Estructura y estabilidad de un dominio proteico BRCT. Mansilla, Alexandra J. I. Obregón Derechos reservados conforme a Ley CONCLUSIONES De los resultados experimentales, se puede concluir: 1. Que las mutaciones realizadas en la posición 21 del dominio BRCT de la DNLJ-ligasa de T. Thermophilus no producen ningún efecto en la estructura de la proteína, manteniéndose el plegamiento compacto y definido de la proteína nativa en sus mutantes. 2. Que si bien la contribución de la arginina 21 del dominio BRCT de la DNLJligasa de T. Thermophilus es favorable para la estabilidad del dominio, este residuo no mostró tener una contribución crucial en la estabilidad del mismo. 3. Que la diferencia en estabilidad entre los mutantes R21M y R21A muestra que mas allá de la relevancia de la carga de la arginina, la hidrofobicidad que su cadena lateral aporta es también significativa en la estabilidad del dominio, por tanto, el aporte de la arginina 21 a la estabilidad del dominio estaría dado por la adición de la contribución favorable de su carga positiva y de la hidrofobicidad de su cadena radical, que también es favorable para la estabilidad del dominio. 4. Que la contribución estabilizante de la Arginina 21, al hallarse en la superficie del dominio, parece tener relevancia más que para el dominio en si, en la capacidad de interactuar con otros módulos de proteínas o ácidos nucleicos, que se considera es la función principal del dominio BRCT. Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM Estructura y estabilidad de un dominio proteico BRCT. Mansilla, Alexandra J. I. Obregón Derechos reservados conforme a Ley APÉNDICE 1 Medios de cultivo (*) Si medio sólido es requerido, se emplea la misma receta agregando 20 gramos de Bactoagar por litro de medio. LB (*) (53) Bactotriptona 10 g Extracto de levadura 5g Cloruro de Sodio 10 g Ajustar a pH 7.5 con Hidróxido de Sodio Agua destilada en cantidad suficiente para 1 litro TB (53) Agua destilada 900 ml Bactotriptona 12 g Extracto de levadura 24 g Glicerol 4 ml Autoclavar y dejar enfriar hasta 60 C Agregar 100 ml de buffer fosfato autoclavado Para un litro de Buffer fosfato: Fosfato de potasio monobásico 23.1 g Fosfato de potasio dibásico 125.4 g Autoclavar Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM Estructura y estabilidad de un dominio proteico BRCT. Mansilla, Alexandra J. I. Obregón Derechos reservados conforme a Ley 2xYT (*) (53) Bactotriptona 20 g Extracto de levadura 10 g Cloruro de Sodio 10 g Agua destilada en cantidad suficiente para 1 litro Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM Estructura y estabilidad de un dominio proteico BRCT. Mansilla, Alexandra J. I. Obregón Derechos reservados conforme a Ley APÉNDICE 2 SDS PAGE (33) • Buffer para el Ánodo (+): 200 mM Tris pH 8.9 (diluido de una solución 10X stock) • Buffer para el cátodo (-): 100 mM Tris/100 mM Tricina/0.1% SDS (no necesita ajustar pH, es aproximadamente 8.25, también puede ser diluido de una solución stock 10X) • Gel Buffer: 3.0 M Tris, pH 8.45/0.3% SDS • Proporción de Acrilamida/bis en el gel de Apilamiento : 48% acrilamida/1.5% bis-acrilamida • Proporción de Acrilamida/bis en el gel de Separación : 46.5% acrilamida/1.5% bis-acrilamida • Buffer de muestra: Para 20 ml (2X) 5 ml 0.5 M Tris, pH 6.8 4 ml 20% SDS 1 ml 2-mercaptoetanol 4 ml 50% glicerol 0.004 g azul de bromofenol 6 ml agua Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM Estructura y estabilidad de un dominio proteico BRCT. Mansilla, Alexandra J. I. Obregón Derechos reservados conforme a Ley Geles : • 1. Gel de Separación: 10% gel 1.22 ml acrilamida 2 ml gel buffer 2 ml 50% glicerol 0.78 ml agua 75 ul 10% persulfato de amonio 7.5 ul TEMED • 2. Gel de apilamiento: 0.25 ml acrilamida 0.75 ml gel buffer 2.0 ml agua 20 ul 10% persulfato de amonio 2 ul TEMED Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM