WB, Nov 2010 SOLUCIONES WESTERN BLOT NOTA: Usar para todas las soluciones agua desionizada Poliacrilamida al 30% ml 25 50 100 150 200 250 Acrilamida (g) 7.3 14.6 29.2 43.8 58.4 73 Bisacrilamida (g) 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2 Nota: Usar guantes y cubrebocas al pesar. Disolver en la mitad del volumen final. Aforar. Filtrar y guardar en frasco ambar a 4°C Tris 1.5 M pH 8.8 (gel separador) mL 50 100 150 200 250 Tris base (g) 9.075 18.15 27.23 36.3 45.4 Nota: Disolver en la mitad del volumen final, agregar agua hasta un 90% aprox del volumen final, ajustar el pH y aforar. Guardar a 4°C Tris 0.5 M pH 6.8 (gel concentrador) Tris HCl (g) Nota: mL 50 100 150 200 250 3 6 9 12 15 Disolver en la mitad del volumen final, agregar agua hasta un 90% aprox del volumen final, ajustar el pH y aforar. Guardar a 4°C SDS 10% SDS (g) Nota: mL 50 100 150 200 5 10 15 20 Usar cubrebocas grueso. Disolver en la mitad del volumen final. Aforar. Guardar a TA 1 WB, Nov 2010 Persulfato de amonio 10% (APS) mL 1 2.5 5 10 20 APS (g) 0.1 0.25 0.5 1 2 Nota: Alicuotar. Guardar a ‐20°C Buffer de Corrida 10X Litros 0.5 1 1.5 2 4 Tris base (g) 15 30 45 60 120 Glicina (g) 72.4 144.8 217.2 289.6 579.2 SDS (g) 5 10 15 20 40 Nota: Aforar. Ajustar el pH a 8.3 si es necesario. Guardar a 4°C • Buffer de transferencia 5X Schafer‐Nielsen (Final: 48 mM tris base, 39 mM glicina, 0.00375 % SDS, 20% metanol, pH 9.2 (sin ajustar; si el pH no da, NO ajustarlo) Tris base (g) MW 121.12 Glicina (g) MW 75.07 SDS (g) Nota: Litros 0.5 1 18.1875 36.375 9.1562 18.3125 0.1171 0.2343 Aforar. Guardar a 4°C. 1.5 54.5625 27.4687 0.3514 2 72.75 36.625 0.4686 NOTA: como al buffer ya diluido (1X) se le agrega el 20% de metanol, los solutos se preparan un poco más concentrados (Tris 60 mM, glicina 40 mM y el SDS 0.04%) TBS 10X Litros 0.5 1 1.5 2 5 Tris base (g) 12.1 24.2 36.3 48.4 121 NaCl (g) 40 80 120 160 400 Nota: Ajustar pH a 7.6 y después aforar. Guardar a 4°C 2 WB, Nov 2010 Ponceau S Ponceau S (g) Ácido Acético (ml) Nota: % ml Final 50 100 150 200 1000 0.2 % 0.1 0.2 0.3 0.4 2 0.5 % 0.25 0.5 0.75 1 5 Aforar. Guardar a TA protegido de la luz. Desecharlo en el frasco. No reusar NaOH 0.1 M NaOH (g) Nota: ml 50 100 0.2 0.4 Guardar a TA. 150 0.6 200 0.8 Solución de teñido Azul de Coomassie para GELES Metanol (ml) Ácido acético (ml) Azul de coomassie (g) Nota: % Final 45 % 10 % 0.25 % mL 100 150 200 250 45 67.5 90 112.5 10 15 20 25 0.25 0.375 0.5 0.625 Aforar. Guardar a TA protegido de la luz. Solución de teñido Azul de Coomassie para MEMBRANAS (TINCIÓN IRREVERSIBLE) Metanol (ml) Ácido acético (ml) Azul de coomassie (g) Nota: % Final 4O % 1% 0.1 % mL 100 150 200 250 40 60 80 100 1 1.5 2 2.5 0.1 0.15 0.2 0.25 Aforar. Guardar a TA protegido de la luz. Solución de desteñido para MEMBRANAS teñidas con Azul de Coomassie Metanol (ml) Nota: % Final 50 % mL 100 150 200 50 75 100 Aforar. Guardar a TA. 3 250 125 WB, Nov 2010 Stripping buffer Tris base (g) 60 mM β‐Mercaptoetanol (ml) SDS (g) 2% Nota: Litros 0.5 1 1.5 2 3.76 7.52 11.28 15.04 3.9 7.8 11.7 15.6 10 20 30 40 Aforar. Ajustar pH a 6.7. Guardar a temperatura ambiente, cubierto con aluminio y en un lugar obscuro. Solución Reveladora y Fijadora Kodak 1:5 ml 250 500 750 1,000 Solución Reveladora ó Fijadora Kodak Stock (ml) 50 100 150 200 Agua (ml) 200 400 600 800 Nota: Cambiar cuando ya esté muy sucio y/o tarde mucho en revelar; Cuando esté muy amarillo y/o tarde mucho en fijar. Guardar a TA en el cuarto de revelado. 4 WB, Nov 2010 SOLUCIONES DE TRABAJO (preparar sólo lo necesario) Buffer de Transferencia 1X‐ con metanol al 20% 125 (1) ml (# de membranas) 375 (3) 500 (4) 625 (5) 250 (2) 750 (6) Metanol 25 50 75 100 125 150 TBS 1X 100 200 300 400 500 600 (hacer la dilución previa 1:5 del 5X) AFORAR con agua desionizada al volumen deseado según el número de membranas que se van a transferir. OJO: como el metanol es miscible, hay que aforar ya que si no el volumen final es incorrecto. Nota: Prepararlo el día que se va a utilizar. En lo que se utiliza mantenerlo a ‐20°C. Solución de lavado: TBS 1X – tween 0.1% Por cada litro de TBS 1X agregar 1 ml de tween (mantenerla a TA mientras se usa) Solución Blotto: TBS 1X ‐ tween 0.1% con leche 5% TBS 1X –tween0.1% Leche 5% (g) mL 25 50 75 100 125 150 175 200 250 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 8.75 10 12.5 Solución Blotto: TBS 1X ‐ tween 0.1% con albúmina 0.1% (ó leche) TBS 1X –tween0.1% Albúmina (ó leche) 0.1% (g) mL 25 50 75 100 125 150 175 200 250 0.025 0.05 0.075 0.1 0.125 0.150 0.175 0.2 0.25 5