4* INFORME FINAL GOBIERNO DE CHILE PROYECTO FONDECYT REGULAR FONDECVT 105963912005 3 2007 NÚMERO PROYECTO DURACIÓN AÑO DE EJECUCIÓN JUAN KRLIZE VIRTONICH RUT INVESTIGADOR(A) RESPONSABLE INSTITUTO DE MICROBIOLOGÍA, FACULTAD DE CIENCIAS, UNIVERSIDAD AUSTRAL DF. CHILE, CASILLA 167, VALDIVIA DIRECCION (63) 221296 (63) 221675 - FONO jkruze(i?uach.cI E-mail 1 PERÍODO QUE INFORMA 1510312008 16/03/2007 HASTA DESDE CONTENIDO (MARQUE CON UNA X EL CASILLERO QUE CORRESPONDA) NO INCLUYE INCLUYE Formulario de Informe Final X Publicaciones X Resumen de Tesis Título/Grado X Información acerca de inventos y patentes X Otros (especificar) X Informe Incentivo Coop. Internacional (Si corresponde) Firma Coinvestigadores(as) Ángara Zambrano A. X Firma Investigador(a) Responsable rs Juan Kruze V. Fecha: 1410312008 CONTENIDO DEL INFORME FINAL I. CUMPLIMIENTO DE LOS OB)ETIVOS PLANTEADOS EN EL PROYECTO. Marque con una X el casillero correspondiente. CunTpiiniento No L Parcial Objetivos Map 1. Crear un patrón proteico para necesario para evaluar relevancia antígenos de diagnóstica. X 2. Ensayar las proteínas obtenidas con sueros de animales infectados y animales libre de infección para la identificación de las proteínas directamente relacionadas con la especificidad sensibilidad y diagnóstica. X 3. Producir un preparado proteico semi-purificado para ser usado como antígeno-Map de fase sólida y, si es necesario, antígenos para la absorción de reacciones cruzadas. x 4. Emplear estas proteínas en una prueba de ELISA y validar su comportamiento usando un panel de 1000 sueros bovinos con estatus conocido de infección bien conocido. x S. Evaluar la nueva prueba de ELISA con muestras de leche en un rebaño con estatus conocido de infección. L Fundamentar el cumplimiento parcial oincumplimiento Se alcanzó a preparar las placas de ELISA con los antígenos de Map, los conjugados marcados, y las soluciones correspondientes. Se estaban ensayando los sueros controles positivos y negativos cuando ocurrió el incendio que material todo el destruyó -biológico. Se alcanzó a recolectar las muestras de suero y leche de 650 animales de un rebaño infectado y se estaban ensayando las muestras con la nueva prueba de ELISA cuando se produjo el incendio que afectó a nuestro laboratorio, perdiéndose todo el material biológico y los resultados jparciales (Tesista:S.Gallardo). Otro(s) aspecto(s) que Ud. considere importante(s) en la evaluación del cumplimiento de los objetivos planteados en la propuesta original o en las modificaciones autorizadas por los Consejos. El proyecto se encontraba en su etapa final de tvb6n con un 95% de avance cuando ocurrió el siniestro la madrugada del 3 de diciembre 2007 que destruyó completamente el edificio principal de la Facultad de Ciencias donde funcionaba el Instituto de Microbiología, Unidad Ejecutora del Proyecto. Como consecuencia del incendio se perdió, además del equipamiento e insumos, la totalidad del material biológico obtenido en las etapas previas de ejecución y gran parte de la información almacenada en los diferentes equipos computacionales del grupo de trabajo. Como consecuencia, no fue posible cumplir todos los objetivos del proyecto y, dado el estado de avance, se decidió poner término al proyecto con los re.stdos obtenidos hasta la fecha. Este siniestro afectó, además, a los tesistas participantes en el proyecto. Uno de ellos (Sergio Gallardo), se encontraba en plena actividad relacionada con el último objetivo del proyecto y perdió todo el material y resultados parciales por lo cual se debió anular la tesis. Otros dos tesistas, Mónica Pradenas (Doctorado) y Nancy Hernández (Bioquímico) habían finalizado la parte experimental de sus tesis y estaban comprometidas a entregar sus manuscritos para ser sometidos a evaluación y rendir examen de grado antes del 31 de diciembre 2007. Sin embargo, la pérdida de información retrasó esta actividad y no alcanzaron a graduarse/titularse aunque terminaron de reconstruir sus manuscritos que se encuentran en etapa de evaluación. II. RESULTADOS OBTENIDOS Describa brevemente los resultados obtenidos en el proyecto en un máximo de cinco páginas, tamaño carta, espacio seguido. Para cada uno de los objetivos específicos, describa o resuma los resultados. Relacione las publicaciones y/o manuscritos enviados a publicación con los objetivos específicos. Incluya en anexos, la información de apoyo que estime pertinente y necesaria para la evaluación. ----- - ------ * -----------Objetivo 1. Crear un patrón proteico para Map necesario para evaluar antígenos de relevancia en inmunodía gnóstico. De acuerdo a la metodología propuesta, se seleccionaron cepas de Map aisladas de casos clínicos, las que fueron cultivadas en medio sólido, y posteriormente fueron subcultivadas en medios líquidos. Se seleccionaron cepas de campo y cepas controles, y se confeccionaron curvas de crecimiento para así determinar la fase exponenciai en la cual se obtuvieron las proteínas de secreción para su evaluación (Figura 1). B ., -. i: 11 * :H7 Figura 1. Crecimiento de la cepa Map UACh-C)304 en medio 7H9-OADC (panel A), y medio Watson Reíd (panel B). Curvas de crecimiento para cada medio en paneles b. Los cultivos líquidos que se encontraban en fase exponencial fueron cosechados, centrifugados, el sobrenadante filtrado y concentrado, para el posterior análisis de western blot de las proteínas contenidas en éste. Es conocido que Map puede ser cultivado en una variedad de medios de cultivos, los cuales influyen directamente en la expresión génica y con ello en la liberación de proteínas en éstos. Para determinar qué medio de cultivo era el óptimo para la obtención de proteínas inmunogénicas se utilizaron dos medios de cultivo para Map, el medio Watson Reid y el medio Middlebrook 7H9-OADC. Map fue cultivado en ambos medios y se recolectó medio de cultivo para analizar la liberación de proteínas inmunogénicas durante distintos tiempos de crecimiento. Se logró exitosamente obtener proteínas secretadas más temprana y eficientemente en el medio líquido Watson Reid, el cual se utilizó para los ensayos posteriores (Figura 2). ,uerç, 11 Sijei 111 ,B - 14 Figura 2. Análisis de western biot de las proteínas del filtrado celular de la cepa UACh-CM304 usando 3 sueros control positivos a diferentes tiempos de cosecha a partir de los medios 7H9OADC (panel A) y WR (panel B). Carril 1: 4 semanas, carril 2: 6 semanas, carril 3: 8 semanas, carril 4: 10 semanas. Los resultados obtenidos para el logro de este objetivo constituyen el cuerpo medular del manuscrito "Comparison of two liquid culture media to detectect antigenic proteins secreted by Mycobacerium avium subsp paratuberculosis" (Jara, MC, Pradenas, M, Hernández, N, Zambrano, A, Collins, MT, Kruze, 3), enviada para su publicación a Ja revista BMC Microbiology Objetivo 2. Ensayar las proteínas obtenidas con sueros de animales infectados con Map y de animales libre de infección para la identificación de las proteínas directamente relacionadas con la sensibilidad y especificidad diagnóstica. Las proteínas de Map fueron analizadas con un gran número de sueros de animales infectados y se pudo determinar que las proteínas secretadas al medio Watson Reid poseen una alta inmunogenicidad comparado con las proteínas celulares de Map. Los patrones inmunogénicos mostraron, además, una alta variabilidad dependiendo del suero utilizado de los distintos animales y en relación principalmente al estadio de infección de los animales (Figura 3). 1 II •- - 4 L.1 I - Figura 3. Análisis de western biot de proteínas secretadas por la cepa UACh-CM304 de Map cultivada en medio WR. En este caso se muestran los resultados de 14 sueros bovinos de casos clínicos de paratuberculosis confirmados por cultivo y de los sueros controles. Se observa una amplia variabilidad en los perfiles inmunoreactivos frente a sueros de animales con diferentes estados de infección con Map. Carriles 1 a 6: casos clínicos y altos eliminadores, carriles 7 a 10: suero de eliminadores medios, carriles 11 a 14: sueros de bajos eliminadores, carril 15: animal control no infectado. Para determinar la especificidad de las proteínas secretadas por Map y descartar la posibilidad de reacciones cruzadas con otras micobacterias, se realizaron preadsorciones séricas con 5 micobacterias medioambientales (M. avium, M. phlei, M. terrae, M. scrofulaceum y M. smegmatis). Los resultados mostraron que la inmunoreactividad de (as proteínas secretadas por Map no varió después del proceso de preadsorción, sugiriendo que estas proteínas, serían además de inmunogénicas, específicas y podrían ser semi-purificadas para ser utilizadas como antígenos de fase sólida en una prueba de ELISA (Figura 4). Es interesante destacar que lo mismo se realizó utilizando sueros de animales infectados en diferentes estadios de infección, en este caso se utilizó para la preadsorción M.phlei (Figura 5). E 1I • 0 a 1* • 19 — Sruni 1 • — • '11IIt1 ._ Senuil Figura 4: Análisis de western biot de proteínas secretadas de la cepa Map CM304-UACh preadsorbida con micobacterias ambientales. Carril 1: suero sin preadsorber, carril 2: suero preadsorbido con M. avium, carril 3: suero preadsorbido con M. phlei, carril 4: suero preadsorbido con M. scrofu!aceum, carril 5: suero preadsorbdo ca la M. smegmatis. — .--- u uii.uil Ic1iV '!cIituit tul mt \m tu Figura 5: Análisis comparativo de la inmunoreactividad de las proteínas del filtrado celular antes y después de la adsorción con M. phlei, usando suero de animales infectados con Map con diferentes estatus de eliminación fecal de Map. Carril 1 sin pre-adsorción, carril 2: con preadsorción utilizando M. phlei. Los resultados obtenidos en el logro de este objetivo constituyen la base del manuscrito titulado "Antibody to secreted proteins of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in sera from infected ruminants" (Pradenas, M, Jara, MC, Hernández, N, Zambrano, A, Collins, MC, Kruze, 1), enviada para su publicación a la revista Veterinary Microbiology. Objetivo 3. Producir un preparado proteico semi-purificado para ser usado como antígeno-Map de fase sólida y, si es necesario, antígenos para la adsorción de reacciones cruzadas. Para la semi-purificación de las proteínas de interés, se realizaron análisis bidimensionales, para así determinar el peso molecular y el punto isoeléctrico (PI), antecedentes que nos permite determinar la mejor manera de purificarlas. El patrón bidimensional resultante arrojó escasas variaciones de acuerdo al punto isoeléctrico entre todas las proteínas inmunodetectadas (valores entre 5 y 6); sin embargo, se pudo determinar que las proteínas de interés poseen pesos moleculares en el rango de 20 a 50 kDa, por lo cual se determinó seguir trabajando sólo con el patrón unidimensional para los siguientes ensayos. En consecuencia, después de haber determinado el rango de inmunoreactividad y su variabilidad en los patrones de unión, se decidió semi-purificar las proteínas de peso molecular inferior a 55 kDa las cuales fueron obtenidas por centrifugación utilizando tubos centricon Plus 70 con un poro de corte de 60 kDa. Con esto se logró un extracto semi-purificado con una concentración proteica de aproximadamente 2,0 ig/pil (Figura 6). El antígeno fue titulado en placas de ELISA, determinándose 100 ng de antígeno como cantidad a adherir en cada pocillo. Una vez preparados los pocillos se procedió a titular los sueros y el conjugado a utilizar en la prueba de ELISA. 12 123 47 : •— ::. 19- 26 ¡ Figura 6: SDS-PAGE de proteínas secretadas por Map cepa UACh-CM304 cultivado en medio líquido Watson Reid. Panel A, carril 2, proteínas secretadas sin semi-purificar; Panel B, carril 2: proteínas semi-purificadas; carril 3: proteínas semi-purificadas y reconcentradas (el carril 1 de ambos paneles muestra el marcador de peso molecular en kDa). Objetivo 4. Emplear estas proteínas en una prueba de ELISA y validar su comportamiento (con y sin adsorción sérica con antígenos de reacción cruzada) usando un panel de 1.000 sueros bovinos con un esta tus de infección bien definido. Al 3 de diciembre de 2007 (fecha del siniestro) se habían realizado ensayos de titulación con el diseño en placa de ajedrez, donde se utilizaron 3 diluciones de suero (1:10, 1:20 y 1:50) y 4 diluciones del conjugado IgG anti-bovino conjugado a peroxidasa (1:5.000; 1:10.000; 1:15.000 y 1: 20.000). A la máxima dilución del suero y de( c,ctuado, se logró discriminar claramente entre animales infectados (muy positivos +++), (positivos, ++) y negativos (no infectados), sugiriendo que estas proteínas pueden ser buenos antígenos de fase sólida para un nuevo ELISA. Lamentablemente, este objetivo no se pudo cumplir en su totalidad debido a que, a consecuencia del incendio, se perdió el banco de sueros con estatus conocido de infección del Laboratorio de Paratuberculosis del Instituto de Microbiología, junto con los sueros no infectados (provenientes de toros del Centro de Inseminación Artificial de la UACh) con los que se realizarían los ensayos estadísticos de validación. Además, también se perdieron más de 500 placas ya sensibilizadas con el antígeno, y todos los reactivos necesarios para realizar los ELISA5, como son IgG antibovino conjugado a peroxidasa, Proteína G conjugada a peroxidasa, cromógeno (TMB), sales para prepara bufferes de lavado, solución de detención y el lector automático de ELISA. Por las razones antes expuesta, no será posible obtener una publicación científica válida con los resultados parciales obtenidos hasta la fecha en relación a este objetivo. Objetivo S. Evaluar la nueva prueba de ELISA conocido de infección. Cklff muestras de leche en rebaños con estatus Al igual que en el objetivo anterior, este objetivo no se pudo cumplir debido a la pérdida del material biológico (placas de ELISA sensibilizadas y muestras de suero y leche) durante el incendio. Para este objetivo se contaba con la colaboración de un alumno tesista de pre-grado (Sergio Gallardo, Medicina Veterinaria), quien alcanzó a recolectar las muestras de suero y leche de 650 animales de un rebaño infectado y estaban ensayando las muestras con la nueva prueba de ELISA cuando se produjo el incendio. La pérdida total de los registros con los resultados parciales tampoco permitirá obtener una publicación. III. PRODUCTOS GENERADOS POR EL PROYECTO En esta sección debe incluir todo documento o material cuyo contenido corresponda substancialmente a los objetivos del proyecto que se informa y en los que se indique el M° del proyecto FONDECYT. Aténgase a los formatos que se incluyen para cada tipo de producto generado. Adjunte copia de los documentos no enviados previamente a EONDECYT. Utilice las hojas adicionales que sean necesarias. Si Ud. tiene un proyecto de Incentivo a la Cooperación Internacional, destaque con (*) las publicaciones generadas como producto del mismo a continuación de las que corresponden al Reaular 1. Artículos en revistas científicas nacionales o extranjeras con Comité Editorial. 1 Marque con una "X" lo que corresponda. Para trabajos En Prensa/ Aceptados/ Enviados adjunte copia de carta de aceptación o de envío. Autor(a)(es/as) Título (Idioma Original) rnbre Completo de1 Revista. Jara, M.C.; Pradenas, M.; Hernández, N.; Zambrano, A.; Collins, M.T.; Kruze, 1. Comparison of two liquid culture media to detect antigenic proteins secreted by Mycobacteríum avlum subsp. paratuberculoslS. ir.1c Microbiology (se adjunta carta recepción) O En preparación J1 Enviada - Pág. Año; 2008 Vol. Ref. bibliográfica Estado de la publicación a O Publicada O Aceptada la fecha.* ¡En Prensa Otras fuentes de financiamiento, si las hay_ Autor(a)(es/as) Título (Idioma Original) Nombre Revista. Ref. bibliográfica Estado de la publicac la fecha.* Otras fuentes de financiamiento, si las L1 _____ Pradenas, M.; Jara, M.C.; Hernández, N.; Zambrano, A.; Collins, M.T.; Kruze,_3. Antibody to secreted proteins of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosís (n sera from Infected ruminants. Veterinary Microbiology Año; 2008 Vol a Publicada ¡En Prensa J[] Pág N° El Aceptada (se adjunta carta recepción) O En preparación Enviada Autor(a)(es/as) Fry, M.P.; Kruze, .J.; Collins, M.T. (*) Título (Idioma Original) Evaluation of four commercial enzyme-linked immunosorbent assayi for the diagnosis of bovine paratuberculosis in ChOcan dairy herds. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation Nombre Completo de la Revista. Año: 2008 Vol. 20 N° 3 Pág. Pp (se adjunta prueba de galera) Ref. bibliográfica O En preparación Estado de la publicación a O Enviada flAceptada Publicada ¡En la fecha . * 1-1 - Prensa Otras fuentes de financiamiento, si las hay Autor(a)(es/as) Salgado, M.; Kruze, 3.; Collins, M.T. Título (Idioma Original) Diagnosis of paratuberculosis by fecal culture and ELISA on milk and serum samples in two types of Chilean dairy goats herds. Journal of Veterinary Dlagnostic Investigation Nibre Completo dé1 Revista. Pág. 99-102 (se adjunta abstract) Año: 2007 Vol. 19 N° 1 E En preparación E Enviada a EjAceptada P Prensa Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias, UACh Ref. bibliográfica Estado de la publicad la fecha.* Otras fuentes de financiamiento, si las Autor(a)(es/as) Título (Idioma Original) Kruze, 3.; Salgado, M.; Collins, M.T. nbre Compleo de la Revista. Paratuberculosis en rebaños caprinos chilenos, Archivos de Medicina Veterinaria Año: 2007 Vol. 39 N° 2 Pág. 147-152 (se adjunta abstract) Ref. bibliográfica E En preparación E Enviada Estado de la publicación a LlAceptada Publicada ¡En la fecha. Prensa Otras fuentes— de — financiamiento, si las hay ZI Autor(a)(es/as) fSaladoM.; Herthnek, D.; Bólske, G.; Leiva, S.; Kruze,). Título (Idioma Original) 1 First isolation of Mycobacterium paratuberculosis from wild guanacos (Lama guanicoe) in Tierra del Fuego Island. - Nfíbre Completo de la Journal of Wildlife Diseases Revista. Año: - Vol. - Ref. bibliográfica Estado de la publicación a 9Publicada ¡En la fecha.* Prensa Otras fuentes de financiamiento, si las hay - Pág. (se adjunta abstract y carta recepción) E En preparación X Enviada flAceptada T 2. Otras publicaciones/productos. Autor(a)(es/as) - Título (Idioma Original) Tipo de publicación o producto Marque con una 'X' lo que corresponda Kruze 1.; Salgado, M. Pasado, presente luturo de la paratuberculosis en Chile. En: Efecto de la intensificación de sistemas ganaderos pastoriles. Aspectos técnicos, Ambientales y Sanitarios. Serie Simposios y Compendios, SOCFIIPA. Seminario ¡Taller ¡Curso ri Monografía Informe Técnico Fl Libro LI Software n Capítulo de Libro El Patente Mapa [J Exposición de Arte Otro. Especificar: Simposio Editor(es) (Libros o Capítulos D.PinoChet. Sociedad Chilena de Producción Animal A.G. Vol. 13. de Libros) pp. 93-104. Nombre de la Editoriat/ Organización Sociedad Chilena de Producción Animal (SOCHIPA) Lugar y Fecha de Publicación País: Chile Ciudad: Frutillar Fecha: 14 Diciembre 2007 Iw 2. Presentaciones a Congresos Nacionales e Internacionales. Adjunte copia del resumen o texto de la ponencia y de la tapa de/libro de Resúmenes, si no la ha enviado previamente. Autor(a)(es/as) Pradenas, M.; Jara, M.C.; lambTano, A.; Kruze, 3.; Collins, M.T. Título (Idioma Original) Antigenicity study of secreted proteins of Mycobacterium avíum subsp. paratuberculosis (Map) isolated from dairy herds in southern Chile. Nombre del Congreso 9th International Colloquium on Paratuberculosis Ciudad: Tsukuba IFecha: 29 oct. - 2 nov. 2007 Lugar y Fecha País: Japón Autor(a)(es/as) Kruze, 3.; Fry, M.P.; Salgado, M.A.; Mella, A.; Collins, M.T. Título (Idioma Original) Evaluation of tour commercial ELISA kits for the diagnosis of bovine paratuberculosis in dairy llierds of southern Chile. Nombre del Congreso 1 9ffi Lugar y Fecha País: Japón Colloqulum on Paratuberculosis Fecha: 29oct. - 2 nov. TCiudad: Tsukubaj 27 7s) Título (Idioma Original) Nombre del Congreso Kruze, J.; Salgado, M; &aciulÍa, X. - Evaluation of tour commercial bovine-ELISA kits for the diagnosis of paratubercu(osis in dairy goats. International Cofloquium oriParatuberculosis -- Ciudad: Tsukuba ui - 1 Fecha: 29oct. - 2 nov. Lugar y Fecha Pa: Japón Autor(a)(es/as) Salgado, M.; Herthnek, O.; Bólske, G.; Kruze, 3. Isolation and molecular confirmation of Mycobacterium avium subsp. paratubercui!osis in guanacos (Lama guanicoe) in Tierra del Fuego, Chile, bv, fecal culture and Real-Time PCR. Nombre del Congreso 9 International Colloquium on Paratuberculosis Título (Idioma Original) Ciudad: Tsukuba Fecha: 29 oct. - 2 nov. 2007 Lugar y Fecha País: Japón Autor(a)(es/as) Salgado, M.; Herthnek, D.; Kruze, 1; Pradenas, M. Título (Idioma Original) Molecular typing of l4ycobacterium avium subsp. paratuberculosis strains from dífferent Chilean domestic and wildlife animal hosts. Nombre del Congreso gth InternatonaI CotIoqus Lugar y Fecha País: Japón oi Paratuberculosis Fecha: 29oct.- 2nov. ICludad:Tsukuba 2007 Autor(a)(es/as) [Paredes E.; Pradenas, M.; Kruze, 1; Jara, M.C.; Collins, M.T. Pathological and bacteriological diagnosis of paratuberculosis in farmed red deer (Cervus elaphus) ami tallow deer (Dama dama) in Chile. Título (Idioma Original) Nombre del Congreso 9nternationalColloquiUm on Paratuberculosis Ciudad: Tsukuba Lugar y Fecha País: Japón Autor()(es/as) SaIgado,M; Kruze, 1; Mella, A. JFecha: 29 oct. - 2 nov. 2007 - Antecedentes preliminares sobre epidemiología molecular de Título (Idioma Mycobacterium paratubercufosis aislados de guanacos (Lama guanicoe) Original) - - en la Isla de Tierra del Fuego, Chile. Nombre del Congreso VIII Jornada Chilena de Buiatría 1 Lugar y Fecha País: Chile Ciudad: Frutillar UM Fecha: 14-16 nov. 2007 fo terminadas en el marco del proyecto. Adjunte copia del resumen no informado anteriormente y certificación de aprobación, si corresponde. 4. Tesis y /0 Memorias en ejecución y Título de la Tesi s Obtención de proteínas secretadas de Mycobacteriumavium subspl paratuberculosis para su posible uso como antígenos en pruebas diagnósticas. Nombre y Apellidos del(deia)/delos(las) Mónica Viviana Pradenas Ferreira y Tutor(a) GradoGrado Doctor en Ciencias Veterinarias Titulo/ Institución Facultad, Universidad Austral de Chile, Departamento Microbiologa Lugar País: Chile Estado de Tesis En Ejecución: Facultad de Ciencias, Instituto de Ciudad: Valdivia Terminada: X Fecha de Inicio: Abril 2005 Fecha de Término: Diciembre 2007 Titulo de la Tesis Nombre y Apellidos del(de la)/de los(las) Detección de proteínas inmunogénicas de Mycobacterium avium subsp J paratuberculosis. María Clara Jara Wilde y Tutor(a) Título! Grado Bioquímico . - . . Institución, Facultad, Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias, Instituto de Departamento Microbiología Lugar País: Chile Estado de Tesis En Ejecución: Ciudad: Valdivia - Terminada: X Fecha de Inicio: agosto 2005 Fecha de Término: marzo 2007 Título de la Tesis Nombre y Apellidos del(de la)/de los(las) proteicos a partir de cepas chilenas de 1 PurificaciÓn de antígenos subsp paratuberculosis. Mycobacterlum avlum Nancy Camila Hernández Villegas yTutor(a) Título! Grado Bioquímico ___________________ . . Institución, Facultad, -le,Austral Facultad de Ciencias, Universidad deInstituto Chide Departamento Microbiolog Lugar País: Chile Estado de Tesis En Ejecución: 1. Ciudad: Valdivia Terminada: X Fecha de Inicio: agosto 2006 Fecha de Término: diciembre 2007 um ] Título de la Tesis Evaluación de cuatro kits comerciales de inmuno-enzimo ensayo (ELISA) para el diagnóstico de paratuberculosis bovina. Nombre y Apellidos del(de la)/de los(las) Alumno(a)(os/as) yjutor(a) Título! Grado Magíster en Ciencias M/Microbiología Institución, Facultad, Departamento Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias, Instituto de Microbiología Lugar País: Chile Ciudad: Valdivia Estado de Tesis En Ejecución: Terminada: X María Paulina Fry Bravo Fecha de Inicio: agosto 2006 Fecha de Término: octubre 2007 Título de la Tesis __ Nombr e-y- Apellidos del(de la)/de los(las) TEvaluación de una prueba de enzimo-inmuno ensayo (ELISA-UACh) para el diagnóstico de paratuberculosis bovina con muestras de suero yjçh—__ Sergio Eugenio Gallardo Valenzuela Título! Grado Medico Veterinario Institución Facultad Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias, Instituto de Departamento Microbiología -.---.------Ciudad: Valdivia País: Chile Lugar .1.- Estado de Tesis __ Ejecución: Terminada: X (suspendida) Fecha ' de Inicio: octubre 2007 Fecha de Término: diciembre 2007 __..--.--.----.-..----.------- ---..-----.-.--.---. IV. DESTAQUE OTROS LOGROS DEL PROYECTO TALES COMO: • Estadías de investigación. • Formación de recursos humanos exceptuando tesistas ya informados. • Actividades de difusión vio extensión en latemtca del proyecto. • Cualquier otro logro no contemplado en los ítem anteriores y que Ud. quiera destacar. 1. En noviembre 2007 se dictó una conferencia sobre "Pasado, presente y futuro de (a Paratuberculosis en Chile" en la Reunión Anual de la Sociedad Chilena de Producción Animal, realizada en Frutillar en la cual se hizo una reseña de los trabajos realizados por nuestro grupo de trabajo, particularmente nuestros dos proyectos FONDECYT, y el futuro trabajo propuesto en el FONDECYT recientemente adjudicado (108506912008). El objetivo de esta conferencia fue dar a conocer a la comunidad la importancia de la enfermedad, su diagnóstico y control, y el aporte fundamental a estos logros realizado por nuestro grupo de trabajo. (ver punto 111.2 Otras publicaciones/productos). 2. En enero 2008 se realizó en nuestro Instituto una reunión con autoridades del Servicio Agrícola y Ganadero de Santiago y P.Montt para analizar y discutir una propuesta de Certificación de Rebaños para ser aplicado a nivel nacional con el soporte técnico de nuestro grupo de trabajo. En esta reunión tuvo vital participación el Dr M.T. Collins, nuestro colaborador de la Universidad de Wisconsin-Madison, USA. (ver punto VI. Informe Proyecto de Incentivo a la Cooperación Internacional). 3. El interés despertado en el medio ganadero de la zona por nuestros trabajos financiados por FONDECYT nos ha impulsado a realizar, aprovechando nuestra infraestructura de laboratorio, algunas investigaciones relacionadas con el diagnóstico de paratuberculosis en otras especies animales, especialmente de vida silvestre, lo cual ha generado algunas publicaciones científicas relacionadas con guanacos, ciervos y caprinos. (ver punto 111.1 Publicaciones/ productos). Para estas publicaciones hemos recibido la invaluable ayuda del Prof. Dr M.T. Collins de la Universidad de Wisconsin (ver punto VI. Informe de Proyecto de incentivo a la Cooperación Internacional). y. RESUMEN Describa en forma precisa y breve el tópico general del proyecto, sus metas y objetivos y los resultados alcanzados. Utilice un lenguaje apropiado para la comprensión del público no especialista en el tema. Esta información podrá ser difundida. (No debe exceder este espacio en fuente Verdana 9) La paratuberculosis bovina es una enfermedad de alta prevalencia en los rebaños lecheros en la mayoría de los países y también en Chile, comprometiendo seriamente a la industria lechera, debido a que produce una fuerte disminución de la producción, enflaquecimiento progresivo de los animales infectados, eliminación prematura de vientres y, finalmente, muerte de los animales afectados. El control de la enfermedad se basa en la detección y eliminación del rebaño de los animales infectados, lo cual requiere de pruebas diagnósticas rápidas, efectivas y de bajo costo para ser aplicadas en forma masiva. Dos son los métodos diagnósticos más utilizados: el cultivo fecal para el aislamiento del agente causal y la detección de anticuerpos anti-Map mediante pruebas serológicas (ELISA). El cultivo fecal es de alto costo, laborioso, poco sensible y lento para entregar un resultado (16 semanas). La prueba de ELISA, por el contrario, es de bajo costo, no requiere equipos sofisticados, es más sensible que el cultivo fecal y permite obtener un resultado dentro de 24 h. Las actuales pruebas diagnósticas de ELISA basadas en la detección de anticuerpos poseen baja sensibilidad debido a que utilizan extractos proteicos crudos de células de Map como antígenos de fase sólida. Además, es necesario realizar una etapa previa de pre-adsorción de los sueros problema con extractos crudos de M.phlei con la finalidad de eliminar reacciones cruzadas con otras micobacterias que producen resultados falsos positivos. Si bien este paso aumenta la especificidad, hace disminuir la sensibilidad diagnóstica de la prueba. El objetivo general del proyecto fue desarrollar una prueba de ELISA autóctona más específica y más sensible que las actualmente existentes en el mercado utilizando antígenos proteicos semi-purificados secretados por Map en medios líquidos ya que estos antígenos serían más inmunogénicos y específicos que los utilizados en las pruebas comerciales. Con este propósito se propusieron los siguientes objetivos específicos: crear un patrón proteico para Map para evaluar antígenos de relevancia diagnóstica, ensayar estas proteínas con sueros de animales infectados y animales libres de infección para identificar las proteínas directamente relacionadas con la sensibilidad y especificidad diagnóstica, producir un preparado proteico semi-purificado para ser usado como antígeno-Map de fase sólida y para la adsorción de reacciones cruzadas, usar estas proteínas en una prueba de ELISA y validar su comportamiento con sueros controles negativos y positivos, y evaluar su utilidad como prueba diagnóstica utilizando muestras de leche de estanque y de vacas individuales en un rebaño infectado. Para el cumplimiento de estos objetivos se seleccionaron cepas de campo aisladas en nuestro laboratorio y cepas controles, y se cultivaron en dos medios de cultivo líquido (Middlebrock 7H9-OADC y Watson Reid) a partir de los cuales se obtuvieron las proteínas secretadas para su evaluación. Watson Reid demostró ser el mejor medio obteniéndose una mayor cantidad de proteínas y en un período de incubación más temprano. Los patrones proteicos fueron diferentes en ambos medios y de demostró que las proteínas secretadas son, en general, de bajo peso molecular (<60 kDa). Estos patrones proteicos inmunogéniCcS evidenciaron que las proteínas más reactivas al ser enfrentadas a sueros de animales controles fueron las que se encuentran en la fracción entre 20 y 50 kDa. Al ensayar estas proteínas inmunoreactivas con diferentes sueros de animales infectados se observó una alta variabilidad entre ellas, por lo que fue necesario utilizar fracciones proteicas, principalmente de aquellas proteínas con un rango <45 kDa, en lugar de usar una proteína única. Mediante ensayos de westernblot se demostró que no se presentan diferencias al realizar preadsorción sérica con distintas micobacterias medioambientales, lo que indicaría que estas proteínas secretadas serían, además de inmunogénicas, específicas. Finalmente estas proteínas obtenidas de los filtrados de cultivo fueron semi-purificadas obteniéndose un extracto proteico con todas las proteínas menores a 45 kDa. Esta fracción fue utilizada como antígeno para ser adherido a placas de ELISA (100 ng por pocillo). Ensayos preliminares de ELISA sugerían fuertemente que las proteínas secretadas por Map, principalmente las fracciones <45 kDa, permitirían discriminar con claridad entre animales infectados y no infectados. Por razones de fuerza mayor (incendio del laboratorio) no se alcanzó a validar la nueva prueba de ELISA con sueros controles y su potencial uso con muestras de leche. nuy beneficiosa para planificar la reconstrucción del laboratorio de Paratuberculosis y analizar 'n forma conjunta las alternativas de colaboración futura para superar la tragedia. )urante la estadía de Prof. Collins se lograron t%Tmlnar dos manuscritos relacionados con el 'royecto Regular que se enviaron a publicación (ver punto III. Publicaciones) y se preparó y nvió el siguiente manuscrito no relacionado directamente con el proyecto y que se encuentra n etapa de evaluación: algado, M.; Herthnek, D.; Bólske, G.; Leiva, 5.; Kruze, ). First isolation of Mycobacterium ,aratuberculosis from wild guanacos (Lama guanicoe) in Tierra del Fuego Island. Journal of Wildlife Disease (en arbitraje) (se adjunta abstract y carta de recepción). demás, el Prof. Collins tuvo importantes reuniones técnicas con nuestro grupo de trabajo y con l grupo de trabajo de la Dra. Marta Alfaro (INIA, Remehue, Osorno) relacionado con el Proyecto Regular N° 1070239/ 2007, del cual el Dr Juan Kruze es investigador alterno. Finalmente, se gestionó una reunión técnica con las autoridades del Servicio Agrícola y Ganadero, División Protección Pecuaria, de Santiago y Puerto Montt, con la finalizad de revisar y discutir el documento de trabajo elaborado por el SAG: "Manual de Prodecimientos: Propuesta de estándares Paratuberculosis bovina (PTBC)". Esta reunión se realizó en Valdivia el martes 22 de Enero con participación de los Drs. Luis Paredes (SAG, Puerto Montt) y Rubén Moreira (SAG, Santiago), además del Dr M.T. Collins, Dr Miguel Salgado y Dr Juan Kruze. Como resultado de esta reunión, el SAG deberá elaborar un Programa definitivo de Certificación de Rebaños para ser aplicado a nivel nacional en Chile, con la asesoría del Dr Collins y nuestro grupo de trabajo. VII.- ANEXOS 1. Informe declaración de gastos proyecto regular N°105063912005. 2. Declaración jurada que certifica la pérdida de documentos de respaldo de los años de ejecución 2005, 2006, y 2007 (noviembre) a consecuencia del incendio que afectó a la Facultad de Ciencias. 3. Informe declaración de gastos Proyecto de Incentivo a la Cooperación Internacional N07070188/2007. 4. Portadas y Resúmenes de las siguientes Tesis finalizadas en el período 2007: a) Mónica Viviana Pradenas Ferreira (Doctorado en Ciencias Veterinarias): Obtención de proteínas secretadas de Mycobacterium avium subsp paratuberculosis para su posible uso como antígenos en pruebas diagnósticas. b) María Clara Jara Wilde (Bioquímico): Detección de proteínas inmunogénicas de Mycobacterium avium subsp paratuberculoSiS. María Paulina Fry Bravo (Magíster en Ciencias MI Microbiología): Evaluación de cuatro kits comerciales de inmuno-enzimo ensayo (ELISA) para el diagnóstico de paratuberculosis bovina. d) Nancy Camita Hernández Villegas (Bioquímico): Purificación de antígenos proteicos a partir de cepas chilenas de Mycobacteríum avíum subsp para tuberculosis. c) S. Documento de la Escuela de Medicina Veterinaria de la UACh que acredita inscripción de Tesis del estudiante Sergio Gallardo Valenzuela, titulada: "Evaluación de una prueba de enzimoinmuno ensayo (ELISA-UACh) para el diagnóstico de paratuberculosis bovina con muestras de suero y leche. 6. Abstracts presentados al 9' Internacional Colloqium on Paratuberculosis, Tsukuba, Japón, oct/nov 2007. 7. Abstract presentado en la VIII Jornada Chilena de Buiatría, Frutillar, Chile, noviembre 2007. 8. Publicaciones: a) Fry, P. et al. Prueba de galera de manuscrito aceptado en el Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, vol. 20 (3), 2008. (Evaluation of four commercial enzyme-linked immunosorbent assays for the diagnosis of bovine paratuberculosis in Chitean dairy he rds). b) Jara, M.C. et al. Abstract y carta de recepción de manuscrito enviado para su publicación a BMC Microbiology (Comparison of two liquid culture media to detect antigenic proteins secreted by Mycobacterium avium subsp. para tuberculosis). c) Pradenas, M. et al. Abstract y carta de recepción de manuscrito enviado para su publicación a Veterinary Microbiology (Antibody to secreted proteins of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in sera from infected ruminants). d) Salgado, M. et al. Abstract publicado en Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 19:99-102, 2007. (Diagnosis of paratuberculosis by fecal culture and ELISA on milk and serum simples in two types of Chilean dairy goats herds). e) Kruze, J. et al. Abstract publicado en Archivos de Medicina Veterinaria 39: 147-152, 2007 (Paratuberculosis en rebaños caprinos chilenos). f) Salgado, M. et al. Abstract y carta de recepción de manuscrito enviado para publicación en Journal of Wildlife Diseases (First isolation of Mycobacterium para tuberculosis from wild guanacos (Lama guanicoe) in Tierra del Fuego Island).