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Fisiogenética Vegetal
USO DE MARCADORES MOLECULARES,
aplicaciones y ejemplos
Cecilia Baginsky
- Tradicionalmente los marcadores moleculares utilizados
en estudios genéticos y de mejoramiento eran aquellos
controlados por genes asociados a caracteres
morfológicos,
en
general
fenotipos
de
fácil
identificación
-La mejora genética dependía de:
- variabilidad genética,
- heredabilidad del carácter que se quería aislar,
- eficacia en la intensidad de la selección aplicada,
- tiempo necesario para realizar un ciclo de selección.
Problemas:
Desconocimiento
¾ Número y efecto de los
genes implicados en la
expresión de un carácter
¾ Localización de estos genes
¾ Función fisiológica
MARCADORES MOLECULARES
Definición:
Definición
Son todos aquellas moléculas (proteínas o ADN) que se
pueden identificar y caracterizar para definir un
genotipo determinado. Muchos de ellos permiten la
asociación de genotipos con fenotipos específicos.
Definición
Es cualquier fenotipo molecular, oriundo de la expresión
de un gen, como es el caso de las isoenzimas o de
segmentos específicos de DNA (correpondiente a
regiones expresadas o no del genoma), que puede ser
detectado y su herencia monitoreada (Ferreira y
Gattapaglia, 1998)
Polimorfismos de DNA
- Variaciones, más o menos complejas en la secuencia de
ADN.
- Varios eventos pueden producir poliformismo:
- Mutuaciones puntuales
- Inserciones o delecciones
- Nuevos arreglos
- Un marcador es polimorfico cuando existen distintas
variantes o “alelos” del marcador dentro de la
población bajo estudio
MARCADORES MOLECULARES
PROTEINAS
• Isoenzimas
ADN
• RFLP (Random Fragments Length Polimorphism)
• PCR- RAPDs (Random Amplified Polimorphic DNA)
• AFLPs (Amplified Fragment Length Polimorphism)
• Minisatélites o VNTR
• Microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeats)
CLASIFICACIÓN DE LOS MARCADORES
MOLECULARES
• Basados en electroforesis de proteínas (Alozímas).
• Basados en hibridación de sondas “Southern Blot” (RFLP
y MINIsatelites o VNTR).
• Basados en PCR (PCR-RFLP, RAPD, AFLP, SSR o
MICROsatelites).
CONCEPTOS CLAVES DE LA GENÉTICA
GENOTIPO
ADN
5’
3’
genes
ARNm
proteínas
células
FENOTIPO
+
AMBIENTE
organismo
tejidos,
órganos
BASE MOLECULAR DE LA
A
A
a
a
GENETICA MENDELIANA
Genealogía para un gen
recesivo
¼
½
¼
A
A
a
A
a
a
mutación que
produce una
proteina corta
E L E C T R O F O R E S I S
Marcadores Moleculares en
base a electroforésis de
proteínas
ISOENZIMAS
ISOENZIMAS
Definición:
Grupo de múltiples formas moleculares de la misma
enzima presentes en una especie, como resultado de la
presencia de más de un gen codificado para cada una
de las enzimas (Moss, 1982)
Desempeñan la misma actividad catalítica pero pueden
tener diferentes propiedades cinéticas. Su diferente
estructura y carga eléctrica hace que presenten
distinta movilidad electroforética en geles de almidón
Modo de herencia CODOMINANTE.
Se corta el gel en
láminas delgadas
Tinción enzimática específica
para distintas láminas
Shikimato
Ácido
Shikímico
Deshidrogenasa
NADP +
3 Deshidro
Shikimato
Precipitado
Azul
NADPH + MTT
Variantes isoenzimaticas de la enzima Shikimato deshidrogenada
SKHD en poblaciones de arroz silvestre brasileñas.
Ventajas de las isoenzimas
•
Simplicidad
•
Mínima cantidad de material en estudio
•
Altamente reproducible
•
Bajo costo
•
Codominante, lo que permite hacer
comparaciones entre especies, poblaciones de
una misma especie y detectar la presencia de
híbridos
Deventajas de las isoenzimas
•
No es capaz de detectar suficiente
polimorfismo al presentar pocos alelos por
locus, especialmente cuando la base genética es
estrecha (entre variedades o especies
próximas)
•
Pueden no reflejar los cambios genéticos que
ocurren en el DNA, además sólo un set de
genes estructurales están representados en
estas proteínas, es decir, sólo parte del
genoma se puede evaluar
Marcadores basados en hibridación de sondas
RFLP = Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción.
• En este método el DNA genómico es digerido con
endonucleasas de restricción.
• Posteriormente este material es transferido a una
membrana e hibridado con sondas homólogas marcadas
con radioactividad o quimioluminiscencia.
• El polimorfismo es detectado en el tamaño de los
fragmentos obtenidos al digerir DNA genómico.
• Modo de herencia CODOMINANTE.
RFLP
Digestión con enzimas de restricción y electroforesis
La hibridación es necesaria
para detectar fragmentos
específicos
Hibridación del DNA: Procedimiento
Bandas de DNA en
la membrana
Hibridación con
una sonda
Sonda
hibridada
Lavado del
filtro
Expuesto a una
película de
rayos-X
Autorradigrafia de marcadores
RFLP revelados por medio de
una sonda radioactiva
Segregación mendeliana de marcadores RFLP en Brassica napus
Hind III 3´- T T C G A A – 5´
5´- A A G C T T – 3´
INDIVIDUO 1
SONDA
H
H
4 kb
H
2 kb
Hind III
4 kb
INDIVIDUO 2
Electroforésis en
agarosa
4 kb
+
2 kb
H
2 kb
H
4 kb
2 kb
falta !
Hind III
6 kb
“LOCUS POLIMÓRFICO”
6 kb
Interpretación de bandas de RFLP
Una mutación crea un nuevo sitio de restricción dentro del
ADN objetivo. Se detectan por lo tanto dos nuevas bandas
sobre la membrana
Sitio de restricción
Sonda
Nuevo sitio de restricción
Interpretación de bandas de RFLP
Una mutación crea un nuevo sitio de restricción entre los sitios de
restrición flanqueantes, creando un fragmento de restricción más
pequeño
Sitio de restricción
Sonda
Nuevo sitio de restricción
Interpretación de bandas de RFLP
Una inserción de una secuencia de ADN entre los sitios
de restricción flanqueantes crea un fragmento más
grande de restricción
Sitio de restricción
Sonda
Evento de inserción
Interpretación de bandas de RFLP
Una delección de una secuencia de ADN entre los sitios
de restricción flanqueantes crea un fragmento más
pequeño de restricción
Sitio de restricción
Sonda
Evento de delección
Marcadores basados en hibridación de sondas
VNTR = Número variable repetidos en tandem.
minisatélites
Secuencias de DNA repetidas una al lado de la otra
(motivo repetido de 15 a 100 pb).
Técnicamente es muy similar a los marcadores RFLP,
sin embargo, difiere en la naturaleza de la sonda.
En este caso se hibrida una sonda que es homóloga a
la secuencia del motivo central del minisatelite.
El polimorfismo detectado se debe a diferencias en
el número de repeticiones.
Es una metodología MULTI-LOCUS (DNA fingerprint)
Analisis de segregación por
DNA fingerprint en 13
hijos de Gallus gallus. El
DNA fue digerido con
HaeIII.
Los ciculos blancos indican
bandas maternas F y los
negros paternas M.
Aplicaciones Agronómicas
Debido a que en general es una técnica mutilocus, su
uso esta restringido a la identificación de variedades
o “accesiones” en bancos de germoplasma.
Muy útiles para asignación de paternidad entre
individuos o entre variedades comerciales de algunos
cultivares.
Se han utilizado para confirmar el origen clonal de
algunas variedades de animales y plantas.
VENTAJAS
• Muchas de las sondas son
“universales” y se pueden
utilizar en una amplia
gama de organismos.
• Se puede lograr amplia
cobertura del genoma.
DESVENTAJAS
• Es una metodología laboriosa
de desarrollar.
• Debe tenerse algún
conocimiento previo del
genoma del organismo bajo
estudio para la construcción
de sondas.
• Se puede desarrollar un
número ilimitado de
marcadores.
• Requiere personal altamente
entrenado.
• Es posible reutilizar las
membranas de hibridación
abaratando los costos.
• Instalaciones adecuadas
para manipular y disponer
del material radioactivo.
Marcadores basados en PCR
PCR
Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
Atributos de los marcadores basados en PCR
(Reacción en Cadena de la Polimerasa)
(Sunnucks 2000)
• Para la PCR se puede usar bajas cantidades de ADN (incluso se
puede usar ADN degradado) y se pueden selecciónar regiones
específicas de ADN
• Los primer usados para la PCR que amplifican regiones homólogas
sobre un amplio rango taxonómico generan datos comparables
directamente, facilitando de este modo el análisis
. El DNA se puede extraer desde material viejo, se pueden
coleccionar y almacenar las muestas.
Test de reacción de PCR a través de un gradiente
de temperatura sobre un termociclador
51°C
Producto buscado
Producto no buscado
59°C
Amplificación de ADN en forma Aleatórea
(RAPD, Random Ampliphied Polymorphic DNA)
•Para el PCR se utiliza un sólo partidor corto (10 bases)
y temperatura de unión de los partidores de 35 ºC .
Estos partidores se unen al azar a sitios complementarios en el
ADN genómico. Si dos partidores se unen en sentido opuesto
dentro de una distancia de ~ 3000 pb se obtiene la amplificación de
un fragmento de ADN.
•El polimorfismo detectado se debe a presencia o
ausencia del fragmento amplificado.
Los marcadores son de tipo DOMINANTE y la técnica es MULTILOCUS
Amplificación de ADN en forma Aleatórea
(RAPD, Random Ampliphied Polymorphic DNA)
Muestras de ADN
Transiluminador
Termociclador
Gel de Agarosa
Detección del producto de RAPD
Electroforesis en geles de agarosa y visualización con
bromuro de etidio
Los RAPDs pueden detectarse corriendo el producto del PCR a través de una
electroforesis en un gel de agarosa o acrilamida. En ambos casos el gel se tiñe con
bromuro de etidio
Las diferencias obtenidas al correr los productos de RAPD en acrilamida versus
agarosa se deben básicamente al grado deresolución de las bandas. En la mayoría de
los casos la electroforesis en geles de agarosa dan una buena resolución
Interpretacíón del patrón de bandas de RAPD
Ejemplo de un mal gel de RAPD
Interpretacíón del patrón de bandas de RAPD
Ejemplo de un buen gel de RAPD
El cuadro muestra una imagen de una mala
calidad de un gel de RAPD. Las bandas están
borrosas. En la parte superior hay una mancha
donde el producto de PCR fue cargado y algunas
bandas no se pueden ver bien. El total de
bandas está medio difuso y hace difícil la
observación. En algunas partes se ven como dos
bandas por sitio. Todo ello hace difícil su
interpretación y se podría cometer errores de
alto riesgo.
El cuadro muestra una imagen de una muy buena
calidad de un gel de RAPD. Tanto la presencia
como la ausencia de la mayoría de las bandas son
muy claras y el background en transparente. Los
investigadores pueden no tener dudas en la
selección de bandas u colección de datos desde
este gel. Por lo tanto, la interpretación de los
resultados puede ser muy segura.
MICROSATÉLITES (secuencia repetidas simple)
(SSR, Simple Sequence Repeat)
• Son secuencias repetidas en tandem en la que le motivo
repetido fluctúa entre 1 y 4 nucleótidos.
• Para el PCR se utilizan partidores específicos que son
complementarios a las secuencias que flanquean el
microsatélite, normalmente son especie específicos.
• El polimorfismo detectado se debe a diferencias en el
número de repeticiones.
• Los marcadores son de tipo CODOMINANTE y la técnica
es de LOCUS UNICO.
Secuencia únicas repetidas (STRs)
Microsatélites
AATG
7 repeats
8 repeats
las regiones repetidas son variables entre las muetras mientras
que las regiones flanqueantes donde los primer de la PCR se
unen son constantes
195
195bp
bp
170
170bp
bp
TCAT
TCATunidad
unidadrepetida
repetida
Diferentes set de primer producen distintos tamaños de productos
de PCR para un mismo alelo de STR
Amplificación de secuencias repetidas
Partidores específicos
Genotipo 1
Genotipo 2
GTGTGT
CACACA
GTGTGTGTGTGT
CACACACACACA
1
2
Diagrama
que
muestra
el
polimorfismo de los microsatélites
debido a las diferencias en su
longitud. En un individuo diploide el
cromosoma A contiene el alelo (ACC)8
mientras que el cromosoma A’ en el
locus homólogo presenta el alelo
(ACC)6. Mediante la Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR),
utilizando primer diseñados en las
regiones flanqueantes, los alelos son
amplificados
para
luego
ser
separados mediante una corrida
electroforética.
El diagrama muetra el patrón de bandas que deben determinar tanto los
homocigotos como el heterocigoto para los mencionados alelos.
Por qué se prefieren los STRs como
marcadores genéticos
• Son altamente variables dentro de varias poblaciones
• Son los que contienen el más elevado contenido de información
polimorfica
• Son muy frecuentes y están distribuidos al azar, lo que permite la
cobertura total de cualquier genoma
• El PCR permite el uso de pequeñas cantidades de ADN (1 ng de
ADN total)
• Son CODOMINANTES
Métodos de Visualización de Microsatélites
Genotipos microsatélites visualizados en un gel
de agarosa y teñidos con Bromuro de Etidio.
Genotipos microsatélites
visualizados en un gel de
poliacrilamida y teñidos
con plata
AFLP:
Amplified Fragment Length Polymorphism
(Amplificación de ADN de largo polimórfico)
Tecnología del AFPL: Paso a paso
Principales caracetrísticas
♦ Una combinación de RFLP y la técnica de PCR
♦ Basada en una selectiva amplificación por PCR
fragmentos de restricción obtenidos de un DNA digerido
de
♦ Elevado número de polimorfismo y gran poder de detección
de variabilidad genética
♦ No requiere de un conocimiento genético previo del
organismo o especie a estudiar
♦ Requiere muy poca cantidad de DNA
♦ Es un método altamente sensible para huellas dactilares de
DNA de cualquier origen y complejidad. Se utiliza para
visualizar polimorfismo de DNA entre las diferentes muestras
de un germoplasma, para generar mapas de ligamiento.
Cuatro pasos
•
El DNA se digiere con dos enzimas de restricción
•
Se incorporan adaptadores de oligonucleótidos específicos a
los extremos de los fragmentos genómicos generados por la
digestión enzimática
• Una fracción de los fragmentos de DNA generados se
amplifica selectivamente vía PCR utilizando primer específicos
diseñados para reconocer la secuencias en los adaptadores.
• La detección del pólimorfismo se puede verificar en geles de
poliacrilamida los cuales pueden ser directamente visulizados
con nitrato de plata. También se pueden marcar
radioactivamente los productos amplificados y luego
visualizarlos
en
un
gel
de
poliacrilamida
mediante
autoradiografía
AMPLIFICACIÓN DE ADN DE LARGO POLIMÓRFICO
(AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism)
Parte 1 ➨ Digestión del DNA con enzimas de restricción
Parte 2
➨ Ligar adaptadores específicos
Mse I
TTAA
CTTAAG
Eco RI
AFLP
Parte 3 ➨ Amplificación de fragmentos de
DNA con partidores específicos
TTAA
CTTAAG
G1
Separación de fragmentos
en gel de secuenciación
G2
Desde el manual
Invitrogen AFLP
Gel de AFPL que corrió con una tinción fluorescente
Esta imagen muestra un gel de AFLP que corrió en un secuenciador automático. Antes de cargar el
gel las muestras se pueden marcar con 2 o 3 tinciones fluorescente (amarillo, azul y verde).
Detectar la presencia o ausencia de una banda en particular es casi imposible debido al alto número
de bandas obtenidas a través de esta técnica y además por que las tinciones fluorescentes no deben
verse por lo ojos. Las bandas se determinan con un laser y la interpretación se debe realizar con un
programa adecuado.
Comparación de Marcadores moleculares
PRINCIPIO
RFLP
SSR
RAPD
AFLP
Corte
Amplif.
(PCR)
Amplif.
(PCR)
Corte y
(ER)
amplif.
(ER-PCR)
POLIMORF.
Moderado
Alto
Moderado
Modrado
# LOCI
1-3
1
1-10
Muchos
DOMIN.
Codom.
Codom.
Dom.
Dom.
DETEC.
Radiact.
Nit.Plata
Br. Etidio
Br. Etidio
Si
No
Si
Alto
Medio
Alto
CONOCIM.
GENOMA
COSTO
Ninguno
Medio
Aplicaciones de corto plazo
• Identificación de parentales o test de paternidad
• Identificación y protección de variedades
• Certificación de pureza genética en la producción
de híbridos
• Monitoreo de fecundación cruzada y
autofecundación
• Evaluación de germoplasma y poblaciones de
mejoramiento (variabilidad, diversidad,
clasificación distancia genética y filogenia)
Aplicaciones de mediano y largo plazo
• Construcción de mapas genéticos de ligamiento
• Mapeo genético de QTL (Quantitative Trait Loci)
• Exploración de locus homólogos en otras especies, a
través de mapeo comparativo
• Introgresión de características vía retrocruzamiento
asistido por marcadores
• Selección temprana en cultivos perennes
Filogenia para accesiones de Fragaria
Contulmo1
Contulmo2
Contulmo3
Contulmo4
Contulmo5
MarBrava1
MarBrava2
MarBrava3
MarBrava4
MarBrava10
MarBrava5
MarBrava6
MarBrava9
MarBrava7
MarBrava8
Chepu1
Chepu4
Chepu3
Chepu5
Chepu6
Carelmapu1
Carelmapu2
Carelmapu3
Carelmapu5
Carelmapu6
Futrono3
Futrono1
Futrono2
Futrono5
Futrono4
Quellón1
Quellón2
Quellón3
Quellón5
Mocopulli1
Mocopulli2
Mocopulli4
Mocopulli5
Butalcura1
Butalcura3
Butalcura4
Butalcura5
Butalcura2
Quemchi9
Quemchi22
Quemchi6
Quemchi1
Quemchi5
Quemchi11
Quemchi19
Quemchi17
Quemchi23
Quemchi10
Quemchi21
Quemchi20
Quemchi16
Quemchi18
Quemchi14
Quemchi12
Quemchi13
Quemchi24
Quellón4
Cucao2
Mocopulli3
Cucao1
Chepu2
Carelmapu4
Manzanar1
Manzanar3
Manzanar5
Manzanar8
Selva
Chandler
0.49
0.61
0.74
Coefficient
0.87
1.00
Type I
Type III
Type IV
Type II
Type I
F.ananassa
Mapa cromosomal
Griffit et al 2000
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