DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS
Nombre del alumno (a):
OBJETIVO:
• Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, el número de mohos y
levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano.
• Evaluar la calidad microbiológica de un alimento, que sea factible de estar contaminado
con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM-111-SSA1-1994.
• Comprender el fundamento de todas las etapas del método de detección y cuantificación
de mohos y levaduras en alimentos.
GENERALIDADES:
Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente,
pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos
mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de
algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición de
otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y
levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos
favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto
contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de
antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto pueden ser un
problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias,
oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como
las mermeladas, cajetas, especias, etc.
Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos
como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar
problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas), (b) resistencia al
calor, congelamiento, antibióticos o irradiación y (c) habilidad para alterar sustratos no
favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar
malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimentos.
NOTA
La Norma Oficial Mexicana utiliza únicamente el agar papa dextrosa para la detección y
cuantificación de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la
cuantificación de las levaduras, la utilización del agar extracto de malta acidificado ya que
es un medio más rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo
microbiano.
FUNDAMENTO
El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo
específico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como
nutrientes a los polisacáridos que contiene el medio. La hidrólisis de estos compuestos se
efectúa por enzimas que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de los hongos
y levaduras a pH ácidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo
acidificado a un pH de 3.5. Así mismo, la acidificación permite la eliminación de la mayoría
de las bacterias. Finalmente, las condiciones de aerobiosis y la incubación a una
temperatura de 25 ± 1 ºC da como resultado el crecimiento de colonias características
para este tipo de microorganismos.
MATERIAL:
 Licuadora estéril o mortero y pistilo
 Mechero bunsen
 Parrillas
de
agitación
y
 Varilla acodada
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calentamiento
Frasco schot
Matraz Erlenmeyer 250 ml
Cajas de Petri
Portaobjetos, cubreobjetos,
Pipetas estériles de 1 ml y 10 ml
Baño María mantenida a 45±1°C
Autoclave
Vortex
Incubadora
Contador de colonias
Microscopio óptico
Termómetro
 Espátula
 Tubos de ensayo con tapo de rosca
REACTIVOS:
 Solución salina o solución de agua
peptonada de 0.1 a 0.02%
 Medio de cultivo Papa Dextrosa
Agar y Agar extracto de malta
acidificado
 Colorantes para tinción de Gram
 Solución colorante de lactofenol
azul de algodón.
TECNICA.
1. Preparación de diluyente. Usar soluciones isotónicas, soluciones salinas o soluciones
de agua peptonada de 0.1 a 0.02%, la selección depende de la sensibilidad del grupo
de microorganismos que se desee determinar. Esterilizando tubos con 9 ml con la
solución disponible, junto con los medios de cultivo.
2. Procedimiento. El proceso de homogenizar y diluir las muestras debe ser rápido, el
objetivo es tener las células microbianas presentes en una solución homogénea del
alimento. El procedimiento es el siguiente:
a) Picar y mezclar la muestra en la moledora o licuadora. El tamaño de muestra
recomendado es entre 300 y 500 g derivados de un muestreo primario en el punto
donde se encuentra el alimento seguido de un submuestreo en el laboratorio de 30
a 50 g.
b) Pesar higiénicamente entre 10 ±0.1 y 50 ± 0.5 g de muestra. Pasar la muestra al
vaso de licuadora estéril.
c) Agregar 90 ml de diluyente a 10 g de muestra o bien 450 ml de diluyente a 50 g
demuestra.
d) Licuar durante 30 segundos a alta velocidad dejar reposar 2 a 3 minutos.
3. Diluciones: Preparar una serie de 4 tubos con 9 ml de diluyente, mantener los tubos
fríos y etiquetados con una etiqueta que exprese la dilución 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5,
proceder de la forma siguiente.
a) Tomar 1 ml de la dilución 10-1, verterlo en tubo etiquetado con 10-2, agita con vigor.
b) Tomar 1 ml de la dilución 10-2, verterlo en tubo etiquetado con 10-3, agitar
vigorosamente.
c) Tomar 1 ml de la dilución 10-3, verterlo en tubo etiquetado con 10-4, agitar de
manera vigorosa.
d) Iniciar el proceso de sembrado.
Técnica
4. Transferir 1 ml, de la (dilución 1:10) a cada una de tres cajas de petri estériles.
5. Inocular 1 ml de la suspensión del segundo tubo (dilución 1:100) a otras tres cajas de
petri estériles y
6. 1 ml a tres cajas de petri (dilución 1:1000) en el caso de que la muestra este muy
contaminada.
7. Verter de 15 a 20 ml de agar extracto de malta acidificado y 50 mg/ml de oxitetraciclina
o gentamicina o Papa Dextrosa Agar acidificado a pH 5 con ácido tartárico
8. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis
en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrás hacia
adelante, sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer con el medio la
tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejándolas
reposar sobre una superficie horizontal fría.
9. Incubar a 25 - 26°C durante 3 días sin destapar, efectuar el recuento presuntivo de las
colonias de hongos desarrolladas, si éste ya se hiciera muy evidente sobre las placas. En
caso contrario prolongar hasta 5 días la incubación y entonces proceder el recuento final
de cada colonia. Si al cabo de 5 días el desarrollo extensivo no permite el recuento de las
colonias reportar él numero obtenido a los 3 días haciendo notar el informe este periodo
de incubación.
a) Contar las placas que presenten entre 10 y 150 colonias.
b) Multiplicar la cifra obtenida por la inversa de la dilución correspondiente y reportar
como No. de UFC/g de muestra.
10. Realizar una tinción húmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de algodón,
para un examen microscópico y una posible identificación de los mohos que se hayan
seleccionado.
a) Realizar una tinción de Gram para la observación microscópica de las levaduras
obtenidas.
11. Reportar las observaciones macroscópicas y microscópicas de los diferentes tipos de
colonias de mohos y levaduras obtenidas durante el análisis. Si es posible reportar el o los
géneros probables.
Extensión en superficie Depositar sobre la superficie de una placa con PDA 500 µl de
una determinada dilución del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con
ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que esté
completamente seco. Incubar la placa, en posición invertida, a la temperatura deseada 25
ºC (durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de alimento, según el tipo de microorganismo.
a) La posición invertida evitará que el agua de condensación se deposite sobre la
superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas. Es una técnica
usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de
bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra
sembrado.
RESULTADOS:
Tipo de alimento
No. Colonias en placa 1, 2 y 3.
Promedio por dilución
CUESTIONARIO:
1. En qué momento aparece las primeras colonias de hongos o levaduras?
2. Todos los sitios inoculados muestran evidencias de deterioro? sí no, ¿cómo explica
este hallazgo?
3. ¿Encontraste hifas septadas o cenocíticas?
4. Menciona las características morfológicas de los hongos:
5. Menciona las características morfológicas de las levaduras:
ESQUEMAS (11):