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Contribución de la Ingeniería Genética al mejoramiento de cultivos en sus características de tolerancia a sequía, salinidad, heladas y rendimiento. El largo camino desde el laboratorio al campo Instituto de Agrobiotecnología del Litoral Edificio del IAL en construcción- octubre de 2013 Calor Frío Patógenos Sequía Herbívoros Salinidad Estímulo externo Abiótico Biótico Percepción Modificación del Metabolismo Modificación de la Expresión Génica Las vías de señales son redes complejas (Adaptado de Wang y Chen, 2010) Estructura de ADN El dogma central de la Biología (Adaptado de Raven y Johnson, 2002) Se puede insertar un fragmento de ADN de cualquier origen en un plásmido bacteriano utilizando una ligasa Transformación Plásmidos como vectores de clonado Hasta 1972 se consideró que E coli era refractaria a la transformación. Luego se pensó que solo eran transformables las cepas recBCActualmente hay numerosos métodos de transformación química, fisiológica y mediante pulsos eléctricos. ¿Qué es un gen? ¿Qué es el ADN? Todo organismo tiene un genoma El genoma es el conjunto de la información genética que tiene ese organismo En los organismos eucariotas los genomas están divididos en un número definido de cromosomas ¿Qué es un gen? ¿Qué es el ADN? Un gen se puede definir como el segmento de ADN necesario y suficiente para generar un ARN o una proteína funcional Existe un número variable de genes en los distintos organismos Se conoce la función de unos pocos. CONICET EN TECNÓPOLIS ¿Qué es un gen? ¿Qué es el ADN? Conocer la función de un gen nos puede ayudar a conocer el origen de una enfermedad, generar un sistema de diagnóstico y elaborar una posible cura. Ejemplos: Conocer el gen que codifica la insulina permite hoy en día tratar adecuadamente a las personas que sufren de diabetes Conocer la función o la presencia de otros genes nos permite diagnosticar enfermedades prematuramente CONICET EN TECNÓPOLIS ¿Qué es un gen? ¿Qué es un transgén? Un transgén es un gen perteneciente a un organismo que se ha introducido en otro organismo distinto. Los objetivos de introducir genes en organismos homólogos o heterólogos son variados. Entre ellos: - obtener conocimiento sobre su función - mejorar alguna característica fenotípica del organismo receptor CONICET EN TECNÓPOLIS En el caso de la insulina, el gen de origen humano se introduce en una bacteria. La bacteria es “engañada” y produce la proteína con función hormonal en grandes cantidades como si fuera propia. En este caso el gen de la insulina se convierte en un transgén en la bacteria. Hombre/Mujer sano/a dador/a de insulina Hombre/Mujer diabético/o Bacteria engañada que fabrica insulina Hombre/Mujer tratado/a con insulina humana En el caso de las plantas la transgénesis se hace para beneficiar al hombre. El gen puede provenir de cualquier especie inclusive de cualquier planta y ser introducido en otra para generar una nueva planta con una característica distintiva y en general beneficiosa. Los transgenes en plantas o las plantas transgénicas Los transgenes en plantas o las plantas transgénicas Una planta es un organismo eucariota superior y en promedio tiene unos 20000 a 40000 genes distintos. Con la trangénesis se busca que el agregado de un solo gen exógeno le de una característica particular. Para esto hay que conocer la función del gen en cuestión, e introducirlo de forma tal de que se exprese en la parte u órgano de la planta que es de interés CONICET EN TECNÓPOLIS ¿Cómo lo percibe la sociedad? La genética no es de ahora El hombre la utilizó desde la antigüedad, aún sin conocer los mecanismos involucrados para domesticar plantas y animales (y microorganismos) La domesticación del maíz Laboratorio de Biotecnología Vegetal Instituto de Agrobiotecnología del Litoral Aislamiento de genes que codifican factores de transcripción en girasol, arroz, Arabidopsis y Medicago truncatula Estudios funcionales de estos genes Estudios funcionales de sus regiones promotoras Aplicaciones biotecnológicas utilizando estos genes y sus promotores como herramientas para el mejoramiento de especies de interés agronómico La regulación de la expresión génica Señales de reconocimiento, percepción y transducción Control transcripcional Modificación de la expresión génica Inducción Modificación P Degradación Ub A B C A B TFIID TATA P C ARN polimerasa GEN Adaptado de Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 2005 Organismos modelo Girasol Arabidopsis thaliana Trigo Arroz Medicago truncatula Soja Maíz Metodología utilizada para determinar la función del gen :”gene discovery” q RT-PCRs Preparación de ARN Preparación de ADN genómico Fluorometría e histoquímica Northern blots. Selección de transformantes Clonado del ADNc Clonado del promotor Análisis del fenotipo Clonado de genes promotores ADN copia Transformación de Arabidopsis thaliana microarreglos Las plantas transformadas con la construcción 35S:HAHB4 presentan una marcada tolerancia a estrés hídrico T WT T Dezar et al., Trans. Res. 2005 WT WT T WT T 24 hs después de regadas Dezar et al., Trans. Res.2005 Las plantas de Arabidopsis thaliana que expresan el gen HaHB4 de girasol son tolerantes a condiciones extremas de sequía WT: plantas no transformadas TG: plantas transformadas con el gen HaHB4 Cuando la intensidad de luz es baja (en la sombra) las plantas transformadas generan más biomasa Plantas transgénicas expresando HaHB4 son notablemente menos atacadas por larvas de Bradysia impatiens pBI121 35S: HAHB4 Salvajes Transgénicas Salvajes Transgénicas Manavella et al., Plant J. 2008 Un largo camino…………….. La historia de las plantas tolerantes a sequía El camino de laboratorio al campo Representación esquemática y optimista del proceso completo necesario para llegar desde el descubrimiento de la función de un gen hasta un producto de mercado. Arce et al., 2008 Recent patents in Biotechnology La historia de los factores de transcripción HD-Zip En 1994 se logró identificar el primer HD-Zip I de girasol, una planta de genoma no secuenciado hasta la fecha La presentación de patentes Seguimos en el laboratorio y en la cámara de cultivo Los cultivos de interés agronómico Selección de plantas transformadas de maíz con el herbicida BASTA como marcador de selección Control sensible al BASTA Transgénica, resistente al BASTA Eligio Morandi et al., resultados no publicados Ensayo de estrés hídrico en invernáculo Eligio Morandi et al., resultados no publicados Medida de fijación de CO2 Eligio Morandi et al., resultados no publicados Medida del área foliar después del ensayo de estrés hídrico plantas transgénicas plantas no transgénicas La respuesta de defensa contra herbívoros está aumentada en el maíz transgénico que expresa HaHB4 Manavella et al., Plant J. 2008 Tratamiento de estrés hídrico a las plantas de soja transgénicas y null Línea 2: gm a7H Cabello et al., resultados no publicados Plantas de trigo que expresan el gen HAHB4 Línea 2 Línea 1 Niveles de expresión de HAHB4 Null heterocigota homocigota Null heterocigota homocigota Trigo transgénico Cabello et al., resultados no publicados Productividad de trigo transgénico que expresa el gen HaHB4 de girasol Ensayos en el campo Trigo Construcción UBI::HaHB4 Cosecha en diciembre de 2009 Trigo Construcción UBI::HAHB4 Cosecha en diciembre de 2009 Ensayo realizado en Monte Buey, Provincia de Córdoba Línea salvaje; Cadenza Línea comercial: BI 3004 Fecha de siembra: junio de 2009 Densidad de siembra: 350 semillas por metro cuadrado Características del suelo; pH 5,8; materia orgánica: 3,0 % Total de lluvias durante el período de desarrollo; 594,5 mm Gerónimo Watson y Federico Trucco (Indear) Trigo Construcción UBI::HAHB4 Cosecha en diciembre de 2009 Villalonga-Bs As Niveles de riego y precipitaciones Gerónimo Watson y Federico Trucco (Indear) Trigo Construcción UBI::HAHB4 Cosecha en diciembre de 2009 Ensayo realizado en Monte Buey, Provincia de Córdoba Gerónimo Watson y Federico Trucco (Indear) Trigo Construcción UBI::HAHB4 Cosecha en diciembre de 2009 Villalonga-Bs As Las diferencias de rendimiento de granos entre los tratamientos de irrigación fueron significativas, siendo un 20 % mayor para las plantas irrigadas Las diferencias de rendimiento entre líneas fueron significativas con un p-value de 0,007 y como ejemplo, la línea a12 presentó un aumento de productividad del 38 % Trigo Construcción UBI::HAHB4 Cosecha en diciembre de 2009 Monte Buey - Córdoba Se observaron bajos rendimientos generales que se atribuyen a una cosecha tardía y a las altas temperaturas durante la misma Rendimientos de maíz en Hugues, provincia de Santa Fe, campaña 2010/2011 Rendimientos de soja en Charata-Chaco, campaña 2010/2011 Trigo 2011/2012 Villalonga 30% de aumento de la productividad 10/12/2013 HaHB4 modificado Soja 2011 Monte Buey 23% aumento de la productividad HaHB4 modificado 10/12/2013 Maíz 2011 Charata 35% aumento de la productividad HaHB4 modificado 10/12/2013 Tecnología HaHB1/AtHB13 Integrantes del equipo de investigación Contacto: rchan@fbcb.unl.edu.ar Raquel Chan Julieta Cabello Agustín Arce HAHB1 confiere tolerancia a temperaturas de congelamiento (heladas) estabilizando las membranas b a Membrane stability 100 Leaching ratio (L) 90 80 70 60 wt 50 TG-A 40 TG-B 30 20 10 0 Control 30´ 2 hs Period of time at -8 °C c Sobrevivientes (%) Tratamiento: 2 hrs at -8 °C Tratamiento: 7 hrs at -8 °C Plantas no aclimatadas WT TG-A TG-B TG-C TG-D TG-E 22 ± 3 85± 2 75 ± 4 70 ± 3 65 ± 2 60 ± 5 Plants expressing the transcription factor HAHB1 (35S:HAHB1) are more tolerant of salt stress a Membrane stability 45 Leaching ratio (L) 40 35 30 wt 25 TG-A 20 TG-B 15 10 5 0 50 100 200 NaCl (mM) b WT TG-B TG-A Treatment: 350 mM of NaCl A: Transgenic plants membranes stability is higher than WT ones. B: illulstrative photograph of transgenic plants tolerating better high salt concentration. Plants expressing the transcription factor HAHB1 (35S:HAHB1) are more tolerant of drought WT TG-A Treatment: Severe water stress applied to 30-day-old plants (three independent lines) Transgenic plants tolerate better this stress condition. Illustrative photograph showing a typical drought stress experiment applied to mature plants (5-weekold) TG-B TG-C Las plantas transformadas con HaHB1/AtHB13 pierden menos rendimiento que las no transformadas en estrés hídrico moderado HaHB11, un gen que confiere múltiples tolerancias y aumenta el rendimiento Grupo de investigación Contacto: rchan@fbcb.unl.edu.ar Raquel Chan Julieta Cabello Jorge Giacomelli HaHB11 confiere tolerancia a estrés hídrico severo Illustrative assay performed with 25-day-old trasnsgenic lines (TG-A, -B, -C) and WT plants, water-starved during 15 days. The illustrative photograph was taken during the assay. Right: a table showing the survival rate of each genotype. Statistical analysis was performed with 64 plants from each genotype. HaHB11 confiere tolerancia a estrés salino TGC TGA TGC TGB TGA TGB 21-day-old trasnsgenic lines (TG-A, -B, -C) and WT plants were watered with a NaCl increasing concentration up to 400 mM along 21 days. The photograph was taken 7 days after the end of the assay. Statistics was performed with n=32 plants for each genotype. HaHB11 confiere tolerancia a la inundación del suelo Phenotype in standard growth conditions 21-day-old trasnsgenic lines (TG-A, -B, -C) and WT plants grown on soil with their roots submerged during six days. Photograph was taken and survivor’s percentage was calculated 6 days after recovery. HaHB11 confiere tolerancia a la inundación total de la planta 21-day-old three independent trasnsgenic lines (TG-A, -B, -C) and WT (101) plants grown on soil and submerged during six days. The photograph was taken six days after recovery at standard conditions. HaHB11 genera mayor masa foliar en las plantas Phenotype in standard growth conditions A: 40-day-old WT and transgenic plants were grown on soil and normally irrigated during the whole life cycle B: with 50-day-old plants HaHB11 aumenta significativamente el rendimiento Rendimiento de plantas crecidas en condiciones normales TGC TGB TGA El rendimiento fue calculado de un experimento hecho con 12 plantas de cada genotipo Muchas gracias Un homenaje a un Grande, el Negro Fontanarrosa ¡Mozo! Hay un transgén en mi sopa Miembros del grupo actual Investigadores Raquel Chan Karina Ribichich Javier Moreno Miembros que participaron con anterioridad Investigadores Daniel Gonzalez Carlos Dezar Doctorandos Becarios post-doctorales Julieta Cabello Agustín Arce Jorge Giacomelli Doctorandos Delfina Re Matías Capella Jesica Raineri Pamela Ribone FCA de la UNR Eligio Morandi Carlos Gosparini Carlos Cairo Andrés Quijano Claudia Palena Gabriela Gago Carlos Dezar Mariana Tioni Pablo Manavella Federico Ariel Del grupo Indear Gerónimo Watson Federico Trucco Mariana Chiozza Ezequiel Marchionni Endosulfan in the Namoi River, Australia: Bt cotton start 1996-97 0.18 Endosulfan Concentration (ug/L) 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 1991-92 1992-93 1993-94 1994-95 1995-96 1996-97 Year 1997-98 1998-99 1999-00 2000-01 Los problemas a resolver Responder las preguntas planteadas y otras que surgirán Mejorar la percepción pública de los transgénicos Problemas con la presentación de patentes Problemas regulatorios Para nuestro país: Desarrollar tecnologías propias y mecanismos que permitan atravesar el pipeline con mayor rapidez y apoyo ¿Qué soluciones puede ofrecer la biotecnología? Se calcula que en 2050 habrá 3000 millones de personas más en el mundo que demandarán el doble de alimentos y energía Sólo queda un 5 % de suelo cultivable En Argentina, los únicos cultivos aprobados para comercialización son Soja tolerante a herbicida Maíz tolerante a herbicida Maíz resistente a insectos Maíz resistente a insectos y tolerante a herbicida Algodón tolerante a herbicida Algodón resistente a insectos Algodón resistente a insectos y tolerante a herbicida
