LY. ON N TIO I NG R M MA E OR FOR R E F F R N S I E Y T P R A R FO H E N ALW I N S E W SAY AG E D S IE CK EA TH O PA U PPL KIT T E S H HT WIT ES EIA HE4 REF 404-10 IVD Instrucciones de uso. 2014-12 Use By/Годно до/Použitelné do/ EN EXPLANATION OF SYMBOLS Holdbar til/Verwendbar bis/ BG ОБЯСНЕНИЕ НА СИМВОЛИТЕ Ημερομηνία λήξης/Fecha CS VÝZNAM SYMBOLŮ DA SYMBOLFORKLARING DE ERKLÄRUNG DER SYMBOLE EL ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΩΝ ΣΥΜΒΟΛΩΝ ES SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS ET SÜMBOLITE SELGITUS FR EXPLICATION DES SYMBOLES Použite´né do/ Uporabno do/ HR OBJAŠNJENJE SIMBOLA Upotrebljivo do/Son Kullanma Tarihi HU JELMAGYARÁZAT IT SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI LT SIMBOLIŲ PAAIŠKINIMAI LV SIMBOLU SKAIDROJUMS NL VERKLARING DER SYMBOLEN de caducidad/Kõlblik kuni/ Utiliser jusque/Rok valjanosti/ Felhasználható/Utilizzare entro/ Sunaudoti iki/Izlietot līdz/Houdbaar tot/Brukes innen/ Użyć przed / Prazo de validade/Expiră la/ Использовать до/Använd före/ Batch code/Номер на партида/ Číslo šarže/Lotnummer/ Chargenbezeichnung/Αριθμός Παρτίδας/Código de lote/Partii kood/Code du lot/Kod serije/ NOSYMBOLFORKLARING PL OBJAŚNIENIE SYMBOLI PT EXPLICAÇÃO DOS SÍMBOLOS RO SEMNIFICAŢIA SIMBOLURILOR RU ОБОНАЧЕНИЯ Sarzsszám/Codice del lotto/ Partijos kodas /Partijas kods /Lot nummer/Partikode/Kod partii/ Código do lote/Număr de lot/ Номер лота/Lotnummer/Číslo SVSYMBOLFÖRKLARING šarže/Številka serije/Kod partije/ SK VÝZNAM SYMBOLOV Parti Kodu SL RAZLAGA SIMBOLOV SR OBJAŠNJENJE SIMBOLA TR SEMBOLLERİN AÇIKLAMALARI 1 Date of manufacture/Дата на 8 oC производство/Datum výroby/ Produktionsdato/Herstellungsdatum/ Ημερομηνία παραγωγής/Fecha de 2 oC Temperature limitation/ Температурни граници/ Teplotní omezení/ Temperaturbegrænsning/ fabricación/Valmistamise kuupäev/ Temperaturbegrenzung/ Date de fabrication/Datum proizvodnje/ Περιορισμοί θερμοκρασίας/ Gyártási idő/Data di produzione/ Límites de temperatura/ Pagaminimo data/Ražošanas datums/ Temperatuuri piirang/ Productiedatum/Fremstillingsdato/ Limite de température/ Data produkcji/Data de fabrico/Data Temperaturno ograničenje/ fabricaţiei/Дата производства/ Hőmérsékletre vonatkozó korlátozás/ Tillverkningsdatum/Dátum výroby/Datum Limiti di temperatura/ izdelave/Datum proizvodnje/Üretim tarihi Temperatūriniai apribojimai/ Temperatūras ierobežojums/ IVD In Vitro Diagnostic Medical Device/ Temperatuurbeperking/ Медицински уред за диагностика Temperaturbegrensninger/ ин витро/Diagnostický zdravotnický Temperatury graniczne/ prostředek in vitro/Medicinsk udstyr til Limite de temperatura/ in vitro-diagnostik/In-vitro-Diagnostikum/ Limite de temperatură/ Ιατροτεχνολογικό προϊόν για διάγνωση Температурный режим/ In Vitro/Dispositivo médico para Temperaturbegränsning/ diagnóstico in vitro/In vitro diagnostiline Teplotné obmedzenie Omejitev temperature/ meditsiiniseade/Dispositif médical de diagnostic in vitro/Diagnostički medicinski Temperaturno ograničenje/ uređaj In Vitro/In vitro orvosdiagnosztikai Sıcaklık sınırlaması/ eszköz/Dispositivo medico per test diagnostici in vitro/In Vitro Diagnostinė Contains sufficient for <96> tests/Съдържа Medicinos Priemonė/Medicīniska ierīce достатъчно количество за тестове in vitro diagnostikai/In vitro-diagnostisch <96>/Lze použit pro <96> testů/Indeholder medisch instrument/In vitro diagnostisk tilsttrækkeligt/Inhalt ausreichend für <96> medisinsk utstyr/Wyrób medyczny do Prüfungen/Περιεχόμενο επαρκές για diagnostyki in vitro/Dispositivo Médico «96» εξετάσεις/Contenido suficiente para de Diagnóstico In Vitro/Dispozitiv medical <96> ensayos/Kogusest piisab <96> testi pentru diagnostic in vitro/Только для läbiviimiseks/Contenu suffisant pour “96” диагностики In Vitro/Endast för in tests/Sadrži dovoljno za <96> testova/A vitro-diagnostik/ Zdravotnícka pomôcka na doboz tartalma <96> vizsgálat elvégzéséhez diagnostiku in vitro/In vitro diagnostični elegendő/Contenuto sufficiente per “96” pripomoček/Diagnostički medicinski saggi/Turinys skirtas atlikti <96> tyrimus/ uređaj In Vitro/<96> testleri için yeterlilik Saturs pietiekams <96> testiem/Inhoud içerir voldoende voor “96” testen/til ”96” test/ Tilstrekkelig innhold for <96> prøver/ REF Catalogue number/Каталожен номер/ Wystarczy na wykonanie <96> testów/ Katalogové číslo/Katalognummer/ Conteúdo suficiente para “96” ensaios/ Bestellnummer/Αριθμός καταλόγου/ Conţinut suficient pentru 96 de teste/ Número de catálogo/Kataloogi number/ Содержит достаточные количества для Numéro de catalogue/Kataloški broj/ «96» определений/Innehåller tillräckligt Katalógusszám/Numero di catalogo/ till “96” antal tester/Obsah postačuje na Katalogo numeris/Numurs katalogā/ tento počet testov: <96>/Vsebina zadostuje Catalogusnummer/Katalognummer/ za <96> testov/Sadržina dovoljna za <96> Numer katalogowy/Número do catálogo/ testova/<96> testleri için yeterlilik içerir Număr de catalog/Номер по каталогу/ Produktnummer/Katalógové číslo/ Kataloška številka/Kataloški broj/ Katalog numarası 2 Consult Instructions for Use/ ORIG HUM Human/С човешки произход/Lidské/ Прочетете инструкцията за Humant/Human/δείγματα αναφοράς/ употреба/Konzultujte s návodem Humano/Inimpäritolu/Humaine/Ljudskog k použití/Se brugsanvisning/Siehe porjekla/Humán/Origine Umana/ Gebrauchsanweisung/Συμβουλευτείτε Žmogaus kilmės/Cilvēku izcelsmes/ τις Οδηγίες σχετικά με τη χρήση/ Human/Menneske/Ludzka/Humano/ Consulte las instrucciones de uso/ Origine umană/Человеческого Vt kasutusjuhendit/Consulter le mode происхождения/Human/Ľudské/ d’emploi/Pročitajte upute za uporabu/ Humanega izvora/Ljudskog porekla/İnsan Olvassa el a használati utasítást/ Consultare le istruzioni per l’uso/Dėl ORIG MOU From mouse/С миши произход/Myší/ naudojimo žiūrėkite instrukcijas/Izlasiet Fra mus/Maus/απο ποντίκι/de ratón/ lietošanas instrukciju/Raadpleeg de Hiirtelt/De souris/Mišijeg porjekla/ instructies voor gebruik/Les instruksene Egérből/Murino/Pelės kilmės/No peles/ før bruk/Sprawdzić w instrukcji użycia/ Van muizen/Fra mus/Mysia/Do rato/De Consulte as Instruções de Utilização/ la şoareci/Мышиного происхождения/ Consultaţi instrucţiunile de utilizare/ Från mus/Myšie/Mišjega izvora/Mišijeg Обратитесь к инструкции по porekla/Fareden применению/Se bruksanvisning/ Prečítajte si návod na používanie/ ORIG BOV Bovine/С говежди произход/ Pročitajte uputstvo za upotrebu/ Hovězí/Bovin/Rind/από βοοειδή/ Kullanım Talimatlarına Bakınız Bovino/Veistelt/Bovine/Rogate stoke/ Szarvasmarha/Bovino/Jaučio/No CONT Contents of kit/Съдържание на набора/ liellopa/Bovien/Bovin/Wołowy/Bovino/ Obsah soupravy/Kittets indhold/Inhalt Origine bovină/крупного рогатого des Kits/Περιεχόμενα του κιτ/Contenido скота/Från ko/Hovädzie/Govejega del kit/Komplekt sisaldab/Contenu du izvora/Rogate krupne stoke/Bovin kit/Sadržaj opreme/A készlet tartalma/ Contenuto del kit/Rinkinio turinys/ Komplekta saturs/Inhoud van de set/ Settets innhold/Zawartość zestawu/ Reconstitute with/Разтваряне с/ Rozřeďte pomocí/Rekonstitueres med/ Rekonstituieren mit/Ανασύσταση με/ Conteúdo do kit/Conţinutul setului/ Reconstituir con/Lahjendamine/ Компоненты набора/Kit innehåll/ Reconstituer avec/Rekonstituirajte s/ Obsah súpravy/Vsebina kompleta/Sadržaj Feloldáshoz/Ricostituire con/Atkurti, opreme/Kitin içindekiler ištirpdant su/Atšķaidīt ar/Reconstitutie met/Rekonstitueres med/Odtworzyć Biological risks/Биологическа za pomocą/Reconstituir com/A опасност/Biologická rizika/Biologisk se reconstitui cu/Растворить в/ fare/Biologische Gefahren/Βιολογικοί Rekonstituera med/Rozrieďte pomocou/ κίνδυνοι/Riesgos biológicos/ Rekonstituirajte z/s/Ponovno formiranje Bioloogilised ohud/Risques biologiques/ sa/Yeniden oluşturulur Biološkli rizici/Biológiai kockázatok/Rischi biologici/Biologinis pavojus/Bioloģiskais Manufacturer/Производител/Výrobce/ risks/Biologische risico’s/Biologiske Producent/Hersteller/Kατασκευαστής/ risikoer/Zagrożenie biologiczne/Riscos Fabricante/Tootja/Fabricant/Proizvođač/ biológicos/ Biologisk risk/Pericole Gyártó/Fabbricante/Gamintojas/ biologice/Биологическая опасность/ Ražotājs/Fabrikant/Produsent/ Biologicky rizikové/Biologické riziká/ Producent/Fabricante/Producător/ Biološkli rizici/Biyolojik riskler Производитель/Tillverkare/ Výrobca/ Izdelovalec/Proizvođač/Üretici 3 4 EIA HE4 Instrucciones de uso ES Kit de ensayo enzimoinmunométrico Para 96 determinaciones USO PREVISTO El EIA HE4 es un ensayo enzimoinmunométrico para la determinación cuantitativa de HE4 en suero humano. El ensayo ha de ser utilizado como ayuda en la monitorización de la respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer ovárico epitelial invasivo. El análisis seriado de valores en el ensayo de HE4 de la paciente debe utilizarse en combinación con otros métodos clínicos para la monitorización del cáncer ovárico. También ha sido diseñado para utilizarse conjuntamente con los ensayos ARCHITECT CA125 II, EIA CanAg CA125 o Lumipulse G CA125II, como ayuda en la estimación del riesgo de cáncer ovárico epitelial en mujeres premenopáusicas y posmenopáusicas que presentan una masa pélvica. Los resultados deben interpretarse en combinación con otros métodos según las guías terapéuticas y clínicas estándares. RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO La proteína epididimal humana 4 (HE4) pertenece a la familia de proteínas ácidas séricas con núcleo de 4 enlaces disulfuro (WFDC) con posibles propiedades inhibidoras de la tripsina. Otras proteínas de esta familia son la SLPI, la elafina y la PS20 (WFDC1) (1, 2). El gen HE4 codifica una proteína de 13 kD, aunque en su forma glucosilada madura tiene aproximadamente 20-25 kD y consta de un péptido simple con dos dominios WFDC (3). La HE4 fue identificada por vez primera en el epitelio del epidídimo distal y originalmente se pronosticó que sería un inhibidor de la proteasa implicado en la maduración espermática (4, 5). Desde entonces se ha comunicado que la HE4 se expresa en varios tejidos normales, incluidos los epitelios de los tejidos respiratorio y reproductivo, así como en el tejido del cáncer ovárico (6-10). Además de su expresión a nivel celular, se ha detectado HE4 secretada a niveles elevados en el suero de pacientes con cáncer ovárico. En un estudio de casos y controles que comparó pacientes con cáncer ovárico con mujeres sanas y pacientes con enfermedades benignas, Hellström et al. descubrieron que la HE4 detectaba el cáncer ovárico con una sensibilidad del 67 % y un nivel de especificidad del 96 % (11). En un estudio posterior que evaluó numerosos biomarcadores conocidos del cáncer ovárico, la HE4 presentó la máxima sensibilidad en la detección del cáncer ovárico, particularmente durante la fase inicial de la enfermedad. En este estudio, la combinación de HE4 y CA125 fue un predictor más preciso de neoplasias malignas que cualquiera de los marcadores por separado, con una sensibilidad del 76 % y una especificidad del 95 % (12). 5 El cáncer ovárico es la cuarta causa más frecuente de muerte relacionada con el cáncer en mujeres en todo el mundo. En Europa, la tasa de mortalidad oscila entre 3,6 y 9,3 por cada 100,000 mujeres (13). Los síntomas de cáncer ovárico están relacionados con la presencia de masas anexiales y son a menudo vagos e inespecíficos. El objetivo principal de la evaluación diagnóstica de una masa anexial es determinar si es benigna o maligna. Se estima que entre el 5 y el 10 % de las mujeres estadounidenses se someterán a una intervención quirúrgica por una posible neoplasia ovárica durante su vida y entre el 13 y el 21 % de dichas mujeres tendrán un tumor ovárico maligno (14). El American College of Obstetricians and Gynecologists Practice Bulletin publicado en 2007 indica lo siguiente: “Las mujeres con cáncer ovárico atendidas por médicos con formación y especialización avanzadas en el tratamiento del cáncer ovárico, como los oncólogos ginecólogicos, presentan mejores índices generales de supervivencia que las que reciben tratamiento sin este tipo de colaboración”. (15). Dado que la mayoría de masas anexiales son benignas, es importante determinar preoperatoriamente si una paciente presenta un alto riesgo de neoplasia ovárica maligna, con el fin de asegurar un tratamiento adecuado (15). Desde el informe inicial de 1988, la impresión clínica, la CA125 sérica y la ecografía, junto con la TC, la RM y la TC/TEP, han sido los estándares para determinar si una masa anexial es una neoplasia maligna (16). Aunque la bibliografía abunda en artículos que describen cuál es la modalidad más precisa, la combinación de exploración física, CA125 y diagnóstico por imagen proporciona el valor pronóstico positivo más elevado (17-19). Para mejorar la clasificación de pacientes con masa pélvica, el EIA HE4 puede utilizarse simultáneamente con los ensayos ARCHITECT CA125 II, EIA CanAg CA125 o Lumipulse G CA125II, como ayuda en la estimación del riesgo de cáncer ovárico epitelial en una paciente. Los resultados deben interpretarse en combinación con otros métodos según las guías terapéuticas y clínicas estándar. Un uso complementario del EIA HE4 es la ayuda en la monitorización de la respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer ovárico epitelial invasivo. Los resultados deben utilizarse en combinación con otros métodos clínicos usados para la monitorización del cáncer ovárico. PRINCIPIO DE LA PRUEBA El EIA HE4 es un inmunoensayo en fase sólida no competitivo basado en la técnica de sandwich directa, que usa dos anticuerpos monoclonales de ratón, 2H5 y 3D8, dirigidos contra dos epítopos del dominio C-WFDC de la HE4. Los calibradores, los controles y las muestras de las pacientes se incuban junto con el anticuerpo monoclonal (MAb) 2H5 anti-HE4 biotinilado en microtiras revestidas con estreptavidina. La HE4 presente en los calibradores o muestras es adsorbida en las microtiras recubiertas con estreptavidina por el MAb anti-HE4 biotinilado durante la incubación. A continuación, las tiras se lavan e incuban con el MAb 3D8 anti-HE4 marcado con HRP. Después del lavado, se añade sustrato tamponado/reactivo cromógeno (peróxido de hidrógeno y 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) a cada pocillo y se deja que se produzca la reacción enzimática. Si hay antígeno, durante la reacción enzimática se desarrollará un color azul. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de HE4 presente en las muestras. 6 La intensidad del color se determina en un espectrofotómetro de microplacas a 620 nm (o bien a 405 nm tras la adición de solución de parada). Se construyen curvas de calibración para cada ensayo representando el valor de la absorbancia con respecto a la concentración de cada calibrador. Finalmente, se leen las concentraciones de HE4 de las muestras de las pacientes a partir de la curva de calibración. REACTIVOS •Cada kit EIA HE4 contiene reactivos para 96 determinaciones. •La fecha de caducidad del kit viene indicada en la etiqueta de la parte exterior de la caja. •No use el kit después de la fecha de caducidad. • No mezcle reactivos de diferentes lotes de kits. • Conserve el kit a una temperatura de 2 ºC a 8 ºC. No lo congele. • Los reactivos abiertos se mantienen estables según los plazos indicados en la tabla siguiente siempre que no estén contaminados, se almacenen en los recipientes originales nuevamente cerrados y se manipulen debidamente. Vuelva a dejarlos a una temperatura de 2 ºC a 8 ºC inmediatamente después de su uso. Componente CantidadAlmacenamiento y estabilidad tras el primer uso MICROPLA Microplaca1 placa 2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en la placa 12 x 8 pocillos separables recubiertos con estreptavidina. Después de abrir el envase, devuelva inmediatamente las tiras no utilizadas a la bolsa de aluminio con desecante. Vuelva a cerrarla cuidadosamente para mantenerlos secos. CAL HE4 A Calibrador A del HE4 1 x 8 mL2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en el vial Solución salina tamponada con fosfato que contiene albúmina sérica bovina, un colorante amarillo inerte y un conservante antimicrobiano sin azida. Listo para su uso. Debe utilizarse también para la dilución de las muestras. 7 Componente CantidadAlmacenamiento y estabilidad tras el primer uso Calibradores B-F del HE4 5 viales, liofilizadosEstabilidad tras la reconstitución 4 semanas a 2-8 °C 4 meses a -20 °C o una temperatura inferior CAL HE4 B CAL HE4 C CAL HE4 D CAL HE4 E CAL HE4 F 1 x 1 mL 1 x 1 mL 1 x 1 mL 1 x 1 mL 1 x 1 mL Los calibradores liofilizados contienen antígeno HE4 en una solución salina tamponada con fosfato con albúmina sérica bovina, un colorante amarillo inerte y un conservante antimicrobiano sin azida. Para reconstituir con agua destilada o desionizada antes de su uso. NOTA: La concentración exacta de HE4 es específica del lote y se indica en la etiqueta de cada vial. Controles del HE4 2 viales, liofilizadosEstabilidad tras la reconstitución 4 semanas a 2-8 °C 4 meses a -20 °C o una temperatura inferior CONTROL HE4 1 1 x 1 mL CONTROL HE4 2 1 x 1 mL Los controles liofilizados contienen antígeno HE4 en una matriz sérica humana y un conservante antimicrobiano sin azida. Para reconstituir con agua destilada o desionizada antes de su uso. BIOTIN Anti-HE4 Anti-HE4 con biotina 1 x 15 mL 8 2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en el vial Anticuerpo monoclonal anti-HE4 de ratón marcado con biotina, aproximadamente 1 μg/mL. Contiene solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2), albúmina sérica bovina, agentes bloqueantes, detergente, un colorante rojo inerte y un conservante antimicrobiano sin azida. Listo para su uso. Componente CONJ Anti-HE4 CantidadAlmacenamiento y estabilidad tras el primer uso Marcador, anti-HE4 con HRP 1 x 0,75 mL2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en el vial Solución de reserva de anticuerpo monoclonal anti-HE4 de ratón marcado con HRP, aproximadamente 40 μg/mL. Contiene conservantes antimicrobianos sin azida. Para diluir con diluyente para marcador antes de usar. DIL CONJ Diluyente para marcador 1 x 15 mL2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en el vial Solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2) que contiene albúmina sérica bovina, agentes bloqueantes, detergentes, un colorante azul inerte y un conservante antimicrobiano sin azida. Listo para su uso. SUBS TMB Sustrato-HRP con TMB 1 x 12 mL2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en el vial Contiene peróxido de hidrógeno tamponado y 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB). Listo para su uso. STOP Solución de parada1 x 15 mL 2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en el vial Contiene ácido clorhídrico 0,12 M. Listo para su uso. 9 Componente WASHBUF CantidadAlmacenamiento y estabilidad tras el primer uso 25X Concentrado de lavado 1 x 50 mL 2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en el frasco Solución salina tamponada con Tris-HCl y estabilizada con Tween 20. Contiene Germall II como conservante. Para diluir 25 veces con agua destilada o desionizada antes de usar. Indicaciones de inestabilidad La solución de sustrato-HRP con TMB debe ser incolora o ligeramente azulada. Un color azul indica que el reactivo se ha contaminado y debe desecharse. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para uso diagnóstico in vitro: • Siga las instrucciones que figuran en el prospecto. La fiabilidad de los resultados del ensayo no puede garantizarse si no se siguen las correspondientes instrucciones de empleo. •Manipule todas las muestras de las pacientes como potencialmente infecciosas. Se recomienda que el reactivo original humano y las muestras humanas se manipulen de acuerdo con el estándar de la OSHA sobre patógenos transmitidos por la sangre (20). Debe aplicarse el nivel de bioseguridad 2 (21), u otras prácticas adecuadas de bioseguridad, para manipular materiales que contienen o se sospecha que contienen agentes infecciosos. •Siga las directrices locales para la eliminación de todos los materiales de desecho. Advertencia Los materiales usados en la preparación del reactivo original humano han sido analizados y se ha comprobado que no reaccionan con los anticuerpos anti-VIH 1 y 2, el anticuerpo anti-VCH y el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Puesto que ningún método puede descartar completamente la presencia de enfermedades transmitidas por la sangre, la manipulación y eliminación de los reactivos originales humanos de este producto deben realizarse como si fueran potencialmente infecciosos. RECOGIDA Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS El EIA HE4 está destinado para utilizarse con suero (incluido el suero recogido en tubos de centrifugadora (SST)). El plasma y otros líquidos corporales no se han validado para su uso con el EIA HE4. Recoja la sangre mediante venopunción y siga las instrucciones de procesamiento del fabricante del tubo de recogida. Cuando se evalúen muestras seriadas, debe utilizarse el mismo tipo de muestra en todo el estudio. 10 El suero puede conservarse entre 2 ºC y 8 °C durante 3 días antes de ser analizado. Para periodos más largos, guarde las muestras a -40 °C o a una temperatura inferior. Lleve las muestras congeladas a temperatura ambiente y mézclelas COMPLETAMENTE invirtiéndolas con cuidado varias veces antes del análisis. Las muestras que contienen partículas grandes deben centrifugarse a 10,000 x g durante 10 minutos antes del uso para eliminar cualquier material particulado que pueda haberse formado en el proceso de descongelación. PROCEDIMIENTO Materiales necesarios pero no suministrados con el kit 1.Agitador de microplacas 2. La agitación debe ser entre moderada y vigorosa, aproximadamente a 700‑1,100 oscilaciones por minuto. Lavadora de microplacas La lavadora automática de placas debe ser capaz de realizar 1, 3 y 6 ciclos de lavado y debe tener un volumen de llenado mínimo de 350 µL por pocillo y ciclo de lavado. Se recomienda emplear una pipeta de 8 canales con puntas de plástico desechables para administrar 350 µL, si no se utiliza una lavadora automática de microplacas. 3. Espectrofotómetro de microplacas Debe utilizarse una longitud de onda de 620 nm y/o 405 nm y un rango de absorbancia de 0 a 3,0. 4. Pipetas de precisión Deben usarse puntas de plástico desechables que permitan administrar volúmenes en microlitros. Se recomienda utilizar una pipeta de 8 canales o una pipeta dispensadora con puntas de plástico desechables para la administración de 100 µL, aunque no es absolutamente necesario. Pipetas para administrar volúmenes de mililitros. 5. Agua destilada o desionizada Para la reconstitución de los calibradores del HE4 y los controles del HE4 y para la elaboración de la solución de lavado diluida. Notas del procedimiento 1. E s necesaria una plena comprensión de estas instrucciones de empleo que figuran en el prospecto para garantizar el uso adecuado del kit EIA HE4. Los reactivos suministrados con el kit están pensados para utilizarse como una unidad integral. No mezcle reactivos idénticos de kits con números de lote diferentes. No use los reactivos del kit después de la fecha de caducidad impresa en la parte exterior de la caja. 2. Debe dejarse que los reactivos alcancen la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de utilizarlos. Las muestras deben mezclarse suave pero completamente tras la descongelación. El ensayo solo debe realizarse a temperaturas comprendidas entre 20 ºC y 25 ºC para obtener resultados precisos. 11 3. A ntes de comenzar a pipetear los calibradores y las muestras de las pacientes, es aconsejable marcar las tiras para poder identificar claramente las muestras durante y después del ensayo. 4. El requisito de un lavado eficaz y profundo para la separación del antígeno unido y no unido y los reactivos de los complejos anticuerpo-antígeno unidos a la fase sólida es uno de los pasos más importantes en un EIA. A fin de garantizar un lavado eficaz, compruebe que todos los pocillos estén totalmente llenos con solución de lavado hasta el borde superior durante cada ciclo de lavado, que la solución de lavado se administre con una velocidad de dispensación adecuada, que la aspiración de los pocillos entre y después de los ciclos de lavado sea completa y que los pocillos estén vacíos. Si queda líquido en los pocillos, invierta la placa y golpéela con cuidado contra papel absorbente. -Lavador automático de tiras: Siga las instrucciones del fabricante para efectuar una limpieza y un mantenimiento apropiados y realice el número necesario de ciclos de lavado antes y después de cada paso de la incubación. El dispositivo de aspiración/lavado no debe dejarse de pie con la solución de lavado durante períodos prolongados, ya que las agujas podrían obstruirse, lo que provocaría una mala dispensación y aspiración de líquido. 5. La solución de sustrato-HRP con TMB es muy sensible a la contaminación. Para conseguir la estabilidad óptima de la solución de sustrato-HRP con TMB, vierta la cantidad necesaria del vial a un recipiente limpiado a fondo o, preferiblemente, a una bandeja de plástico desechable, para evitar la contaminación del reactivo. Utilice siempre puntas de pipeta de plástico desechables limpias (o puntas de pipeta dispensadora). 6. Utilice siempre puntas de pipeta de plástico desechables limpias, así como una técnica de pipeteado preciso adecuada, al manipular muestras y reactivos. Evite que la punta de la pipeta toque la superficie del líquido para impedir su contaminación. Emplear una técnica de pipeteado apropiada es especialmente importante al manipular las muestras y el sustrato-HRP con TMB. Preparación de los reactivos Estabilidad del reactivo preparado Calibradores B-F del HE4 4 semanas a 2-8 ºC 4 meses a -20 °C o una temperatura inferior Añada exactamente 1,0 mL de agua destilada o desionizada a cada vial. Deje reposar al menos 15 minutos para reconstituir y mezcle suavemente antes del uso. NOTA: La concentración de los calibradores se indica en las etiquetas y debe usarse para el cálculo de los resultados. 12 Preparación de los reactivos Estabilidad del reactivo preparado Controles 1 y 2 del HE4 4 semanas a 2-8 ºC 4 meses a -20 °C o una temperatura inferior Añada exactamente 1,0 mL de agua destilada o desionizada a cada vial y mezcle suavemente. Deje reposar al menos 15 minutos para reconstituir y mezcle suavemente antes del uso. NOTA: Los rangos de los controles están indicados en las etiquetas. Solución de lavado2 semanas a 2-25 °C en un recipiente cerrado Vierta los 50 mL del concentrado de lavado en un recipiente limpio y diluya 25 veces añadiendo 1,200 mL de agua destilada o desionizada para conseguir una solución de lavado tamponada. Solución de trabajo de marcador4 semanas a 2-8 ºC en un recipiente cerrado Prepare la cantidad necesaria de solución de trabajo de marcador mezclando 50 μL de marcador, anti-HE4 con HRP, con 1 mL de diluyente para marcador por tira (véase la tabla siguiente): Número de tiras Marcador, anti-HE4 con HRP Diluyente para marcador (µL) (mL) 1 50 1 2100 2 3150 3 4200 4 5250 5 6300 6 7350 7 8400 8 9450 9 10500 10 11550 11 12600 12 Asegúrese de usar un tubo limpio de plástico o vidrio para preparar la solución de trabajo de marcador. Alternativa: Vierta el contenido del marcador, anti-HE4 con HRP, en el vial de diluyente para marcador y mezcle suavemente. Compruebe que todo el contenido del vial del marcador, anti-HE4 con HRP, se transfiere al vial de diluyente para marcador. 13 NOTA: La solución de trabajo de marcador es estable durante 4 semanas a una temperatura de 2 ºC a 8 ºC. No prepare más solución de trabajo de marcador de la que vaya a utilizar en este periodo y asegúrese de almacenarla correctamente. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Realice cada determinación por duplicado para los dos calibradores, los controles y las muestras desconocidas. Debe elaborarse una curva de calibración en cada ensayo. Todos los reactivos y muestras deben llevarse a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de su uso. 1. Para empezar, prepare los calibradores B-F, los controles 1 y 2, la solución de lavado y la solución de trabajo de marcador. Es importante usar recipientes limpios. Siga las instrucciones cuidadosamente. 2. Transfiera el número necesario de tiras de microplacas a un soporte de tiras. (Devuelva inmediatamente las tiras no utilizadas a la bolsa de aluminio con desecante y vuelva a cerrarla cuidadosamente). Lave cada tira una vez con la solución de lavado. No lave más tiras de las que puedan manejarse en 30 minutos. 3. Pipetee 25 µL de cada uno de los calibradores del HE4 (CAL A, B, C, D, E y F), los controles del HE4 (C1 y C2) y las muestras desconocidas (desc.) en los pocillos de tiras de acuerdo con el esquema siguiente: 1 2 3 A Cal A Cal E Primera Desc. B Cal A Cal E Primera Desc. C Cal B Cal F 2 Desc. D Cal B Cal F 2 Desc. E Cal C C1 F Cal C C1 G Cal D C2 H Cal D C2 4 5 6 7, etc. 4. A ñada 100 μL de anti-HE4 con biotina a cada pocillo usando una pipeta de precisión de 100 μL (o una pipeta de precisión de 100 μL de 8 canales). Evite que la punta de la pipeta toque la superficie del líquido para impedir su contaminación. 14 5. Incube la placa durante 1 hora (± 10 min) a temperatura ambiente (20-25 ºC) agitándola constantemente usando un agitador de microplacas. 6. Tras la primera incubación, aspire y lave cada tira 3 veces usando el procedimiento de lavado descrito en las notas del procedimiento (punto 4). 7. Añada 100 µL de solución de trabajo de marcador a cada pocillo. Use el mismo procedimiento de pipeteado que en el punto 4 anterior. 8. Incube el marco durante 1 hora (± 5 min) a temperatura ambiente (20-25 °) agitando constantemente. 9. Tras la segunda incubación, aspire y lave cada tira 6 veces usando el procedimiento de lavado descrito en las notas del procedimiento (punto 4). 10. Añada 100 µL de sustrato-HRP con TMB a cada pocillo utilizando la misma técnica de pipeteado que en el punto 4 anterior. El sustrato-HRP con TMB debe añadirse a los pocillos con la mayor rapidez posible y el tiempo entre la adición al primer pocillo y la adición al último debe ser inferior a 5 minutos. 11. Incube durante 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente (20-25 °C), agitando constantemente. Evite la exposición a luz solar directa. 12. Lea inmediatamente la absorbancia a 620 nm en un espectrofotómetro de microplacas. Opción Si el laboratorio no tiene acceso a un lector de microplacas capaz de leer a 620 nm, la absorbancia puede determinarse tal como se indica en el punto 12 alternativo siguiente: Alt. 12. Añada 100 µL de solución de parada, mezcle y lea la absorbancia a 405 nm en un espectrofotómetro de microplacas dentro de los 15 minutos siguientes a la adición de la solución de parada. Rango de medición El EIA HE4 mide concentraciones entre 15 y 900 pM. Si se espera obtener concentraciones de HE4 superiores al intervalo de medición, se recomienda diluir las muestras con calibrador A del HE4 antes del análisis (véase “Cálculo de resultados con muestras diluidas”). Control de calidad Los controles 1 y 2 de HE4 deben utilizarse para la validación de cada serie de ensayos. Los rangos de los resultados esperados están indicados en las etiquetas de los viales. Los resultados del ensayo HE4 deben considerarse válidos si: -Los valores medios de los duplicados de control se encuentran dentro de los rangos especificados. - Las réplicas de duplicados de los calibradores B-F y los controles no superan un CV del 15 %. - Las réplicas de duplicados del calibrador A (cero) no difieren entre sí más de 0,06 unidades de densidad óptica (DO). 15 Si un ensayo produce resultados no válidos para el calibrador o el control, deberán revisarse completamente los reactivos, la precisión de las pipetas, la lavadora de placas y el rendimiento del lector y, a continuación, se repetirán los análisis. Cada laboratorio puede asimismo preparar sus propios grupos de suero con diferentes niveles, que pueden utilizarse como controles internos para garantizar la precisión del ensayo. Material de referencia Como no se dispone de material de referencia común para el antígeno HE4, los valores del calibrador del EIA HE4 se asignan de acuerdo a una serie de estándares de referencia internos. CÁLCULO DE LOS RESULTADOS Si se usa un lector de espectrofotómetro de microplacas con programa de cálculo incorporado, consulte el manual del espectrofotómetro y cree un programa usando la concentración indicada en la etiqueta de cada uno de los calibradores del HE4. Para el cálculo automático de los resultados de HE4, se recomienda usar cualquiera de los métodos siguientes: • Método de ajuste de la curva spline cúbica. El calibrador A debe estar incluido en la curva con el valor 0 pM. • Interpolación con evaluación punto a punto. El calibrador A debe estar incluido en la curva con el valor 0 pM. • Método de ajuste de la curva cuadrática. El calibrador A debe estar incluido en la curva con el valor 0 pM. NOTA: No deben usarse métodos de evaluación por regresión lineal ni paramétricos de grado 4. Para la evaluación manual, se construye una curva de calibración representando los valores de absorbancia (A) obtenidos para cada calibrador del HE4 frente a la correspondiente concentración de HE4 (en pM). Las concentraciones de HE4 desconocidas pueden leerse después a partir de la curva de calibración usando el valor de absorbancia medio de cada muestra de paciente. Cálculo de resultados con muestras diluidas Si las muestras en un análisis inicial dan valores de HE4 superiores a 900 pM, deben diluirse a 1/10 y 1/100 con calibrador A del HE4 para obtener la concentración de HE4 exacta de las muestras. - Dilución a 1/10 = 50 µL de muestra + 450 µL de calibrador A del HE4 - Dilución a 1/100 = 50 µL de dilución a 1/10 + 450 µL de calibrador A del HE4 La concentración de HE4 de la muestra no diluida se calcula entonces de la manera siguiente: - Dilución a 1/10: 10 x valor medido - Dilución a 1/100: 100 x valor medido 16 Cálculo del valor ROMA El algoritmo de riesgo de neoplasia ovárica maligna (risk of Ovarian Malignancy Algorithm, ROMA) es una prueba sérica que combina los resultados de HE4, CA125 y estado menopáusico en un valor ROMA. Cálculo del índice pronóstico Se calcula un índice pronóstico (IP) para mujeres premenopáusicas y posmenopáusicas por separado utilizando las ecuaciones (1) y (2) indicadas a continuación. Para calcular el IP, los valores de ensayo obtenidos con el EIA HE4 y con los ensayos ARCHITECT CA125 II, EIA CanAg CA125 o Lumipulse G CA125II, respectivamente, se introducen en la ecuación aplicable del algoritmo siguiente, en función del estado menopáusico de la mujer. (1) Mujer premenopáusica Índice pronóstico (IP) = -12,0 + 2,38*LN[HE4] + 0,0626*LN[CA125] (2) Mujer posmenopáusica Índice pronóstico (IP) = -8,09 + 1,04*LN[HE4] + 0,732*LN[CA125] Cálculo del valor ROMA Para calcular el valor ROMA (es decir, la probabilidad predictiva), introduzca el valor calculado del índice predictivo en la ecuación (3): (3) Valor ROMA (%) = exp(IP) / [1 + exp(IP)] * 100 Los ejemplos siguientes pueden utilizarse para validar los cálculos del IP y del valor ROMA: Estado menopáusico HE4 (pM) CA125 (U/mL) Cálculo del IP IP ROMA (%) Premenopáusico 37,5 74,9 -12,0+(2,38*3,624) +(0,0626*4,316) -3,10388 4,29 Premenopáusico 386,6 21,8 -12,0+(2,38*5,957) +(0,0626*3,082) 2,371517 91,5 Posmenopaúsico 66,7 11,3 -8,09+(1,04*4,200) +(0,732*2,425) -1,94683 12,5 Posmenopaúsico 383,1 22,7 -8,09+(1,04*5,948) +(0,732*3,122) 0,381799 59,4 17 18 REF 404-10 Prepare Wash Solution Prepare Tracer working solution Prepare HE4 Controls Prepare HE4 Calibrators 1. Step HE4 DIL CONJ 25X CONJ Anti-HE4 WASHBUF 1, 2 CONTROL HE4 B, C, D, E, F CAL Vial/Plate Tracer, HRP Anti-HE4 (µL) Tracer Diluent (mL) 1 50 1 2 100 2 3150 3 4 200 4 5 250 5 6 300 6 7 350 7 8 400 8 9 450 9 1050010 1155011 12 600 12 No. of Strips Dilute 50 mL of Wash Concentrate with 1200 mL of distilled or deionised water. Mix 50 µL of Tracer, HRP Anti-HE4 with 1mL of Tracer Diluent per strip: Add 1 mL of distilled or deionised water to each vial and mix gently. Allow to stand for at least 15 minutes. NOTE: The exact concentration of each calibrator is stated on the label. Reconstituted stability: 4 weeks at 2-8oC. Procedure Prepare the components directly before use. Use wash and incubation conditions according to the Instructions. Note. The assay should only be performed at temperatures between 20–25oC to obtain accurate results. HE4 EIA Protocol Sheet 19 Wash MICROPLA 12. 100 µL in each well Allow to mix at 20–25oC Read at 405 nm within 15 min STOP MICROPLA MICROPLA Alt,12Add Stop Solution Alt,13Mix Alt,14Read absorbance Read absorbance 30 min shaking at 20–25oC 620 nm MICROPLA 1 hour shaking at 20–25oC Wash each well six times with Wash Solution. Use manual or automatic washer. 100 µL in each well 11.Incubate MICROPLA MICROPLA TRACER WORKING SOLUTION MICROPLA MICROPLA BIOTIN Anti-HE4 100 µL in each well Add TMB HRP-Substrate CONTROL HE4 1, 2 100 µL in each well 1 hour shaking at 20–25oC Wash each well three times with Wash Solution Use manual or automatic washer. 25 µL in each well CAL A, B, C, D, E, F HE4 Wash each well once with Wash Solution. Use manual or automatic washer. MICROPLA SUBS TMB 10. Wash Add Tracer working solution 7. 9. Wash 6. Incubate Incubate 5. 8. Add Biotin Anti-HE4 4. 3. Add calibrators, controls and samples 2. 1155011 12 600 12 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Las pacientes con cáncer ovárico confirmado pueden presentar valores del ensayo HE4 en el mismo intervalo que las mujeres sanas. Ciertos tipos histológicos de cáncer ovárico, por ejemplo, los tumores mucinosos o de células germinales, raramente expresan HE4, por lo que no se recomienda emplear HE4 para monitorizar pacientes con diagnóstico de cáncer ovárico mucinoso o de células germinales (7). Inversamente, puede haber niveles elevados de antígeno HE4 en mujeres con enfermedad no maligna. Por tanto, el nivel de HE4 no puede usarse como prueba absoluta de la presencia o ausencia de enfermedades malignas, y no debe utilizarse la prueba de HE4 en el cribado del cáncer. Los resultados de la prueba deben interpretarse solo conjuntamente con los resultados de otros análisis y procedimientos de diagnóstico de las enfermedades y tratamiento de las pacientes y la prueba de HE4 no puede sustituir a ninguna exploración clínica establecida. El algoritmo de riesgo de neoplasia ovárica maligna no se ha validado para los siguientes grupos de pacientes: pacientes tratadas previamente por tumor maligno, pacientes actualmente en quimioterapia y pacientes menores de 18 años de edad. La forma de la función matemática denominada «Algoritmo de riesgo de malignidad ovárica» (ROMA) depende del estatus premenopáusico o posmenopáusico de una mujer. El estatus premenopáusico o posmenopáusico debe basarse en la función ovárica determinada mediante datos disponibles que procedan de la evaluación clínica y la historia médica. El valor ROMA no incluye edad, historial familiar, signos clínicos ni resultados de diagnóstico por imagen y debe interpretarse en combinación con estos parámetros. La incapacidad del EIA HE4 y/o del ensayo CA125 para funcionar como se ha indicado, o un error en el cálculo de los resultados, puede conducir a una evaluación de riesgo inexacta o un tratamiento inadecuado de la paciente. En concreto, un resultado falsamente bajo del ensayo puede llevar a determinar que la paciente tiene bajo riesgo de cáncer ovárico epitelial, lo que podría derivar a la paciente a un nivel de asistencia menos especializado. Por tanto, el uso de los resultados del ensayo sin considerar los demás resultados de laboratorio, los estudios de diagnóstico por imagen y la evaluación clínica podría suponer un riesgo. Los anticuerpos anti-reactivo (anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) o anticuerpos heterófilos) de la muestra de la paciente pueden interferir ocasionalmente con el ensayo, aunque se incluyan agentes bloqueantes específicos en los tampones. El ensayo debe realizarse en un entorno con temperatura controlada, ya que la incubación a temperaturas superiores al intervalo recomendado de 20-25 °C puede dar resultados falsamente bajos. 20 VALORES ESPERADOS La distribución de los niveles de HE4 determinados en 1983 muestras se indica en las tablas siguientes: Distribución de los valores del ensayo HE4 Número 0,0 - 150,0 pM de sujetos 150,1 300,0 pM 300,1 500,0 pM > = 500,1 pM APARENTEMENTE SANAS Mujeres (premenopáusicas) 423 416 (98 %) 4 (0,9 %) 0 (0,0 %) 3 (0,7 %) Mujeres (posmenopáusicas) 443 424 (96 %) 16 (3,6 %) 2 (0,5 %) 1 (0,2 %) CASOS BENIGNOS Embarazo Trastorno ginecológico 0 (0,0%) 0 (0,0%) 347 324 (93 %) 18 (5,2 %) 1 (0,3 %) 4 (1,2 %) 22 21 (95 %) 1 (4,5%) benigno Otros casos benignos Hipertensión/Insuf. 107 96 81 (76 %) 8 (7,5 %) 7 (6,5 %) 11 (10 %) 75 (78 %) 16 (17 %) 2 (2,1 %) 3 (3,1 %) cardiaca congestiva CÁNCER 127 27 (21 %) 18 (14%) 21 (16 %) 61 (48 %) Cáncer de mama 46 40 (87 %) 4 (8,7 %) 2 (4,3 %) 0 (0,0 %) Cáncer de pulmón 50 28 (56 %) 16 (32 %) 6 (12 %) 0 (0,0 %) Cáncer ovárico Cáncer de endometrio Cáncer gastrointestinal 266 203 (76 %) 36 (14 %) 11 (4,1 %) 16 (6,0 %) 56 47 (84 %) 21 8 (14 %) 0 (0,0 %) 1 (1,8 %) Niveles del ensayo HE4 distribuidos por edad para mujeres aparentemente sanas Resultado de HE (pM) Edad (años) N Mediana Percentil 95 < 40 316 47,6 81,6 40–49 110 48,2 110,6 50–59 179 52,5 104,4 60–69 208 60,7 113,0 ≥70 53 91,1 233,3 En este estudio, el 98 % de las mujeres premenopáusicas sanas presentaron un valor en el EIA HE4 < 150 pM y el 96 % de las mujeres posmenopáusicas sanas presentaron un valor en el EIA HE4 < 150 pM. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio valor de referencia para la población de interés. Monitorización del estado de la enfermedad en pacientes diagnosticadas de cáncer ovárico La eficacia del EIA HE4 como ayuda en la monitorización del estado de la enfermedad en pacientes con cáncer ovárico se determinó evaluando los cambios en los niveles de HE4 en muestras de suero seriadas de 80 pacientes en comparación con los cambios en el estado de la enfermedad. Se llevó a cabo un estudio con un total de 354 pares de observaciones, con una media de 4,4 observaciones por paciente. Un cambio positivo en la HE4 se definió como un incremento en el valor que fuera al menos un 25 % superior al valor anterior de la prueba. Este nivel de cambio tiene en cuenta la variabilidad del ensayo y la variabilidad biológica. El 60 % de las muestras de pacientes (76/126) con un cambio positivo se correlacionó con la progresión de la enfermedad, mientras que el 75 % de las muestras seriadas de paciente (171/228) sin cambios significativos en el valor de HE4 se correlacionó con la ausencia de progresión. La concordancia total fue del 70 % (247/354). La tabla siguiente presenta los datos en un formato 2 x 2. Cambio en el estado de la enfermedad por par secuenciado Aumento en la concentración de HE4 Progresión No progresión Total >25 % 76 57133 < 25 % 50 171221 Total126 228354 22 La tabla siguiente muestra la distribución por paciente. El 93 % de los juegos de sueros de paciente (54/58) con un cambio positivo se correlacionó con la progresión de la enfermedad, mientras que el 32 % de los juegos de sueros (7/22) que no mostraron cambios significativos en el valor de HE4 se correlacionó con la ausencia de progresión. La concordancia total en este estudio fue del 76 % (61/80). Cambio en el estado de la enfermedad por paciente Aumento en la concentración de HE4 Progresión No progresión Total >25 % 54 15 69 < 25 % 4 7 11 Total 58 22 80 Estimación del riesgo en pacientes que presentan masa pélvica La eficacia del EIA HE4 en combinación con el CA125 determinado mediante los ensayos ARCHITECT CA125 II, EIA CanAg CA125 o Lumipulse G CA125II, para la estimación del riesgo de cáncer ovárico epitelial en pacientes que presentan masa pélvica se determinó en un ensayo clínico prospectivo, multicéntrico y doble ciego. Se desarrolló un algoritmo (ROMA, véase página 17) para la estimación del riesgo de cáncer ovárico epitelial. Este algoritmo tiene en cuenta los valores de HE4 y CA125, así como el estado menopáusico de la paciente. El algoritmo calcula una probabilidad pronóstica de encontrar cáncer ovárico epitelial al realizar cirugía. En el estudio prospectivo se incluyó un total de 502 pacientes y se determinó la probabilidad pronóstica de cáncer ovárico, así como la posibilidad de separación en grupos de bajo y alto riesgo basada en valores ROMA. La distribución de frecuencias acumuladas de los valores ROMA para casos benignos y casos de cáncer ovárico, incluidos los tumores de potencial maligno bajo (LMP), calculada mediante el algoritmo, se indica en las figuras 1 y 2, respectivamente, para la combinación de ensayos EIA HE4 + ARCHITECT CA125 II, y en las figuras 3 y 4 para la combinación de ensayos EIA HE4 + EIA CanAg CA125. La combinación de ensayos EIA HE4 + Lumipulse G CA125II mostró una distribución de frecuencias muy similar a la de la combinación de ensayos EIA HE4 + ARCHITECT CA125 II. Las gráficas de la distribución de frecuencias ilustran la distribución de las pacientes con enfermedad benigna y cáncer ovárico epitelial (incluyendo LMP), respectivamente, en diferentes puntos de corte del valor ROMA. 23 Benigno (N=200) Cáncer (N=34) % de casos de cáncer con valor ROMA inferior % de casos benignos con valor ROMA inferior Fig. 1 Distribución de frecuencias acumuladas de los valores ROMA para mujeres premenopáusicas. Combinación de ensayos EIA HE4 + ARCHITECT CA125 II Valor ROMA: EIA HE4 + Architect CA 125 II Benigno (N=151) Cáncer (N=117) Valor ROMA: EIA HE4 + Architect CA 125 II 24 % de casos de cáncer con valor ROMA inferior % de casos benignos con valor ROMA inferior Fig. 2 Distribución de frecuencias acumuladas de los valores ROMA para mujeres posmenopáusicas. Combinación de ensayos EIA HE4 + ARCHITECT CA125 II Benigno (N=200) Cáncer (N=34) % de casos de cáncer con valor ROMA inferior % de casos benignos con valor ROMA inferior Fig. 3 Distribución de frecuencias acumuladas de los valores ROMA para mujeres premenopáusicas. Combinación EIA HE4 + EIA CanAg CA125 Valor ROMA: EIA HE4 + CanAg CA 125 Benigno (N=151) Cáncer (N=117) Valor ROMA: EIA HE4 + CanAg CA 125 25 % de casos de cáncer con valor ROMA inferior % de casos benignos con valor ROMA inferior Fig. 4 Distribución de frecuencias acumuladas de los valores ROMA para mujeres posmenopáusicas. Combinación EIA HE4 + EIA CanAg CA125 Estratificación en grupos de bajo y alto riesgo Se empleó el algoritmo de riesgo de neoplasia ovárica maligna para estratificar a las mujeres en grupos de riesgo para detectar cáncer ovárico epitelial. Se utilizaron los siguientes puntos de corte con objeto de alcanzar un nivel de especificidad del 75 %. Debe tenerse en cuenta que los diferentes puntos de corte para la estratificación del riesgo en grupos de alto y bajo riesgo deben seleccionarse en función del ensayo CA125 que se utilice. Puntos de corte para alcanzar un nivel de especificidad del 75 %, para la combinación de ensayos EIA HE4 + ARCHITECT CA125II: Mujeres premenopáusicas Valor ROMA > 13,1 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial Valor ROMA < 13,1 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial Mujeres posmenopáusicas Valor ROMA > 27,7 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial Valor ROMA < 27,7 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial Puntos de corte para alcanzar un nivel de especificidad del 75 %, para la combinación de ensayos EIA HE4 + CanAg CA125: Mujeres premenopáusicas Valor ROMA > 12,5 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial Valor ROMA < 12,5 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial Mujeres posmenopáusicas Valor ROMA > 14,4 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial Valor ROMA < 14,4 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial Puntos de corte para alcanzar un nivel de especificidad del 75 %, para la combinación de ensayos EIA HE4 + Lumipulse G CA125II: Mujeres premenopáusicas Valor ROMA > 13,1 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial Valor ROMA < 13,1 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial Mujeres posmenopáusicas Valor ROMA > 27,7 % = Alto riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial Valor ROMA < 27,7 % = Bajo riesgo de detectar cáncer ovárico epitelial La estratificación del riesgo en alto riesgo de presentar cáncer ovárico epitelial en todas las pacientes con masa anexial mediante los valores ROMA con un nivel de especificidad del 75 % se muestra en la tabla 1, incluida la estratificación del riesgo obtenida por separado para los grupos de pacientes premenopáusicas y posmenopáusicas, respectivamente. La sensibilidad de la estratificación de pacientes con cáncer ovárico epitelial (estadio I-IV) en el grupo de alto riesgo fue del 94 %, con una especificidad del 75 %, de manera que el 75 % de las mujeres con masa pélvica benigna quedaron clasificadas en el grupo de bajo riesgo. Los valores 26 pronósticos positivos y negativos fueron del 58 % y del 97 %, respectivamente. Tabla 1: Estratificación del riesgo en alto riesgo de presentar cáncer ovárico epitelial (EOC) en pacientes con masa anexial utilizando la combinación de ensayos EIA HE4 + ARCHITECT CA125 II para calcular el valor ROMA. Punto de corte premenopáusico > 13,1 % para la estratificación en el grupo de alto riesgo con un nivel de especificidad del 75 %, Punto de corte posmenopáusico > 27,7 % para la estratificación en el grupo de alto riesgo con un nivel de especificidad del 75 %. Mujeres premenopáusicas n = 234 Mujeres posmenopáusicas n = 268 Mujeres premenopáusicas y posmenopáusicas combinadas n = 502 26/34 (76%) 108/117 (92%) 134/151 (89%) 10/16 (63%) 3/6 (50%) 13/22 (59%) 6/7 (86%) 24/28 (86%) 30/35 (86%) EOC estadios I-IIIC a 7/8 (88%) 35/39 (90%) 42/47 (89%) EOC estadios I-IV 16/18 (89%) EOC estadios I-IV y LMP combinados Potencial maligno bajo EOC estadios I-II 105/111 (95%) 121/129 (94%) Cáncer ovárico epitelial estadio I-IIIb y estadio IIIC (epiplón negativo, ganglio linfático positivo) a Las tasas de falsos negativos y el porcentaje de cáncer ovárico epitelial estratificado en bajo riesgo de presentar cáncer ovárico epitelial en pacientes con masa anexial, calculados mediante el valor ROMA con un nivel de especificidad del 75 %, se muestran en la tabla 2. La estratificación en grupos de alto y bajo riesgo de presentar cáncer ovárico epitelial mediante el algoritmo ROMA con una especificidad del 75 % generó una tasa de falsos negativos general del 6,2 %. El 3% de todos los casos estratificados en el grupo de bajo riesgo presentaron cáncer ovárico epitelial. 27 Tabla 2:Tasa de falsos negativos (FNR) y porcentaje de cáncer ovárico epitelial, calculados mediante el valor ROMA, para todos los casos estratificados en el grupo de bajo riesgo en pacientes con masa anexial. Punto de corte premenopáusico < 13,1 % para la estratificación en el grupo de bajo riesgo con un nivel de especificidad del 75 %; punto de corte posmenopáusico < 27,7 % para la estratificación en el grupo de alto riesgo con un nivel de especificidad del 75 %. Cáncer ovárico Tasa de falsos negativos epitelial a (FNR) Porcentaje de cánceres en el grupo de bajo riesgo Cánceres Cánceres falsos totales FNR negativos Cánceres Benignos falsos verdaderos % negativos positivos Premenopáusicas 2 18 11,1% 2 149 1,3% Posmenopáusicas 6 111 5,4% 6 113 5,0% Todas las pacientes 8 129 6,2% 8 262 3,0% No están incluidos los tumores de potencial maligno bajo (LMP); b FNR = Falso negativo/(verdadero positivo + falso negativo); c Falso negativo/(verdadero negativo + falso negativo) a No hubo diferencias estadísticamente significativas en la sensibilidad y especificidad del valor ROMA utilizando los valores del ARCHITECT CA125 II, el EIA CanAg CA125 o el Lumipulse G CA125IIpara distinguir entre trastornos benignos y cáncer ovárico epitelial. Mediante la combinación de ensayos EIA CanAg CA125 + EIA HE4, la sensibilidad de la estratificación en el grupo de alto riesgo de las pacientes con cáncer ovárico epitelial en estadios I-IV fue del 93 %. Los valores pronósticos positivos y negativos fueron del 57 % y del 97 %, respectivamente. Mediante la combinación de ensayos Lumipulse G CA125II + EIA HE4, la sensibilidad para la estratificación en el grupo de alto riesgo de las pacientes con cáncer ovárico epitelial en estadios I-IV fue del 93 %. Los valores pronósticos positivos y negativos fueron del 58 % y del 97 %, respectivamente. CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO Precisión La precisión del ensayo HE4 es ≤ 15 % de CV total. Se realizó un estudio siguiendo la directriz EP5-A2 (22) del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS/CLSI). Se analizó un grupo de cuatro muestras de suero, con dos lotes de reactivos, en réplicas de dos, en dos momentos separados por 20 días. Los datos de dicho estudio se resumen a continuación*. 28 Muestra Lote de reactivos n Conc. media (pM) DE CV intraa- DE total intraanalí- nalítico (pM) tico (pM) (%) CV total (%) 1 1 80 50,3 0,81 1,6 2,34 4,7 2 80 48,0 0,69 1,4 2,17 4,5 1 80 75,3 1,81 2,4 2,96 3,9 2 80 72,4 1,73 2,4 4,70 6,5 1 80 255 5,68 2,2 12,0 4,7 2 80 242 5,21 2,2 12,8 5,3 1 80 407 6,22 1,5 14,5 3,6 2 80 385 8,71 2,3 21,6 5,6 2 3 4 * Datos representativos; los resultados de laboratorios específicos pueden diferir de los aquí presentados. Límite de detección El límite de detección del ensayo EIA HE4 es < 15 pM. El límite de detección (LD) corresponde al límite superior del intervalo de confianza del 95 % y representa la mínima concentración de antígeno HE4 que puede distinguirse de cero. Se empleó la directriz EP17-A (23) del NCCLS para diseñar los experimentos sobre el LD. Se realizó un estudio en el que el calibrador A del HE4 (cero) y 4 muestras de sujetos sanos diluidas a 5 pM con diluyente de muestras fueron analizados en réplicas de 24 por prueba en 4 pruebas efectuadas en dos días separados. El LD se calculó de la manera siguiente: LD (pM) = 5,0 pM x (1,65 x DE0 + 1,65 x DE5) / (DO5 - DO0) El límite de detección del kit EIA HE4 fue < 2,5 pM. Sensibilidad funcional La sensibilidad funcional del ensayo EIA HE4 es < 25 pM. La sensibilidad funcional se expresa como la concentración de un analito en la que el CV es del 20 %. Se empleó la directriz EP5-A2 (22) del NCCLS para diseñar los experimentos de determinación de la sensibilidad funcional. Se realizó un estudio en el que un grupo de sensibilidad de cinco miembros se analizó en réplicas de 4 en 2 pruebas en 20 días diferentes con dos lotes de reactivos. La sensibilidad funcional determinada para el EIA HE4 fue < 5 pM. Recuperación La recuperación media del ensayo EIA HE4 es del 100 ± 15 %. Se realizó un estudio en el que se añadieron diluciones de una muestra de paciente con concentraciones conocidas de HE4 a muestras de suero humano normales. La concentración de HE4 se determinó mediante el ensayo EIA HE4 y se calculó el porcentaje de recuperación resultante. Los datos representativos de este estudio se resumen en la tabla siguiente*. 29 Muestra Valor del ensayo endógeno (pM) Antígeno HE4 añadido Valor del ensayo (pM) HE4 observado (pM) Porcentaje de recuperación (%)** 1 44,6 1560,6102 7596,0 89 350397 96 650686 96 2 41,1 1555,7 99 7595,2 91 350400 98 650657 93 3 40,6 1554,0 97 7595,1 91 350403 99 650680 96 4 46,6 1563,3103 75106 97 350410 99 650645 90 5 40,2 1556,5102 75102 98 350402 99 650676 96 La recuperación media entre las cuatro concentraciones enriquecidas que indica la tabla fue del 97 %. * Datos representativos; los resultados de laboratorios específicos pueden diferir de los aquí presentados. **% de recuperación = Concentración de HE4 observada (pM) / Concentración de HE4 endógena (pM) + HE4 añadido (pM) Efecto de gancho por dosis alta El efecto gancho por dosis altas es un fenómeno en el que muestras con niveles muy elevados pueden situarse dentro del rango dinámico del ensayo. En el EIA HE4 no se observó efecto gancho por dosis altas para las muestras que contenían hasta 300,000 pM de antígeno natural HE4. 30 Linealidad de dilución La linealidad de dilución media del ensayo EIA HE4 es del 100 ± 15 %. Se realizó un estudio para el EIA HE4 diseñado según la directriz EP6-A (24) del NCCLS/ CLSI. Las muestras de suero con valores de HE4 elevados se diluyeron mediante el calibrador A del HE4 (cero). Se determinó la concentración de HE4 para cada dilución y se calculó el porcentaje (%) de recuperación. Los datos representativos de este estudio se resumen en la tabla siguiente*. Muestra Factor de dilución final Valor obtenido Valor esperado Porcentaje de (pM) (pM) recuperación (%)** 1Sin diluir889,6889,6100 1:1,25720,0711,7101 1:1,7543,1533,8101 1:2450,6444,8101 1:2,5345,9355,897,2 1:5183,6177,9103 1:1097,689,0109 1:2049,144,5110 1:4025,922,2116 2Sin diluir697,0697,0100 1:1,25544,9557,697,7 1:1,7429,8418,2103 1:2361,1348,5104 1:2,5275,9278,899,0 1:5134,5139,496,5 1:1074,469,7107 1:2039,134,9112 1:4021,017,4120 3Sin diluir680,2680,2100 1:1,25499,7544,291,8 1:1,7354,4408,186,8 1:2296,7340,187,2 1:2,5247,2272,190,9 1:5124,9136,091,8 1:1061,768,090,7 1:2034,634,0102 1:4018,417,0109 Recuperación media entre las tres muestras diluidas indicadas arriba = 101 %. * Datos representativos; los resultados de laboratorios específicos pueden diferir de los aquí presentados. **% de recuperación = Concentración de HE4 obtenida x Factor de dilución / Concentración de HE4 sin diluir. 31 Especificidad analítica La especificidad analítica media del ensayo EIA HE4 es del 100 ± 15 %. Se han realizado estudios de recuperación para comparar los sueros que contienen los compuestos siguientes (en las concentraciones indicadas) con sueros de control. Se ha empleado la directriz EP7-A (25) del NCCLS para diseñar los experimentos sobre interferencias. Se estudiaron las siguientes sustancias y concentraciones y se observó que no interfieren con la prueba. Interferencias séricas endógenas Concentración de análisis Triglicéridos30 mg/mL Bilirrubina0,2 mg/mL Hemoglobina10 mg/mL Proteína total120 mg/mL Interferencias con medicamentos quimioterapéuticos Concentración de análisis Carboplatino500 µg/mL Cisplatino165 µg/mL Clotrimazol0,3 µg/mL Ciclofosfamida500 µg/mL Dexametasona10 µg/mL Doxorrubicina1,16 µg/mL Leucovorina2,68 µg/mL Melfalán2,8 µg/mL Metotrexato45 µg/mL Paclitaxel3,5 ng/mL Enfermedades clínicas que pueden interferir El ensayo EIA HE4 se evaluó utilizando muestras con HAMA y factor reumatoide (FR) para evaluar adicionalmente la especificidad del ensayo. Se evaluaron cinco muestras positivas para el HAMA y cinco muestras positivas para el FR con respecto al porcentaje de recuperación del antígeno de HE4 añadido a cada muestra a aproximadamente 50 y 450 pM. Los resultados de recuperación media se resumen en la tabla siguiente*. Enfermedad clínica Número de muestras % de recuperación media HAMA 5101 FR 5 95 * Datos representativos; los resultados de laboratorios específicos pueden diferir de los aquí presentados. 32 GARANTÍA Los datos de rendimiento aquí presentados se obtuvieron usando el procedimiento de ensayo indicado. Cualquier cambio o modificación del procedimiento no recomendado por Fujirebio Diagnostics puede afectar a los resultados, en cuyo caso Fujirebio Diagnostics rechaza todas las garantías expresas, implícitas u obligatorias, incluida la garantía implícita de comerciabilidad e idoneidad para el uso. 33 BIBLIOGRAFÍA 1. Israeli O, Goldring-Aviram A, Rienstein S, Ben-Baruch G, Korach J, Gold man B, Friedman E. 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