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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN LECHE CRUDA Autora: Ana Gabriela Ipiales Michilena e-mail: gabriela_ipiales@hotmail.com Tesis de Grado para optar por el Título Profesional de QUÍMICO DE ALIMENTOS Tutor: Dr. Iván Tapia e-mail: ivan_tapia_c@hotmail.com Quito, Mayo 2015 Ipiales Michilena Ana Gabriela (2015). Estudio comparativo de tres métodos analíticos para determinación de proteína en leche cruda. Trabajo de investigación para optar por el grado de Químico de Alimentos. Carrera de Química de Alimentos. Quito: UCE. P. 109 ii DEDICATORIA Dedico este trabajo con todo cariño a mi madre, quien ha sido la persona que me ha apoyado incondicionalmente para la culminación de mi carrera, además de ser quien me ha guiado, escuchado, comprendido y ayudado durante todo el transcurso de mi vida, y a quien considero el mejor ejemplo que he tenido. iii AGRADECIMIENTOS A mis padres Enrique y Teresa, por el apoyo y la confianza que siempre depositaron en mí. Por brindarme un hogar lleno de amor y respeto. A mis hermanos Juan, Lucy y Lupita a los cuales quiero mucho y me han apoyado siempre. A mi novio Mauri por todo el tiempo y amor compartido, y por estar junto a mí en todos los momentos que he necesitado. A mis amigas Mery, Nathy y Moni que hicieron de transcurso en la universidad una linda experiencia, y a mi amiga Tatty quien compartió conmigo el tiempo en Agrocalidad. A la Dra. Lorena Goetschel y al Dr. Iván Tapia por toda la ayuda brindada a lo largo de la carrera, por ser unos excelentes maestros y seres humanos. Al Dr. Raúl Bahamonde por la ayuda brindada en la tesis. A todo el personal del laboratorio de Control de Calidad de la Leche de Agrocalidad por brindarme la oportunidad de realizar el trabajo en sus instalaciones. iv UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS AURORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL Yo Ana Gabriela Ipiales Michilena, en calidad de autora del trabajo de investigación realizado sobre “Estudio comparativo de tres métodos analíticos para determinación de proteína en leche cruda”, autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que como autora me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento. Quito, a los 22 días del mes de Abril del 2015 Ana Gabriela Ipiales Michilena CI: 1722857503 v UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS INFORME DE APROBACIÓN DE LA TESIS POR PARTE DEL TUTOR CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS Dejo constancia que he leído la tesis presentada por la Señorita Ana Gabriela Ipiales Michilena para optar por el título profesional cuyo tema es; “Estudio comparativo de tres métodos analíticos para determinación de proteína en leche cruda” la misma que reúne los requerimientos, y los méritos suficientes para ser sometida a evaluación por el tribunal calificador. En la ciudad de Quito, a los 22 días del mes de Abril del 2015 Firma del Tutor ______________________ Dr. Iván Tapia CI: 170846835-8 vi UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS INFORME DEL TRIBUNAL CALIFICADOR Quito, 15 de mayo del 2015 Señora Isabel Fierro DECANA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Presente Señora Decana: El Tribunal encargado de calificar la Tesis: “Estudio comparativo de tres métodos analíticos para determinación de proteína en leche cruda” presentada por la señorita Ana Gabriela Ipiales Michilena, estudiante de la Carrera de Química de Alimentos, luego del estudio y revisión correspondiente, resolvió: APROBAR REPROBAR la Tesis con la NOTA de: ………………………………….………… la Tesis. Es cuanto podemos informar. Atentamente, _______________________ FIRMA PROFESOR Dr. Iván Tapia CI: 1708468358 _____________________ FIRMA PROFESOR Dra. Lorena Goetschel CI: 1709719239 vii _____________________ FIRMA PROFESOR Q. Raúl Bahamonde, MSc CI: 1717676389 LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN La investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Control de Calidad de la Leche, de la institución AGROCALIDAD, ubicada en la dirección Eloy Alfaro y Gonzales Suárez, Granja del MAGAP, Sector La Granja, frente a Gasolinera PETROCOMERCIAL, Tumbaco, Pichincha, Ecuador. Las muestras de leche para el estudio fueron tomadas en la Facultad de Agronomía de la Universidad Central del Ecuador, ubicada en Tumbaco, la Morita. viii ÍNDICE DE CONTENIDOS 1 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1 1.1 Planteamiento del problema ............................................................................................ 1 1.2 Formulación del problema .............................................................................................. 2 1.3 Hipótesis de trabajo (o de investigación) ........................................................................ 2 1.4 Objetivos de la investigación ........................................................................................... 3 1.4.1 General ............................................................................................................................ 3 1.4.2 Específicos ...................................................................................................................... 3 1.5 2 Importancia y justificación .............................................................................................. 3 MARCO TEÓRICO ................................................................................................................... 5 2.1 Antecedentes ..................................................................................................................... 5 2.2 Fundamento Teórico ........................................................................................................ 7 2.2.1 La leche .......................................................................................................................... 7 2.2.1.1 Proteínas de la leche ............................................................................................... 7 2.2.1.2 Métodos de análisis de proteína ............................................................................. 8 2.2.2 Validación ...................................................................................................................... 8 2.2.2.1 Requisitos de una validación .................................................................................. 9 2.2.2.2 Importancia de la validación de un método............................................................ 9 2.2.2.3 Grado de validación ............................................................................................... 9 2.2.2.4 Alcance de la validación ...................................................................................... 10 2.2.2.5 Esquema de validación ......................................................................................... 12 2.2.3 Comparación entre métodos ......................................................................................... 12 2.2.3.1 Contraste t para datos emparejados ...................................................................... 13 2.2.3.2 Prueba F de Fisher ................................................................................................ 13 2.2.3.3 Rectas de regresión para la comparación de métodos analíticos .......................... 13 2.2.3.4 Análisis de Varianza............................................................................................. 14 2.2.3.5 Precisión, exactitud y errores ............................................................................... 15 2.2.4 Espectroscopia infrarroja por transformadas de Fourier .............................................. 16 2.2.4.1 Vibraciones moleculares ...................................................................................... 17 2.2.4.2 Tipos de vibraciones moleculares ........................................................................ 17 2.2.4.3 Absorción de la radiación infrarroja ..................................................................... 18 2.2.4.4 Espectrofotómetros de infrarrojo.......................................................................... 19 2.2.4.5 Milkoscan FT+ ..................................................................................................... 21 2.2.5 Ultrasonido ................................................................................................................... 22 2.2.5.1 Relación del ultrasonido con las propiedades de una matriz ................................ 23 ix 2.2.5.2 Tipos de ondas ultrasónicas.................................................................................. 25 2.2.5.3 Ekomilk ultra pro ................................................................................................. 26 2.2.6 Kjeldahl ........................................................................................................................ 27 2.3 3 2.2.6.1 Ventajas y limitaciones ........................................................................................ 28 2.2.6.2 Fundamento del método y etapas ......................................................................... 28 Fundamento legal ........................................................................................................... 30 METODOLOGÍA .................................................................................................................... 32 3.1 Tipo de investigación...................................................................................................... 32 3.2 Diseño experimental ....................................................................................................... 32 3.2.1 Diseño experimental de la validación parcial............................................................... 32 3.2.1.1 Alcance de la validación ...................................................................................... 32 3.2.1.2 Parámetros de la validación.................................................................................. 33 3.2.2 Diseño experimental de la comparación entre métodos ............................................... 37 3.2.2.1 Prueba t pareada ................................................................................................... 38 3.2.2.2 Prueba F de Fisher ................................................................................................ 40 3.2.2.3 Curvas de Correlación .......................................................................................... 41 3.2.2.4 Comparación de los métodos espectroscópico IR-Kjeldahl y ultrasonido ........... 43 3.2.3 Criterios de aceptación ................................................................................................. 44 3.3 Materiales y métodos ..................................................................................................... 45 3.3.1 Métodos ........................................................................................................................ 45 3.3.1.1 Procedimiento Método Infrarrojo ......................................................................... 45 3.3.1.2 Procedimiento Método Ultrasonido ..................................................................... 46 3.3.1.3 Procedimiento Método Kjeldahl .......................................................................... 47 3.3.2 Materiales y equipos..................................................................................................... 48 4 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS....................................................... 50 4.1 Análisis de resultados de la validación ......................................................................... 50 4.1.1 Linealidad ..................................................................................................................... 50 4.1.2 Exactitud....................................................................................................................... 52 4.1.3 Porcentaje de recuperación........................................................................................... 53 4.1.4 Precisión ....................................................................................................................... 54 4.2 Análisis de resultados de la comparación de los métodos ........................................... 57 4.2.1 Prueba t para datos emparejados .................................................................................. 58 4.2.1.1 Comparación entre los métodos espectroscópico IR y Kjeldahl .......................... 58 4.2.1.2 Comparación entre los métodos espectroscópico IR y ultrasonido ...................... 59 4.2.2 Prueba F.................................................................................................................... 60 4.2.2.1 Comparación entre los métodos espectroscópico IR y Kjeldahl ......................... 60 4.2.2.2 Comparación entre los métodos espectroscópico IR y ultrasonido ...................... 61 x 4.2.3 Prueba de correlación ............................................................................................... 62 4.2.3.1 Correlación entre los métodos espectroscópico infrarrojo y Kjeldahl ................. 62 4.2.3.2 Correlación entre los métodos espectroscópico infrarrojo y ultrasonido ............. 63 4.2.4 Comparación entre los métodos espectroscópico infrarrojo, Kjeldahl y ultrasonido ... 66 5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...................................................................... 67 5.1 Conclusiones ................................................................................................................... 67 5.2 Recomendaciones ........................................................................................................... 69 6 BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 71 7 ANEXOS .................................................................................................................................. 74 Anexo 1. Certificado del material de referencia............................................................................... 74 Anexo 2. Tabla de la distribución t .................................................................................................. 77 Anexo 3. Valores críticos de F para un contraste de una cola (P=0.05)........................................... 78 Anexo 4. Resultados de exactitud para las concentraciones 2-7 ...................................................... 79 Anexo 5. Resultados de precisión para las concentraciones 2-7 ...................................................... 86 Anexo 6. Fotos de la investigación ................................................................................................. 93 Anexo 7. Certificado de traducción del resumen por un experto en el idioma ................................ 94 xi LISTA DE TABLAS Tabla 1-1. Tabla oficial obligatoria para el pago por calidad de la leche cruda ................................. 2 Tabla 2-1. Alcance de la validación ................................................................................................. 10 Tabla 2-2 Regiones del espectro infrarrojo. ..................................................................................... 16 Tabla 2-3. Tipos de vibraciones de la molécula de proteína ............................................................ 21 Tabla 2-4. Factor de conversión nitrógeno total - proteína .............................................................. 27 Tabla 3-1. Intervalo de concentraciones del MRC ........................................................................... 33 Tabla 3-2. Diseño del Análisis de Varianza ..................................................................................... 36 Tabla 3-3. Ecuaciones para el análisis de varianza .......................................................................... 36 Tabla 3-4. Exactitud, comparación espectroscópico IR/Kjeldahl ................................................... 38 Tabla 3-5. Exactitud, comparación espectroscópico IR- ultrasonido .............................................. 39 Tabla 3-6. Precisión, comparación espectroscópico IR/Kjeldahl ..................................................... 40 Tabla 3-7. Precisión, comparación espectroscópico IR- Ultrasonido ............................................. 40 Tabla 3-8. Análisis de varianza para el modelo de regresión simple ............................................... 42 Tabla 3-9. ADEVA de dos factores con una sola muestra por grupo .............................................. 43 Tabla 3-10. Criterios de aceptación.................................................................................................. 44 Tabla 3-11. Materiales y equipos para el método espectroscópico infrarrojo medio ....................... 48 Tabla 3-12. Materiales y Equipos para el Método Ultrasonido........................................................ 48 Tabla 3-13. Materiales y Equipos para el Método Kjeldahl ............................................................. 49 Tabla 4-1. Valores para la prueba de linealidad ............................................................................... 50 Tabla 4-2. Parámetros de linealidad ................................................................................................. 51 Tabla 4-3. Datos de exactitud para la concentración 1.................................................................... 52 Tabla 4-4. Resultados de exactitud para los ocho niveles de concentración .................................... 53 Tabla 4-5. Resultados de recuperación para los 8 niveles de concentración.................................... 54 Tabla 4-6. Análisis de varianza de factores anidados y homogéneos para la concentración 1 ........ 54 Tabla 4-7. Resultados de Sr , SR, CVr y CVR para la concentración 1.......................................... 55 Tabla 4-8. Resultados del valor F para los ocho niveles de concentración ...................................... 55 Tabla 4-9. Resultados de desviaciones estándar de repetibilidad y reproducibilidad para los ocho niveles de concentración .......................................................................................................... 56 Tabla 4-10. Resultados de los coeficientes de variación de repetibilidad y reproducibilidad para los ocho niveles de concentración.................................................................................................. 57 Tabla 4-11. Datos obtenidos de la valoración ácido-base del método Kjeldahl............................... 57 Tabla 4-12. Porcentaje de proteína a partir del método Kjeldahl ..................................................... 58 Tabla 4-13. Resultados de la comparación entre los métodos espectroscópico IR-Kjeldahl ........... 59 Tabla 4-14. Resultados de la comparación entre los métodos espectroscópico IR-ultrasonido ....... 60 Tabla 4-15. Resultados de la comparación entre los métodos espectroscópico IR-Kjeldahl ........... 61 xii Tabla 4-16. Resultados de la comparación entre los métodos espectroscópico IR-ultrasonido ....... 61 Tabla 4.17. Análisis de varianza para el modelo de regresión simple ............................................. 63 Tabla 4-18. Análisis de varianza para el modelo de regresión simple ............................................. 64 Tabla 4-19. Tabla comparativa de parámetros de linealidad ............................................................ 65 Tabla 4-20. Resultados de los análisis de leche por los tres métodos analíticos .............................. 66 Tabla 4-21. Resultados del ADEVA de dos factores con una sola muestra por grupo ................... 66 LISTA DE FIGURAS Figura 2-1. Esquema de validación .................................................................................................. 12 Figura 2-2. Uso de rectas de regresión para comparación de dos métodos analíticos ..................... 14 Figura 2-3. Diferencias entre Precisión y Exactitud......................................................................... 15 Figura 2-4. Espectro electromagnético............................................................................................. 16 Figura 2-5. Vibraciones Moleculares. .............................................................................................. 17 Figura 2-6. Tipos de Vibraciones moleculares ................................................................................. 18 Figura 2-7. Espectrofotómetro de Dispersión .................................................................................. 19 Figura 2-8. Espectrofotómetro por Transformadas de Fourier ......................................................... 20 Figura 2-9. Esquema completo de funcionamiento de un espectrofotómetro infrarrojo por transformadas de Fourier. ......................................................................................................... 20 Figura 2-10. Milko scan FT+ ........................................................................................................... 22 Figura 2-11. Espectro de Frecuencia del Sonido.............................................................................. 23 Figura 2-12. Ekomilk ultra pro......................................................................................................... 27 Figura 2-13. Digestor Kjeldahl......................................................................................................... 29 Figura 2-14. Destilador Kjeldahl ...................................................................................................... 30 Figura 3-1. Curva de linealidad ........................................................................................................ 34 Figura 3-2. Curva de correlación método espectroscópico IR/Kjeldahl .......................................... 41 Figura 3-3. Gráfica de correlación método espectroscópico IR/ultrasonido .................................... 42 Figura 4-1. Curva de linealidad ........................................................................................................ 50 Figura 4-2. Curva de correlación de los métodos espectroscópico IR - Kjeldahl ............................ 62 Figura 4-3. Curva de correlación de los métodos espectroscópico IR - ultrasonido ........................ 63 xiii RESUMEN DOCUMENTAL Debido a la necesidad de contar con valores certificados de proteína que aseguren el pago justo por calidad de la leche y con el fin de que clientes, empresas y centros de acopio regulados por Agrocalidad no se vean perjudicados, se realizó el presente estudio, que consta de una comparación de los tres métodos analíticos utilizados para el análisis de proteína en leche cruda (espectroscópico infrarrojo medio, Kjeldahl y ultrasonido). Previamente se realizó una validación parcial del método infrarrojo que es el más utilizado en el laboratorio por su rapidez y facilidad de uso. Para el proceso de validación parcial del método infrarrojo se usó material de referencia certificado en ocho niveles de concentración (2.86% - 3.80%) y se determinó parámetros de exactitud, recuperabilidad, repetibilidad, reproducibilidad y linealidad. Para el proceso de comparación de los tres métodos analíticos se tomaron muestras de leche recolectadas de la facultad de agronomía de la Universidad Central del Ecuador y se utilizaron las siguientes herramientas estadísticas: prueba t pareada, estadístico F, pruebas de correlación y un ADEVA de dos factores con una sola muestra por grupo. Como conclusión se cumplió con todos los criterios de validación planteados en la investigación para el método infrarrojo espectroscópico medio y como resultado de la comparación de los tres métodos analíticos, se determinó que no existe diferencia significativa entre ellos, es decir, se aceptó la hipótesis nula al 5% en todas las pruebas aplicadas. PALABRAS CLAVES: VALIDACIÓN, INFRARROJO, ULTRASONIDO, KJELDAHL, COMPARACIÓN DE MÉTODOS, HERRAMIENTAS ESTADÍSTICAS. xiv ABSTRACT Due to the need for protein certified values that ensure fair payment for milk quality and in order that customers, businesses and storage facilities regulated by AGROCALIDAD are not adversely affected, this study was conducted comprising a comparison of three analytical methods used for the analysis of protein in raw milk namely: medium infrared spectroscopy, Kjeldahl and ultrasound methods. Before applying the infrared method which is the most widely used in the laboratory for its speed and ease of use, a partial validation was performed. For the partial validation process using the infrared method, certified reference material was used in eight concentration levels (2.86% - 3.80%) to determinate accuracy, recoverability, repeatability, reproducibility and linearity parameters. Milk samples collected from the School of Agronomy of the Central University of Ecuador were used to perform the process of comparison by applying the three analytical methods. Some of the statistical tools used were paired t-test, F-test, correlation test and two-factor analysis of variance ANOVA with a single sample pro group. In conclusion, all validation criteria outlined in the research when applying the medium infrared spectroscopy were met and as a result of the comparison of the three analytical methods, it was determined that there is no significant difference between them. In order words, the null hypothesis of 5% was accepted in all the tests applied. KEYWORDS: VALIDATION, INFRARED, ULTRASOUND, KJELDAHL, COMPARISON OF METHODS, STATISTICAL TOOLS. xv CAPÍTULO 1 1 1.1 INTRODUCCIÓN Planteamiento del problema La Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de Calidad del Agro AGROCALIDAD es una institución de regulación y control de las actividades productivas del agro en el país. Como autoridad nacional una de sus funciones es la regulación del pago por calidad de leche en finca y centros de acopio. El acuerdo ministerial 394 vigente, capítulo IV (seguimiento y control), Artículo 9, menciona que una de las funciones de AGROCALIDAD es controlar, regular y sancionar las distorsiones o irregularidades en la fase de producción primaria de la cadena de leche, con el objetivo de verificar y controlar el pago del precio de sustentación más componentes, calidad higiénica y sanitaria por litro de leche cruda pagado en finca o centro de acopio. (Ministerio de Agricultura, 2013) El Artículo 10 menciona que AGROCALIDAD tiene la obligación de verificar la transparencia, veracidad, correcto funcionamiento y calibración de los equipos utilizados para el análisis de leche cruda, así como la validación de los resultados emitidos por los laboratorios de las industrias, centros de acopio o laboratorios privados. Estos resultados son determinantes ya que permiten el cálculo del precio final del litro de leche mediante la aplicación de la tabla 1-1, la cual muestra que el precio de la leche está determinado por la cantidad de proteína y grasa. El presente estudio se centra en la proteína, variable de importancia para el pago justo por componente de la leche. En el Laboratorio de Control de la Leche de AGROCALIDAD se cuenta con tres métodos para determinación de proteína en leche: infrarrojo espectroscópico medio, el cual es usado por su rapidez y facilidad de uso; ultrasonido, que no se lo usa por desconocimiento de la fiabilidad de sus resultados y finalmente Kjeldahl, que tampoco se lo usa debido al largo tiempo de análisis, a pesar de ser el método oficial de análisis de leche cruda. El laboratorio no cuenta con métodos validados, por lo que en el presente estudio se verificará parámetros de validación de por lo menos un método para el análisis de proteína en leche (solamente uno debido al costo que implica este proceso), siendo el más adecuado el que se basa en la aplicación del espectro de infrarrojo medio, debido a su constante y mayoritario uso, para posteriormente compararlo con los otros dos métodos y así asegurar que los datos reportados con 1 cualquiera de los tres métodos de análisis de proteína no difieran significativamente en sus resultados y no se vea afectado el pago a los clientes. Tabla 1-1. Tabla oficial obligatoria para el pago por calidad de la leche cruda TABLA OFICIAL DE PAGO AL PRODUCTOR MAS CALIDAD PROPUESTA MAGAP PRECIO BASE Base contenido GRASA Base contenido PROTEÍNA Grasa 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3;6 3,7 3,8 3,9 4,0 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 Proteína → 2,80 2,90 0,4155 0,4200 0,4179 0,4224 0,4203 0,4248 0,4227 0,4272 0,4251 0,4296 0,4275 0,4320 0,4299 0,4344 0,4323 0,4368 0,4347 0,4392 0,4371 0,4416 0,4395 0,4440 0,4419 0,4464 0,4443 0,4488 0,4467 0,4512 0,4491 0,4536 0,4515 0,4560 0,4200 INGRESE SU 0,4200 PRECIO $/Kg Grasa $/Kg Proteína 3,00 2,90 3,00 0,4245 0,4269 0,4293 0,4317 0,4341 0,4365 0,4389 0,4413 0,4437 0,4461 0,4485 0,4509 0,4533 0,4557 0,4581 0,4605 3,10 0,4290 0,4314 0,4338 0,4362 0,4386 0,4410 0,4434 0,4458 0,4482 0,4506 0,4530 0,4554 0,4578 0,4602 0,4626 0,4650 3,20 04335 0,4359 0,4383 0,4407 0,4431 0,4455 0,4479 0,4503 0,4527 0,4551 0,4575 0,4599 0,4623 0,4647 0,4671 0,4695 3,30 0,4380 0,4404 0,4428 0,4452 0,4476 0,4500 0,4524 0,4548 0,4572 0,4596 0,4620 0,4644 0,4668 0,4692 0,4716 0,4740 3,40 0,4425 0,4449 0,4473 0,4497 0,4521 0,4545 0,4569 0,4593 0,4617 0,4641 0,4665 0,4689 0,4713 0,4737 0,4761 0,4785 Index % sobre precio de sustentación 2,4 4,5 3,50 0,4470 0,4494 0,4518 0,4542 0,4566 0,4590 0,4614 0,4638 0,4662 0,4686 0,4710 0,4734 0,4758 0,4782 0,4806 0,4830 Por décima % Grasa Por décima % Proteína 3,60 0,4515 0,4539 0,4563 0,4587 0,4611 0,4635 0,4659 0,4683 0,4707 0,4731 0,4755 0,4779 0,4803 0,4827 0,4851 0,4875 3,70 0,4560 0,4584 0,4608 0,4632 0,4656 0,4680 0,4704 0,4728 0,4752 0,4776 0,4800 0,4824 0,4848 0,4872 0,4896 0,4920 3,80 0,4605 0,4629 0,4653 0,4677 0,4701 0,4725 0,4749 0,4773 0,4797 0,4821 0,4845 0,4869 0,4893 0,4917 0,4941 0,4965 0,0024 0,0045 0,5714 1,0714 3,90 0,4650 0,4674 0,4698 0,4722 0,4746 0,4770 0,4794 0,4818 0,4842 0,4866 0,4890 0,4914 0,4938 0,4962 0,4986 0,5010 4,00 0,4695 0,4719 0,4743 0,4767 0,4791 0,4815 0,4839 0,4863 0,4887 0,4911 0,4935 0,4959 0,4983 0,5007 0,5031 0,5055 Tomado de: (Ministerio de Agricultura, 2013) 1.2 Formulación del problema La inexistencia de un estudio comparativo entre los tres métodos de análisis para la determinación de proteína en leche cruda, incide en que el laboratorio de control de calidad de la leche de AGROCALIDAD desconozca la posible existencia de una diferencia significativa entre estos métodos, la misma que puede afectar los resultados emitidos para el pago por calidad de la leche. 1.3 Hipótesis de trabajo (o de investigación) Ho: No existe diferencia significativa entre el método para determinación de proteína espectroscópico infrarrojo medio y los métodos Kjeldahl y ultrasonido. Ha: Existe diferencia significativa entre el método espectroscópico infrarrojo medio y el método Kjeldahl. 2 Existe diferencia significativa entre el método espectroscópico infrarrojo medio y el método ultrasonido. 1.4 Existe diferencia significativa entre los tres métodos de análisis. Objetivos de la investigación 1.4.1 General Realizar un estudio comparativo de tres métodos analíticos para la determinación de proteína en leche cruda. 1.4.2 Específicos Validar parcialmente el método normalizado espectroscópico infrarrojo medio para la determinación de proteína en leche, utilizando los parámetros de exactitud, recuperabilidad, precisión y linealidad. Comparar los métodos espectroscópico infrarrojo medio y Kjeldahl mediante una prueba “t” para datos emparejados, un contraste F y una prueba de correlación. Comparar los métodos espectroscópico infrarrojo medio y ultrasonido mediante una prueba “t” para datos emparejados, un contraste F y una prueba de correlación. Comparar los métodos espectroscópico, Kjeldahl y ultrasonido mediante un ADEVA de dos factores con una sola muestra por grupo 1.5 Importancia y justificación La proteína es uno de los parámetros que se toma en cuenta para el pago justo de la leche, tal como se muestra en la tabla 1.1, además junto con la grasa son buenos indicadores de la calidad del pienso, es decir, si la proteína o la grasa son bajos en la leche indican que el rumen tiene pH bajo y debe ajustarse el pienso. Un estudio comparativo entre los métodos Kjeldahl, ultrasonido y espectroscópico infrarrojo medio, ayudará a conocer si existe o no diferencia significativa entre los dos primeros métodos mencionados frente al infrarrojo, al cual previamente se lo validará parcialmente. Esto tiene directa implicación en conocer si se puede emplear Kjeldahl o ultrasonido además del infrarrojo que es el más utilizado en el laboratorio de control de calidad de la leche de AGROCALIDAD, sin afectar el resultado obtenido y que se puedan ver afectados los clientes. 3 La validación parcial del método espectrofotométrico infrarrojo medio en el equipo MilkoScanTM FT+ es necesaria, en primera instancia, porque debido a su rapidez y facilidad es el método más utilizado en el laboratorio para la determinación de proteína en leche cruda, y también es indispensable para AGROCALIDAD, porque como agencia de regulación y control del pago de la leche, necesita un respaldo que certifique que los valores obtenidos por este método no perjudiquen a ninguna de las partes interesadas. 4 CAPITULO 2 2 2.1 MARCO TEÓRICO Antecedentes Pauta (2015) de la Universidad de Cuenca realizó un estudio sobre la validación de parámetros fisicoquímicos (densidad, grasa, sólidos totales y sólidos no grasos) de la leche, utilizando el equipo MilkoScan FT1 basado en tecnología FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy). Para la validación se analizaron 80 muestras de leche cruda y como material de referencia se utilizó los datos obtenidos por los métodos oficiales de la norma INEN. Para el caso de la linealidad el coeficiente de correlación “r” fue mayor a 0.99 para todos los parámetros fisicoquímicos, cumpliendo así con el criterio de aceptación (r>0.98), también se aplicó pruebas de hipótesis para la pendiente y ordenada, demostrando que existe una linealidad significativa. Para el caso de la exactitud se realizó una prueba t, aceptando la hipótesis nula para todos los parámetros, es decir, el valor calculado de t era menor a su valor tabulado; también se calculó el valor del error absoluto, tomando como criterio de aceptación %Error= ⩽1.5%. La precisión fue determinada a partir de pruebas de Fisher y de los coeficientes de variación de repetibilidad y reproducibilidad. Finalmente para el análisis de robustez, se realizó variaciones de temperatura y se aplicó una prueba t de Student. La validación demostró que el método analítico empleado era lineal, preciso, exacto y robusto en el intervalo de concentraciones estudiadas. (Pauta Zaruma, 2015). Chen et al. (1994) realizaron un estudio comparativo entre un equipo FOSS NIRSystem 6500 y los métodos tradicionales para la determinación de los componentes fisicoquímicos de la leche (grasa, proteína, sólidos totales, lactosa y sólidos no grasos); el pago de la leche viene dado por la cantidad de grasa y proteína, en la investigación se planteo demostrar si el pago de la leche era el mismo con el equipo FOSS y con los métodos convencionales. Para el caso de la proteína el coeficiente de correlación entre el método infrarrojo y el método oficial Kjeldahl fue de 0.97 y una desviación estándar de la curva de 0.08%; para los demás parámetros también se obtuvieron r superiores a 0.9. Con estos datos se demostró que no hay diferencia significativa en el precio de la leche obtenido a partir del método NIRS en comparación con los otros métodos. (Chen, Chen, Chen, & Hsieh, 1994). Ortiz (2008) comparó los resultados de proteína, lactosa y grasa obtenidos por el equipo MilkoScan (basado en tecnología NIRS), de los resultados obtenidos por los métodos tradicionales Kjeldahl, Fehling y Gerber respectivamente. Los análisis para proteína y lactosa presentaron una mayor variación por los métodos tradicionales que por el método infrarrojo, debido a que son métodos 5 basados en la titulación, donde el error humano juega un papel importante; además en el caso de la proteína factores como la destilación, influye puesto que es posible la pérdida de nitrógeno y disminución del valor total proteico. El método Gerber mostró un comportamiento casi lineal, lo cual se explica debido a que es una técnica bastante sencilla donde lo único que se tiene que leer es el porcentaje de grasa en la escala del buritómetro al final de la separación. La desviación estándar de los análisis de proteína y lactosa tanto para el equipo MilkoScan como para los métodos tradicionales no fue significativa; por otra parte la desviación estándar de los resultados de grasa fue menor para la prueba fisicoquímica, lo que implica que esta técnica brinda resultados bastante confiables. (Ortiz Ramírez, 2009) López (2001) realizó una investigación sobre calibración de un instrumento NIR, SY –3650-II, el cual es un analizador versátil de alimentos basado en tecnología de infrarrojo cercano. Posterior a la calibración se comparó los datos obtenidos por el equipo NIR y por los métodos tradicionales, además se realizó un análisis de costos de los mismos. Para la calibración se utilizaron 120 muestras de leche, los parámetros fueron grasa, proteína, humedad y azúcares. Para la regresión se usó el modelo de cuadrados mínimos, una vez recolectados los 120 espectros para calibración y obtenidos los valores de referencia de los métodos de laboratorio tradicionales se desarrolló la curva de calibración obteniéndose un R2 de 0.9740 para proteína; un R2 de 0.9894 para grasa; un R2 de 0.9423 para azúcares, un R2 de 0.9673 para humedad. Para el proceso de comparación se analizaron 30 muestras por los métodos tradicionales de laboratorio y por el instrumento NIR y se empleó una prueba estadística t de medias emparejadas. Para proteína, humedad y azúcares se obtuvieron valores de t iguales a 2.57, 2.31 y 1.82, puesto que estos valores son menores al valor tabulado de t, se aceptó la hipótesis nula al 99% y no se determinó diferencia significativa entre el valor obtenido por el equipo NIR y el valor de los métodos tradicionales. Para la grasa el valor de t calculado de 3.48 fue mayor al tabulado por lo que se rechazó la hipótesis nula y se determinó la existencia de diferencia significativa. En cuanto a los costos usando métodos convencionales, el costo de analizar proteína, humedad y azúcares es de 13.2, 2.17 y 6.8 dólares, respectivamente, en cambio usando NIR el costo por componente es de 5.5 dólares. (López Bautista, 2001) Zafra (2014) estableció criterios de comparación entre los espectros obtenidos por un espectrofotómetro portátil MicroPRAZIR con tecnología NIRS (Near infrared spectroscopy) y un equipo de referencia FOSS NIRSystem 6500 at-line, el cual habían previamente comprobado su robustez. En el experimento se analizaron 24 muestras de leche previamente calentadas a 40°C y homogenizadas; los resultados de los análisis revelaron que los dos equipos generaron espectros paralelos obteniendo picos característicos comunes con los dos modos de análisis NIRS. (Zafra, 2014) 6 2.2 Fundamento Teórico 2.2.1 La leche La leche es el producto de la secreción mamaria normal de animales bovinos lecheros sanos, obtenida mediante uno o más ordeños diarios, higiénicos, completos e ininterrumpidos, sin ningún tipo de adición o extracción, destinada a un tratamiento posterior previo a su consumo. (INEN, 2015) Los constituyentes mayoritarios de la leche de vaca son la proteína, lactosa, grasa y sólidos totales; la leche difiere en su composición dependiendo de algunos factores como: especie, raza, ordeño, tiempo de ordeño, periodo de lactancia, estado nutricional, composición del alimento, estaciones del año, temperaturas ambientales, edad, salud de la ubre, enfermedades en general, cambio de sistema de ordeño, ejercicio, hormonas, medicamentos, genética, etc. (Munguía Ortega, 2010) La leche es un producto inestable y perecedero que se altera rápidamente, sobre todo por la contaminación microbiana. Es un alimento complejo que consta de tres fases: una acuosa que tiene sales, azúcares, proteínas, vitaminas y aminoácidos disueltos; otra sólida, en estado coloidal, formada por proteínas complejas, fostatos y otras sales insolubles de calcio y por último una fase lipídica emulsionada, formada por grasas, esteroles y vitaminas liposolubles. Su color blanco se debe a la dispersión de la luz que generan las partículas coloidales, y también es ligeramente amarilla por los carotenoides, vitamina A y lactoflavina. Su densidad varía alrededor de 1,035, dependiendo del contenido de grasa y su pH es cercano a las neutralidad, alrededor de 6,6. A continuación se detalla la composición y los métodos analíticos de determinación de la proteína en leche. 2.2.1.1 Proteínas de la leche La leche tiene proteínas de alto valor biológico, aproximadamente 90% con respecto a FAO, los aminoácidos que se encuentran ligeramente deficientes son los azufrados (metionina+cisteína). Las proteínas de la leche son de dos tipos: la caseína, en suspensión coloidal, y las del suero, principalmente la lactoglobulina y la lactalbúmina; la caseína constituye aproximadamente el 80% del total de proteínas de la leche y las disueltas en el suero el 20% restante. La caseína de la leche es un complejo de fosfoproteínas y glicoproteínas que está en forma de suspensión coloidal, en micelas estabilizadas, que coagulan en medio de ácidos débiles, alcohol y 7 por la adición de enzimas de origen animal o microbiano. Las micelas proteicas tienen una estructura compleja, forman un núcleo hidrófobo y una superficie polar e hidrófila que estabiliza la suspensión coloidal. Las micelas tienen un tamaño comprendido entre 50 y 300 nm de diámetro; en un litro de leche hay alrededor de mil billones de micelas. Cada una de ellas es un gel hidratado permeable, con 2/3 de agua y 1/3 de caseína. Por otro lado la lactoglubulina y la lactalbúmina precipitan a 100°C y pH 4,5; están más equilibradas en aminoácidos esenciales que la caseína y su valor biológico es mayor. (Primo Yúfera, 1998) 2.2.1.2 Métodos de análisis de proteína La norma técnica ecuatoriana para el análisis de proteína en leche cruda es la NTE INEN 16, en ella se indica que el método oficial para determinación de nitrógeno total es Kjeldahl, el valor resultante de este análisis debe ser multiplicado por un factor de conversión nitrógeno-proteína (6.38 para la leche) para obtener el valor de proteína. Por otro lado la AOAC tiene establecido tres métodos oficiales para la determinación de proteína en leche: Kjeldahl, dye binding y espectroscópico infrarrojo medio. El método dye binding se caracteriza por la formación de un coágulo de proteína coloreado e insoluble producto de la reacción de la proteína con una solución coloreada de ácido sulfónico a pH 2, el coágulo se separa por filtración y se mide colorimétricamente el exceso de tintura en el sobrenadante, esta medida se relaciona con el contenido de proteína. Para el caso del método espectroscópico infrarrojo medio la normativa AOAC hace referencia al calibrado previo que se debe hacer con muestras analizadas por métodos tradicionales y posteriormente seguir con las instrucciones del fabricante. Los métodos utilizados en esta investigación son el espectroscópico infrarrojo medio, Kjeldahl y ultrasonido, los mismos que son descritos a profundidad en la sección 2.2.4, 2.2.5 y 2.2.6. 2.2.2 Validación Existen varias definiciones de validación, entre las cuales se va a citar a tres: 1) según la guía de validación de la OAE: “Validación es la confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos del método para una utilización o aplicación específica prevista” (OAE, 2011). 2) citada por la norma ISO 17025: “La validación es la confirmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto” (ISO, 2005). 3) de acuerdo al manual del EURACHEM: “La validación de un método es el proceso de definir una necesidad analítica y 8 confirmar que el método en cuestión tiene capacidades de desempeño consistentes con las que requiere la aplicación” (Eurachem, 2005). Estas tres definiciones mencionadas permiten concluir que una validación busca confirmar que un método sea adecuado o apto al propósito para el cual fue diseñado. 2.2.2.1 Requisitos de una validación Cabe mencionar que existen requisitos implícitos para la validación de un método en cuanto a personal y a equipo de trabajo, es decir: Los equipos que se van a requerir para la validación deben estar funcionando correctamente y estar a su vez calibrados. El personal debe ser técnicamente competente en el campo requerido (Eurachem, 2005). 2.2.2.2 Importancia de la validación de un método Además del costo que el cliente paga al laboratorio para obtener un análisis confiable, en base al resultado analítico de una medición, el cliente toma decisiones. Por ejemplo, en el caso del análisis de proteína en leche, el resultado que se entregue tiene consecuencia en el costo que se va a pagar al dueño de la finca o centro de acopio; ya que en este caso, mientras más contenido de proteína tenga la leche mayor será su precio, es decir, el resultado entregado debe ser correcto para evitar perjudicar o favorecer a la persona en cuestión. La validación permite que el resultado entregado sea correcto, es decir, adecuado a su propósito y brinda al cliente la confianza para tomar una decisión en base al resultado obtenido. (Eurachem, 2005). 2.2.2.3 Grado de validación El laboratorio, de acuerdo a sus necesidades y a los protocolos de validación, debe decidir cuáles serán los parámetros de validación que se analicen, estas necesidades toman en cuenta al cliente, la experiencia existente sobre el método y la necesidad de compatibilidad con otros métodos similares que ya estén en uso dentro del laboratorio o en otros laboratorios. Cuando un método ha sido validado por una organización de aprobación de normas (por ejemplo la AOAC), como es el caso de la presente investigación, en la cual el método utilizado para determinación de proteína en leche es el AOAC Método Oficial 972.16, el laboratorio puede 9 solamente establecer datos de desempeño del método para su propio uso, o también denominada validación parcial. (Eurachem, 2005) 2.2.2.4 Alcance de la validación Para establecer los parámetros de validación que se van a verificar, se puede observar la tabla 2-1, la cual indica el parámetro que necesita ser validado en función del tipo de método utilizado. Tabla 2-1. Alcance de la validación b c d e Gravimétrica Física Intervalo lineal y de trabajo Si Si Si a a Límite de detección Si Si No a a Límite de cuantificación Si Si Sia Recuperación Si Si No Exactitud Si Si Si Repetibilidad Si Si Si Reproducibilidad Si Si Si d d Sensibilidad Si Si Sid,e Selectividad Sid Sid Sid,e Robustez Sid Sid Sid a solo para análisis a nivel de trazas Volumétrica Potenciométrica Cromatográfica Parámetros de validación Espectrofotométrica Tipo de prueba Si No Sia Si Si Si Si Sie Si Sid Si No Sia Si Si Si Si Sid Si Sid No Sib No No No Sic Sic No Sib Sid solo para métodos cualitativos solo para métodos cuantitativos solo para métodos no normalizados solo para análisis de aniones o cationes por ión selectivo Tomado de: (COFEPRIS, 2011) Intervalo lineal y de trabajo: Intervalo de las concentraciones analíticas o los valores de las propiedades sobre las cuales el método va a ser aplicado. Dentro del intervalo de trabajo puede existir un intervalo de respuesta lineal, en el que, la señal de respuesta sistema de medición tendrá una relación lineal con la concentración del analito o el valor de la propiedad. (OAE, 2011) 10 Límite de detección: Es la menor concentración del analito en una muestra que puede detectarse, pero no necesariamente cuantificarse bajo las condiciones establecidas de la prueba. (Eurachem, 2005) Límite de cuantificación: Es el contenido igual o mayor que el menor punto de concentración en la curva de calibración. (Eurachem, 2005) Recuperación: La recuperación es el cociente entre la cantidad de analito medida y el contenido en la muestra. En el caso ideal, se obtiene un 100%. En mediciones experimentales puede perderse analito especialmente en el caso de tratamientos complejos de muestras con analito en cantidades traza, dando lugar a porcentajes de recuperación menores (importante especialmente en el caso de procedimientos cromatográficos). (OAE, 2011) Exactitud: Es la proximidad de concordancia entre el resultado de una medición y el valor de referencia aceptado. (Eurachem, 2005) Repetibilidad: Precisión en condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones según las cuales los resultados independientes de una prueba se obtienen con el mismo método, sobre objetos de prueba idénticos, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, usando el mismo equipo y dentro de intervalos de tiempo cortos. (OAE, 2011) Límite de repetibilidad “r”: El valor menor o igual a aquél de la diferencia absoluta entre dos resultados de prueba individuales, obtenidos bajo condiciones de repetibilidad, el cual se espera con una probabilidad de 95%. (Eurachem, 2005) Precisión Intermedia: La precisión intermedia expresa la variación dentro de un laboratorio en: diferentes días, diferentes analistas, diferente equipo, etc. (Eurachem, 2005) Reproducibilidad: Precisión bajo condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones según las cuales los resultados de prueba se obtienen con el mismo método, sobre objetos de prueba idénticos, en diferentes laboratorios, por diferentes operadores, usando diferentes equipos. (OAE, 2011) Límite de reproducibilidad “R”: El valor menor o igual a aquél de la diferencia absoluta entre dos resultados de prueba individuales, obtenidos bajo condiciones de reproducibilidad, el cual se espera con una probabilidad de 95%. (Eurachem, 2005) CVGTRD Sensibilidad: El cambio en la respuesta de un instrumento de medición dividido por el correspondiente cambio del estímulo. (OAE, 2011) Selectividad: La capacidad de un método para determinar exactamente y específicamente el analito de interés en presencia de otros componentes en una matriz de muestra bajo las condiciones de prueba establecidas. (OAE, 2011) Robustez: Capacidad de un procedimiento analítico de no ser afectado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método, provee una indicación de su confiabilidad en condiciones de uso normales. (OAE, 2011) 11 2.2.2.5 Esquema de validación Cuando se tiene la necesidad de resolver un problema analítico, el laboratorio debe evaluar si los métodos existentes pueden solventar esta necesidad o en caso contrario se plantea el diseño de un nuevo método. La figura 2-1 plantea las preguntas que permitirán mediante una evaluación confirmar que el método es el adecuado a su propósito, concepto que anteriormente se definió como validación. (Eurachem, 2005) Figura 2-1. Esquema de validación Tomado de: (Eurachem, 2005) 2.2.3 Comparación entre métodos Para la comparación de métodos analíticos se utilizan los denominados contrastes de significación, los cuales permiten conocer si existe una diferencia significativa entre la cantidad de analito obtenida por un método analítico y la cantidad conocida de un patrón, es decir, se contrasta estos resultados. Los contrastes de significación dan respuestas a las siguientes preguntas: ¿Qué seguridad existe de que el valor experimental obtenido está próximo al valor real? , ¿Qué seguridad hay de que el valor obtenido es igual (o diferente) a otros valores hallados en el análisis de la misma muestra, o a los valores hallados por otra persona en otro momento? (Miller & Miller, Estadística y Quimiometría para Química Analítica , 2002) 12 2.2.3.1 Contraste t para datos emparejados Para la comparación entre dos métodos de análisis y conocer si estos producen resultados significativamente diferentes, es conveniente el uso del contraste “t” para datos emparejados. Esta prueba se utiliza para comparar medias y, por lo tanto, ayuda en la detección de errores sistemáticos, además es adecuada debido a que toma en cuenta la variación debida al método y separa la variación que existe entre cada lote de leche. 2.2.3.2 Prueba F de Fisher La prueba F de Fisher es un contraste de significación que compara las desviaciones estándar de dos conjuntos de datos, es decir, los errores aleatorios. Es usada para determinar si la diferencia entre dos varianzas muestrales es significativa, dicho de otra manera para probar si un método analítico A es más preciso que B (una cola) o si los métodos A y B difieren en su precisión (dos colas). El contraste F considera la razón de los cuadrados de las desviaciones estándar y 2.2.3.3 Rectas de regresión para la comparación de métodos analíticos El uso de gráficas de correlación entre dos métodos es usado cuando hay un intervalo de concentraciones. En el eje x debe representarse el método más preciso (de referencia), ya que la recta de regresión, se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los valores de x (ya que se supone que todos los errores ocurren en la dirección y). La gráfica de correlación es útil cuando se quiere comparar un nuevo método con uno de referencia y la pregunta sería: ¿el nuevo método proporciona resultados significativamente más altos o bajos que el método estándar?, este gráfico ayuda a la determinación de errores sistemáticos. Para obtener una curva de regresión confiable también se debe tener un número razonables de puntos (al menos 10) cubriendo uniformemente el intervalo de concentraciones de interés. Para realizar la correlación se deben calcular (ayudándose de Excel) el valor del coeficiente de correlación, la pendiente y ordenada al origen, cada una de ellas con sus límites de confianza. Cada punto en el gráfico representa una muestra única analizada por los dos métodos. Si el resultado para el análisis de la muestra es el mismo para los dos métodos, se obtendrá una curva con ordenada al origen igual a cero, y una pendiente y coeficiente de correlación igual a uno. Sin embargo aunque se esté libre de errores sistemáticos, los errores aleatorios limitan a que se tenga esos resultados deseados. La figura 2-2 presenta los posibles casos que adopta el analito cuando los métodos por los cuales fue analizado se comparan a diferentes concentraciones. 13 Figura 2-2. Uso de rectas de regresión para comparación de dos métodos analíticos Tomado de: (Miller & Miller, 2002) El caso (a) es el ideal (ordenada al origen b=0, pendiente a y coeficiente de correlación r=1). En la curva (b) la ordenada al origen no es cero, en este caso un método de análisis puede conducir a un resultado más alto o más bajo que el otro en una cantidad fija, esto podría ocurrir si la señal de fondo de uno de los métodos se hubiera calculado erróneamente. Otro posible caso es tener pendiente >1 ó <1, gráfica (c), lo cual indica que puede darse un error sistemático en la pendiente de una de las gráficas de calibrado individuales. Si los dos errores (b) y (c) ocurren simultáneamente se presenta el caso (d). En la curva (e) se manifiestan otros tipos posibles de error sistemático. Finalmente en el caso (f) puede surgir cuando un analito se encuentra en dos formas químicas distintas, el método del eje y podría detectar sólo una forma de analito, mientras que el segundo método detecta ambas formas. (Miller & Miller, Estadística y Quimiometría para Química Analítica, 2002) 2.2.3.4 Análisis de Varianza El análisis de varianza (ADEVA) es una herramienta muy utilizada en el análisis de datos de diseños experimentales. Es usada cuando se quiere contrastar más de dos medias. Un ejemplo posible sería la comparación de los resultados medios obtenidos de la concentración de un analito utilizando varios métodos. En estos casos hay dos fuentes de variación, la primera corresponde al error aleatorio y siempre está presente y la segunda se conoce como factor controlado y en el ejemplo correspondería a los métodos de análisis empleados. 14 El ADEVA separa y estima las diferentes fuentes de variación, es decir, el error aleatorio del error provocado al cambiar de método. De esta manera se puede contrastar si una alteración en el factor de control produce una diferencia significativa entre los valores medios obtenidos. 2.2.3.5 Precisión, exactitud y errores Como ya se mencionó anteriormente la precisión es una medida de la dispersión de los datos, en cambio la exactitud mide la distancia entre el valor real del analito y el valor medio de los resultados. En la figura 2-3 se explica estos dos términos suponiendo 4 casos posibles: En el primer caso todos los datos están agrupados, es decir, su dispersión es baja por lo tanto hay una alta precisión, además el valor medio de estos datos está muy cercano al valor real por lo cual tiene exactitud alta. En el segundo caso los datos son precisos, pero tienen una baja exactitud debido a que la media está muy lejana del valor real. En el tercer y cuarto caso la precisión es baja, existe una gran dispersión de los datos, pese a eso la exactitud en el cuarto caso es alta debido a que la media de los resultados está cercana al valor real. (Rubinson & Rubinson, 2001) El origen de la alta dispersión y baja exactitud está en los errores. Existen errores aleatorios y sistemáticos. El error sistemático se origina por una causa fija, también se lo denomina error determinado. Los errores aleatorios en cambio tienen su origen en causas arbitrarias o indeterminadas y son aquellos que afectan a la precisión. En resumen, la precisión describe errores aleatorios, el sesgo describe errores sistemáticos, y la exactitud debido a que puede ser obtenida de un resultado promedio incorpora ambos tipos de error. (Miller & Miller, Estadística y Quimiometría para Química Analítica, 2002) Figura 2-3. Diferencias entre Precisión y Exactitud Tomado de: (Rubinson & Rubinson, 2001) 15 2.2.4 Espectroscopia infrarroja por transformadas de Fourier Para comprender el funcionamiento del espectrofotómetro infrarrojo por transformadas de Fourier es necesario revisar previamente los fundamentos de la espectroscopia infrarroja, la misma que consiste en hacer pasar un haz de radiación electromagnética a través de materia. Una vez que ha ocurrido esta interacción radiación y materia el haz de luz infrarroja saliente va a diferir del haz entrante debido a la absorción molecular. La espectrometría infrarroja es una técnica no destructiva y que requiere de una cantidad pequeña de muestra para el análisis. Esta técnica proporciona información de los grupos funcionales presentes y también la cuantificación de los mismos. Para cada molécula existe un espectro infrarrojo, es decir, es como una huella dactilar. (Wade, 2004) (Skoog, Holler, & Nieman, 2001) La luz infrarroja es radiación electromagnética, como se puede observar en la figura 2-4 las frecuencias del infrarrojo se encuentran por debajo del visible y por encima de la radiación del microondas. (Wade, 2004) Figura 2-4. Espectro electromagnético Tomado de: (Wade, 2004) El espectro infrarrojo se divide en tres regiones: infrarrojo cercano, medio y lejano (Skoog, Holler, & Nieman, 2001). Los límites de cada una de ellas se muestran en la tabla 2-2. Tabla 2-2 Regiones del espectro infrarrojo. Tomado de: (Skoog, Holler, & Nieman, 2001) 16 En los años 80 se utilizaban con mayor frecuencia los espectrofotómetros infrarrojos del tipo dispersivo, para el análisis orgánico cualitativo y determinación de estructuras de compuestos; sin embargo en la actualidad la mayoría de los instrumentos son del tipo de transformadas de Fourier para análisis cuantitativo de muestras complejas, como en la presente investigación que se analizó proteína en leche. (Skoog, Holler, & Nieman, 2001) 2.2.4.1 Vibraciones moleculares Para comprender como vibran las moléculas se puede observar la figura 2-5. Entre dos átomos unidos mediante un enlace covalente, este último actúa como un muelle o resorte, si el enlace se alarga existe una fuerza que hace que los átomos se junten hasta lograr la longitud de onda de equilibrio, por el contrario si el enlace se comprime, esta fuerza que busca el equilibrio hace que los átomos se separen. Cuando el enlace se comprime o se alarga, y posteriormente se lo deja en libertad, los átomos vibran. (Wade, 2004) La frecuencia de vibración en una molécula depende de la masa de los átomos y de la rigidez del enlace. Los átomos más pesados vibran a frecuencias más bajas y los enlaces más rígidos (que son más fuertes) vibran a frecuencias más altas. (Wade, 2004) Figura 2-5. Vibraciones Moleculares. Tomado de: (Wade, 2004) 2.2.4.2 Tipos de vibraciones moleculares Existen dos categorías de vibraciones: estiramiento (tensión) y de flexión 1. Vibraciones de estiramiento: son aquellas en las que los átomos de un enlace oscilan alargando y acortando la distancia del mismo, sin modificar el eje ni el ángulo de enlace. Estas vibraciones son de dos tipos: simétrica y asimétrica. 17 2. Vibración de flexión: en este caso existe un cambio en el ángulo entre dos enlaces y son de cuatro tipos: de tijereteo, de balanceo, de aleteo y de torsión. Para una molécula que está compuesta de más de dos átomos, son posibles todos los tipos de vibraciones indicados anteriormente, en la figura 2-6 se muestran estos tipos de vibraciones: (Skoog, Holler, & Nieman, 2001) Figura 2-6. Tipos de Vibraciones moleculares Tomado de: (Wade, 2004) Cada forma en la cual una molécula puede vibrar se llama modo normal de vibración. El número de posibles modos de vibración que una molécula puede tener están determinados por el número de átomos que la componen, para las moléculas no lineales es 3N-6 y para las lineales son 3N-5. 2.2.4.3 Absorción de la radiación infrarroja No todas las moléculas absorben radiación infrarroja. Para hacerlo, una molécula debe sufrir un cambio en el momento dipolar (el momento dipolar está determinado por la magnitud de la diferencia de carga y por la distancia entre dos átomos). El ácido clorhídrico H-Cl es un buen ejemplo de molécula con momento dipolar; esta molécula vibra naturalmente, produciendo una constante variación en el momento dipolar, lo que origina un campo que puede interaccionar con el campo eléctrico de la radiación. Si la frecuencia de la radiación coincide exactamente con la frecuencia de vibración natural de la molécula, tiene lugar la absorción de la radiación. 18 En resumen, una molécula sólo absorbe radiación infrarroja cuando su momento dipolar interacciona con el campo eléctrico; este acoplamiento es posible si las frecuencias de radiación y vibración de enlace coinciden. Las moléculas apolares como el N2 o el O2 no absorben en el infrarrojo. (Skoog, Holler, & Nieman, 2001) 2.2.4.4 Espectrofotómetros de infrarrojo Estos instrumentos miden las frecuencias de la luz infrarroja que son absorbidas por un compuesto. Existen dos tipos de espectrofotómetros: los de dispersión y por transformadas de Fourier. Un espectrofotómetro infrarrojo de dispersión (figura 2-7) lleva este nombre porque dispersa la luz en todas sus diferentes frecuencias y mide las frecuencias individualmente; consta de dos haces de luz, un haz que pasa por la celda de la muestra y otro haz que pasa por la celda de referencia que contiene el disolvente o nada, este haz compensa cualquier absorción debida al aire o al disolvente. Consta también de un monocromador, el cual utiliza prismas o rejillas de difracción que hace que solo entre una frecuencia de luz, cada vez, en el detector. Como cada vez, sólo se observa una frecuencia, se necesita de 2 a 10 minutos para explorar y hacer un barrido de todo el espectro. (Wade, 2004) Figura 2-7. Espectrofotómetro de Dispersión Tomado de: (Wade, 2004) Un espectrofotómetro por transformadas de Fourier (figura 2-8) utiliza un interferómetro para medir el espectro. La luz infrarroja va desde la fuente incandescente hasta un separador de haz luminoso. Parte de la luz atraviesa el separador y parte es reflejada con un ángulo de 90°. La luz reflejada incide sobre un espejo estacionario, mientras que la trasmitida incide sobre un espejo que se mueve a velocidad constante. Los rayos retornan de los espejos para recombinarse en el separador, los rayos del espejo móvil han recorrido una distancia diferente a la que recorren los rayos del espejo fijo, esto hace que al combinarse creen un modelo de interferencia denominado 19 interferograma que contiene simultáneamente todas las frecuencias pero desfasadas unas de otras una fracción de segundo. Este interferograma pasa por el compartimiento de la muestra para alcanzar el detector. Debido a que este instrumento mide todas las frecuencias simultáneamente en lugar de explorarlas individualmente como el espectrofotómetro dispersivo, el tiempo de análisis se reduce entre 1 y 2 segundos. (Wade, 2004) Figura 2-8. Espectrofotómetro por Transformadas de Fourier Tomado de: (Wade, 2004) El interferograma resultante no puede ser interpretado directamente, así que para ello se ocupa una técnica matemática llamada trasformadas de Fourier, esta transformación se lleva a cabo por el ordenador y logra transformar el interferograma en un espectro infrarrojo normal, ver figura 2-9. Figura 2-9. Esquema completo de funcionamiento de un espectrofotómetro infrarrojo por transformadas de Fourier. 20 2.2.4.5 Milkoscan FT+ La marca comercial del espectrofotómetro infrarrojo por transformadas de Fourier con el cual se trabajó es MilkoScan FT+. Este es un analizador de leche completamente automático de alta capacidad (cumple con lo establecido por la IDF y la AOAC) y fue específicamente diseñado para el pago por calidad de la leche y control lechero. Trabaja con la zona media del espectro infrarrojo y para el caso de la proteína, la absorción se debe a los tipos de vibraciones moleculares de los péptidos. El grupo peptídico produce hasta 9 bandas características llamadas A,B,I,II, III, IV, V, VI y VII. Las bandas Amida I y Amida II son las dos principales bandas de los espectros IR de proteínas, en la figura 2-3 se puede observar el tipo de banda, su frecuencia y a la vibración del enlace que corresponde. (Mayorga, 2014) Tabla 2-3. Tipos de vibraciones de la molécula de proteína Tomado de: (Mayorga, 2014) El equipo MilkoScan FT+ predice la composición química de una muestra realizando previamente una calibración, para lo cual se necesita contar con un conjunto amplio de muestras representativas, colectar los espectros, analizar las muestras mediante un método de referencia, en este caso un método de referencia es Kjeldahl y realizar las curvas de calibración mediante una regresión lineal, procurando una pendiente muy cercana a 1 y un intercepto cercano a 0. (Jiménez, 2007) Las calibraciones del MilkoScan se basan en la amplia base de datos que FOSS ha ido creando a lo largo de más de 15 años. Para determinar la proteína de la muestra desconocida se compara su espectro con los espectros de la base de datos, y la predicción se basa en los espectros que más se parecen al espectro de la muestra desconocida. La única ventaja de las calibraciones es que las 21 actualizaciones son directas. Las nuevas muestras simplemente se incorporan a la base de datos. (FOSS, 2015) Figura 2-10. Milko scan FT+ 2.2.5 Ultrasonido El ultrasonido es una tecnología innovadora, la cual en este siglo ha ido emergiendo de acuerdo a las nuevas necesidades de la población; se puede definir al ultrasonido como ondas sonoras no perceptible por el oído humano. Para que existan ondas sonoras debe haber perturbaciones o vibraciones en algún medio, por ejemplo al aplaudir o al golpear un diapasón. Los medios de propagación de las ondas sonoras son sólidos, líquidos o gaseosos. Sin un medio no puede haber sonido, es por esta razón que en el espacio exterior como en el vacío solo hay silencio. En gases y líquidos estas ondas son longitudinales y en medio sólido pueden ser longitudinales como transversales, ya que en un componente sólido las acciones intermoleculares son más fuerte que en fluidos. El ultrasonido se encuentra en frecuencias superiores a 20KHz e incluso llega a los GHz, siendo el límite superior aproximadamente de 1GHz, por debajo de estas frecuencias se encuentra la región audible que es percibida por el humano y va desde los 20KHz hasta los 20 Hz, después de esta región se encuentra la zona infrasónica con frecuencias menores a 20 Hz, ver figura 2-11. (Wilson, Buffa, & Lou, 2007) 22 Figura 2-11. Espectro de Frecuencia del Sonido Tomado de: (Wilson, Buffa, & Lou, 2007) El ultrasonido en una técnica no destructiva y en el caso de la presente investigación se usa para conocer la composición de la leche. El análisis de composición de una matriz mediante ultrasonido se basa en el siguiente principio físico: el movimiento de una onda acústica; sabiendo que la onda acústica es afectada por el medio a través del cual viaja. Conociendo la trayectoria de propagación de las ondas sonoras, se conoce el comportamiento que tuvieron mientras se propagaban en el interior de la muestra, de esta forma las ondas se reflejarán o transmitirán según reglas conocidas. (Pineda, y otros, 2009) 2.2.5.1 Relación del ultrasonido con las propiedades de una matriz Para entender cómo se puede caracterizar un material mediante la aplicación de la técnica ultrasónica (Santos, Cancino, Yenque, Ramírez, & Palomino, 2005), se presentan a continuación los siguientes conceptos: Velocidad ultrasónica: La velocidad del sonido es usualmente el parámetro ultrasónico más fácil de medir, en un medio homogéneo está directamente relacionado con el módulo de elasticidad, densidad del material, módulo de Poisson y el grado de homogeneidad. Frecuencia: Todos los materiales tienden a actuar hasta cierto punto como un filtro al paso de la onda, atenuando o dispersándolo. Las ondas del sonido oscilan a una frecuencia específica, esto es, número de vibraciones o ciclos por segundo. 23 Atenuación: Es la reducción del nivel de una señal, cuando pasa a través de un elemento; la intensidad de la energía aplicada disminuye con el espesor del material, siendo amortiguada en tasas diferentes según el tipo de material, la amortiguación se debe a los efectos interactivos de la densidad, dureza, viscosidad y estructura molecular. La atenuación en un material dado, normalmente aumenta con la frecuencia y se mide en decibeles. Amplitud: Es la distancia máxima entre el punto más alejado de una onda y el punto de equilibrio o medio Impedancia: Es la resistencia que opone un medio a las ondas que se propagan en él. Se puede caracterizar a las ondas de ultrasonido en función de su amplitud y frecuencia, estos dos parámetros son definidos por el investigador y se controlan mediante el generador de onda con el cual se trabaje. Por otro lado existen parámetros que dependen de las propiedades físicas de la matriz que se va a estar expuesta a la onda sonora. Estos parámetros son: la velocidad ultrasónica, el coeficiente de atenuación y la impedancia acústica. Por lo tanto la medición de estos parámetros nos dará información de cambios en la estructura, composición o estado físico de los materiales. (González Martínez) Por ejemplo, la velocidad de las ondas sonoras que se desplazan por un material, es función de la densidad y del módulo de elasticidad y estos son propiedades físicas que dependen de la estructura, composición y estado físico del material, es posible entonces utilizar la medida de velocidad ultrasónica para obtener información de las propiedades físicas del material. Por otro lado el coeficiente de atenuación puede ser utilizado para caracterizar las propiedades físicas de materiales, ya que la atenuación es causada principalmente por adsorción y por dispersión, fenómenos que dependen de propiedades físicas del material como la viscosidad, concentración, conductividad térmica, relajación moléculas y homogeneidad de mismo. Finalmente, la impedancia acústica depende de la composición y microestructura del material, y como en los casos anteriores, la medida de este parámetro puede brindar información de las propiedades físicas de la matriz estudiada. (González Martínez) El ultrasonido son ondas mecánicas sonoras de alta frecuencia, originadas por la vibración de un cuerpo elástico y propagadas en un medio material (en este caso la leche), con el fin de determinar la composición de la misma. (Pineda, y otros, 2009). Para la generación de una onda ultrasónica se utiliza un transductor piezoeléctrico, el mismo que, convierte las señales eléctricas en señales sonoras y viceversa. Luego la señal es emitida, amplificada y analizada con instrumentación comercial. (Santos, Cancino, Yenque, Ramírez, & Palomino, 2005) 24 2.2.5.2 Tipos de ondas ultrasónicas Las ondas de ultrasonido pueden dividirse en dos tipos: de alta frecuencia y de baja frecuencia. (González Martínez) 2.2.5.2.1 Ultrasonido de alta frecuencia O también llamado de baja intensidad, en este tipo de ultrasonido las ondas son “no destructivas”, es decir, no causan alteraciones físicas o químicas en la matriz analizada. Esta técnica aparte de ser no destructiva, es no invasiva y rápida. Entre las aplicaciones tenemos las siguientes: Composición de un alimento: como por ejemplo la determinación de proteína en leche. También se puede medir el cambio de la composición de un alimento mediante el cambio de la velocidad ultrasónica. Por ejemplo, la velocidad ultrasónica en una solución de azúcar se incrementa aproximadamente 4ms-1 por cada 1% de incremento en la concentración. Determinación de tamaños de partícula: En un sistema disperso como una suspensión, espuma o emulsión; si una onda ultrasónica incide, se va dispersando de acuerdo al tamaño y composición de las partículas del sistema coloidal. El grado de dispersión de la onda se encuentra relacionado con el coeficiente de atenuación y la velocidad ultrasónica, por lo tanto se puede obtener información acerca del tamaño de la partícula. Medida del espesor de materiales: Se basa en la medición del tiempo gastado por un pulso de ultrasonido en viajar a través de una muestra y ser reflejado nuevamente hasta el transductor. Con esta técnica se puede medir el espesor del recubrimiento de chocolates en confitería, capas de grasa en tejidos musculares y cáscaras de huevos entre otros. Detección de materia extraña: En la industria de alimentos se puede encontrar materiales extraños y peligrosos como metal, vidrio o madera. Estos pueden ser detectados debido a que su impedancia acústica es mucho mayor a la del alimento. 2.2.5.2.2 Ultrasonido de baja frecuencia También conocido como ultrasonido de alta intensidad, utiliza niveles de potencia más altos que el ultrasonido de alta frecuencia, lo que genera que se alteren propiedades físicas y químicas del material que se analiza, debido a que se generan elevados gradientes de presión, temperatura y corte dentro del material. 25 En la industria de alimentos esta técnica no tiene mucha aplicación, una de las pocas aplicaciones se basa en el efecto físico, mecánico y químico que causan sobre el alimento estas ondas, lo que provoca fenómenos como el rompimiento celular, la des-gasificación de líquidos, homogenización de emulsiones y la dispersión de materiales agregados, etc. Otros ejemplos se mencionan a continuación: Aceleración de reacciones: Esta técnica de alta intensidad genera radicales libres que producen oxidación en bebidas alcohólicas, el ultrasonido genera también erosión en las partículas suspendidas de un líquido lo que puede hacer que algunos componentes de estas partículas que puedan acelerar reacciones se expongan Inhibición de microorganismos y enzimática: Enzimas como la peroxidasa y la pepsina pueden inhibir su acción catalítica cuando han sido sometidas a prolongadas exposiciones de ultrasonido. También esta técnica se usa para reducir carga bacteriana de alimentos, ya que se altera la membrana de microorganismos, afectando la homeostasis Aceleración de procesos: el ultrasonido afecta la permeabilidad de los tejidos, lo cual hace que sea más fácil la trasferencia de masa y facilita el proceso de extracción Deshidratación asistida: Existen estudios de deshidratación de vegetales, en los cuales un tratamiento de 30 min de ultrasonido redujo hasta el 40% en peso. Otros estudios indican que también se pueden extraer sustancias flavonoides. Modificación de carnes: El ultrasonido produce también el ablandamiento de la carne. Emulsificación: se usa en la industria de alimentos para mejorar la mezcla de las fases de una emulsión. 2.2.5.3 Ekomilk ultra pro La marca comercial del analizador de leche por ultrasonido es Ekomilk ultra pro, con este analizador se puede medir grasa, proteína, solidos no grasos, densidad, lactosa, punto de congelación, agua añadida, conductividad, pH y temperatura. Es un aparato compacto, portátil, ligero y fácil de usar. El análisis es rápido, tan solo 40 segundos para obtener los parámetros antes mencionados. Para su funcionamiento succiona una pequeña muestra de leche y la somete al paso de una onda de ultrasonido. 26 Figura 2-12. Ekomilk ultra pro 2.2.6 Kjeldahl En 1883, el científico danés Johann Kjeldahl introdujo un método analítico para la determinación de nitrógeno orgánico, el cual lleva su nombre. Es un método oficial descrito en múltiples normativas: AOAC, US-EPA, ISO, Farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias y se basa en una valoración ácido-base. (García Martínez & Fernández Segovia). El nitrógeno se encuentra presente en un sin número de sustancias; en el caso de la industria alimentaria el método Kjeldahl es de gran utilidad para determinación de proteína. Como muchas proteínas contienen aproximadamente el mismo porcentaje de nitrógeno, si se multiplica este porcentaje de nitrógeno por un factor (que depende de cada muestra y que varía alrededor de 6.25, ver tabla 2-4) se obtiene el porcentaje de proteína del alimento. Tabla 2-4. Factor de conversión nitrógeno total - proteína Tomado de: (García Martínez & Fernández Segovia) 27 2.2.6.1 Ventajas y limitaciones El método Kjeldahl tiene como limitación su laboriosidad y lentitud, que realmente es un problema si se debe analizar una gran cantidad de muestras, sin embargo presenta la ventaja de ser un método de referencia y debido a esto los resultados obtenidos son confiables. Otra limitación de este método es la de no permitir la determinación de todas las formas de nitrógeno en una muestra. El método supone o se sobreentiende que la totalidad del nitrógeno de la muestra está en forma proteica, aun cuando esto no es verdad. El nitrógeno de las aminas y amidas se transforman cuantitativamente a iones amonio, sin embargo los grupos nitro, azo y azoxi dan lugar a amonio elemental o a oxidos diversos, éstos se pierden en el medio ácido caliente. (Skoog, West, Holler, & Crouch, 2005). Para corregir este problema se puede precalentar la muestra con un agente reductor como ácido salicílico y tiosulfato sódico. Otros compuestos como la piridina y sus derivados (compuestos aromáticos heterocíclicos) son más resistentes a la digestión con ácido sulfúrico, lo que da lugar a la obtención de resultados bajos. La proteína de la leche, que es el analito de esta investigación contiene nitrógeno heterocíclico de los aminoácidos: histidina y triftófano (imidazol de la histidina e indol del triptófano), sin embargo en este caso la mínima cantidad de este nitrógeno heterocíclico hace que se lo tome como insignificante y no se considere de importancia en el análisis de la proteína total. (Alais, 1985) 2.2.6.2 Fundamento del método y etapas El método Kjeldahl se fundamenta en la digestión de la muestra en ácido caliente, momento en que se oxida el carbono e hidrógeno de la muestra a CO2 y agua, posterior a esto la disolución resultante se enfría, se diluye y se alcaliniza. Finalmente el amonio liberado se destila, se recoge en ácido y se lo valora. Este es el resumen del método, el cual se puede detallar dividiéndolo en tres etapas: 2.2.6.2.1 Digestión: En este paso la muestra se somete a una descomposición, lo cual se logra con ácido sulfúrico concentrado y caliente. Este procedimiento trasforma el nitrógeno en iones amonio (Skoog, West, Holler, & Crouch, 2005). Esta etapa es la que más tiempo requiere es por ello que se ha realizado modificaciones al procedimiento original para la disminución de este tiempo. 28 Una de estas modificaciones consiste en añadir una sal neutra como el sulfato de potasio, esto logra elevar el punto de ebullición de la disolución de ácido sulfúrico y por ende la temperatura de la digestión. Otra sustancia que acelera este proceso es el peróxido de hidrógeno permitiendo, incrementando el oxígeno para una rápida oxidación de la muestra. El mercurio, cobre y selenio, combinados o en estado elemental también actúan como buenos catalizadores de esta reacción. Habitualmente el catalizador que se utiliza es una mezcla de sulfato de potasio, sulfato de cobre y selenio; e K2SO4:CuSO4 : Se (10:1:0,1 en peso). Después se adicionan 10 mL de H2SO4 concentrado y 5 mL de H2O2. Luego se digiere a 420°C por un tiempo que depende de la muestra. El indicativo para saber que la reacción ha finalizado es el color de la disolución final, el cual debe ser color verde esmeralda. (García Martínez & Fernández Segovia). Figura 2-13. Digestor Kjeldahl 2.2.6.2.2 Destilación La etapa de la destilación se basa en alcalinizar la muestra digerida para hacer que el nitrógeno se desprenda en forma de amoniaco. El amoniaco destilado se recoge sobre un exceso conocido de ácido bórico. Las ecuaciones de esta etapa son las siguientes: (NH4)2SO4 + 2 NaOH → 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O (Desprendimiento de amonio) NH3 + H3BO3 → NH4 + H2BO3 (Amonio recogido en ácido bórico) El procedimiento se lo realiza de la siguiente manera: Una vez finalizada la digestión se debe dejar enfriar el tubo con la disolución verde esmeralda, luego se adiciona 50 ml de agua destilada, luego se coloca el tubo en el destilador con una cantidad suficiente de NaOH 10N (50ml aproximadamente). El amonio que se libera es arrastrado por vapor 29 de agua y se recoge sobre la disolución de ácido bórico al 4%p/v. (García Martínez & Fernández Segovia). Figura 2-14. Destilador Kjeldahl 2.2.6.2.3 Valoración La valoración ácido-base empleada consiste en valorar el ión borato formado en la etapa de la destilación con una solución de ácido clorhídrico o ácido sulfúrico y utilizando como indicador una disolución alcohólica de una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno. El número de equivalentes de ácido que se consumen corresponden al número de equivalentes de amoniaco destilados. La ecuación de esta etapa es la siguiente: H2BO3 - + H+ → H3BO3 2.3 Fundamento legal La presente investigación se basa en los requerimientos del acuerdo ministerial N° 394, capítulo IV “Del seguimiento y Control”, artículo 9 y 10. Artículo 9. El Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca —MAGAP-a través de la Subsecretaría de Ganadería y de la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro —AGROCALIDAD- ejecutarán las acciones y los instrumentos necesarios para el control, la regulación y sanción de las distorsiones o irregularidades que se den en la fase de producción primaria de la cadena de la leche, esto de acuerdo a lo establecido en Acuerdo Interministerial 2013-001. Esto con el objetivo de verificar y controlar el pago del precio de sustentación más componentes, calidad higiénica y sanitaria por litro de leche cruda pagado en finca o centro de acopio. Adicionalmente, realizarán todas las acciones necesarias con los demás Ministerios y entes competentes para ejecutar acciones de control y regulación de toda la cadena láctea. 30 Artículo 10. La Subsecretaría de Ganadería y la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro —AGROCALIDAD-, serán quienes verifiquen la transparencia, veracidad, correcto funcionamiento y calibración de equipos utilizados para el análisis de leche cruda; y, validaran los resultados de los análisis de calidad de leche cruda emitidos por los laboratorios de las industrias, centros de acopio o laboratorios privados. Resultados de laboratorio que es insumo determinante para el cálculo del precio final pagado en finca, mediante la aplicación de la Tabla Oficial presentada en este instrumento. En caso de incumplimiento se aplicará el procedimiento establecido en el Acuerdo Interministerial 2013-001, de 15 de marzo del 2013, publicado en el Registro Oficial No. 941, del 25 de abril del 2013. 31 CAPÍTULO III 3 3.1 METODOLOGÍA Tipo de investigación La presente investigación tiene un enfoque cuantitativo y usa el método general de la ciencia (Método científico). También ocupa otros métodos particulares como el Documental, Comparativo, Matemático, Experimental y Estadístico. 3.2 Diseño experimental Este estudio consta de dos partes, la primera se encarga de la validación parcial del método infrarrojo espectroscópico medio y la segunda del estudio comparativo entre los tres métodos analíticos para determinación de proteína: infrarrojo, ultrasonido y Kjeldahl. 3.2.1 Diseño experimental de la validación parcial 3.2.1.1 Alcance de la validación La determinación del alcance de validación depende del método analítico en cuestión. En esta investigación el método analítico que se validó fue el espectroscópico infrarrojo medio y en base a las siguientes consideraciones se definieron los parámetros a ser evaluados: 1. Es un método normalizado, es decir, un método desarrollado por una Institución técnicamente reconocida, en este caso AOAC. 2. Es un método espectrofotométrico. 3. En un método que mide componente mayoritario, en esta investigación es la proteína, que se encuentra aproximadamente en un 3% en la leche cruda. Con estas consideraciones y según la tabla 2-1, los parámetros que se desarrollaron fueron: Rango de trabajo o Linealidad Exactitud Porcentaje de recuperación Precisión Repetibilidad Reprodubilidad 32 3.2.1.2 Parámetros de la validación Todos los parámetros de validación fueron realizados con material de referencia certificado (MRC), que el Laboratorio de Control de Calidad de Leche de Agrocalidad compró al laboratorio INTI (Instituto Nacional de Tecnología Industrial) de Argentina. Este material se adquirió en un rango de trabajo de 11 niveles, que va desde 2.86% hasta 3.80% de proteína en leche fluida entera. (Ver anexo 1) De los 11 niveles de proteína se tomaron 8 para realizar la validación ya que los otros 3 niveles fueron utilizados para calibración de algunos equipos en el Laboratorio de Control de leche. En la tabla 3-1 se muestran las ocho concentraciones que fueron tomadas para la validación. Tabla 3-1. Intervalo de concentraciones del MRC Muestra N° 1 2 3 4 5 6 7 8 % Proteína 2.86 3.18 3.29 3.36 3.38 3.60 3.63 3.80 A continuación se describe el diseño experimental para cada parámetro de la validación: 3.2.1.2.1 Linealidad Para este parámetro se realizó una recta de regresión entre los valores reportados en la ficha técnica del material de referencia certificado y los valores obtenidos en el laboratorio por el método espectroscópico infrarrojo medio. Para los valores certificados de proteína reportados en la ficha técnica, el laboratorio INTI utilizó la metodología de referencia ISO 8968-2:2001 (IDF 20-2:2001) (Método Kjeldahl); con la prueba de linealidad se busca identificar errores sistemáticos y observar si el método infrarrojo proporciona resultados significativamente más altos o más bajos que el procedimiento establecido por el laboratorio INTI. Para trazar la curva de linealidad se tomaron los ocho niveles de concentración del material de referencia certificado, en el eje X se colocaron los valores del MRC y en el eje Y los valores obtenidos en el laboratorio por el método infrarrojo medio. 33 Figura 3-1. Curva de linealidad Para determinar la significancia del coeficiente de correlación “r” se aplicó una prueba t, la cual se presenta en la ecuación 1. ó Donde: r= coeficiente de correlación n= número de puntos usados en el cálculo El valor t calculado se compara con el valor tabulado, utilizando un contraste de dos colas y (n-2) grados de libertad. Hipótesis: Ho: no existe correlación Por lo tanto, a mayor correlación se espera rechazar la hipótesis nula y obtener un valor de t mucho más grande. 3.2.1.2.2 Exactitud Para medir la exactitud se utilizó una prueba “t”, la cual compara una media experimental con un valor conocido, el valor conocido es el reportado en la ficha técnica del material de referencia certificado (MRC), el mismo que se encuentra en el Anexo 1. Para esta prueba se realizaron quince repeticiones por cada nivel de concentración (cinco por día), luego se aplicó la ecuación 2: ó Donde: : Media de los valores 34 Valor verdadero aceptado del material de referencia (MRC) n: Tamaño muestral Sponderada: Desviación estándar ponderada (Ecuación 3) Se usó la desviación estándar ponderada debido a que los datos fueron tomados en tres días diferentes, y esta estimación es mejor que el valor de s para cualquier subserie individual. Hipótesis: Ho: Hi: 3.2.1.2.3 Porcentaje de recuperación: Con los 15 datos tomados para la prueba de exactitud se calculó el porcentaje de recuperación mediante la ecuación 4: ó ó Dónde: : Media de los valores Valor verdadero aceptado del material de referencia (CRM) 3.2.1.2.4 Precisión El estudio de precisión se realizó calculando las desviaciones estándar de repetibilidad (S r) y de reproducibilidad (SR) con sus respectivos límites, los coeficientes de variación de repetibilidad (%CVr) y de reproducibilidad (%CVR) y el valor F para cada uno de los niveles de material de referencia certificado. Esto se lo hizo a partir de un análisis simple de varianza (ADEVA de factores totalmente anidados y homogéneos), este estudio se realizó en tres días diferentes y cinco repeticiones por día, como se puede observar en la tabla 3-2. 35 Tabla 3-2. Diseño del Análisis de Varianza CADA NIVEL Día Repeticiones 1 2 1 C11 C21 2 C12 C22 3 C13 C23 4 C14 C24 5 C15 C25 Tomado de: (INEN, 2007) 3 C31 C32 C33 C34 C35 Las ecuaciones que rigen este diseño de factores anidados son las que se muestran en la tabla 3-3. Tabla 3-3. Ecuaciones para el análisis de varianza Origen de la varianza Análisis simple de la varianza Grados de libertad Sumas de diferencias (v) cuadráticas (SDC) Diferencias cuadráticas medias (DCM=SDC/v ) Entre grupos (Between) Dentro del grupo (Within) Global =(2+12) (= Tomado de: (INEN, 2007) Desviación estándar de repetibilidad: ó Límite de repetibilidad: (Ecuación 6) Donde t es el valor de Student en dos sentidos para ν= a una confianza dada (el nivel de confianza normal establecido es de 95% cuyo valor es 1,96), y Sr es la desviación estándar medida bajo condiciones de repetibilidad. Coeficiente de variación de repetibilidad: 36 Desviación estándar de reproducibilidad: ó Límite de reproducibilidad: (Ecuación 9) Donde t es el valor de Student en dos sentidos para ν= a una confianza dada (el nivel de confianza normal establecido es de 95% cuyo valor es 1,96), y SR es la desviación estándar medida bajo condiciones de reproducibilidad. Coeficiente de variación de reproducibilidad: ó Precisión Intermedia: ó Hipótesis: Ho: Hi: Donde: = Varianza entre grupos “Días” (between) = Varianza dentro del grupo “Repeticiones” (within) 3.2.2 Diseño experimental de la comparación entre métodos El diseño experimental para la comparación de los tres métodos analíticos se realizó con muestras de leche entera, tomadas del ganado vacuno de la Facultad de Agronomía de la Universidad Central. Cada día se tomó una muestra del lote de producción de leche y esto se lo realizó durante 10 días. Luego se procedió a analizar cada muestra por los tres métodos analíticos de determinación de proteína (espectroscópico infrarrojo, ultrasonido y Kjeldahl). Para los métodos espectroscópico infrarrojo y ultrasonido los equipos presentan directamente el porcentaje de proteína de la leche analizada, tal como se mencionó en el capítulo 2; en cambio para el método Kjeldahl debido a que es una valoración ácido-base requiere de la ecuación 12 para obtener el resultado. 37 í ó Dónde: NHCl: Normalidad del ácido clorhídrico VHCl: Volumen de ácido clorhídrico en mililitros consumido en la valoración mleche: masa de leche en gramos 14: Peso equivalente del nitrógeno 6.38: Factor de conversión para la leche (nitrógeno-proteína) 10: Factor Una vez que se tiene el análisis de las muestras de leche por los tres métodos analíticos se procedió a realizar todas las pruebas estadísticas que permiten compararlos, para este caso se utilizó una prueba t pareada, un estadístico F y una prueba de correlación. 3.2.2.1 Prueba t pareada Esta prueba se usa para el estudio de comparación de medias entre dos métodos analíticos. Con los datos recolectados se procedió a comparar el método Kjeldahl (no validado) frente al método espectroscópico infrarrojo que fue validado previamente y posteriormente se comparó infrarrojo con ultrasonido. En la tabla 3-4 y 3-5se muestran las matrices de datos que corresponden a esta prueba. Tabla 3-4. Exactitud, comparación espectroscópico IR/Kjeldahl Lote 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Método Método kjeldahl espectroscópico IR x1 y1 x2 y2 x3 y3 x4 y4 x5 y5 x6 y6 x7 y7 x8 y8 x9 y9 x10 y10 Media Sd Grados de libertad Valor t 38 d x1- y1 x2- y2 x3- y3 x4- y4 x5- y5 x6- y6 x7- y7 x8- y8 x9- y9 x10- y10 Hipótesis: Ho: ó Ha: ó Tabla 3-5. Exactitud, comparación espectroscópico IR- ultrasonido Lote 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Método Método espectroscópico IR ultrasonido x1 z1 x2 z2 x3 z3 x4 z4 x5 z5 x6 z6 x7 z7 x8 z8 x9 z9 x10 z10 Media Sd Grados de libertad Valor t d x1- y1 x2- y2 x3- y3 x4- y4 x5- y5 x6- y6 x7- y7 x8- y8 x9- y9 x10- y10 Hipótesis: Ho: ó Ha: ó La ecuación para esta prueba es: Donde: Valor medio de las diferencias entre los valores que forman cada par : Desviación estándar de las diferencias entre los valores que forman cada par n: número de parejas E l número de grados de libertad es n-1. (Ver anexo 2) 39 3.2.2.2 Prueba F de Fisher Esta prueba se usa para el estudio de comparación de varianzas entre dos métodos analíticos. Para ello se procedió a comparar el método Kjeldahl frente al método espectroscópico infrarrojo que fue validado previamente y posteriormente se comparó Kjeldahl con ultrasonido. En las tablas 3-6 y 3-7 se muestran las matrices que corresponden a esta prueba. Tabla 3-6. Precisión, comparación espectroscópico IR/Kjeldahl Lote 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media Des. Estándar Valor F Método espectroscópico IR x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10 Método Kjeldahl y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 y10 Hipótesis: Ho: ó Hi: ó Tabla 3-7. Precisión, comparación espectroscópico IR- Ultrasonido Lote 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media Des. Estándar Valor F Método espectroscópico IR x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10 40 Método Ultrasonido z1 z2 z3 z4 z5 z6 z7 z8 z9 z10 Hipótesis: Ho: ó Ha: ó La ecuación de esta prueba es: ó Donde: Desviación estándar del método 1 Desviación estándar del método 2 Sin embargo 1 y 2 se disponen de tal modo que F sea siempre ⩾1 El número de grados de libertad tanto del numerador como del denominador son n-1. Ver anexo 3 3.2.2.3 Curvas de Correlación Estas curvas sirven para la comparación de dos métodos analíticos cuando existe un intervalo de concentraciones. En el eje X debe ir el método más preciso, por lo cual se colocó los datos del método espectroscópico IR medio, debido a que este fue validado previamente; en el eje Y se colocan los métodos Kjeldahl y ultrasonido como se muestran en los gráficos 3-2 y 3-3. Figura 3-2. Curva de correlación método espectroscópico IR/Kjeldahl 41 Figura 3-3. Gráfica de correlación método espectroscópico IR/ultrasonido Para evaluar que tan bien el modelo planteado anteriormente explica la relación entre X y Y se probó hipótesis sobre la pendiente y la ordenada de las curvas. Estas hipótesis prueban si la pendiente es significativamente diferente de cero y si la ordenada es significativamente igual a cero, con n-2 grados de libertad. El estadístico t para la prueba de hipótesis de la pendiente es el que se muestra en la ecuación 15 y para la hipótesis de la ordenada la ecuación 16. (Gutiérrez & De La Vara, 2004) ó ó Otro enfoque para analizar la significancia del modelo de regresión lineal es aplicando el análisis de varianza que se muestra en la tabla 3-8, con este análisis se complementó las pruebas de hipótesis mencionadas anteriormente. En este caso se prueba que Fo es mayor que la Ftabulada con 1 y n-2 grados de libertad en el numerador y denominador, respectivamente; mostrando así un modelo de regresión significativo. Tabla 3-8. Análisis de varianza para el modelo de regresión simple Fuente de Suma de Grados de Cuadrado variación cuadrados libertad medio Regresión SCR = b Sxy 1 CMR Error o SCE = Syy – b Sxy n-2 CME Syy n-1 residual Total 42 Fo CMR/CME Ftabulada Donde: ó ó ó ó ó 3.2.2.4 Comparación de los métodos espectroscópico IR-Kjeldahl y ultrasonido Para la comparación de los tres métodos analíticos se utilizó un análisis de varianza ADEVA de dos factores con una sola muestra por grupo, ya que este experimento se ve afectado por dos factores, el método empleado y el número de lote. Las fórmulas para este diseño experimental se presentan en la tabla 3-9 Tabla 3-9. ADEVA de dos factores con una sola muestra por grupo Fuente de variación Suma de cuadrados Grados de libertad Entre bloques (Lotes) r-1 Entre tratamientos (Métodos) c-1 Residual por diferencia Total por diferencia N-1 Donde: N= número total de medidas T1 = suma de las medidas en la i-ésima muestra. T2 = suma de las medidas en la j-ésima muestra. T = suma de todas las medidas, gran total. c = número de tratamientos 43 r = número de bloques Hípotesis: Ho: Hi: 3.2.3 Criterios de aceptación La tabla 3-10 muestra los requisitos que deben ser cumplidos en cada prueba realizada de la investigación para poder ser aceptada. Tabla 3-10. Criterios de aceptación Parámetros de validación Parámetro Diseño experimental Curva de correlación Linealidad Contraste estadístico para r, Criterio de aceptación Rechazo de la Ho al 95% prueba t Exactitud (en un Estadístico t Aceptación de la Ho al 99% rango de trabajo) Recuperabilidad (%) 95% - 105% Diseño de factores Precisión completamente anidados y CVsr <5% homogéneos CVsR <5% Comparación de métodos Parámetro Exactitud entre métodos Precisión entre métodos Diseño experimental Estadístico t Aceptación de la Ho al 95% Aceptación de la Ho al 95% Prueba F Hipótesis para la pendiente, estadístico t Correlación entre Hipótesis para la ordenada, métodos estadístico t Adeva para regresión simple, estadístico F ADEVA de dos factores con una sola Criterio de aceptación Rechazo de la Ho al 95% Aceptación de la Ho al 95% Rechazo la Ho al 95% Aceptación de la Ho al 95% Prueba F muestra por grupo 44 3.3 Materiales y métodos 3.3.1 Métodos Espectroscópico infrarrojo medio: Método Oficial AOAC 972.16: 1972 Grasa, lactosa, proteína y sólidos en leche. Ultrasonido: No tiene método de referencia Kjeldahl: Método Oficial AOAC 991.20. Nitrógeno total en leche. 3.3.1.1 Procedimiento Método Infrarrojo Preparación de muestras Calentar la muestra aproximadamente por 5 minutos en un baño de agua hasta observar que la muestra esté homogénea. Si la muestra se encuentra en fundas recolectoras o envases que no tienen el tamaño necesario para el análisis en el equipo MilkoScan FT+, luego de realizar el paso anterior se agita suavemente y se trasvasa al frasco apropiado. Las muestras en los frascos apropiados se colocan en los racks de 10 puestos del equipo MilkoScan FT+, para ser agitados con movimientos suaves, entre 10 a 15 veces. Se procede a transportarlos las muestras en los racks al equipo MilkoScan FT+ para el análisis. Procedimiento Para ejecutar los análisis de grasa, proteína, sólidos totales, sólidos no grasos, punto crioscópico, mediante el uso del equipo, se realiza los siguientes pasos: Encender el equipo MilkoScan FT+ y el computador abriendo el software Start Foss Integrator. Al momento del encendido del equipo, empieza preparar las soluciones de trabajo. descritas en el Anexo II (S-6060 Zero Liquid Concentrate, S-470 Cleaning Agent, Cuando la ventana de eventos de sesión de trabajo indique 0 de 0, se habilita la opción de Play y se inicia el análisis. Colocar las muestras sobre el comveyor 5000 Basic. Escoger en la ventana de Registro de Muestras la opción de Nueva Tarea-Análisis. Se incluyen los siguientes datos: 45 Tipo de tarea: Normal Nombre: Identificación de muestra y sus códigos de la muestras o rangos. Total: Número de muestras a analizar Otros (comentarios) Agregar lista a tareas Hacer Click en Play y el equipo automáticamente corre las muestras y ejecuta el análisis. Los resultados son registrados electrónicamente en el software que permite su recuperación como archivo electrónico. Luego de terminar los análisis, iniciar los respectivos tratamientos de limpieza (Lavado de pipeta, purga, limpieza). Apagar el equipo y cerrar el software Start Foss Integrator. 3.3.1.2 Procedimiento Método Ultrasonido Preparación de muestras Las muestras de leche deben estar entre 5-35°C. Si la temperatura de la leche es superior a 38°C el mensaje “Muestra caliente” aparecerá en la pantalla. Si se trata de analizar muestras frías las cuales tienen la grasa/crema separada, es muy probable que los resultados sean erróneos, especialmente para el análisis de grasa. En este caso es necesario calentar las muestras a temperaturas de 40-42°C, mezclar la leche para disolver la grasa separada, luego enfriarla a 20-25°C y finalmente analizarla con el EKOMILK La acidez de las muestras de leche debe ser menor a 25°T para vaca, búfalo y cabra y menor a 28°T para la leche de oveja. Usar las muestras solamente una vez. Cuando la medición se ha llevado a cabo, desechar la muestra. Procedimiento Insertar el tapón de plástico con el tubo de vinil en lugar del émbolo Llene la taza de medición con la muestra de leche a medir. Coloque la taza de medición en el soporte de plástico con el tubo en la muestra de leche. 46 Pulse MODE y por medio de los botones de búsqueda ▲, ▼ seleccione el modo deseado: *LECHE DE VACA 1: análisis de la leche cruda de vaca Cuando se muestra el tipo adecuado de leche, pulse OK para iniciar la medición. La leche automáticamente es impulsada a la cámara de medición. El mensaje ANALIZANDO aparece en la pantalla, mientras la medición está pasando. Cuando la medición se completa la leche regresa de forma automática a la taza y la pantalla muestra los resultados obtenidos de los parámetros de la leche. Antes de comenzar una nueva medición, hay una posibilidad para borrar la última medición de la memoria del analizador. Pulse el botón ▼ y luego presione el botón ▲sin soltar el botón ▼. El mensaje que aparecerá en la pantalla será registro descartado. En caso de leche insuficiente en la cámara (o daño en el sistema de medición) el mensaje que aparecerá en la pantalla será “cámara vacía”. Colocar más leche y empezar el análisis de nuevo. Después de que se complete la medición los resultados se podrán imprimir pulsando el botón ▲ en el panel frontal del analizador. Los resultados se imprimen cada vez que se pulsa este botón. El número de mensaje: 001 aparece en la pantalla si el analizador trabaja en el modo “recolección e impresión de datos” ¡ATENCIÓN! el número máximo de registros puede ser 120. Si usted intenta escribir más registros aparece en la pantalla “NO ESPACIO EN LA MEMORIA”. En este caso, debe transferir los datos a un ordenador y limpiar/vaciar la memoria del Analizador. Lectura e interpretación de los resultados Una vez realizado el análisis aparecerá en la pantalla los 6 parámetros al mismo tiempo. La primera pantalla muestra siempre los siguientes parámetros: Grasa, sólidos no grasos (SNG), densidad de la leche: en la fila superior Agua añadida a la leche, valor de congelación*, proteína: en la fila inferior 3.3.1.3 Procedimiento Método Kjeldahl Añadir 15 gramos de sulfato de potasio K2SO4, 1ml de solución catalítica de cobre CuSO4.5H2O y de 8 a 10 perlas de ebullición en el tubo de digestión. Llevar la muestra a una temperatura de 38 ± 1 °C y mezclarla mediante agitación suave hasta que esté homogénea Pesar la muestra caliente 5±0.1ml e inmediatamente poner en el tubo de digestión 47 Añadir 25 ml de ácido sulfúrico concentrado Colocar los frascos en el digestor Empezar el ajuste del digestor con la temperatura suficientemente baja como para que la muestra de ensayo no forme espuma en el cuello del tubo Kjeldahl Digestar al menos 20 minutos o hasta que los humos blancos aparezcan en el tubo, luego ir incrementando la temperatura hasta llegar al máximo por un tiempo total de 2.8 a 2.25 horas Al final de la digestión el líquido del tubo debe ser claro y libre de material sin digerir (color claro verde esmeralda) Enfriar a temperatura ambiente añadiendo 300 ml de agua Para la destilación añadir 50 ml de solución de H3BO3 con indicador en un erlenmeyer graduado de 500ml. Abrir el agua del condensador y ajustar el equipo para que añada 75 ml de NaOH al 50% 3.3.2 Valorar con una solución estándar de 0.1 M HCL hasta la primera tonalidad rosa Materiales y equipos Los materiales, equipos y reactivos empleados en los métodos de determinación de proteína en leche cruda (espectroscópido infrarrojo, ultrasonido y Kjeldahl) son los que se muestran en las tablas 3-11, 3-12 y 3-13. Tabla 3-11. Materiales y equipos para el método espectroscópico infrarrojo medio Materiales y Equipos Reactivos MilkoScan FT+ Planchas de calentamiento con sistema de agitación Magnética S-6060 Zero Liquid Concentrate S-470 Cleaning Agent Agitador magnético pequeño Fossclean kit Purificador de agua Agua Destilada tipo II Baño María Probetas de 100, 250, 1000 y 2000 cm3 Tabla 3-12. Materiales y Equipos para el Método Ultrasonido Materiales y Equipos Reactivos Ekomilk Ultra Pro Vasos de precipitación de 250 cm3 Agua Destilada tipo II Agua Destilada tipo II. 48 Piceta Tabla 3-13. Materiales y Equipos para el Método Kjeldahl Materiales y Reactivos Equipos Aparato de Kjeldahl, Ácido sulfúrico concentrado 95-98% H2SO4 exento de nitrógeno. para Solución digestión CuSO4.5H2O, Sulfato de potasio K2SO4. Libre de nitrógeno Matraz Solución de Hidróxido de sodio NaOH al 50% P/P 50cm . Tubos de libre de nitrógeno. Perlas de ebullición Solución indicadora de rojo de metilo/ verde de bromocresol: Disolver 0.2 gramos de rojo de metilo y aforar a 100 ml en 95% de etanol. Disolver un digestión gramo de verde de bromocresol y aforar a 500ml en etanol al 95%. Kjeldahl de Mezclar una parte de la solución de rojo de metilo con 5 partes de la 3 500 cm . solución de verde de bromocresol Bureta de 50 Solución de ácido bórico al 4% con indicador. Pesar 40 gramos de H3BO3, 3 cobre destilación. 3 de Concentración 0.05 g/ml en Agua y Kjeldahl de catalítica cm . disolver y aforar a 1 litro con agua destilada, añadir 3 ml de la solución Balanza indicadora de rojo de metilo/verde de bromocresol. La solución final debe analítica ser de color naranja sensible al Solución de ácido clorhídrico estandarizada 0.100M 0.1mg 49 CAPITULO 4 4 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 4.1 Análisis de resultados de la validación 4.1.1 Linealidad A continuación se presentan los resultados obtenidos para el parámetro de linealidad, se realizó una curva entre los valores obtenidos por el método espectroscópico y los valores reportados por el material de referencia. Tabla 4-1. Valores para la prueba de linealidad % Proteína Valores reportados en la ficha técnica del MRC, usando el método Kjeldahl Valores del MRC reportados por el laboratorio de AGROCALIDAD, usando el método espectroscópico IR 2.86 3.38 3.36 3.18 3.29 3.80 3.63 3.60 2.82 3.38 3.37 3.20 3.28 3.82 3.64 3.62 % Proteína (valor reportado por el Laboratorio de Control de Leche, usando el método espectroscópico IR) % Proteína LINEALIDAD 3.90 3.70 3.50 3.30 3.10 2.90 2.70 2.50 y = 1.0588x - 0.196 R² = 0.9983 2.50 2.70 2.90 3.10 3.30 3.50 3.70 3.90 % Proteína (Valor reportado en la ficha técnica del MRC) Figura 4-1. Curva de linealidad 50 Tabla 4-2. Parámetros de linealidad Pendiente b 1.0588 Desviación estándar de la pendiente Sb 0.0179 Ordenada al origen a -0.1960 Desviación estándar de la ordenada Sa 0.0609 Sx/y 0.0139 2 Desviación estándar de la correlación Coeficiente de determinación R 0.9983 Coeficiente de correlación r 0.9991 Límite de confianza de la pendiente b t n 2 Sb 1 0 88 2 0 01 9 LC= 1 0 88 ± 0.0439 LC superior= 1.1027 LC inferior= 1.0149 Límite de confianza de la ordenada al origen a t n 2 Sa 0 19 0 2 LC= 0 19 0 ± 0.1492 0 0 09 LC superior= -0.0468 LC inferior= -0.3452 En la figura 4-1 se puede observar una correlación positiva muy fuerte (Hernández, Fernández, & Baptista, 2010) entre los valores reportados en la ficha técnica del MRC y los valores obtenidos por el método espectroscópico IR, en la tabla 4-2 se presentan los cálculos relacionados a la gráfica: pendiente, ordenada al origen, desviaciones estándar de la ordenada, pendiente y correlación, también el coeficiente de determinación y de correlación. 51 Para determinar el grado de correlación de la curva se utilizó el coeficiente de correlación r, que para este caso es de 0.9991, aplicando el estadístico t (ecuación 1) se rechazó la hipótesis nula (la cual dice que no existe correlación entre X y Y) y se determinó que el coeficiente de correlación es significativo ya que el valor de t calculado es mayor al valor tabulado. Este alto grado de correlación indica que los resultados obtenidos en el laboratorio no son significativamente diferentes de los resultados reportados del material de referencia certificado, cumpliendo así con el criterio de validación establecido. 4.1.2 Exactitud A continuación se muestran los resultados del análisis de exactitud para los ocho niveles del material de referencia certificado. Como ejemplo se presenta detalladamente el cálculo para la primera concentración, el cálculo para las otras concentraciones se encuentran en el anexo 4. En la tabla 4-4 se muestra el resumen de la exactitud de los ocho niveles. Concentración 1 Tabla 4-3. Datos de exactitud para la concentración 1 Repetición Día 1 Día 2 Día 3 1 2.75 2.82 2.97 2 2.77 2.82 2.96 3 2.78 2.81 2.96 4 2.79 2.82 2.70 5 2.80 2.82 2.71 Media 2.78 2.82 2.86 Media total 2.82 52 tcal 19 Tabla 4-4. Resultados de exactitud para los ocho niveles de concentración Concentración Media Valor real u Sponderada t cal t tab 99% Significancia 1 2 3 4 5 6 7 8 2.82 3.20 3.28 3.37 3.38 3.62 3.64 3.82 2.86 3.18 3.29 3.36 3.38 3.60 3.63 3.80 0.08 0.03 0.03 0.02 0.06 0.04 0.04 0.04 -1.94 1.99 -1.94 2.02 -0.12 2.12 1.04 2.38 2.98 2.98 2.98 2.98 2.98 2.98 2.98 2.98 ns ns ns ns ns ns ns ns Utilizando la ecuación 2 y 3 de la página 34 se calculó el valor del estadístico t para los ocho niveles de concentración, en la tabla 4-4 se observa el contraste entre este valor y el valor tabulado de t y su respectiva significancia. En todos los niveles de concentración se aceptó la hipótesis nula al 99%, puesto que el valor de t calculado es menor al valor tabulado, es decir, no existe diferencia significativa entre la media experimental y el valor conocido del material de referencia en el rango analizado que va desde 2.86% hasta 3.80%. Al aceptar la hipótesis nula se deduce que no hay evidencia de errores sistemáticos, en otras palabras, la única diferencia entre el valor observado y el conocido se atribuye a la variación aleatoria. Por lo mencionado anteriormente se cumple con el criterio de aceptación planteado para la prueba de exactitud utilizando el método infrarrojo espectroscópico medio. 4.1.3 Porcentaje de recuperación Con la ecuación 4 de la página 35 se determinó el porcentaje de recuperación. Para la concentración 1 se detalla el cálculo con la fórmula, para las otras concentraciones se siguió el mismo procedimiento obteniendo los resultados de la tabla 4-5. Los ocho niveles de concentración tienen un porcentaje de recuperación que se encuentra en el rango 95 - 105%, es decir, se cumple con el criterio de aceptación planteado. 53 Concentración 1 Recuperación Recuperación 100 98 Tabla 4-5. Resultados de recuperación para los 8 niveles de concentración Concentración 1 2 3 4 5 6 7 8 4.1.4 % Recuperación 98.56 100.55 99.62 100.32 99.94 100.56 100.29 100.61 Valor conocido 2.86 3.18 3.29 3.36 3.38 3.60 3.63 3.80 Media 2.82 3.20 3.28 3.37 3.38 3.62 3.64 3.82 Precisión Los resultados de precisión se obtuvieron mediante un ADEVA de factores totalmente anidados y homogéneos que se muestra en las tablas 3-2, 3-3 y las ecuaciones 5-11 de las páginas 36 y 37. El estudio se realizó calculando el valor del estadístico F, las desviaciones estándar de repetibilidad (Sr) y de reproducibilidad (SR) con sus respectivos límites, los coeficientes de variación de repetibilidad CVr y de reproducibilidad CVR, los cuales se obtienen a partir del ADEVA antes mencionado. Para la concentración 1 se muestran los cálculos detallados en las tablas 4-6 y 4-7; para el resto de concentraciones ver el anexo 5. El resumen con los resultados de todos los niveles se muestran en la tablas 4-8, 4-9 y 4-10. Tabla 4-6. Análisis de varianza de factores anidados y homogéneos para la concentración 1 Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Entre grupos Dentro de los grupos Total 0.01681333 0.08176 2 12 0.09857333 14 54 Promedio de los cuadrados 0.008406667 0.006813333 F Valor crítico para F 1.23 ns 3.89 Tabla 4-7. Resultados de Sr , SR, CVr y CVR para la concentración 1 Valor de Referencia: 2.86 Repetición 1 2 3 4 5 Total Media Día 1 2.75 2.77 2.78 2.79 2.80 13.89 2.78 Día 2 2.82 2.82 2.81 2.82 2.82 14.09 2.82 Día 3 2.97 2.96 2.96 2.70 2.71 14.30 2.86 SDCB SDCW SDCG 0.0168 0.0818 0.0986 DCMB DCMW DCMG 0.0084 0.0068 0.0070 CVr CVR Sr x Sr x 0 082 2 82 0 08 2 82 Total 8.54 8.55 8.55 8.31 8.33 42.28 8.46 Media 2.85 2.85 2.85 2.77 2.78 14.09 2.82 Sr SR S2I. 0.0825 0.0857 0.0005 2 93 30 Tabla 4-8. Resultados del valor F para los ocho niveles de concentración Concentración 1 2 3 4 5 6 7 8 F calculada 1.23 0.53 0.04 0.83 3.25 1.14 0.43 0.23 F Tabulada 5% 3.89 3.89 3.89 3.89 3.89 3.89 3.89 3.89 Significancia ns ns ns ns ns ns ns ns En la tabla 4-8 se muestra los resultados del estadístico F para el rango de concentraciones de proteína. Se aceptó la hipótesis nula al 5% para todos los niveles de concentración, puesto que el valor calculado de F es menor que el valor tabulado al 5%, es decir, la varianza entre grupos (días) no difiere significativamente de la varianza dentro del grupo (repeticiones). Con la aceptación de la hipótesis nula en todos los niveles se cumple el criterio de aceptación establecido. 55 Tabla 4-9. Resultados de desviaciones estándar de repetibilidad y reproducibilidad para los ocho niveles de concentración Desviación Desviación estándar estándar de de reproducibilidad repetibilidad (Sr) (SR) (r) (R) 1 0.0825 0.0857 0.2288 0.2375 2 0.0338 0.0310 0.0936 0.0860 3 0.0252 0.0208 0.0699 0.0577 4 0.0204 0.0198 0.0566 0.0550 5 0.0646 0.0855 0.1791 0.2370 6 0.0365 0.0373 0.1011 0.1035 7 0.0395 0.0356 0.1096 0.0986 8 0.0379 0.0327 0.1052 0.0906 Valor menor 0.0204 0.0198 0.2288 0.2375 Valor mayor 0.0825 0.0857 0.0566 0.0550 Concentración Límite de Límite de repetibilidad reproducibilidad En la tabla 4-9 se observan las desviaciones estándar de repetibilidad (Sr) y reproducibilidad (SR) para los ocho niveles de concentración, las Sr y SR del método espectroscópico infrarrojo medio están comprendidas entre el valor menor y el valor mayor de todas las desviaciones típicas de todos los niveles, es decir, las Sr del método están comprendidas entre 0.0204 y 0.0825 y las SR del método están comprendidas entre 0.0198 y 0.0857. Dicho en otras palabras, los análisis de proteína en leche cruda que se hagan por el método infrarrojo en el laboratorio deben tener unas desviaciones estándar de repetibilidad y reproducibilidad que no se encuentren fuera del rango antes mencionado. En la tabla 4-9 también se muestran los resultados de los límites de repetibilidad y reproducibilidad para cada nivel de concentración, en el caso del primer nivel el límite de repetibilidad es 0.2288, es decir, este es el valor debajo del cual se debe obtener con una probabilidad de 95%, el valor absoluto de la diferencia entre dos valores individuales medidos bajo condiciones de repetibilidad. En el caso del límite de reproducibilidad, el primer nivel tiene un valor de 0.2375, es decir, este es el valor debajo del cual se debe obtener con una probabilidad del 95%, el valor absoluto de la diferencia entre dos valores individuales medidos bajo condiciones de reproducibilidad. Este concepto se aplica para todos los demás niveles de concentración. 56 Tabla 4-10. Resultados de los coeficientes de variación de repetibilidad y reproducibilidad para los ocho niveles de concentración Concentración 1 2 3 4 5 6 7 8 Coeficiente de variación de repetibilidad ( ) 2.93 1.06 0.77 0.61 1.91 1.01 1.08 0.99 Coeficiente de variación de reproducibilidad ( ) 3.04 0.97 0.64 0.59 2.53 1.03 0.98 0.86 Para una interpretación porcentual de las desviaciones estándar Sr y SR se determinó los coeficientes de variación de repetibilidad CVr y de reproducibilidad CVR; los ocho niveles de concentración presentaron un CVr y un CVR menores a 5%, indicando un buen grado de homogeneidad en los valores de la variable y cumpliendo así con el criterio de aceptación establecido. (Ver tabla 4-10). 4.2 Análisis de resultados de la comparación de los métodos Se analizó las muestras de leche por los tres métodos analíticos, para el caso de espectroscópico infrarrojo y ultrasonido los resultados se obtuvieron directamente en los equipos correspondientes, pero para el método Kjeldahl se realizó los cálculos en base a los datos obtenidos de la valoración. La tabla 4-11 muestra el peso de leche tomado para las diez muestras y el volumen de ácido clorhídrico utilizado para cada una de ellas, a partir de estos datos y mediante la ecuación 12 de la página 38 se determinaron los porcentajes de proteína de todas las muestras, estos resultados se presentan en la tabla 4-12. Tabla 4-11. Datos obtenidos de la valoración ácido-base del método Kjeldahl N° Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Masa leche (g) 5.0583 5.0792 5.1234 5.0490 5.0282 5.0162 5.0486 5.0743 5.0123 5.1153 57 V HCl (ml) 14.3 14.0 14.2 14.7 14.2 13.9 14.0 14.6 14.8 15.4 1 Proteína NHCl VHCl 38 Masa leche 10 Donde: NHCl= 0,1241 N Proteína 1 0 12 1N 1 3ml 0 83g 10 38 Proteína Proteína 3 13 Tabla 4-12. Porcentaje de proteína a partir del método Kjeldahl Masa leche V HCl (g) (ml) 1 5.0583 14.3 3.13 2 5.0792 14.0 3.06 3 5.1234 14.2 3.07 4 5.0490 14.7 3.23 5 5.0282 14.2 3.13 6 5.0162 13.9 3.07 7 5.0486 14.0 3.07 8 5.0743 14.6 3.19 9 5.0123 14.8 3.27 10 5.1153 15.4 3.34 N° Muestra 4.2.1 %Proteína Prueba t para datos emparejados 4.2.1.1 Comparación entre los métodos espectroscópico IR y Kjeldahl La tabla 4-13 muestra el valor del estadístico t resultante de la comparación de los métodos espectroscópico IR y Kjeldahl utilizando la ecuación 13 de la página 39. Puesto que el valor calculado de t es menor que el valor tabulado se acepta la hipótesis nula, es decir, los métodos no proporcionan resultados significativamente diferentes al 5%. Por lo tanto no se detecta la presencia de errores sistemáticos y los errores del experimento se atribuyen a fuentes aleatorias. 58 Tabla 4-13. Resultados de la comparación entre los métodos espectroscópico IR-Kjeldahl % Proteína método % Proteína espectroscópico IR Método Kjeldahl 1 3.16 3.13 0.03 2 3.11 3.06 0.05 3 3.10 3.07 0.03 4 3.17 3.23 -0.06 5 3.10 3.13 -0.03 6 3.03 3.07 -0.04 7 3.12 3.07 0.05 8 3.23 3.19 0.04 9 3.32 3.27 0.05 10 3.29 3.34 -0.05 x 3.16 3.16 0.01 s 0.092 0.097 0.045 Lote g.l 9 t calculada 0.47 t tabulada 95% 2.26 Diferencia El contraste t para datos emparejados permitió separar la variación o error que existe entre los diferentes lotes de leche (ya sea por alimentación, temperatura o estado del ganado) y que la variación existente entre las medidas solo provenga de la diferencia entre métodos y del error aleatorio que siempre está presente, es decir, esta prueba es independiente de la concentración. 4.2.1.2 Comparación entre los métodos espectroscópico IR y ultrasonido En la tabla 4-14 se muestra el resultado de la comparación de los métodos Infrarrojo y ultrasonido utilizando la prueba t para datos emparejados de la página 39, ecuación 13. Ya que el valor calculado de |t| es menor al valor tabulado se acepta la hipótesis nula, es decir, los métodos no proporcionan resultados significativamente diferentes al 5%. Por lo tanto no se detecta la presencia de errores sistemáticos y los errores del experimento se atribuyen a fuentes aleatorias. 59 Tabla 4-14. Resultados de la comparación entre los métodos espectroscópico IR-ultrasonido % Proteína método % Proteína espectroscópico IR método ultrasonido 1 3.16 3.18 -0.02 2 3.11 3.08 0.03 3 3.10 3.14 -0.04 4 3.17 3.20 -0.03 5 3.10 3.14 -0.04 6 3.03 3.07 -0.04 7 3.12 3.16 -0.04 8 3.23 3.21 0.02 9 3.32 3.32 0.00 10 3.29 3.27 0.02 x 3.16 3.18 -0.01 s 0.092 0.078 0.029 Lote 4.2.2 g.l 9 t calculada -1.54 t tabulada 95% 2.26 Diferencia Prueba F 4.2.2.1 Comparación entre los métodos espectroscópico IR y Kjeldahl En la tabla 4-15 se muestra el contraste F para la comparación de los métodos espectroscópico infrarrojo y Kjeldahl, esta prueba contrasta la diferencia entre estos dos métodos en cuanto a su precisión. Puesto que el valor calculado de F es menor que su valor tabulado se acepta la hipótesis nula, es decir, no hay diferencia significativa entre las dos varianzas al 5%, los dos métodos son igualmente precisos. Con esto se confirma que las diferencias entre las medidas se deben a errores aleatorios, ya que si la diferencia hubiera sido superior a 4.03 (valor tabulado al 5%) no se podría atribuir a estos errores y se debería buscar los posibles errores sistemáticos. 60 Tabla 4-15. Resultados de la comparación entre los métodos espectroscópico IR-Kjeldahl Lote 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 s F calculada F tabulada 95% % Proteína método % Proteína espectroscópico IR método Kjeldahl 3.16 3.13 3.11 3.06 3.10 3.07 3.17 3.23 3.10 3.13 3.03 3.07 3.12 3.07 3.23 3.19 3.32 3.27 3.29 3.34 0.092 0.097 1.12 4.03 4.2.2.2 Comparación entre los métodos espectroscópico IR y ultrasonido En la tabla 4-16 se muestra el resultado del contraste F para la comparación de los métodos espectroscópico infrarrojo y ultrasonido, en este caso se contrastó estos dos métodos en cuanto a su precisión, para ello se ocupó la ecuación 14 de la página 41. Puesto que el valor calculado de F es menor que su valor tabulado se acepta la hipótesis nula, es decir, no hay diferencia significativa entre las dos varianzas al 5%, esto es que los dos métodos son igualmente precisos. Con esto se confirma que las diferencias entre las medidas se deben a errores aleatorios. Tabla 4-16. Resultados de la comparación entre los métodos espectroscópico IR-ultrasonido Lote % Proteína método espectroscópico IR % Proteína método ultrasonido 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 s 3.16 3.11 3.10 3.17 3.11 3.03 3.12 3.23 3.32 3.29 0.092 3.18 3.08 3.14 3.20 3.15 3.07 3.16 3.21 3.32 3.27 0.078 1.38 4.03 F calculada F tabulada 95% 61 4.2.3 Prueba de correlación En la figura 4-2 se puede observar una correlación que se encuentra entre considerable y muy fuerte, determinada por el coeficiente de correlación de 0.8883 (Hernández, Fernández, & Baptista, 2010). Para verificar la significancia de la regresión lineal se aplicó el estadístico t para pendiente y ordenada, a partir de las ecuaciones 15 y 16 de la página 42, además se realizó un análisis de varianza que corrobore que la relación lineal es significativa. 4.2.3.1 Correlación entre los métodos espectroscópico infrarrojo y Kjeldahl Correlación de los métodos espectroscópico IR - Kjeldahl %Proteína (método Kjeldahl) 3.35 3.30 R² = 0.7891 r=0.8883 3.25 y = 0.9411x + 0.1795 3.20 3.15 3.10 3.05 3.00 3.00 3.05 3.10 3.15 3.20 3.25 % Proteína (método espectroscópico IR) 3.30 3.35 Figura 4-2. Curva de correlación de los métodos espectroscópico IR - Kjeldahl Pruebas t para pendiente to b 0 9 11 CME Sxx to 0 0022 00 1 ** ttab 95%= 2.31 ttab 99%= 3.36 Prueba t para la ordenada to a 1 CME n 01 9 x2 Sxx to 0 0022 0 33 ns ttab 95%= 2.31 ttab 99%= 3.36 62 1 10 3 1 32 00 1 Tabla 4.17. Análisis de varianza para el modelo de regresión simple Fuente de Suma de Grados de Cuadrado variación cuadrados libertad medio Regresión 0.067 1 0.07 Error 0.018 8 0.00 Total 0.085 9 Fo Ftab 95% Ftab 95% 29.93** 5.32 11.25 Para la regresión entre los métodos Kjeldahl y espectroscópico IR el valor obtenido del estadístico t para la pendiente es altamente significativo, es decir, es mayor al valor tabulado al 99%, por lo que se rechaza la hipótesis nula y se dice que la pendiente es significativamente diferente de cero; por otro lado el valor de t para la ordenada es no significativo, con lo cual se acepta la hipótesis nula y se dice que la ordenada es significativamente igual a cero y finalmente se determinó que el valor de F obtenido a partir del análisis de varianza es altamente significativo, los resultados de estos tres parámetros analizados indican que la relación lineal entre el método espectroscópico infrarrojo y el método Kjeldahl es significativa. 4.2.3.2 Correlación entre los métodos espectroscópico infrarrojo y ultrasonido En la figura 4-3 se puede observar una correlación positiva muy fuerte entre los métodos espectroscópico IR y ultrasonido (Hernández, Fernández, & Baptista, 2010) determinada por un coeficiente de 0.9637. Al igual que en el caso anterior se verificó la significancia de la regresión lineal aplicando el estadístico t para la pendiente y la ordenada, además de un análisis de varianza para la regresión. Correlación de los métodos espectroscópico IR - ultrasonido %Proteína (método ultrasonido) 3.35 3.30 3.25 y = 0.8205x + 0.5819 R² = 0.9288 r= 0.9637 3.20 3.15 3.10 3.05 3.00 3.00 3.05 3.10 3.15 3.20 3.25 %Proteína (método espectroscópico IR) 3.30 3.35 Figura 4-3. Curva de correlación de los métodos espectroscópico IR - ultrasonido 63 Prueba t para la pendiente to b 0 820 CME Sxx 0 000 8 00 to ** ttab 95%= 2.31 ttab 99%= 3.36 Prueba t para la ordenada a to 1 CME n 0 819 x2 Sxx to 1 0 000 8 10 2 31 00 2 ns ttab 95%= 2.31 ttab 99%= 3.36 Tabla 4-18. Análisis de varianza para el modelo de regresión simple Fuente de Suma de Grados de Cuadrado variación cuadrados libertad medio Regresión 0.050 1 0.05 Error 0.005 8 0.00 Total 0.055 9 Fo Ftab 95% Ftab 99% 83.67** 5.32 11.25 Para el caso de la comparación infrarrojo-ultrasonido se aceptó la hipótesis nula para la ordenada al 95%, se rechazó la hipótesis nula para la pendiente al 95% y se obtuvo un valor altamente significativo de F en el análisis de varianza, con lo cual se determina que estos dos métodos tienen una relación lineal significativa. En la tabla 4-19 se presenta una tabla comparativa entre los parámetros de linealidad y las pruebas de hipótesis realizadas para los dos casos de regresión (espectroscópico IR-Kjeldahl y espectroscópico IR-ultrasonido). 64 Tabla 4-19. Tabla comparativa de parámetros de linealidad Parámetro Símbolo Pendiente Desviación estándar de la pendiente Ordenada al origen Desviación estándar de la ordenada Desviación estándar de la correlación Coeficiente de determinación Coeficiente de correlación Estadístico F Prueba t para hipótesis de la ordenada Prueba t para hipótesis de la pendiente b Comparación de los métodos espectroscópicoKjeldahl 0.9411 Sb 0.1720 0.0888 a 0.1795 0.6089 Sa 0.5443 0.2809 Sx/y 0.0473 0.0244 R2 0.7891 0.9127 r F 0.8883 29.93** 0.33 ns 0.9554 83.67** 2.17 ns t t 5.47** Comparación de los métodos espectroscópicoultrasonido 0.8119 9.15 ** Como se puede observar en la tabla 4-19 los valores de desviaciones estándar tanto de la pendiente como de la ordenada y de la correlación son mucho menores en la comparación de los métodos IRultrasonido que IR-Kjeldahl, mostrando una mayor dispersión de datos para esta última. En cuanto a la correlación también se observa un mejor coeficiente para la comparación IRultrasonido. El valor del estadístico F obtenido del análisis de varianza es mucho más alto en el caso de la comparación IR-ultrasonido, demostrando así una mejor relación lineal que IR-Kjeldahl. Para los dos tipos de comparaciones (IR-Kjeldahl y IR- ultrasonido) se aceptó la hipótesis nula en el caso de la ordenada y se la rechazó para la hipótesis de la pendiente. Estas dos condiciones muestran que el modelo de regresión lineal es significativo para los dos casos. Por lo mencionado anteriormente se puede decir que la relación entre los métodos instrumentales (IR-ultrasonido) es mucho mejor que la relación entre un método instrumental-clásico (IRKjeldahl), esto se puede atribuir a que un método clásico como el caso del Kjeldahl consta de varios pasos (digestión, destilación y valoración) y en cada uno de ellos se puede introducir errores a menos que exista una gran experticia por parte del analista, además de un material correctamente calibrado. Es por ello que los métodos instrumentales como el caso del espectroscópico IR son una 65 muy buena opción para laboratorios que necesitan analizar un gran número de muestras con rapidez, precisión y exactitud. 4.2.4 Comparación entre los métodos espectroscópico infrarrojo, Kjeldahl y ultrasonido Tabla 4-20. Resultados de los análisis de leche por los tres métodos analíticos Lote 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % Proteína Espectroscópico IR Kjeldahl 3.16 3.13 3.11 3.06 3.10 3.07 3.17 3.23 3.10 3.13 3.03 3.07 3.12 3.07 3.23 3.19 3.32 3.27 3.29 3.34 Ultrasonido 3.18 3.08 3.14 3.2 3.14 3.07 3.16 3.21 3.32 3.27 Tabla 4-21. Resultados del ADEVA de dos factores con una sola muestra por grupo Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados Lotes Métodos Error 0.20 0.00 0.01 9 2 18 0.02 0.00 0.00 Total 0.22 29 F 27.26 ** 1.36 ns Valor Probabilidad crítico para F 95% 0.00 0.28 2.46 3.55 La tabla 4-20 muestra los resultados del análisis de varianza realizado para la comparación de los tres métodos analíticos: espectroscópico IR, Kjeldahl y ultrasonido. Se utilizó un ADEVA de dos factores con una sola muestra por grupo debido a que este experimento se ve afectado por los métodos analíticos empleados y por los diferentes lotes de leche; se determinó diferencia significativa entre los lotes ya que todos los días la leche tiende a tener una composición diferente por variaciones en el clima y el alimento del ganado. En cuanto a los métodos el valor calculado de F es menor a su valor tabulado por lo tanto se acepta la hipótesis nula al 95%, es decir, los métodos no introducen una fuente de variación significativa en el análisis de diferentes lotes d leche cruda. En otras palabras en este experimento hay tres fuentes de variación, dos significativas, el error aleatorio y la variación de los lotes, y la tercera que no es significativa que son los métodos. 66 CAPÍTULO V 5 5.1 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Conclusiones Se realizó un estudio comparativo de tres métodos analíticos para determinación de proteína en leche cruda (espectroscópico infrarrojo medio, Kjeldahl y ultrasonido), mediante el uso de herramientas estadísticas se aceptó la hipótesis nula para todas las pruebas realizadas y por lo tanto se determinó que no existe diferencia significativa al 95% entre los tres métodos. Validación del método espectroscópico infrarrojo medio Se validó parcialmente el método normalizado espectroscópico infrarrojo medio para la determinación de proteína en leche cruda, usando parámetros de linealidad, exactitud, recuperabilidad y precisión. El coeficiente de correlación del método es 0.9991 y es significativo al 5%, es decir, se rechaza la hipótesis nula y se demuestra la linealidad del método Infrarrojo espectroscópico medio. De acuerdo al estadístico t, se acepta la hipótesis nula al 1% para los ocho niveles de concentración, es decir, no existe diferencia significativa entre la media experimental y el valor conocido del material de referencia certificado. El método espectroscópico infrarrojo medio es exacto en el rango de concentración de proteína que va desde 2.86% hasta 3.80%. Se acepta el criterio de validación para el porcentaje de recuperación en las ocho concentraciones analizadas, puesto que todas ellas se encuentran en el rango establecido de 95-105%. La prueba de precisión realizada a partir de un análisis de varianza de factores totalmente anidados y homogéneos revela las siguientes conclusiones: Se acepta la hipótesis nula al 5% para todos los niveles de concentración, es decir, que no existe diferencia significativa entre la varianza entre grupos (días) y la varianza dentro del grupo (repeticiones), cumpliendo así el criterio de validación. Las desviaciones estándar de repetibilidad (Sr) del método Infrarrojo espectroscópico medio están comprendidas en el rango 0.0204 y 0.0825 y las desviaciones estándar de reproducibilidad (SR) se encuentran entre 0.0198 y 0.0857. 67 Los coeficientes de variación de repetibilidad y reproducibilidad son menores al 5% en todos los niveles de concentración, lo que indica un buen grado de homogeneidad de los valores y se cumple con el criterio de validación establecido. Por los puntos antes mencionado el método Infrarrojo espectroscópico medio es preciso en el rango de concentración de proteína que va desde 2.82% hasta 3.82% Comparación de los métodos Comparación de los métodos espectroscópico IR y Kjeldahl De acuerdo al estadístico t para datos emparejados se acepta la hipótesis nula al 5%, es decir, los métodos no proporcionan resultados significativamente diferentes. El método Kjeldahl es igualmente exacto que el método validado espectroscópico infrarrojo. La prueba F para la comparación de varianzas de estos dos métodos indica que el valor calculado de F es menor que su valor tabulado por lo que se acepta la hipótesis nula, es decir, no hay diferencia significativa entre las dos varianzas al 5%, el método Kjeldahl es igualmente preciso que el método validado espectroscópico infrarrojo. El estadístico t aplicado a la pendiente y la ordenada muestra la existencia de una relación lineal significativa entre estos dos métodos, rechazando la hipótesis nula en el caso de la pendiente y aceptándola para la ordenada. A partir del análisis de varianza para la regresión se comprueba la existencia de una relación lineal significativa entre los dos métodos, con un valor de F altamente significativo. Comparación de los métodos espectroscópico infrarrojo y ultrasonido Se acepta la hipótesis nula al 5% usando el estadístico t para datos emparejados, es decir, los métodos no proporcionan resultados significativamente diferentes, dicho en otros términos el método Ultrasonido es igualmente exacto que el método validado Infrarrojo espectroscópico medio. Conforme indica la prueba F para comparación de varianzas, el valor calculado de F es menor que su valor tabulado por lo que se acepta la hipótesis nula, es decir, no hay diferencia significativa entre las dos varianzas al 5%, por lo tanto el método Ultrasonido es igualmente preciso que el método validado Infrarrojo medio. El contraste t aplicado a la pendiente y ordenada muestra que la relación lineal entre los métodos espectroscópico infrarrojo y ultrasonido es significativa, rechazando la hipótesis nula en el caso de la pendiente y aceptándola para la ordenada. 68 Mediante el análisis de varianza para la regresión se comprueba la existencia de una relación lineal significativa entre los dos métodos, con un valor de F altamente significativo. Comparación de los métodos espectroscópico infrarrojo-Kjeldahl-ultrasonido De acuerdo al análisis de varianza de dos factores con una sola muestra por grupo, los métodos espectroscópico IR medio, Kjeldahl y ultrasonido no introducen una fuente de variación significativa en el análisis de diferentes lotes de leche cruda, usando un nivel de significancia del 5%. 5.2 Recomendaciones Se recomienda el uso del equipo MilkoScan FT+ para el análisis de proteína en leche, ya que es un equipo confiable, rápido, exacto y preciso, según lo demostrado en esta investigación. Además va acorde con los requerimientos de las industrias lácteas y centros de acopio que deben realizar grandes cantidades de análisis de leche por día y asegurar que el pago a los proveedores sea justo. Realizar más estudios para determinación de proteína en leche por el método espectroscópico infrarrojo medio, para corroborar la fiabilidad de los resultados y que pueda ser incluido como otro método oficial en la normativa INEN 16 para determinación de proteína en leche. Se recomienda realizar más investigaciones sobre el uso de métodos instrumentales en la industria alimentaria, ya que al contrario de los métodos tradicionales poseen ventajas como la rapidez, software de fácil manejo, sencillo tratamiento de la muestra antes del análisis y menor desviación estándar en sus mediciones. Realizar estudios comparativos entre los resultados del equipo MilkoScan FT+ y los métodos tradicionales para otros parámetros fisicoquímicos de la leche como son la grasa, lactosa, sólidos totales, sólidos no grasos y caseína, con el fin de demostrar que existe confiabilidad en los datos obtenidos, al igual que en el caso de la proteína. Seguir correctamente el protocolo de preparación de muestras de leche (que consta de calentamiento y homogenización) para el método espectroscópico infrarrojo medio en el equipo MilkoScan FT+ ya que este es el punto crítico para un buen resultado. Utilizar material de vidrio calibrado en todas las mediciones, especialmente en el método Kjeldahl para evitar la introducción de errores sistemáticos 69 Se recomienda el calibrado semanal del analizador EKOMILK (método ultrasonido), puesto que en esta investigación se pudo evidenciar que es un equipo muy sensible a movimientos y que brinda resultados exactos y precisos siempre y cuando esté perfectamente calibrado. Realizar una correcta limpieza de los equipos de medición rápida EKOMILK y MILKOSCAN FT+ para evitar que los residuos de leche puedan afectar las nuevas mediciones. Llevar controles rigurosos de la temperatura del baño térmico para asegurar una correcta homogenización de las muestras de leche antes del análisis por cualquier método analítico. Llevar controles de la temperatura de la refrigeradora para asegurar que las muestras antes del análisis se encuentren en un rango de temperatura de 2°C-8°C. 70 6 BIBLIOGRAFÍA Alais. (1985). Ciencia de la Leche. En Alais, Ciencia de la Leche (pág. 199). Barcelona: Editarial Reverté. S.A . COFEPRIS, C. F. (16 de Febrero de 2011). Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura. Criterios para la Validación de Métodos Fisicoquímicos . México . Chen, A. O., Chen, Y. S., Chen, Y. S., & Hsieh, N. (1994). Quantitative analysis of composition by near infrared spectroscopy and price estimation on raw bovine milk. Journal Of The Chinese Agricultural Chemical Society 32, 384-394. Eurachem. (Noviembre de 2005). Métodos Analíticos Adecuados a su Propósito. 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Obtenido de Repositorio Universidad de Oviedo : http://digibuo.uniovi.es/dspace/bitstream/10651/27953/6/TFM_Isabel%20Zafra%20Chill eron.pdf 73 7 ANEXOS Anexo 1. Certificado del material de referencia 74 75 76 Anexo 2. Tabla de la distribución t Valor de t para un intervalo de 90% 95% 98% 99% confianza de valor crítico de |t| para 0.10 0.05 0.02 0.01 1 6.31 12.71 31.82 63.66 2 2.92 4.30 6.96 9.92 3 2.35 3.18 4.54 5.84 4 2.13 2.78 3.75 4.60 5 2.02 2.57 3.36 4.03 6 1.94 2.45 3.14 3.71 7 1.89 2.36 3.00 3.50 8 1.86 2.31 2.90 3.36 9 1.83 2.26 2.82 3.25 10 1.81 2.23 2.76 3.17 12 1.78 2.18 2.68 3.05 14 1.76 2.14 2.62 2.98 16 1.75 2.12 2.58 2.92 18 1.73 2.10 2.55 2.88 20 1.72 2.09 2.53 2.85 30 1.70 2.04 2.46 2.75 50 1.68 2.01 2.40 2.68 ∞ 1.64 1.96 2.33 2.58 valores de P de número de grados de libertad Los valores críticos de |t| son adecuados para un contraste de dos colas. Para un contraste de una cola el valor se toma de la columna para dos veces el valor de P deseado, es decir, para un contraste de una cola, P=0.05, 5 grados de libertad, el valor crítico se lee de la columna P=0.10 y es igual a 2.02. Tomado de (Miller & Miller, 2002) 77 Anexo 3. Valores críticos de F para un contraste de una cola (P=0.05) ν2 ν1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 15 20 1 161.4 199.5 215.7 224.6 230.2 234.0 236.8 238.9 240.5 241.9 243.9 245.9 248.0 2 18.51 19.00 19.16 19.25 19.30 19.33 19.35 19.37 19.38 19.40 19.41 19.43 19.45 3 10.13 9.552 9.277 9.117 9.013 8.941 8.887 8.845 8.812 8.786 8.745 8.703 8.660 4 7.709 6.944 6.591 6.388 6.256 6.163 6.094 6.041 5.999 5.964 5.912 5.858 5.803 5 6.608 5.786 5.409 5.192 5.050 4.950 4.876 4.818 4.772 4.735 4.678 4.619 4.558 6 5.987 5.143 4.757 4.534 4.387 4.284 4.207 4.147 4.099 4.060 4.000 3.938 3.874 7 5.591 4.737 4.347 4.120 3.972 3.866 3.787 3.726 3.677 3.637 3.575 3.511 3.445 8 5.318 4.459 4.066 3.838 3.687 3.581 3.500 3.438 3.388 3.347 3.284 3.218 3.150 9 5.117 4.256 3.863 3.633 3.482 3.374 3.293 3.230 3.179 3.137 3.073 3.006 2.936 10 4.956 4.103 3.708 3.478 3.326 3.217 3.135 3.072 3.020 2.978 2.913 2.845 2.774 11 4.844 3.982 3.587 3.357 3.204 3.095 3.012 2.948 2.896 2.854 2.788 2.719 2.646 12 4.747 3.885 3.490 3.259 3.106 2.996 2.913 2.849 2.796 2.753 2.687 2.617 2.544 13 4.667 3.806 3.411 3.179 3.025 2.915 2.832 2.767 2.714 2.671 2.604 2.533 2.459 14 4.600 3.739 3.344 3.112 2.958 2.848 2.764 2.699 2.646 2.602 2.534 2.463 2.388 15 4.543 3.682 3.287 3.056 2.901 2.790 2.707 2.641 2.588 2.544 2.475 2.403 2.328 16 4.494 3.634 3.239 3.007 2.852 2.741 2.657 2.591 2.538 2.494 2.425 2.352 2.276 17 4.451 3.592 3.197 2.956 2.810 2.699 2.614 2.548 2.494 2.450 2.381 2.308 2.230 18 4.414 3.555 3.160 2.928 2.773 2.661 2.577 2.510 2.456 2.412 2.342 2.269 2.191 19 4.381 3.522 3.127 2.895 2.740 2.628 2.544 2.477 2.423 2.378 2.308 2.234 2.155 20 4.351 3.493 3.098 2.866 2.711 2.599 2.514 2.447 2.393 2.348 2.278 2.203 2.124 ν1= Número de grados de libertad del numerador ν2= Número de grados de libertad del denominador Tomado de (Miller & Miller, 2002) 78 Anexo 4. Resultados de exactitud para las concentraciones 2-7 Concentración 2 Valor de referencia: Repetición Día 1 Día 2 Día 3 1 3.11 3.17 3.17 2 3.17 3.17 3.21 3 3.21 3.21 3.21 4 3.22 3.22 3.22 5 3.22 3.22 3.23 Media 3.19 3.20 3.21 Media total 3.20 79 Concentración 3 Valor de referencia: Repetición Día 1 Día 2 Día 3 1 3.23 3.23 3.24 2 3.28 3.28 3.28 3 3.29 3.29 3.29 4 3.29 3.29 3.29 5 3.29 3.29 3.30 Media 3.28 3.28 3.28 Media total 3.28 80 Concentración 4 Valor de referencia: Repetición Día 1 Día 2 Día 3 1 3.36 3.39 3.36 2 3.37 3.40 3.36 3 3.36 3.39 3.36 4 3.37 3.40 3.37 5 3.38 3.32 3.37 Media 3.37 3.38 3.36 Media total 3.37 81 Concentración 5 Valor de referencia: Repetición Día 1 Día 2 Día 3 1 3.33 3.34 3.48 2 3.35 3.34 3.49 3 3.35 3.35 3.49 4 3.36 3.34 3.49 5 3.37 3.35 3.24 Media 3.35 3.34 3.44 Media total 3.38 82 Concentración 6 Valor de referencia: Repetición Día 1 Día 2 Día 3 1 3.57 3.57 3.57 2 3.57 3.64 3.64 3 3.57 3.65 3.64 4 3.64 3.65 3.64 5 3.65 3.65 3.65 Media 3.60 3.63 3.63 Media total 3.62 83 Concentración 7 Valor de referencia: Repetición Día 1 Día 2 Día 3 1 3.58 3.59 3.6 2 3.59 3.59 3.67 3 3.67 3.65 3.66 4 3.66 3.66 3.67 5 3.67 3.68 3.67 Media 3.63 3.63 3.65 Media total 3.64 84 Concenetración 8 Valor de referencia: Repetición Día 1 Día 2 Día 3 1 3.77 3.78 3.78 2 3.77 3.78 3.83 3 3.84 3.84 3.85 4 3.84 3.85 3.84 5 3.86 3.86 3.86 Media 3.82 3.82 3.83 Media total 3.82 85 Anexo 5. Resultados de precisión para las concentraciones 2-7 CONCENTRACIÓN 2 Valor de Referencia: 3.18 Repetición Día 1 Día 2 Día 3 Total Media 1 3.11 3.17 3.17 9.45 3.15 2 3.17 3.17 3.21 9.55 3.18 3 3.21 3.21 3.21 9.63 3.21 4 3.22 3.22 3.22 9.66 3.22 5 3.22 3.22 3.23 9.67 3.22 Total 15.93 15.99 16.04 47.96 15.99 Media 3.19 3.20 3.21 9.59 3.20 SDCB 0.0012 DCMB 0.0006 Sr 0.0338 SDCW 0.0137 DCMW 0.0011 SR 0.0310 SDCG 0.0149 DCMG 0.0011 S2I. -0.0002 Análisis de varianza de factores anidados Resumen Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza Día 1 5 15.93 3.186 0.00223 Día 2 5 15.99 3.198 0.00067 Día 3 5 16.04 3.208 0.00052 Suma de Grados de cuadrados libertad 0.00121333 2 0.000606667 los grupos 0.01368 12 0.00114 Total 0.01489333 14 Origen de las variaciones Promedio de los F Probabilidad 0.53 0.60 cuadrados Valor crítico para F Entre grupos Dentro de 86 3.89 CONCENTRACIÓN 3 Valor de Referencia: 3.29 Repetición Día 1 Día 2 Día 3 Total Media 1 3.23 3.23 3.24 9.70 3.23 2 3.28 3.28 3.28 9.84 3.28 3 3.29 3.29 3.29 9.87 3.29 4 3.29 3.29 3.29 9.87 3.29 5 3.29 3.29 3.30 9.88 3.29 Total 16.38 16.38 16.40 49.16 16.39 Media 3.28 3.28 3.28 9.83 3.28 SDCB 0.0001 DCMB 0.00003 Sr 0.0252 SDCW 0.0076 DCMW 0.0006 SR 0.0208 SDCG 0.0077 DCMG 0.0005 S2I. -0.0002 Análisis de varianza de factores anidados Resumen Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza Día 1 5 16.38 3.276 0.00068 Día 2 5 16.38 3.276 0.00068 Día 3 5 16.4 3.28 0.00055 Suma de Grados de cuadrados libertad 5.3333E-05 2 2.6667E-05 0.00764 12 0.00063667 0.00769333 14 Origen de las variaciones Promedio de los Valor F Probabilidad crítico para cuadrados F Entre grupos Dentro de los grupos Total 87 0.04 0.96 3.89 CONCENTRACIÓN 4 Valor de Referencia: 3.36 Repetición Día 1 Día 2 Día 3 Total Media 1 3.36 3.39 3.36 10.11 3.37 2 3.37 3.40 3.36 10.13 3.38 3 3.36 3.39 3.36 10.11 3.37 4 3.37 3.40 3.37 10.14 3.38 5 3.38 3.32 3.37 10.07 3.36 Total 16.84 16.90 16.82 50.56 16.85 Media 3.37 3.38 3.36 10.11 3.37 SDCB 0.0007 DCMB 0.0003 Sr 0.0204 SDCW 0.0050 DCMW 0.0004 SR 0.0198 SDCG 0.0057 DCMG 0.0004 S2I. -0.00002 Análisis de varianza de factores anidados Resumen Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza Día 1 5 16.84 3.368 7E-05 Día 2 5 16.9 3.38 0.00115 Día 3 5 16.82 3.364 3E-05 Suma de Grados de cuadrados libertad 0.00069333 2 0.000346667 los grupos 0.005 12 0.000416667 Total 0.00569333 14 Origen de las variaciones Promedio de los Valor F Probabilidad crítico para cuadrados F Entre grupos Dentro de 88 0.83 0.46 3.89 CONCENTRACIÓN 5 Valor de Referencia: 3.38 Repetición Día 1 Día 2 Día 3 Total Media 1 3.33 3.34 3.48 10.15 3.38 2 3.35 3.34 3.49 10.18 3.39 3 3.35 3.35 3.49 10.19 3.40 4 3.36 3.34 3.49 10.19 3.40 5 3.37 3.35 3.24 9.96 3.32 Total 16.76 16.72 17.19 50.67 16.89 Media 3.35 3.34 3.44 10.13 3.38 SDCB 0.0272 DCMB 0.0136 Sr 0.0646 SDCW 0.0501 DCMW 0.0042 SR 0.0855 SDCG 0.0772 DCMG 0.0055 S2I. 0.0031 Análisis de varianza de factores anidados Resumen Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza Día 1 5 16.76 3.352 0.00022 Día 2 5 16.72 3.344 3E-05 Día 3 5 17.19 3.438 0.01227 Suma de Grados de cuadrados libertad 0.02716 2 0.01358 los grupos 0.05008 12 0.004173333 Total 0.07724 14 Origen de las variaciones Promedio de los Valor F Probabilidad crítico para cuadrados F Entre grupos Dentro de 89 3.25 0.07 3.89 CONCENTRACIÓN 6 Valor de Referencia: 3.6 Repetición Día 1 Día 2 Día 3 Total Media 1 3.57 3.57 3.57 10.71 3.57 2 3.57 3.64 3.64 10.85 3.62 3 3.57 3.65 3.64 10.86 3.62 4 3.64 3.65 3.64 10.93 3.64 5 3.65 3.65 3.65 10.95 3.65 Total 18 18.16 18.14 54.3 18.10 Media 3.60 3.63 3.63 10.86 3.62 SDCB 0.0030 DCMB 0.0015 Sr 0.0365 SDCW 0.0160 DCMW 0.0013 SR 0.0373 SDCG 0.0190 DCMG 0.0014 S2I. 0.0001 Análisis de varianza de factores anidados Resumen Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza Día 1 5 18 3.6 0.0017 Día 2 5 18.16 3.632 0.00122 Día 3 5 18.14 3.628 0.00107 Origen de las Suma de Grados de Promedio de variaciones cuadrados libertad los cuadrados Entre grupos 0.00304 2 0.00152 grupos 0.01596 12 0.00133 Total 0.019 14 Dentro de los 90 F Probabilidad 1.14 0.35 Valor crítico para F 3.89 CONCENTRACIÓN 7 Valor de Referencia: 3.63 Repetición Día 1 Día 2 Día 3 Total Media 1 3.58 3.59 3.6 10.77 3.59 2 3.59 3.59 3.67 10.85 3.62 3 3.67 3.65 3.66 10.98 3.66 4 3.66 3.66 3.67 10.99 3.66 5 3.67 3.68 3.67 11.02 3.67 Total 18.17 18.17 18.27 54.61 18.20 Media 3.63 3.63 3.65 10.922 3.64 SDCB 0.0013 DCMB 0.0007 Sr 0.0395 SDCW 0.0188 DCMW 0.0016 SR 0.0356 SDCG 0.0201 DCMG 0.0014 S2I. -0.0003 Análisis de varianza de factores anidados Resumen Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza Día 1 5 18.17 3.634 0.00203 Día 2 5 18.17 3.634 0.00173 Día 3 5 18.27 3.654 0.00093 Suma de Grados de cuadrados libertad 0.00133333 2 0.000666667 los grupos 0.01876 12 0.001563333 Total 0.02009333 14 Origen de las variaciones Promedio de los Valor F Probabilidad crítico para cuadrados F Entre grupos Dentro de 91 0.43 0.66 3.89 CONCENTRACIÓN 8 Valor de Referencia: 3.8 Repetición Día 1 Día 2 Día 3 Total Media 1 3.77 3.78 3.78 11.33 3.78 2 3.77 3.78 3.83 11.38 3.79 3 3.84 3.84 3.85 11.53 3.84 4 3.84 3.85 3.84 11.53 3.84 5 3.86 3.86 3.86 11.58 3.86 Total 19.08 19.11 19.16 57.35 19.12 Media 3.82 3.82 3.83 11.47 3.82 SDCB 0.0007 DCMB 0.0003 Sr 0.0379 SDCW 0.0173 DCMW 0.0014 SR 0.0327 SDCG 0.0179 DCMG 0.0013 S2I. -0.0004 Análisis de varianza de factores anidados Resumen Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza Día 1 5 19.08 3.816 0.00183 Día 2 5 19.11 3.822 0.00152 Día 3 5 19.16 3.832 0.00097 Suma de Grados de cuadrados libertad 0.00065333 2 0.000326667 los grupos 0.01728 12 0.00144 Total 0.01793333 14 Origen de las variaciones Promedio de los Valor F Probabilidad crítico para cuadrados F Entre grupos Dentro de 92 0.23 0.80 3.89 Anexo 6. Fotos de la investigación Equipo MilkoScan FT+ Equipo Ultrasonido Equipo Kjeldahl 93 Anexo 7. Certificado de traducción del resumen por un experto en el idioma 94
