Presentación AFLP

AFLP
(Amplified Fragment Length
Polimorphic)
Polimorfismo de Longitud de
Fragmentos Amplificados
Características principales
• Es una combinación de las tecnologías de RFLP y
de pcr
• Está basada en la amplificación selectiva de
los fragmentos de restricción mediante la PCR
• Es un método muy sensible para caracterizar
el ADN cualquiera que sea su origen y su
complejidad
• Se puede aplicar con ADN genómico total o
con ADNc
Ventajas
• Son altamente reproducibles
• No se necesita información previa de las
secuencias ni hay que generar sondas de
hibridación
• Es una técnica muy útil para crear mapas
genéticos en forma rápida
• Los AFLP permiten una exploración rápida de
los polimorfismos del genoma entero
Desventajas
• Los AFLP generan cantidades enormes de
información, por lo que pueden requerir un
análisis automatizado y, por consiguiente,
tecnología de computación adecuada
• Son de tipo dominante
• Requieren bastante técnica en el laboratorio y,
especialmente, en el análisis de los datos
Etapas de los AFLPs
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Digestión del ADN
Ligación deadaptadores
Preamplificación (PCR)
Amplificación Selectiva (segundo PCR)
Corrimiento en geles de poliacrilamida
Digestión del ADN
• Corte con Enzimas de Restricción: EcoR1 (de
corte raro) y Mse1 (de corte frecuente)
Sitios de corte de algunas enzimas de
restricción
Digestión del ADN
ADN de doble cadena
5´ ----GAATTC------------------------------TTAA---- 3´
3´ ----CTTAAG------------------------------AATT---- 5´
Digestión del ADN
5´ AATTC------------------------------T
3´
3´
G------------------------------AAT 5´
Corte con enzima
de restricción EcoR1
Corte con enzima
de restricción Mse1
Ligación de adaptadores
• EcoRI-adaptador
5’-CTCGTAGACTGCGTACC
OLIGO #1
CATCTGACGCATGGTTAA-5’ OLIGO #2
• MseI-adaptador
5’-GACGATGAGTCCTGAG
OLIGO #3
TACTCAGGACTCAT-5’
OLIGO #4
Ligación de adaptadores
5´ GTAGACTGCGTACCAATTC----------TTACTCAGGACGCATC 3´
3´ CATCTGACGCATGGTTAAG---------AATGAGTCCTGAGTAG 5´
Adaptador EcoR1
Adaptador Mse1
Preamplificación
• Preamplificación EcoR1 primer
5´ GACTGCGTACCAATTC + N(A) 3´
• Preamplificación Mse1 primer
5´ GATGAGTCCTGAGTAA + N(C) 3´
Alineamiento de primers en PCR de
preamplificación
• Alineamiento primer EcoR1+A
5´ GACTGCGTACCAATTCA 3´
3´ CTGACGCATGGTTAAGT---------AATGAGTCCTGAGTAG 5´
• Alineamiento del primer Mse1+C
5´ GTAGACTGCGTACCAATTC--------GTTACTCAGGACTCATC 3´
3´CAATGAGTCCTGAGTAG 5´
Amplificación Selectiva
• Primers selectivos para EcoR1
5´ GACTGCGTACCAATTC + AAC 3´
5´ GACTGCGTACCAATTC + AAG 3´
5´ GACTGCGTACCAATTC + ACA 3´
5´ GACTGCGTACCAATTC + ACC 3´
5´ GACTGCGTACCAATTC + ACG 3´
5´ GACTGCGTACCAATTC + ACT 3´
5´ GACTGCGTACCAATTC + AGC 3´
5´ GACTGCGTACCAATTC + AGG 3´
• Primers selectivos para Mse1
5´ GATGAGTCCTGAGTAA + CAA 3´
5´ GATGAGTCCTGAGTAA + CAC 3´
5´ GATGAGTCCTGAGTAA + CAG 3´
5´ GATGAGTCCTGAGTAA + CAT 3´
5´ GATGAGTCCTGAGTAA + CTA 3´
5´ GATGAGTCCTGAGTAA + CTC 3´
5´ GATGAGTCCTGAGTAA + CTG 3´
5´ GATGAGTCCTGAGTAA + CTT 3´