Tema Metabolismo del Nitrógeno
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1 Tema 9: Metabolismo del Nitrógeno y del Azufre Las plantas superiores son organismos autotróficos capaces de sintetizar sus componentes moleculares orgánicos a partir de nutrientes inorgánicos obtenidos del medio en el que crecen. Para diversos nutrientes minerales este proceso implica su absorción por la raíz a partir del suelo y la incorporación de los mismos a compuestos orgánicos, esenciales para el crecimiento y desarrollo del vegetal. Dicha incorporación es conocida como asimilación de nutrientes. La asimilación de algunos nutrientes, particularmente nitrógeno y azufre, requiere de una compleja serie de reacciones bioquímicas que se encuentran entre las de mayor requerimiento energético entre los organismos vivos. Asimilación de Nitrógeno El nitrógeno es el nutriente que más limita el crecimiento de las plantas en la mayoría de las especies. En relación a la importancia para el crecimiento y desarrollo del vegetal, su adquisición y asimilación sólo es secundaria a la asimilación del carbono fotosintético. La viabilidad y la germinación de la semilla, la producción de proteínas de alta calidad, como así también de alimentos ricos en compuestos proteicos, son aspectos que dependen en gran medida de la disponibilidad de nitrógeno del medio tanto como de su contenido en la planta. En la célula vegetal son numerosos los compuestos que contienen nitrógeno: aminoácidos (proteínas), nucleósidos y nucleótidos (DNA y RNA), cofactores (NAD, FAD, CoA, etc.) y hormonas (auxinas, citoquininas y etileno), además de una gran variedad de metabolitos secundarios. En la biósfera este elemento se encuentra en diversas formas. La atmósfera contiene aproximadamente un 78 % de nitrógeno molecular (N2), el cual no se encuentra disponible de manera directa para la mayoría de los organismos vivos. La adquisición de nitrógeno a partir de la atmósfera requiere de la ruptura de un triple enlace covalente entre dos átomos de nitrógeno (N≡N) excepcionalmente estable, para producir nitrato (NO3-) o amonio (NH4+). Estas reacciones, conocidas como fijación de nitrógeno, son el resultado de procesos tanto industriales como naturales. La mayor parte del nitrógeno tomado por los organismos es reciclado de un pool de compuestos que ha sido previamente usado por otros organismos. Nuevos aportes de nitrógeno a este pool se generan en reacciones químicas resultantes de fenómenos naturales (fuego, 2 relámpagos) o de la actividad humana (máquinas de combustión interna, fertilizantes químicos), aunque principalmente (un 90%) se origina a partir de la fijación biológica del nitrógeno atmosférico (N2). Cuando el N inorgánico ha sido fijado como NO3- o NH4+ entra al ciclo biogeoquímico del N (Figura 1) pasando por diversas formas orgánicas e inorgánicas hasta que, eventualmente, regresa a su forma atmosférica bimolecular (N2). En una representación esquemática del ciclo del nitrógeno en la naturaleza (Figura 2), se puede ver la participación decisiva de determinados micro-organismos y de las plantas en la dinámica del recambio de materiales. Por ejemplo, bacterias libres o simbióticas, como así también algunas algas y levaduras, son responsables de la fijación biológica del N. Otros microorganismos producen la amonificación o putrefacción del N orgánico del suelo formando NH4+. A su vez bacterias nitrificantes promueven la transformación de NH4+ en NO2- (Nitrosomonas) y de éste en NO3- (Nitrobacter) en los procesos de nitritación y nitratación, respectivamente. El NO3así formado es la principal fuente de N para las plantas, las cuales incorporan este elemento mediante la reducción asimiladora del nitrógeno, proceso que se encuentra íntimamente ligado a la fotosíntesis. El N asimilado por las plantas es incorporado a numerosos compuestos orgánicos. Los organismos heterótrofos, como los animales, deben incorporar los compuestos orgánicos nitrogenados pre-formados por los vegetales, pues son incapaces de sintetizar estos compuestos a partir de N inorgánico. La materia orgánica muerta (plantas y animales, o sus residuos) caen al suelo y por amonificación y nitrificación son convertidos en diversas formas de N inorgánico (NH4+, NO2-, NO3-). Son también micro-organismos los encargados de cerrar el ciclo. Las bacterias desnitrificantes promueven la reducción desasimiladora del N mediante la cual a partir de NO3- producen N2 que se libera a la atmósfera. 3 Figura 1 Figura 2 4 Fijación biológica de nitrógeno La mayoría de las bacterias fijadoras de nitrógeno son organismos de vida libre (Tabla 1) que se encuentran en el suelo. Algunas son capaces de formar asociaciones simbióticas con plantas superiores (Tabla 2), donde la célula procariota provee directamente a la especie hospedadora el nitrógeno fijado a cambio de carbohidratos y de otros nutrientes. La simbiosis tiene lugar en nódulos que se forman en las raíces de la planta huésped y que contienen a la bacteria fijadora de nitrógeno. Tipo de Bacteria Especie * Hetrótrofos Anaerobio Clostridium pasteurianum Anaerobio facultativo Klebsiella pneumoniae Microaerófilo Azotobacter vinelandii Aerobio Azospirillum lipoferum * Autótrofos Bacteria quimiotrófica Thiobacillus ferrooxidans Bacteria fotosintética Rhodospirillum rubrum Cianobacterias Unicelular Gloeothece spp. Filamentosos Oscillatoria spp. Heterocísticos Anabaena, Nostoc spp. Tabla 1: Bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre 5 Especie fijadora de Nitrógeno Especie huésped Rhizobiaceae Azorhizobium Leguminosas Bradyrhizobium Rhizobium Sinorhizobium Actinomycetales Frankia Cyanobacterias Aliso, Casuarina Gunnera (angiospermas) Macrozamia (gimnospermas) Azolla (pteridofita) Blasia (briofita) Rhizalenia (diatomea) Tabla 2: Organismos simbióticos fijadores de nitrógeno Fijación de nitrógeno por organismos simbióticos El tipo más común de simbiosis ocurre entre miembros de la familia Leguminosae y bacterias del suelo de los géneros Rhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium y Photorhizobium (familia Rhizobiaceae). Estos organismos del suelo son estimulados para invadir las raíces de plantas susceptibles donde se transforman en orgánulos intracelulares (bacteroides) y convierten el nitrógeno atmosférico (N2) en amoníaco (NH4+), que es asimilado por la planta. La planta, a su vez, desarrolla unos órganos especializados (nódulos radiculares) que albergan a los bacteroides, proporcionándoles el medio adecuado y los nutrientes necesarios para que la fijación de N pueda llevarse a cabo. 6 Nodulación El complejo proceso de formación de nódulos funcionales puede resumirse de la siguiente manera (Figura 3): 1. Inducción de la infección: El primer paso para la infección de las raíces de las leguminosas por Rhizobium es el crecimiento bacteriano en la rizósfera. Las raíces de las leguminosas excretan al medio un conjunto de compuestos de bajo peso molecular que comprenden una mezcla de flavonoides modificados que provocan cambios en la actividad de la célula de Rhizobium. En la planta, los flavonoides inductores se originan a partir de las mismas rutas biosintéticas que producen las fitoalexinas. Las células de Rhizobium responden a concentraciones muy bajas (aproximadamente 50 nM) de los flavonoides inductores, los cuales activan un conjunto de genes bacterianos necesarios para el proceso de nodulación. La expresión de dichos genes se traduce en la síntesis de diversos compuestos entre los que se incluyen polisacáridos que son excretados al exterior de la membrana celular bacteriana y que constituyen los exopolisacáridos de superficie. El siguiente paso es el contacto entre las células de Rhizobium y los pelos radiculares (células epidérmicas) de una planta hospedadora susceptible. El éxito de la infección se produce sólo después de un contacto entre combinaciones compatibles de Rhizobium y planta. Las células bacterianas se adhieren a los pelos radiculares de forma polar (un extremo de la célula bacteriana de forma bacilar contacta con el pelo radicular). La especificidad del enlace está dada por interacciones entre lectinas de la planta y la pared celular bacteriana modificada por los exopolisacáridos de superficie. 2. Formación del hilo infectivo: En respuesta a la unión de las células de Rhizobium, los pelos radiculares se curvan y atrapan a las bacterias en una estructura semejante al cayado de un pastor. La pared celular del pelo radicular se invagina en el punto de unión y se extiende dentro de la célula para formar un hilo de infección. El núcleo de la célula epidérmica emigra al extremo del hilo infectivo y se agranda, lo cual puede indicar un incremento de la actividad transcripcional. A medida que el hilo de infección progresa a través de las células epidérmicas de la raíz, las células corticales más profundas comienzan a dividirse para la formación del nódulo. Por su parte, las células rizobianas también se dividen dentro del hilo infectivo, el cual se ramifica y penetra en numerosas células corticales. 3. Formación del nódulo: Finalmente, las bacterias son liberadas en el interior de las células corticales a través del extremo del hilo de infección. Al liberarse, quedan envueltas por la 7 membrana plasmática de la célula de la planta y se depositan de forma compartamentalizada, dentro del citoplasma de las células corticales. La composición de la membrana plasmática que envuelve a los bacteroides se modifica, transformándose en la membrana peribacteroidal (mpb) dentro de la cual permanecen los bacteroides rodeados por el fluido peribacteroidal. Las células rizobianas se dividen en mayor o menor extensión, mientras que las células vegetales infectadas se ensanchan y con el tiempo llegan a estar repletas de bacterias. La división de las células corticales cesa cuando las bacterias se diferencian en bacteroides que ya fijan nitrógeno. Todos estos procesos van acompañados de un incremento de los niveles de ARNs y de proteínas específicos y de otros compuestos necesarios para el establecimiento de nódulos funcionales. Figura 3 Fijación de nitrógeno en los nódulos radiculares 8 La reducción de nitrógeno molecular (N2) a iones amonio (NH4+) es una transformación que tiene una elevada demanda energética. La reducción industrial de N (proceso de Haber) requiere temperaturas y presiones muy altas, además de un catalizador. En la fijación biológica de N, que tiene lugar a temperatura ambiente y a presión atmosférica, se consume una gran cantidad de energía, en forma de ATP, y se requiere un potente reductor que done los electrones a un elevado potencial redox. La reacción que se verifica en este proceso es: N2 + 8 e- + 8 H+ + 16 ATP 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi La enzima que cataliza esta reacción es la nitrogenasa. En la reacción catalizada por esta enzima se puede ver que la reducción de N2 a NH4+ (donde se transfieren 6 electrones) está acoplada a la reducción de 2 H+ con producción de N2., reacción que también es catalizada por la nitrogenasa. La enzima, llamada complejo enzimático de la nitrogenasa (Figura 4), puede ser separada en dos componentes, la proteína-Fe (que contiene hierro) y la proteína-MoFe (que contiene hierro y molibdeno), ninguna de las cuales posee actividad catalítica por sí misma. La proteína-Fe es la más pequeña y posee dos subunidades idénticas de 32 a 72 kDa cada una (según el organismo). Cada dímero contiene un grupo azufre-hierro (4Fe-4S=) que participa en las reacciones redox involucradas en la conversión de N2 a NH4+. Esta proteína (Fe protein) es extremadamente sensible al oxígeno (O2), el cual la inactiva irreversiblemente. La proteína.MoFe presenta cuatro subunidades y su peso molecular total es de 180 a 235 kDa (según el organismo). Posee dos átomos de molibdeno por molécula en dos grupos Mo-Fe-S, los cuales poseen un número variable de grupos Fe-S. Esta proteína (MoFe protein) también es inactivada por oxígeno, aunque más lentamente. El dador de electrones para el proceso redox catalizado por este complejo enzimático es la ferredoxina, la cual cede los electrones a la Fe protein, que a su vez hidroliza el ATP y reduce la MoFe proteín. Ésta última es la que finalmente reduce el N2 (sustrato de la enzima) produciendo NH4+. Aunque la nitrogenasa es capaz de reducir numerosos sustratos in vitro, en condiciones naturales sólo reacciona con N2 y H+. Cuando la enzima actúa sobre los iones H+ cataliza el pasaje de H+ a H2 (gaseoso). En condiciones naturales esta reducción puede ser importante y competir con el N2 por los electrones de la nitrogenasa, disminuyendo la eficiencia de la fijación de nitrógeno. Sin embargo, algunas especies de rizobios contienen una actividad de hidrogenasa, 9 enzima capaz de producir la ruptura del H2 formado y generar electrones que se usan para la reducción de N2, mejorando de ese modo la eficiencia en la fijación de nitrógeno. Los bacteroides necesitan oxígeno para la oxidación de los compuestos fotosintetizados por las plantas a fin de generar los altos niveles de ATP que se requieren para el proceso de fijación de N. La disponibilidad de oxígeno para los bacteroides es regulada por la planta, la cual debe asegurar un adecuado suministro para la respiración y, al mismo tiempo, evitar que el oxígeno inactive la nitrogenasa. La concentración de oxígeno en las células bacteroidales del nódulo está regulada por una proteína de la planta llamada leghemoglobina (Lb). La Lb es semejante a la mioglobina, posee un grupo prostético hemo y, como ocurre con la hemoglobina de las células animales, tiene una alta afinidad por el oxígeno. Se piensa que actúa como un transportador de oxígeno que amortigua sus altas fluctuaciones en las células nodulares. La Lb se localiza en el citoplasma de las células vegetales infectadas (y no dentro de la membrana peribacteroidal), lo que sugiere que controla el flujo de oxígeno en el citoplasma de la célula vegetal y no dentro del bacteroide. El NH4+ formado (compuesto tóxico para plantas y animales) debe ser rápidamente convertido dentro de los núdulos radiculares en formas orgánicas antes de ser transportado al tallo por vía xilemática. Leguminosas de regiones templadas tienden a exportar el N a otros tejidos en forma de amidas (principalmente los aminoácidos asparagina o glutamina), mientras que las de origen tropical, lo hacen en forma de ureidos (principalmente alantoína, ácido alantoico y citrulina). 10 Figura 4: Actividad de la nitrogenasa en el bacteroide 11 Determinantes genéticos en la formación del nódulo El desarrollo de los nódulos radiculares fijadores de nitrógeno implica la expresión coordinada de diversos genes bacterianos y de la leguminosa (Figura 5). Entre los genes de Rhizobium se encuentran los genes nod, requeridos para la inducción y desarrollo de los nódulos y los genes nif y fix, necesarios para la fijación de nitrógeno. Los genes nod se clasifican como “genes nod comunes” (nodA, nodB y nodC), que se encuentran en todas las cepas rizobianas, y los “genes nod específicos de huésped” (nodP, nodQ y nodH, nodF, nodE y nodL) que difieren entre las distintas especies de rizobios y determinan el rango de hospedadores. Sólo uno de estos genes, el gen regulador nodD, se expresa de forma constitutiva y su producto, la proteína NodD regula la transcripción de los otros genes nod. Los compuestos de bajo peso molecular liberados por la planta (flavonoides) que inducen la nodulación, activan la proteína NodD, la cual, a su vez, induce la transcripción de los otros genes nod. Estos últimos, poseen regiones promotoras con una secuencia altamente conservada, llamada “caja nod” a la cual se une la proteína NodD activada para inducir la transcripción de dichos genes (todos los genes nod, salvo nodD). Además de los genes nod que sirven para la inducción y desarrollo de los nódulos. Rhizobium posee genes para la fijación de nitrógeno: los genes nif, homólogos a genes similares identificados en organismos fijadores de nitrógeno de vida libre y los genes fix, que se encuentran sólo en organismos simbióticos. Algunos de estos genes suministran diversos componentes estructurales de la nitrogenasa. Los genes de la planta para los nódulos (genes Nod) codifican polipéptidos que se sintetizan específicamente durante las fases del desarrollo del nódulo, llamados nodulinas. Las nodulinas han sido divididas en tres grupos según sus funciones probables: las del grupo 1 son componentes estructurales del nódulo; las del grupo 2 son enzimas responsables de la asimilación de nitrógeno por la planta; las del grupo 3 son necesarias para mantener las funciones de los bacteroides. 12 Figura 5: Regulación genética de la nodulación 13 Reducción asimiladora de nitrógeno La principal fuente de N del suelo para las plantas es el NO3-, el cual es absorbido por las raíces. La incorporación de dicho elemento en compuestos orgánicos requiere de una reducción (de estado de oxidación +5, en el NO3- a -3, en el NH4+). En general, cuando el suministro de NO3es bajo, una proporción elevada se reduce en las raíces, mientras que si aumenta, una proporción creciente del nitrógeno se transporta por el xilema hasta las hojas en forma de NO3- y es ahí donde tiene lugar la reducción. La capacidad de reducción de NO3- en las raíces de la mayor parte de las especies leñosas es muy elevada, por lo cual la cantidad de NO3- en hojas es muy baja; por el contrario, en algunas especies herbáceas la mayor parte del NO3- es reducido en las hojas en las cuales llega a alcanzar una concentración elevada. La reducción del NO3- a NH4+ es catalizada por dos enzimas distintas: nitrato reductasa, que reduce NO3- a NO2- (en el citosol) y nitrito reductasa, que reduce el NO2- a NH4+ (en cloroplastos de hojas o plástidos de raíces) de acuerdo con la siguiente reacción global: NO3- + 10 H + + 8 e- NH 4+ + 3 H2 O Nitrato reductasa La nitrato reductasa (NR) cataliza la siguiente reacción: NO3- + NAD(P)H + H + + 2 e- NO2- + NAD(P) + + H2 O La forma más común de la enzima usa sólo NADH como dador de electrones; otra forma de la enzima que se encuentra predominantemente en tejidos heterotróficos (como raíces) puede usar tanto NADH como NADPH. Las NRs de plantas superiores son homodímeros, es decir, están compuestas por dos subunidades idénticas, cada una con un peso molecular de 100 kDa. Cada subunidad contiene tres grupos prostéticos: un dinucleótido de flavina y adenina (FAD), un grupo Hemo y un complejo de Molibdeno. El aceptor inicial de electrones cedidos por NADH o NADPH es la región polipeptídica de la enzima donde se une el FAD, el cual acepta dos electrones que 14 desde allí pasan, a través de la región correspondiente al grupo Hemo, hacia el complejo de Molibdeno, desde donde son transferidos al nitrato (Figura 6). La concentración de nitrato, la luz y los niveles de carbohidratos son factores que modifican la expresión de los genes que codifican la nitrato reductasa. Estos factores inducen la síntesis de novo de la enzima. Además, la proteína está sujeta a una regulación post-transduccional que involucra una fosforilación reversible de la enzima. La luz, los niveles de carbohidratos y otros factores ambientales estimulan una fosfatasa de proteínas que desfosforila varios residuos de serina de la proteína NR, activando así la actividad de la enzima. Por el contrario, la oscuridad y los iones Mg2+ estimulan una kinasa de proteínas que fosforila los mismos residuos de serina, produciendo en este caso la inactivación de la enzima. La regulación post-transduccional mediante fosforilación-defosforilación de la proteína enzimática provee un control más rápido del que puede conseguirse a través de la síntesis y degradación de la enzima (minutos versus horas). La regulación de la NR es de vital importancia para la planta debido a que el nitrito (uno de los productos de la reacción que cataliza) es altamente reactivo y potencialmente tóxico. Las células de la planta transportan inmediatamente el nitrito generado desde el citosol (donde actúa la nitrato reductasa) hacia los cloroplastos (en hojas) o los plástidos (en raíces). En estas organelas la nitrito reductasa (NiR) reduce el nitrito a amonio. Figura 6 15 Nitrito reductasa Los cloroplastos de los tejidos verdes y los plástidos de las raíces poseen diferentes formas de la enzima, pero ambas formas transfieren electrones desde la ferredoxina hacia el nitrito según la siguiente reacción: NO2- + 6 Fdred + 8 H + + 6 e- NH4+ + 6 Fdox + 2 H2 O La Ferredoxina reducida deriva del transporte electrónico de la fotosíntesis en los cloroplastos y del NADPH generado en el ciclo oxidativo de las pentosas-fosfato en los tejidos no fotosintéticos. Ambas formas de la enzima (de cloroplastos y de plástidos) consisten en un polipéptido de cadena única (63 kDa) que contiene dos grupos prostéticos: un grupo hierro-azufre (Fe4S4) y un grupo Hemo especializado. Estudios cinéticos sugieren que ambos grupos prostéticos acoplados (Fe4S4-Hemo) sobre la enzima se unen al nitrito y lo reducen directamente a amonio, sin acumulación de compuestos nitrogenados de estados redox intermedios. Los iones nitrato y la luz inducen la transcripción de la enzima (la cual es mejorada por sacarosa), mientras que la asparagina y la glutamina reprimen tal inducción. Figura 7 16 Asimilación del amonio Aunque el ión amonio es principalmente generado por fijación del nitrógeno atmosférico o por reducción del nitrato, una pequeña cantidad también puede ser tomado directamente de suelos con pHs ácidos, especialmente por los árboles. Estas tres formas de tomar el N se denominan en conjunto asimilación primaria de nitrógeno. Sin embargo, el ión amonio también puede ser sintetizado en grandes cantidades en la planta en varias reacciones del metabolismo secundario (fotorrespiración, catabolismo de asparagina, arginina y ureidos, metabolismo de aminoácidos y metabolismo proteico en semillas y hojas senescentes). Las plantas evitan la toxicidad del ión NH4+ convirtiéndolo rápidamente en aminoácidos. La vía primaria para esta conversión involucra la acción secuencial de dos enzimas: la Glutamina Sintetasa y la Glutamato Sintetasa, las cuales actúan conjuntamente en el denominado “ciclo de la glutamato sintetasa” de la asimilación de amonio (Figura 8). Figura 8 17 - Glutamina Sintetasa (GS): Actualmente existe evidencia de que esta enzima es la única puerta de entrada del amonio hacia los aminoácidos en las plantas superiores. La reacción que cataliza requiere de la hidrólisis de una molécula de ATP y de cationes divalentes como Mg2+, Mn2+, o Co2+ como cofactores. Cataliza la siguiente reacción: Glutamato + amonio + ATP Glutamina + AMP + Pi - Glutamato sintetasa: Tambien llamada glutamina-2-oxoglutarato aminotransferasa (GOGAT). Su actividad en plástidos es estimulada por elevados niveles de glutamina. Existen dos tipos de GOGAT según el aceptor de electrones: NADH (en plástidos de tejidos no fotosintéticos), o Ferredoxina (en cloroplastos). Las reacciones catalizadas por estas enzimas son, respectivamente: NADH-GOGAT: Glutamina + 2-oxoglutarato + NADH + H+ 2 Glutamato + NAD+ Fd-GOGAT: Glutamina + 2-oxoglutarato + Fdred 2 Glutamato + Fdox Ambas enzimas (GS y GOGAT) actuando en tandem, es decir de manera secuencial, permiten la asimilación del ión amonio en el aminoácido glutamato que pasa a glutamina, permitiendo a la vez que se regenere el glutamato para que se reinicie el ciclo de asimilación de amonio (Figura 8). El ión amonio también puede ser asimilado por una vía alternativa, mediante la actividad de la Glutamato Deshidrogenasa (GDH) que cataliza la siguiente reacción 2-oxoglutarato + amonio + NAD(P)H Glutamato + H2O + NAD(P)+ Aunque esta enzima se encuentra en cantidades importantes en mitocondrias y cloroplastos, su rol específico aún se desconoce. Una vez que el nitrógeno se asimiló como glutamina y glutamato, se incorpora a otros aminoácidos por medio de reacciones de transaminación. Las enzimas que catalizan estas reacciones se denominan aminotransferasas, se 18 encuentran en citoplasma, cloroplastos, mitocondrias, glioxisomas y peroxisomas. Las aminotransferasas cloroplastídicas pueden tener un importante rol en la biosínteis de aminoácidos en hojas. Un ejemplo de este tipo de enzimas es la aspartato aminotransferasa (AAT) que cataliza la siguiente reacción Glutamato + Oxaloacetato Aspartato + 2-oxoglutarato El aspartato es un aminoácido que además de intervenir en la síntesis proteica, es necesario para la biosínteis de otros aminoácidos (familia del aspartato) y cumple otros importantes roles en la célula. La asparagina, aminoácido aislado de una especie de Asparagus, no sólo es precursor de la síntesis proteica sino que constituye un compuesto nitrogenado de transporte y almacenamiento clave en las plantas debido a su estabilidad y a su elevada relación N/C. La principal vía para su síntesis, catalizada por la Asparagina Sintetasa (AS), es la siguiente Glutamina + Aspartato + ATP Asparagina + Glutamato + AMP + PPi La AS es citosólica en hojas, en raíces y en nódulos fijadores de N. La expresión genética de esta enzima es inhibida por elevados niveles de luz y carbohidratos, condiciones que, por otro lado, estimulan a la GS y GOGAT plastídicas. La diferente regulación de estas vías (que compiten entre sí) ayudan al balance del metabolismo del C y del N en los vegetales. Es decir, condiciones de vasta energía (elevados niveles de luz y carbohidratos) estimulan GS y GOGAT, inhiben AS, y así favorecen la asimilación de N en glutamina y glutamato, compuestos ricos en carbono que participan en la síntesis de nuevos materiales celulares. Por el contrario, condiciones de energía limitada inhiben GS y GOGAT, estimulan AS, y así favorecen la asimilación de N en asparagina, compuesto rico en nitrógeno y suficientemente estable para usarse para almacenamiento o para transporte a larga distancia. De esta manera asparagina y glutamina son compuestos que unen los metabolismos del C y del N. 19 Figura 6: Metabolismo del amonio 20 21 Figura 6: Metabolismo del amonio 22 Figura 7: Esquemas del metabolismo del amonio Asimilación de Azufre El azufre es uno de los elementos más versátiles en los organismos vivos. Los puentes disulfuro de las proteínas presentan funciones estructurales y regulatorias. Este elemento participa en el transporte electrónico en grupos azufre-hierro. Está presente en el sitio catalítico de numerosas enzimas y co-enzimas (ureasa y Coenzima A) y también en numerosos compuestos secundarios (Figura 8). La mayor parte del azufre de las plantas superiores deriva del ión sulfato absorbido de las soluciones edáficas. En el suelo este compuesto principalmente proviene del desgaste de las rocas, aunque la industruialización añade una fuente adicional: la polución atmosférica. Los compuestos SO2 y H2S (producto de los combustibles fósiles) llegan al suelo con la lluvia. El SO2 gaseoso puede ser tomado a través de los estomas y posteriormente metabolizado por las plantas. En las plantas el primer paso en la síntesis de compuestos azufrados ogránicos es la reducción de sulfato al aminoácido cisteína. El SO42- es un ión muy estable y consecuentemente necesita ser activado. La activación consiste en: Sulfato + ATP APS + PPi Donde, APS es la adenosina-5’- fosfosulfato. Esta reacción, catalizada por la ATP sulfurilasa, es energéticamente desfavorable y para proseguir precisa que sus productos, APS y PPi, sean rápidamente convertidos en otros compuestos. Lo cual se consigue con la actividad de una pirofosfatasa inorgánica, que hidroliza el pirofosfato a fosfato inorgánico (aportando la energía para la activación del sulfato), mientras que APS reacciona con otra molécula de ATP para producir: APS + ATP PAPS + ADP 23 Donde, PAPS es 3’-fosfoadenosina-5´-fosfosulfato. Posteriormente PAPS es reducido a sulfuro (S2-). Esta es la principal ruta de asimilación de sulfato en bacterias y hongos. En plantas, alternativamente puede ocurrir que el azufre presente en APS sea convertido en un tiosulfonato (R-SO3-) unido a una enzima, que luego es reducido a tiosulfuro (R-S-). O bien APS es directamente reducido a sulfito y luego a sulfuro. En cualquiera de los tres casos, el tiosulfuro o sulfuro resultante reacciona con O-acetilserina para formar serina y acetato. Las enzimas involucradas en la síntesis de cisteína se han encontrado en el citosol, plástidos y mitocondrias de diversas especies. Las hojas son generalmente mucho más activas en la asimilación de azufre que las raíces. El azufre asimilado en las hojas es exportado por el floema hacia sitios de síntesis proteica (ápices de tallos y raíces, y frutos) principalmente como glutatión (Figura 9). 24 Figura 8: Compuestos orgánicos que contienen azufre Figura 9: Asimilación del azufre 25 Metabolismo Especial del Nitrógeno En la actualidad se han descripto más de 13.000 compuestos secundarios que contienen nitrógeno y se calcula que el número real de estos compuestos debe ser mucho mayor. Entre los principales compuestos de este tipo se puede mencionar: alcaloides, aminas, aminoácidos no proteicos, glicósidos cianogenéticos y glucosinolatos. Alcaloides, glicósidos cianogenéticos y glucosinolatos son temas que se tratan en otros puntos de la materia, en consecuencia en este eje temático desarrollaremos aminoácidos no proteicos y aminas. Aminoácidos no proteicos A pesar de que las proteínas de todos los organismos se sintetizan con 20 aminoácidos (AA), se han identificado más de 900 compuestos vegetales secundarios que pueden ser clasificados como tales, debido a que poseen un grupo carboxilo y un grupo amino o imino. Estos AA no son usados para la síntesis proteica de las plantas (de ahí el nombre de AA no proteicos) pero frecuentemente constituyen antinutrientes o antimetabolitos pues pueden interferir especialmente con el metabolismo de micro-organismos; aunque también son tóxicos para herbívoros (insectos y animales superiores), e incluso para otras plantas. En consecuencia, estos compuestos son parte del mecanismo de defensa de las plantas que los producen. Muchos AA no proteicos son semejantes a AA proteicos (Figura 10) y con bastante frecuencia se puede considerar a los primeros análogos estructurales de los segundos. Muchas veces derivan biosintéticamente de los AA proteicos, o bien poseen rutas biosintéticas que muestran poca semejanza con las de los AA proteicos. Estos compuestos son especialmnente abundantes en leguminosas, liliáceas y en varios hongos superiores (géneros Amanita y Coprinus) y algas marinas. Se ha postulado que existen en muchas otras especies pero en concentraciones extremadamente bajas. Los órganos vegetales ricos en estos compuestos son semillas (Leguminosae) y rizomas (Liliaceae). En semillas pueden exceder el 10 % del peso seco y dar cuenta de más del 50 % del nitrógeno presente. Estos compuestos son removilizados (al menos parcialmente) durante la germinación y por lo tanto presentan un rol en el almacenamiento de N, además de su función defensiva. 26 Las plantas productoras de AA no proteicos parecen tolerar estos antimetabolitos. Sus aminoacil-tRNA sintetasas discriminan entre AA proteicos y sus análogos, mientras que las enzimas de organismos no adaptados no lo hacen. Desde el punto de vista de la ecología y del metabolismo vegetal, los AA no proteicos pueden considerarse compuestos de defensa “multipropósito” y de almacenamiento de nitrógeno. Debido a que afectan blancos básicos (síntesis proteica y metabolismo de aminoácidos) presentes en todos los organismos, pueden ser ecológicamente importantes en las interacciones planta-planta (alelopatía), planta-microbio (bacterias, hongos, virus vegetales) y planta-herbívoros (insectos, vertebrados). Los AA no proteicos tomados por micro-organismos, por herbívoros, o por otras plantas pueden interferir con el metabolismo de éstos por medio de los siguientes mecanismos: 1. Pueden ser aceptados por el ribosoma en lugar del AA proteico correspondiente durante la biosíntesis de proteínas, conduciendo a la síntesis de proteínas defectivas (Ej.: Canavanina, ácido acetidina -2-carboxílico, etc.) 2. Pueden inhibir la activación de aminoacil-tRNA sintetasas, o de otros pasos de la síntesis proteica. 3. Pueden inhibir competitivamente sistemas de captación de AA (Ej.: ácido acetidina -2carboxílico, etc.). 4. Puede haber inhibición de la biosíntesis de AA. Ya sea por competición con el sustrato, o mediante una inhibición enzimática por feedback de los primeros pasos de una ruta biosintética por mimetismo con el producto final (Ej.: azaserina, albizina, Saminoetilcisteína). 5. Pueden afectar otros blancos, como procesos relacionados con DNA o RNA (canavanina, mimosina), o con la β-oxidación de lípidos (hipoglucina). Entre la gran cantidad de AA no proteicos existentes, describiremos sólo algunos importantes por su toxicidad: 3-Cianoalanina: Se encuentra en semillas de Vicia sativa y en otras especies del mismo género. Su biosíntesis se efectúa por acción de la β-Cianoalanina Sintetasa sobre cisteína y cianuro y su 27 hidrólisis es catalizada (en plantas que acumulan el AA) por la β-Cianoalanina Hidrolasa (Figura 11). Cisteína + CN- 3-Cianoalanina + SH- La 3-Cianoalanina posee efectos neurotóxicos, causando rigidez muscular y convulsiones en pollos y ratas. Sus efectos se suprimen con piridoxal fosfato. Acido N-Oxalil-diaminopropiónico: Este AA no proteico es una neurotoxina que se encuentra en Lathyrus sativus, L. latifolius, L. clymenum y otras 18 especies del género. Fue además aislado de dos especies de Crotalaria (Leguminosa, como Lathyrus). Su biosíntesis ocurre según las siguientes reacciones (Fig 11): Acido Oxálico + HS.Co- A Oxalil-CoA + Ac. 1,2-diaminopropiónico Oxalil-CoA + H2O (en presencia de ATP) HS.CoA+ Ac. N-Oxalil-diaminopropiónico La enfermedad causada por este compuesto, “neuralatirismo”, se caracteriza por rigidez muscular, parálisis de las extremidades inferiores, convulsiones y, en casos severos, por la muerte. Aminoácidos no proteicos relacionados al ácido N-oxalil-diaminopropiónico que también producen neurolatirismo son el ácido α,γγ-diaminobutírico (aislado de Vicia aurantia, Lathyrus sativus, L. silvestris, L. latifolius y otros 11 Lathyrus) y el ácido γ-N-oxalidil diaminobutírico (aislado de Lathyrus silvestris, L. latifolius y otros 18 Lathyrus más). Canavanina: Es el ácido 2-aminoguanidoxibutírico, frecuente en las leguminosas (descripto en unas 300 especies de Papilionoideas) y el principal AA no proteico de Canavalia ensiformis. Es un análogo de la arginina y posee efectos antimetabólicos en bacterias, algunos insectos y en plantas que carecen de canavanina. Debido a sus actividades como antimetabolito presenta interés farmacéutico, por ejemplo como compuesto antitumoral. En C. ensiformis, además actúa como fuente de nitrógeno. 28 Hipoglicina A y B: Los frutos inmaduros de Blighia sapida contienen Hipoglucina A (dipéptido derivado de glutamina con el ác. γ-glutámico). Aunque poco se sabe acerca de su biosínteis, se cree que derivan de la isoleucina. Las hipoglicinas poseen un efecto hipoglucemiante, pudiendo provocar (en hombre y animales) convulsiones, e incluso la muerte. Mimosina: Se encuentra en hojas y semillas de Leucaena glauca y L. lecocephala. También fue aislada de especies de Mimosa. Este AA se encuentra parcialmente convertido en glicósido. Su biosíntesis se haría a partir de lisina y o-acetilserina. En vertebrados produce pérdida del pelo. Acido Acetidina-2-carboxílico: Es un análogo del AA proteico prolina y actúa inhibiendo la síntesis de este último compuesto. En animales causa inhibición del crecimiento y malformaciones fetales debido a que el ácido acetidina-2-carboxílico es incorporado al colágeno en lugar de la prolina. Se encuentra en especies de Leguminosas, Agaváceas y Liliáceas. Es, además, un componente menor en la remolacha azucarera (Quenopodiáceas). La biosíntesis de este compuesto se iniciaría a partir de metionina, que sería convertida en homoserina, la cual a su vez sería aminada a ácido 2, 4-diaminobutírico, que luego pasaría a ácido 4-amino-2-oxo-butírico. Este último es ciclizado a ácido acetidina-2-carboxílico. Seleno aminoácidos: son un tipo especial de AA no proteicos que se encuentran en plantas que acumulan selenio, como la leguminosas del género Astragalus, donde se ha detectado mayoritariamente. El Selenio se acumula principalmente como Se-metil-selenocisteína. Sin embargo, si plantas no acumuladoras de selenio crecen en suelos seleníferos, se acumula como selenometionina. Sólo las plantas no acumuladoras de selenio incorporan los seleno aminoácidos en las proteínas y,1 en consecuencia, tales plantas son tóxicas para animales y pueden ser fatales para herbívoros. Esta incorporación ocurre porque las aminoacil-tRNA transferasas no distinguen entre Se derivados y los AA análogos azufrados. La ruta biosintética para la Se-metilselenocisteína es la misma que para la síntesis de S-metil-cisteína. Algunas especies que acumulan estos compuestos son: Haplopappus fremontii (Compositae) y Stanleya pinnata (Cruciferae) que acumulan Se-metilselenocisteína. Mientras que 29 Morinda reticulata (Rubiaceae), Neptunia amplexicaulis (Leguminosae) y Lecythis ollaria (Lecythidaceae) acumulan Selenocistationina. 30 Figura 10: Estructura de algunos AA no proteicos y de sus análogos. 31 Figura 11: Biosíntesis de cianoalanina y de otros AA no proteicos. Aminas Las aminas vegetales pueden clasificarse en aminas alifáticas (mono-, di- y poliaminas) y aminas aromáticas (que por sus propiedades fisiológicas se clasifican como protoalcaloides). Estos compuestos se comportan como cationes a pH fisiológico (valores de pKa entre 9 y 11), son metabolitos secundarios ampliamente distribuidos entre las plantas y existen como productos independientes o como intermediarios en la biosíntesis de alcaloides. Aminas Alifáticas Monoaminas Se han descripto aproximadamente 30 compuestos de este tipo, son comunes en flores de algunas familias (Rosáceas, Aráceas, etc.) y en cuerpos fructíferos de algunos hongos (por ej.: Phallus impudicus). Algunas monoaminas alifáticas y sus fórmulas se muestran en la Figura 12. Estos compuestos poseen olor desagradable (ya que semejan el olor de la carne podrida) y atraen insectos que visitan las flores o cuerpos fructíferos de hongos y acarrean con ellos el polen o las esporas, contribuyendo así a la polinización o a la dispersión de esporas. Además de su importancia en la biología floral, se ha propuesto que presentan un rol en la defensa (en algas rojas) ya que poseen actividad antibacteriana. En las plantas superiores las monoaminas alifáticas se biosintetizan por la acción de una Lalanina-aldehído aminotransferasa (dependiente de piridoxal fosfato) que produce la aminación de aldehídos alifáticos (Figura 13). En muchas algas rojas (Rodofíceas) se producen a partir de aminoácidos, por acción de una aminoácido descarboxilasa inespecífica (que también es dependiente de piridoxal fosfato), para la cual la leucina es el mejor sustrato, seguido de norleucina, isoleucina, valina y otros (Figura 14). Diaminas y poliaminas 32 Son compuestos policatiónicos capaces de unirse a polianiones (como el DNA). Las diaminas putrescina y las poliaminas espermidina y espermina están presentes probablemente en todas las plantas, mientras que la diamina cadaverina se encuentra en leguminosas (Figura 15). Así como las histonas estabilizan las cadenas de DNA de organismos eucariotas, la putrescina y la cadaverina cumplen con esta función en bacterias. Los DNAs de mitocondrias y cloroplastos vegetales (de origen microbiano según la teoría de endosimbiosis) nos son regulados o estabilizados por histonas. La putrescina y las poliaminas podrían tener la misma importancia en estas organelas que en las bacterias. Estos compuestos son capaces de estimular in vitro diversas etapas de la biosíntesis proteica (probablemente a través de interacciones con ácidos nucleicos). Por otro lado, putrescina y cadaverina pueden estabilizar biomembranas. Como consecuencia de todas estas interacciones, putrescina, espermina y espermidina son probablemente importantes para la regulación del crecimiento de las plantas, lo que explicaría su ubicua distribución. Algunas de estas aminas (putrescina y cadaverina) son precursores de varios grupos de alcaloides (pirrolizidina, nicotina, tropano, quinolizidina, y otros). La putrescina en plantas superiores puede formarse a partir del aminoácido arginina por dos rutas diferentes, siendo la más importante la vía de la agmatina y de la N-carbamilputrescina, en la cual participan la arginina descarboxilasa, la agmatina iminohidrolasa y la Ncarbamilputrescina amidohidrolasa. La putrescina es la poliamina que sirve de base para la biosíntesis de otras aminas (Figura 16). Muchas plantas poseen aminooxidasas que catalizan la oxidación de las aminas a aldehídos. Cuando la putrescina y la cadaverina son oxidadas, los aldehídos producidos adoptan espontáneamente formas cíclicas, produciéndose 1-pirrolina y 1-piperideina. Aminas Aromáticas Estas aminas generalmente derivan de la descarboxilación de aminoácidos catalizada por las respectivas aminoácido-descarboxilasas (Figura 17). Entre ellas podemos nombrar: Histamina: esta amina heterocíclica ha sido registrada en numerosas especies de todo el Reino Vegetal. Se origina por descarboxilación del aminoácido histidina y puede existir como amina 33 libre o como derivados N-metilados o N-acetilados, o formando amidas con ácidos orgánicos. Está presente, junto a serotonina y a acetilcolina, en los pelos urticantes de las ortigas (Urtica dioica, U. Urens, etc.), donde cumplen un rol defensivo. La histamina es además un neurotransmisor de vertebrados que se acumula en vesículas secretoras de los mastocitos. La inyección de histamina produce dolor e inflamación de la piel. Además, causa cefalea y caída de la presión arterial en el hombre, pudiendo producir la muerte en casos extremos. Sin embrago, cuando ingresa al organismo por vía oral es transformada por las bacterias del tracto digestivo en compuestos fisiológicamente inactivos. Protoalcaloides: reciben esta denominación las aminas aromáticas que no poseen hetrociclos nitrogenados. Todas estas aminas (fenilalquilaminas) derivan de los aminoácidos fenilalanina o tirosina (en cambio los compuestos que derivan del triptofano, poseen heterociclos aminados y se clasifican como alcaloides). Algunas de estas aminas, cuyas fórmulas se muestran en la Figura 18, se mimetizan con importantes neurotransmisores, como dopamina y noradrenalina, o con hormonas, como la adrenalina. Entre las fenilalquilaminas importantes podemos nombrar: Noradrenalina: aislada de bananas (Musa paradisiaca), hojas de espinaca (Spinacea oleracea), papa (Solanum tuberosum) y acónito (Aconitum napellus). Los frutos de banana son también especialmente ricos en otros neurotransmisores, como dopamina, serotonina e histamina. Mescalina: es un conocido halucinógeno obtenido del cactus Lophophora williamsii (mescal o peyotl) y de otros (Trichocereus) que han sido usado por aborígenes para propósitos rituales. Esta amina psicomimética interactúa con los receptores de los neurotransmisores serotonina, noradrenalina y dopamina e interfiere con el almacenamiento, liberación y metabolismo de las aminas biogénicas naturales. Efedrina y derivados: activan la liberación de noradrenalina, dopamina y serotonina e inhiben su re-captación, produciendo efectos eufóricos en los vertebrados. La efedrina es particularmente conspicua en especies de Ephedra (Gnetáceas), de donde fue aislada. Presenta uso médico como broncodilatador (espasmos bronquiales y asma); además, dilata la pupila, eleva la presión sanguínea y suprime el sueño. Hordeína: es un protoalcaloide presente en plantas de cebada en germinación. 34 Figura 12: Estructura de algunas aminas alifáticas Figura 13 35 Figura 14 Figura 15: Diaminas y Poliaminas 36 Figura 16: Biosíntesis de putrescina y de otras aminas Figura 17 Figura 18 37 38
