Presentación de PowerPoint

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recuadro
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Genómica y transcriptómica para la
generación de datos en Evolución
• Gabriela Bedó
Genómica. Sus objetivos
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Compilar todas las secuencias de un
organismo
Establecer la localización de los genes
Establecer la función de los genes
Generar perfiles de expresión en
diferentes condiciones
Conocer las proteínas producidas por los
genes
..........


Se nutre de los datos surgidos de la
secuenciación de ADN.
Aprovecha el desarrollo de métodos de
secuenciación masiva que han permitido
la secuenciación de genomas completos
Secuenciación de próxima
generación (Next Generation
Sequencing o NGS)

Las plataformas más utilizadas se
basan en los siguientes pasos
• Fragmentación del
•
•
•
ADN en pequeños trozos (30
a 700 pares de bases según la técnica)
Amplificación de cada trozo por PCR generando
clones
Secuenciación de cada clon por rápidos métodos
desarrollados año a año.
Ensamblado

Dos ejemplos
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En ambos casos se generan los
fragmentos. Con todos ellos se
prepara una “librería”.
En
diferentes
soportes,
estos
fragmentos de amplifican numerosas
veces por la técnica de PCR.
Posteriormente se secuencian de
distintas e ingeniosas formas:
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El método del Ion Torrent PSG se
basa en la detección de cambios de
pH inducidos por la liberación de un
ion hidrógeno durante la incorporación
de un nucleótido.
El método del MiSeq de Illumina se
basa en la detección de fluorescencia
tras la incorporación de nucleótidos
marcados fluorescentemente. Cada
nucleótido
fluoresce
de
forma
diferente
ADN genómico o ADNc
Cortado en fragmentos
pequeños, se prepara
una “librería”
Librería
Cada fragmento se replica
muchas veces por PCR
amplificación
Secuenciación
ATAGTCAGCTG
TAT C
ATAGTCAGCTG
TAT C
La incorporación de
un nucleótido
produce un cambio
de pH característico
que es registrado
La incorporación de un
nucleótido produce una
emisión de fluorescencia
característica que es
registrada
La enorme cantidad de secuencias es publicada y ordenada en bases de datos
Desarrollos a partir de la
secuenciación de genomas
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Genética reversa
Bioinformática
Genómica funcional
Análisis por genética reversa
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Es particularmente importante para
utilizar los datos de los proyectos
genoma
Se basa en el hecho de que actualmente
existen muchas secuencias de las que
no se sabe su función. Ej: apenas un
10% de los genes humanos tienen
asignada su función.
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Empieza con el gen clonado o proteína
purificada y progresa hacia el
conocimiento de su función.
Para ello se basa generalmente en
alterar la función del gen y realizar
análisis fenotípico.
Análisis funcional en genética
reversa
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Anular el gen para conocer su función
• Aprovecha modelos biológicos
• En ellos disminuye la cantidad de
producto del gen (“knock down”) o la anula
totalmente (“knock out”).
• También se puede sobreexpresar ese gen
Organismo transgénico
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Tradicionalmente esto se logra
introduciendo en el organismo:
•
•
una versión alterada del gen que sustituye la
original
Una versión del gen que se expresa más o en
otra ubicación
• En ambos casos hablamos de organismo
transgénico
Otra alternativa: Uso de pequeños ARNs
interferentes para inhibir la traducción o
degradar el ARNm
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Pequeñas
moléculas de ARN.
En el complejo
RISC se generan
fragmentos de unos
20 nucleótidos
complementarios a
un ARNm.
Al unirse al ARNm
promueven su
degradación o
inhiben su
traducción
Transcripción
ARN mensajero
ARN pequeños
(pueden sintetizarse en la
misma célula o introducirse
artificialmente)
Complejo RISC
Procesa los ARN
intereferentes
Los pequeños fragmentos
de ARN interferente se
unen a un ARNm por
complementariedad de
bases e inducen su
degradación o inhiben su
traducción
Modelos
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Para estudiar los genes y los procesos
que regulan las funciones biológicas, los
genetistas experimentan en organismos
modelo:
fáciles de mantener en el laboratorio
Generaciones cortas
Progenie abundante
Fácil de mutagenizar y aparear
Organismos modelo
Ratones (modelo de muchas
enfermedades humanas)
Mosca de la fruta
Drosophila (con mutantes naturales,
permitió mapeo e identificación de genes)
Maíz
Organismos modelo
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Saccharomyces cerevisae
(levadura que se reproduce por
gemación)
Schizosccharomyces pombe
(por fision)
En otras áreas
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Caenorhabditis elegans
Arabidopsis thaliana
Pez cebra
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Para muchos de ellos se encuentran
bases de datos con secuencias
completas
Cepas con deleciones y mutaciones
específicas
En Drosophila uso de elemento P
(transposon) para introducir genes o
como mutágeno
Bioinformática
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Estudio de la información contenida en
los genomas.
Esa información incluye la suma de
todas las secuencias que codifican para
proteínas y RNAs, más los sitios de
“señalización” que permiten su acción en
el tiempo y tejido
Programas estadísticos de “búsqueda de
genes” que detecta secuencias consenso.
Una secuencia entera, aun bien ensamblada está exenta de significado. Sin
embargo muchas de las señales están conservadas: límites de los exones e
intrones, señal de poliadenilación, sitios de unión de proteínas regulatorias en el
promotor, etc.
Es así que programas informáticos pueden ir identificando señales en la secuencia
para caracterizar la presencia y estructura de los genes.
AACTGCCTGGTTAC…………………………………………………ACGTCCGGAC
El análisis de la secuencia buscando combinaciones de nucleótidos
“consenso” que funcionan como señales permite darle sentido a la
secuencia e identificar genes
Sitio de unión
de proteínas
regulatorias
Sitio de unión
de la
polimerasa
Inicio de la
traducción
Sitio
reconocimiento
de splicing
Terminación de
la traducción
Genómica funcional
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También pueden analizarse patrones
genómicos de expresión génica e ir
viendo todos los genes implicados en una
función (genómica funcional)
La genómica funcional permite a los
investigadores identificar muchos genes
cuyos niveles de expresión se encuentran
modificados en determinados estados.
La otra alternativa
 Conocer
directamente el
transcriptoma: ……
Conjunto de transcriptos presentes en
un organismo dado, en un tejido dado
en determinadas condiciones
El transcriptoma varía y cambia con las
condiciones o estímulos
Célula muscular
ARN mensajeros
Proteína actina
Proteína miosina
Ya no se describen los
genes, sino los ARN
mensajeros en cuanto a
secuencia y abundancia.
Célula pancreática
ARN mensajeros
Proteína insulina
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