequeñas más
tiempo son retenidas en la columna.
—  Estas geles tienden a usarse para separar proteínas de otras
moléculas en orden de magnitud de su tamaño pequeño, y son a
menudo usadas para remover componentes de amortiguadores
de bajo peso y sales de soluciones proteícas.
—  A menudo son utilizado en etapas finales de procesos de
purificación.
—  Pequeños volumenes deben sera aplicados a la columna para
lograr resolución efectiva.
—  Requiere tiempo de procesamiento más largo.
Cromatografía de Intercambio Iónico
Cromatografía de Intercambio
Iónico
—  Ácido aspártico y ácido glutámico tienen carga negativa mientras
lisina, arginina y histidina tienen cargas positivas.
—  La carga neta que exhibe una proteína depende de la cantidad
de los a.a. cargados en la proteína y en el pH de la solución de
la proteína.
—  Un valor de pH sobre punto isoeléctrico (proteína exhibe carga
negativa)
—  Esta cromatografía está basada en el principio de atracción
electroestática reversible de una molécula cargada a una matriz
sólida que contiene atada covalentemente grupos de cargas
opuestas.
—  Las proteínas pueden ser eludidas alterando el pH o
incrementando la concentración de sales en el amortiguador.
—  La mayoría de los proceso de purificación al menos emplean un
paso de intercambio iónico (técnica cromatográfica más popular)
—  Menos costosa.
—  A pH fisiológico muchas proteínas exhiben una carga negativa.
—  Cromatografía de intercambio aniónico es la más usada.
Cromatografía de interación
hidrofóbica
Cromatografía de interación
hidrofóbica
—  Ocho de los veinte aminoácidos son hidrofóbicos por su
naturaleza no polar de sus grupos (R).
—  La cromatografía de interacción hidrofóbica fracciona las
proteínas por su diferencia en grado de hidrofobicidad. (Esto
depende de la ocurrencia de interacciones hidrofóbicas entre los
parchos hidrofóbicos de la superficie de las proteínas y los
grupos hidrofóbicos covalentes atados a la matriz.
—  La separación de la proteína por interacciones hidrofóbicas
depende de la interacción de la proteína, la matriz del gel y el
solvente acuoso que rodea.
—  Incrementando la fortaleza iónica de una solución por la
adicción de una sal neutral incrementa la hidropobicidad de las
moléculas proteícas.
—  Columnas de interacción hidrofóbica son mejores si se
aplican bajo condiciones de alta fortaleza iónica.
—  Mientras una proteína sea mas hidrofóbica más fuerte
se enlaza.
Cromatografía de afinidad
—  Tiene una alta bioespecificidad, lo cual produce un alto grado de
purificación.
—  Una gran variedad de ligandos pueden ser covalentemente
enlazados a la matriz.
—  Elución de la proteína enlazada a una columna de afinidad es
lograda por la alteración de la composición de los buffer de elución,
de forma tal que la afinidad de la proteína por un ligando
inmovilizado sea reducida grandemente.
—  Una gran variedad de interaciones no covalentes contribuyen a la
interación proteína ligando.
—  Cambios en el pH del buffer, fortaleza iónica, inclusión de
detergentes o agentes como el glicol de etileno pueden ser
suficientes para eludir la proteína.
—  Cromatografía de afinidad ofrece muchas ventajas sobre
métodos tradicionales.
—  La especificidad y selectividad no puede ser superada por otros
procedimientos
—  Incrementa la pureza y tiene casi un 100% de producción
—  Incorporación de un paso de afinidad drásticamente reduce los
pasos subsiguientes para lograr la purofocación del producto.
—  Reducción drástica de tiempo y dinero.
Limitaciones:
—  Ligando bioespecíficos son costosos y exhiben pobre
estabilidad.
—  Técnicas son químicamente complejas, peligrosas ,
que consumen tiempo y dinero.
Enfoque isoeléctrico
—  Se usa a menudo en el control de calidad del proceso de
purificación para identificar dos proteínas similares que
son difíciles de separar por otros medios.
—  Cada proteína tiene un número específico de a.a.
cargados en su superficie en lugares concretos. Cada
proteína tiene una firma eléctrica única, conocida como
su punto isoeléctrico (IEP).
—  Este IEP puede ser usado para separar proteínas cuyas
demás características sean similares
Verificación
—  En cada paso del proceso de purificación es importante
verificar la proteína.
—  Verificar que la proteína no se ha perdido y que los
intentos de concentración han sido exitoso.
—  La SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida)
suele usarse para hacer estas comprobaciones.
—  Se le añade SDS(detergente) a una muestra de mezcla de
proteinas y se calienta la mezcla.
—  Las cargas del sulfato se distribuyen equitativamente en la
proteína desnaturalizada.
—  Se hace una separación dependiendo del tamaño
(número de carga de las proteínas)
—  La muestra se carga en una matriz de gel especial
(PAGE), donde forma una única banda en un lugar
específico, según su tamaño y masa molecular.
—  Se añade un tinte azul (Tinción Azul de Coomasie) lo
cual permite observar la banda coloreada que permite
la comparación con un marcador de tamaño conocido.
—  Un método específico para la detección de proteínas es
el Western Blotting
Conservación de la proteína
—  Liofilización (secado por congelación)
—  En este proceso los cristales de hielo se subliman a vapor
de agua directamente sin pasar por el estado líquido.
—  Se ha demostrado que la liofilización mantiene la
estructura proteíca y por esta razón es el método
habitualmente elegido para conservar las proteínas
biotecnológicas.