Universidad Simón Bolívar Decanato de Estudios de Postgrado Coordinación de Biología Estudio molecular del oncogen BCR/ABL t(9:22) en pacientes venezolanos con Leucemia Mieloide Crónica. Tesis Doctoral presentada a la Universidad Simón Bolívar por Fanny Carreño Como requisito parcial para optar al título de Doctora en Ciencias Biológicas Realizado bajo la Tutoría de: Dr. René Utrera Sartenejas, Enero 2008 DEDICATORIA Siento un inmenso placer al elogiar con esta tesis a las dos personas que engendraron en mí la curiosidad y la pasión por el mundo desgarrador y fascinante de la LEUCEMIA A mi hijo Alejandro Antonio A mi maestro José Luís López ii AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mis más sinceros agradecimientos al Dr. René Utrera por brindarme la oportunidad de desarrollar este proyecto tan ambicioso, el cual, sin lugar a dudas, ha permitido nuestro crecimiento personal y entera satisfacción al aportar un humilde granito de arena en la búsqueda de una mejora en la calidad de vida de las personas que sufren estos tipos de aflicciones. Al Dr. José Luís López a quien admiro y respeto infinitamente. Él es la persona que con su paciencia, cariño, buen humor y amor por su trabajo me enseñó que cuando se cree y ama lo que se está haciendo no importan las adversidades y el reconocimiento porque siempre te queda la satisfacción de que estas ayudando a mejorar la vida de un enfermo. A la Dra. Osiris Da Costa, por su invaluable ayuda en la obtención de las muestras, las interminables revisiones y discusión de historias clínicas, su apoyo en la revisión del manuscrito y su amistad desinteresada. Osiris mil gracias. A la Dra. Leonor Cárdenas, por abrirme siempre las puertas de su consulta en la busca de muestras e historias clínicas, así como todo su apoyo profesional y personal en la culminación de este proyecto. A las Lic. Aramilena Prado y Patricia Rodríguez quienes me brindaron todo su apoyo en la realización de la técnica citometría de flujo y en la revisión y discusión de los resultados referentes a este tema. Chicas, siempre les estaré en deuda. Al Dr. Ivan Galindo, por permitirme realizar en su laboratorio la técnica de RT-PCR en Tiempo Real y por todo su apoyo y colaboración durante los experimentos. Al Dr. Juan Carlos Martinez, por su infinita paciencia en los interminables momentos de consultas sobre los experimentos de RT-PCR en Tiempo Real. Mil gracias Juan. A los Dres. Pedro Sánchez, Ana Monzón y Elsa Tovar por todas las facilidades que me dieron durante la estandarización del panel de las translocaciones. A mi esposo Carlos Méndez, por toda su ayuda en la realización de la estadística de este trabajo. Carlos, sin temor a dudas, haz sido mi horizonte en la culminación de este trabajo, sin ti este logro no hubiera sido posible. Gracias por cruzar hacia mi camino y empezar a caminar junto a mi, gracias por tanto amor a nuestros hijos y sobre todo gracias por seguir allí con tu infinita paciencia y sabiduría. Te amo. A la Dra. Susana Blanco, porque en el momento más difícil de mí doctorado sólo tú me enseñaste la puerta que conduciría a mi objetivo final. Siempre estaré cuando me necesites susi (ve susi ve). A la Dra. Margarita Rodríguez, por todos sus consejos oportunos y por ser esa madre que todos los estudiantes necesitamos en los momentos más difíciles. A la Dra. Antonieta Porco, por sus valiosos consejos en las discusiones de laboratorio y por su apoyo moral en los momentos de duda. Al Dr. Emilio Herrera, trabajar contigo ha sido una experiencia de vida para mí. Tú mano amiga recogió los despojos, los pego con sonrisas, cafés y canciones, pero también con trabajo, perseverancia y confianza en mí y en mi trabajo. Profe, muchas gracias, su confianza y cariño me permitieron levantarme y culminar hoy este camino. Siempre te estaré en deuda. Al Dr. Guillermo Barreto (mi coordinador), por estar siempre allí para escuchar mis dudas, mis quejas, mis sin sabores, pero sobre todo para darme opciones de salida. Guille mil gracias. A la Dra. Martha Bravo, por comenzar conmigo este camino y por mantenerme atada a una silla durante las horas interminables de discusión de papers. Los caminos que iniciamos con amigos son más llevaderos en los momentos más tortuosos, pero son esos mismos caminos los que a veces y sin un por qué separan nuestros destinos. Espero que tu sendero esté siempre lleno de dicha y amor. iii A mis inolvidables amigas Noelis, María José y Yumelis, me siento muy afortunada de que ni el tiempo, ni la distancia, ni las dificultades hayan podido agrietar las paredes de nuestra amistad. Gracias por estar siempre allí. Las quiero. A mis panas del asco: Pedro, Ariana, Giselle, Cristinita. Gracias por aguantar a esta Cumanesa en todos sus momentos. A los compañeros y profesores amigos del laboratorio de genética de poblaciones: Rosita, Angela, Tatiana, Bladimir, Maribet, Victor, Nicida, Prof. Jazmin, Prof. Marisol. Gracias por compartir conmigo esos momentos de trabajo extra. A la Doctora Yajidy El Abed, por haber recorrido este camino conmigo y compartir los interminables trasnochos y fines de semana en la Univ. Amiga, gracias por todas tus palabras de aliento y apoyo cuando más lo necesité. A mis amiguis de celular: Rafa (monster), Gladinex, Anita, Loly, Adriana, Jaki, deisy, Juancito. A mis amiguis del laboratorio: Estluz, Leomig, Andreina, Roybel, Luisa, Patricia, Pedro, Mayela, Vanessa, Yurianny, Fifí, Carolina, María José, Orbelis. A las super chicas de la coordinación Judiht y Marisol, quienes además de cumplir su trabajo a cabalidad están siempre pendientes de que sus chicos estén al día y terminen lo más pronto posible su camino académico. Gracias Judiht por guiarme siempre. A la coordinadora Prof. Solange Issa, por todo su gran apoyo y colaboración durante la entrega del manuscrito. Gracias profe. A mis dos angeles guardianes: Joa y Maggi, ustedes son el mejor regalos que me dieron mis padres. Gracias por perseverar conmigo en este camino. Las amo. A mis padres, Antonio y Alida, quienes me enseñaron que el regalo más valioso que tenemos para dar es la humildad. Los amo. A mi hijo Rodrigo, regalo especial de dios que llegó en su justo momento. A dios gracias. A la Señora Margarita Vallejo, por su paciencia y colaboración durante el escrito de este manuscrito y por enseñarme que no importa cuanto trabajo tengas, la familia siempre esta primero. A mis cuñis Hector, Enrique, Sandy, Norelis, por su solidaridad. A mis amigos Nora, Oliver, Sergio, Israel, Priscila y cheo. Gracias por todo el amor y cuidado hacia mi y mis hijos. Nora, eres una hermana más. A mis tías, tíos y primas lindas que nunca me desampararon, Enrique, Lilia, Zuleima, Hortensia, Marisol, Carelin, Elianny, Hayarit, Francys, Vanesa, Daniela, Osmari. A mi hija putativa Liz, que dios te bendiga. Al FONACIT por financiar este proyecto (código G2001000784) y por darme la beca que permitió mi residencia en Caracas y permanencia en el postgrado. A todos GRACIAS iv RESUMEN Estudio molecular del encogen BCR/ABL en pacientes venezolanos con leucemia mieloide crónica. La leucemia mieloide crónica (LMC) es una patología clínica común, caracterizada por la expansión clonal de células mieloides progenitoras. Esta es causada por la translocación recíproca y no aleatoria t(9;22)(q34;q11), que origina el gen de fusión BCR-ABL en el cromosoma 22 (conocido como cromosoma Filadelfia, Ph+), el cual codifica para una proteína quimérica funcionalmente activa que es capaz de ejercer un efecto transformante en todas las células que la producen. Este trabajo reporta el estudio molecular por RT-PCR de la translocación BCR-ABL en 297 pacientes venezolanos diagnosticados clínicamente con LMC. Los análisis estadísticos de estos datos demuestran que dicha translocación se presenta con una frecuencia de 67.3% (200/297), la cual no corresponde con lo reportado en estudios previos (95%). De los 200 pacientes positivos para BCR/ABL, las variantes estuvieron distribuidas de la siguiente manera: b2a2 (43.5%), b3a2 (39.5%), e1a2 (3.5%), mientras que de sus co-expresiones se encontró que: b2a2/b3a2 (12.5%) y b2a2/e1a2 (1%). Los datos obtenidos de las variantes con mayor frecuencia (b2a2 y b3a2) concuerdan con los resultados reportados en otros países. Las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 fueron clonadas y secuenciadas, pudiéndose identificar en algunos pacientes, el punto de fusión que identifica a cada una de ellas. En las secuencias realizadas sobre la variante b2a2 fueron detectadas 2 mutaciones puntuales silentes: a) (T/C) en la posición 402 de 3 pacientes y b) (T/C) en la posición 434 de 1 paciente, ambas en la región abl del híbrido BCR/ABL, mientras que las secuencias realizadas para las variantes b3a2 y e1a2, evidenciaron el punto de fusión reportado, no detectándose mutaciones en la porción del gen abl. El cálculo de la frecuencia para las variantes reportadas evidenció que ninguna de ellas estuvo relacionada con la edad o el sexo, aunque se observó una mayor probabilidad de detección de la enfermedad en etapa adulta, principalmente a partir de los 40 años. La estandarización de un panel de translocaciones asociadas con diversos tipos de leucemia permitió la identificación de éstas en 40 pacientes que dieron negativos para la quimera BCR/ABL, 2 fueron positivos para CBFβ/MYH11, 5 positivos para AML1/ETO, 6 positivos para E2A/PBX1, 3 positivos para SIL/TAL, 11 positivos para TEL/AML y 9 positivos para PML/RARα. Análisis por citometría de flujo permitió hacer la clasificación de 10 pacientes LMC en fase inicial (3 FC) y crisis blástica (7 CB), a estos últimos se les logró identificar su linaje y fueron clasificados en LMCCB mieloide (4) y en LMCCB linfoide (3). El estudio de los tres factores que pueden originar la resistencia al tratamiento con Imatinib demostró que en las tres fases de la enfermedad la resistencia a Imatinib fue causada por un aumento en los niveles de expresión de BCR/ABL y no por la presencia de mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de esta quimera o por un aumento en los niveles de expresión del gen Lyn, el cual ha sido abundantemente implicado en la resistencia a Imatinib. Estos datos demuestran que BCR/ABL ejerce directamente un efecto transformante en las células que lo expresan en pacientes con una resistencia primaria, tal como ha sido reportado. Este trabajo confirma que la detección molecular de la LMC es la vía más rápida, confiable y efectiva en el diagnóstico temprano de la LMC, el cual colabora con el tratamiento y supervivencia de los pacientes que sufren esta patología. Así mismo, se demuestra la importancia de los paneles de diagnóstico y la gran ayuda que ofrece la citometria de flujo en la clasificación de la LMC y otras leucemias. La evolución de estos estudios, contribuirán a la obtención de un mayor conocimiento del comportamiento de la LMC en la población venezolana y a un mejor tratamiento en base a las diferentes terapias que hoy en día son aplicadas en nuestro país. Palabras claves: LMC, BCR/ABL, Lyn. v ÍNDICE GENERAL Introducción Clínica de la Leucemia Mieloide Crónica (LMC) Factores genéticos y no genéticos (ambientales) relacionados a la LMC Citogenética de la LMC Caracterización de los genes translocados en la LMC Vías de señalización celular que se ven afectadas en pacientes LMC Adhesión celular alterada Activación constitutiva de la señalización mitogénica Reducción de la apoptosis celular Degradación de proteínas inhibidoras de ABL por proteosomas Tratamiento de la LMC Tratamiento de la LMC con Imatinib Resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes con LMC Sobre-expresión de la quimera BCR/ABL Modificación en la expresión de genes por BCR/ABL Expresión del gen Lyn Mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera BCR/ABL Otras modalidades de tratamiento para la LMC Técnicas empleadas para el diagnóstico y clasificación de las leucemias Citogenética Citometría de flujo Señales de dispersión Señales de Fluorescencia PCR en tiempo real Justificación e importancia del tema tratado Objetivos General Específicos 1 2 4 5 7 11 12 13 15 17 18 20 22 23 23 25 27 28 29 30 31 32 32 34 39 42 42 Metodología Diagnóstico molecular de BCR/ABL Obtención de las muestras Extracción de ARNtotal Obtención de células mononucleares (Gradiente de Ficoll) Extracción de ARN total. Protocolo A Extracción de ARN total. Protocolo B Determinación de la concentración y calidad del ARNt Transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa Transcripción reversa (RT) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Clonación de las variantes de BCR/ABL Preparación de células competentes Ligación Transformación Extracción y Purificación del ADN plasmídico (Mini-prep) Digestión del ADN plasmídico con enzimas de restricción (endonucleasas) Secuenciación manual y automática de los productos de BCR/ABL vi 45 45 45 45 45 46 47 47 47 47 50 50 51 52 53 53 54 Purificación de los productos de PCR (protocolos A y B) Secuenciación manual Reacción de secuenciación para los productos de la PCR Reacción de secuenciación para los plásmidos Corrida electroforética de las reacciones de secuenciación manual, en geles de poliacrilamida al 6%. Tinción con plata para los geles de secuencia Secuenciación automática Análisis estadístico en el diagnóstico molecular Detección de otras translocaciónes que inducen leucemia: panel de diagnóstico Obtención de la muestra RT-PCR convencional: Citometría de Flujo Determinación de la LMC mediante citometría de flujo usando paneles de anticuerpos monoclonales específicos. Obtención de la muestra Procesamiento de las muestras en el citómetro de flujo y su correspondiente análisis. Análisis de los resultados Factores implicados en la resistencia al tratamiento de la LMC con imatinib Modificación de la expresión génica por bcr/abl Obtención de la muestra Selección de genes a ser estudiados Tratamiento del ARNtotal con ADNasa Aislamiento de ARNmensajeros RT-PCR convencional RT-PCR en Tiempo Real Análisis de los datos Cuantificación relativa sin curva estandar Análisis estadístico Detección de mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera BCR/ABL. Obtención de la muestra RT-PCR Purificación de los productos de la PCR Secuenciación automática 54 55 55 56 Resultados 80 80 80 80 82 Diagnóstico molecular de BCR/ABL Extracción de ARN total. Extracción de ARN total. Protocolo A Extracción de ARN total. Protocolo B Determinación de la translocaciòn BCR/ABL por transcripción inversa a partir de ARNt y su posterior amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) Clonación de productos de PCR con variantes de BCR/ABL Secuenciación de las muestras clonadas o productos de PCR de las diferentes variantes de BCR/ABL Secuenciación manual Secuenciación automática Variante b2a2 Variante b3a2 Variante e1a2 Análisis estadístico de los resultados obtenidos en el diagnóstico molecular de BCR/ABL vii 56 57 57 58 59 59 60 62 62 64 64 65 70 70 71 71 72 72 73 74 74 74 75 76 76 76 78 79 83 85 87 88 91 91 94 96 98 Frecuencia de la quimera BCR/ABL en pacientes LMC Venezolanos Frecuencia de la variantes b2a2, b3a2, e1a2, b2a2/e1a2 y b2a2/b3a2 en pacientes LMC venezolanos. Comparación de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2 y b2a2/b3a2 entre pacientes LMC venezolanos y otros países latinoamericanos. Comparación de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2 y b2a2/b3a2 entre pacientes LMC venezolanos con respecto a la edad y el sexo. Detección de otras translocaciónes que inducen leucemia: panel de diagnóstico Citometría de Flujo Caso LMC Caso LMC en crisis blástica (CB) linfoide Caso LMC en crisis blástica (CB) mieloide Factores implicados en la resistencia al tratamiento de la LMC con imatinib Modificación de la expresión génica por BCR/ABL Selección de los pacientes a ser evaluados Estandarización de las condiciones de amplificación por PCR Eliminación de ADNg en las muestras de ARNt usadas en la síntesis de ADNc Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR convencional para los genes GAPDH, Lyn y AKAP12 Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR en Tiempo Real para los genes GAPDH, Lyn y AKAP12 Evaluación por PCR en Tiempo Real del gen Lyn en pacientes Venezolanos con LMC Estadística de la RTQPCR Detección de mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera BCR/ABL Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR para el punto de fusión y el dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL Secuenciación automática del dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL de los pacientes con LMC 99 99 101 103 106 110 111 113 115 119 119 119 121 121 122 122 124 128 132 132 134 Discusión Conclusiones Lista de Referencias Anexos 141 Anexo A 205 Anexo B 206 Anexo C 207 Anexo D 209 173 176 204 Anexo E viii ÍNDICE DE FIGURAS Fig. Título Pág. 1 Esquema representativo del proceso de Hematopoyesis. 2 2 Esquema representativo de la translocación recíproca y no aletoria entre los cromosomas 9 y 22 que originan el cromosoma Filadelfia que participa en la aparición y evolución de la LMC. 6 3 Esquema representativo de los diferentes dominios estructurales presentes en las proteínas (A) BCR, (B) ABL y el híbrido (C) BCR/ABL. 8 4 Esquema representativo de la estructura de los genes abl y bcr en sus respectivos cromosomas y las diferentes isoformas quiméricas que se pueden forman a partir de la fusión de ambos. 10 5 Esquema representativo del complejo de adhesión focal. 14 6 Esquema de las diferentes vías de señalización celular que pueden ser afectadas por la expresión del híbrido BCR/ABL. 15 7 Esquema de algunas vías de señalización celular que pueden ser afectadas por la expresión del híbrido BCR/ABL. 17 8 Representación de las tres primeras modalidades terapéuticas usadas para el tratamiento de la LMC. 19 9 Presentación farmacéutica del inhibidor Glivec, modo de acción y su estructura química. 22 10 Identificación de genes que pueden ser usados para distinguir pacientes LLA sensibles y resistentes al tratamiento con Imatinib. 24 11 Identificación de los diferentes tipos de células inmaduras que se pueden encontrar en un frotis sanguíneo de paciente con LMC. 30 12 Ilustración representativa de un estudio citogenético con células de un paciente LMC. 31 13 Ilustración representativa del funcionamiento del citómetro de flujo. 33 ix 14 Ilustración representativa del modo de acción de los tres sistemas de detección de la amplificación por RTQ-PCR. 36 15 Ilustración representativa del sistema Light Cycler para amplificación por RTQ-PCR. 37 16 Esquema ilustrativo de la posición de los cebadores en los genes bcr y abl (Panel A) y en las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 (Panel B). 49 17 Secuencias de las variantes b2a2 (Panel A), b3a2 (Panel B) y e1a2 (Panel C) correspondientes a las diferentes translocaciones del híbrido BCR/ABL. 50 18 Dot plot de la serie blanca en condiciones de normalidad. 65 19 Esquema de los posibles casos que se pueden presentar a la hora del análisis de resultados en los Dot plot de fluoresecencia Ag-Ag o mixto. 66 20 Dot plot de fluorescencia mixto. 67 21 Dot plot de fluorescencia mixto representativo de la separación en cuadrante de las poblaciones celulares y valoración en porcentajes de la intensidad de expresión del Ag analizado. 68 22 Dot plot de fluorescencia Ag-Ag representativo de la separación en cuadrante (líneas verdes) del enfrentamiento de dos antígenos y la valoración de sus expresiones en porcentajes. 69 23 Secuencia del híbrido BCR/ABL identificando el punto de fusión y el dominio tirosina quinasa. 78 24 Extracción de ARNt. 81 25 Extracción de ARNt con Trizol. 83 26 Amplificación por RT-PCR de las diversas variantes de BCR-ABL. 85 27 Determinación de colonias positivas conteniendo el fragmento clonado 86 28 Determinación de los clones positivos. 87 29 Secuencia manual del paciente 112 (b2a2). 89 30 Alineación de las secuencias manuales de los pacientes LMC 20, 54 112, 130, 139 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL 90 x (Variante b2a2, número de acceso: AJ131467). 31 Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC 20, 54, 93, 112, 130, A9 y A6 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (Variante b2a2, número de acceso: AJ131467). 93 32 Secuencias de los pacientes LMC 93 y A9 con el punto de fusión de la quimera BCR/ABL, variante b2a2. 93 33 Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC A15, 16, 17, 18 y 19 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (Variante b3a2, número de acceso: AJ131466). 95 34 Secuencias de los pacientes LMC A15 y A19con el punto de fusión de la quimera BCR/ABL, variante b3a2. 96 35 Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC A7 y A14 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (Variante e1a2, número de acceso: AF113911). 97 36 Secuencias de los pacientes LMC A7 y A14 con el punto de fusión de quimera BCR/ABL, variante e1a2. 98 Análisis de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2, e1a2, b2a2/e1a2 y b2a2/b3a2 de los pacientes LMC venezolanos con respecto a la edad y el sexo. 105 Distribución por grupos de edades de los pacientes BCR/ABL y distribución de la población general Venezolana. 105 Estandarización por RT-PCR de siete translocaciones vinculadas Con el origen y evolución de otros tipos de leucemia 107 Dot-plot de la población celular (por tamaño y granulosidad) de los tes casos de LMC analizados. 111 41 Dot-plot de la población celular de un paciente con LMC analizado 112 42 Dot-plot de la población celular de un paciente representativo de los tres casos de LMC en crisis blástica analizados 114 Dot-plot de la población celular de un paciente representativo de los tres casos de LMC en crisis blástica analizados 116 Ensayos de amplificación por PCR convencional en muestras previamente tratadas con ADNasa. 121 37 38 39 40 43 44 xi 45 Estandarización de la amplificación por PCR convencional de los genes GAPDH, Lyn y AKAP12. 122 46 Gráficas de amplificación, curva de fusión y corrida en agarosa 1.5% de los productos de amplificación de los genes GAPDH, AKAP12 y Lyn en personas normales y pacientes con LMC. 123 47 Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 1. 126 48 Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 2. 126 49 Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 3. 127 50 Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp.4. 127 51 Gráfica de la expresión relativa del gen Lyn en controles (N, puntos blancos) y pacientes LMC en las diferentes fases clínicas de enfermedad. 130 52 Gráfica de la expresión relativa aleatorizada de los gen GAPDH y Lyn en las diferentes fases clínicas de la LMC. 131 53 Estandarización del protocolo de PCR empleado para la amplificación del punto de fusión de la quimera BCR/ABL en pacientes con LMC 133 54 Estandarización del protocolo de PCR empleado para la amplificación del dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL en pacientes con LMC 133 55 Alineación de la secuencias automáticas de los pacientes F1, F2, F3, F5, F6, F10, F11, F12, F13, F14, F25, F16, F17, F18, F19 y la secuencia reportada para el dominio de BCR/ABL (número de acceso: NM005157) 138 56 Mutaciones puntuales encontradas en el dominio tirosina quinasa (SH1) de la quimera BCR/ABL asociadas con la resistencia clínica a Imatinib. 166 xii ÍNDICE DE TABLAS Tabla Título Pág. I Mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa del a quimera BCR/ABL que han sido asociadas con la resistencia al tratamiento con Glivec en pacientes con LMC y LLA. 28 II Secuencia de cebadores empleados en la amplificación de las diferentes variantes de la translocación BCR/ABL y del control interno BCR en pacientes LMC. 48 III Translocaciones seleccionadas para la producción de paneles de diagnóstico de Leucemias. 61 IV Paneles de anticuerpos monoclonales usados en el diagnóstico de enfermedades hematoncológicas. 63 V Genes seleccionados para los estudios de expresión génica en pacientes positivos para la translocación BCR/ABL. 71 VI Secuencia de cebadores usados para la amplificación de la quimera BCR/ABL y el dominio tirosina quinasa en pacientes con LMC 77 VII Cuadro resumen de los 200/297 pacientes LMC positivos para la translocación BCR/ABL y sus respectivas variantes obtenidas. 84 VIII Cálculo de la frecuencia de BCR/ABL en pacientes Venezolanos con LMC y su comparación con la frecuencia esperada de 95% de positivos para BCR/ABL, reportado en otros países. 99 IX Frecuencia de las diferentes variantes BCR/ABL encontradas en los pacientes LMC venezolanos y su comparación con un modelo de distribución uniforme. X Frecuencia de las variantes b2a2 y b3a2 encontradas en los pacientes LMC venezolanos y su comparación con un modelo de distribución uniforme. 101 XI Valores de p obtenidos de la comparación entre las frecuencias de las variantes (b2a2, b3a2, b2a2/b3a2) encontradas en Venezuela 103 xiii 100 y en otros países latinoamericanos. XII Resumen de los resultados obtenidos en la RT-PCR realizada a 40 pacientes de los 96 que dieron negativos para la quimera BCR/ABL 109 XIII Pacientes LMC positivos incluidos en el estudio de expresión génica mediante la técnica de PCR en Tiempo Real. 120 XIV Valores obtenidos a partir de la amplificación por PCR en Tiempo Real de los genes GAPDH y Lyn. 129 XV Resumen de los resultados obtenidos en el estudio de los factores que afectan la respuesta al tratamiento con Imatinib 139 XVI Compuestos inhibidores de proteínas tirosina quinasa y su espectro de acción 171 xiv LISTA DE ABREVIATURAS LMC = Leucemia mieloide crónica LMA = Leucemia mieloide Aguda LLA = Leucemia linfocítica aguda SP = Sangre periférica MO = Médula ósea c-abl = Designación para el gen abl bcr = Designación para el gen bcr ABL = Designación para la proteína ABL BCR = Designación para la proteína BCR BCR/ABL = Designación para la proteína quimérica Ph+ = Cromosoma filadelfia SH1 = Dominio 1 de homología con la familia Src SH2 = Dominio 2 de homología con la familia Src SH3 = Dominio 3 de homología con la familia Src ADN = Ácido desoxirribonucleico ARNm = Ácido ribonucleico mensajero ARNt = Ácido ribonucleico total DEPC = Dietilpirocarbonato b2a2 = Variante de BCR/ABL b3a2 = Variante de BCR/ABL e1a2 = Variante de BCR/ABL HLA = Sistema de leucocitos antígenos humano CDs = antígenos celulares IFNα = Interferon alfa STI751, Glivec = Fármaco usado contra la LMC FC = Fase crónica de la LMC xv FA = Fase acelerada de la LMC CB = Fase de crisis blástica de la LMC K562 = Línea celular creada a partir pacientes LMC que expresa BCR/ABL. RTQ-PCR = Racción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa Lyn= Designación para el gen Lyn. LYN = Designación que se le da a la proteína codificada a partir de gen Lyn. GAPDH = gliceraldehil pirubato deshidrogenasa Fish = Técnica de inmunofluorescencia con sondas marcadas para ver cromosomas en metafase. CMF = Técnica de Citometría de flujo FSC = distribución de la serie blanca en el gráfico de dispersión de acuerdo al tamaño celular SSC = Distribución de la serie blanca en el gráfico de dispersión de acuerdo a su complejidad o granulocidad. Ag = Anticuerpo Monoclonal. CD 10, 20, 33, 34, ….etc.= Nombre para designar a los diferentes antígenos celulares. xvi INTRODUCCIÓN Algunas alteraciones cromosómicas y genéticas en las células progenitoras hematopoyéticas inmaduras, sean mieloides (que dan origen a eritrocitos, monocitos, plaquetas, megacariocitos, promielocitos, etc) o linfoides (que dan origen a linfocitos B, T y células suicidas naturales), han sido involucradas en la producción de proteínas quiméricas funcionales que dan origen a las leucemias (Ver figura 1) (Faderl y Col. 1999; López. 2002; Melo y Col. 2003). De acuerdo al tipo de célula progenitora que se altera, las leucemias han sido clasificadas en dos grandes grupos: (1) las leucemias mieloblásticas, en las cuales la alteración que se produce involucra a las células progenitoras de origen mieloide, y (2) las leucemias linfoblásticas, en las cuales la alteración envuelve a células progenitoras de origen linfoide. Adicionalmente, las leucemias han sido clasificadas en crónicas y agudas de acuerdo a la madurez del tipo celular comprometido y a la agresividad clínica con la cual se desarrollan. (Bennett y Col. 1976; Bennett y Col. 1996; Goldsby y Col. 2000). Por otra parte, las leucemias crónicas, en las que se incluyen a la leucemia mieloide crónica (LMC) y a la leucemia linfocítica crónica (LLC), se caracterizan fundamentalmente por la presencia de células sanguíneas en diferentes períodos de maduración y por ser consideradas menos agresivas en su inicio, aún cuando el paciente tiene menos probabilidad de sobrevivir en etapas avanzadas. Por su parte, las leucemias agudas, en las que se incluyen la leucemia mieloide aguda (LMA) y la leucemia linfoblástica aguda (LLA), están caracterizadas por un alto número de células inmaduras y por presentar cuadros agresivos en los inicios de la enfermedad, sin embargo, a diferencia de las leucemias crónicas, el paciente puede sobrevivir posterior a un tratamiento adecuado (Bennett y Col. 1976; Bennett y Col. 1996; Goldsby y Col. 2000). Una de las leucemias que más ha sido estudiada en la actualidad es la leucemia mieloide crónica (LMC), la cual ha marcado pauta para el estudio y comprensión de los otros tipos de leucemias. Esta enfermedad involucra a todas las células de origen mieloide y 1 algunas de las células de origen linfoide. Adicionalmente, estudios vinculados con la LMC la reportan como la más frecuente en adultos (15 -20%), con una incidencia de 1 - 2 casos por cada 100.000 personas por año. Por otra parte, la edad promedio en la cual se manifiesta esta enfermedad ha sido estimada cercana a los 45 años, con un intervalo comprendido entre los 25 y 70 años (70 %). Aunque la LMC es considerada como una leucemia que se manifiesta fundamentalmente en adultos, también ha sido reportada en niños (10%) (Faderl y Col. 1999; http://seer.cancer.gov/statfacts/). Figura 1. Esquema representativo del proceso de Hematopoyesis. Los círculos y flechas rojos identifican las células progenitoras mieloides y linfoides que dan origen a las diferentes células sanguíneas. La figura interna muestra los distintos componentes de la médula ósea entre los que se encuentran las células troncales hematopoyéticas y del estroma, las células de soporte del estroma, adipocitos y osteoblastos. Tomado de http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/stem/specific/specific02.htm. Clínica de la Leucemia Mieloide Crónica (LMC). La LMC se define clínicamente como una expansión clonal de células progenitoras hematopoyéticas principalmente del linaje mieloide donde se incluyen: granulocitos del tipo 2 promielocito, mielocito y metamielocito presentes tanto en la médula ósea (MO) como en la sangre periférica (SP). La gran cantidad de granulocitos presentes durante la LMC se debe a las alteraciones que ocurren en el proceso de diferenciación de estas células, impidiendo su desarrollo hacia glóbulos blancos maduros y provocando su acumulación y aumento desmesurado con respecto a las células normales (Golde y Gulate, 1994; Bennett y Col. 1996; Amarante-Mendes y Col. 1998; Deininger y Col. 2000; Kosugi y Col. 2000). Desde el punto de vista de su evolución clínica, la LMC se puede clasificar en tres fases: .- Fase crónica inicial. Tiene un período variable de duración (aproximadamente de 3 a 5 años). En esta fase se pueden observar cantidades similares de células maduras e inmaduras, tanto en MO como en SP. Adicionalmente, es posible encontrar en los pacientes que padecen de LMC un elevado recuento de leucocitos, esplenomegalia (crecimiento del bazo), baja actividad de la fosfatasa alcalina de los neutrófilos, anemia y un hipermetabolismo con la consecuente pérdida de peso, fatiga, fiebre y niveles elevados de ácido úrico. .- Fase acelerada. Puede durar algunos meses y se caracteriza tanto por un aumento en el número de blastos en MO y SP (≥ 10%), como el de los basófilos y eosinófilos (≥ 20%). A su vez es posible encontrar leucocitosis (cuando el valor absoluto de leucocitos es mayor de 11.000), visceromegalia (crecimiento de las vísceras) progresiva, anemia progresiva, trombocitosis (presencia de un alto número de plaquetas en la sangre), mielofibrosis (acumulación de fibras y células sanguíneas anómalas dentro de la médula ósea), dolor en los huesos, fiebre y un aumento en la resistencia al tratamiento. .- Fase terminal o de crisis blástica. Está asociada a signos y síntomas de leucemia aguda o enfermedad extramedular, las cuales se caracterizan por un aumento excesivo de células blásticas mieloides o linfoide en MO y SP (≥ 20%) y pancitopenia (disminución de todas las poblaciones celulares de la sangre). En esta última etapa, el paciente tiene menos probabilidad de sobrevivir, pues se hace completamente resistente al tratamiento, y el período de vida pudiera verse limitado a unos pocos meses. Mas aún, existen algunos casos en los que se puede llegar a una fase refractaria final en la cual el paciente no responde a 3 ningún tipo de tratamiento (Kantarjian y Col. 1993; Golde y Gulate, 1994; Beedassy y Col. 2000; Di Bacco y Col.. 2000). Factores genéticos y no genéticos (ambientales) relacionados a la LMC. Factores genéticos: Hasta ahora no se ha encontrado ningún factor genético o predisposición que induzca LMC. Por ejemplo, estudios en pacientes gemelos afectados con LMC no reportan un mayor riesgo de desarrollar esta enfermedad por parte del hermano que no se ha visto afectado. Sigue siendo un misterio el por qué sólo uno de dos gemelos idénticos es capaz de desarrollar LMC, siendo su genética idéntica y el ambiente al que son expuestos prácticamente el mismo (John y Col. 1973). Actualmente, la única asociación descrita de un factor genético con la aparición de la LMC deriva de los trabajos realizados con el sistema de histocompatibilidad (HLA). Se ha demostrado que la respuesta inmune mediada por linfocitos T, vía expresión de diferentes alelos HLA, juega un rol muy importante en la inmunosobrevivencia contra la LMC. En tal sentido, Cortes y col. (1998) demostraron que ciertas moléculas de HLA clase I y II son capaces de asociarse con BCR/ABL e inducir una respuesta inmune tipo CD8+ linfocito T citotóxico contra esta proteína quimérica. Por su parte, Yasukawa y colaboradores (2000) realizando un estudio sobre los diferentes alelos reportados para HLA y las variantes b2a2 y b3a2 presentes en la LMC, encontraron que existía una asociación en la expresión de algunos tipos de alelos HLA y las variantes expresadas en pacientes LMC en comparación con personas normales. Estos resultados suponen una ventaja de no padecer la enfermedad en aquellas personas que expresan los alelos que son capaces de presentar a la quimera ante el sistema inmune para que sea degradada. En contraparte a los trabajos anteriores, Mundehada y colaboradores (2004) no consiguieron ninguna asociación específica entre las diferentes variantes de las quimeras presentes en la LMC y los alelos HLA reportados anteriormente. Aunque los hallazgos obtenidos en este tema no han producido resultados contundentes, han abierto una puerta en la búsqueda de diferentes tipos de moléculas que pudieran inducir una predisposición a la LMC. 4 Factores no genéticos (ambientales): Existen muchos factores no genéticos que han sido relacionados con el origen y evolución de la LMC. Por ejemplo, las exposiciones por largo tiempo a altas energías de radiación (tal como ocurrió en Japón durante la segunda guerra mundial), algunas drogas (quimioterapia), algunos inmunosupresores y las radiaciones usadas en el tratamiento de otros tipos de canceres u otras enfermedades, pueden incrementar el riesgo de aparición de LMC entre un 20 – 30%. Otros factores asociados a la aparición de la LMC que han sido estudiados incluye: los campos electromagnéticos de frecuencias extremadamente baja, pesticidas, bencenos, formaldehídos, infecciones virales (por ejemplo el virus HTLV-1, que causa la leucemia/linfoma de células T del adulto) y errores en la recombinación que ocurren a lo largo de la vida, entre otros (Sompayrac 1999). La propensión a la leucemia también puede verse incrementada luego de largos períodos de endogamia en una población. Adicionalmente, una hipótesis similar ha planteado que las personas que no han sido expuestas durante su juventud a los agentes infecciosos comunes, pueden tener mayor propensión a sufrir de leucemias. Los agentes infecciosos serían nuevos en su sistema causando una inmunorespuesta fuerte e inadecuada (Robien y Ulrich. 2003). Citogenética de la LMC: Aunque la LMC se conoce hace más de 150 años, la alteración cromosómica que la produce no fue descubierta sino hasta 1960 (Nowell y Hungerford). A partir de este momento fue conocida como la enfermedad del cromosoma Ph+ (o cromosoma Filadelfia en honor a la ciudad donde fue descubierta por primera vez), debido a que la principal característica que presentaban los pacientes que la padecían era la presencia de un cromosoma 22 de menor tamaño en su cariotipo, con respecto al cromosoma 22 de personas normales. Años más tarde, fue incluida dentro del subgrupo LMC debido a que el 95% de los pacientes que presentaban esta patología clínica también presentaban un cromosoma 22 con las mismas características que las reportadas por Nowell y Hungerford y a partir de este momento se convirtió en el distintivo de identificación de la LMC (Faderl y Kantarjian. 2000; Goldman y Melo. 2003). 5 A principios de los años 70 el estudio detallado del cromosoma Ph+ permitió descubrir que su origen es producto de la translocación de la porción distal del cromosoma 22 dentro de otro cromosoma, usualmente el cromosoma 9 (Rowley, 1973). Citado por Goldman y Melo. 2003). En 1982 De Klein y colaboradores, demostraron que el oncogen abl estaba involucrado en la translocación generada desde el cromosoma 9 al cromosoma 22, indicando que la translocación era recíproca y no aleatoria entre los brazos largos de ambos cromosomas. Esto sugirió, por primera vez, un rol determinante del gen abl en la aparición y evolución de la LMC. Para el año de 1984 Prakash y Yunis, mapearon la secuencia de los puntos de corte en los cromosomas 22 y 9 en las sub-bandas 22q11.21 y 9q34.1, respectivamente. A partir de ese momento la translocación fue también denotada como t(9;22)(q34;11). Más aún, estos investigadores también reportaron que aunque la posición del corte en el cromosoma 9 era poco variable, en el cromosoma 22 si existía un alto grado de variabilidad en el punto de corte, el cual estaba agrupado en un área que fue llamada bcr ("binding cluster region"). En 1985 Shtivelman y colaboradores se refirieron a esta región como un gen al que se le denominó bcr, además reportaron que en la translocación el oncogen abl era transferido al cromosoma 22 (Ver figura 2). Figura 2. Esquema representativo de la translocación recíproca y no aleatoria entre los cromosomas 9 y 22 que originan el cromosoma Filadelfia que participa en la aparición y evolución de la LMC. Las bandas de color rojo y amarillo representan la región de ambos cromosomas involucrados en el punto de fusión. Tomado de http://www.popularmechanics.com/science/health_medicine/1281066.html. 6 Caracterización de los genes translocados en la LMC: Posterior al descubrimiento de la translocación t(9;22)(q34;11) y a la identificación de los genes involucrados en ella, la atención se centró principalmente en la caracterización detallada de los genes abl y bcr, la proteína híbrida (bcr/abl) que se produce en la translocación y las funciones celulares en las que se ven envueltos (Melo 1996; Kantarjian y Col. 2000). El gen abl humano es el homólogo del oncogen v-abl del virus de la leucemia murina de Abelson. El ARNm que se transcribe a partir de este gen comprende 11 exones (denominados a1- a11), los cuales codifican para una proteína de 145-KDa conformada por 1.097 aminoácidos. Entre las propiedades que caracterizan a la proteína ABL se incluye una actividad enzimática del tipo tirosina quinasa no receptora, que se expresa en todos los tejidos y que está presente en las dos isoformas originadas por un corte y empalme alternativo (“splicing”) del primer exón del ARNm del gen. Adicionalmente, la proteína ABL contiene diversos dominios estructurales: a) tres dominios de homología Src: SH1, SH2 y tirosina quinasa SH3, los cuales están ubicados en el extremo N-terminal, b) un dominio central rico en prolina que permite la interacción con dominios SH3 de otras proteínas y por último c) un dominio ubicado en el extremo C-terminal que contiene señales de localización nuclear, unión al ADN, exportación hacia el citoplasma y de unión a F-actina y G-actina, (ver figura 3). Basado en su estructura proteica, la proteína ABL puede ser ubicada tanto en el citoplasma como en el núcleo y ha sido implicada en la regulación de procesos celulares tan importantes como: la diferenciación celular, el ciclo celular, la adhesión celular y respuesta a estrés. En condiciones normales, la actividad enzimática de la proteína ABL es fuertemente regulada por la unión intramolecular de la porción inicial de la región Nterminal (comprendida por el exon 1 [1b o 1a] y la primera parte del exon 2 [a2]) al dominio SH1, (Kipreos y Wang, 1990; Sawyers y Col. 1994; Lewis y Col.. 1998; Faderl, y Col. 1999; Van Etten, 1999; Yuan y Col. 1999; Pluk y Col. 2002 ; Goldman, y Melo. 2003. 7 Figura 3. Esquema representativo de los diferentes dominios estructurales presentes en las proteínas (A) BCR, (B) ABL y (C) el híbrido BCR/ABL. Las nomenclaturas p160, p145 y p210 representan otra forma en la que son llamadas estas proteínas. N y C indican los extremos N-terminal y C-terminal de cada proteína respectivamente. Los bloques de distintos colores representan los diferentes dominios estructurales para cada proteína. En el dominio serina/treonina de BCR se señala la ubicación del residuo de tirosina 177. El esquema del híbrido BCR/ABL muestra las regiones de la proteína que corresponden a BCR y ABL, así como el punto de fusión más común. Tomado de Expert Reviews in Molecular Medicine © 2003 Cambridge University Press. Por su parte, el gen bcr transcribe un ARNm que abarca 25 exones (también denominados e1 – e25) los cuales codifican para una proteína de 160-KDa conformada por 1.271 aminoácidos. El producto proteico de este gen es expresado en todos los tejidos y, al igual que ABL, presenta diferentes dominios estructurales: a) en el extremo N-terminal se encuentra un dominio hélice vuelta hélice involucrado en la formación de homodímeros u homotetrámeros (oligomerización), además de un dominio de unión a SH2, b) en la porción central se encuentra un dominio con actividad enzimática serina-treonina quinasa (cuyos únicos sustratos identificados han sido BAP-1 y el mismo BCR) y adicionalmente un dominio con homología a los factores de intercambio de GTP por GDP, Rho, Rho GEF y por último c) en el extremo C-terminal un dominio que facilita la unión de lípidos dependientes de Calcio (CalB) y un dominio con homología a la proteína activadora de la GTPasa Rac (Rac-GAP), la cual es una pequeña GTPasa de la super familia Ras que regula la 8 polimerización de actina y la actividad de una NADPH oxidasa en células fagocíticas (ver figura 3) (Deininger y Col. 2000). La localización celular de BCR ha sido precisada específicamente en el citoplasma y dentro de sus funciones mas importantes destaca su participación en las vías de transducción de señalización celular, lo cual quedó evidenciado cuando se demostró que BCR fosforilada en su residuo de tirosina 177 es capaz de unirse a la proteína adaptadora Grb2 (proteína que participa en la activación de la vía de señalización de Ras). Otras investigaciones han demostrado que la proteína BCR también posee la capacidad de asociarse con el ADN y con la proteína XPB, a través de su estructura aminoacídica, lo cual le permite jugar un rol crucial durante el proceso de reparación del ADN, iniciación general de la transcripción y regulación del ciclo celular (Laurent y Col. 2001; Duncan y Col. 2003). Además de las características estructurales específicas de la proteína BCR cabe destacar que tanto el gen como la proteína deben su nombre a la presencia de regiones conocidas como "binding cluster region" (bcr), las cuales han sido reportadas como regiones sensibles a ruptura. Hasta ahora, se conocen tres regiones dentro del gen bcr que presentan estas características, las cuales han sido ubicadas de mayor a menor dependiendo de la frecuencia con que ocurre el corte. Estas son: la región bcr mayor (M-bcr), la región bcr menor (m-bcr) y la región bcr micro (µ-bcr) (ver figura 4) (Wetzler y Col. 1995; Maru y Col. 1999; Takeda y Col. 1999; Laurent y Col. 2001). De la fusión de los genes abl y bcr en t(9;22)(q34;q11), y su posterior transcripción y traducción, se originan dos proteínas híbridas denominadas BCR/ABL y ABL/BCR. La proteína quimérica BCR/ABL es funcionalmente activa y ha sido demostrado que ejerce un efecto importante en la transformación de las células presentes en los pacientes con LMC. Sin embargo, aún cuando el híbrido ABL/BCR es transcripcionalmente activo, hasta los momentos, no se ha determinado su participación en algún rol funcional que lo vincule al origen y evolución de la enfermedad, a pesar de todos los estudios que se han realizado en la región codificante de esta proteína (Mes-Masson y Col. 1986). 9 Figura 4. Esquema representativo de la estructura de los genes abl y bcr en sus respectivos cromosomas y algunas de las isoformas quiméricas que se pueden formar a partir de la fusión de ambos. Las flechas rojas indican los diferentes puntos de ruptura para ambos genes. Tomado de The New England Journal of Medicine, 2003. El gen híbrido bcr/abl involucra generalmente al exon 2 (a2) del gen abl y los exones, 1 (e1), 12 (b2) 13 (b3) y 19 (e19) del gen bcr. La variabilidad en el punto de corte del gen bcr ha permitido detectar varias isoformas BCR/ABL o variantes en los pacientes con LMC. Una de estas isoformas es producida como consecuencia de la ruptura en la región menor de corte del gen bcr (m-bcr), la cual involucra el exón 1 e induce la expresión de un ARNm de 7.5 kb que codifica para una proteína de 190 KD. Esta primera variante proteica, denominada p190BCR/ABL o e1a2, está presente en el 70% de los casos de LLA de adulto y en un 20% de los casos LMC (Hermans y Col. 1987). La segunda isoforma es producida como resultado de una ruptura en la región mayor de corte de bcr (M-bcr) que involucra los exones 12 y 13, conduciendo a la producción de un ARNm de 8.5Kb que codifica para una proteína de 210 KD. Esta isoforma denominada p210BCR/ABL, es la más común en los casos de LMC (95%), la cual a su vez se subdivide en dos variantes: b2a2 y b3a2, denominadas así por Melo y Col. (1995). La tercera y última isoforma del híbrido BCR/ABL es la menos común y se produce como resultado de una ruptura en la región micro de corte de bcr (µ-bcr) que involucra al exon 19, codificando una proteína de 230 KD. Esta isoforma denominada p230BCR/ABL o e19a2, fue primero identificada en pacientes con un tipo de leucemia conocida 10 como leucemia neutrofílica crónica (LNC) y que ha sido reportada en pocos casos de LMC (ver figura 4) (Melo y Col.1993; Melo, 1996; Wilson y Col. 1997; Briz y Col. 1997; Kantarjian, y Col. 2000; Quackenbush y Col. l. 2000; Duncan, y Col. 2003). Cabe destacar que además de las isoformas más comunes descritas anteriormente, también han sido identificadas otras variantes de BCR/ABL reportadas con una frecuencia de aparición mucho menor. Estas variantes han sido denominadas: e1/a3, b2a3, b3a3, e2/a1a, e6/a2, e8/a2 y e13/a2. (Melo y Col. 1994; Melo, 1996; Melo, y Col. 1996; Pane y Col. 1996; Ravandi y Col. 1999; Laurent y Col. 2001). Vías de señalización celular que se ven afectadas en pacientes con LMC. La quimera BCR/ABL conserva la actividad enzimática tipo tirosina-quinasa de la proteína ABL pero de una manera desregulada (la proteína está activada constitutivamente). Dada su funcionalidad, el híbrido BCR/ABL ha sido vinculado de manera crucial en las vías de señalización que participan en el crecimiento, diferenciación y apoptosis celular. Por lo tanto, basado en la importancia vital que tiene la actividad tirosina-quinasa de la proteína ABL (mantenida en la quimera) y sumado a la nueva capacidad de interactuar con múltiples dominios de otras proteínas, gracias a las nuevas conformaciones adquiridas por su unión con BCR, se ha hecho necesario tratar de entender los mecanismos mediante los cuales esta células transformadas conducen a una condición de malignidad. (Melo 1996; Deininger y Col.2000; Kantarjian y Col. 2000). Uno de los eventos que desencadena el efecto transformante de la fusión BCR/ABL incluye la inducción de la proliferación de estas células de una manera independiente de los factores de crecimiento hematopoyéticos (eritropoyetina, trombopoyetina, interleuquina 3 o 6, factores estimulantes de colonias granulocito-macrófago y factor de células troncales), quienes cumplen este rol en condiciones normales. Este hecho, desencadena una serie de cambios intracelulares que traen como consecuencia la expansión del clon maligno con respecto a las células que no producen la proteína quimérica (Cline 1994; Faderl y Col. 1999). 11 Basados en diversas investigaciones referidas a las diferentes vías de señalización celular que pueden ser afectadas por la proteína híbrida BCR/ABL (Verfallie y Col. 1997; Deininger y Col. 2000; Melo y Col. 2003), las cuales participan no sólo al inicio sino durante la progresión de la LMC, han sido propuestos 4 mecanismos principales para incidir en la transformación maligna de las células de pacientes con LMC: 1) Adhesión celular alterada, de los clones transformados con las células del estroma de la médula ósea (MO) y de la matriz extracelular. 2) Activación constitutiva de la señalización mitogénica. 3) Reducción de la apoptosis celular. 4) Degradación de proteínas inhibitorias de ABL mediada por proteosomas. 1. Adhesión celular alterada: En el microambiente del estroma de la médula ósea ocurren procesos de adhesión y mantenimiento de las células progenitoras de la sangre. Estos procesos son regulados por receptores y agonistas de supervivencia y proliferación a través de una estimulación directa sobre estas células, lo cual facilita la adquisición de una buena fijación, comunicación y control de la diferenciación (Di Bacco y Col. 2000). En efecto, el proceso de adhesión celular es llevado a cabo por un grupo de proteínas receptoras de la superficie celular conocidas como integrinas. Estas proteínas son glicoproteínas compuestas de dos sub-unidades α y β (α4β1 y α5β1), donde la cadena α determina la especificidad por el ligando y la cadena β participa en la activación de la vía de transducción de señal, posterior a la unión del ligando. Esta vía de señalización se inicia cuando las integrinas son activadas por su ligando e inducen el reclutamiento tanto de proteínas del citoesqueleto (tales como tensina, paxillina, talina y vinculina) como de proteínas con actividad tirosina-quinasa (Fax y c-ABL) y proteínas adaptadoras (GRB2 y CRKL), las cuales forman el complejo de adhesión focal (Clark y Brugge, 1995; Schwartz y Col. 1995; Lewis, y Col. 1996). Varios estudios han demostrado que las células progenitoras presentes en los pacientes con LMC, exhiben una disminución en su capacidad para adherirse a las células del estroma 12 de la MO y a la matriz extracelular. En tal sentido, Zhao y Col. (1997) demostraron que las células en pacientes con LMC expresaban una isoforma de las integrinas (β1B) que las hacía incapaz de mantener la adhesión celular y que esa isoforma no ha sido detectada en las células de personas normales. Por otro lado, Salgia y Col. (1995) y Gotoh y Col (1997) observaron que en las células transfectadas con BCR/ABL las proteínas tensinas, paxillinas, talinas, vinculinas y FAK se encontraban constitutivamente fosforiladas. Todos estos hallazgos permitieron llegar a la conclusión de que algunos cambios en la estructura de las integrinas y de otras proteínas pertenecientes a su cascada de señalización, alteraban su función y originaban como consecuencia modificaciones en el proceso de transducción de señal desde afuera hacia adentro de las células, lo que se traduce en una desregulación del proceso que controla la fijación y proliferación de estas células, permitiendo entonces la liberación e infiltración de células progenitoras al torrente sanguíneo y linfático (Ver figura 5) (Gordon y Col. 1987; Verfaillie y Col. 1997; Deininger y Col. 2000). 2. Activación constitutiva de la señalización mitogénica: Aunque las funciones de la proteína c-ABL no han sido completamente entendidas, es bien conocido el rol que ella juega en la regulación del ciclo celular. En efecto, en condiciones normales la proteína c-ABL se encuentra presente en el núcleo, gracias al dominio de localización nuclear presente en su estructura proteica. Una vez en el núcleo, esta proteína es capaz de regular la proliferación celular gracias a su dominio SH2 y a su actividad tirosinaquinasa, que le permiten asociarse con una gran cantidad de las proteínas que conforman la maquinaria del ciclo celular induciendo un bloqueo en su progresión (Ray y Col. 1994; Sirard y Col. 1994). 13 Figura 5. Esquema representativo del complejo de adhesión focal. Las integrinas están ubicadas en la membrana celular mientras que el grupo de proteínas citoplasmáticas que se aglomeran a su alrededor conforman el complejo de adhesión focal. La asociación de las integrinas con las proteínas de la matriz extracelular permite su fijación al sitio de interés. Tomado de The New England Journal of Medicine, 2003. Cortez y Col. (1997) demostraron que células 32D (células precursoras mieloides), que expresan la proteína quimérica BCR/ABL mantienen una activación constitutiva del ciclo 14 celular inducido por los factores de crecimiento. La habilidad que adquieren estas células transformadas para continuar con el crecimiento celular, sugiere que BCR/ABL mantiene activados todos los componentes de la maquinaria del ciclo celular que participan en la transición de la fase G1 a S. Adicionalmente, ha sido demostrado que la actividad de las quinasas dependientes de ciclina incluyendo Cdk2, Cdk3, Cdk4 y Cdk6 es elevada en las células que expresan BCR/ABL, incluso se ha encontrado que la presencia de BCR/ABL inhibe el efecto de agentes genotóxicos que pueden bloquear o producir aberraciones en el ciclo celular. Por otra parte, la proteína BCR/ABL es también capaz de interactuar en el citoplasma, vía proteínas adaptadoras (GRB2, CBL, SHC Y CRKL), con la vía de señalización que envuelve a la proteína Ras. Aunque los eventos de señalización “aguas abajo” de Ras no han sido completamente caracterizados, es bien conocido su rol crucial en la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), principalmente la vía de JAK quinasa. Otras de las vías implicadas en los procesos proliferativos inducidos por BCR/ABL son: la de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y aquellas donde participan los factores de transcripción de activadores y transductores de señal (STAT) y MYC. (Ver figura 6) (Sawyers y Col. 1992; Puil y Col. 1994; Pelicci y Col. 1995; Cahill y Col. 1996; Zou y Col. 1997; Deininger y Col. 2000; Melo y Col. 2003; Goldman y Melo. 2003; Andreu y Col. 2005). 15 Figura 6. Esquema de las diferentes vías de señalización celular que pueden ser afectadas por la expresión del híbrido BCR/ABL. En la parte superior se muestra la proteína BCR/ABL con los diferentes dominios estructurales que permiten su unión a una gran cantidad de transductores de señales tales como GRB2, CBL, SHC y CRKL. Las vías señaladas con flechas corresponden a las MAPs quinasas, JAK-STAT, PI3-quinasa y FAK. Tomado de New England Journal of Medicine, 2003. 3. Reducción de la apoptosis celular: La hematopoyesis normalmente involucra mecanismos de proliferación, diferenciación y apoptosis, siendo estos procesos a su vez regulados por la concentración y composición de citoquinas. La apoptosis en particular, ha sido descrita como un programa de suicidio celular genéticamente controlado, el cual puede ser activado tanto por la desregulación de un oncogen detectado por la célula, como a través de los estímulos de estrés o de agentes externos que pudieran estar presentes en el ambiente celular, dañando la estructura del ADN. Las vías de señalización involucradas en el desencadenamiento de la apoptosis incluyen a las tirosinas quinasas, las cuales pueden ser activadas de una manera independiente de sus receptores celulares e inducir, vía Raf-1, la activación de Akt quien, a su vez, es capaz de activar proteínas que participan directamente en la vía apoptótica, tales como Bad, Bcl-xl y Bcl-2 (Nieborowska-Skorska y Col. 1999; Deininger y Col. 2000). La inhibición de la apoptosis en pacientes con LMC ha sido ampliamente reportada, más aún, algunos estudios han divulgado que la proteína BCR/ABL no solo es capaz de unirse a muchas moléculas transductoras de señal, sino que además puede interactuar con otras proteínas ubicadas en los diferentes escalones de las cascadas de señalización de las vías antes señaladas, ejerciendo de esta manera su efecto transformante. En tal sentido, Ahmed y Col. (1998) reportaron la participación directa de BCR/ABL en la vía de señalización de STAT, la cual está involucrada en mecanismos de funcionalidad antiapoptóticos. En efecto, la quimera BCR/ABL es capaz de activar a STAT, favoreciendo su entrada al núcleo y de esta manera activando la transcripción de genes involucrados en la supresión de la apoptosis tales como cmyc, ciclina D1 y p21(waf). Otros mecanismos implicados en la inhibición de esta vía, han sido vinculados a través de: a) la proteína quinasa (PKC), b) la vía de la interleuquina 3 (asociación física con su receptor) con activación de Jak2, c) desregulación de la expresión de bcl-2 y aumento en la expresión de bcl-xl y d) el bloqueo directo de la liberación de citocromo c desde la membrana interna de la mitocondria, siendo este último mecanismo el que impide la 16 activación de las diferentes caspasas y en consecuencia el reconocimiento y excisión (“cleavage”) de las proteínas que desencadenan la cascada de degradación nuclear y celular (Ver figura 7) (Bedi y Col. 1994; Puil y Col. 1994; Chapman y Col 1995; Wilson-Rawls y Col 1996; Amarante-Mendes y Col 1998; Dubrez y Col 1998; Carlett-Falcone y Col 1999; Jamieson y Col 1999; Di Bacco y Col 2000). Figura 7. Esquema de algunas vías de señalización celular que pueden ser afectadas por la expresión del híbrido BCR/ABL. Las vías involucradas en la apoptosis son resaltadas con flechas rojas. En la parte superior se muestra la proteína BCR/ABL unida a los diferentes transductores de señales celulares. Las dos vías principales de la apoptosis involucran a PI3-quinasa y a Ras, quienes coinciden en la cascada de AKT hasta llegar a las proteínas de la mitocondria BCLXL y BCL2. Tomado de New England Journal of Medicine, 2.003. 4. Degradación de las proteínas inhibitorias de ABL mediada por proteosomas: El cuarto y último mecanismo postulado en la transformación de las células de pacientes con LMC es la degradación de proteínas que inhiben a ABL, vía proteosomaubiquitina. El sistema proteosoma-ubiquitina es el mayor sistema no lisosomal que permite una rápida degradación y procesamiento de proteínas. Los principales sustratos de esta vía son las proteínas regulatorias y los factores de transcripción. Diversos investigadores han demostrado que el complejo proteosoma-ubiquitina es abundantemente expresado en las células leucémicas y que además dicha expresión aumenta mucho más en el proceso de transformación maligna de las células mononucleares. Dai y Col. (1998) demostraron que la quimera BCR/ABL es capaz de inducir la degradación de las proteínas inhibitorias de ABL, 17 Abi-1 y Abi-2 en células Ph+, vía proteosomas. Este hecho, fue el primer indicio de que muchas otras vías de señalización, además de las ya descritas, pueden ser afectadas por BCRABL en su efecto transformante (Shinohara y Col. 1996; Hershko, 1997; Zhang, y Col. 1999). Tratamiento de la LMC. El compendio de los descubrimientos hechos en la última década sobre la LMC, tanto a nivel clínico como a nivel molecular, ha permitido evolucionar en modo progresivo y eficiente en el tratamiento de las personas afectadas con esta patología (Wu 2003). A principio de los años 50, los pacientes con LMC eran tratados solo con radioterapia y compuestos químicos como, la ciclofosfamida, metrotexato, clorambucil y tiotepa entre otros. Para 1957 se incluye el uso de busulfán en el tratamiento con quimioterapia, el cual fue reforzado luego con la inclusión de la hidroxiurea (1964). Un año después se logró iniciar el transplante de médula ósea alogénico, lo que amplió el espectro de tratamientos a usar, aumentando el porcentaje de supervivencia de los pacientes que padecían de la enfermedad. No obstante, fue en 1990 cuando Donnall Thomas (premio Nobel) logra el perfeccionamiento del transplante de médula ósea antólogo, el cual aumentó aún más las posibilidades de supervivencia. Más recientemente, también se logró la inclusión del interferón α (IFNα) en el tratamiento con quimioterapia (ver figura 8). Actualmente, todas estas modalidades terapéuticas se siguen empleando en el tratamiento de la LMC, ya sean solas o en combinación, dependiendo de cada caso. Sin embargo, estos tipos de tratamientos son muy tóxicos, comprometen las células sanas del paciente y aunque pueden erradicar completamente la enfermedad no eliminan completamente la posibilidad de que el paciente vuelva a recaer. En este sentido, es importante destacar que el uso del interferón α (IFNα) marcó pauta en el tratamiento de la LMC debido su mediano nivel de toxicidad con respecto a los métodos terapéuticos mencionados en párrafos anteriores. Adicionalmente, su uso trajo nuevas esperanzas de cura y supervivencia para los pacientes afectados, ya que en muchos casos se logró obtener no sólo una remisión clínico- 18 hematológica, sino que también algunos enfermos lograron alcanzar una conversión citogenética (Ph-) de intensidad y duración variable (Rozman y Carreras 1995). A B C Figura 8. Representación de las tres primeras modalidades terapéuticas usadas para el tratamiento de la LMC. A) Radioterapia para la eliminación de tumores. B) Quimioterapia con interferón α. C) Transplante de Médula ósea (MO) alogénico, el número 1, en esta última gráfica, indica la recolección de la MO a partir de los huesos de la cadera, el número 2 indica los componentes de la MO que son importantes para el transplante y el número 3 indica el proceso de repoblación del receptor con la MO del donante. Tomado de: http://www.cancerinfo.es/index.php?textoid=21&orden=12, http://www.brachiterapia.it/ita/ ht ml/carci.htm, http://www.besthealth.com/besthealth/surgery/spanish/pages/100112.html, http://www.Germe sonline.com/catalog/41/594/115019/sell_arbutin.html, http://www.innovacionesleucemia.com/article 2.asp. El IFNα es una glicoproteína producida por el organismo en respuesta a enfermedades malignas. Este, junto con los INFβ, θ y τ conforman el grupo de los interferones tipo I, cuya nomenclatura ha sido designada de acuerdo a la secuencia de los genes que los codifican. En humanos hay al menos 18 genes no alélicos de IFNα, cuatro de los cuales son pseudogenes y 19 al menos 6 son genes no alélicos del IFNw. Con respecto a sus receptores, se sabe que en la mayoría de las células los receptores de IFN existen en una densidad de 103 a 104 / célula. En relación al mecanismo de acción del IFNα, se ha demostrado que tras la unión con su receptor, el complejo IFN-receptor se interna en el citoplasma celular y una vez allí, da lugar a la activación de enzimas ligadas al receptor (tirosinas quinasas - tyk 2, JAK1 y JAK2), las cuales son capaces de fosforilar a las proteínas STAT 1a, STAT 1b y STAT 2, las cuales se unen luego para formar el complejo ISGF3-a (ge factor-3 estimulado por IFN). Este complejo se une entonces con la proteína citoplasmática p48 formando un complejo de cuatro moléculas llamado ISGF3-g que se une en el núcleo a distintas regiones ISRE (IFN stimulated response element), dando lugar a la transcripción de ISGs (IFN stimulated genes). Por último, como resultado del proceso de traducción, se sintetizan numerosas proteínas con función protectora, habiéndose descubierto hasta el momento más de 30, muchas de las cuales tienen un papel esencial en la inhibición de la replicación. Una de estas enzimas es la proteína quinasa elF-2α, cuya forma activa fosforila forma parte del complejo iniciador de la traducción protéica. Tal fosforilación bloquea entonces la construcción ulterior de la sub-unidad, deteniendo así la síntesis proteica (la enzima es capaz de bloquear la síntesis proteica en células afectadas y no en células sanas) (Fish y Col. 1999; Faderl y Kantarjian 2000; Faderl, 2004). Desafortunadamente, con el paso del tiempo, el uso de IFNα en pacientes con LMC trajo como consecuencia la aparición de pacientes resistentes a este tratamiento, mejor conocidos como pacientes refractarios. Este hecho, estimuló la búsqueda de nuevos tratamientos para los pacientes LMC, los cuales estuvieron enfocados principalmente (gracias a los avances en los estudios moleculares de la quimera) a atacar la estructura y función de la actividad tirosina-quinasa presente en BCR/ABL, la cual es causante de la enfermedad. Tratamiento de la LMC con Imatinib. Entre los años de 1995 y 1996, Druker y Col. reportaron la identificación del fármaco STI571 derivado del 2-fenilamino pirimidina (formalmente conocido como CGP57148B, ahora mencionado también como Imatinib mesylate; Gleevec® o Glivec® de Novartis), el cual fue usado, en su primera fase de ensayo, en aquellos pacientes LMC resistentes al tratamiento 20 con INFα. Cincuenta y tres de 54 pacientes mostraron una respuesta hematológica completa con 300mg de la droga, mientras que el 31% de estos pacientes mostró una respuesta citogenética, con un 13% de respuesta completa. En vista de la fantástica respuesta al fármaco se decidió luego ampliar el tratamiento a pacientes con LMC en crisis blástica mieloide o linfoide y en pacientes con LLA Ph+, observándose un 11% de respuesta hematológica completa en pacientes con crisis blástica mieloide y un 15% en los casos con enfermedad linfoide (Schindler y Col. 2000; Wu 2003; Deininger y Col. 2005). Imatinib es un compuesto químico que debido a su estructura es capaz de unirse específicamente al sitio de unión del ATP en la quimera BCR/ABL. Adicionalmente, este compuesto puede inhibir reversiblemente a c-ABL, PDGF-Rα- y β, proteína c-Kit y a la proteína de fusión TEL-PDGF-R. La estructura cristalina del complejo Imatinib-quimera reveló que Imatinib se inserta fuertemente en el dominio catalítico de la quimera BCR/ABL y su grupo piridinil entra por debajo de la α-hélice en el lóbulo N-terminal de la quinasa. De esta manera, el compuesto es enroscado al grupo amino secundario y queda fuertemente unido a la región de activación del loop. Esta región, controla la actividad catalítica de muchas quinasas por ser el interruptor entre los estados de activación e inactivación dependientes de fosforilación. En quinasas altamente activas el loop es estabilizado en una conformación abierta por fosforilación en sus residuos de serina, treonina y tirosina y en esta conformación, la cadena β formada, proporciona la plataforma para la unión del sustrato (ver figura 9) (Schindler y Col. 2000; Topaly y Col. 2001). La selección de este inhibidor, entre muchos otros, para el tratamiento de la LMC estuvo basada en dos hechos fundamentales: a) usado a concentraciones micromolares fue capaz de provocar la remisión hematológica y citogenética completa de una gran cantidad de pacientes, principalmente aquellos que se encontraban en la fase crónica (FC) de la enfermedad y b) presentó un efecto tóxico muy bajo en el organismo en comparación con el INFα, la radioterapia y la quimioterapia (Druker y Col. 2001; Sawyers y Col. 2002). 21 En la actualidad, aunque el Imatinib sigue siendo el medicamento más usado en el tratamiento de la LMC, estudios recientes han reportado que pacientes con LMC en fase acelerada, en crisis blástica o pacientes con LMA Ph+, pueden desarrollar resistencia contra este fármaco. Este hecho ha traído como consecuencia la recaída de estos pacientes e incluso su muerte (Gorre y Col. 2001; Shah y Col. 2002; Dai y Col. 2004; Yoshida y Melo 2004; Gu y Col. 2005; Wolf y Col 2005). Figura 9. Presentación farmacéutica del inhibidor Imatinib, modo de acción y su estructura química. A) Presentación en capsulas de 400 mg del fármaco. B) a. Inhibición competitiva con el ATP por el dominio 22 tirosina quinasa de BCR/ABL. b. Estructura química del 2-fenilamino pirimidina. Tomado de http://www.chem.uoa.gr/chemicals/chem_imatinib.htm; www.leucemie-espoir.org/spip/article2.html. Resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes con LMC. Dada la gran trascendencia que ha tenido el medicamento Imatinib en la recuperación completa, sobrevivencia y calidad de vida de los pacientes con LMC, muchos investigadores se han centrado en la búsqueda de la (s) causa (s) que origina (n) la resistencia a este tratamiento. Partiendo del hecho de que la alteración inicial de la supervivencia y la regulación del ciclo celular inducida por BCR/ABL puede promover aberraciones cromosomales y mutaciones adicionales, que amplifiquen la transformación mediada por BCR/ABL, los investigadores han propuesto varios mecanismos que pudieran estar influyendo en la resistencia a Imatinib. Estos son: 1) Sobre-expresión exacerbada de la quimera BCR/ABL. 2) Cambios en la expresión de genes involucrados en las diferentes vías de señalización celular. 3). Presencia de mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera BCR/ABL. 1. Sobre-expresión de la quimera BCR/ABL. En el caso de la sobre-expresión de la quimera BCR/ABL, estudios in vitro con líneas celulares resistentes al tratamiento con Imatinib mostraron amplificación en la expresión de la quimera BCR/ABL en asociación con la sobre-expresión de la proteína (Mahon y Col 2000). Por su parte, Gorre y Col. (2001) a través de estudios bioquímicos y análisis moleculares, encontraron que en todos los pacientes analizados la resistencia a la droga estuvo asociada a la reactivación de la transducción de señal de BCR/ABL y que en 6 de 11 pacientes la resistencia estuvo asociada con la amplificación progresiva de la quimera BCR/ABL. Por otro lado, Olavarria y Col. (2001), realizando en pacientes con enfermedad mínima residual cuantificaciones de la quimera BCR/ABL por RT-PCR en Tiempo Real, también reportaron que pacientes que sufrieron recaída presentaron altos niveles de la quimera. Así mismo, Weisberg y Griffin (2000), usando las líneas celulares Ba/F3 y K562 y Keeshan y Col. (2001), 23 usando la línea celular 32D, evidenciaron que células con altos niveles de expresión de la quimera fueron más resistentes al tratamiento en comparación con las que presentaron bajos niveles de expresión. Los investigadores llegaron a la conclusión de que la sobre-expresión de BCR/ABL en pacientes con LMC es el paso inicial en el reestablecimiento de la transducción de señal que conduce a la resistencia del tratamiento con Imatinib (Le Coutre y Col. 2000; Goldman y Melo 2001; Hochhaus y Col. 2001; Barnes y Col. 2005). 2. Modificación en la expresión de genes por BCR/ABL. Con respecto a los cambios en la expresión de genes involucrados en las diferentes vías de transducción de señal de la quimera BCB/ABL asociados a la resistencia del tratamiento con Imatinib, ha sido sugerido que en etapas posteriores de la evolución de la LMC puede ocurrir la sobre-expresión o sobre activación de quinasas que trabajan “aguas abajo” en las cascadas de señalización activadas por BCR/ABL. En este sentido, los trabajos de Hofmann y Col. (2002), usando análisis de expresión de genes por microarreglos, reportaron que el mecanismo de resistencia al tratamiento con Imatinib es debido a la expresión de genes que participan en las cascadas de señalización tomadas por la quimera para inducir su efecto transformante. Ellos también analizaron pacientes con LMC y LLA con diferentes rangos de respuesta al Imatinib y encontraron variaciones en la expresión de una gran cantidad de genes para cada tipo de muestra (ver figura 10). 24 Figura 10. Identificación de genes que pueden ser usados para distinguir pacientes con LLA sensibles y resistentes al tratamiento con Imatinib. Las muestras son listadas horizontalmente y los 95 genes son listados verticalmente. S1-10 pacientes sensibles a Imatinib antes del tratamiento. R1-7 pacientes con resistencia primaria antes del tratamiento. T1-8 casos resistentes en presencia de Imatinib. La intensidad de colores indica los niveles de confianza de la expresión de los datos. Tomado de Hofmann y Col. 2002. Por su parte, Salesse y Verfaillie (2003) usando técnicas de hibridización sustractiva, “differential display”, y RTQ-PCR, demostraron que uno de los efectos transformantes de BCR/ABL es inducir la disminución o aumento de la expresión de diversas moléculas que participan en el control de la proliferación, diferenciación, bloqueo de la apoptosis y control de la adhesión celular. Estas y otras investigaciones generaron un gran impacto en el estudio de la resistencia al tratamiento que conllevó a la identificación de un inmenso número de genes 25 cuya expresión era alterada por la quimera BCR/ABL, utilizando principalmente técnicas como los microarreglos y PCR en Tiempo Real y en el uso tanto de líneas celulares establecidas (que expresan BCR/ABL) o células de pacientes con LMC. Es de interés mencionar que en todos los casos analizados, la resistencia al tratamiento con Imatinib estuvo relacionada principalmente con una recaída o con la evolución de la LMC a una fase acelerada o de crisis blástica (Kaneta y Col. 2003; Dvorak y Col. 2003; Ohmine y Col. 2003; Hakansson y Col. 2004; Radich y Col. 2006). Todos estos hallazgos evidencian los diferentes mecanismos propuestos para ser usados por la quimera BCR/ABL para inducir la resistencia al fármaco Imatinib, los cuales han sido observados de forma única (Dai y Col. (2004) o en combinación (Gorre y Col. (2001), dependiendo del tipo de mecanismo. Estos hechos muestran el carácter redundante de las alteraciones celulares producidas por la quimera BCR/ABL. Expresión del gen Lyn. Uno de los genes que más ha llamado la atención en los estudios de modificación de la expresión génica mediada por BCR/ABL es el gen Lyn, debido a que ha sido reportado en diversos trabajos que su expresión se ve significativamente alterada en pacientes con LMC que se encuentran en etapas avanzadas de la enfermedad y que presentan resistencia al tratamiento con Imatinib (Baran y Col. 2003; Luciano y Col. 2003; Yu y Col. 2003; Dai y Col. 2004; Rodriguez y Col. 2004; Contri y Col. 2005; Jing y Col. 2005). Así mismo, el descubrimiento de que la proteína LYN puede ser directamente activada por la quimera BCR/ABL en ausencia de factores de crecimiento, ha aumentado mucho más la curiosidad con respecto al papel que esta proteína puede cumplir en el efecto transformante de BCR/ABL en pacientes con LMC (Torigoe y Col. 1992). Estudios con líneas celulares con una alta resistencia al Imatinib, obtenidas a partir de pacientes con LMC, demostraron que en estas células el crecimiento y la supervivencia no estuvo mediado por una sobre-expresión de BCR/ABL (en este caso más bien se observó disminución de su expresión) o por la presencia de mutaciones puntuales sino por la sobreexpresión y activación de las proteínas tirosina quinasa LYN y HCK, las cuales no fueron 26 inhibidas por Imatinib (Nimmanapalli y Col. 2001; Donato, y Col. 2003). Esta modificación de la expresión y activación de LYN también ha sido reportada en estudios con las líneas celulares K562 y LAMA84, también resistentes al tratamiento con Imatinib. En este caso, el aumento de expresión y activación de LYN estuvo asociado a un aumento en la expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-2, lo que induciría a pensar en un papel de LYN en la vía de la apoptosis (Dai y Col. 2004). Estudios citogenéticos y moleculares han revelado que el gen Lyn está ubicado en el cromosoma 8 y transcribe un ARNm de 3.2Kb, el cual codifica para una proteína de 58.5 KDa con actividad tipo tirosina-quinasa igual que c-ABL (Yamanashi y Col. 1987). A proteína LYN presenta dos isoformas, p53 y p56, las cuales se forman como resultado de un “splicing” alternativo del ARNm. La actividad catalítica de LYN es altamente regulada por fosforilación en su residuo de tirosina en la posición 508 (Shangary y Col. 2003). LYN ha sido involucrada en varias funciones celulares entre la cuales podemos mencionar: su participación junto con FYN en una vía sinergística que regula la degranulación de las células troncales (Parravicini y Col. 2002). También ha sido demostrada la participación de LYN en los mecanismos de respuesta al estrés celular, por su unión directa a p53 a través de su dominio SH3. Esta unión, al igual que ocurre con c-ABL, permite formar un complejo estable que estimula la transcripción de genes en respuesta a daños en el ADN. Es bien conocido que la activación final de p53 induce apoptosis celular y detiene el crecimiento celular. Estos estudios también demuestran que LYN puede inducir la acumulación nuclear de p53 ubiquitinizado, para inhibir su exportación al citoplasma celular (Ren y Col. 2000). Más recientemente, LYN ha sido considerada como un componente importante en la transducción de señal mediada por citoquinas en una gran variedad de tipos celulares y también se ha reportado su rol clave en el crecimiento y la apoptosis de células hematopoyéticas (Donato, et al. 2003). Evidencias obtenidas a partir de modelos murino y humano, sugieren que LYN es un blanco importante “aguas abajo” de la señalización de BCR/ABL, más aún, ha sido evidenciada la activación de LYN en células positivas para BCR/ABL obtenidas a partir de pacientes con LMC en crisis blastica y en células leucémicas HL-60 transfectadas con BCR/ABL. En conjunto, estos hallazgos han originado la posibilidad de que la activación de 27 LYN puede estar implicada en la función antiapoptótica de BCR/ABL, incluyendo aquellos casos en los que la expresión de BCR/ABL es disminuida por cualquier otro factor (Dai y Col. 2004). 3. Mutaciones puntuales en el dominio tirosina-quinasa de la quimera BCR/ABL. Por último, con respecto a las mutaciones puntuales asociadas a la resistencia del tratamiento con Imatinib, Gorre y Col (2001) también encontraron en su estudio que algunos pacientes en crisis blástica, tanto linfoide como mieloide, presentaron la mutación puntual Thr315Ile (C944T) relacionada con el puente de hidrógeno que une a la droga con la porción ABL de la quimera. A partir de este descubrimiento se ha generado recientemente una amplia lista de mutaciones puntuales que han sido encontradas en el dominio tirosina-quinasa de los pacientes resistentes al Imatinib (Ver Tabla I). Es importante resaltar que la mayoría de estas mutaciones han sido reportadas en pacientes con etapas avanzadas de la LMC o en pacientes con LLA Ph+. Estos hallazgos permitieron inferir que la presencia de estas mutaciones causa la pérdida de especificidad del Imatinib por el dominio tirosina-quinasa de BCR/ABL, no permitiendo su inhibición. Para contrarrestar este efecto varias industrias farmacéuticas están creando nuevos compuestos, que solos o en combinación con el Imatinib, puedan controlar el efecto transformante de BCR/ABL. Los candidatos más resaltantes son: inhibidores farnesiltransferasa (SCH66336), inhibidor adafostin (NSC680410), inhibidor tirosina-quinasa de la clase de las pidopirimidinas (PD166326), inhibidor del ciclo celular conocido como flavopiridol (NSC649890) en combinación con inhibidores de las vías de señalización de supervivencia como el bortezomib y los conocidos como los inhibidores de tirosina quinasa de segunda generación Nilotinib (ANM107) y Desatinib, quienes presentan una potencia de acción mayor (por un factor de 20 -50) con respecto a imatinib (Hoover y Col. 2002; RocheLestienne y Col. 2002; Branford y Col. 2003; Melo y Col. 2003; Dai y Col. 2004; Wolff y Col. 2005; Kantarjian, y Col. 2006; Talpaz y Col. 2006 ; Guilhot y Col. 2007). Tabla I. Mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL que han sido asociadas con la resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes con LMC y LLA. (Tomado de Melo y Col. 2003). 28 Por otro lado, es interesante mencionar que varios de los investigadores antes mencionados consideran que la fase inicial de una recaída en LMC, o el inicio de la resistencia al tratamiento con Imatinib, involucra primero una sobre-expresión de BCR/ABL en aquellas células que no fueron eliminadas por el tratamiento, las cuales posteriormente podrían adquirir y acumular mutaciones puntuales que luego, cuando se inicia la recaída o resistencia, serían capaces de ejercer el efecto inhibitorio de una manera independiente de la quimera (Barnes y Col. 2005). Otras modalidades de tratamiento para la LMC. Es importante mencionar que actualmente están siendo desarrollados otros sistemas para el tratamiento de pacientes con LMC. Entre estos podemos mencionar el uso de oligonucleótidos antisentido (AS), ARN de interferencia (ARNi), ribozimas (ARN catalítico), DNAzimas y fragmentos de BCR. Los tres primeros son capaces de unirse directamente sobre 29 el ARN, el cuarto sobre el ADN para poder ejercer su efecto y el último lo hace directamente sobre la molécula BCR-ABL. No obstante, aún cuando estos sistemas son eficientes no han logrado erradicar completamente la enfermedad debido a que no se ha podido obtener un alto grado de especificidad en ninguno de los sistemas, tal como es el caso de los oligos antisentido y las ribozimas (Buchdunger y Col. 1996; James y Gibson 1998; Galderisi y Col. 1999; Kasper y Col. 1999; Clark. 2000). Por último, debemos resaltar que el seguimiento del tratamiento de los pacientes que padecen LMC dio un giro de 180 grados gracias al uso de técnicas, como la PCR en Tiempo Real, la cual permite la cuantificación continua de la quimera BCR/ABL en pacientes que ya han sido diagnosticados BCR/ABL positivos. Este hecho ha traído grandes avances en la disminución de un gran número de pacientes en fase de crisis blástica, así como un monitoreo más específico de los pacientes que se encuentran en fase crónica y fase acelerada (Kreuzer y Col. 1999; Neumann y Col. 2003; Müller y Col. 2007). Técnicas empleadas para el diagnóstico y clasificación de las leucemias. En la actualidad, el diagnóstico y clasificación de las leucemias contempla una serie de parámetros clínicos, bioquímicos y moleculares que permiten discernir, en el menor tiempo posible y de una forma muy certera, el tipo de leucemia que padece una persona favoreciendo así el tratamiento que se le debe aplicar. Estos estudios comprenden el diagnóstico clínico de acuerdo a una sintomatología clínica específica, los estudios morfológicos de las células del paciente (ver figura 11), siguiendo el acuerdo FAB (grupo de cooperación Británico-Americano-Francés), los estudios citogenéticos, los estudios inmunológicos y los estudios moleculares, siendo estos últimos los que han permitido alcanzar una clasificación más precisa (Kersey 1997; Chomel y Col. 2000; Avisati y Col. 2001). 30 Figura 11. Identificación del los diferentes tipos de células inmaduras que pueden encontrarse en un frotis sanguíneo de paciente con LMC. Las flechas rojas identifican los eritroblastos, metamielocitos, blastos y mielocitos. Las células inmaduras corresponden a las de gran tamaño, con muchas granulaciones en su interior y con una coloración púrpura. Tomado de www.leucemie-espoir.org/spip/article2.html. Citogenética Los estudios citogenéticos involucran principalmente la identificación de alteraciones a nivel cromosómico. Estos incluyen: tamaño, número, presencia de translocaciones, deleciones, inversiones, etc. La citogenética abarca una serie de técnicas de tinción y fluorescencia que permiten ampliar el rango de diagnóstico, estas incluyen los cariotipos, tinción de bandas G y más actualmente la técnica de hibridización in situ con fluorescencia (FISH). El FISH permite la identificación de zonas específicas del ADN, incluso a nivel de un solo gen. La técnica incluye la producción de sondas sintéticas que luego son conjugadas a compuestos fluorescentes. Esta sonda es capaz luego de hibridar con secuencias diana en el ADN de interés y emitir una fluorescencia específica que permite la identificación de los genes en estudio (ver figura 12). Cabe destacar, que aún cuando estos estudios proporcionan una información muy valiosa sobre las alteraciones cromosómicas, no cuentan con la sensibilidad necesaria que permita el uso de poca cantidad de muestra, así como el gran esfuerzo de laboratorio que hace falta para lograr buenos resultados (Faderl y Col. 1999; Di bacco y Col. 2000; Melo 2003). 31 A B Figura 12. Ilustración representativa de un estudio citogenético con células de un paciente con LMC. A) Cariotipo realizado con células en metafase de un paciente con LMC. Las flechas rojas indican la formación del cromosoma Filadelfia en el par 22 y la formación de un cromosoma con mayor tamaño en el par 9. B) identificación por FISH de la translocación BCR/ABL y de los genes abl y bcr en células en metafase de un paciente con LMC. Tomado de www.leucemie-espoir.org/spip/article2.html. Citometria de flujo Por su parte, los estudios inmunológicos contemplan la identificación de proteínas receptoras de membrana, citoplasmáticas y nucleares específicas (antígenos), las cuales son detectadas con el uso de anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos específicos. La citometría de flujo (CMF), es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente son digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula. (www.citometriadeflujo.com). Estos parámetros son: • Parámetros relacionados con las características intrínsecas de la célula, como su tamaño y la complejidad o granularidad de su núcleo y citoplasma. 32 • Parámetros relacionados con características antigénicas de cada célula (conocido como inmunofenotipo). Las señales producidas por la interacción de las células con el haz de luz son de dos tipos: 1. Señales de dispersión. La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamentalmente: el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado complejidad. En los Citómetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersión: a.- La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión. b.- La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula. 2. Señales de Fluorescencia. Un fluorocromo es una molécula química que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una longitud superior (menor energía). El espectro de absorción o excitación es el intervalo sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es el intervalo sobre el que un fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía se utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina “Stokes shift”. Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de los complejos Antígeno/Anticuerpo, marcados con un fluorocromo, situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual 33 a la proporción de componentes fluorescentes de la partícula (Ver figura 13) (www.citometriadeflujo.com). A B C Figura 13. Ilustración representativa del funcionamiento del citómetro de flujo. A) Cámara a través de la cual se hace pasar la suspensión a estudiar, las células pasan una a una a través del dispositivo para poder ser leídas por el láser. B) Señales de dispersión que permiten la identificación del tamaño y la granulosidad de cada célula. C) Detección de la fluorescencia emitida por los anticuerpos monoclonales conjugados a fluorocromos. Tomado de http://www.citometriadeflujo.com/HTML/fundamentos%20frame.htm Actualmente, la CMF es una técnica que se aplica en la rutina diaria de muchos laboratorios clínicos y de investigación y es capaz de proporcionar resultados de forma rápida que pueden ser aplicables al diagnóstico. Gracias a su gran especificidad el citómetro puede distinguir entre varias poblaciones celulares diferentes, y detectar una población celular en una muestra en la que predominan otras poblaciones celulares. Aún con toda su versatilidad, los estudios inmunológicos presentan ciertas limitantes puesto que no pueden identificar las fases tempranas de algunas leucemias (tal como la LMC en fase crónica y acelerada), pero su uso es indispensable en los diferentes centros de 34 diagnóstico porque permite identificar el tipo de linaje (mieloide o linfoide) en los casos de LMC en fase de crisis blastica, lo cual ayuda a decidir el tratamiento más adecuado (Goldsby y Col. 2000). PCR en Tiempo Real. En contraparte con las técnicas anteriores, los estudios moleculares, tales como RTPCR (“reverse transcription – polymerase chain reaction”) y más recientemente RT-PCR Cuantitativa en Tiempo Real (RTQ-PCR), han marcado pauta en los estudios de diagnóstico y seguimiento de la evolución de las leucemias. Estas técnicas pueden identificar en muy corto tiempo no solo el tipo específico de leucemia que presenta el paciente, sino sus variantes e incluso la respuesta que el paciente presenta ante un tratamiento dado o un transplante de médula ósea. Las técnicas de RT-PCR y RTQ-PCR involucran la producción de un ADN complementario a partir de un ARN mensajero molde proveniente de cada paciente y su posterior amplificación empleando cebadores específicos para la identificación de la alteración cromosomal distintiva de cada tipo de leucemia. Estas técnicas presentan una mayor sensibilidad con respecto a las antes mencionadas gracias a que son capaces de detectar una célula maligna entre 100.000 células normales y sólo necesitan una mínima cantidad de muestra del paciente para dar resultados muy fidedignos (Deininger y Col. 2000; Goldman y Col. 2004). En el caso particular de la RTQ-PCR, el producto obtenido puede ser visualizado y cuantificado en el mismo momento en el que se está produciendo, todo esto a partir de la presencia de un reportero fluorescente que se une o intercala en el ADNc obtenido de cada muestra de paciente y emite una señal que aumenta de manera proporcional directa a la cantidad de producto de PCR formado. Esta PCR combina el principio de fluorescencia con una alta sensibilidad analítica y precisión, ofreciendo un rango de detección dinámico de 6 o más órdenes de magnitud (Heid y Col. 1996). En el mercado existe una gran variedad de sistemas de reporteros fluorescentes, entre los que resaltan: 1. El sistema de detección por SYBR Green. 35 2. El sistema de detección por hibridización de sondas. 3. El sistema de detección por TaqMan. 1. El sistema de detección por “SYBR Green” consiste en la capacidad que tiene este colorante para intercalarse en el surco menor de la molécula de ADN de doble cadena. Este compuesto es agregado en la mezcla de reacción de PCR y su detección en el proceso de amplificación es evidente solo cuando se han formado las cadenas dobles de ADN. La desventaja de esta técnica de detección es que el “SYBR Green” es un agente fluorescente que no es secuencia específico, es decir, que tanto las amplificaciones inespecíficas como los dímeros de cebadores no pueden distinguirse del amplicón específico en estudio (http://www.rapidcycler.com/lightcycler_u/lectures/quantification_on_lc.htm). 2. Por su parte, el sistema de detección por hibridización de sondas si permite la detección de la amplificación de productos específicos. En él, dos sondas son producidas de tal manera que puedan hibridizar una al lado de la otra en la cadena de ADN diana. La sonda ubicada hacia el extremo 3` es marcada con fluoresceína, la cual actúa como un donador de fluorescencia por transferencia de energía de resonancia (FRET), mientras que la sonda del extremo 5` es marcada con un colorante aceptor. Cuando la reacción de amplificación se inicia, la señal FRET es vista sólo cuando la taq polimerasa elimina ambas sondas de la cadena de ADN que sirve como molde, liberando así la molécula fluorescente. (http://www.rapidcycler.com/lightcycler_u/lectures/quantification_on_lc.htm) 3. Por último, el sistema de detección por sonda “TaqMan” consiste en la producción de una sonda que, al igual que en el sistema 2, es capaz de hibridizar con una secuencia diana en el ADN, pero en este caso la misma sonda lleva unida a ella la molécula de fluoresceína y un “Quenching” que inhibe que la fluoresceína se active y emita fluorescencia. Cuando la taq polimerasa, en su proceso de amplificación, hidroliza la sonda y elimina la inhibición que ejerce el “Quenching” sobre la fluoresceína entonces ésta puede fluorescer (ver figura 14) (http://www.rapidcycler.com/lightcycler_u/lectures/quantification_on_lc.htm). 36 Figura 14. Ilustración representativa del modo de acción de los tres sistemas de detección de la amplificación por RTQ-PCR. 1) Sistema de detección con el colorante “SYBR Green”, representado en color verde. 2) Sistema de detección con sondas de hibridización. La fluoresceína es identificada con el color verde mientras que el colorante aceptor está representado en rojo. C) Sistema de detección con sondas TaqMan. La fluoresceína es identificada con el color verde mientras que el “Quencher” está representado en rojo. Tomado de http://www.rapidcycler.com/lightcycler_u/lectures/quantification_on_lc.htm. Existen diferentes equipos diseñados para el proceso de RTQ-PCR, pero todos siguen un mismo fundamento. El sistema del LightCycler es uno de los más usados en los estudios de cuantificación de quimeras que causan leucemias, enfermedad residual y estudios de expresión génica, ya que permite el análisis de una gran cantidad de muestras en un tiempo muy corto. Este sistema trabaja con pequeños capilares de vidrio que admiten el cargado de muy poco material de reacción (20 μl), lo cual reduce el costo de los reactivos y permite partir de muy poca cantidad del material (http://www.idahotechnology.com/rapid/images/schematic.gif). 37 genético a estudiar A B Figura 15. Ilustración representativa del sistema Light Cycler para amplificación por RTQ-PCR. A) Equipo de LightCycler exponiendo el sistema de carrusel. B) Configuración interna del equipo mostrando cada una de las cámaras y dispositivos. Tomado de http://www.idahotechnology.com/rapid/images/schematic.gif La RTQ-PCR es una de las técnicas más usadas en el estudio de la expresión génica en enfermedades como la leucemia. Esta permite hacer no sólo una cuantificación absoluta de la muestra sino que también se pueden realizar análisis de expresión relativa con la inclusión de un gen “housekeeping” (por ejemplo GAPDH), el cual sirve como marco de referencia en la medición de la expresión de un gen en estudio (Towatari y Col. 1991; Sill y Col. 1995; Canitrot y Col. 1999; Takeda y Col. 1999). Con base en lo expuesto en párrafos anteriores, en el presente trabajo de investigación se enfocaron los dos aspectos más resaltantes en el estudio de la LMC. El primero, en el que se investigó todo lo relacionado con el diagnóstico molecular de esta patología y el segundo, en el que se investigaron los tres mecanismos principales que han sido propuestos para adquirir resistencia contra el tratamiento con Imatinib. Este trabajo es pionero en el reporte de una estadística detallada de la frecuencia con que se presenta la LMC y sus variantes en los principales centros de referencia del país, lo cual, a su vez, permitió hacer una extrapolación 38 de la situación a nivel nacional y con respecto a otros países. La estadística obtenida, también permitió evidenciar la relación que pudiera tener la LMC con la edad y el sexo de los pacientes venezolanos que la padecen. Por último, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran la importancia que tiene en nuestro país el esfuerzo combinado de grupos de trabajo multidisciplinarios, constituidos por médicos especialistas en enfermedades hematoncológicas (como la LMC) e investigadores en el área de la biología moleculares (Biólogos, Bioanalistas, etc), así como la combinación de técnicas en la formación del engranaje perfecto de visión, experimentación y discusión que conforman la maquinaria que trabaja en pro de una mayor y mejor comprensión del comportamiento de estas patologías tanto en nuestra población como en el resto del mundo. 39 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DEL TEMA TRATADO En general, las leucemias son patologías clínicas que afectan tanto a niños como a adultos (principalmente a adultos) sin distinción de raza o género y se encuentran ampliamente distribuidas a nivel mundial. En sus inicios, el diagnóstico de la leucemia era sinónimo de muerte inminente, sin embargo con el paso de los años se han desarrollado diversos tipos de tratamientos como la quimioterapia, radioterapia, transplante de médula ósea y otras como la terapia génica, los cuales han permitido en algunos casos la erradicación completa de la enfermedad y en otros han logrado al menos alargar mucho más el periodo de vida del paciente con buena calidad de vida. (http://seer.cancer.gov/statfacts/). Actualmente se cuenta con una clasificación bien detallada de todos los tipos de leucemias (sus variantes y sus pronósticos) que han sido encontrados en diversos países. Sin embargo, este conocimiento sólo ha sido útil para indicarnos cuan grave y complicadas son estas alteraciones y de lo difícil que se hace conseguir una completa erradicación de las mismas. (Goldsby y Col. 2000; Duncan, y Col. 2003; Melo y Col .2003) Una de las leucemias que más ha llamado la atención en la comunidad mundial es la leucemia mieloide crónica o LMC, debido a que esta alteración es una de las más frecuentes entre los pacientes que visitan los diferentes centros de diagnóstico a nivel mundial. Por si esto fuera poco, la LMC es inducida por una translocación que ocasionalmente es encontrada en leucemias como la LLA y tiene efectos de mal pronóstico tanto en niños como en adultos (Deininger y Col. 2003). En países desarrollados como Estados Unidos, aproximadamente 4.500 nuevos casos de LMC son diagnosticados cada año (Mow et al. 2002). En los países europeos las estadísticas para LMC y otros tipos de leucemias son muy similares, razón por la cual en la actualidad se están realizando diversos estudios para determinar la frecuencia y prevalencia de estas en las diferentes poblaciones así como su tratamiento. 39 En el caso particular de Venezuela, el diagnóstico molecular de la LMC se realizaba inicialmente en un solo centro de referencia a nivel nacional (Banco Municipal de Sangre, BMS), el cual está a cargo del Doctor José Luís López. Más recientemente, se han desarrollado otros dos centros de diagnóstico, pero éstos son privados, no son considerados centros de referencia nacional y el costo por del diagnóstico molecular es elevado. Aunque en el centro de referencia BMS no se disponen de datos estadísticos que permitan hacer un estimado de la frecuencia con la que se presentan los casos de LMC, se sabe (Dr. José Luís López, comunicación personal) que aproximadamente un promedio de 600 pacientes anuales llegan a este centro y que un buen porcentaje de ellos son diagnosticados como LMC. Si a este número se le adicionan los casos atendidos por los centros privados y el considerable número de personas del interior del país con bajos recursos económicos y escasa posibilidad de traslado a estos centros, se podría obtener un valor estadístico de frecuencia de la enfermedad en Venezuela cercanos a los reportados por otros países en relación con su número total de habitantes. En vista de las observaciones anteriores, las leucemias han sido catalogadas como un problema importante de salud pública a nivel nacional. Este hecho ha traído como consecuencia la unión de varios investigadores y médicos especialistas del área para tratar de buscar soluciones concretas que permitan controlar la situación. El proyecto de grupo FONACIT G-2001000784 involucra dos centros clínicos (Banco Municipal de Sangre, (BMS) y el Hospital Dr. Miguel Pérez Carreño (HPC)) y dos centros de investigación (Universidad Simón Bolívar (USB) y el Instituto de Estudios avanzados (IDEA)). Este proyecto, tiene su centro piloto en la USB y su objetivo fundamental fue la estandarización y puesta en funcionamiento de diversas técnicas moleculares para ser empleadas en el diagnóstico de la LMC y otros tipos de leucemias. Este diagnóstico se hace en forma gratuita y permite realizar el diagnóstico inicial y el seguimiento de pacientes en tratamiento con Imatinib o posterior a un transplante alogénico de médula ósea. Adicionalmente incluye la preparación de personal capacitado para trabajar en esta área, así como la capacitación de nuevos centros a nivel nacional, de tal manera que el país pueda contar con varios centros de referencias de diagnóstico y seguimiento de las leucemias. 40 Con base en la importancia vital que tiene este tipo de investigación para la salud de nuestra nación, la realización de esta tesis Doctoral es considerada una pieza fundamental en el inicio, desarrollo y consolidación de este nuevo centro de referencia nacional, pues ésta pretende establecer la estandarización de las principales técnicas moleculares de diagnóstico de la LMC y realizar el diagnóstico molecular de un número significativo de pacientes que permita hacer por primera vez la detección de la frecuencia de esta patología en nuestro país. Posteriormente, con el fin de establecer el estatus de nuestros pacientes en cuanto a la respuesta al tratamiento que actualmente se está empleando para atacar la LMC y los posibles factores moleculares que pudieran estar influyendo en el desarrollo de resistencia contra este tratamiento, también se pretende realizar estudios de análisis de secuencias, estudio expresión génica, detección de mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de la proteína quimérica y persistencia en la expresión del distintivo molecular de esta enfermedad. Adicionalmente, se implementará el uso de paneles de diagnóstico no sólo para la LMC sino para otras leucemias cuya frecuencia de aparición sea cercana a la de la LMC. Esta tesis servirá como prototipo en la realización de nuevos trabajos de investigación relacionados con el diagnóstico y tratamiento de otros tipos de leucemia, tales como la LMA, LLC, LLA y linfomas. 41 OBJETIVOS Objetivo General: Estudio molecular de la translocación BCR/ABL en pacientes Venezolanos con leucemia mieloide crónica LMC. Objetivos específicos: 1.- Determinación de la presencia de la translocación BCR/ABL, vinculada al subtipo de leucemia mieloide crónica (LMC), en pacientes leucémicos y controles mediante las técnicas de extracción de ARN, RT-PCR y Northern Blot. 2.- Clonamiento de los diferentes productos de la fusión BCR/ABL encontrados en los pacientes leucémicos. 3.- Secuenciación de los diferentes productos de interés de la fusión BCR/ABL encontrados en los pacientes leucémicos y comparación de los mismos con los reportados en la bibliografía. 4.- Elaboración de sondas de ADNc enriquecidas a partir de pacientes LMC y controles para monitorear, mediante la técnica de “screening” diferencial con librería de ADNc, cambios de expresión génica en genes claves relacionados con el desarrollo, evolución y resistencia al tratamiento de la patología LMC. 5.- Elaboración de arreglos de membrana de ADNc humanos específicos, basados en los reportes internacionales, para ser hibridizados con sondas de ADNc de pacientes con LMC y controles que permitan identificar genes involucrados en el desarrollo, evolución y resistencia al tratamiento de la LMC. 42 6.- Determinación de la frecuencia de la translocación BCR/ABL en pacientes LMC Venezolanos. Nota importante: Es imprescindible aclarar que en este trabajo fue necesario modificar tanto de la última actividad planteada en el objetivo 1 (Northern Blot), como de los objetivos 4 y 5 de la tesis. Todas las modificaciones estuvieron fundamentadas en el hecho de que aún cuando este trabajo estuvo financiado por un proyecto de grupo aprobado por el FONACIT, la entrega de los recursos financieros sufrió retardos, lo cual alteró el cumplimento de algunos de sus objetivos. Adicional a esto, estuvo el dramático hecho de que todos los pedidos de reactivos y principalmente de equipos necesarios para su realización fueron detenidos o retardados por el problema del paro petrolero que hubo en el país. Con respecto a la realización del Northern Blot, el empleo de está técnica no fue necesario debido a que obtuvimos muy buenos resultados con la RT-PCR en la identificación de la translocación y sus variantes y a que las secuenciaciones manuales y automáticas permitieron obtener resultados completamente satisfactorios. Con respecto a los objetivos 4 y 5, que involucran el uso de técnicas para estudios de expresión génica relacionados con el desarrollo, evolución y resistencia al tratamiento de la LMC, fue necesario introducir cambios en las técnicas propuestas, incorporando el uso de la técnica de RTQ-PCR debido a que los equipos y reactivos necesarios para el logro de estos objetivos llegaron hace tan solo 10 meses a Venezuela. En todo caso, el cambio resultó favorable debido a que la RTQ-PCR es una técnica más actual y con mayor sensibilidad en este tipo de estudios. Por otro lado, también se decidió incluir un estudio de mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL en los pacientes analizados con el fin de completar, en conjunto con el Dr. José Luís López, el estudio de los tres posibles mecanismos 43 que podrían ser responsables de la resistencia al tratamiento con Imatinibib observada en pacientes venezolanos con LMC. Adicionalmente, se debe mencionar que también se decidióincluir en este estudio la técnica de citometría de flujo en el diagnóstico de algunos casos de LMC ya que es una técnica ampliamente usada para el diagnóstico inicial de este y otros tipos de leucemias, lo que permitió hacer un análisis comparativo con las técnicas moleculares durante el estudio. Por último, este estudio se incluyó como un objetivo adicional de gran utilidad, la creación de un panel diagnóstico en donde además de la detección de BCR/ABL para el diagnóstico de LMC o LLA, también se incluyeron otros tipos de translocaciones vinculadas a otras leucemias. Este aporte permite mejorar las expectativas de la comunidad que sufre de este tipo de problemas, y permite a su vez facilitar el trabajo de los médicos a través un diagnóstico más completo. 44 METODOLOGÍA DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA QUIMERA BCR/ABL Obtención de las muestras: En el presente estudio se evaluaron 297 muestras de pacientes con diagnóstico de leucemia referidos por el Banco Municipal de Sangre de Caracas y Hospital Miguel Pérez Carreño, con edades comprendidas entre 0 meses y 90 años, abarcando ambos géneros. La selección de los pacientes sospechosos de LMC, a ser confirmados mediante ensayos moleculares en el Laboratorio de Genética Molecular Humana de la Universidad Simón Bolívar, se hizo sobre la base de estudios clínicos, morfológicos y citoquímicos . Se procesaron muestras a partir de aspirados de médula ósea (MO) por punción directa y sangre periférica (SP). También se tomaron muestras de personas que no presentaron ninguna manifestación clínica de LMC, con el fin de usarlos como controles negativos durante los ensayos. Todas las muestras fueron almacenadas en tubos con K3EDTA, mantenidas a temperatura ambiente y procesadas el mismo día en que fueron recolectadas. Todas las muestras fueron tomadas bajo previo consentimiento informado (Anexo E). Extracción de ARN total. Obtención de células mononucleares (Gradiente de Ficoll). Por cada 3 ml de muestra se agregaron 3 ml de Ficoll y se centrifugó por 30 min. a 1.500 rpm. De las tres fases formadas, se tomó la capa intermedia que contenía las células blancas mononucleares y se colocó en un tubo eppendorf estéril. Posteriormente, las muestras se centrifugaron por 3 min. a 3.000 rpm. y el sedimento producido fue usado para la extracción del ARN total (ARNt). Extracción de ARN total. Protocolo A. (Modificado de Chomczynski & Sacchi. 1986). El pellet obtenido por gradiente de Ficoll se homogeneizó con 1 ml de solución desnaturalizante (citrato de sodio 0.75 M, sarkosyl al 10%, 250g de guanidina isotiocianato, y 45 antes de su uso se le agregó 0.35 ml de 2-mercaptoetanol) y se dejó reposar por 5 min. a temperatura ambiente. Luego se procedió a agregar secuencialmente al homogenato 0,1 ml de acetato de sodio 2M a pH 4, 1 ml de fenol saturado en agua y 0,2 ml de cloroformo-alcohol isoamílico (49:1) (se mezcló suavemente). La suspensión se agitó vigorosamente por 10 seg. y se incubó en hielo por 15 min. Las muestras se centrifugaron a 11.000 rpm por 20 min. a 4°C y se tomó la fase acuosa. Esta fase se transfirió a un tubo nuevo, estéril y libre de ARNasa y se mezcló por inversión con 1 ml de isopropanol, posteriormente se colocó a -20°C por 1 hora. Los tubos fueron luego centrifugados a 11.000 rpm. a 4°C por 20 min. y el pellet fue resuspendido en 0,3 ml de solución desnaturalizante. Por último, se hizo una reprecipitación con 1 volumen de isopropanol y se colocó a -20°C por 1 hora, se centrifugó a 11.000 rpm por 10 min. y luego el pellet fue resuspendido en 0,3 ml de etanol frió al 75% con agua tratada con DEPC, se agitó suavemente para permitir el lavado del pellet y se centrifugó a 7.500 rpm. por 5 min. Posteriormente se descartó el sobrenadante y el ARNt (pellet) se dejó secar invirtiendo el eppendorf en un papel absorbente nuevo por aproximadamente 30 min. El ARN obtenido se resuspendió en 40 μl de H2O tratada con DEPC mezclando suavemente y fue almacenado a -80 °C hasta su uso. Extracción de ARN total. Protocolo B. (kit con Trizol). El pellet obtenido por gradiente de Ficoll se homogeneizó con 1 ml de Trizol®Reagent (Invitrogen), la mezcla se pasó a través de una jeringa de 5 ml (8-10 veces) y se incubó a temperatura ambiente por 5 min. Posteriormente se le agregó 200 μl de cloroformo, se mezcló por inversión y se dejó reposar 5 min. a temperatura ambiente. Luego, se centrifugó a 14.000 rpm. a 4 ºC por 15 min., y se tomó la fase acuosa a la cual se le añadió igual volumen de isopropanol, para la precipitación se mezcló por inversión y se dejó reposar por 15 min. a 4 ºC. Por último, se centrifugó a 14.000 rpm por 15 min. a 4 ºC, descartándose el sobrenadante. El pellet de ARNt obtenido fue lavado con 1 ml de etanol al 75% frío, se centrifugó durante 5 min. a 7.500 rpm a 4 ºC y posteriormente el pellet se secó por inversión del eppendorf sobre papel absorbente durante unos 20 min. El ARNt se resuspendió en 40 μl de agua libre de ARNasa. 46 Determinación de la concentración y calidad del ARNt. La concentración del ARNt fue determinada por cuantificación espectrofotométrica (260/280) y su calidad fue visualizada en un gel de agarosa al 1% (MOPS 1X y formaldehído 37%) como lo describe Ausubel y col. (1995). La corrida electroforética se llevó a cabo en una cámara horizontal libre de ARNasa “Easy CastTM” a un voltaje de 100 V. Los geles fueron fotografiados empleando el sistema Gel Doc 2000TM Gel Documentation System, PC, 220-240 V, CCIR y el software del equipo Quantity One 4.2.1 de BIO RAD. Transcripción Inversa – Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR). Transcripción inversa (RT). La síntesis de ADN complementario (ADNc) se realizó en un volumen final de 30 μl, preparada en dos etapas. En la primera parte se preparó una mezcla que contuvo: 5 μl de la muestra de ARNt (0.5-1 μg), 1 μl de oligo RP (“Random Primer”) (100 ng/μl), 4 μl de Buffer 5X, 11 μl de agua tratada con DEPC. Posteriormente se incubó a 68 ºC por 3 min. y se dejó 5 min. a temperatura ambiente. En la segunda etapa se agregó a la primera mezcla: 0,5 μl ARNasin Inhibitor (Promega), 1 μl de dNTP`s 10 mM, 2 μl de MgCl2 25 mM, 4,5 μl de agua tratada con DEPC y 1 μl de la enzima M-MVL transcriptasa inversa (Invitrogen). El tubo se incubó a 37 ºC por 1 hora para permitir la acción de la enzima y luego se desnaturalizó a 95 ºC por 2 min. El ADNc obtenido se almacenó a -20 ºC hasta su uso en los posteriores análisis. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Para una reacción de PCR de 20 μl se mezclaron: 6.3 μl de agua Millipore, 2 μl de dNTP`s (2 mM), 2 μl de buffer 10X, 1.5 μl del cebador sentido B2B (10 pmol/ μl), 1.5 μl del cebador antisentido CA3- (10 pmol/ μl), 1.6 μl de MgCl2 25 mM, 0.1 μl de taq polimerasa y 5 μl del ADNc. La PCR se realizó en dos tipos de termocicladores, el Rapid Cycler de Idaho Technology (RC) y el MiniCycler de JM research (MC). Los programas empleados en cada uno de los termocicladores fueron: (RC) un ciclo de 94 ºC 3 min., 35 ciclos de: 94 ºC 10 seg., 55 ºC 10 seg., 72 ºC 30 seg., un ciclo de 72 ºC 3 min. (MC) un ciclo de 94 ºC 5 min., 35 ciclos de: 94 ºC 1 min., 55 ºC 1 min., 72 ºC 50 seg., un ciclo de 72 ºC 10 min. y 4 ºC 5 min. Los cebadores y tamaños esperados para cada variante están detallados en la Tabla II. 47 Tabla II. Secuencia de cebadores empleados en la amplificación de las diferentes variantes de la translocación BCR/ABL y del control interno BCR en pacientes con LMC. Los tamaños esperados para cada producto, así como la temperatura de “annealing” fueron tomados de Cross y Col. 1994. Tipo de estudio Variantes Secuencia de Cebadores Tamaño del Producto Temperatura de Annealing Translocación BCR/ABL b2a2 b3a2 e1a2 B2B: CA3-: TGTTGACTGGCGTGATGTAGTTGCTTGG B2B: CA3-: TGTTGACTGGCGTGATGTAGTTGCTTGG BCR-C: CA3-: TGTTGACTGGCGTGATGTAGTTGCTTGG ACAGAATTCGCTGACCATCAATAAG ACAGAATTCGCTGACCATCAATAAG ACCGCATGTTCCGGGACAAAAG 310 pb 385 pb 55°C 481 pb Control interno BCR Gen bcr B2B: C5e-: ACAGAATTCGCTGACCATCAATAAG 808 pb 55°C ATAGGATCCTTTGCAACCGGGTCTGAA La figura 16 (Panel A) ilustra la localización donde están alineados los cebadores usados en este trabajo sobre los genes bcr y abl y sobre las secuencias hibridas producidas una vez ocurrida la translocación, figura 16 (Panel B). Adicionalmente se ilustran los diferentes puntos de corte, correspondientes a las variantes p210 (b2a2 y b3a2) y p190 (e1a2), así como los tamaños esperados para cada una. Por su parte, en la figura 17 es posible apreciar con mucho mas detalle las secuencias de las tres variantes reportadas (b2a2 b3a2 y e1a2), resaltándose la posición de los cebadores usados para su detección por PCR, los puntos de corte reportados para cada una de las variantes, y las secuencias de ambos genes cercanas al punto de unión de la translocación involucrada, respectivamente. 48 Figura 16. Esquema ilustrativo de la posición de los cebadores en los genes bcr y abl (Panel A) y en las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 (Panel B). La barra de color amarillo representa al gen bcr y la barra roja representa al gen abl. Las flechas amarillas indican la zona de unión de los diferentes cebadores en bcr y las flechas rojas indican la región donde se unen los cebadores en abl, la dirección de cada una de las flechas indican los cebadores. BCR-C, B2B, C5e, y CA3 son los nombres que reciben los diferentes cebadores sentidos y antisentidos. Los números con la línea blanca indican los tamaños esperados con cada juego de cebador para cada variante. Tomado de http://www.compgene.com/bcrabl.htm A. b2a2 1 81 161 241 321 401 481 561 641 721 801 881 gcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcc cagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagt ggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgacc aactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagaagcccttcagcggccagtagc atctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaa atgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaag ctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaa ctacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgc tgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatac gaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacac cctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgca acaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagt B. b3a2 1 81 161 241 gcgaacaagggcagcaaagctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcc cagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagt ggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgacc aactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctcta 49 321 401 481 561 641 721 801 881 961 tgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctg actttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgac cccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccg ggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactaca tcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagc agcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagg gagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctgg ccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaag cccactgtctatggtgtgtcccctaactacgacaagt C. e1a2 1 81 161 241 321 401 481 561 641 721 801 881 961 gtaccagccctaccagagcatctacgtcgggggcatgatggaaggggagggcaagggcccgctcctgcgcagccagagca cctctgagcaggagaagcgccttacctggccccgcaggtcctactccccccggagttttgaggattgcggaggcggctat accccggactgcagctccaatgagaacctcacctccagcgaggaggacttctcctctggccagtccagccgcgtgtcccc aagccccaccacctaccgcatgttccgggacaaaagccgctctccctcgcagaactcgcaacagtccttcgacagcagca gtccccccacgccgcagtgccataagcggcaccggcactgcccggttgtcgtgtccgaggccaccatcgtgggcgtccgc aagaccgggcagatctggcccaacgatggcgagggcgccttccatggagacgcagaagcccttcagcggccagtagcatc tgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatg accccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctc cgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtccaagcaactac atcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgag cagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaag ggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctg gccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaa Figura 17. Secuencias de las variantes b2a2 (Panel A), b3a2 (Panel B) y e1a2 (Panel C) correspondientes a los diferentes puntos de corte del híbrido BCR/ABL. En violeta y amarillo se señalan las secuencias donde se unen los cebadores. En verde se señalan las secuencias correspondientes a las regiones del gen bcr y en azul se señalan las secuencias correspondientes a las regiones del gen abl involucradas en la amplificación por PCR. Una vez obtenidos los productos amplificados por PCR, estos fueron analizados en geles de agarosa al 1,5% utilizando como buffer de corrida TAE 1X (Tris Base 2M, Ácido Acético Glacial 5,71%, EDTA 0,05 M pH 8). La corrida electroforética se llevó a cabo en una cámara horizontal “Easy CastTM” con un voltaje de 100 V y tiempo de corrida de 15 min. La visualización de las bandas se hizo empleando un transiluminador de luz ultravioleta DyNA Light Dual Intensity UV Transiluminator. Los geles fueron fotografiados en un equipo Gel Doc 2000TM “Gel Documentation System”, PC, 220-240 V y analizados por el uso del software Quantity One 4.2.1 de Biorad. Clonación de las variantes de BCR/ABL Una vez detectadas como positivas, mediante RT-PCR, para algunas de las variantes (p210: b2a2/b3a2 y p190: e1a2) reportadas para BCR/ABL, 10 muestras (13, 20, 54, 69, 88, 89, 108, 112, 130 y 139) de pacientes venezolanos con LMC fueron clonadas (ver Anexo A) con el propósito de facilitar ensayos posteriores y preservar estas muestras como controles positivos en el laboratorio. Entre los ensayos posteriores destacó el obtener las secuencias respectivas y realizar los análisis para confirmar tanto los puntos de fusión de las diferentes 50 variantes analizadas con respecto a las secuencias reportadas en la literatura, como la aparición de mutaciones no reportadas en los híbridos analizados. Preparación de células competentes. Una colonia de células DH5α fue inoculada en 5 ml de caldo LB (Luria-Bertani. Por cada litro: Bacto triptona 20 gr/Extracto de Bacto Levadura 5 gr/ NaCl 8.58 gr) e incubada durante 12-14 horas a 37 ºC con agitación constante. Posteriormente 2 ml del caldo crecido fueron usados para inocular 50 ml de medio (LB) e incubado a 37 ºC con agitación constante hasta alcanzar una densidad óptica de 0,3 a 550 nm (~ 5 X 107 células/ml), aproximadamente 2-3 horas de incubación. El cultivo celular fue separado en dos tubos Corex estériles, enfriado en hielo por 10 min. y centrifugado durante 15 min. a 750-1000 g. a 4 ºC. El pellet fue resuspendido en 1/3 del volumen del buffer de transformación CCMB 80 frío (CaCl2.2H2O 80 mM, MnCl2.4H2O 20 mM MgCl2.6H2O 10 mM, acetato de potasio 1M, pH 7 1%, Glicerol 10%) por 20 min. y reposado en hielo. La suspensión se centrifugó por 10 min. a 750-1000 g a 4 ºC. El pellet obtenido se resuspendió nuevamente en 1:12 del buffer CCMB 80 y posteriormente alicuotado en volúmenes de 200 μl. Las células fueron almacenadas a -70ºC hasta su uso. Ligación. Los productos de la PCR fueron ligados al vector pGEM-T Easy, Promega. Este vector es preparado cortándolo con la enzima de restricción EcoRV y posteriormente agregada una timina al extremo 3’ de ambos extremos del vector. Estos extremos del vector mejoran significativamente su ligación a un producto de la PCR, ya que por una parte evita la recircularización del vector y lo más importante permite exponer una terminación compatible con los extremos de los productos de la PCR, en los cuales usualmente las polimerasas termoestables, usadas de rutina, agregan una base nucleotídica de más en el extremo 3’ (usualmente adenina) de todos los fragmentos que se encuentran en forma “romo/blunt”, lo cual es independiente del templado que se está amplificando (Anexo B). 51 La ligación del producto BCR/ABL al plásmido se realizó usando 5 µl del Buffer “Rapid Ligation” 2X, 0,5 µl del vector pGEM-T Easy (50 ng), 3,5 µl del producto de PCR y 1 µl T4 DNA ligasa. La mezcla de reacción obtenida (10 μl) fue agitada cuidadosamente se dejó a temperatura ambiente 1 hora y luego se dejó a 4 ºC toda la noche y hasta el momento de su uso. Transformación. Para la reacción de transformación de los productos BCR/ABL ligados al vector pGEM-T Easy, se tomaron 200 μl de células DH5α competentes (preparadas previamente) a las cuales se les agregó 4 μl de la reacción de ligación. Se dejaron en hielo durante 30 min., se provocó un choque térmico a 42 ºC por 2 min., posteriormente se agregó 1 ml del caldo LB y se incubó durante 1 hora a 37 ºC. La mezcla de transformación fue luego centrifugada por 5 min. a 5.000 rpm y el pellet fue resuspendido cuidadosamente en 200 μl de caldo LB + ampicilina (100 µg/ml). En paralelo con la transformación de los plásmidos contentivos de las secuencias clonadas, también se hizo la transformación del plásmido pBS/SK, el cual fue usado como control positivo de transformación bacteriana. Cuatro placas fueron sembradas de la siguiente manera: a) LB agar y 100 μl de DH5α (control bacterias), b) LB agar, Ampicilina (Amp.), IPTG (isopropil-β-D-tiogalaptopiranoside) y X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranoside) y 100 μl de DH5α transfectadas con PBS/SK (control de transformación), c) una tercera placa preparada igual a la segunda pero donde sólo se sembraron 100 μl de DH5α competentes (control del inserto) y d) una última placa preparada igual que la segunda pero sembrada con 100 μl de los productos de la ligación. A B C D Control bacterial Control de Control de Cel Transformación con sin transformar Transformación Competentes. DH5α+ p-GEM+PCR 52 Las placas se incubaron a 37 ºC por aproximadamente 15 horas y se seleccionaron sólo las colonias blancas para el posterior análisis de confirmación del clonaje mediante minipreparaciones (Miniprep). Las colonias blancas se sembraron por separado en tubos con 2 ml de suspensión LB y ampicilina y se dejaron en incubación toda la noche a 37 ºC con agitación constante. Extracción y purificación del ADN plasmídico (Mini-prep). Para una reacción típica de miniprep se tomaron 1,5 ml del medio crecido con las colonias recombinantes, se centrífugó por 1 min. a 12.000 rpm y al pellet se le agregaron 100 μl de la sol I (resuspensión) de mini-prep (50 mM de glucosa, 25 mM de Tris-HCL pH 8, 10 mM de EDTA pH 8). Se agitó el tubo suavemente con los dedos hasta lograr su completa resuspensión. A esta suspensión se le colocaron luego 200 μl de sol. II (lísis) de mini-prep (0.2 N de NaOH y 1% de SDS), la cual se agitó suavemente hasta lograr la ruptura de las células (formación de una solución muy densa), y posteriormente se le agregó 150 μl de sol III (neutralización) de mini-prep (5 M de acetato de potasio y ácido acético glacial), con agitación suave nuevamente. A la mezcla obtenida se le agregaron 450 μl de fenol, se agitó por inversión, se centrifugó durante 5 min. a 12.000 rpm y la fase acuosa obtenida fue transferida a un tubo eppendorf nuevo donde se le añadieron 900 μl (2 ½ vol) de etanol absoluto (99.8 %) . Esta fase se dejó precipitar por 1 hora a -20 ºC, se centrifugó por 20 min. a 12.000 rpm, el pellet se lavó con 1 ml etanol al 70 %, se centrifugó 10 min. a 12.000 rpm y se dejó secar a 37 ºC hasta permitir descartar el etanol. El pellet obtenido se resuspendió luego en 30 μl de H2O millipore, se le agregó 1 μl de ARNasa por 1 h a 37ºC con agitación frecuente y se almacenó a 4 ºC. Dos microlitros del producto de la mini-prep fueron corridos en un gel de agarosa al 0.8% a 80 V. Digestión del ADN plasmídico con enzimas de restricción (endonucleasas). 53 Para evaluar la presencia del inserto BCR/ABL dentro del plásmido purificado a partir de los clones seleccionados, se realizó un análisis de restricción. Usualmente, la reacción de digestión contenida en 10 μl estuvo compuesta de: 2 μl del ADN plasmídico purificado, 1 μl de la enzima de restricción Eco RI, 1 μl de Buffer 10X de la enzima y 6 μl de H2O Millipore estéril. Esta reacción se incubó luego a 37 ºC por 2 horas y se colocó en hielo. Los productos de la digestión fueron corridos en un gel de agarosa al 1,5 % junto con un marcador de peso molecular y el plásmido purificado sin digerir. Secuenciación manual y automática de los productos BCR/ABL. Para las reacciones de secuenciación manual y automática se emplearon tanto productos de PCR directos como clones con los insertos correspondientes. Purificación de los productos de la PCR. Los productos de la PCR de cada paciente, fueron corridos en geles de agarosa al 1,5% y las bandas correspondientes a las variantes BCR/ABL fueron cortadas y colocadas en eppendorf de 1,5 ml identificados. Se emplearon dos métodos de purificación: Método A: Purificación por esferas de vidrio BioRad (Willis, E., et al 1990). A cada tubo con el trozo de gel se le agregaron 500 μl de buffer de unión (NaClO4 6M, Tris HCL pH 8 50mM, EDTA 10 mM), se incubó a 37 °C hasta que el gel se disolvió completamente. Luego se le agregaron 4 μl de solución de esferas de vidrio al tubo, se agitó durante 30 min., se centrifugó a 14.000 rpm por 5 min y el pellet fue lavado 3 veces con 100 μl de buffer de unión y centrifugado nuevamente a 14.000 rpm por 5 min. El pellet obtenido fue lavado entonces 5 veces con la solución de lavado (Tris HCl pH 7,5 20 mM, EDTA 2 mM, NaCl 0.4 M, etanol 50%) y centrifugado a 14.000 rpm por 5 min. El sedimento fue resuspendido en 20 μl de agua Millipore, incubado previamente a 37 °C por 5 min., centrifugado a 14.000 rpm. por 2 min. y el sobrenadante obtenido (conteniendo el ADN) fue centrifugado por última vez para eliminar los restos de las esferas de vidrio. Cinco microlitros del producto purificado fueron cuantificados y corridos en un gel de agarosa 1.5% para verificar su cantidad y calidad. 54 Método B: Purificación usando el “kit Wizard® PCR preps DNA purification system” de Promega. Con este método se purificaron los productos de dos formas, a partir de bandas y directamente del producto (ver especificaciones para cada caso). Para la obtención del ADN purificado se emplearon mini-columnas especiales (como especificado en el protocolo del kit) y los productos fueron eluidos en 40 μl de agua millipore. La pureza y calidad del producto fue verificada por cuantificación espectrofotométrica y por visualización directa en gel de agarosa al 1.5%. Los productos purificados por ambos métodos fueron empleados tanto en la secuenciación manual como en la automática. Secuenciación manual. Reacción de secuenciación para los productos de la PCR. Las muestras de los pacientes analizadas mediante secuenciación manual de productos de la PCR fueron las siguientes: 13, 20, 54, 108, 112, 139, 92 y 93. Para la reacción de secuenciación se empleó el “kit SILVER SEQUENCETM DNA Sequencing Reagents” de Promega. Con el valor de la concentración de cada producto purificado, obtenido espectrofotométricamente, se realizaron los cálculos de la cantidad en nanogramos (ng) a usar en cada reacción. Para ello se utilizó la siguiente fórmula de conversión: ng = 120 fmol x 6.6x10-4 x pb del producto Donde 120 fmol equivale a 16 ng de un producto de 200 bp, 6,6x10-4 es el factor de conversión y bp corresponde a los pares de bases que tiene el producto a estudiar. Por cada muestra se prepararon cuatro tubos diferentes identificados con las letras A, C, G, T y a cada uno se le agregó 2 μl de la mezcla de d/ddNTP respectivo y se almacenaron en hielo hasta su uso. Aparte, se prepararon 16 μl de una mezcla que contenía 5 μl de Buffer 5X de secuenciación, 1 μl del cebador antisentido Ca3 (4,5 pmol/μl), la cantidad correspondiente de muestra de acuerdo a los ng calculados previamente y agua Millipore. A esta mezcla se le colocó luego 1 μl de Taq Polimerasa grado secuenciación, se agitó 55 suavemente y se tomaron 4 μl que fueron agregados a cada uno de los tubos almacenados en hielo. Los tubos fueron incubados en un termociclador pre-calentado a 95 ºC y se corrió un programa de temperatura que incluía: 95 ºC por 2 min, luego 60 ciclos a 95 ºC por 30 seg, 42 ºC por 30 seg y 70 ºC por 1 min. Al terminar la corrida se le añadieron a cada tubo 3 μl de solución para detener la reacción. Finalmente, los tubos fueron almacenados a -20 ºC hasta ser analizados en geles de poliacrilamida al 6%. Reacción de secuenciación para los plásmidos. En el caso de los plásmidos se partió de la recomendación de que se deben usar entre 2-4 μg (1-2 pmol) de un plásmido cuyos bp estén en el rango entre 3000 y 5000. Las mezclas de reacción se prepararon igual que las de secuenciación de productos de la PCR. El cebador sentido B2B también fue usado en estas reacciones. Corrida electroforética de las reacciones de secuenciación manual, en geles de poliacrilamida al 6%. La corrida electroforética, de los diferentes productos secuenciados, se realizó en geles de acrilamida al 6%. La acrilamida al 40% se preparó disolviendo 38.96 g de acrilamida + 1.04 g de bisacrilamida (manteniendo una relación 37.5:1) para un volumen final de 100 ml. La solución fue filtrada al vacío usando un filtro millipore de 0.2 μm de diámetros y almacenada a 4 °C. Por su parte, la solución de acrilamida al 6% se preparó tomando 6ml de la solución concentrada al 40% de acrilamida/bisacrilamida, 4 ml del buffer TBE 10X, 16.8 gr de Urea (7M concentración final) y agua bidestilada hasta completar 40 ml. Al momento de preparar los geles se produjo su polimerización agregando 80 µl de APS 20% y de 48 µl de TEMED. El aparato empleado para la preparación y corrida de los geles fue el sistema de electroforesis vertical para geles de secuencia (C.B.F Scientific Cat # EGT-100). Los dos vidrios entre los que se dejó polimerizar el gel fueron tratados bajo condiciones especiales. Uno de ellos fue tratado con solución repelente (Pennzoil) y el otro con solución adherente (Silane, etanol absoluto), en modo de facilitar la separación de los vidrios sin la ruptura del gel. Al vidrio adherente se le colocaron los separadores de 0.4 mm 56 de grosor y para la formación de los bolsillos se usó un peine de bolsillos cuadrados del mismo grosor. El buffer de corrida fue preparado al momento de realizar la corrida. A partir de un buffer TBE 10X se prepararon 1.000 ml a concentración 1X con agua bidestilada. Los productos de cada reacción de secuencia fueron calentados a 70 °C por 2 min. para garantizar su completa desnaturalización y luego fueron colocados en hielo durante 5 min. Previo al cargado de las muestras en el gel, se realizó una pre-corrida a 1.000 V durante 30 min. Las muestras fueron corridas usando primero 2.000 V durante 2 min. (para facilitar que las muestras entraran en el gel) y luego a 1.000 V durante 4 o 7 horas para corridas de secuencias de productos de PCR directamente o secuencias de insertos clonados en plásmidos, respectivamente. La fuente de poder empleada en estos experimentos fue la E-C Apparatus Corporation (EC.4000P-120). Tinción con plata para los geles de secuencia. Una vez finalizada la corrida electroforética, los geles fueron sumergidos en ácido acético glacial al 10 % durante 30 min. con agitación constante para fijar el ADN en el gel. Para la tinción con plata el vidrio fue lavado con agua destilada para eliminar los restos del fijador y luego fue sumergido en la solución de tinción (1 gr de nitrato de plata, 1.5 ml de formaldehído 37% y 1.000 ml de agua bidestilada) por 30 min con agitación constante. Diez minutos antes de finalizar la tinción con plata se preparó la solución de revelado (30 gr de carbonato de sodio, 1.5 ml de formaldehído 37%, 200 μl de tiosulfato de sodio (10 mg/ml) y 1.000 ml de agua bidestilada bien fría). Luego de este tiempo el gel fue lavado 2 veces (para eliminar los excesos de la tinción de plata) con agua destilada por 2 min cada vez. Posteriormente, el gel fue transferido a otra bandeja la cual contenía la solución de revelado. Se agitó constantemente hasta que aparecieron las primeras bandas. Luego la solución de revelado fue descartada y se agregó nueva solución de revelado. Se continuó agitando hasta que aparecieron todas las bandas y luego se le añadió ácido acético al 10 % para detener el proceso de revelado. El gel fue secado y envuelto en papel plástico tipo “envoplast”, escaneado y almacenado para su posterior análisis. 57 Secuenciación automática. Las siguientes muestras de los pacientes: 13, 20, 54, 92, 93, 108, 110, 112, 130, 139, 174, 12434, 11973, 13536, A6, A9, A15, A16, A17, A18 y A19 fueron enviadas para análisis por secuenciación automática. Las cantidades y concentraciones de productos y cebadores sentido y antisentido (CA3-, B2B y BCR-C) fueron preparadas de acuerdo a lo establecido por cada centro de secuenciación automática a los que fueron enviados (CEESAN (Venezuela) y MACROGEN (Corea)). Las secuencias obtenidas fueron comparadas con las secuencias reportadas en la base de datos del “Gene Bank” y alineadas con respecto a las diferentes variantes usando el software presente en la página web http://bio.lundberg.gu.se/. Análisis estadísticos de los datos obtenidos en el diagnóstico molecular. Con los resultados de los 200 pacientes estudiados, que dieron positivos molecularmente para la translocación BCR/ABL, se realizaron los cálculos para la determinación de la frecuencia. Al valor obtenido se le realizó una prueba de bondad de ajuste (Chi Cuadrado/χ) comparada con las frecuencias reportadas en la literatura. Adicionalmente, se calculó la frecuencia de cada una de las variantes y se determinó si existía predominancia de alguna de ellas empleando también una prueba de bondad de ajuste, para ello se usó un modelo nulo donde cada variante era igualmente probable (modelo de distribución uniforme). La frecuencia de las variantes fue a su vez comparada contra los resultados reportados en la literatura, usando para ello la prueba de contraste t de “Student” sobre las frecuencias modificadas por transformación arcoseno (Sokal y Rolf, 1995) y aplicando la corrección de Bonferronni (1995). Por último, se determinó si existía relación de dichas variantes con el sexo y la edad de los pacientes estudiados, y para ello se realizó un análisis de covarianza mediante una regresión logística usando el programa R (R Development Core Team, 2006) en donde los grupos de variantes separados por sexo covarían con la edad. 58 DETECCIÓN DE OTRAS TRANSLOCACIÓNES QUE INDUCEN LEUCEMIA: PANEL DE DIAGNÓSTICO. Dado que se obtuvieron 97 pacientes negativos para BCR/ABL, que evidentemente mostraron síntomas clínicos de alteraciones hematooncológicas, se decidió incluir en este trabajo la estandarización y aplicación de un panel diagnóstico que permitió identificar la presencia de otras translocaciones relacionadas con otros tipos de leucemias. La creación de este panel permitirá a futuro realizar una detección más rápida y efectiva de la presencia de una o varias translocaciones que causan leucemias en un mismo paciente, así como el análisis de un mayor número de muestras. El panel incluyó 7 de las translocaciones más frecuentemente reportadas para varios tipos leucemias (ver tabla III). Estas son: MYH11/CBFβ (INV 16) AML/ETO (8:22) LMA MLL/AF4 (4:11) E2A/PBX-1 (1:19) LLA SIL/TAL1 (TAL1D) TEL/AML (12:21) PML/RARα (15:17) LPA Obtención de la muestra: Alícuotas de ARNs totales de 40 de los 97 pacientes que dieron negativos para BCR/ABL fueron usadas en este ensayo. También se usaron muestras de personas no enfermas (controles), previo consentimiento. 59 RT-PCR convencional: Para la producción de los diferentes ADNc se siguió el protocolo descrito en la sección de diagnóstico molecular (RT-PCR). Algunos de los cebadores empleados para amplificar cada translocación fueron diseñados por el laboratorio de acuerdo a lo reportado en la bibliografía y otros fueron provistos por el Dr. José Luís López (BMS). En todos los casos se utilizó una PCR tipo Nested PCR (se hacen dos PCR y en la segunda se usa el producto de la primera como templado y uno o ambos cebadores cambian) para poder obtener los diferentes amplificados. La mezcla de reacción de la PCR 1 de todas las translocaciones contuvo 6.2 μl de agua ultra pura, 2 μl de dNTP`s 2 mM, 2 μl de buffer M 10X, 1.6 μl de MgCl2 25 mM, 1.5 μl del cebador sentido 10 pmol/ μl, 1.5 μl del cebador antisentido 10 pmol/ μl, 0.2 μl de taq polimerasa y 5 μl de ADNc. Las PCRs se realizaron en el MiniCycler de MJ Research. El programa de temperatura fue el mismo para todas las translocaciones (ver Tabla III). Los productos de PCR de cada translocación fueron corridos en geles de agarosa al 1.5% y se usó siempre un marcador de peso molecular de 100 pares de bases para verificar el tamaño de cada uno. 60 Tabla III. Translocaciones seleccionadas para la producción de paneles de diagnóstico de Leucemias. La secuencia de los cebadores para las diferentes PCRs, así como los programas de temperturas y los productos esperados fueron tomados de pallisgaard y Col. 1998. Translocación Tipo Secuencia de Tamaño Temperatura Tipo de de Cebadores Productos de Annealing Leucemia PCR MYH11/CBFβ (INV 16) Nested MYH11/ CBFβ: PCR 1 1R: TTTGAAGGCTCCCATGATTCTG 2R: AGGTCCCCTTCCAGCTTCTTCT 3R: GAGCTGGATGTTGAGAGTGGAGAT MYH11/ CBFβ: PCR 2 5A: TGGGCTGTCTGGAGTTTGATG 6A: TGAGCGCCTGCATGTTGAC 4A: TCCTCGTCCAGCTGGTCTTG AML/ETO (8:21) 174, 241, 270, 337, 348, 483, 58°C LMA 58°C LMA 58°C LLA 376, 403 pb. 58°C LLA 183 pb 58°C LLA 293, 332 pb. 58°C LLA 393, 338, 427, 58°C LPA 544, 663 pb. AML/ETO: PCR1 Nested 821U: GATGGCACTCTGGTCACTGTG 821U1: TCTCCTATCTCGGGTGAAATGTC 353 pb. AML/ETO: PCR2 821U: TGGCTGGCAATGATGAAAAC 821U1: CGTTGTCGGTGTAAATGAACTG MLL/AF4 (4:11) MLL/AF4: PCR1 Nested 7R: CCGCCTCAGCCACCTACTAC 8R: AGCACTCTCTCCAATGGCAATAGT 10A: GAATTTGAGTGAGTTTTTGAAGATGTATC MLL/AF4: PCR2 9R: GGACCGCCAAGAAAGAAGT 11R: AGCAGATGGAGTCCACAGGATCAG 12A: GTTTTTGGTTTGGGTTACAGAACT E2A/PBX1 E2A /PBX-1: PCR1 (1:19) E1: TTCTCGTCCAGCCCTTCTACC E2: TTTTCCTCTTCTCGCCGTTTCA P: GCCACGCCTTCCGCTAAC Nested E2A /PBX-1: PCR2 317, 204, 318, 272, 159, 273, 317, 186pb. E1: CTACGACGGGGGTCTCCAC E2: AGGTTCCGCTCTCGCACTT P: CATGTTGTCCAGCCGCATCAG SIL/TAL1 SIL/TAL1: PCR1 Nested S: CGACCCCAACGTCCCAGAG T: CGGTCATCCTGGGGCATATTT SIL/TAL1: PCR1 S: CCCGCTCCTACCCTGCAAAC T: AGACCGGCCCCTCTGAATAG TEL/AML TEL/ AML:PCR1 (12:21) T: CACTCCGTGGATTTCAAACAGTC A: AGCCGAGTAGTTTTCATCATTGC Nested TEL/ AML:PCR2 T: CTCATCGGGAAGACCTGGCTTAC A: AGCACGGAGCAGAGGAAGTTG PML/RARα (15:17) PML/ RARα : PCR1 Nested P1: CAAGAAAGCCAGCCCAGAG P2: GTGCGCCAGGTGGTAGCTC R: AAGCCCTTGCAGCCCTCAC PML/ RARα : PCR2 P1: GCCAGTGTACGCCTTCTCCAT P2: CAGCGCGACTACGAGGAGAT R: CCCATAGTGGTAGCCTGAGGAC 464 pb. 61 CITOMETRÍA DE FLUJO La citometría de flujo se ha convertido en una herramienta clave en los diferentes laboratorios clínicos debido a que permite, de una manera rápida y eficiente, identificar la presencia de anomalías en el estado de maduración de las células presentes en una muestra, de acuerdo a la distribución que estas presentan con respecto a su tamaño y complejidad (granularidad). Esta técnica está basada en el uso de anticuerpos monoclonales específicos que reconocen proteínas (antígenos) presentes tanto en la superficie celular, como en el citoplasma y el núcleo de las células analizadas. La determinación de las leucemias por citometría de flujo le ofrece al médico la oportunidad de confirmar el diagnóstico clínico de estas así como su clasificación, lo cual le permite iniciar un tratamiento inmediato y efectivo (el tratamiento varía dependiendo del tipo de leucemia que se diagnostica) antes de tener los resultados definitivos que brinda el diagnóstico molecular. (www.citometriadeflujo.com) En tal sentido, en este trabajo se decidió incluir la evaluación por citometría de flujo de algunos casos de LMC. Para ello, se tomaron 10 muestras de pacientes con diagnóstico clínico de LMC del Banco Municipal de Sangre (BMS) a cargo del Dr. Pedro Sánchez. Este estudio nos permitió evaluar los alcances, ventajas y desventajas que tiene esta técnica con respecto al análisis complementario que ofrece el diagnóstico molecular de la LMC. Determinación de la LMC mediante citometría de flujo usando paneles de anticuerpos monoclonales específicos. En el laboratorio de citometría de flujo del BMS fue posible diagnosticar pacientes con LMC tanto en fases iniciales como en crisis blástica linfoide y mieloide. En efecto, la tabla IV muestra en detalle el panel de anticuerpos monoclonales usados en este estudio. 62 Tabla IV. Panel de anticuerpos monoclonales usados en el laboratorio de citometría de flujo del BMS para el diagnóstico de leucemia. Cada grupo de antígenos CD, tanto de superficie celular como citoplasmático, es usado para identificar una población celular determinada. Panel de Leucemia (LLA LMA LMC) Anticuerpos Monoclonales Anticuerpos Monoclonales de Antígenos de superficie Celular Anti-CD10/CD20/CD19 de Antígenos Citoplasmáticos MPO/CD79α/cCD3/HLA-DR (precursores y blastos de células B y T) (linaje mieloide, linfoideB o T, NK ,LLA linaje T) Anti-CD15/CD34 IgG1/ IgG2/ IgG3 (células madres, blastos, progenitores linfoides) (cél. B maduras,) Anti-DR/CD22 (sup. Cél: B maduras, citopl: pre.B ) Anti-CD13/CD38 (progenit. Tempr. de granulocitos, monocitos ) Anti-CD11c/CD117 (células mieloides inmaduras, monocitos, macrófagos, granulocito, cél. NK, B, T) Anti-CD4/CD8 (Cél. T, monocitos, macrófagos, granulocitos ) Anti-CD14/CD45 (Cél. Hematop., monocit., macrófagos granulocitos) Anti-CD3/CD7 (Cél. Pluripotentes, NK y T) Anti-CD2 (Cél. NK y T) Anti-CD56 (Cél. NK ) Anti-CD33 (precursores mieloides, monocitos) TdT/Cµ (LLA linaje B) Cada anticuerpo monoclonal usado en los estudios de citometría de flujo estuvo conjugado a un fluorocromo específico que podía ser FITC (isocianato de fluoresceína), PerCP (Proteína clorofila peridinina) o PE (ficoeritrina). Estos compuestos son capaces de emitir fluorescencia cuando son expuestos a la luz de un láser, permitiendo así que una vez formado el complejo antígeno-anticuerpo-fluorocromo conjugado, este pudiera ser detectado y analizado por el citómetro. 63 Obtención de la muestra: Las muestras fueron obtenidas a partir de aspirados de médula ósea (MO) y sangre periférica (SP). El procesamiento y análisis de las muestras se realizó el mismo día de su obtención. Procesamiento de las muestras en el citómetro de flujo y su correspondiente análisis. Para cada muestra se tomó el número necesario de tubos de polietileno, los cuales fueron identificados con los códigos que correspondían a cada grupo de anticuerpos monoclonales específicos para el reconocimiento de antígenos de superficie celular o con los códigos que correspondían a cada grupo de anticuerpos monoclonales específicos para el reconocimiento de antígenos citoplasmáticos y controles isotípicos. Posteriormente a cada tubo se le agregaron 5 μl del anticuerpo respectivo y un volumen de la muestra equivalente a una concentración de 500.000 ó 1.000.000 de células por cm3, (a cada muestra se le realizó previamente un conteo hematológico (Coulter Gen-System 2) para determinar el número de leucocitos que contenía) y fueron incubados en oscuridad por 10 min. Luego se les agregó una solución de lisis de la casa comercial DAKO (Uti-lyse), esta lisis comprendía dos etapas, la primera consistía en fijar las células con 100 μl de la sol. A durante 10 min. a temperatura ambiente y en oscuridad, la segunda consistió en lisar los glóbulos rojos presentes en la muestra añadiendo 1 ml de la sol. B bajo las mismas condiciones de incubación. Por último, las muestras fueron centrifugadas a 1.500 rpm por 3 min, lavadas con 1 ml de PBS y resuspendidas en 0.5 μl de PBS antes de ser pasadas por el citómetro de flujo. Los anticuerpos monoclonales utilizados para la caracterización inmunofenotípica de las células se citan en la tabla IV. Las muestras a las que se les realizó la determinación de los antígenos citoplasmáticos fueron tratadas con el kit de permeabilización de la casa comercial DAKO intra-stain. Primero se les agregó 50 μl de la sol. A, para fijar las células, se incubó durante 10 min, se centrifugó igual que en la primera parte, se lavó con PBS, se agregó 50 μl de la sol. B permeabilizante, se agregaron los anticuerpos citoplasmáticos necesarios y se incubó la mezcla durante 20 min. a temperatura ambiente en oscuridad. Posteriormente se lavó con PBS y luego se resuspendió en 64 0,5 ml de PBS para ser pasadas por el citómetro de flujo. Las muestras fueron leídas en un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson & Co. San José USA) y los resultados obtenidos fueron luego analizados usando el sofware Cell Quest. Análisis de los resultados: Los resultados fueron reflejados en forma de gráficas dot-plot, donde cada muestra incluyó un dot-plot de dispersión, que permitió identificar la distribución de la serie blanca de acuerdo al tamaño (FSC) y granularidad de su núcleo y citoplasma (SSC) (ver Fig. 18). En este dot-plot de dispersión o “scattergrama” las poblaciones celulares fueron representadas por agrupaciones homogéneas de puntos donde las células más pequeñas y con menor granularidad, estuvieron ubicadas en la parte inferior de la gráfica (esta posición también es sinónimo de inmadurez celular), mientras que las células de mayor tamaño y con mayor granularidad se ubicaron en la parte superior de la gráfica (esta posición es sinónimo de madurez celular). Teniendo como patrón de referencia el dot-plot de dispersión de una persona en condiciones normales se pudieron identificar los diferentes casos que presentaron alteraciones hematoncológicas. Figura 18. Dot-plot de dispersión de la serie blanca en condiciones de normalidad. En el eje Y está representado el tamaño de las células y en el eje X está representada la granularidad. Los linfocitos se ubican en la parte inferior de la gráfica, los monocitos se ubican en la zona superior intermedia y los granulocitos se distribuyen en la parte superior derecha de la gráfica. Los dibujos ubicados a los lados de cada población reflejan la forma de cada grupo. 65 Adicional al dot-plot de dispersión, los resultados también incluyeron varios dot-plot de fluorescencia, los cuales podían ser de fluorescencia Antígeno-Antígeno (Ag-Ag) o de fluorescencia mixta (SSC-Ag). Los primeros permitieron medir la intensidad de la expresión de diferentes antígenos enfrentados dentro de una población determinada y los segundos permitieron identificar las poblaciones celulares positivas para cada antígeno estudiado (ver Fig. 19 y 20). La figura 19 muestra el esquema explicativo del análisis de los dot-plot de fluorescencia Ag-Ag: A= Células que co-expresan ambos Ag con una alta intensidad. B= Células que expresan ambos Ag pero con intensidad media para ambos (B) o para cada uno de ellos (B2-B3). C= Células que expresan un solo Ag con alta intensidad. D= Células que expresan un solo Ag con intensidad media. E= Células que no expresan ninguno de los Ag. F= Expresión Heterogénea. Células que van desde la no expresión de un Ag, pasando por células con expresión débil, hasta células que presentan una expresión fuerte. Por su parte el dot-plot Ag-Ag, en la misma fig. 19, muestra un ejemplo de una población celular enfrentada a un grupode anticuerpos (CD3 y CD9) donde se puede observar algunos de los casos explicados en el esquema. Figura 19. Esquema de los posibles casos que se pueden presentar a la hora del análisis de resultados en los dot-plot de fluoresecencia Ag-Ag o mixto. El esquema evidencia la intensidad de las diferentes poblaciones estudiadas. El dot-plot Ag-Ag muestra el reconocimiento de la muestra a los Ac. CD3 y CD9. 66 Por último, la figura 20 muestra un ejemplo representativo de un dot-plot de fluorescencia mixto que permitió la interpretación de este tipo de gráficos en los resultados obtenidos. Esta gráfica ubica en el eje Y la característica de dispersión que permite observar tanto las poblaciones celulares que se forman en la región seleccionada como su grado de complejidad e inmadurez, es decir, en la parte inferior de la gráfica se ubicaron las poblaciones menos complejas e inmaduras mientras que en la parte superior se ubicaron las más complejas y con diferentes grados de madures. En el eje X de la gráfica se ubica un Ac (anticuerpo) conjugado con un fluorocromo específico que permite identificar de izquierda a derecha la intensidad de expresión del Ag estudiado (expresión nula, intermedia y alta respectivamente). En resumen, este gráfico es el que permite hacer una selección (por agrupación celular y por su ubicación en la gráfica) de las células que expresan un Ag determinado. Como se puede observar en el ejemplo se formaron 5 poblaciones celulares, tres en el lado inferior (denotando inmadurez con esta posición) y 2 en el lado superior (demostrando un grado de inmadurez menor), cuando estas fueron enfrentadas al Ac CD4 se encontró que la población roja presentó una alta e intensa expresión del Ag CD4, mientras que las poblaciones verdes, azules y amarillas presentaron una expresión intermedia para este Ag y por último se observaron las poblaciones violetas quienes presentaron una expresión de nula a débil del Ag. Figura 20. Dot-plot de fluorescencia mixto. En el eje Y se ubicó la característica de granularidad y en el eje X se ubicó la característica de Ag. Cada color identificó una población celular. 67 Además de los diferentes dot-plots, el citómetro también mostró una división en cuadrantes de cada gráfica obtenida (ver Fig. 21). Dicha división permitió hacer una precisa separación de las diferentes poblaciones celulares formadas (analizada por el eje Y), por cuadrante, y además fue capaz de arrojar una valoración en porcentaje de las variaciones en la intensidad de expresión de los antígenos estudiados. El cuadrante posee un punto medio que fue siempre colocado de tal manera que las diferentes poblaciones formadas quedaron incluidas dentro de éste. Cada sección del cuadrante (SI, SD, II y ID) indicó el grado de positividad o negatividad que mostró cada población para la expresión de un antígeno estudiado, así tenemos que en el dot-plot mixto que presenta la figura 21, el antígeno analizado en el eje X mostró una expresión heterogénea de dicho anticuerpo entre las poblaciones ubicadas hacia la parte inferior de la gráfica y que la población ubicada más a la derecha (cuadrante ID) presentó una alta intensidad de expresión del antígeno en cuestión. Figura 21. Dot-plot de fluorescencia mixto representativo de la separación en cuadrante (líneas verdes) de las poblaciones celulares y valoración en porcentajes de la intensidad de expresión del Ag analizado. SI corresponde a la porción superior izquierda del cuadrante donde Y es positivo y X es negativo para las variables estudiadas, SD corresponde a la porción superior derecha del cuadrante donde Y y X son positivos, II corresponde a la porción inferior izquierda del cuadrante donde Y y X son negativos y ID corresponde a la porción inferior derecha del cuadrante donde Y es negativo y X es positivo. Sin embargo, cuando el análisis con cuadrantes se realiza sobre un dot-plot de fluorescencia Ag-Ag, la expresión y valoración estadística para cada cuadrante cambia. Por lo tanto, el antígeno ubicado en el eje Y tuvo una expresión con valor estadístico solo cuando su marcaje estuvo incluido dentro de los cuadrantes SI y SD, pero no así para los cuadrantes II e 68 ID. En el caso del antígeno ubicado en el eje X, este tuvo una expresión con valor estadístico solo cuando su marcaje estuvo incluido dentro de los cuadrantes SD e ID, más no así para los cuadrantes SI e II (ver Fig. 22). Figura 22. Dot-plot de fluorescencia Ag-Ag representativo de la separación en cuadrante (líneas verdes) del enfrentamiento de dos antígenos y la valoración de sus expresiones en porcentajes. SI corresponde a la porción superior izquierda del cuadrante donde Y es positivo y X es negativo para las variables estudiadas, SD corresponde a la porción superior derecha del cuadrante donde Y y X son positivos, II corresponde a la porción inferior izquierda del cuadrante donde Y y X son negativos, ID corresponde a la porción inferior derecha del cuadrante donde Y es negativo y X es positivo. 69 FACTORES IMPLICADOS EN LA RESISTENCIA AL TRATAMIENTO DE LA LMC CON IMATINIB En vista de que el tratamiento con Imatinib es indispensable para la supervivencia de los pacientes con LMC y que nuestro país no escapa de los casos de pacientes que se han hecho resistentes al tratamiento con este fármaco, se decidió investigar como último objetivo de esta tesis cual de los tres factores reportados en la bibliografía podrían estar provocando la resistencia en nuestros pacientes. Es importante destacar que, aunque la resistencia al tratamiento con Imatinib es observada principalmente en pacientes en crisis blástica, en este trabajo se decidió incluir todas las fases de esta enfermedad debido a que éste es pionero en nuestro país y se quería investigar si lo reportado en la bibliografía también se cumplía para los pacientes venezolanos. Además, es importante mencionar que de los tres factores implicados en el mecanismo de resistencia a Imatinib, nosotros estudiamos dos de ellos (modificación de la expresión génica y mutaciones en el dominio TK) en el centro piloto de la USB, mientras que el tercero (cuantificación de la quimera BCR/ABL por PCR en tiempo Real) ya estaba siendo realizado por el Dr. José Luís López en el BMS en el inicio de estos experimentos. Los resultados de los tres factores fueron usados en las comparaciones y discusiones posteriores. MODIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POR BCR/ABL. Dado que ha sido ampliamente reportada la participación de la quimera BCR/ABL en la modificación de la expresión de un gran número de genes que participan en diferentes vías de señalización celular, como mecanismo de resistencia al tratamiento con Imatinib, se quiso determinar si en pacientes venezolanos positivos para BCR/ABL el mecanismo de resistencia a imatinib era causado por alteración en la expresión de algunos genes sospechosos de sufrir tales modificaciones (Hofmann y Col. 2002; Salesse y Verfaillie 2003; Dvorak y Col. 2003; Dai y Col. 2004; Radich y Col. 2006). 70 Obtención de la muestra: A tal fin, se seleccionaron 23 pacientes positivos para BCR/ABL, los cuales dieron su consentimiento para ser usados en el estudio. Ocho de ellos se encontraban en la fase crónica de la enfermedad, 8 estaban en fase acelerada y 7 presentaban la fase de crisis blástica al momento de tomar las muestras. Como controles normales se escogieron 11 personas al azar que fuesen negativos al hacerles la detección molecular de la translocación BCR/ABL. Selección de genes a ser estudiados: Para la selección de los genes a ser analizados se hizo una búsqueda exhaustiva en la bibliografía más reciente, tomando en cuenta: 1) el tipo de estudio realizado (microarreglos, real-time PCR, etc), 2) importancia de los genes en las diferentes vías de señalización que son afectadas por la proteína BCR/ABL, 3) la frecuencia con la que aparecían reportados en la bibliografía (Dai y Col. 2004; Rodriguez y Col. 2004; Contri y Col. 2005; Jing y Col. 2005), y 4) como era afectada su expresión (aumenta o disminuye). Los genes seleccionados a ser evaluados mediante Real-Time PCR fueron: Lyn y AKAP 12 como genes problema y GAPDH como gen control. El diseño de los diferentes cebadores se hizo empleando el programa Primer3. Las secuencias de los diferentes cebadores para cada gen fueron enviadas a sintetizar a “OPERON molecules for life” (ver Tabla V). Tabla V. Genes seleccionados para los estudios de expresión génica en pacientes positivos para el oncogen BCR/ABL (Deininger y Col. 2000). Temp. Genes Secuencia GAPDH up CATCAAGAAGGTGGTGAA GAPDH down GGGTCTTACTCCTTGGAG AKAP 12 up CAGGATGGGGAAGCTGAA Tamaño “Annealing” Modificación de la expresión 243 bp 55 °C No cambia 264 bp 60 °C Disminuye AKAP 12 down GGTATCCACCTTGCGCTT Aumenta Lyn up ACTGCCCAGATGAGCTCT Lyn down AAGTGCAACCAGTGATGG 218 bp 71 55 °C Tratamiento del ARN total con ADNasa: Las 34 muestras de ARN total fueron tratadas con el kit RQ1 RNase-Free Dnase de Promega. Para una mezcla típica de reacción de 10 μl se usó 1U de enzima por 1 μg de ARN, 1 μl de buffer RQ1 10X y se completó hasta 10 μl con agua libre de nucleasa. La mezcla fue incubada durante 20 min. a 37 °C y luego la enzima fue inactivada por una incubación a 75 °C por 10 min. Posterior a este tratamiento, las muestras fueron tratadas con 1 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamil, agitadas por inversión y centrifugadas a 14.000 rpm. por 5 min. Los volúmenes obtenidos fueron entonces mezclados con 2½ volúmenes de isopropanol, incubados a -20 °C por 1 h, centrifugados a 14.000 rpm por 15 min., lavados 3 veces con etanol 75%, resuspendidos en 40 μl de agua pura con DEPC y almacenados (en alícuotas de 10 μl) a -80°C. La integridad y cantidad del ARN fue visualizada por la corrida del mismo en geles de agarosa al 1% y por cuantificación espectrofotométrica. Debido a la gran sensibilidad del sistema empleado, la integridad del ARN fue indispensable en la obtención de resultados confiables. Aislamiento de ARN mensajero: Para obtener los ARNm a partir de los ARN totales de las diferentes muestras se utilizó el kit “PolyATract mRNA system” de Promega. Para ello, se empleó el protocolo de extracción de pequeña escala, donde se colocó de 0.1 a 1 mg de ARNt en un eppendorf estéril y se completó con agua millipore tratada previamente con DEPC hasta 500 μl. Esta suspensión fue luego calentada a 65 °C por 10 min. y entonces se le agregó 3 μl del oligo dT Biotinilado, 3 μl 72 de SSC 20X, se mezcló gentilmente y se incubó a temperatura ambiente hasta que la solución estuvo completamente fría. Mientras se daba el proceso de enfriamiento se prepararon las soluciones stock de 0.5X (30 μl SSC 20X + 1.170 ml de agua Millipore) y 0.1X de SSC (7 μl SSC 20X + 1.393 agua millipore). Adicionalmente se hizo el lavado de las partículas paramagnéticas-streptavidina (SA-PMPs) proporcionadas por el kit, empleando SSC 0.5 X y capturando las partículas con el porta eppendorf magnético. Las SA-PMPs fueron finalmente resuspendidas en 100 μl de SSC 0.5 X, quedando así listas para ser usadas en la captura del ARNm unido al oligo biotinilado. El proceso de captura se llevó a cabo mezclando la reacción de hibridación (ARNmBiotina) con las SA-PMPs lavadas, se incubó a temperatura ambiente por 10 min y luego se hizo la captura de los híbridos ARNm-Biot.-SA-PMPs usando el porta eppendorf magnético. Se realizaron 4 lavados con SSC 0.1X y finalmente el sedimento fue resuspendido en dos tandas con 100 μl y 150 μl de agua millipore tratada con DEPC respectivamente, lo cual permitió el desprendimiento del complejo Biot.-SA-PMPs de las moléculas de ARNm. RT-PCR convencional: Los ARN mensajeros de las 34 muestras fueron usados para producir varias alícuotas por duplicado de ADNc. Un duplicado fue usado en las PCR convencionales y el otro fue almacenado, al igual que el ARNm para ser usado en la técnica de RTQ-PCR en tiempo real. Se realizaron tres tipos de PCR convencionales, (1) la correspondiente a la demostración de la pureza de los ARNm, (2) la correspondiente a la verificación de si los pacientes eran positivos para el oncogen BCR/ABL y por último, (3) la correspondiente a la verificación de la funcionalidad de los cebadores diseñados para cada gen a usar. En el primer y segundo caso el programa de temperatura empleado fue el mismo que se utilizó en la sección de diagnóstico molecular (RT-PCR) usando el MiniCycler de MJ Research. En el tercer caso se usaron 2 programas de temperatura puesto que no todos los genes amplificaron bajo un mismo programa. El primer programa, usado para amplificar los genes GAPDH y LYN contó con un ciclo de 94 ºC 5 min., 35 ciclos de: 94 ºC 30 seg., 55 ºC 30 seg., 72 ºC 30 seg., un ciclo 73 de 72 ºC 10 min. y un ciclo de 4 ºC 5 min. El segundo programa, que permitió amplificar a AKAP 12 contó con un ciclo de 95 °C 5 min. 35 ciclos de: 94 ºC 30 seg., 60 ºC 30 seg., 72 ºC 30 seg., un ciclo de 72 ºC 10 min. y un ciclo de 4 ºC 5 min., usando el MiniCycler de MJ Research. Es importante mencionar que la amplificación de GAPDH en ambos programas fue determinante porque este gen fue usado como gen de referencia. Por último, todos los programas de temperatura fueron luego adaptados al “light cycler”. Los productos de PCR obtenidos fueron corridos en geles de agarosa al 1.5% para verificar la presencia de bandas específicas en la amplificación de cada producto. RT-PCR en Tiempo Real: Para preparar la reacción de RT-PCR en Tiempo Real se usó el kit LightCycler® RNA Master SYBR Green I de Roche. En una reacción típica de 20 μl se utilizó Mn(OAc)2 a una concentración final de 3.25 mM, cebadores sentido y antisentido a una concentración de 0.3 μM para cada gen, ARNmaster SYBR Green I a 1X de concentración y agua Millipore. Las pre-mezclas de reacción fueron hechas de acuerdo al gen a amplificar y a la cantidad de muestra a procesar. El gen control GAPDH siempre fue montado en paralelo con los genes en estudio, así como el control negativo de la reacción (agua). Cantidades de 12,8 μl de la premezcla fueron colocadas en capilares especiales, por separado, luego se colocó la cantidad de agua correspondiente a cada tubo y por último fueron agregadas cada una de las muestras. Como no se pudo obtener una concentración inicial exacta de las muestras se colocó siempre la misma cantidad de muestra para cada gen. Los capilares fueron luego tapados herméticamente y centrifugados al mínimo de velocidad y tiempo que permitió la mini centrífuga. Todos los capilares fueron introducidos con mucho cuidado y en estricto orden ascendente, en un carril empleado para tal fin y éste, a su vez, fue ensamblado en el termociclador antes de que el equipo fuese cerrado herméticamente. Los programas de temperatura, tiempos, identificación de cada muestra y almacenamiento de datos, fueron digitalizados en el computador antes de iniciar cada amplificación. Adicionalmente, se 74 programó el equipo para que al final de las reacciones realizara una curva de temperatura de fusión para todas las muestras. Análisis de datos: Cuantificación relativa sin curva estándar: La cuantificación relativa se basa en la suposición de que la relación entre la concentración de dos genes es equivalente a la relación entre la fluorescencia producida por ellos, y por lo tanto también a la relación entre los puntos de cruce. El punto de cruce para cada curva fue determinado como el número de ciclos en el cual la segunda derivada de la curva se hace máxima (se usó el método de la segunda derivada). Esto quiere decir que la relación entre la concentración del gen y el punto de cruce es inversa, es decir, que a mayor punto de cruce (o número de ciclos) menor será la expresión del gen. A partir de las gráficas obtenidas de la PCR en tiempo real para cada gen se obtuvieron los puntos de cruce de cada una de las muestras. Con estos datos se calculó una relación de la expresión (Ratio= R) entre el gen problema (Lyn o AKAP12) y el gen GAPDH para cada una de las muestras (normal y enfermo), lo que permitió normalizar este valor para cada gen: R = punto de cruce gen problema punto de cruce gen GAPDH El R de cada uno de los enfermos fue luego dividido entre la media del R para los normales: Ri enfermo______ Media de Rnormal El valor obtenido de esta ecuación reflejó el aumento o disminución de la expresión de un gen en particular por paciente. Análisis Estadístico: 75 Con los resultados obtenidos se realizó una comparación múltiple de medias de la relación entre los genes problemas y el gen GAPDH siguiendo el método de Pfaff (2001). DETECCIÓN DE MUTACIONES PUNTUALES EN EL DOMINIO TIROSINAQUINASA DE LA QUIMERA BCR/ABL. La presencia de mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa (dominio TK) de la proteína híbrida BCR/ABL, también ha sido ampliamente reportada en pacientes con LMC que se han vuelto resistentes al tratamiento con imatinib, principalmente en aquellos que se encuentran en la fase de crisis blástica de la enfermedad (Hoover, y Col. 2002; Melo y Col. 2003; Wolff, y Col. 2005; Talpaz y Col. 2006). Con el objetivo de demostrar, si la presencia de estas mutaciones en nuestros pacientes es lo que pudiera estar causando la resistencia al tratamiento con Imatinib, se procedió a realizar la identificación de las mismas. Obtención de la muestra: Los mismos 23 pacientes positivos para BCR/ABL usados tanto en los estudios de expresión génica como en la cuantificación de la quimera BCR/ABL fueron usados en esta sección. De estos pacientes 8 se encontraban en la fase crónica, 8 estaban en fase acelerada y 7 presentaban la fase de crísis blástica. Los controles normales fueron los mismos de la sección anterior. RT-PCR: A partir de las alícuotas de ARNt se construyeron los ADNc a ser empleados en el proceso de amplificación. Los protocolos de retro-transcripción y PCR fueron los mismos que 76 se emplearon en la sección de diagnóstico molecular. Para estar seguros de que el dominio TK amplificado en las muestras correspondía a células que expresaban la quimera BCR/ABL y no al ABL de alguna célula sana que pudieran tener estas, se realizaron 2 PCRs (tipo nested) en las que se usaron los cebadores B2B, ABL-R6 y ABL-F4 (ver tabla VI). En ambas PCRs se usó el mismo programa de temperatura, el cual consistió en: un ciclo de 94 ºC 1 min., 35 ciclos de: 94 ºC 1 min., 48 ºC 1 min., 72 ºC 1 min., un ciclo de 72 ºC 10 min Tabla VI. Secuencia de cebadores usados para la amplificación de la quimera BCR/ABL y del dominioTK en pacientes con LMC. Los tamaños esperados para cada producto, así como la temperatura de “annealing” fueron tomados de Branford y Col. 2002. Tipo de estudio Translocación Secuencia de Cebadores Tamaño Temperatura del Producto de Annealing 1.200 pb 48°C 565 pb 48°C BCR/ABL+ DTK B2B: ACAGAATTCGCTGACCATCAATAAG ABL-R6: AGAACTTGTTGTAGGCCAG Dominio tirosina quinasa (DTK) ABL-F4: TCCCCCAACTACGACAA ABL-R6: AGAACTTGTTGTAGGCCAG En la PCR1 se amplificó un producto de 1.200 pb contentivo del punto de fusión BCR/ABL y del dominio TK, mientras que en la PCR2, la cual usó como templado 2μl del producto de la PCR1, se amplificó un producto de 565 pb correspondiente solo al dominio TK (ver Fig. 23). gcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtca ctgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagt tacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggag cagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgacc aactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagaa gcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgt tggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgtt 77 gcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaag ctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggc caaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctgg taccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggc agcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatac gaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcc tccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgac gggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggt gtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatgaagcacaag ctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcgtgtggaagaaatacagcctgacg gtggccgtgaagaccttgaaggaggacaccatggaggtggaagagttcttgaaagaagct gcagtcatgaaagagatcaaacaccctaacctggtgcagctccttggggtctgcacccgg gagcccccgttctatatcatcactgagttcatgacctacgggaacctcctggactacctg agggagtgcaaccggcaggaggtgaacgccgtggtgctgctgtacatggccactcagatc tcgtcagccatggagtacctggagaagaaaaacttcatccacagagatcttgctgcccga aactgcctggtaggggagaaccacttggtgaaggtagctgattttggcctgagcaggttg atgacaggggacacctacacagcccatgctggagccaagttccccatcaaatggactgca cccgagagcctggcctacaacaagttctccatcaagtccgacgtctgggcatttggagta ttgctttgggaaattgctacctatggcatgtccccttacccgggaattgacctgtcccag gtgtatgagctgctagagaaggactaccgcatggagcgcccagaaggctgcccagagaag gtctatgaactcatgcgagcatgttggcagtggaatccctctgaccggccctcctttgct gaaatccaccaagcctttgaaacaatgttccaggaatccagtatctcagacgaagtggaa Figura 23. Secuencia del híbrido BCR/ABL identificando el punto de fusión y el dominio tirosina – quinasa. En violeta, amarillo y verde se señalan las secuencias donde se unen los cebadores. La línea vertical muestra el punto de fusión BCR/ABL. El fondo azul claro corresponde a la zona amplificada en la PCR 1 (BCR/ABL+DTK: 1.200 pb). El mismo fondo pero con las letras color naranja corresponde a la zona amplificada en la PCR 2 (DTK: 565 pb). La zona con fondo gris identifica el bolsillo de unión al ATP del dominio TK. La zona con fondo azul oscuro identifica el loop catalítico del dominio TK. La zona subrayada en negro corresponde al loop de activación del dominio TK. La figura 23 muestra los diferentes juegos de cebadores usados en esta sección que permitieron amplificar el dominio TK del híbrido (secuencias amarilla y verde). También se resaltan las tres zonas de este dominio sensibles a mutaciones puntuales (secuencias en gris, azul oscuro y subrayado). Los productos obtenidos en las PCRs 1 y 2 fueron analizados (6 μl) en geles de agarosa al 1.5% utilizando como buffer de corrida TAE 1X (Tris Base 2M, Ácido Acético Glacial 5,71%, EDTA 0,05 M pH 8). La corrida electroforética se llevó a cabo en una cámara horizontal “Easy CastTM” con un voltaje de 100 V y tiempo de corrida de 20 min. La visualización de las bandas se hizo empleando un transiluminador de luz ultravioleta DyNA Light Dual Intensity UV Transiluminator. Los geles fueron fotografiados en un equipo Gel Doc 2000TM “Gel Documentation System”, PC, 220-240 V y analizados por el uso del software Quantity One 4.2.1 de Biorad. 78 Purificación de los productos de la PCR. Los productos de la PCR 2 (dominioTK) fueron corridos en geles de agarosa de bajo punto de fusión (Promega) al 2.5 % y las bandas con el tamaño esperado fueron cortadas y colocadas en eppendorf de 1.5 ml identificados. El método de purificación empleado fue el “kit Wizard® PCR preps DNA purification system” y se siguió el mismo protocolo especificado en la sección de diagnóstico molecular. Secuenciación automática. Las muestras purificadas fueron enviadas para análisis por secuenciación automática. Las cantidades y concentraciones de productos y cebadores (sentido ABL-F4 y antisentido ABL-R6) fueron preparadas de acuerdo a lo establecido por el centro de secuenciación automática CEESAN. Las secuencias obtenidas fueron comparadas con respecto a la secuencia reportada para este dominio en la base de datos del “Gene Bank” y adicionalmente fueron alineadas usando el software presente en la página web http://bio.lundberg.gu.se/ 79 RESULTADOS DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BCR/ABL Con el objeto de confirmar no solo la presencia del oncogen BCR/ABL en los pacientes venezolanos con LMC, sino además de poder establecer la presencia de las diferentes variantes que han sido reportadas en la literatura, se estandarizaron los protocolos para el diagnóstico molecular de la translocación 9:22, lo cual implicó amplificar por PCR, clonar y secuenciar las muestras de los pacientes que resultaron positivos para esta translocación. Extracción de ARN total. Los dos métodos empleados en el laboratorio de genética molecular humana para la estandarización de la extracción del ARN total a partir de sangre periférica (SP) o médula ósea (MO) dieron resultados muy satisfactorios, debido a que, en ambos casos, se pudo obtener un ARN total de buena calidad y concentración. Es importante mencionar que en el caso particular de la extracción de ARN total a partir de MO, no fue necesario hacer ninguna variación en el protocolo gracias a que el uso del gradiente con Ficoll, para la obtención de células mononucleares, permitió la eliminación de espículas y restos de grasas provenientes de este tipo de muestra. Extracción de ARN total. Protocolo A (Chomczynski y Sacchi, 1986). De los 297 pacientes a los que se les hizo extracción de ARNt, 50 fueron procesados usando el método descrito por Chomczynski y Sacchi (1986), el cual fue modificado en el laboratorio. Este método permitió hacer una purificación óptima del ARNt tanto de médula ósea (MO) como de sangre periférica (SP) en los pacientes estudiados. La integridad y abundancia del ARNt extraído fue evidenciado tanto por la ubicación de las bandas respectivas en el gel, como por su separación e intensidad. En efecto, en la figura 23 se observan las dos bandas más resaltantes de las extracciones del ARNt de los pacientes, correspondientes a los ARNs ribosomales (ARNr) 28S y 18S y la banda más débil ubicada 80 en la parte inferior del gel corresponde al ARNr 5S. Es posible apreciar que entre los ARNr 28S y 18S se encuentra una región que corresponde a la mayor proporción de ARN mensajeros (ARNm), obtenido durante el proceso de extracción. Cabe destacar que durante el proceso de extracción del ARNt también fue posible encontrar que en algunos casos, la cantidad de ARNt obtenida fue baja, como se puede apreciar en el caso de la muestra del paciente 108 (figura 24/ carril 1), sin embargo esto no afectó los posteriores análisis realizados sobre las muestras. Aún en los casos de muestras que presentaron una degradación parcial, fue posible realizar los ensayos posteriores por PCR, ya que los fragmentos amplificados se encontraban delimitados en un promedio de tamaño comprendido entre 300/820 pb. Por otra parte, también fue posible encontrar que en algunos casos las extracciones obtenidas contenían abundante cantidad de ARNt, esto debido a la cuantiosa cantidad de células inmaduras presentes en muchos de los pacientes analizados, observadas durante el desarrollo del protocolo de extracción, como por ejemplo el caso de los pacientes 19 y 20 (figura 24/ carriles 4 y 5), que resultaron diagnosticados como positivos para BCR/ABL. Para estos casos de presencia abundante de ARNt, se procedió a la preparación de las diluciones respectivas, en modo de evitar que las reacciones de amplificación posteriores se vieran inhibidas por exceso de muestra. 108 mo 112 mo 13 sp 19 sp 20 mo 28 S ARNm 18 S 5S 1 2 3 4 5 Figura 24. Extracción de ARNt. Los ARNt extraídos de los pacientes 108, 112, 13, 19 y 20 fueron corridos en geles de agarosa al 1%. Los carriles 1, 2 y 5 corresponden a ARNt obtenidos a partir de médula ósea (mo) y los carriles 3 y 4 corresponden a ARNt obtenidos a partir de sangre periférica (sp). Los ARNr de mayor abundancia (28S, 16S y 5S), así como la distribución de los ARNm son indicados en la figura. 81 Extracción de ARN total. Protocolo B (Usando Trizol). Del total de 297 muestras analizadas, 247 ARNt fueron obtenidos usando el reactivo Trizol (Invitrogen), tal como lo señala el protocolo original de la casa comercial. En la figura 25 se muestra la corrida en geles de agarosa de los ARN’s de los pacientes 25, 42, 43, 54, 69 y 70. Como se puede observar, las muestras presentaron variación en la concentración del ARNt, identificándose, al igual que en el primer protocolo, los diferentes tipos de ARN ribosomal y mensajero. En este caso tampoco se observaron indicios de degradación en estas muestras y aunque algunas presentaron una baja concentración (Paciente 42 y 69), estas pudieron ser usadas en los experimentos de retro-transcripción y amplificación por PCR sin ningún tipo de contratiempo. Los datos obtenidos en la cuantificación espectrofotométrica de las muestras, empleando ambos métodos de extracción, revelaron que la mayoría de ellas presentaron valores ubicados en el rango entre 1.8 y 2.0 en la relación OD260/ OD280, indicando un buen grado de pureza en todas las muestras producidas en ambos tipos de protocolos. Es importante resaltar que los dos tipos de muestras (sangre periférica y médula ósea) usadas en las dos técnicas de extracción dieron un buen rendimiento indiferentemente de su procedencia, siendo el factor preponderante para una mayor cantidad obtenida, el número de células iniciales sobre las cuales se hizo la extracción. Como ya se indicó con anterioridad, visualmente fue posible predecir un mayor rendimiento en la cantidad obtenida, por simple observación de un mayor número de células durante el procesamiento de las muestras. Por último, debemos mencionar que lograr obtener un ARN total puro e íntegro fue un paso fundamental en este trabajo, el cual garantizó la obtención de resultados confiables en las técnicas posteriores en las que éste fue usado. Un ARN puro es de vital importancia si se toma en consideración que en técnicas como la RT-PCR convencional y la RT-PCR en Tiempo Real cualquier contaminante puede influir significativamente en la actividad de las enzimas involucradas en las diferentes reacciones, así como también en la función de algún otro compuesto. 82 25 42 43 54 69 70 mo mo sp sp mo mo 28 S ARNm 18 S 5S 1 2 3 4 5 6 Figura 25. Extracción de ARNt con Trizol. Los ARNt extraídos de los pacientes 25, 42, 43, 54, 69 y 70 fueron corridos en geles de agarosa al 1%. Los carriles 1, 2, 5 y 6 corresponden a ARNt extraídos a partir de médula ósea (mo) y los carriles 3 y 4 corresponden a ARNt obtenidos a partir de sangre periférica (sp). Los ARNr de mayor abundancia (28S, 16S y 5S), así como la distribución de los ARNm son indicados en la figura. Determinación de la translocaciòn BCR/ABL por transcripción inversa a partir de ARNt y su posterior amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (RTPCR). De las 297 muestras de pacientes a las que se les realizó RT-PCR, 200 (67.3%) resultaron positivas y 97 (32.7%) resultaron negativas para el oncogen BCR/ABL. Del total de 200 pacientes positivos obtenidos se determinó que 87/200 (43.5%) mostraron solo la variante b2a2, 79/200 (39.5%) presentaron solo la variante b3a2 y 7/200 (3.5%) mostraron la variante e1a2. Del restante grupo de pacientes, 25/200 (12.5%) y 2/200 (1%) presentaron simultáneamente en co-expresión las variantes b2a2/b3a2 y b2a2/e1a2, respectivamente (ver Tabla VII). En todas las PCR realizadas para cada paciente fue amplificado simultáneamente un control positivo interno (el gen BCR), en modo de verificar la ausencia de falsos negativos. En algunos de los análisis realizados sobre las muestras de los pacientes LMC, no se obtuvo amplificación de este control interno. Curiosamente estas muestras fundamentalmente correspondieron a pacientes LMC con abundante cantidad de células inmaduras (observadas durante la obtención de la muestra (mo/sp) y extracción del ARNt), sobre las cuales se demostró por PCR ser positivas para la quimera BCR/ABL. Para este resultado inesperado de la amplificación del control interno (BCR) no encontramos una 83 explicación, ya que durante la translocación que ocurre en la célula inmadura, esta mutación se presenta tan solo en uno de los alelos, quedando el otro alelo con la posibilidad de permitir la amplificación del control positivo, en este caso el gen BCR. Tabla VII. Cuadro resumen de los 200/297 pacientes LMC positivos para la translocación BCR/ABL y sus respectivas variantes obtenidas. Variantes BCR/ABL N° de pacientes b2a2 87 (43.5%) b3a2 79 (39.5%) e1a2 7 (3.5%) b2a2/b3a2 25 (12.5%) b2a2/e1a2 2 (1%) Total 200 (100%) La figura 26 muestra el resultado molecular obtenido por RT-PCR de algunas de las diferentes variantes de la translocación BCR/ABL encontradas en algunos pacientes sospechosos clínicamente de LMC. Los diferentes tamaños de bandas producidos por PCR que se pueden apreciar en el gel de agarosa, corresponden a los 3 únicos tipos de variantes que fueron obtenidas en este estudio. A través de la combinación de diferentes cebadores específicos fue posible detectar estas variantes. En el caso de las variantes b2a2 y b3a2, el uso de los cebadores B2B (sentido) y CA3 (antisentido) (ver metodología) permitió su detección, ya sea en forma individual (carriles 1 y 2, variante b2a2 (310 bp) y carril 3 variante b3a2 (380 bp)), o en forma de múltiples variantes expresándose simultáneamente en un mismo paciente (carril 4, variantes b2a2 y b3a2). Por otra parte, la variante e1a2 (480 bp, carriles 5 y 6) fue determinada usando los cebadores BCR-C (sentido) y CA3 (antisentido). 84 Durante todas las amplificaciones realizadas por PCR para la determinación de las variantes en estudio, fue realizado en paralelo la amplificación de un control interno el cual nos permitió determinar cuando podríamos estar en presencia de falsos negativos, tal como se explicó en el segundo párrafo de esta sección. El carril 7 de la figura 26, muestra la amplificación positiva del control interno (BCR) de 808 pb del paciente 20, el cual a su vez resultó positivo para la variante b2a2. M 1 112 2 20 3 174 4 5 6 110 12434 12902 7 8 20 800 bp BCR (Control Interno) (808 pb) 500 bp BCRABL (e1a2) (480 pb) BCRABL (b3a2) (380 pb) 300 bp BCRABL (b2a2) (310 pb) Figura 26. Amplificación por RT-PCR de las diversas variantes de BCR-ABL. Las muestras amplificadas de los pacientes 112, 20, 174, 110, 12434 y 12902 fueron corridas en un gel de agarosa al 1.5%. Los carriles 1 y 2 muestran el producto de amplificación para la variante b2a2 (310 bp), el carril 3 muestra la variante b3a2 (380 bp), el carril 4 muestra la co-expresión de las variantes b2a2 y b3a2, los carriles 5 y 6 muestran la variante e1a2 (480 bp), el carril 7 muestra la amplificación del control interno BCR (808 bp) y el carril 8 muestra el control negativo de reacción. M corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp. Clonación de productos de PCR con variantes de BCR/ABL Del número total de 297 pacientes estudiados (sospechosos clínicamente de LMC) 200 resultaron positivos para las diferentes variantes. Para determinar si los puntos de fusión de algunas de las variantes de los pacientes con LMC estudiados, correspondían a las secuencias reportadas en la literatura, 10 muestras (4 b2a2, 4 b3a2 y 2 e1a2) fueron clonadas para facilitar el proceso de secuenciación, en particular durante el proceso de secuenciación manual, en donde al inicio fue prácticamente imposible secuenciar directamente a partir de productos de PCR, mas no así a partir de plásmidos con las secuencias respectivas a ser secuenciadas. Los clones que se obtuvieron permitieron a su vez almacenar material de muestras de pacientes positivos para diferentes variantes, y ser 85 usados como controles positivos, o simplemente conservar estos productos debido a que en muchas oportunidades los ARNt se fueron degradando con el tiempo. De cada uno de los productos de PCR clonados correspondientes a los 10 pacientes estudiados, se lograron aislar varios clones contentivos de los diferentes insertos. La figura 27 muestra una foto representativa del crecimiento bacterial que por lo general se obtuvo en estos casos. La coloración azul observada en las colonias indicó que estas no poseían el inserto (región Lac Z del ADN bacterial no interrumpida), mientras que las colonias blancas o con bordes azulados indicaron la presencia del inserto. Colonias Azules (Inserto Ausente) Colonias Blancas (Inserto Presente) Figura 27. Determinación de colonias positivas conteniendo el fragmento clonado. Se observa el crecimiento de colonias correspondiente a células competentes DH5α transformadas con el vector pGEM T easy, ligado al inserto de interés. Las células fueron crecidas en placas que contenían 25 ml del medio nutritivo LB agar con Ampicilina (100 μg/ml), IPTG (100 mg/ml) y X-gal (40 mg/ml). A partir de las placas conteniendo las bacterias transformadas, se procedió al crecimiento en suspensión de algunas de las colonias blancas de los 10 clones. Posteriormente se extrajeron, mediante mini-preparaciones, los diferentes plásmidos purificados a ser secuenciados, en los cuales se pudo confirmar la presencia de los respectivos insertos en los plásmidos presentes en las bacterias transformadas, mediante análisis de restricciones de los plásmidos con la enzima EcoRI (ver Anexo B). A manera de ejemplo, en la figura 28 se pueden observar algunos de los clones positivos para la presencia del inserto b2a2 en los pacientes 20 y 130, a través de las bandas obtenidas 86 (carriles 3, 4, 5, 7, 8, 11 12 y 14), posterior al análisis de restricción. En el caso de pacientes positivos para las variantes b3a2 y e1a2 se procedió de la misma manera (datos no mostrados). Clones Paciente 20 Clones Paciente 130 Plásmidos 500 pb Insertos (310 pb) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Figura 28. Determinación de clones positivos. La digestión de los clones se llevo a cabo con la enzima de restricción EcoRI, para la identificación de plásmidos positivos que contenían el inserto (carriles: 3, 4, 5, 8, 11, 12 y 14). Las muestras de los pacientes 20 y 130 fueron corridas en geles de agarosa al 2%. Se cargaron 10 μl de la reacción por carril y el gel fue corrido durante 20 min. a 60 mV. Las flechas indican los insertos liberados así como los plásmidos linearizados. Carril 1 corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp. Secuenciación de las muestras clonadas o productos de PCR de las diferentes variantes de BCR/ABL. A través del proceso de secuenciación de tan solo algunas muestras se buscó determinar: 1) si coincidía el punto de fusión de las quimeras secuenciadas, en sus respectivas variantes, con las secuencias reportadas en la base de datos; 2) cambios significativos en el marco de lectura de la quimera BCR/ABL obtenida con los cebadores empleados, que pudieran originar modificaciones de aminoácidos esenciales tanto en los dominios perteneciente a la región de ABL como en la región de BCR que conforma la quimera. Estos cambios pudieran estar relacionados con la producción de quimeras con mayor actividad oncogénica. Cabe destacar que en los geles de agarosa siempre se observaron los productos amplificados a tamaños similares a los reportados en la literatura, sin embargo en vista de que esta simple observación no es suficiente para garantizar que las quimeras obtenidas fueran similares en secuencia a las reportadas, se tomaron algunas muestras en forma aleatoria para producir su secuencia y verificarlo con respecto a lo reportado. 87 Secuenciación manual. Los primeros análisis de secuenciación fueron realizados en forma manual debido a que no se tenía la expectativa, para aquel entonces, de poder realizar las secuencias automáticas. Sin embargo, es importante mencionar que estas secuencias manuales se hicieron a partir de productos previamente clonados y no a partir de productos de PCR, tal como se explicó en la sección anterior. Efectivamente, 5 de los 10 pacientes estudiados (20, 54, 112, 130 y 139) fueron secuenciados de manera manual con éxito, lo que permitió realizar una lectura adecuada de las mismas. Los experimentos de secuenciación manual fueron hechos por duplicado para cada paciente. La figura 29 muestra la secuenciación manual del paciente 112, positivo para la variante b2a2 de BCR/ABL. Como se observa en esta figura, las flechas gruesas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl, descritos en la literatura para la translocación BCR/ABL. Las flechas delgadas indican la lectura de algunas de las bases observadas, resaltando en azul el punto de fusión. Cabe destacar, que en algunos casos en donde estaban 2 bases similares consecutivas en la secuencia, se formaba una banda más gruesa, no definiéndose la separación de las 2 bandas, esto ocasionalmente dificultaba un poco el análisis. Cada una de las secuencias manuales obtenidas de los pacientes con LMC (20, 54, 112, 130 y 139) fueron leídas y alineadas entre ellas y con respecto a la secuencia de la quimera BCR/ABL (número de acceso: AJ131467), en modo de verificar que estas secuencias mostraban el punto de fusión BCR/ABL para la variante b2a2 reportado en la literatura. 88 c a t c a a t a a g g a a g a a g c c c t t T G C BCR ABL A Figura 29. Secuencia manual del paciente 112 (b2a2). Corrida electroforética en gel de poliacrilamida al 6% de la secuencia del clon del paciente 112, positivo para la variante b2a2. Las flechas gruesas indican la región de fusión de la translocación BCR/ABL. Las flechas delgadas indican algunas de las bases obtenidas en el electroferograma. La corrida se hizo a un voltaje de 2000 V por 2 min. y luego a un voltaje de 1000 V por 7 h. El gel fue teñido por tinción con plata, secado, escaneado y las imágenes fueron almacenadas. Como se puede observar en la figura 30, todos los pacientes presentaron el mismo punto de fusión BCR/ABL (variante b2a2) reportado en la literatura bajo el número de acceso AJ131467. Cabe destacar que durante el proceso de lectura de las secuencias manuales se detectó un único cambio de base T/C en la posición 402 de la secuencia BCR/ABL (en el segmento correspondiente al gen abl), en los pacientes 112 y 139 (99% de homología) lo cual no produjo ningún cambio de aminoácidos. 89 Estos resultados de secuenciación manual permitieron confirmar que los pacientes 20, 54, 112, 130 y 139 no sólo son positivos para la translocación BCR/ABL, sino que además son portadores de la variante b2a2 específicamente. BCR/ABL Score = 349 bits (176), Expect = 2e-93 Identities = 179/180 (99%), Gaps = 0/180 (0%) (Variante b2a2) Pac.20 1 Pac.54 1 Pac.112 1 Pac.130 1 Pac.139 1 BCR/ABL 274 a.a I Pac.20 61 Pac.54 61 Pac.112 61 Pac.130 61 Pac.139 61 BCR/ABL 334 a.a 121 Pac.54 121 Pac.112 121 Pac.130 121 Pac.139 121 BCR/ABL 394 P L T I N K E E A L Q R P V A S D F Q G L S E A A R W N S K E N L L A G E N D P N L F V A L Y D 60 60 60 60 333 120 120 120 120 120 393 P AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGAAAACGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGT |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGAAAACGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG |||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC S 60 E CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC P Pac.20 a.a ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG 180 180 180 180 180 453 F Figura 30. Alineación de las secuencias manuales de los pacientes LMC 20, 54, 112, 130, 139 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (variante b2a2, número de acceso: AJ131467). La zona resaltada en letras verdes indica la secuencia del cebador sentido B2B usado para la detección de la translocación. Las flechas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl. Las letras en azul indican la secuencia aminoacídica. Los recuadros azules indican un mismo cambio de base T/C (en la posición 402) detectado en los pacientes LMC 112 y 139, el cual no implicó cambio de aminoácidos. 90 Secuenciación Automática. Una vez que se pudo contar con la facilidad de poder enviar a secuenciar de manera automática las muestras, se procedió a verificar las secuencias que fueron realizadas de modo manual y otras muestras adicionales, de las variantes b2a2 (7), b3a2 (5) y e1a2 (3). Las secuencias automáticas fueron alineadas en bloques para poder analizar posibles cambios ocurridos entre las diferentes secuencias. Variante b2a2. La figura 31 muestra la secuenciación automática de 7 pacientes con LMC (20, 54, 93, 112, 130, A9 y A6), en los cuales se confirmó la presencia de la variante b2a2. Como se observa en esta figura, las flechas gruesas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl, descrito en la literatura para la translocación BCR/ABL, variante b2a2. Como se puede apreciar fueron detectados 3 polimorfismos en los pacientes LMC 93, 112 y 130, todos ubicados en la región del gen abl perteneciente a la quimera. En el caso de los pacientes LMC 93 y 112 se encontró un mismo polimorfismo T/C en la posición 402 (abl), mientras que en el paciente LMC 130 fue detectado otro polimorfismo T/C en la posición 434 (abl). En los 3 casos no hubo cambio de aminoácidos, por lo tanto las mutaciones detectadas fueron consideradas como silentes. Por su parte, la figura 32 muestra los electroferogramas parciales correspondientes a las secuencias de los pacientes 93 y A9 donde es posible apreciar el punto de fusión de la quimera BCR/ABL variante b2a2. Con este resultado, llevado a cabo en un grupo de pacientes LMC, fue posible confirmar la existencia del punto de fusión BCR/ABL reportado en la literatura (Melo y Col. 1993). 91 Variante b2a2. BCR/ABL (Variante b2a2) 20 1 54 1 93 1 112 1 A9 1 A6 1 BCR/ABL 274 a.a 20 61 54 61 93 61 112 61 A9 61 A6 61 BCR/ABL 334 a.a 20 121 54 121 93 121 112 121 A9 121 A6 121 BCR/ABL 394 a.a 20 181 54 181 93 181 112 181 A9 181 A6 181 BCR/ABL 454 a.a ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAAGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAG I P L T I N K E E A L Q R P V A S D F E 60 60 60 60 60 60 333 CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCTCAGGGTTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC | || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCC P Q G L S E A A R W N S K E N L L A G P 120 AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGAAAACGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGAAAACGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCAC ||| ||| | | ||| | AGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAAC S E N D P N L F V A L Y D F V A S G D N 180 ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 240 ACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAA T L S I T K G E K L R V L G Y N H N G E 92 120 120 120 120 120 393 180 180 180 180 180 453 240 240 240 240 240 513 20 241 54 241 93 241 112 241 A9 241 300 A6 241 300 BCR/ABL 514 TGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| TGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGC ||||||||||||||||||||||||||| 300 300 300 300 TGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGC a.a W C E A Q T K N G Q 546 G Figura 31. Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC 20, 54, 93, 112, 130, A9 y A6 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (Variante b2a2, número de acceso: AJ131467). La zona resaltada con letras verdes indica la secuencia del cebador sentido B2B usado para la detección de la translocación. Las flechas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl. Las letras en azul indican la secuencia aminoacídica correspondiente a la región secuenciada. Los recuadros azules indican un mismo cambio de base T/C (2 en la posición 402 [pacientes LMC 93 y 112] y 1 en la posición 434 [paciente LMC 130]) los cuales no implicaron cambios de aminoácidos. A Pac LMC A9. ABL/BCR B Pac LMC 93. ABL/BCR Figura 32. Secuencias de los pacientes LMC 93 y A9 con el punto de fusión de la quimera BCR/ABL, variante b2a2. Panel A: paciente LMC A9. Panel B: Paciente LMC 93. Todas las secuencias fueron realizadas en ambos sentidos usando los cebadores B2B y CA3. Las flechas señalan el punto de fusión b2a2. 93 Variante b3a2. La figura 33 muestra la secuenciación automática de 5 pacientes con LMC (A15, A16, A17, A18 y A19), en los cuales se confirmó la presencia de la variante b3a2. Como se observar en esta figura, las flechas gruesas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl, descrito en la literatura para la translocación BCR/ABL, variante b3a2. Como se puede apreciar, a diferencia de la variante b2a2, no fueron detectados cambios en la secuencia de ninguno de los 5 pacientes analizados. La figura 34 muestra los electroferogramas parciales correspondientes a las secuencias de los pacientes A15 y A19 donde es posible apreciar el punto de fusión de la quimera BCR/ABL variante b3a2. Con este resultado, llevado a cabo en un grupo de pacientes LMC, fue posible confirmar la existencia del punto de fusión BCR/ABL reportado en la literatura (Melo y Col. 1993). Variante b3a2. BCR/ABL A15 1 A16 1 A17 1 A18 1 A19 1 BCR/ABL 274 a.a A15 61 A16 61 A17 61 A18 61 A19 61 BCR/ABL 334 a.a A15 121 A16 121 A17 121 ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAAT I P L T I N K E D D E S P G L Y G F L N 60 60 60 60 60 333 GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTA V I V H S A T G F K Q S S K A L Q R P V 120 GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 180 94 120 120 120 120 393 180 180 A18 121 A19 121 BCR/ABL 394 a.a A15 181 A16 181 A17 181 A18 181 A19 181 BCR/ABL 454 a.a A15 241 A16 241 A17 241 A18 241 A19 241 BCR/ABL 514 a.a GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| GCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAAC A S D F E P Q G L S E A A R W N S K E N 180 CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTG L L A G P S E N D P N L F V A L Y D F V 240 GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTAT A S G D N T L S T K G E K L R V L G Y N 180 453 240 240 240 240 513 300 300 300 300 300 546 Figura 33. Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC A15, 16, 17, 18 y 19 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (Variante b3a2, número de acceso: AJ131466). La zona resaltada con letras verdes indica la secuencia del cebador sentido B2B usado para la detección de la translocación. Las flechas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl. Las letras en azul indican la secuencia aminoacídica correspondiente a la región secuenciada. La zona resaltada tanto de la secuencia nucleotídica como de la secuencia de aminoácidos indican el excedente de la porción de abl presente en esta variante. A Pac LMC A15. ABL/BCR B Pac LMC A19. ABL/BCR Figura 34. Secuencias de los pacientes LMC A15 y A19 con el punto de fusión de la quimera BCR/ABL, variante b3a2. Panel A: paciente LMC A15. Panel B: Paciente LMC A19. Todas las secuencias fueron realizadas en ambos sentidos usando los cebadores B2B y CA3. Las flechas señalan el punto de fusión b2a2. 95 Variante e1a2. La figura 35 muestra la secuenciación automática de 2 pacientes LMC (A7 y A14), en los cuales se confirmó la presencia de la variante e1a2. Como se puede apreciar en esta figura, las flechas gruesas indican el punto de fusión de los genes bcr y abl, descrito en la literatura (Melo y Col. 1996) para la translocación BCR/ABL, variante e1a2. En este caso, no se encontraron cambios en las secuencias de los pacientes LMC con respecto a la secuencia reportada (AF113911). Variante e1a2. A7 1 A14 1 BCR/ABL a.a 1 A76 1 A14 61 CAACAGTCCTTCGACAGCAGCAGTCCCCCCACGCCGCAGTGCCATAAGCGGACCCGGCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAACAGTCCTTCGACAGCAGCAGTCCCCCCACGCCGCAGTGCCATAAGCGGCACCGGCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAACAGTCCTTCGACAGCAGCAGTCCCCCCACGCCGCAGTGCCATAAGCGGCACCGGCAC Q Q S F D S S S P P T P Q C H K R H R H BCR/ABL 61 a.a TGCCCGGTTGTCGTGTCCGAGGCCACCATCGTGGGCGTCCGCAAGACCGGGCAGATCTGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCCCGGTTGTCGTGTCCGAGGCCACCATCGTGGGCGTCCGCAAGACCGGGCAGATCTGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCCCGGTTGTCGTGTCCGAGGCCACCATCGTGGGCGTCCGCAAGACCGGGCAGATCTGG C P V V V S E A T I V G V R K T G Q I W 60 60 60 120 120 120 BCR/ABL (Variante e1a2) A7 121 CCCAACGATGGCGAGGGCGCCTCCCATGGAGACGCAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCAACGATGGCGAGGGCGCCTCCCATGGAGACGCAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 180 A14 121 BCR/ABL a.a 121 CCCAACGATGGCGAGGGCGCCTCCCATGGAGACGCAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCA P N D G E G A S H G D A E A L Q R P V A 180 A7 181 240 A14 181 BCR/ABL a.a 181 TCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTT S D F E P Q G L S E A A R W N S K E N L A7 241 300 A14 241 BCR/ABL a.a 241 CTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCC L A G P S E N D P N L F V A L Y D F V A A7 301 360 A14 301 BCR/ABL a.a 301 AGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAAT S G D N T L S I T K G E K L R V L G Y N A7 361 420 A14 361 CACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAAC 96 180 240 240 300 300 360 360 420 BCR/ABL a.a 361 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAAC H N G E W C E A Q T K N G Q G W V P S N 420 Figura 35. Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC A7 y A14 y la secuencia reportada para la translocación BCR/ABL (Variante e1a2, número de acceso: AF113911). La zona resaltada con letras verdes indica la secuencia del cebador sentido BCR-C usado para la detección de la translocación. Las flechas indican el punto de fusión de los genes bcry abl. Las letras en azul indican la secuencia aminoacídica correspondiente a la región secuenciada. La figura 36 muestra los electroferogramas parciales correspondientes a las secuencias de los pacientes LMC A7 y A14 donde es posible apreciar el punto de fusión de la quimera BCR/ABL variante e1a2. Con este resultado fue posible confirmar la existencia del punto de fusión BCR/ABL reportado en la literatura (Melo y Col. 1996). Pac LMC A7. ABL/BCR A Pac LMC A14. ABL/BCR B Figura 36. Secuencias de los pacientes LMC A7 y A14 con el punto de fusión de la quimera BCR/ABL, variante e1a2. Panel A: paciente LMC A7. Panel B: Paciente LMC A14. Todas las secuencias fueron hechas en ambos sentidos usando los cebadores BCR-C y CA3. Las flechas señalan el punto de fusión e1a2. Es importante resaltar que en las secuencias obtenidas para las variantes b2a2 y e1a2, la región correspondiente al gen abl es la misma (lectura a la derecha de la flecha) mientras que la región perteneciente al gen bcr varió en cada una de ellas (lectura a la izquierda de la flecha). Estos resultados evidencian el hecho de que en efecto el gen bcr puede presentar diferentes puntos en su estructura que son sensibles a rupturas y con capacidad para fusionarse de manera no aleatoria con el gen abl independientemente de la zona donde se fraccione. 97 Análisis estadístico de los resultados obtenidos en el diagnóstico molecular de BCR/ABL. A partir de los datos obtenidos del diagnóstico molecular de los 200 pacientes positivos para las diferentes variantes de la quimera BCR/ABL (ver tabla VII), se procedió a realizar un análisis de frecuencia (ver tabla VIII) que permitió comparar la presencia de las diferentes variantes (sean solas o en co-expresión múltiple) de los pacientes LMC venezolanos con respecto a la reportada en la literatura internacional. Adicionalmente, se analizó si existía una correlación significativa de la aparición entre la translocación BCR/ABL y sus diferentes variantes, con respecto a la edad y el sexo, por separado. Frecuencia de la quimera BCR/ABL en pacientes LMC venezolanos. En el laboratorio se recibieron 297 muestras de pacientes diagnosticados clínicamente con LMC, los cuales fueron posteriormente verificados mediante el uso de herramientas moleculares. Como ya se mencionó, 200 pacientes fueron molecularmente confirmados como LMC, lo cual a su vez, facilitó la determinación de la frecuencia de la quimera BCR/ABL en estos pacientes (ver tabla VIII). Como se puede apreciar en la tabla XI, el cálculo de la frecuencia de la quimera BCR/ABL en los pacientes venezolanos con respecto a los datos reportados en países como México, Ecuador, Chile y Brasil muestran que la frecuencia encontrada de la quimera BCR/ABL en nuestro estudio fue menor (alfa 0.05, χ2 > 5.024) que lo reportado en la literatura (Melo y Col. 1998; Meissner y Col. 1999; Artigas y Col. 2002; Paz y Miño y Col. 2002), observándose que de los 297 pacientes diagnosticados clínicamente con LMC, 200 (67,3%) de ellos resultaron ser realmente pacientes LMC. La presencia de la translocación BCR/ABL es considerada el distintivo para clasificar un paciente con LMC (Cross y Col. 1994; Melo y Col. 1996; Deininger y Col. 2000). Por otra parte, los 97 (32.7%) pacientes restantes clínicamente diagnosticados con LMC, fueron negativos para la presencia de la quimera BCR/ABL, lo cual sugiere que estos pacientes a pesar de presentar una clínica similar, no pueden ser considerados como LMC por no expresar la translocación distintiva de la misma. Tabla VIII. Cálculo de la frecuencia de BCR/ABL en pacientes venezolanos con LMC y su comparación con la frecuencia esperada de 95% de positivos para BCR/ABL, reportado en otros países (Melo y Col. 1996). 98 Positivo Negativo Total (n) Frecuencia Observada Frecuencia Esperada χ2 Alfa/2 0.025 0,673 0,327 0,95 0,05 518,638 5,024 297 Frecuencia de las variantes b2a2, b3a2, e1a2, b2a2/e1a2 y b2a2/b3a2 en pacientes LMC venezolanos. Basado en que no existen muchos reportes que reflejen la distribución de las diferentes variantes de BCR/ABL, se podría afirmar que no hay un consenso que permita decir cual debería ser la frecuencia esperada para cada una de las variantes conocidas, tal como si ha sido descrita para la frecuencia de la translocación BCR/ABL en general. Por esta razón, las frecuencias esperadas empleadas para la comparación entre las variantes de BCR/ABL fueron de igual valor para cada una de ellas (la misma probabilidad de ocurrencia de cada variante). En la tabla IX es posible apreciar la frecuencia de las diferentes variantes BCR/ABL encontradas en los pacientes LMC venezolanos, la frecuencia de igualdad esperada (igual valor para todas = 0,2) y su comparación. Tabla IX. Frecuencia de las diferentes variantes BCR/ABL encontradas en los pacientes LMC venezolanos y su comparación con un modelo de distribución uniforme. Variante n Frecuencia Frecuencia Observada Esperada b2a2 87 0,435 0,2 b3a2 79 0,395 0,2 e1a2 7 0,035 0,2 b2a2/b3a2 25 0,125 0,2 b2a2/e1a2 2 0,01 0,2 Total 200 99 χ2 162,2 Alfa/2 0.025 11,143 Inicialmente los 200 pacientes LMC positivos para la translocación BCR/ABL, fueron agrupados de acuerdo a las variantes presentes en cada uno. Cabe destacar que el ensayo molecular a través del uso de cebadores específicos, una buena separación electroforética y el uso de un marcador de peso molecular, permitió definir que variante tenía cada paciente. Por lo tanto, se determinó que 87 pacientes LMC presentaron la variante b2a2, 79 la variante b3a2, 7 la variante e1a2, 25 presentaron la coexpresión de las variantes b2a2/b3a2 y 2 la coexpresión de las variantes b2a2/e1a2 (tabla IX). Adicionalmente, en la tabla IX se puede apreciar que cada variante se presentó en una proporción diferente a la esperada, siendo las más frecuentes las variantes b2a2 (0,435) y b3a2 (0,395), seguidas de las mismas variantes en co-expresión b2a2/b3a2 (0,125); y por último, se encontraron con menor frecuencia la variante e1a2 (0,035) y las variantes en coexpresión b2a2/e1a2 (0.010). Estos resultados, reflejan una disparidad con respecto a lo esperado (χ2 > 162,2 - alfa 0.05), mientras que un análisis donde se contemplaron solo las variantes mas frecuentes (b2a2 y b3a2 por separado), nos indicó que ambas variantes tienen igual probabilidad de ser encontradas en los pacientes LMC (χ2 = 0.39 - alfa 0.05) (ver tabla X). Tabla X. Frecuencia de las variantes b2a2 y b3a2 encontrada en los pacientes LMC venezolanos y su comparación con un modelo de distribución uniforme. Variante n Frecuencia Frecuencia Observada Esperada b2a2 87 0,435 0,5 b3a2 79 0,395 0,5 Total 166 100 χ2 0.39 Alfa/2 0.025 5.02 Comparación de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2 y b2a2/b3a2 entre pacientes LMC venezolanos y otros países latinoamericanos. Una vez establecidas las frecuencias de las variantes encontradas en los pacientes LMC venezolanos, se decidió comparar estos datos contra los datos latinoamericanos reportados en la bibliografía. En vista de que los escasos estudios latinoamericanos no reportan todas las variantes encontradas en este trabajo, la comparación de las frecuencias entre Venezuela y otros países latinoamericanos solo se realizó con aquellas variantes que coincidieron con este estudio; por lo tanto en esta sección solo fueron consideradas 2 de las variantes por separadas (b2a2 y b3a2) y la co-expresión b2a2/b3a2, las cuales fueron encontradas como las mas frecuentes en este trabajo. La tabla XI muestra el p valor de la comparación entre las frecuencias determinadas por este trabajo, con las frecuencias reportadas en México (Arana-Trejo RM y Col. 2002), Ecuador (Paz y Miño y Col. 2002), Brasil (Meissner y Col. 1999) y Chile (Artigas y Col. 2002), usando un alfa corregido de 0,005. Con este análisis se determinó que no existe ninguna diferencia significativa entre Venezuela y México con respecto a las variantes b2a2 y b3a2, sea por separado o en su condición de co-expresión b2a2/b3a2. En el caso de Ecuador, solo fue posible comparar con respecto a las 2 variantes mas frecuentes encontradas (b2a2 y b3a2), ya que en el estudio ecuatoriano no fue reportado ningún caso con ambas variantes en co-expresión (b2a2/b3a2). Sin embargo, a diferencia del análisis efectuado con respecto a México, el estudio del Ecuador reportó una baja frecuencia para la variante b3a2, la cual al ser comparada con el valor obtenido en este estudio mostró una diferencia estadísticamente significativa (p = 0,0002) (ver tabla XI). Con respecto a los valores obtenidos en este estudio y comparándolos con los de Brasil, no se obtuvieron diferencias significativas para ninguna de las variantes, ya sea por separado (b2a2 y b3a2) o en co-expresión (b2a2/b3a2). Por último, con respecto a Chile sólo se pudo comparar la variante b3a2, no encontrándose ninguna diferencia significativa de la frecuencia con respecto a lo reportado en este estudio. Es importante hacer notar el contraste apreciable entre los diferentes números de muestras procesadas (“n”) en los 101 estudios realizados en Ecuador, Brasil y Chile (37, 33 y 11 respectivamente), con respecto a los estudiados en México (250) y Venezuela (200) (este estudio). Tabla XI. Valores de p obtenidos de la comparación entre las frecuencias de las variantes (b2a2, b3a2, b2a2/b3a2) encontradas en Venezuela y en otros países latinoamericanos. n = n° de pacientes LMC estudiados. En rojo se señala el valor de p con una diferencia significativa. n Venezuela/México Venezuela/Ecuador Venezuela/Brasil Venezuela/Chile 200/250 200/37 200/33 200/11 Variante b2a2 0,0969 (87/120) b3a2 0,6213 (79/88) b2a2/b3a2 0,4126 (25/17) b2a2 0,0789 (87/35) b3a2 0,0002 (79/2) b2a2/b3a2 b2a2 0,0057 (87/13) b3a2 0,0131 (79/14) b2a2/b3a2 b2a2 0,0504 (25/6) b3a2 0,0613 (79/6) b2a2/b3a2 alfa corregido 0,0056 Comparación de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2, e1a2, b2a2/e1a2 y b2a2/b3a2 de los pacientes LMC venezolanos con respecto a la edad y el sexo. En la medida en que se fueron recopilando los datos de las diferentes variantes encontradas en los pacientes LMC, y basado en que la leucemia mieloide crónica es una enfermedad que ha sido reportada predominantemente en adultos, este trabajo analizó si había alguna correlación estadísticamente significativa entre la aparición de alguna (s) de las variantes y la edad en que fueron diagnosticados clínica y molecularmente los pacientes. Adicionalmente se extendió el análisis con respecto al sexo. 102 La figura 37(A) muestra el resultado obtenido para la distribución de las variantes encontradas en los pacientes LMC con respecto a la edad. Como es posible apreciar el mayor número de casos estuvo comprendido entre las edades de 21 a 60. Al mismo tiempo, se pudo observar que las variantes más frecuentes estuvieron presentes en todos los grupos de edad, mientras que la coexpresión de variantes (b2a2/b3a2; b2a2/e1a2) fue más frecuente en pacientes mayores de 20 años. En el caso de la distribución de la enfermedad con respecto al sexo (Fig. 37 B) se pudo observar que todas las variantes presentaron una distribución similar en ambos sexos. Por último, la figura 37(C) muestra el análisis estadístico de regresión logística realizado con el programa R (R Development Core Team 2006) mediante el cual se evaluaron las variables sexo y edad, con respecto a las variantes BCR/ABL encontradas en los pacientes LMC venezolanos. Este análisis determinó que no existen razones suficientes para pensar que hay una relación de los casos de LMC observados con la edad o el sexo, esto quiere decir, que el riesgo de padecer la enfermedad no es directamente proporcional a la edad, ni se relaciona con el sexo. Aunque esto último pudiera parecer una contradicción con lo observado en la figura 37 A, lo que nos está indicando es que existe una edad media en la cual es mayor la posibilidad de que la enfermedad sea detectada y que esta edad media corresponde al grupo de los adultos. Para descartar que la mayor incidencia en la detección de la LMC, en la población adulta, no fuera resultado de un efecto de la distribución de edades de la población general venezolana, se comparó la distribución de edad de los pacientes LMC con respecto a la población general. La figura 38 muestra que la distriución de edad dentro de la enfermedad (barras) no sigue la misma tendencia que la distribución de edad de la población general (línea azul), por lo tanto, la mayor frecuencia de la enfermedad entre los 20 y 60 años no es resultado de la distribución de edad de la población venezolana. 103 B A N° de pacientes BCR/ABL positivos n 87 80 M F n 79 60 40 n 25 n 25 20 n7 n 7 0 b2a2 b3a2 Edad n2 e1a2 b2a2/ b3a2 b2a2/ e1a2 Variantes C Coeficiente Error Estándar p valor r2 0,01 Intercepto -0,154 0,908 0,86 Edad 0,011 0,019 0,57 Sexo 0,669 1,264 0,59 Interacción -0,021 0,028 0,45 Figura 37. Análisis de las frecuencias de las variantes b2a2, b3a2, e1a2, b2a2/e1a2 y b2a2/b3a2 de los pacientes LMC venezolanos con respecto a la edad y el sexo. (A) indica la distribución de las variantes encontradas vs la edad. (B) indica la distribución de las diferentes variantes estudiadas vs el sexo. (C) Análisis estadístico de regresión logística para evaluar las variables sexo y edad (Programa R [Development Core Team 2006]). Los datos empleados corresponden al total de pacientes LMC positivos (200) para la translocación BCR/ABL. 0.015 0.010 0.000 0.005 Probabilidad 0.020 Distribucion por grupo de edad en pacientes LMC y la poblacion general Venezolana 10 20 30 40 50 60 70 80 EDAD Figura 38. Distribución por grupos de edades de los pacientes BCR/ABL y distribución de la población general Venezolana. El histograma de frecuencia muestra como están distribuidas las edades de los pacientes LMC positivos para la quimera BCR/ABL. La línea azul muestra la distribución de la población venezolana (Tomado de http://www.ocei.gov.ve) 104 DETECCIÓN DE OTRAS TRANSLOCACIONES QUE INDUCEN LEUCEMIA: PANEL DE DIAGNÓSTICO. A partir de las diferentes PCR’s realizadas para la estandarización de las 7 translocaciones en estudio y del control interno GAPDH, los diversos productos obtenidos fueron corridos en geles de agarosa al 1.5% para su visualización. Es importante mencionar que una vez que fueron optimizadas las condiciones de PCR para cada translocación, se realizaron al menos tres repeticiones de cada una de ellas. Para ninguna de las translocaciones estudiadas se contó con un control positivo de los tamaños reportados y dado que los cebadores empleados permiten la identificación de nuevas variantes dentro de las zonas estudiadas para cada translocación, se esperaba observar la presencia de variantes no reportadas, tal como pudo observarse en la referencia tipo (Pallisgaard y Col. 1998). En efecto, la figura 39 muestra el ordenamiento de las 7 translocaciones que fueron estandarizadas usando 40 pacientes que dieron negativos para la quimera BCR/ABL. La figura 39 A muestra una corrida electroforética representativa de los pacientes con sintomatología clínica de LMC que fueron estudiados para la translocación CBFβ/MYH11. Solo dos (3 y 4) de los tres carriles presentaron productos de amplificación para esta alteración, también conocida como inv 16. La banda observada en el carril 3, aunque es tenue, corresponde con uno de los tamaños esperados (241 pb) para esta translocación (ver tabla III en Metodología). Por su parte, la banda observada en el carril 4, con un tamaño aproximado de 150 pb, podría corresponder con el producto esperado de 174 pb, sin embargo no se puede dar fe cierta de esto hasta no obtener la secuencia de este producto. Por su parte, la figura 39 B muestra el gel de agarosa representativo de los pacientes a los que se les amplificó la translocación AML1/ETO. En este caso se puede decir que aunque se observaron bandas bien definidas en dos de los pacientes analizados (carriles 2 y 3), estas no correspondieron con el tamaño esperado (353 pb) para esta translocación, también identificada como t(8:21). Adicionalmente, se pudo observar que entre las bandas observadas para cada paciente existió disparidad de tamaño (aproximadamente150 y 180 p). Este resultado llamó poderosamente la atención puesto que 105 este patrón se repitió en todas las repeticiones realizadas. Para descartar la presencia de nuevas variantes para esta translocación se hace indispensable la secuenciación de estos dos productos. Figura. 39 Estandarización por RT-PCR de 7 translocaciones vinculadas en el origen y evolución de otros tipos de leucemias. Las 7 translocaciones fueron identificadas como A) CBFβ/MYH11 (inv 16), B) AML1/ETO (8:21), C) MLL/AF4 (4:11), D) E2A/PBX1 (1:19), E) SIL/TAL (TAL 1D), F) TEL/AML1 (12:2) y G) PML/RARα (15:17). GAPDH (H) fue usado como control interno. Todos los productos de PCR fueron corridos en un gel de agarosa al 1.5% a 80 V durante 30 min. El carril marcado con la letra M en todas la corridas corresponde al marcador de peso molecular de 100 pb. El carril 1, en todas las translocaciones analizadas, corresponde al control negativo de la reacción, con excepción del control interno donde el control negativo se ubicó en el carril 9. Los carriles 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 corresponden al producto de PCR obtenido a partir de los ADNc de los pacientes analizados. Las flechas indican las bandas obtenidas en cada translocación. Para la translocación MLL/AF4 la figura 39 C muestra los productos de amplificación de dos muestras (carriles 2 y 3) con diagnóstico clínico para LMC. En el carril 2 se pude observar la amplificación muy tenue de una banda de aproximadamente 185 pb, la cual concuerda con uno de los tamaños esperados para esta alteración también conocida como t(4;11). Adicionalmente, en el carril 3 se observó la presencia de dos bandas 106 bien definidas con tamaños aproximados de 160 pb y 400 pb. La co-expresión observada en este paciente podría ser la misma reportada en la referencia tipo, en la cual se obtuvo la co-expresión de dos productos de 159 y 404 pb respectivamente. Con respecto a la translocación E2A/PBX1, también conocida como t(1:19), la figura 39 D mostró la amplificación de una banda bien definida en uno de los tres pacientes analizados. Este producto de amplificación, ubicado en el carril 2, presentó un tamaño de aproximadamente 190 pb, el cual no correspondió con el tamaño reportado (376 y 403 pb) en la publicación usada como tipo para estandarizar esta translocación. La especificidad de esta banda podría sugerir la presencia de una nueva variante en este paciente. Por otro lado, el estudio de la translocación SIL/TAL1 mostró la presencia de amplificado en dos (carriles 2 y 4) de las tres muestras estudiadas en el ejemplo representativo. En la figura 39 E se puede evidenciar que el carril 2 presentó una banda de amplificación bien contundente, la cual se ubicó por encima de los 200 pb. Este producto de amplificación no se correspondió con el tamaño esperado para esta translocación. Sin embargo, el carril 4 presentó una banda igualmente definida pero el tamaño del producto fue de menor tamaño en comparación con el obtenido en el carril 2. Este último producto presentó un tamaño muy cercano a los 200 pb, el cual podría corresponderse con el tamaño de 185 pb reportado para esta translocación. Con respecto al estudio de la translocación TEL/AML1, debemos aclarar que para esta translocación en particular se emplearon los cebadores usados por Satake y Col. 1997, debido a que esta translocación ya se estaba estandarizando en laboratorio para el momento en el que se incluyeron estos experimentos. Como se muestra en la figura 39 F, dos (carriles 2 y 3) de los tres pacientes analizados presentaron productos de amplificación para la translocación. En el carril 2 se evidenció un producto amplificado de aproximadamente 200 pb, el cual no coincidió con ninguno de los posibles productos esperados para esta translocación. Sin embargo, el carril 4 presentó un producto de amplificación de aproximadamente 239 pb, el cual si coincidió con uno de los productos esperados. Por último, la figura 39 G muestra la corrida electroforética de tres de los productos obtenidos para la translocación PML/RARα. Como se puede observar, sólo uno de los tres pacientes analizados presentó una banda lo suficientemente definida y con tamaño de aproximadamente 430 pb, la cual correspondió con el tamaño esperado para la variante 107 BCR1. Es importante destacar que esta translocación fue una de las más difíciles de estandarizar puesto que en ninguna de las prueba realizadas se logró obtener una única banda, de hecho, en la misma figura se puede observar de presencia de bandas inespecíficas en todas las muestras estudiadas. Por último, la figura 39 H muestra varias de las corridas para el gen control GAPDH en las muestras estudiadas, como se puede observar GAPDH siempre pudo ser amplificado en las muestras con una buena intensidad. La tabla XII presenta un resumen de las translocaciones encontradas en los 40 pacientes analizados. Entre las 7 translocaciones estudiadas TEL/AML1 y PML/RARα fueron las más frecuentes, mientras que la CBFβ/MYH11 fue menos frecuente. Las translocaciones MLL/AF4 y E2A/PBX1 fueron co-expresadas, en algunos casos, junto con la translocación TEL/AML1 (datos no mostrados). Tabla XII. Resumen de los resultados obtenidos en la RT-PCR realizada a 40 pacientes de los 96 que dieron negativos para la quimera BCR/ABL. CBFβ/MYH11 AML1/ETO (inv 16) (8:21) MLL/AF4 (4:11) E2A/PBX1 (1:19) SIL/TAL (TAL 1D) TEL/AML PML/RAR 11 (12:21) α (15:17) 2 analizados Pacientes 5 4 6 3 11 9 108 CITOMETRíA DE FLUJO En la unidad de citometría de flujo del Banco Municipal de Sangre (BMS) se realizaron los análisis para la determinación de los inmunofenotipos usados de rutina en el diagnóstico de algunos tipos de leucemias. Como ya se explicó en la metodología, fueron procesadas muestras de médulas óseas y sangre periférica, aunque durante el diagnóstico inicial es usualmente recomendable el uso de médula ósea, dejando el estudio de sangre periférica para pruebas de control en pacientes previamente diagnosticados. Un total de 10 muestras recibidas, fueron evaluadas con el Panel A para diagnosticar LLA, LMA y LMC. De los 10 pacientes analizados 3 resultaron positivos para LMC en fase inicial, 3 resultaron positivos para LMC en fase de crisis blástica linfoide (LMC CBL) y 4 resultaron positivos para LMC en fase de crisis blástica mieloide (LMC CBM). Estas últimas fases pudieron ser identificadas debido al gran número de blástos que presentaron las muestras. La figura 40 muestra el ordenamiento de los dot plots de las poblaciones celulares representativas de las tres fases estudiadas en este trabajo con respecto al dot plot de una persona en condición normal. Como se puede observar, en 3 (graficas inferiores) de los 4 gráficos mostrados la distribución de las poblaciones celulares de la serie blanca sufrió una alteración tanto en el tamaño como en la granularidad, con respecto a una persona normal (gráfica superior), mostrándose un aumento en la población linfocitaria y una caída considerable (principalmente en los casos de crisis blástica) de las poblaciones que indican madures celular (monocitos y granulocitos). Este hecho denotó entonces la posible presencia de una gran cantidad de células inmaduras cuya corroboración de inmadures y tipo de linaje (linfoide o mieloide) debió ser identificado mediante un inmunofenotipo (anticuerpos monoclonales específico). 109 Figura 40. Dot-plots de la población celular (por tamaño y granularidad) de los tres casos de LMC analizados. El eje Y de todas las gráficas incluye la variable tamaño, mientras que el eje X incluye la variable granularidad. Los tres casos de estudio presentados incluyen LMC (Leucemia mieloide crónica), LMCCBM (Leucemia mieloide crónica en crisis blástica linfoide) y LMCCBL (Leucemia mieloide crónica en crisis blástica mieloide). Las 3 gráficas alineadas en la parte inferior de la figura representan los casos con LMC analizados, mientras que la gráfica ubicada en la parte superior representa el caso de una persona en condición normal. Caso LMC: La Figura 41 muestra un resultado gráfico representativo, por análisis de citometría de flujo, de un paciente clínicamente sospechoso de LMC. Además de este caso ilustrado, se identificaron 2 casos adicionales bajo este mismo esquema metodológico. 110 Figura 41. Dot-plots de las poblaciones celulares de un paciente con LMC analizado. En la parte superior de la figura se ubicaron los gráficos de dispersión del caso tratado vs un caso normal, mientras que en la parte media e inferior se ubicaron los gráficos de fluorescencia de los antígenos de superficie celular que se usaron para descifrar esta alteración. Los gráficos de los marcadores de superficie celular fueron todos mixtos, usando la variable granularidad (SSC) en el eje Y y la variable Ag en el eje X. Los puntos de color negro identificaron los diferentes tipos de poblaciones celulares formados. Los puntos de color rojo en las gráficas de fluorescencia identificaron los antígenos estudiados. Como se puede observar en los dot plots, la distribución de las poblaciones celulares del paciente con LMC no presentó mucha variación (encontrándose principalmente dos poblaciones delineadas como R1 (en rojo) y R2 (en azul)) con respecto al gráfico de una persona normal. En este caso el paciente presentó tanto células maduras como inmaduras y lo que se pudo observar fue una mínima tendencia de las poblaciones 111 hacia el lado izquierdo de la gráfica, lo que podría indicar la presencia o inicio de una anormalidad. Cuando se analizó en detalle la región R1, con los antígenos de superficie celular CD34, CD45 y CD117 (figura 41A, 41B y 41C respectivamente), usados para evidenciar la presencia de células inmaduras o blástos y células hematopoyéticas en la muestra, las gráficas de fluorescencia mixta mostraron un buen porcentaje de una población celular (en rojo) con características hematopoyéticas (CD 45 +), así como la poca presencia células inmaduras o blastos (CD 34 - y CD 117 -). Por su parte, el análisis de esta misma región con los antígenos CD 13 + y CD 33 + (figura 41D y E respectivamente) evidenciaron (también en rojo) el carácter aberrante y mieloide respectivo de las poblaciones observadas. Estos resultados indicaron que el paciente en estudio presentó una LMC (debido a la presencia de células hematopoyéticas aberrantes de origen mieloide), la cual no pudo ser clasificada en fase crónica o acelerada debido a la poca cantidad de blastos presentes en la misma. Caso LMC en Crísis Blástica (CB) linfoide: En la figura 42 se presenta el resultado gráfico representativo, por análisis de citometría de flujo, de un paciente clínicamente sospechoso de LMC en crisis blástica. Además de este caso ilustrado, se identificaron 3 casos adicionales bajo este mismo esquema metodológico. El dot plot mostró una contundente variación en la distribución de las diferentes poblaciones celulares de la muestra de un paciente con LMC con respecto a la población celular de una muestra normal. En este caso, se evidenció claramente la predominancia de una población linfocitaria con respecto a las otras poblaciones, indicado por el ordenamiento de abajo hacia arriba de la gráfica en color rojo. Esta zona fue delimitada como región R1 y fue analizada posteriormente con anticuerpos monoclonales específicos mediante los dot plots, donde la coloración roja o verde identificó la expresión de cada uno de ellos. 112 Figura 42. Dot-plots de la población celular de un paciente representativo de los 3 casos de LMC en crisis blástica analizados. En este caso se ejemplifica una LMC en CB con linaje linfoide. En la parte superior de la figura se ubicaron los gráficos de dispersión del caso tratado vs un caso normal. En la parte media e inferior se ubicaron los gráficos de fluorescencia de los marcadores de superficie celular y citoplasmáticos que fueron usados para identificar esta alteración. Todos los gráficos de marcadores de superficie celular y de marcadores citoplasmáticos fueron mixtos. Los dot plots para analizar la región R1 demostraron la presencias de un alto porcentaje (89%) de células blásticas y progenitores hematopoyéticos en la muestra, tal 113 como lo demuestran los marcadores de superficie celular CD 117 y CD 34 (figura 42 D y E respectivamente). Un análisis más exhaustivo de estos blastos permitió evidenciar el carácter aberrante de los mismos (CD 13, figura. 42B). Durante el proceso de identificación del linaje de los blastos observados, se encontró un porcentaje considerable de expresión del marcador de progenitores linfoides y mieloides (CD 11c, figura. 42A), el cual, al ser analizado junto con los marcadores CD33 (progenitor mieloide, figura 42C) y HLA-DR (marcador de linaje linfoide, figura 42F) evidencio el carácter linfoide de los blastos encontrados. Como se puede observar, el marcador de linaje linfoide tuvo un mayor porcentaje de expresión en comparación con CD33. Estos resultados permitieron diagnosticar al paciente como un LMC en crisis blástica de origen linfoide. Caso LMC en crísis blástica (CB) mieloide: La figura 43 presenta el resultado gráfico representativo, por análisis de citometría de flujo, de un paciente clínicamente sospechoso de LMC en fase de crisis blástica (CB). Además de este caso ilustrado, se identificaron 4 casos adicionales bajo este mismo esquema metodológico. Como se muestra en el gráfico de dispersión, el paciente con LMC presenta una completa variación en la distribución de las poblaciones celulares analizadas en comparación con una muestra normal. Al igual que en el caso anterior, se observó un aumento exacerbado de la población linfocitaria (90%), evidenciado por el aumento de puntos negros de abajo hacia arriba de la parte izquierda de la gráfica (resaltado en un óvalo). Esta zona también fue delimitada como región R1 y fue analizada con anticuerpos monoclonales específicos en los diferentes gráficos de fluorescencia mixtos, donde se evidenció la expresión de cada antígeno a través de una coloración fucsia. 114 A D E B F C 115 G H J I K L M 116 Figura 43. Dot-plots de la población celular de un paciente con LMC en crisis blástica. En este caso se ejemplifica una LMC en CB con linaje mieloide. En la parte superior de la figura se ubicaron los gráficos de dispersión del caso tratado vs un caso normal. En la parte media e inferior se ubicaron los 13 gráficos de fluorescencia de los marcadores de superficie celular y citoplasmáticos que fueron usados para identificar esta alteración. Todos los gráficos de marcadores de superficie celular y de marcadores citoplasmáticos fueron mixtos. La coloración fucsia en los diferentes gráficos identificó los antígenos estudiados. Para una precisa identificación de esta alteración se estudió la expresión de 11 antígenos de superficie celular y 2 antígenos citoplasmáticos. Los gráficos de fluorescencia mixtos para la expresión de CD34 y CD 117 (figura 43 C y 43 H, respectivamente) demostraron la presencia de blastos y células progenitoras hematopoyéticas en la región analizada, así como el carácter aberrante temprano de las mismas (CD 13 y CD 19, figura 43 D y F respectivamente). La identificación del linaje de los blastos también fue analizado a través de los gráficos de fluorescencia mixtos. De los marcadores de linaje linfoide empleados (CD 10, CD 20, CD 15, CD 19, CD 4 y CD 8), solo 1 (CD 10) presentó una expresión considerable (ver figuras 43 A, B, E, F, J y K respectivamente). Es importante mencionar que los antígenos para células T citotóxicas dieron porcentajes muy bajos (CD 4 y CD 8 respectivamente) como para poder hacer la relación entre ellos. Adicionalmente, la no expresión de los antígenos de células B citoplasmáticos IgG y TDT (figura 40 L y M respectivamente) evidenciaron el origen mieloide de los blastos estudiados. Este hecho fue corroborado por la expresión de los antígenos de precursores mieloides CD 33 y CD 11c (figuras 43 G e I respectivamente). Estos datos, permitieron emitir un diagnóstico contundente de una LMC en crisis blástica con linaje mieloide. Por último, es imprescindible mencionar que todos los casos de LMC en crisis blástica que resultaron positivos por inmunofenotipo, también dieron positivos para el oncogen BCR/ABL. Sin embargo, en los casos donde se intuía una fase inicial por citometría no siempre dieron positivos para el oncogen. 117 FACTORES IMPLICADOS EN LA RESISTENCIA AL TRATAMIENTO DE LA LMC CON IMATINIB MODIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POR BCR/ABL. En vista de que este estudio fundamentalmente se enfocó en la leucemia mieloide crónica (LMC) presente en pacientes venezolanos, se quiso determinar si la translocación BCR/ABL presente en estos pacientes, guardaba relación con posibles variaciones en la expresión de algunos genes que previamente han sido reportados en estudios con microarreglos (Ohmine y Col 2001). Por lo tanto, en este trabajo se decidió implementar el uso de la técnica PCR en Tiempo Real, para evaluar comparativamente los niveles de expresión de algunos genes, tanto en pacientes con LMC como en personas no afectadas por esta enfermedad. Selección de los pacientes a ser evaluados. La tabla XIII muestra los 23 pacientes que fueron seleccionados para el estudio de las variaciones de expresión génica, determinados por PCR convencional. Como ya se mencionó en la metodología, los pacientes fueron agrupados de acuerdo a la fase de la enfermedad, establecida clínicamente por los médicos del servicio hospitalario y por el fenotipo determinado por citometría de flujo, dando origen a 3 grupos de pacientes: 1) Fase crónica (FC), 2) Fase acelerada (FA) y 3) Fase de crisis blástica (CB). Entre los parámetros considerados en la tabla XIII se encuentran el sexo, donde se observó un mayor número de hombres padeciendo la enfermedad (17/23) con respecto a las mujeres (6/23), la edad (la cual osciló entre los 16 y 55 años) y la cuantificación de la quimera BCR/ABL por PCR cuantitativo, la cual evidenció un aumento en la expresión de la quimera en aquellos pacientes pertenecientes al grupo de CB con respecto a las otras dos fases estudiadas. El parámetro del tratamiento con Imatinib evidenció no sólo una elevada irregularidad en su consumo por parte de los pacientes con LMC sobre los cuales se administró el fármaco, sino también la presencia de variaciones en la respuesta al tratamiento en aquellos pacientes que si cumplen fielmente el tratamiento. Esta variación en la respuesta al tratamiento con Imatinib incluyó respuesta al tratamiento (RT), respuesta hematológica (RH), respuesta 118 citogenética (RC) y no respuesta (NR). Por último, los parámetros resumidos en la tabla XIII también indican que: a) varios de estos pacientes han sido tratados por años (MR y AG por ejemplo) y b) afortunadamente muy pocos pacientes han fallecido desde que se les diagnosticó la enfermedad. Adicionalmente es importante mencionar que 1) ninguno de los pacientes usados en este estudio fue sometido a transplante de médula ósea y 2) sólo en algunos casos el riesgo Sokal pudo ser medido. Fase Crónica Fase Acelerada Crisis Blástica Pacientes Pacientes Pacientes Tabla XIII. Pacientes LMC positivos incluidos en el estudio de expresión génica mediante la técnica de PCR en Tiempo Real. RT= respondió al tratamiento (Imatinib), TI= Tratamiento irregular, RH= respuesta hematológica, NR= no respondió, --= No se sabia porque eran pacientes referidos del interior. Paciente Sexo Edad FC M 35 AG M 41 AG M PCR Tratamiento Diagnóstico Cuantitativa Imatinib Inicial. _ ST 02-02-05 No 23-08-00 No _ TI _ TI Fallecido No FG M _ RT LM M 55 _ TI 04-10-01 No No 35 13-06-05 No ZB F 2.54% RT RB M _ TI No JS F _ TI No DF M _ _ No CC F _ NR No JH M 10.9% RH No HP M 13.76% RT No OH M 13.7% RH FA M 34% RH 11% NR 2.74% RH 2.5% RH 16 No 20-10-05 No JC M MR F M la C F GP M _ RH Si AA M 85.8% NR Si 37.5% RH 85.8% _ 53 46 No 21-02-98 No No ML F JG M NP M _ _ Si GF M 1.6% RT No 119 03-04-03 No Estandarización de las condiciones de amplificación por PCR. Eliminación de ADNg en las muestras de ARNt usadas en la síntesis de ADNc. Previo a la estandarización de las condiciones de PCR para cada uno de los productos a ser amplificados se procedió a verificar, post tratamiento con ADNasa, la no presencia de ADNg en las muestras de ARNt debido a que su presencia podría afectar los resultados obtenidos en los ensayos de PCR en Tiempo Real, ya sea a través de amplificados inespecíficos o de productos específicos obtenidos a partir de la amplificación de la secuencia del gen presente en el ADNg. La figura 44 muestra una corrida electroforética donde la amplificación del gen control (GAPDH) es observada sólo en la muestra de ADNc sintetizado a partir de ARNt previamente tratado con ADNasa (carril 3). Por otra parte, las amplifiaciones directas, a partir del ARNt tratado previamente con ADNasa o ARNt sin tratar (carriles 2 y 4 respectivamente), no mostraron bandas de amplificación del tamaño esperado, tal como se observó en la amplificación del ADNg (346 bp). Es importante destacar la amplificación inespecífica (“smear”) que se observó con la muestra de ARN que no fue tratada con ADNasa (carril 4), este producto inespecífico podría alterar los valores de cuantificación relativa que se estarían produciendo con el análisis de PCR en Tiempo Real. 200 pb 1 2 3 4 M Figura. 44. Ensayos de amplificación por PCR convencional en muestras previamente tratadas con ADNasa. (1) Control negativo de la reacción. (2) Amplificación del gen GAPDH usando ARNt tratado con ADNasa. (3) Amplificación del gen GAPDH usando ADNc sintetizado a partir de ARNt previamente tratado con ADNasa. (4) Amplificación del gen GAPDH a partir de ARNt sin tratamiento con ADNasa. (6) Marcador de peso molecular 100 bp. Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR convencional para los genes GAPDH, Lyn y AKAP12. 120 Las condiciones para la amplificación por PCR convencional de los genes a estudiar Lyn y AKAP12 (también conocido como Gravin) fueron estandarizadas. Adicionalmente, para determinar si los productos obtenidos en la estandarización de esta PCR correspondían con los esperados para los genes en estudio y a su vez evaluar posibles amplificaciones inespecíficas que podrían estarse presentando en los ensayos, se procedió a evaluar mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.5%, los productos amplificados, tanto del gen control GAPDH como el de los genes Lyn y AKAP12. Como se puede apreciar en la figura 45 el tamaño del producto de los genes GAPDH (243 pb) (carriles 2), LYN (218 pb) (carril 3) y AKAP12 (264 bp) correspondieron al tamaño esperado, no observándose en el gel otros productos secundarios que pudieran alterar el análisis del ensayo. 300 pb 200 pb 1 2 3 4 M Figura. 45 Estandarización de la amplificación por PCR convencional de los genes GAPDH, Lyn y AKAP12. (1) Control negativo de la reacción para el gen GAPDH. (2) Amplificación del gen GAPDH (243 pb). (3) Amplificación del gen LYN (218 pb). (4) Amplificación del gen AKAP12 (264 pb). Marcador de peso molecular 100 bp. Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR en Tiempo Real para los genes GAPDH, Lyn y AKAP12. Para determinar si los productos obtenidos en la estandarización de la PCR en Tiempo Real correspondían con los obtenidos en la PCR convencional para los genes en estudio y a su vez, evaluar posibles amplificaciones inespecíficas con el “Light Cycler”, se procedió a evaluar mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.5% los productos amplificados por PCR en Tiempo Real tanto del gen control GAPDH como de los genes Lyn y AKAP12. Como se puede apreciar en la figura 46, el tamaño del producto de los genes GAPDH (243 pb) (carriles 2 y 3) y Lyn (218 pb) (carriles 8 y 9) correspondieron con 121 los tamaños esperados, no observándose en el gel otros productos secundarios que pudieran alterar la fluorescencia. En el caso del gen AKAP12 lamentablemente no se pudo obtener un producto específico del tamaño esperado durante el ensayo de PCR en Tiempo Real, a pesar de que durante los ensayos de estandarización con los cebadores empleados en una PCR convencional fue posible obtener un productos de 264 bp (figura 45, PCR convencional). Esta limitante, obtenida repetidamente en al menos 4 experimentos realizados separadamente, no permitió continuar con la evaluación de la expresión de este gen ya que solo se observaron productos inespecíficos de amplificación. Esto resalta la importancia que tiene la evaluación de las condiciones de PCR en Tiempo Real previo a la cuantificación, de modo de estar seguro que los resultados obtenidos permitirán realizar un análisis real de la situación. B A C E D F G 200 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura. 46. Gráficas de amplificación, curva de fusión y corrida en agarosa 1.5% de los productos de amplificación de los genes GAPDH, AKAP12 y LYN en personas normales y pacientes con LMC. Las gráficas de amplificación (A, B y C) fueron construidas usando el software del equipo al mismo tiempo que se producían los productos de amplificación. Estas gráficas permitieron apreciar la fluorescencia emitida por el producto formado versus el número de ciclos especificados en el programa al momento de cargar las muestras. Las curvas de fusión (D, E y F) fueron construidas al final de cada amplificación. Estas gráficas permitieron comparar la fluorescencia producida por el producto versus la variación de la temperatura en orden ascendente. Cada línea de color formada en las gráficas representa una muestra cargada. La leyenda en negro identifica cada muestra y gen usado. La agarosa al 1.5% (G) fue corrida durante 30 min. a 80 V. En todas las corridas se usó un marcador de peso molecular de 100 pb. Por otra parte, debemos mencionar que durante los ensayos de estandarización de la PCR en Tiempo Real fueron procesadas muestras tanto de ADNc de pacientes leucémicos 122 (figura 46 carriles 3, 6 y 9), como ADNc de personas normales (figura 43 carriles 2, 5 y 8). Como se puede apreciar, en el proceso de amplificación de ambos tipos de muestra (en los casos de los genes GAPDH y LYN) no se observaron variaciones en el gel. Evaluación por PCR en Tiempo Real del gen Lyn en pacientes venezolanos con LMC. El gen Lyn fue tomado como punto de partida en los estudios de expresión génica debido a que ha sido reportada tanto su participación en la cascada de señalización de la quimera BCR/ABL como su potencial transformante, dado a que este gen codifica para una proteína con actividad tipo tirosina quinasa igual que BCR/ABL (Dai, y Col. 2004; Rodriguez, y Col. 2004). Adicionalmente, estudios con microarreglos y RT-PCR en Tiempo Real han demostrado que su expresión puede verse afectada en líneas celulares y pacientes con LMC, así como en otros tipos de leucemias como la LLC (Contri, A. y Col. 2005). Por lo tanto, debido a la importancia que pudiera tener este gen con el desarrollo de la Leucemia Mieloide Crónica, principalmente hacia la fase de crisis blástica, se decidió evaluar sus niveles de transcripción en 23 pacientes venezolanos diagnosticados clínica y molecularmente como LMC con respecto a individuos normales (Tabla XIII). Las PCRs en Tiempo Real de los pacientes LMC, tanto para el control interno GAPDH como para Lyn, fueron corridas en varias tandas de amplificación donde siempre fueron incluidos controles de reacción, muestras de las diferentes fases de la enfermedad y controles normales. Las figuras 47, 48, 49 y 50 muestran 4 tandas de amplificación representativas de los resultados obtenidos en este estudio. Como se puede observar, las gráficas de amplificación (A y B en cada figura) muestran un comportamiento cinético donde se evidencia un inicio del proceso de amplificación, aproximadamente en el ciclo 20, que luego alcanza una fase linear o de crecimiento exponencial y culmina en una fase de saturación. La eficiencia de amplificación de cada muestra dependió de la calidad del ARNt usado. Las curvas de temperatura de fusión para los genes GAPDH y LYN (C y D en cada figura) muestran los diferentes puntos máximos correspondientes a los productos esperados 123 para cada gen estudiado en las muestras procesadas. Como se puede apreciar en la gráfica 47, el punto máximo correspondiente a la temperatura de fusión para el gen GAPDH presentó una mayor temperatura de fusión (Panel C, aproximadamente 85°C) con respecto al gen Lyn (panel D, aproximadamente 82°C), esta diferencia se explica debido al mayor tamaño del producto amplificado para GAPDH (243 pb) con respecto al producto de Lyn (218 pb). Por otro lado, en las figuras 47, 48, 49 y 50 (panel E) se pueden visualizar las corridas electroforéticas en geles de agarosa de la mayoría de los productos amplificados durante el análisis realizado por PCR en Tiempo Real. Como se puede ver, por el tamaño del producto amplificado, cada una de las bandas se correspondió con el tamaño esperado para cada gen amplificado y las variaciones observadas en la intensidad de las bandas en los geles de electroforesis no fueron tomadas como cambio en la expresión ya que estas variaciones fueron debidas a la pérdida inevitable de muestra al momento de romper los capilares para cargar el producto en los geles de agarosa. Cabe destacar que aunque en todas las gráficas de amplificación (A y B de las 4 figuras) se observó amplificación en la línea correspondiente al agua, esta fue debido a los dímeros de cebadores y no a una contaminación en el tubo de control de la reacción, tal como se puede corroborar en las curvas de fusión y en los geles de agarosa de todas las tandas. 124 B A C D E Figura 47. Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 1. Las gráficas de amplificación (Paneles A y B) fueron construidas por el software del equipo al mismo tiempo que se producía el producto de amplificación. Esta gráfica ilustró la fluorescencia emitida por el producto formado vs el número de ciclos especificados en el programa al momento de cargar las muestras. Las curvas de temperatura de fusión (Paneles C y D) fueron construidas al final de la amplificación. Estas gráficas comparan la fluorescencia producida por el producto vs la variación de la temperatura en orden ascendente. Cada línea de color formada en las gráficas representa una muestra cargada. Las barras y círculos rojos demuestran los picos máximos de temperatura de fusión para cada gen. La leyenda en negro identifica cada muestra por código y especifica que gen fue usado. La agarosa (E) fue corrida durante 30 min. a 80 V. En todas las corridas se usó un marcador de peso molecular de 100 pb. A B C D E Figura 48. Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 2. Las gráficas de amplificación (Paneles A y B) corresponden a la fluorescencia emitida por el producto formado versus el número de ciclos especificados en el programa al momento de cargar las muestras. Las curvas de temperatura de fusión (Paneles C y D) fueron construidas al final de la amplificación, las gráficas comparan la fluorescencia producida por el producto versus la variación de la temperatura en orden ascendente. Cada línea de color formada en las gráficas representa una muestra cargada. La leyenda en negro identifica cada muestra por código y especifica el gen amplificado. La agarosa (Panel E) fue corrida durante 30 min. a 80 V. En todas las corridas se usó un marcador de peso molecular de 100 pb. 125 A A C B B C D D E Figura 49. Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp. 3. Las gráficas de amplificación (Paneles A y B) corresponden a la fluorescencia emitida por el producto formado vs el número de ciclos especificados en el programa al momento de cargar las muestras. Las curvas de temperatura de fusión (Paneles C y D) fueron construidas al final de la amplificación, las gráficas comparan la fluorescencia producida por el producto versus la variación de la temperatura en orden ascendente. Cada línea de color formada en las gráficas representa una muestra cargada. La leyenda en negro identifica cada muestra por código y especifica el gen amplificado. La agarosa (Panel E) fue corrida durante 30 min. a 80 V. En todas las corridas se usó un marcador de peso molecular de 100 pb. B A D A C E Figura 50. Cuantificación relativa del gen Lyn en personas normales y pacientes con LMC en las tres fases clínicas (FC, FA y CB) de la enfermedad. Exp.4. Las gráficas de amplificación (Paneles A y B) corresponden a la fluorescencia emitida por el producto formado vs el número de ciclos especificados en el programa al momento de cargar las muestras. Las curvas de temperatura de fusión (Paneles C y D) fueron construidas al final de la amplificación, las gráficas comparan la fluorescencia producida por el producto vs la variación de la temperatura en orden ascendente. Cada línea de color formada en las gráficas representa una muestra cargada. La leyenda en negro identifica cada muestra por código y especifica el gen amplificado. La agarosa (E) fue corrida durante 30 min. a 80 V. En todas las corridas se usó un marcador de peso molecular de 100 pb. 126 Estadística de la RTQ-PCR. Los puntos de cruce obtenidos a partir de las curvas de amplificación, por el método de la segunda derivada, fueron usados para el cálculo de la expresión relativa “Ratio” de expresión de los genes GAPDH y Lyn (ver Anexo C). La tabla XIV muestra los valores de punto de cruce para los genes GAPDH y Lyn en los 23 pacientes con LMC, en sus diferentes fases, y en los 13 individuos normales tomados como controles. También se presentan los valores de los Ratios obtenidos para cada muestra y la división entre el Ratio de cada muestra y el Ratio promedio de los controles normales. Las últimas filas de cada sección de la tabla evidencian los valores de los promedios y la desviación estándar obtenidos para cada parámetro analizado. 127 Tabla XIV. Valores obtenidos a partir de la amplificación por PCR en Tiempo Real de los genes GAPDH y Lyn. Las filas resaltadas indican las diferentes fases de la LMC y los controles normales. Las columnas indican los diferentes parámetros calculados. Las iniciales representan los nombres de las muestras. Fase Acelerada Crisis Blástica Normales Pacientes Personas Pacientes Pacientes Fase Crónica Paciente Punto de Cruce Punto de cruce Gen GAPDH Gen Lyn Ratio Ratio enfermo/ Ratio promedio normal FC 29.12 27.61 0.94814560 0.96600379 AG 24.96 24.88 0.99679487 1.01556936 AG 24.90 25.66 1.03052209 1.04993183 FG 26.01 26.27 1.00999616 1.02901929 LM 24.97 26.28 1.05246296 1.07228595 ZB 27.56 23.49 0.85232221 0.86837558 RB 27.06 22.90 0.84626755 0.86220688 JS 26.94 24.91 0.92464736 0.94206297 Promedio 26.44 25.25 0.95764485 0.97568196 desv 1.51086541 1.54511211 0.07860551 0.08008603 DF 22.30 21.10 0.99103139 1.00969733 CC 22.23 21.36 0.96086370 0.97896143 JH 22.12 21.87 0.98869801 1.00732000 HP 23.07 22.25 0.96445600 0.98262140 OH 26.30 22.99 0.87414449 0.89060888 FA 22.03 21.75 0.98729006 1.00588553 JC 23.13 21.31 0.96454821 0.98271534 MR 22.26 22.33 1.00314465 1.02203874 Promedio 22.93 22.12 0.96677206 0.98498108 desv 1.42520174 0.48275992 0.04042330 0.04118467 M la C 23.25 24.18 1.04 1.05958825 GP 25.84 28.48 1.10216781 1.12292635 AA 23.85 21.59 0.90524109 0.92229118 ML 24.90 22.62 0.90843373 0.92554396 JG 25.43 23.47 0.92292568 0.94030885 NP 34.23 27.95 0.81653520 0.83191453 1.13887885 GF 19.86 22.20 1.11782477 Promedio 25.33714286 24.3357143 0.97330395 0.9916360 desv 4.398907873 2.77046841 0.11394112 0.11608718 0.97441104 SB 27.98 26.76 0.95639743 EH 25 24.18 0.96720000 0.98541708 CS 27.18 22.73 0.8367667 0.85202783 KN 20.58 21.42 1. 04081633 1.06041996 LE 27.11 23.18 0.85503504 0.87113951 RM 22.64 23.54 1.03975265 1.05933625 KL 26.28 27.06 1.02968037 1.04907425 EM 28.80 29.58 1.02708333 1.04642830 GP 22.60 27.26 1.20619469 1. 2289132 YA 27.67 22.91 0.82797253 0.84356728 SF 22.56 24.46 1.08421986 1.10464099 FC 29.23 24.67 0.84399589 0.85989244 1.06473189 LE 25.75 26.91 1.04504854 Promedio 25.64461358 24.9738462 0.98151333 1 desv 2.756285591 2.34376314 0.11430382 0.11645672 128 La figura 51 muestra la gráfica con los valores obtenidos del Ratio de expresión relativa del gen Lyn en pacientes con LMC en las diferentes fases de la enfermedad. Como se puede observar en el gráfico, los promedios de todos los tratamientos (FC, FA y CB) no evidenciaron cambios en la expresión de este gen en comparación con el grupo control (N). La variación observada de los ratios en las diferentes fases de tratamiento fue similar a la observada en el grupo normal, lo que indica que esta variación es producto de la variación intrínseca esperada en cualquier sistema biológico. 1,4 1,2 LYN Ratio 1 0,8 0,6 FC FA CB N 0,4 0,2 0 Figura 51. Gráfica de la expresión relativa del gen LYN en controles (N, puntos blancos) y pacientes LMC en las diferentes fases clínicas de enfermedad, fase crónica (FC, puntos sólidos), fase acelerada (FA, triángulo sólido) y crisis blástica (CB, cuadros sólidos). La línea sólida en cada tratamiento muestra el promedio obtenido del número de pacientes para cada caso, mientras que la línea punteada representa el valor al cual no hay diferencia de expresión entre los pacientes y los normales. Adicional a los cálculos con los promedios, también se hizo un análisis de aleatorización de la expresión génica del gen Lyn en los pacientes con LMC mediante el remuestreo bootstrap de 50.000 replicas, con el fin de comparar la expresión del gen housekeeping GAPDH con el gen estudiado Lyn según el método modificado de Rest (Matthew, H; David, C y Pfaffl, M 2006). La figura 52 muestra los diagramas de caja obtenidos para la expresión relativa aleatorizada de los genes GAPDH y LYN en las diferentes fases de la LMC. Como se 129 puede observar, la expresión relativa del gen LYN en las diferentes fases de la LMC no presentó variación con respecto a la expresión del gen GAPDH. Figura 52. Gráfica de la expresión relativa aleatorizada de los genes GAPDH y Lyn en las diferentes fases clínicas de la LMC, fase crónica (FC), fase acelerada (FA) y crisis blástica (CB). La línea central de cada caja muestra la mediana, los límites superior e inferior de la caja muestra los espacios intercuartil. Las líneas punteadas señalan la distancia hacia los extremos de la distribución. Los círculos vacíos muestran los valores que quedan fuera de la distribución. 130 DETECCIÓN DE MUTACIONES PUNTUALES EN EL DOMINIO TIROSINAQUINASA DE LA QUIMERA BCR/ABL. Con el objetivo de evidenciar si la presencia de mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL en pacientes venezolanos con LMC era el detonante principal de la resistencia al tratamiento con Imatinib, se estandarizaron dos protocolos de PCR para analizar las mismas 23 muestras de pacientes positivos para la quimera BCR/ABL usadas en los ensayos de expresión génica. Evaluación electroforética de los productos obtenidos por PCR para el punto de fusión y el dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL. Para determinar si los productos obtenidos en la estandarización de los dos protocolos de PCR correspondían con los esperados para el punto de fusión BCR/ABL y el dominio tirosina quinasa, se procedió a evaluar mediante electroforésis en geles de agarosa al 1.5% los productos amplificados de las dos regiones del gen abl en estudio. La figura 53 muestra los productos de amplificación de algunos de los pacientes analizados. Como se puede observar, en varias muestras se logró obtener una banda del tamaño esperado (1200 pb) para el punto de fusión de la quimera BCR/ABL. En las muestras donde no se observaron bandas en el primer intento o se evidenciaron bandas inespecíficas, fue necesario montar otra PCR con un nuevo ADNc, puesto que los intentos para mejorar la amplificación usando otras temperaturas no dieron resultados satisfactorios. Por su parte, la figura 54 muestra los geles de agarosa 1.5% para los productos purificados del dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL en los pacientes con LMC. En estos geles, se observó la presencia de una única banda de aproximadamente 565 pb en todas la muestras analizadas cuando fueron usados los cebadores ABL-F4 y ABL-R6. A diferencia de la PCR 1 para el punto de fusión, esta amplificación fue muy fácil de obtener y su alto rendimiento permitió realizar las purificaciones correspondientes, hecho que garantizó una alta eficiencia en la secuenciación automática. 131 Figura 53. Estandarización del protocolo de PCR empleado para la amplificación del punto de fusión de la quimera BCR/ABL en pacientes con LMC. El carril 1, en ambos geles, corresponde al control negativo de la reacción. Los carriles 2 al 16, en el gel inferior, corresponden a las diferentes muestras que fueron cargadas y el último carril (M) corresponde al marcador de peso molecular de 100 pb. La flecha roja identifica al producto obtenido (1200 pb) con los cebadores B2B y ABL- R6, el cual incluye tanto a la quimera BCR/ABL como al dominio tirosina quinasa. Figura 54. Estandarización del protocolo de PCR empleado para la amplificación del dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL en pacientes con LMC. El carril 1corresponde al control negativo de la reacción. Los carriles del 2 al 21, corresponden a las diferentes muestras que fueron cargadas en el gel y el último carril (M) corresponde al marcador de peso molecular de 100 pb. La flecha roja identifica al producto obtenido (565 pb) con los cebadores ABL- F4 y ABL- R6, el cual correspondió al dominio tirosina quinasa. 132 Secuenciación automática del dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL de los pacientes con LMC. A partir de los productos purificados de la PCR 2 (correspondiente al dominio tirosina quinasa) se lograron secuenciar automáticamente 15 muestras LMC de forma satisfactoria. En la figura 55 se muestra la alineación de todas la secuencias obtenidas, así como su comparación con la secuencia reportada para este dominio (NM 005157; ver anexo D) y su secuencia aminoacídica. Esta alineación demostró que ninguna de las secuencias analizadas presentó mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa estudiado. Las porciones coloreadas en azul y ubicadas en los extremos de la alineación de secuencias representan los cebadores empleados, mientras que las porciones coloreadas en verde, naranja y azul representan las zonas funcionales del dominio tirosina quinasa como son el bolsillo de unión al ATP, el loop catalítico y el loop de activación respectivamente. DTQ aa TCCCCCAACTACGACAAGTGGGAGATGAACGC F1 1 F2 1 F3 1 F5 1 F6 1 F10 1 F11 1 F12 1 F13 1 F14 1 F15 1 F16 1 F17 1 F18 1 F19 1 DTQ aa 721 F1 61 TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGGACATCACCATGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGGACATCACCATGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGC T D I T M K H K L G G G Q Y G E V Y E G GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG 133 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 780 120 F2 61 F3 61 F5 61 F6 61 F10 61 F11 61 F12 61 F13 61 F14 61 F15 61 F16 61 F17 61 F18 61 F19 61 DTQ Aa 781 F1 121 F2 121 F3 121 F5 121 F6 121 F10 121 F11 121 F12 121 F13 121 F14 121 F15 121 F16 121 F17 121 F18 121 F19 121 DTQ aa 841 F1 181 F2 181 F3 181 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAG V W K K Y S L T V A V K T L K E D T M E 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 840 GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTGGTG V E E F L K E A A V M K E I K H P N L V 180 CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC 240 134 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 180 900 240 240 F5 181 F6 181 F10 181 F11 181 F12 181 F13 181 F14 181 F15 181 F16 181 F17 181 F18 181 F19 181 DTQ Aa 901 F1 241 F2 241 F3 241 F5 241 F6 241 F10 F11 241 F12 241 F13 241 F14 241 F15 241 F16 241 F17 241 F18 241 F19 241 DTQ Aa 961 F1 301 F2 301 F3 301 F5 301 F6 301 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTGATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCA----------------------------------------|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCACTGAGTTCATGACC Q L L G V C T R E P P F Y I I T E F M T 240 240 240 240 240 240 240 240 240 240 240 240 960 TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ------------------------------------------------------------ 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTG 1020 Y G N L L D Y L R E C N R Q E V N A V V CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGACTACCTGGAGAAGAAAAACTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 135 360 360 360 360 360 F10 301 F11 301 F12 301 F13 301 F14 301 F15 301 F16 301 F17 301 F18 301 F19 301 DTQ 1021 aa F1 361 F2 361 F3 361 F5 361 F6 361 F10 361 F11 361 F12 361 F13 361 F14 361 F15 361 F16 361 F17 361 F18 361 F19 361 DTQ 1081 aa F1 421 F2 421 F3 421 F5 421 F6 421 F10 421 F11 421 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ------------------------------------------------------------ 360 CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTGGAGAAGAAAAACTTC 1080 L L Y M A T Q I S S A M E Y L E K K N F ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ------------------------------------------------------------ 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTA 1140 I H R D L A A R N C L V G E N H L V K V GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| -----------------------------------------------------------|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 136 480 480 480 480 480 480 480 F12 421 F13 421 F14 421 F15 421 F16 421 F17 421 F18 421 F19 421 DTQ 1141 aa F1 481 F2 481 F3 481 F5 481 F6 481 F10 481 F11 481 F12 481 F13 481 F14 481 F15 481 F16 481 F17 481 F18 481 F19 481 DTQ 1201 aa |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACCTACACAGCCCATGCTGGAGCC 1200 A D F G L S R L M T G D T Y T A H A G A AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCA-------------------------------------------------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCAT------------------------------------------------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AA---------------------------------------------------------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ------------------------------------------------------------ 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AA---------------------------------------------------------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCT-------- 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTTCCCCATCAAATGGACTGCACCCGAGAGCCTGGCCTACAACAAGTTCTCCATCAAG 1260 K F P I K W T A P E S L A Y N K F S I K Figura 55. Alineación de las secuencias automáticas de los pacientes LMC F1, F2, F3, F5, F6, F10, F11, F12, F13, F14, F25, F16, F17, F18, F19 y la secuencia reportada para el dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL (número de acceso: NM 005157). La zona resaltada en azul claro indica las secuencias a las que se unen los cebadores sentido ABL-F4 y antisentido ABL-R6. Las letras mayúsculas en color fucsia indican la secuencia aminoacídica del dominio tirosina quinasa. La zona resaltada en verde corresponde al bolsillo de unión al ATP en el dominio. Las letras color naranja dentro de la zona verde corresponden al loop catalítico del dominio. Las letras en color azul remarcadas corresponden al loop de activación del dominio. 137 A continuación, la tabla XV presenta un resumen de los resultados obtenidos en el estudio de los tres factores implicados en el mecanismo de resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes venezolanos con LMC, donde sólo se consideraron los 15 pacientes que pudieron ser secuenciados para el dominio tirosina quinasa. Tabla XV. Resumen de los resultados obtenidos en el estudio de los factores que afectan la respuesta al tratamiento con imatinib. Las filas resaltadas indican las diferentes fases de la LMC. Las columnas indican los diferentes parámetros calculados. Las iniciales en la columna de pacientes, representan los nombres de las muestras. Las iniciales en la columna de tratamiento indican la respuesta que tuvieron los pacientes al Imatinib: ST= sin tratamiento, TI= tratamiento irregular, RT= responde al tratamiento, RH= respuesta hematológica, NR= no responde al tratamiento y -- = no se cuantificó o no se sabe su respuesta al tratamiento porque son pacientes referidos del interior. Paciente Expresión del Fase Crónica Fase Acelerada Crisis Blástica Pacientes Pacientes Pacientes gen Lyn Mutación puntual Cuantificación de En el DTQ BCR/ABL Respuesta al tratamiento con Imatinib FC No varió No se encontró _ ST LM No varió No se encontró _ TI JS No varió No se encontró _ ZB No varió No se encontró GZ No varió No se encontró 0.99% NR LP No varió No se encontró 17.8% NR 2.54% TI RT HP No varió No se encontró 13.76% RT OH No varió No se encontró 13.7% RH JH No varió No se encontró 10.9% JC No varió No se encontró 11% MR No varió No se encontró 2.74% RH GF No varió No se encontró 1.6% RT ML No varió No se encontró 37.5% RH M la C No varió No se encontró 2.5% RH AA No varió No se encontró 85.8% NR RH NR ni con Nilotinib Como se puede observar en la tabla XV los 15 pacientes analizados se encontraron distribuidos en las diferentes fases clínicas de la LMC, donde 4 muestras se ubicaron en la fase crónica, 5 muestras se ubicaron en la fase acelerada y 4 muestras se ubicaron en la fase 138 de crisis blástica. Los estudios de expresión del gen Lyn mostró que ninguno de los pacientes varió la expresión de este gen con respecto a los controles normales. En el estudio de las mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa, se encontró que estos pacientes tampoco presentaron mutaciones puntuales en ninguna de las regiones de este dominio. Por su parte, la cuantificación de la quimera BCR/ABL en estos mismos pacientes si evidenció valores en porcentajes de la expresión de esta quimera. Los valores reportados oscilaron en un rango entre 1.6% y 85.8%, observándose los mayores porcentajes en la fase de crisis blástica. Cuando estos porcentajes fueron comparados con el valor internacional esperado (0.001%) para un paciente que prácticamente no expresa la quimera y que en consecuencia está respondiendo satisfactoriamente al tratamiento con Imatinib, se encontró que todos nuestros valores estuvieron muy por encima del valor esperado. Estos resultados indicaron que desde el punto de vista de la expresión del encogen BCR/ABL, los pacientes analizados presentaron resistencia al tratamiento con Imatinib. Con respecto a la respuesta al tratamiento con Imatinib observada por los médicos tratantes, se obtuvo que 3 pacientes presentaron respuesta con Imatinib (RT), 5 presentaron respuesta hematológica (RH), 2 presentaron un tratamiento irregular (TI), 1 estaba sin tratamiento al momento de tomar la muestra (ST) y 2 no presentaron respuesta al tratamiento con Imatinib (NR). Así mismo, se observó que uno de estos últimos pacientes (JC) tampoco respondió al tratamiento con el inhibidor de segunda generación conocido como Nilotinib. 139 DISCUSIÓN La leucemia mieloide crónica (LMC) es una patología clínica que ha sido reportada mundialmente como una de las más comunes dentro del gran grupo que conforman las leucemias y su estudio ha marcado pauta en la identificación y compresión de otras leucemias (Faderl y Col. 1999). El descubrimiento de la alteración genética que la causa, las transformaciones celulares que desencadenan su progresión y fase final, así como las estrategias que han sido empleadas para su tratamiento han permitido mejorar y aumentar la supervivencia y calidad de vida de las personas que la padecen. Son innumerables las investigaciones que se han avocado a la búsqueda de una cura definitiva contra esta enfermedad y aunque existen muchos grupos de trabajo, tanto en Europa como en América y el resto del mundo, es importante resaltar la labor invaluable de investigadores como Junia Melo, Michael Dininger, John Goldman, Stefan Faderl, Wolf Hofmann, Hagop Kantarjian, Charles Sawyer, David Barnes, James Griffin y Susan Branford, entre otros, quienes utilizando diferentes herramientas moleculares y bioquímicas han ido despejando las incógnitas que hacían impenetrable el complejo mundo de la LMC, transformándola de una enfermedad incurable y mortal a una enfermedad donde el paciente, si es diagnosticado a tiempo, tiene muchas probabilidades de sobrevivencia. En América del sur son escasas las investigaciones que han sido publicadas sobre pacientes con LMC en comparación con el resto del mundo. Sin embargo, los estudios realizados en países como Brasil, Chile, Argentina, Ecuador y Bolivia han permitido conocer el espectro de frecuencia con que se presenta esta patología en cada una de estas poblaciones, lo que a su vez amplió más el conocimiento sobre la misma y su comparación entre poblaciones. En el caso particular de Venezuela, se podría decir que actualmente el estudio de la LMC ha tenido un gran avance ya que muchos datos citogenéticos e incluso moleculares han sido reportados tanto en revistas nacionales como expuestos en congresos internacionales. El pionero en los estudios moleculares de la 141 LMC en Venezuela es el Dr. José Luís López, quien no solo creó el primer laboratorio de biología molecular para la detección de la LMC a nivel nacional, sino que además ha capacitado a un grupo considerable de personas para el diagnóstico de esta. El trabajo que a continuación se discute contó con su valiosa colaboración y permitió terminar satisfactoriamente tanto la parte del diagnóstico molecular de la LMC como lo referente a la citometría de flujo y los estudios de resistencia al tratamiento con Imatinib. En este contexto, el presente trabajo reporta el estudio molecular del oncogen BCR/ABL causante de la leucemia mieloide crónica o LMC en pacientes venezolanos provenientes de los centros de referencia nacional: Banco Municipal de Sangre (BMS) y del hospital Dr. Miguel Pérez Carreño (HMPC). La detección molecular se centró en la búsqueda del punto de fusión de los genes bcr y abl que originan la translocación t(9;22), esta incluyó la detección de las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 reportadas para la LMC mediante el uso de la técnica de RT-PCR convencional con cebadores específicos para cada una de ellas. Todas las variantes obtenidas de algunos pacientes fueron clonadas y secuenciadas. La posibilidad de encontrar otras alteraciones (mutaciones puntuales) en la región donde ocurre la fusión BCR/ABL también fue analizada. Los datos obtenidos permitieron realizar análisis de frecuencia de la translocación BCR/ABL y de cada una de las variantes encontradas en nuestra población con respecto a las reportadas en otros países latinoamericanos, así como su relación con la edad y el sexo. Este trabajo reporta la presencia de un gran número de pacientes (97) con sintomatología clínica de leucemia, sospechosos de LMC pero que resultaron negativos al estudio molecular de BCR/ABL. Por esta razón, se decidió incluir la detección de otras translocaciones asociadas a otros tipos de leucemias, lo cual no solo permitió determinar si estos pacientes sufrían de esas alteraciones sino que además permitió establecer un diagnóstico molecular más completo de estas patologías en el laboratorio. La estandarización del panel de leucemia desarrollado en este trabajo será usado a futuro tanto para la búsqueda de otras translaciones en un mismo paciente, sospechoso de LMC negativo para la translocación BCR/ABL, como para el análisis de aquellos pacientes con 142 sintomatología clínica no definida para un tipo específico de leucemia. Todo esto redundará en un rápido y mayor número de muestras procesadas con resultados confiables. Adicionalmente, debido a la importancia que aún tienen los análisis por citometría de flujo durante el diagnóstico inicial de las leucemias (linaje celular de los blástos), también realizaron inmunofenotipos en algunas de las muestras de pacientes con LMC referidos del Banco Municipal de Sangre, haciendo mayor énfasis en los casos LMC en crisis blástica. Estos datos permitieron confrontar mas de un método diagnóstico sobre un mismo paciente, lo cual ayudó a evaluar en conjunto ventajas y desventajas de ambos métodos y estrategias que permitieran acelerar con eficiencia el diagnóstico de las personas afectadas. Por último, en vista de la gran importancia que ha tenido el tratamiento con el fármaco Imatinib en la supervivencia de pacientes con LMC, se llevó a cabo un último estudio que incluyó el análisis de tres de los principales factores que han sido implicados en la resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes LMC en las tres diferentes fases de la enfermedad. En detalle, con respecto la estandarización de los protocolos de extracción de ARN total para el diagnóstico molecular de la quimera BCR/ABL se encontró que ambos proporcionaron excelentes resultados. Así, los resultados obtenidos con el método de guanidine isothiocyanate de Chomczynski y Sacchi (1987) concordaron con los obtenidos por Lee y col. (1995), Tobal y col. (2000), Deininger y col. (2000), Hofmann y col. (2002) y Ohmine y col. (2003), quienes trabajando con PCR multiplex en pacientes LLA con BCR/ABL positivo, RT-PCR semicuantitativa en enfermedad mínima residual de pacientes con LMA, differential display en líneas celulares que reproducen la LMC para estudios de expresión génica, estudios de expresión génica con microarreglos de Oligonucleótidos en pacientes LLA Ph+ tratados con Imatinib y estudios de expresión génica usando microarreglos de DNA en líneas celulares BCR/ABL+ resistentes a 143 Imatinib respectivamente, lograron obtener un ARN total de óptima calidad. Una de las principales ventajas de este método es que ha sido muy recomendado para aquellos laboratorios que están comenzando pues garantiza buenos resultados con reactivos más económicos. Sin embargo, el hecho de usar reactivos que pueden ser preparados en el laboratorio puede traer como consecuencia la probabilidad de contaminación en la extracción del ARN total, dado que involucra la preparación de todas las soluciones en el laboratorio. Por último, está el hecho de que el método de Chomczynski y Sacchi (1987) contempla un protocolo más laborioso que implica más pasos en el proceso de extracción (comparado con el método de trizol) lo que podría ser otra fuente de contaminación de este método. Por su parte, los resultados obtenidos con el método de trizol fueron comparables con los reportados en trabajos como los de Pierce y col. (2000), Roche-Lestienne y col. (2002), Kaneta y col. (2003), Hui y col. (2003), Barbouti y col. (2003), Branford y col. (2003), Jiang y col. (2004), Boultwood y col. (2004), Zeng y col. (2005) y muchos otros, quienes obtuvieron un ARN total con un buen rendimiento y pureza que podía ser usado en estudios de líneas celulares expresando BCR/ABL para estudios de señalización celular, estudios de identificación de mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de la quimera BCR/ABL usando RFLP RT-PCR y ASO-PCR, estudios de expresión génica usando microarreglos, cuantificación por RT-PCR en tiempo real de la respuesta a tratamiento en pacientes LMC, estudios con FISH y RT-PCR de otros tipos de translocaciones presentes en pacientes LMC en crisis blástica, secuenciación automatizada para detección de mutaciones, estudios de desregulación de la expresión génica por BCR/ABL, etc. Estas y muchas otras investigaciones ponen de manifiesto la generalización que ha tomado este método en diferentes tipos de estudios moleculares de la LMC. Una de las principales ventajas del método de trizol con respecto a otros métodos es que este permite, una vez que es agregado a las células en estudio, no solo la lisis de estas si no que además esta solución puede ser almacenada para procesamientos 144 posteriores sin que el ARN sufra algún daño debido a que la solución de trizol es capaz de estabilizar las moléculas de ARN minimizando su degradación tal como fue reportado por Branford y col. (2003). Con respecto a la detección por RT-PCR del punto de fusión BCR/ABL, en este trabajo se reporta la identificación de la translocación BCR/ABL en sus diversas variantes en 200 pacientes venezolanos con diagnóstico clínico de LMC. Estos resultados fueron confirmados por secuenciaciones automáticas posteriores en algunas de las muestras, en las que se evaluó no solo el punto de fusión BCR/ABL sino también la presencia de otras alteraciones (posibles mutaciones puntuales) en las secuencias adyacentes al punto de fusión de la quimera. En referencia a la frecuencia de aparición de la translocación BCR/ABL en nuestros pacientes se determinó que de los 297 pacientes analizados molecularmente, 67.3% (200) fueron casos positivos para LMC, mientras que un 32.7% (97) correspondió a casos negativos. Nuestros resultados no concordaron con los reportados por Cross y Melo (1994), Barnes y Melo (2003), Ohsaka y Col. (2002), Wong y col. (2003), Mundhada y col. (2004), Ray y col. (2004), quienes encontraron que de un 100% de casos de LMC clínicamente diagnosticados un 90-95% presentó la translocación BCR/ABL distintiva de la enfermedad mientras que un 5% no la presentó. Así mismo, con lo reportado por Goh y Col. (2006) quienes reportaron un porcentaje mayor (98%) del transcrito BCR/ABL en los pacientes coreanos con LMC. La discrepancia en los resultados obtenidos en este trabajo y la reportada en la bibliografía pudo deberse a varios factores: A) una discordancia en la exigencia de la clasificación clínica de los posibles pacientes LMC en nuestro país con respecto a otros países, es decir, puede ser que debido a que la sintomatología clínica de la LMC es muy similar a muchos otros síndromes mielodisplásicos, los médicos tratantes podrían, a propósito, solicitar la realización del oncogen BCR/ABL aún cuando se sospeche que algunos pacientes no sufren de LMC. Quizá los médicos prefieren ser flexibles en la 145 realización del diagnóstico a arriesgarse a que algún paciente potencialmente positivo se les quede fuera del diagnóstico, B) al ser los dos centros hospitalarios, utilizados en esta investigación, sitios de referencia nacional para el estudio de las leucemias, llegan muchas muestras provenientes de diferentes regiones del interior con un diagnóstico previo de posible LMC del cual no se tiene certeza porque no se cuenta con la historia clínica del paciente, C) muchas de las muestras llegan sin la solicitud de ser analizadas primero por el citómetro de flujo (pues esto aumentaría los costos) antes de hacer el diagnóstico molecular para tener una idea del linaje celular que estas presentan y así poder descartar de antemano aquellas muestras con características diferentes, D) el hecho de que muchos médicos tratantes mandan muestras de pacientes que son síndromes mielodisplásicos en proceso de transformación a LMC o LMA para que se les realice el oncogen, estas muestras pueden o no dar positivas para BCR/ABL y F) el tipo de muestra (SP o MO) a partir de la cual se realizaron los análisis. En relación a este último punto, es bien sabido que pacientes que están en el inicio de la enfermedad pudieran resultar negativos a un análisis molecular a partir de SP, por lo tanto el hecho de que algunas muestras fueran tomadas a partir de SP, pudo haber generado la presencia de falsos negativos. Todos los casos antes mencionados pudieron conllevar entonces a la obtención de un mayor número de resultados negativos para la detección de la translocación en comparación con lo reportado, razón por la cual se hace imprescindible poder comunicar estos datos a los servicios de hematología y a los médicos que integran estos servicios, de modo de garantizar que se tomen medidas que permitan orientar a estos profesionales en el tipo de paciente que debe ser analizado molecularmente. Cabe destacar, que la recomendación no solo incluiría el detalle del procesamiento molecular, sino además lo referente a la toma y tipo de muestra por parte de los médicos del interior del país. Adicional a la detección de la translocación BCR/ABL en general, este trabajo también reporta los primeros datos vinculados a la identificación de 3 de las variantes creadas por los diferentes puntos de ruptura en el gen bcr (b2a2, b3a2 y e1a2) en los 200 146 pacientes LMC que resultaron positivos para esta translocación. El análisis de frecuencia realizado para las variantes b2a2 y b3a2 mostró un alto porcentaje de estas dos variantes, 43.5% (87 pacientes) y 39.5% (79 pacientes) respectivamente, con respecto a la variante e1a2 la cual presentó una frecuencia menor de 3.5% (7 pacientes). Estas variaciones en las frecuencias fueron analizadas estadísticamente y se observaron diferencias significativas entre estos dos grupos, lo se que traduce en una prevalencia de las variantes b2a2 y b3a2 en comparación con la variante e1a2. Sumado a esto, también se evaluó estadísticamente si la pequeña diferencia observada entre las dos variantes más frecuentes (b2a2 y b3a2) era significativa, encontrándose una diferencia no significativa entre ambas variantes, lo que indicó una misma probabilidad de aparición para ambas en los pacientes venezolanos con LMC. Estos resultados fueron similares con los reportados por Cross y col. (1994), Arana-trejo y col. (2002), Meissner y Col. (1998); Gonzalez y col. (1993) y Dongen y Col. (1999) quienes trabajando con diferentes cantidades de pacientes con LMC también encontraron una mayor frecuencia de estas variantes con respecto a las demás. Estos mismos autores también observaron la misma predominancia de aparición entre las variantes b2a2 y b3a2 (ver tabla XI en resultados). En contraste, Paz-Miño y col. (2002) reportaron una mayor frecuencia de la variante b2a2 (94.6%) con respecto a la variante b3a3 (5.4%), en 37 pacientes LMC de la población ecuatoriana. Por su parte y en contraposición con las dos frecuencias del trabajo anterior, los trabajos de Artigas y col. (2002), Auewarakul y Col. (2006) y Mondal y Col. (2006) reportaron una mayor frecuencia de la variante b3a2 (100%/11 pacientes, 73%/139 pacientes y 57%/122 pacientes, respectivamente), con respecto a la variante b2a2 (0%/11, 27%/139 y 27%/122 pacientes, respectivamente) en pacientes chilenos, tailandeses y de la India. Las variaciones encontradas por los autores chilenos fueron asociadas principalmente a variaciones étnicas debido al alto grado de mestizaje presente en este país, en el caso de Venezuela aún cuando se presenta una población donde el mestizaje es predominante, no se observó una tendencia marcada hacia una de estas variantes (ver tabla XI en resultados). 147 En relación con la variante e1a2 se encontró que ésta se expresó con una baja frecuencia (3.5%) en los 200 pacientes con LMC estudiados en comparación con las otras variantes analizadas. Es importante destacar que esta variante es expresada generalmente en pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA), sin embargo algunos trabajos han reportado su presencia en algunos pacientes con LMC. En tal sentido, Melo y Col. (1994), Kirk y Col. (1996), Melo (1997), Lemes y col. (1999), Roumier y Col. (1999), Ohsaka y col. (2002) y Andrikovics y Col. (2007) reportaron la expresión de la variante e1a2 en pacientes con LMC con una frecuencia muy baja (Ohsaka y Col. 2002, Melo y Col. 1994), la cual fue considerada como un caso raro en pacientes con LMC y se relacionó con un tipo específico de leucemia (leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) (Selleri y Col. 1990, Roumier y Col. 1999). Adicionalmente, Melo y Col. (1996) sugirieron que p190BCR/ABL, como también es conocida la variante e1a2, podía ser considerada como una forma especifica de LMC en la que las características citomorfológicas son intermedias entre LMC y LMMC. Por su parte, Ohsaka y Col. (2002) han considerado que estos casos deben ser tratados como una enfermedad heterogénea, puesto que en varios de ellos el componente monocítico no estuvo presente. Esta variante también ha sido relacionada con eventos secundarios de la misma LMC, es decir, con la evolución de la enfermedad y resistencia al tratamiento con Imatinib (Ohsaka y Col. 2002, Andrikovics y Col. 2007). En este estudio en particular no se observó ninguna relación directa entre la variante e1a2 y la fase de la enfermedad en la que se encontraban los pacientes. Así mismo, la respuesta al tratamiento también varió para cada paciente. Con respecto al componente monocítico, se encontró que el único paciente de los 7 reportados, perteneciente al centro de referencia BMS no presentó monocítosis, sin embargo este paciente llamó mucho la atención porque aunque fue positivo para el encogen BCR/ABL y citogenéticamente fue analizado como un caso de LMC, también presentó una sobreexpresión del gen JAK2 el cual ha sido principalmente relacionado con las patologías Policitemia Vera y Trombocitemia Esencial (Dra. Osiris Da Costa, comunicación personal). La variabilidad observada en nuestro paciente con respecto a los parámetros: a) 148 fase de la enfermedad, b) respuesta al tratamiento y c) presencia de un fenotipo indicativo de otras enfermedades diferentes de la LMC, nos induce a pensar en un carácter heterogéneo para esta condición en nuestro paciente tal como ha sido reportado por Ohsaka y Col. (2002), sin embargo habría que hacer un estudio mucho más exhaustivo sobre este punto antes de poder hacer cualquier aseveración. Adicional a la identificación de las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 por separado, también se reporta la identificación de la co-expresión de las variantes b2a2/b3a2 y b2a2/e1a2. Los resultados obtenidos en el cálculo de la frecuencia de estas coexpresiones evidenció un elevado porcentaje de expresión de la co-expresión de las variantes más frecuentes (12.5% para b2a2/b3a2) con respecto a una muy baja expresión de la co-expresión que involucra una de las variantes mas frecuentes (en este caso b2a2) y a la variante menos frecuente e1a2 (1% para b2a2/e1a2). En referencia a la coexpresión de las variantes b2a2/b3a2, los resultados obtenidos en este estudio fueron similares a los reportados por Arana-trejo y Col. (2002), Meissner y Col. (1999), Pallisgaard y Col. (1998), Dongen y Col. (1999) y Mondal y Col. 2006 quienes también identificaron esta co-expresión en pacientes con LMC y en líneas celulares ya establecidas, usando las técnicas de RT-PCR y multiplex RT-PCR. En cuanto a la frecuencia de expresión de esta misma co-expresión, Arana-trejo y Col. (2002) y Meissner y Col. (1999) observaron una frecuencia similar a la encontrada en este trabajo, mientras que por el contrario Donger y Col. (1999) y Goh y Col. (2006) reportaron una frecuencia de 5% y < 2% respectivamente. Estas diferencias en la frecuencia de expresión de la co-expresión b2a2/b3a2 quizá pudieron deberse a la técnica empleada por estos autores para la detección de las mismas, como se sabe (Pallisgaard y Col. 1998) una PCR multiplex puede generar problemas de inespecificidad por competencia de cebadores a la hora de la amplificación o al número de muestras empleadas para el estudio. En cuanto a la presencia y frecuencia de la co-expresión b2a2/e1a2 en pacientes LMC tenemos que nuestros resultados fueron muy similares a los reportados por van Rhee y Col. (1996). Estos investigadores reportaron la presencia de esta coexpresión tanto en pacientes en fase crónica como en crisis blástica con una frecuencia muy baja. En contraste, este 149 trabajo determinó que los 3 pacientes que presentaron esta co-expresión se encontraban en fase acelerada. Es indispensable aclarar que aunque en la discusión de las frecuencias de las diferentes variantes y co-expresiones se incluyeron reportes de varios países, en la tabla XI presentada en los resultados (donde se hace la comparación de la frecuencia obtenida en este trabajo con respecto a la obtenida en otros países), sólo se consideraron los trabajos realizados por latinoamericanos (México, Brasil, Ecuador y Chile) debido a que sus trabajos fueron los únicos que presentaron detalles completos de los valores de las frecuencias obtenidas para cada variante. Con respecto a la amplificación del gen bcr como control interno, se observó un buen resultado en aquellos pacientes que dieron negativos para la translocación BCR/ABL, descartando la posibilidad de ser falsos negativos. Estos pacientes mostraron una banda muy nítida a 800 pb, correspondiente al tamaño esperado para el producto de este gen, sin embargo, algunos de los pacientes que resultaron positivos para la translocación presentaron una amplificación del gen bcr que varió desde una banda tenue, pero distinguible, a la ausencia total de la misma. Estos resultados son similares a los obtenidos por Cross y Col. (1994) quienes aplicando RT-PCR en pacientes con posible LMC también encontraron variaciones en las amplificaciones del gen bcr en pacientes positivos para la translocación BCR/ABL. Cabe por lo tanto destacar que usando el control interno para amplificar el gen bcr, se pudo determinar con mucho grado de certeza que en los pacientes que no amplificaron la translocación, esto era debido a que realmente no estaba presente dicha mutación, incluso descartando posibles errores técnicos del método empleado. Aquellos pocos casos en que no se detectó ninguna banda durante la amplificación, fueron repetidos y atribuidos a errores técnicos. Pacientes que resultaron positivos por PCR para BCR/ABL presentaron una variación en la detección del gen bcr, sin embargo en estos casos no importó la ausencia 150 de la amplificación del gen control bcr, debido a que lo importante era que ya se estaba determinando la presencia de la translocación BCR/ABL. Dos últimos aspectos importantes que se consideraron en este trabajo fueron la edad y el sexo en relación con las frecuencias de las variantes encontradas. En el caso de la edad, los resultados obtenidos no mostraron ninguna relación significativa o tendencia entre la edad y la enfermedad o con alguna variante en particular, aún cuando se observó la predominancia de dos grupos de edades (21-40 y 41-60) en casi todas las variantes encontradas. Estos resultados fueron compatibles con los de Rosas-Cabral y Col. (2003), quienes no encontraron ninguna relación directa entre la edad y la presencia de BCR/ABL y sus variantes. Sin embargo, la gráfica que combina la distribución de las edades de los pacientes positivos para la translocación BCR/ABL vs la distribución de la población venezolana por edad, mostró una tendencia de la población venezolana a expresar la enfermedad en edades comprendidas entre los 30 y los 60 años aproximadamente, lo que cataloga a la LMC como una enfermedad que predominantemente se presenta en adultos. Nuestros resultados fueron compatibles con los publicados por Sawyer y Druker (1999), Melo y Col. 2003. Auewarakul y Col. (2006) y Mondal y Col. 2006, quienes clasifican a la LMC como una enfermedad que se manifiesta principalmente en adultos. Adicionalmente, el trabajo de Auewarakul y Col. (2006) también reportó una relación de la variante b3a2 con pacientes de mayor edad. Con respecto al sexo, en este trabajo no se encontró una relación significativa entre algunas de las variantes encontradas por separado o en general con un sexo en particular. Estos resultados se compaginan con los reportados por Goh y Col. (2006) quienes tampoco hallaron una relación entre las variantes y el sexo. Dado que este es el primer trabajo formal, con fines de investigación y académico, que se realiza en Venezuela en el diagnóstico molecular tanto del oncogen BCR/ABL como de cada una de sus variantes, se propuso la preservación de las diferentes variantes de la translocación BCR/ABL que pudieran expresar lo pacientes Venezolanos. En tal sentido, en este trabajo se reporta la clonación satisfactoria de las 151 variantes b2a2, b3a2 y e1a2, expresadas en pacientes con LMC. Dicho clonaje, permitió contar con material de respaldo que a posteriori puediera ser usado como control en la estandarización de otras translocaciones para el análisis de mutaciones puntuales en diferentes regiones de la quimera y para estudios de expresión génica. Adicionalmente, los clones también pueden servir para la creación de líneas celulares con características específicas que permitan continuar los estudios de estos tipos de patologías y así avanzar en el estudio tanto de la LMC como el de otras leucemias. Por su parte, las secuenciaciones automáticas de las variantes obtenidas por RTPCR corroboraron de manera definitiva la presencia de cada una de ellas en los pacientes con LMC. La alineación en bloques de los grupos de pacientes con respecto a cada variante reportada demostró la presencia de los puntos de fusión correspondiente a las variantes b2a2, b3a2 y e1a2. Tal como se documentó en la sección de RT-PCR, los puntos de fusión reportados en este trabajo son los mismos que han sido señalados en la mayoría de los trabajos relacionados con este tema. No se encontraron variantes del punto de fusión diferentes a las reportadas. En relación a las secuencias obtenidas para la variante b2a2, se observó que además del punto de fusión que identifica a esta variante, también se encontró la presencia de sustituciones de bases T/C en la porción abl de 3 (pacientes 93, 112 y 130) de las secuencias analizadas. Sin embargo, cuando se hizo la conversión de bases a aminoácidos de la región estudiada, se observó que ninguna de las sustituciones encontradas produjo cambios en el marco de lectura proteica. En este sentido, Mondal y Col. (2006) reportaron la presencia de este mismo polimorfismo en pacientes LMC de la India, el cual fue asociado con la presencia de co-expresiones de variantes BCR/ABL. Esta asociación del polimorfismo difiere de los resultados observados en este trabajo puesto que los tres pacientes que presentaron este polimorfismo presentaron solo la variante b2a2. Adicionalmente, Meissner y Col. (1998) y Saussele y Col. (2000) también demostraron la presencia del polimorfismo T/C en la quimera BCR/ABL, pero este se ubicó en la región bcr (exon b2) a 8 bases del punto de fusión BCR/ABL en pacientes 152 LMC. Además, Saussele y Col. (2000) reportaron una significante frecuencia (28,8%) de este polimorfismo tanto en pacientes LMC como en otros síndromes mielodisplásicos y leucemias agudas. Dada la prevalencia del polimorfismo en todos los pacientes LMC estudiados, estos investigadores propusieron el uso de este polimorfismo como marcador para diferenciar los alelos bcr rearreglados en heterocigotos versus los normales. Aún cuando las variaciones polimórficas en la secuencia de la porción abl reportadas en este trabajo no influyen para nada en la producción de la proteína final, llaman la atención debido a que es justo en la porción abl, de la quimera BCR/ABL, donde se localizan la mayoría de los dominios funcionales y reguladores de este híbrido. Con base en esto, se decidió hacer una búsqueda electrónica del dominio de la porción abl involucrado en la zona de secuenciación donde se encontraron los cambios y esta reveló que dicha zona corresponde al dominio SH3 de la quimera BCR/ABL reportada. El dominio SH3 es uno de los principales en la regulación de la actividad tirosina quinasa (TK) tanto de c-ABL como de la quimera BCR/ABL. En condiciones normales el dominio SH3 de la proteína ABL es capaz de asociarse intramolecularmente con diferentes regiones (punto de unión entre los dominios SH2 y SH1 (tirosina quinasa) y con la porción C-terminal) de esta molécula e inducir su inactivación o autoinhibición (Mayer y Baltimore 1994; Moarefi y Col. 1997; Hofmann y Col. 2002; Smith y Col. 2003). Adicional a esto, también se ha demostrado la asociación del dominio SH3 de ABL con otras proteínas reguladoras (Abi 1 y 2) de su actividad (Dai y Col. 2001). Aunque en principio, estos hallazgos parecieran hablar a favor de la aparición de polimorfismos o mutaciones puntuales en la región SH3 de la quimera BCR/ABL que eliminen la capacidad reguladora de esta región los trabajos de Lionberger y Col. (2000), Smith y Col. (2003) y Meyn y Col. (2006) plantean que la perdida de esta regulación es debido a procesos de fosforilación tanto en el mismo dominio SH3 como en los diferentes dominios a los cuales se une y que este proceso puede ser realizado tanto por la oligomerización de la propia quimera BCR/ABL como por proteínas pertenecientes a la 153 familia Src. Por otra parte, trabajos como los de Cross y Col. (1999); Stanglmaier y Col. (2003) y Nieborowska-Skorska y Col. (1999) demostraron que mutaciones en el dominio SH3 más bien inhiben la unión de BCR/ABL a otras proteínas en su efecto transformante. Esta misma situación ha sido reportada por Ren y Col. (2005) para la proteína PI3K, donde mutaciones en el dominio SH3, en su subunidad p58, inhibió la interacción de esta proteína con la misma BCR/ABL y que esto a su vez, inhibió el crecimiento independiente de los factores de crecimiento y citoquinas en las células que la producen. En el caso de las secuencias para las variantes b3a2 y e1a2 se encontró un 100% y 99%, respectivamente, de homología con la secuencia reportada en el gen-Bank para estas variantes. Además, se pudo observar que, a diferencia de lo encontrado para la variante b2a2, ninguna de las secuencias analizadas para estas variantes presentó sustituciones en su porción abl o bcr. Ya que el diagnóstico molecular de la quimera BCR/ABL fue negativo en 97 pacientes clínicamente sospechosos de LMC, se llevó a cabo la determinación de 7 tipos de translocaciones relacionadas con otros trastornos neoplásicos en estos pacientes. Esta detección fue basada en el hecho de que prácticamente todas las leucemias son originadas por translocaciones cromosómicas que producen proteínas híbridas funcionales que son capaces de inducir transformaciones malignas en los pacientes que las expresan (Zheng y Col. 2007). Sin embargo, es importante mencionar que son pocas las leucemias que presentan una única translocación que marque su inicio, tal como lo son las translocaciones BCR/ABL y PML/RARα respectivamente. En el caso de otras leucemias como la LMA y LLA se ha demostrado que tanto su origen como su evolución están relacionadas con la presencia de dos o más translocaciones las cuales, en la mayoría de los casos, pueden implicar un buen o mal pronóstico para la vida del paciente (Lo coco y Col. 1999; Nasedkina y Col. 2002; Zhu y Col. 2005; Wan y Col. 2007; Zheng y Col. 2007). 154 Con base a lo anteriormente expuesto, se llevó a cabo la estandarización de las translocaciones BCR/ABL (9:22) p190, E2A/PBX-1 (1:19), MLL/AF4 (4:11) y TEL/AML (12:21) vinculadas con el desarrollo de la leucemia LLA. Las translocaciones AML/ETO (8:21), PML/RARα (15:17) y CBFβ/MYH11 (INV 16) frecuentemente encontradas en la leucemia LMA y por último, la translocación PML/RARα (15:17) la cual está asociada con la presencia de la leucemia LPA (Ver esta misma sección en resultados). En los últimos años varios grupos de trabajo han realizado grandes esfuerzos por estandarizar multiplex PCRs que permitan, en una sola reacción y en un tiempo mínimo, amplificar tanto las translocaciones de buen y mal pronóstico ya conocidas, como las posibles variantes que se generan de estas. En este contexto, Pallisgaard y Col. (1998), Scurto y Col. (1998), van Dongen y Col. (1999), Ariffin y Col. (2003) y Liang y Col. (2002) han reportado la estandarización de multiplexs RT-PCRs donde, además de poner a punto todos los aspectos relacionados con una amplificación rápida y eficiente, también han desarrollado nuevos métodos de análisis de los fragmentos obtenidos en cada una de ellas. Así, Scurto y Col. (1998) estandarizaron una multiplex PCR donde los análisis de los productos de amplificación fueron realizados por Southern blot o dot-blot hybridization, Dupont y Col. (2002) estandarizaron una multiplex PCR donde los productos de PCR fueron analizados por fluorescencia en capillares y Shi y Col. (2003) quines estandarizaron una multiplex PCR donde los productos de amplificación fueron identificados y cuantificados por un equipo de PCR en Tiempo Real. En este estudio en particular, es importante mencionar que aunque en el inicio de la estandarización de las translocaciones se tuvo la intención de usar una PCR multiplex igual a la reportada por Pallisgard y Col. (1998), esta idea fue modificada debido al alto grado de inespecificidad de bandas (datos no mostrados). Dado que nuestro objetivo principal no era estandarizar PCRs multiplex, sino lograr obtener un buen amplificado de cada translocación que pudiera ser usado en el diagnóstico y pronóstico de estas alteraciones, se decidió hacer las reacciones de PCRs por separado pero en paralelo, 155 manteniendo el mismo programa de temperaturas reportado por Pallisgard y Col. (1998) para todas las translocaciones. En cuanto al método de verificación de los productos obtenidos, se siguió el procedimiento estándar que incluyó la corrida en geles de agarosa. Los resultados obtenidos en este trabajo para cada translocación son similares a los obtenidos por Pallisgard y Col. (1998) y los de Ariffin y Col. (2003), quienes observaron la presencia tanto de bandas esperadas, de acuerdo a los cebadores empleados, como la presencia de nuevas variantes creadas por “splicing alternativo”. Cabe destacar que los cebadores usados en la amplificación de cada translocación fueron creados de tal manera que se pudiera evidenciar la presencia de variantes dentro de cada una de ellas si las hubiera. Desafortunadamente, no se contó con controles positivos (ya fuesen pacientes o líneas celulares) que permitieran evidenciar la presencia de algunas de las translocaciones aún cuando se tenían los cebadores para amplificarlas. En pacientes que padecen de leucemia LLA, la presencia de las translocaciones BCR/ABL p190, E2A/PBX1 y MLL/AF4 han sido asociadas con un mal pronóstico en comparación con pacientes que no presentan estas translocaciones, mas aún estos pacientes presentan una menor respuesta al tratamiento (Crist y Col. 1990; Chessells y Col. 2002; Ariffin y Col. 2003). En el caso particular de la translocación MLL/AF4, esta ha sido asociada con una LLA muy agresiva en niños (Nasedkina y Col. 2002). Por el contrario, la translocación TEL/AML1, una de las más comunes en niños con LLA, ha sido asociada a un buen pronóstico, en el que los pacientes muestran una excelente respuesta al tratamiento seguida de una remisión completa o un porcentaje de recaída muy bajo. El logro de la detección de la translocación TEL/AML1 por métodos moleculares aumentó significativamente la calidad de vida de los pacientes LLA debido al buen pronóstico que ella indica. Anteriormente no se tenía conocimiento de esta translocación debido a que el rearreglo cromosomal que la produce es criptico o silencioso, es decir, no podía ser identificado por métodos citogenéticos (Shurtleff y Col. 1995; Rubnitz y Col. 1997). 156 Con base en estos descubrimientos, la terapia moderna para niños con LLA ha incluido en su método de riesgo estratificado la detección de la translocación TEL/AML1, como marcador de bajo riesgo de muerte y las translocaciones BCR/ABL (p190), MLL/AF4 y E2A/PBX1 como marcadores de alto riesgo de muerte (Nasednika 2003). Desde el punto de vista del tratamiento, los pacientes con LLA que presentan las translocaciones BCR/ABL (p190) y la MLL/AF4 reciben una combinación de altas dosis de quimioterapias y transplante de médula ósea y en el caso particular de la BCR/ABL el fármaco Imatinib es incluido en el tratamiento (Karachunskii y Col. (2002) nombrado por Nasedkina y Col. (2003); http://www.cancer.org). La detección temprana de las translocaciones de mal pronóstico en los pacientes con LLA unida a la aplicación inmediata de las estrategias de tratamiento antes mencionadas, han permitido aumentar la tasa de supervivencia de estos pacientes en un 65% (Arico y Col.2000). En el caso de la LMA, la presencia de las translocaciones AML/ETO, CBFβ/MYH11 y PML/RARα han sido asociadas con un buen pronóstico, mientras que todas las translocaciones que involucren al cromosoma 11q23 (MLL) están asociadas con un muy mal pronóstico, como lo son las translocaciones MLL/AF6, MLL/AF9 y MLL/ELL entre otras (http://www.cancer.org). La translocación AML/ETO ha sido reportada en un 6-8% en pacientes LMA adultos y en un 10-14% en niños con LMA y es especialmente encontrada en la LMA subtipo M2. Por su parte, la translocación CBFβ/MYH11 es encontrada en un 5-7% de pacientes LMA y es estrechamente asociada con el subtipo LMA-M4. La translocación PML/RARα ha sido reportada en un 5-10% de pacientes LMA y es asociada con el subtipo M3. En contraparte, la translocación BCR/ABL es raramente encontrada en la LMA (Martineau y Col. 1998; Van Dongen y Col. 1999). Es importante recalcar que aunque la translocación PML/RARα es propia de la LPA, esta es incluida en el panel de la LMA porque existen pacientes que pueden sufrir un proceso de transformación de LMA a LPA, de hecho la LPA es considerada por muchos autores como un subtipo de la LMA (subtipo M3) (Douer 2000; Lengfelder y Col. 2005). En cuanto al tratamiento empleado en los pacientes LMA, se recomienda el uso de quimioterapias en las que el tipo de drogas a combinar, su concentración y tiempo 157 de aplicación van depender de las translocaciones que cada paciente exprese (http://www.cancer.org). Por último, en el caso de la LPA, la translocación PML/RARα se ha convertido en el distintivo característico de su inicio debido a que todos los pacientes que presentan la translocación desarrollan los diferentes síntomas de esta enfermedad. La identificación de dicha translocación se ha convertido en los últimos años en sinónimo de buen pronóstico dado que ha sido demostrado que el 100% de los pacientes que la presentan tienen una excelente respuesta al tratamiento con ATRA (ácido retinoico todo trans. En estos paciente, al igual de cómo ocurre en otras translaciones, se ha evidenciado la presencia de pacientes que se han vuelto resistentes al tratamiento y se ha demostrado que dicha resistencia es debida a la aparición de otras translocaciones que asocian al gen RARα con otros genes como NPM y PLZF. Estos hallazgos han conllevado a la búsqueda de nuevos fármacos que permitan contrarrestar sus efectos. Es así como actualmente el tratamiento de la LPA ha incluido el uso de compuestos arsénicos como el trióxido arsénico (Lo coco y Col. 1999). La detección de todas estas translocaciones también es importante para los estudios de enfermedad mínima residual, donde pacientes que ya han entrado en una etapa de remisión completa son monitoreados eventualmente para prevenir una recaída. La aparición de alguna de las translocaciones de mal pronóstico implicaría la reaparición inminente de la enfermedad en estos pacientes (Dongen y Col. 1999; Boeckx y Col. 2002). Los grandes avances en la identificación de diferentes translocaciones y su asociación con un pronósticos clínicos específicos, para un tipo de leucemia dada, ha permitido la producción de fármacos con gran efectividad en el tratamiento de leucemias que años atrás eran consideradas altamente tóxicos, tales como son los casos particulares de la LMC BCR/ABL (9:22) tratada actualmente con Imatinib y la LPA PML/RARa (15:17) que es tratada con ATRA (Nasedkina 2003). 158 El último fin de la estandarización de todas estas translocaciones es poder crear a futuro, pero en un corto plazo, en nuestro país, arreglos en membrana o microarreglos que involucren la mayoría de las translocaciones reportadas y sus posibles variantes para cada tipo de leucemia que permitan ofrecer una mayor gama de translocaciones y variantes que amplíen la información diagnóstica y pronóstica para cada paciente en un tiempo mínimo. En este sentido, los trabajos recientes de Nasedkina y Col. 2002 y 2003, Shi y Col. 2003 y Chun y Col. (2007) están marcando pauta en el desarrollo una metodología que combina el uso de la multiplex PCR y la hibridización con microarreglos de oligonucleótidos para una más precisa identificación de los diversos transcritos de fusión que causan las leucemias. Adicional a los estudios de diagnóstico molecular de los pacientes con LMC, en este trabajo también reportamos el análisis inmunofenotípico de 10 pacientes LMC que resultaron positivos para la quimera BCR/ABL. La evaluación de estas muestras con el panel de leucemias demostró que para los 3 pacientes con LMC en fase crónica el inmunofenotipaje no fue significativo para el establecimiento de un diagnóstico contundente de esta patología, tal como ha sido reportado en trabajos anteriores (Darrell y Kenneth 1997; Bain y Col. 2002). La presencia de una muy elevada proporción (> 80%) de células pertenecientes a la serie mieloide madura y un bajo porcentaje (< 2%) de la serie inmadura permitió dar solo un diagnóstico sugestivo de LMC, indicado por la alta expresión de los marcadores hematopoyéticos de origen mieloide CD45, CD33 y CD13. Sin embargo, en los casos LMC en crisis blástica estos mismos análisis si permitieron hacer una excelente caracterización de la patología. Una vez evidenciada la presencia de una gran cantidad de blastos en las 7 muestras restantes (> 50 y 80% respectivamente), los inmunofenotipos con marcadores de superficie celular y citoplamáticos permitieron la clasificación de estas crisis blásticas en mieloides y linfoides. Estos resultados, a diferencia de los obtenidos en la LMC en fase crónica, si tuvieron un gran impacto en los procedimientos médicos que se sucedieron para tratar de salvar la vida de estos pacientes. Luego de la verificación de la presencia del encogen BCR/ABL, por métodos 159 moleculares, todos estos pacientes fueron iniciados en el tratamiento con Imatinib 600 mg y se pudo observar que los pacientes que presentaron una crisis blástica mieloide comenzaron a responder al tratamiento, mientras que dos de los pacientes que presentaron una crisis linfoide murieron al poco tiempo de iniciado el tratamiento. Adicionalmente se pudo observar que pocos meses después de iniciado el tratamiento con Imatinib los pacientes con crisis blástica mieloide tuvieron una mejor respuesta a este (algunos presentaron solo una respuesta hematológica) con respecto al paciente en crisis blástica linfoide, quien presentó una resistencia completa al Imatinib. Una baja respuesta al tratamiento, recaídas y posterior muerte en pacientes LMC con crisis blástica linaje linfoide han sido reportadas previamente. En este sentido, Druker y Col. (2001) y Lahayet y Col. (2005) han encontrado que pacientes LMC con crisis blástica linfoide, ya sea linaje B o T, siempre tienen una peor respuesta a la enfermedad aún cuando se aplique tratamiento con Imatinib y que esto mismo ocurre en pacientes con LLA positivos para BCR/ABL. Por su parte, Talpaz y Col. (2006) encontraron que pacientes con LMC en crisis blástica linfoide recaen nuevamente en la enfermedad luego de 6 meses de tratamiento aun cuando son tratados con inhibidores de segunda generación como el dasatinib. Gracias a este tipo de análisis los investigadores han coincidido en que el tratamiento en pacientes con crisis blástica linfoide, así como en pacientes con LLA BCR/ABL+, debe ser combinado y mucho más prolongado (Lahayet y Col. 2005). La inclusión al mercado de nuevos citómetros de flujo que permiten hacer un análisis con cuatro colores en lugar de dos ha permitido ampliar aun más el campo del estudio tanto de leucemias en sus fases iniciales e intermedias como de otros síndromes mielodisplásicos. En este contexto, Kussick y Wood (2003) demostraron que en un paciente en fase crónica se pudo identificar un proceso de transformación blástica donde los blastos presentaron un inmunofenotipo de linaje linfoide tipo T. Adicionalmente se ha reportado que en la actualidad la citometría de flujo esta siendo ampliamente incluida en los estudio de tratamiento de la LMC debido a la identificación de subpoblaciones de 160 células hematopoyéticas troncales en pacientes con LMC que han sido involucradas en la resistencia al fármaco Imatinib (Jiang y Col. 2007; Brendel y Col. 2007). La identificación de estas poblaciones celulares (Cd34+, CD38- y lin-) y la posterior identificación de la quimera BCR/ABL en ellas está marcando pauta en la búsqueda de mecanismos adicionales que participan en la resistencia a este compuesto, que hasta ahora es el tratamiento más eficaz contra este tipo de leucemia. Todos estos hallazgos demuestran que la técnica de inmunofenotipaje por citometría de flujo y los estudios moleculares deben co-existir para garantizar un diagnóstico integro que vaya a favor de la supervivencia de los pacientes que presentan estas patologías Con respecto a los estudios relacionados con la resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes con LMC, en el presente trabajo reportamos los resultados obtenidos en el análisis de tres de los factores mayormente implicados en esta resistencia. De los dos factores que involucran alteraciones en la quimera BCR/ABL, como lo son las mutaciones en el dominio tirosina quinasa y la modificación de los niveles de expresión de BCR/ABL, se encontró que ninguno de los pacientes analizados presentaron alguna de las mutaciones puntuales reportadas para el dominio tirosina quinasa de BCR/ABL. En cambio, los estudios de cuantificación de la expresión de BCR/ABL si mostraron un aumento significativo en la expresión de esta quimera en la mayoría de los pacientes examinados, principalmente en las etapas de fase acelerada y de crisis blástica. Por su parte, el estudio del factor que involucra la alteración de la expresión de proteínas como LYN que están relacionadas con la cascada de señalización “aguas abajo” de BCR/ABL demostró que el gen Lyn no presentó alteración en sus niveles de expresión en ninguna de las muestras analizadas, independientemente de la fase en la que se encontraban los pacientes. Estos resultados indican que en estos pacientes venezolanos el mecanismo de resistencia al Imatinib estuvo asociado con un aumento en la expresión de la quimera BCR/ABL, la cual fue capaz de evadir el efecto bloqueante del fármaco Imatinib. La reactivación de la quimera BCR/ABL por aumento en su expresión en pacientes con LMC ha sido ampliamente reportada (Le coutre y Col. 2000; Hochhaus y 161 Col. 2002; Chelysheva y Col. 2007). Además, se ha demostrado que este aumento puede ocurrir por reamplificación génica de la quimera, ya sea por duplicaciones a nivel del gen híbrido BCR//ABL o por la aparición de trisomia de los cromosomas 9 y 22 (Le coutre y Col. 2000; Weisberg y Griffin 2000), por un aumento directo en la producción de ARN mensajeros para BCR/ABL (Olavarria y Col. 2001; Chelysheva y Col. 2007) o por ambos (Sirulink y Col. 2001; Hochhaus y Col. 2002). Nuestros resultados son consistentes con los reportados por todos estos autores, quienes trabajando con muestras de pacientes con LMC o con diferentes tipos de líneas celulares demostraron un aumento en la expresión de BCR/ABL. Es importante aclarar que en este trabajo no se hicieron determinaciones citogenéticas (bandeo G o Fish) para verificar si el aumento en los niveles de mensajero fue debido a modificaciones a nivel cromosómico o genómico. Los estudios del aumento en la expresión de BCR/ABL en líneas celulares establecidas, a partir de pacientes con LMC o de células transfectadas con BCR/ABL que son resistentes a Imatinib, ha ofrecido una amplia gama de respuestas con respecto a la resistencia a fármacos en células expresando BCR/ABL, debido a que en ellas han podido ser observados varios mecanismos de resistencia que aún han sido encontrados en pacientes (Weisberg y Griffin 2000; Keeshan y Col. 2001; La Rosée y Col. 2004). La respuesta al tratamiento con Imatinib también se ha relacionado directamente con la fase de la enfermedad en la cual se encuentre el paciente. A nivel clínico, ha sido establecido que el uso de Imatinib es capaz de inducir una respuesta hematológica y citogenética en pacientes en diferentes fases de la LMC, principalmente en pacientes con fase crónica temprana donde se ha observado un 100% de respuesta hematológica y un 87% de respuesta citogenética al fármaco. En contraparte, en pacientes en fase acelerada y en crisis blástica la respuesta a Imatinib puede disminuir considerablemente observándose solo una respuesta de 16% y 8% respectivamente (Sawyer C. y Col. 2002; Radich J y Col. 2006). Así mismo, esa respuesta al fármaco ha estado asociada con una inducción de la disminución de los niveles de BCR/ABL, mientras que la resistencia al fármaco ha estado asociada con un aumento en sus niveles de expresión (Barnes y Col. 162 2005). A este respecto, los datos de este trabajo reportan que en todas las fases analizadas se observaron tanto pacientes que respondieron al tratamiento como pacientes que no lo hicieron, aún cuando todos presentaron altos niveles de expresión de BCR/ABL en relación con el valor reportado de no expresión (0.001%). Con base en esto, podemos inferir que en el caso de la fase crónica, los dos pacientes que no respondieron al tratamiento con Imatinib debieron su resistencia a diferentes factores, donde el paciente que presentó niveles más altos de BCR/ABL de (17.8 %) debió su resistencia a un alto número de moléculas de la quimera que no pudieron ser eliminadas con la dosis de Imatinib suministrada (para fase crónica generalmente se administran 400 mg/d), mientras que el paciente con un porcentaje mucho menor (0.99%) de BCR/ABL su resistencia pudo deberse a mecanismos independientes de la expresión de la quimera y al hecho de que quizá este paciente pudiera encontrarse en una etapa tardía de esta fase, tal como ha sido reportado (Branford y Col. 2003; Dai y Col. 2004; Radich y Col. 2006). El caso donde si hubo respuesta al Imatinib se podría decir que el paciente se encontraba en una etapa temprana de la fase crónica, que aunado a un porcentaje relativamente bajo (2.54%) de expresión de la quimera permitió que el fármaco (400 mg/d) pudiera cumplir su efecto. En estos casos también habría que considerar el tiempo de tratamiento que tenía cada uno de los pacientes al momento de la toma de la muestra. En el caso de la fase acelerada podemos decir que casi todos los pacientes respondieron al tratamiento aunque la mayoría presentó solo una respuesta hematológica (esta es la última respuesta que se pierde antes de entrar en la etapa de resistencia al Imatinib (Dra. Osiris Da Costa comunicación personal). Estos resultados podrían hablar de una posible recaída (hacerse resistentes) en estos pacientes en un período corto, lo cual es muy común en esta fase de la enfermedad. Con respecto al paciente que presento respuesta a Imatinib aún con valores elevados de BCR/ABL (13.76%) podemos decir que quizá este paciente fue tratado con la dosis más alta (600 mg/d) del tratamiento al momento de su diagnóstico y quizá esto indujo la eliminación a gran escala de la quimera. En cuanto a la fase de crisis blástica se observó que el paciente que tuvo respuesta al tratamiento fue el que presentó los niveles más bajos de BCR/ABL, dado que los pacientes en esta ultima fase generalmente son tratados con las dosis más altas del 163 fármaco nosotros podemos especular que la alta dosis de Imatinib (600 mg/d), al igual que el caso anterior, también pudo tener efecto sobre los niveles de BCR/ABL. Además, este caso podría ser un ejemplo de cómo aún en etapas avanzadas de la enfermedad solo la quimera puede estar ejerciendo el efecto transformante, tal como lo evidenció la respuesta inmediata de este paciente al ser tratado con Imatinib. Por su parte, el paciente que no respondió al tratamiento con Imatinib es obvio que debió su resistencia al exacerbado aumento en los niveles de BCR/ABL (85.8%), éste murió al poco tiempo de ser diagnosticado. Este último resultado es consistente con lo reportado por Radich J y Col. (2006) quienes reportaron una menor respuesta a Imatinib por parte de los pacientes en la etapa de crisis blástica y con lo reportado por Druker y Col. (2001) en cuanto al fallecimiento temprano de pacientes en crisis blástica. En resumen, estos resultados inducen a pensar que la respuesta que pueda tener un paciente al Imatinib va a depender de la etapa de la enfermedad en la que este se encuentre al momento de ser diagnosticado, de la cantidad de quimera que éste expresando y finalmente de la dosis de Imatinib que le sea colocada en el inicio de su tratamiento. Estos resultados también demuestran que Imatinib es capaz de actuar en las diferentes fases de la LMC en pacientes con diagnostico reciente e inducir una respuesta como ha sido reportado con anterioridad (Hochhaus y Col. 2002 y Branford y Col. 2002; Lahaye y Col. 2005; Kantarjian y Col. 2006). En relación a la ausencia de mutaciones puntuales en nuestros pacientes podemos decir que ésta pudo deberse a varios factores: 1) la presencia de mutaciones puntuales ha sido detectada en paciente en etapas muy avanzadas de la enfermedad, principalmente en pacientes con una resistencia secundaria (el paciente se recupera completamente y luego de 6 meses aproximadamente vuelve a recaer) (Gorre y Col. 2001; Branford y Col. 2002 y 2003; Shah y Col. 2002; Corbin y Col. 2003; Melo y Col. 2003; Kantarjian y Col. 2006; Shah y Col. 2007). En nuestro caso, todos los pacientes examinados correspondieron al grupo que presentaba una resistencia primaria, es decir, estos pacientes vienen de un primer diagnóstico en el que se les colocó por primera vez el fármaco Imatinib, tuvieron una respuesta inicial pero que al poco tiempo recayeron. 2) Aunque existen varios reportes que demuestran la presencia de mutaciones puntuales en 164 pacientes con LMC todavía existe una gran controversia en la frecuencia de aparición de las mismas (Roche-Lestienne y Col. 2002; Branford y Col. 2002). 3) Algunos autores (Hochhaus y Col. 2002; Roche-Lestienne y Col. 2002) no catalogan estas mutaciones como marcadores de resistencia al tratamiento con Imatinib debido a que estas también han sido encontradas en pacientes con LMC que nunca han sido sometidos a tratamiento. 4) Para que estas mutaciones puedan ser detectadas muchos autores han tenido que recurrir a métodos de detección muy sensibles (Shah y Col. 2002; Willis y Col. 2005; Sorel y Col. 2005; Hughes y Col. 2006), lo que ha llevado a aumentar la creencia de la baja frecuencia de las mismas aún cuando se hayan identificado diversos tipos de estas. Con respecto a este punto, en este trabajo la presencia de las mutaciones puntuales fue evidenciada usando el método de secuenciación directa igual que Branford y Col. 2003, quienes empleando este método en 144 pacientes con LMC lograron hacer la identificación de varias mutaciones en 27 pacientes en etapas avanzadas de la LMC. 6) El último factor que pudo originar la ausencia de mutaciones en este estudio fue el número de pacientes empleados en el análisis, sobre todo en lo que se refiere a los pacientes en fase acelerada y de crisis blástica. Estos resultados hablan en favor de una baja frecuencia de estas mutaciones y de la necesidad de aumentar el número de muestras, así como el afinamiento técnico, para lograr dar con estas. Con base en los reportes anteriores muchos investigadores piensan que, aunque han sido identificadas más de 50 mutaciones diferentes en pacientes con LMC resistentes al tratamiento con Imatinib (ver figura 56), estas mutaciones pueden ser consideradas como un efecto oncogénico secundario dependiente o independiente de BCR/ABL que puede aparecer con la evolución de la enfermedad en la que además, pueden ser estimulados otros cambios a nivel de la propia quimera o en otras proteínas con actividad tirosina quinasa (Gorre y Col. 2001; Roche-Lestienne y Col. 2002). 165 Figura 56. Mutaciones puntuales encontradas en el dominio tirosina quinasa (SH1) de la quimera BCR/ABL asociadas con la resistencia clínica a Imatinib. Los recuadros de colores identifican los diferentes dominios de BCR/ABL. La porción agrandada corresponde al dominio tirosina quinasa, también identificado como el dominio SH1. Los óvalos resaltados con las letras P, C y A corresponden a la región P-loop, catalítica y de activación de este dominio. Las líneas verticales identificadas con códigos corresponden a las diferentes mutaciones que han sido identificadas. En lo concerniente a la ausencia de cambios en los niveles de expresión del gen Lyn en pacientes con LMC resistentes al tratamiento con Imatinib se ha observado que, al igual que con las mutaciones puntuales, las modificaciones en su expresión y la de otros genes han sido observadas en pacientes en etapas muy avanzadas o finales de la LMC, principalmente en pacientes o en líneas celulares con resistencia secundaria a Imatinib y en pacientes con LLA Ph+ (Hofmann y Col. 2002; Donato y Col. 2003; Jing y Col. 2005). Como se mencionó en párrafos anteriores, quizá el hecho de que los pacientes empleados en este estudio presentaran una resistencia primaria contra Imatinib pudo ser el factor que determinó la ausencia de sobre-expresión en este gen. Por otro lado, la sobre-expresión del gen Lyn también ha sido vinculada directamente a procesos de transformación celular en los que la célula se ha vuelto independiente de la sobre-expresión de la quimera BCR/ABL. En este contexto, los trabajos de Dai y Col. (2004 a y b) usando las líneas celulares K562 y LAMA84, 166 resistentes a altas dosis de Imatinib, demostraron que en estas células la resistencia a Imatinib no era causada por sobre-expresión de BCR/ABL (los niveles de expresión de este fueron bajos) sino por la sobre-expresión de Lyn (Imatinib no inhibe a Lyn). Este hecho fue confirmado por el tratamiento de las dos líneas celulares con los agentes flavopiridol y bortezomib, los cuales redujeron drásticamente la expresión Lyn y Hck (ambas pertenecientes a la familia src) y en consecuencia produjeron una inducción a apoptosis en ambas líneas celulares. Lo que evidenció que el efecto transformante era ejercido por Lyn y no por sobre-expresión de BCR/ABL. Trabajos adicionales como los de Donato y Col. (2003), Jing y Col. (2005), Ito y Col. (2007) y Rahmani y Col. (2007) soportan estos datos y al mismo tiempo plantean que la sobre-expresión de Lyn en pacientes resistentes a Imatinib es un mecanismo secundario a la sobre-expresión de BCR/ABL que ocurre generalmente por el descontrol celular que ha causado la quimera en su proceso de transformación inicial y que es mayormente observado cuando los niveles de la quimera son abruptamente disminuidos por efecto de la inhibición por Imatinib. La extrapolación de los resultados que arrojan estas investigaciones, con respecto a los resultados obtenidos en este trabajo permiten especular que, dada la sobreexpresión de BCR/ABL en todos los pacientes analizados, la sobre-expresión de Lyn no fue aumentada puesto que la quimera estaría ejerciendo por si misma su efecto transformante en estas células. Estos datos también ayudan a corroborar que, en efecto, todos nuestros pacientes se encontraban en una etapa de resistencia primaria para el momento de toma de las muestras. Adicionalmente, es importante destacar que la mayoría de las investigaciones donde se ha observado sobre-expresión del gen Lyn han sido realizadas en líneas celulares establecidas que presentan una resistencia elevada al imatinib y los estudios de expresión génica que evidenciaron dicho aumento estuvieron basados fundamentalmente en estudios con microarray (Ohmine y Col. 2003). Con respecto a este último aspecto es imprescindible mencionar que la técnica de cuantificación relativa usada en este estudio incluyó el uso de SYBR Green como compuesto fluorescente para identificar el proceso de amplificación. Este procedimiento es visto por varios investigadores como un método de baja sensibilidad debido a la inespecificidad que presenta este compuesto al unirse al 167 ADN, lo que pudo haber generado un background en los resultados obtenidos. Quizá un aumento mínimo de expresión pudo estar enmascarado dentro del background creado por este compuesto, aunque en nuestro trabajo fueron tomadas todas las medidas necesarias de procesamiento de muestras y obtención de datos. Además, en este caso se hace necesario recordar que en este estudio todos los datos fueron normalizados por el uso del gen housekeeping GAPDH. A este respecto, en la actualidad se están creando kits específicos de detección para diferentes genes que son producidos con el mismo fundamento empleado para la cuantificación de la quimera BCR/ABL (con sondas TaqMan), los cuales permitirán aumentar aún más la sensibilidad en estas detecciones. Los resultados obtenidos en el estudio de las mutaciones y expresión génica sugieren que los próximos estudios deben estar enfocados en pacientes con períodos relativamente largos de resistencia primaria, a estudios de enfermedad mínima residual y principalmente aquellos pacientes que hayan presentado recaídas con resistencia secundaria a Imatinib. Además de los factores de resistencia al Imatinib que ya han sido discutidos en secciones anteriores, otras investigaciones han puesto en evidencia la activación de otros mecanismos que desencadenan resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes con LMC. En este sentido, los trabajos de Gorre y Col. (2002) y Pocaly y Col. (2007) demostraron la implicación de la sobre-expresión de las proteínas Hsp 90 y 70 respectivamente, en mecanismos de resistencia a imatinib independientes de BCR/ABL. Estas proteínas han sido vinculadas a la degradación de proteínas pro-apoptóticas. Por su parte, los trabajos de Yang y Col. (2003) evidenciaron que la hipermetilación de los sitios CpG del área promotora de genes como JunB, puede actuar otro mecanismo de resistencia a Imatinib usado por BCR/ABL para inhibir sobre-expresión de genes que promueven la diferenciación o apoptosis celular. Así mismo, los trabajos de GambacortiPasserini y Col. (2000) demostraron que la resistencia a Imatinib en modelos animales no fue debida a ninguno de los factores entes mencionados sino a la presencia en el plasma de una glicoproteína ácida α1 (AGP), la cual fue capaz de unirse a Imatinib de una 168 manera dosis-dependiente inhibiendo así su entrada a células BCR/ABL+. Ellos también encontraron que los niveles de esta proteína en el plasma habían sido elevados después del tratamiento con Imatinib. De igual forma, Ertmer y Col. (2007) demostraron que células de mamíferos tratadas con Imatinib fueron inducidas a autofagia (proceso de degradación dependiente de lisosomas) y que esta inducción fue dependiente de la dosis de fármaco suministrada. Este proceso también fue observado en diferentes tipos de líneas celulares, lo que indicó que este es un proceso que ocurre de manera general en todas las células. Igualmente, Dai y Col. (2004 a y b), trabajando con diferentes tipos de líneas celulares resistentes a Imatinib, hablaron de la presencia de mutaciones puntuales en sitios adyacentes al dominio tirosina quinasa que pudieran causar una inhibición alostérica que impida la unión de este fármaco con BCR/ABL. Uno de los hallazgos que ha causado más revuelo en las investigaciones de resistencia a Imatinib fue la demostración de que pacientes que adquieren una remisión citogenética completa de la LMC presentaan células progenitoras (CD34+; CD38+) y células troncales hematopoyética (HSC) quiescentes (CD34+; CD38-) que expresaban la quimera BCR/ABL y que estas no fueron eliminadas por el tratamiento con Imatinib aún después de dos años de tratamiento (Holyoake y Col. 2001; Bhatia y Col. 2003). Estos autores demostraron por Fish y RTQ-PCR que estas células presentaban niveles aumentados de BCR/ABL con respecto a las células mononucleares de la médula ósea. Ellos observaron que Imatinib no indujo apoptosis en las células progenitoras que transportaban la quimera. Bhatia y Col. (2003) evidenciaron que la persistencia de estas células no fue debida a la reamplificación de BCR/ABL y supusieron que como en estas células había sido reportada la actividad de una bomba de exflujo (ABCB1 ó MDR1 y ABCB2, Thomas y Col. 2004; Brendel y Col. 2007), esta podría estar causando la resistencia a Imatinib. Adicionalmente, Sengupta y Col. 2007, también encontraron que en pacientes con crisis blástica las vías de señalización implicadas en la renovación autocrina de las células troncales pueden ser afectadas por BCR/ABL en su transformación inicial pero que luego estas pueden hacerse independientes de esta quimera por activación continua de estas vías (Shh, Wnt, Notch y sonic hedgehog), lo que las conduce a posteriori a un estado de proliferación descontrolado. Por su parte, los 169 trabajos de Holyoake y Col. (2001) demostraron que células HSC silentes que expresaban la quimera BCR/ABL adquirían la capacidad de salirse de manera espontánea de la fase Go del ciclo celular y entrar a un estado continuo de ciclo celular, mientras que las células que presentaron una disminución de los transcritos BCR/ABL fueron inducidas a quiescencia. Estos autores también mostraron que estas células primitivas, aisladas de pacientes con LMC, son capaces de sobrevivir en ausencia de factores de crecimiento como IL-3 y G-CSF y esto ha sido relacionado con una activación anormal (inducida por BCR/ABL) de la producción autocrina de estos factores. En confirmación con estos hallazgos, Jiang y Col. (2007) corroboraron la inducción de los mecanismos de sobreexpresión de BCR/ABL, activación celular por la inducción autocrina de lo factores IL-3 y G-CSF y la expulsión de Imatinib por proteínas transportadoras en células troncales quiescentes. Estos trabajos concluyen que estas células hematopoyéticas, ya sean quiescentes o proliferantes, tienen un papel fisiológico determinante en la patología de la resistencia a Imatinib, principalmente en los pacientes que sufren recaída en la enfermedad. Este mecanismo de resistencia está marcando pauta en la búsqueda de nuevos fármacos que contrarresten el efecto de BCR/ABL. Aunque aún existe una gran controversia entre los diferentes factores que pueden inducir la resistencia a Imatinib en pacientes con LMC, varios autores (Gorre y Col. 2001; Olavaria y Col. 2001; Barnes y Col. 2005) están de acuerdo en que la sobreexpresión de BCR/ABL es el mecanismo primario que desencadena la resistencia inicial contra Imatinib, el cual puede ser sustituido en etapas avanzadas por la activación de mecanismos secundarios como los mencionados anteriormente. Todas las investigaciones analizadas hasta ahora permiten evidenciar el carácter redundante de la quimera BCR/ABL tanto en su proceso de transformación celular inicial como en la adquisición de resistencia al tratamiento con Imatinib. Este hecho ha traído como consecuencia la búsqueda de nuevos compuestos que sean capaces de atacar 170 a la quimera BCR/ABL y a otras quinasas tales como las pertenecientes a la familia Src, lo cual podría proveer un tratamiento mucho más efectivo para personas con LMC y LLA Ph+, principalmente en aquellas que se encuentran en un estado avanzado de la enfermedad (Kantarjian y Col. 2006). En este contexto, varios tipos de inhibidores de tirosina quinasa han sido desarrollados recientemente (ver tabla XVI). Estos fueron creados de acuerdo a los escenarios de resistencia que se han ido presentando. Tabla XVI. Compuestos inhibidores de proteínas tirosina quinasa y su espectro de acción. PDFGR= receptor-β del factor de crecimiento derivado de plaquetas. MAP= proteína activada por mitógenos. Tomado de Kantarjian y Col. 2006. DROGA QUINASA INHIBIDA Imatinib BCR/ABL, c-Kit, PDGFR. Dasatinib BCR/ABL, familia quinasa Src, c-Kit, PDGFR, quinasa receptora de epinefrina. Nilotinib BCR/ABL, c-Kit, PDGFR. SKI606 BCR/ABL, familia quinasa Src. VX680 BCR/ABL, quinasas Aurora, quinasa Flt3. BIRB 796 BCR/ABL, quinasa p38 MAP. ONO12380 BCR/ABL, quinasa LYN. Adafostin BCR/ABL, otras tirosinas quinasas. El desarrollo de estos inhibidores involucró varios aspectos, en lo referente al ataque de la quimera BCR/ABL se quiso asegurar una respuesta eficaz con los fármacos aún en pacientes que presentasen mutaciones tan críticas como la T315I. En los casos donde el problema fue la alta expresión de la quimera BCR/ABL se quiso obtener un compuesto que lograra la erradicación completa de esta a concentraciones muy bajas para poder así garantizar una mejor calidad de vida al paciente durante tratamiento. En relación con la sobre-expresión de otras quinasas como LYN, se planteó la necesidad de 171 crear un fármaco que con baja toxicidad para el organismo, que tuviera una acción dual, es decir, que lograra eliminar tanto a BCR/ABL como a otras quinasas para de esta manera evitar la ingesta de dos fármacos diferentes que pudieran crear efectos secundarios mayores a la cura (Kantarjian y Col. 2006). Todos estos hallazgos han permitido el ensamblaje por piezas de un escenario celular que abarca la identificación de muchas de las vías de señalización que pueden ser “tomadas” por la quimera BCR/ABL en su efecto transformante inicial y como éstas son modificadas a un nivel tal que permite el establecimiento, a posteriori, de una resistencia a gran escala contra fármacos como el Imatinib. Todos estos eventos nos permiten resumir que muy probablemente, el sendero a seguir en el tratamiento de esta enfermedad será la creación de un sistema de ataque que involucre la combinación de varios compuestos químicos específicos contra los puntos críticos que son “blancos” por la quimera tanto a nivel de células troncales como en las diferentes etapas de diferenciación celular que permita el resguardo de la estabilidad de los diferentes procesos celulares que al final son los que mantienen la homeostasis de la vida. . 172 CONCLUSIONES 1. Se logró el diagnóstico molecular de la translocación BCR/ABL en 200 pacientes venezolanos con clínica de Leucemia Mieloide Crónica (LMC). Las variantes encontradas fueron las b2a2, b3a3 y e1a2, así como la co-expresión entre ellas. Estos resultados demuestran que la técnica de RT-PCR usada fue altamente sensible en la detección de esta anomalía genética. 2. Las variantes b2a2, b3a2 y e1a2 pudieron ser clonadas y secuenciadas manual y automáticamente de forma satisfactoria. Las variantes analizadas presentaron el punto de fusión BCR/ABL reportado, pero en la secuencia de la variante b2a2 de algunos pacientes también se evidenció la presencia de una mutación puntual silente C/T en la porción abl de la fusión (3 en la posición 402 y 1 en la posición 434). La región donde se localizó la mutación puntual correspondió con el dominio SH3 de la proteína ABL. 3. La frecuencia de la translocación BCR/ABL en los pacientes venezolanos analizados fue de 67.3% (200/297). Este valor fue diferente al reportado internacionalmente (95%) para esta translocación en pacientes con LMC. Por su parte, las variantes tuvieron una frecuencia de 43.5% (87 pac.) para b2a2, de 39.5% (79 pac.) para b3a2, de 3.5% (7 pac.) para e1a2 y las co-expresiones b2a2/b3a3 (25 pac.) y b2a2/e1a2 (1 pac.) quedaron incluidas dentro del 13.5% restante. Las variantes b2a2 y b3a2 presentaron una mayor frecuencia comparación con la variante e1a2 y las coexpresiones de ellas, así mismo sus co-expresiones presentaron mayor frecuencia que la variante e1a2. La frecuencia de las variantes b2a2 y b3a2 fue igual a la reportada en México, Brasil y Chile. Mientras que la co-expresión b2a2/b3a2 fue más alta que la reportada por México y Brasil. La variante e1a2, generalmente presente en pacientes con LLA, fue expresada en pacientes con LMC con una baja frecuencia. 4. No se observó ninguna correlación entre las variantes BCR/ABL encontradas y la edad o el sexo en los 200 pacientes estudiados. Sin embargo, con respecto a la edad se 173 observó que de acuerdo a la distribución general de la población venezolana existe una mayor probabilidad de detección de la enfermedad en personas adultas, principalmente a partir de los 40 años de edad. 5. El gen bcr, aunque muestra una excelente amplificación en pacientes negativos para la translocación BCR/ABL, presentó variaciones en su expresión en pacientes que presentaron la translocación. 6. Se logró la estandarización satisfactoria de un panel de diagnóstico de otras translocaciones asociadas a diferentes tipos de leucemias, el cual permitió hacer la clasificación molecular de 40 de los 97 pacientes que dieron negativos para la translocación BCR/ABL. Se encontraron 2 pacientes positivos para CBFβ/MYH11, 5 pacientes positivos para AML1/ETO, 6 pacientes positivos para E2A/PBX1, 3 pacientes positivos para SIL/TAL, 11 pacientes positivos para TEL/AML y 9 pacientes positivos para PML/RARα. Estos resultados demuestran la importancia de este panel en la detección de otras translocaciones en pacientes donde no se tenga una certeza de su clínica, en la detección de varias translocaciones en un mismo paciente y en el procesamiento de un mayor número de muestras en un tiempo menor. 7. Se logró la identificación por citometría de flujo (inmunofenotipo) de 10 pacientes con clínica de LMC. A 3 de estos pacientes solo se les pudo dar un diagnóstico sugestivo de LMC, mientras que a los otros 7 se les pudo hacer la clasificación de una LMC en fase de crisis blástica y además, por este mismo método, se les consiguió identificar el linaje celular de los blastos que presentaba cada uno: 4 presentaron un linaje mieloide y 3 presentaron un linaje linfoide. Esta última identificación fue determinante en el tratamiento y supervivencia del paciente. Todos los pacientes en crisis blástica también dieron positivos para la translocación. Estos hallazgos demostraron el uso indispensable de esta herramienta en la clasificación completa de estas patologías. 174 8. El estudio de la resistencia a Imatinib en 23 pacientes con LMC en diferentes fases de la enfermedad, evidenció que de los tres factores analizados, el aumento en los niveles de expresión de la quimera BCR/ABL pareciera ser uno de los factores principalmente implicados en la resistencia contra Imatinib. En contraparte, la presencia de mutaciones puntuales en su dominio tirosina quinasa y el aumento en los niveles de expresión del gen Lyn parecieran no estar relacionadas con esta resistencia. Estos resultados no son determinantes dado que se deberían analizar los otros factores relacionados con la resistencia a Imatinib para poder dar una conclusión contundente a este respecto. 175 LISTA DE REFERENCIAS 1. Ahmed M, Dusanter-Fourt I, Bernard M, Mayeux P, Hawley RG, Bennardo T, Novault S, Bonnet ML, Gisselbrecht S, Varet B, Turhan AG. 1998. BCR-ABL and constitutively active erythropoietin receptor (cEpoR) activate distinct mechanisms for growth factor-independence and inhibition of apoptosis in Ba/F3 cell line. Oncogene. Jan 29;16(4):489-96. 2. Amarante-Mendes, GP. Naekyung Kim C, Liu L, Huang Y, Perkins CL, Green DR, Bhalla K. 1998. BCR/Abl exerts its antiapoptotic effect against diverse apoptotic stimuli trhough blokage of mithochondrial release of cytochromo C and activation of Caspase-3. Blood. 91: 1700-1705. 3. Andreu EJ, Lledo E, Poch E, Ivorra C, Albero MP, Martinez-Climent JA, Montiel-Duarte C, Rifon J, Perez-Calvo J, Arbona C, Prosper F, Perez-Roger I. 2005. BCR-ABL induces the expression of Skp2 through the PI3K pathway to promote p27Kip1 degradation and proliferation of chronic myelogenous leukemia cells. Cancer Res. Apr 15; 65(8):3264-72. 4. Andrikovics H, Nahajevszky S, Szilvasi A, Bors A, Adam E, Kozma A, Kajtar B, Barta A, Poros A, Tordai A. 2007. First and second line imatinib treatment in chronic myelogenous leukemia patients expressing rare e1a2 or e19a2 BCR-ABL transcripts. Hematol Oncol. 25:143-147. 5. Arana-Trejo RM, Ruiz Sánchez, Ignacio-Ibarra G, Baez de la Fuente E, Garces O, Gomez Morales E, Castro Granados M, Ovilla Martinez R, Rubio-Borja ME, Solis Anaya L, Herrera P, Delgado Llamas J, Kofman S. 2002. BCR/ABL p210, p190 and p230 fusion genes in 250 Mexican patients with chronic myeloid leukaemia (CML). Clin Lab Haematol. Jun. 24(3). 145-50. 6. Arico M, Valsecchi M, Camitta B, Schrappe M, Chessells J, Baruchel A, Gaynon P, Silverman L, Janka-Schaub G, Kamps W, Pui CH, Masera G. 2000. Outcome of treatment in children with Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia. N Eng J Med; 342: 998-1006. 7. Ariffin H, Chen SP, Wong HL, Yeoh A. 2003. Validation of a multiplex RT-PCR assay for screening significant oncogene fusion transcripts in children with acute lymphoblastic leukemia. Singapore Med J. 44(10): 517-520. 8. Artigas CG, Melo A, Roa JC, Paez E, Vittini C, Arriagada M, Gonzalez L, Pflaumer E, Roa I. 2002. [Detection of BCR-ABL gene sequences using RT-PCR in patients with leukemia in the IX region. Chile]. Rev Med Chil 130:623-630. 176 9. Auewarakul CU, Huang S, Yimyam M, Boonmoh S. 2006. Natural history of Southeast Asian chronic myeloid leukemia patients with different BCR-ABL gene variants. Acta Haematol 116:114-119. 10. Avvisati G, Lo Coco F, Mandelli F. 2001. Acute promyelocytic leukemia: Clinical and morphologic features and prognostic factors. Seminars in Hematology. 38: 1. 412. 11. Bain BJ, Barnett D, Linch D, Matutes E, Reilly JT. 2002. Revised guideline on immunophenotyping in acute leukaemias and chronic lymphoproliferative disorders. Clin Lab Haematol 24:1-13. 12. Baran, C. P., S. Tridandapani, C. D. Helgason, R. K. Humphries, G. Krystal, and C. B. Marsh. 2003. The inositol 5'-phosphatase SHIP-1 and the Src kinase Lyn negatively regulate macrophage colony-stimulating factor-induced Akt activity. J Biol Chem 278:38628-38636. 13. Barbouti, A., M. Hoglund, B. Johansson, C. Lassen, P. G. Nilsson, A. Hagemeijer, F. Mitelman, and T. Fioretos. 2003. A novel gene, MSI2, encoding a putative RNAbinding protein is recurrently rearranged at disease progression of chronic myeloid leukemia and forms a fusion gene with HOXA9 as a result of the cryptic t(7;17)(p15;q23). Cancer Res 63:1202-1206. 14. Barbouti A, T. Ahlgren, B. Johansson, M. Hoglund, C. Lassen, I. Turesson, F. Mitelman, and T. Fioretos. 2003. Clinical and genetic studies of ETV6/ABL1-positive chronic myeloid leukaemia in blast crisis treated with imatinib mesylate. Br J Haematol 122:85-93. 15. Barnes DJ, y Melo JV, 2002. Cytogenetic and molecular genetic aspects of chronic myeloid leukaemia. Acta Haematol 108:180-202. 16. Barnes DJ, B. Schultheis, S. Adedeji, J. V. Melo. 2005. Dose-dependent effects of Bcr-Abl in cell line models of different stages of chronic myeloid leukemia. Oncogene 24:6432-6440. 17. Barnes, D. J., D. Palaiologou, E. Panousopoulou, B. Schultheis, A. S. Yong, A. Wong, L. Pattacini, J. M. Goldman, and J. V. Melo. 2005. Bcr-Abl expression levels determine the rate of development of resistance to imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia. Cancer Res 65:8912-8919. 18. Barnes, K., E. McIntosh, A. D. Whetton, G. Q. Daley, J. Bentley, and S. A. Baldwin. 2005. Chronic myeloid leukaemia: an investigation into the role of Bcr-Ablinduced abnormalities in glucose transport regulation. Oncogene 24:3257-3267. 177 19. Bedi A, Zehnbauer BA, Barber JP, Sharkis SJ, Jones RJ. 1994. Inhibition of apoptosis by BCR-ABL in chronic myeloid leukemia. Blood. Apr 15; 83(8):2038-44. 20. Beedassy A, Topolsky D, Styler M, Crilley P. 2000. Extramedullary blast crisis in a patient with chronic myelogenous leukemia in complete cytogenetic and molecular remission on interferon-alpha therapy. Leuk Res. 2000 Aug; 24(8):733-5. 21. Bennett, J. M., D. Catovsky, M. T. Daniel, G. Flandrin, D. A. Galton, H. R. Gralnick, and C. Sultan. 1976. Proposals for the classification of the acute leukaemias. FrenchAmerican-British (FAB) co-operative group. Br J Haematol 33:451-458. 22. Bhatia R, Holtz M, Niu N, Gray R, Snyder DS, Sawyers CL, Arber DA, Slovak ML, Forman SJ. 2003. Persistence of malignant hematopoietic progenitors in chronic myelogenous leukemia patients in complete cytogenetic remission following imatinib mesylate treatment. Blood 101:4701-4707. 23. Boeckx N, Willemse MJ, Szczepanski T, van der Velden VHJ, Langerak AW, Vandekerckhove P, van Dongen JJM. 2002. Fusion gene transcripts and Ig/TCR gene rearrangements are complementary but infrequent targets for PCR-based detection of minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Leukemia; 16: 368-375. 24. Boultwood, J., A. Pellagatti, F. Watkins, L. J. Campbell, N. Esoof, N. C. Cross, H. Eagleton, T. J. Littlewood, C. Fidler, J. S. Wainscoat. 2004. Low expression of the putative tumour suppressor gene gravin in chronic myeloid leukaemia, myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukaemia. Br J Haematol 126:508-511. 25. Branford S, Rudzki Z, Walsh S, Grigg A, Arthur C, Taylor K, Herrmann R, Lynch KP, Hughes TP. 2002. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood 99:3472-3475. 26. Branford, S., Z. Rudzki, A. Harper, A. Grigg, K. Taylor, S. Durrant, C. Arthur, P. Browett, A. P. Schwarer, D. Ma, J. F. Seymour, K. Bradstock, D. Joske, K. Lynch, I. Gathmann, T. P. Hughes. 2003. Imatinib produces significantly superior molecular responses compared to interferon alfa plus cytarabine in patients with newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic phase. Leukemia 17:24012409. 27. Branford, S., Z. Rudzki, S. Walsh, I. Parkinson, A. Grigg, J. Szer, K. Taylor, R. Herrmann, J. F. Seymour, C. Arthur, D. Joske, K. Lynch, T. Hughes. 2003. Detection of 178 BCR-ABL mutations in patients with CML treated with imatinib is virtually always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphatebinding loop (P-loop) are associated with a poor prognosis. Blood 102:276-283. 28. Brendel C, Scharenberg C, Dohse M, Robey RW, Bates SE, Shukla S, Ambudkar SV, Wang Y, Wennemuth G, Burchert A, Boudriot U, Neubauer A. 2007. Imatinib mesylate and nilotinib (AMN107) exhibit high-affinity interaction with ABCG2 on primitive hematopoietic stem cells. Leukemia 21:1267-1275. 29. Briz, M., C. Vilches, R. Cabrera, R. Fores, and M. N. Fernandez. 1997. Typical chronic myelogenous leukemia with e19a2 junction BCR/ABL transcript. Blood 90:5024-5025. 30. Buchdunger E, Zimmermann J, Mett H, Meyer T, Müller M, Druker BJ, Lydon NB. 1996. Inhibition of Abl protein-tyrisine Kinasa in vitro and in vivo by a 2phenylaminopyrimidine derivative. Cancer Research. 56: 100-104. 31. Cahill MA, Janknecht R, Nordheim A. 1996. Signaling pathway: jack all cascades. Curr. Biol. 6: 16-19. 32. Canitrot Y, Lautier D, Laurent G, Fréchet M, Ahmed A, Turhan AG, Salles B, Cazaux C, Hoffmann JS. 1999. Mutator phenotype of BCR-ABL transfected Ba/F3 cell lines and its association with enhanced expression of DNA polymerase beta. Oncogene. 18: 2676-2680. 33. Catlett-Falcone R, Dalton WS, Jove R. 1999. STAT proteins as novel targets for cancer therapy. Signal transducer an activator of transcription. Curr Opin Oncol. Nov; 11(6):490-6. 34. Chapman RS, Whetton AD, Chresta CM, Dive C. 1995. Characterization of drug resistance mediated via the suppression of apoptosis by Abelson protein tyrosine kinase. Mol Pharmacol. Aug; 48(2):334-43. Ter Arkh ;79(4):49-53. 35. Chelysheva E, Turkina AG, Misiurin AV, Aksenova EV, Domracheva EV, Zakharova AV, Khoroshko ND. 2007. [Monitoring of minimal residual disease in patients with chronic myeloleukemia: clinical value of real-time polymerase chain reaction]. Ter Arkh 79:49-53. 36. Chessells JM, HarrisonCJ, Watson SL, Vora AJ, Richard SM. 2002. Treatment of infants with acute lymphoblastic leukemia: results of the UK Infant Protocols 1987-99. Br J Haematol; 117 (2): 306-14. 37. Chomczynski P. y Sacchi 1987. Single-step method of RNA isolation by acidic guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162:156. 179 38. Chomel JC, Brizard F, Veinstein A, Rivet J, Sadoun A, Kitzis A, Guilhot F, Brizard A. 2000. Persistence of BCR-ABL genomic rearrangement in chronic myeloid leukemia patients in complete and sustained cytogenetic remission after interferon-α therapy or allogeneic bone marrow transplantion. Blood. 95: 404409. 39. Chun SM, Kim YL, Choi HB, Oh YT, Kim YJ, Lee S, Kim TG, Yang EG, Park YK, Kim DW, Han BD. 2007. Identification of leukemia-specific fusion gene transcripts with a novel oligonucleotide array. Mol Diagn Ther. 2007;11(1):21-8. 40. Clark EA, y Brugge JS. 1995. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science. Apr 14;268(5208):233-9 41. Clark, R. E. 2000. Antisense therapeutics in chronic myeloid leukaemia: the promise, the progress and the problems. Leukemia 14:347-355. 42. Clark R, S. A. Byatt, C. F. Bennett, M. Brama, M. Martineau, A. V. Moorman, K. Roberts, L. M. Secker-Walker, S. Richards, O. B. Eden, A. H. Goldstone, C. J. Harrison. 2000. Monosomy 20 as a pointer to dicentric (9;20) in acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 14:241-246. 43. Cline MJ. 1994. The molecular basis of leukemia. Engl J Med. Feb 3; 330(5): 328-36. 44. Contri, A., A. M. Brunati, L. Trentin, A. Cabrelle, M. Miorin, L. Cesaro, L. A. Pinna, R. Zambello, G. Semenzato, and A. Donella-Deana. 2005. Chronic lymphocytic leukemia B cells contain anomalous Lyn tyrosine kinase, a putative contribution to defective apoptosis. J Clin Invest 115:369-378. 45. Corbin AS, La Rosee P, Stoffregen EP, Druker BJ, Deininger MW. 2003. Several Bcr-Abl kinase domain mutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib. Blood 101:4611-4614. 46. Cortes J, Fayad L, Kantarjian H, O'Brien S, Lee MS, Talpaz M. 1998. ssociation of HLA phenotype and response to interferon-alpha in patients with chronic myelogenous leukemia. Leukemia. Apr; 12(4):455-62. 47. Cortez, D., G. Reuther, A. M. Pendergast. 1997. The Bcr-Abl tyrosine kinase activates mitogenic signaling pathways and stimulates G1-to-S phase transition in hematopoietic cells. Oncogene 15:2333-2342. 48. Crist W, Carrol A, Shuster J, Jakson J, Head D, Borowitz M, Behm F, Link m, Steuber P, Ragab A, Hirt A, Brock B, Land V, pullen J. 1990. Philadelphia chromosome positive childhood leukemia: clinical and cytogeneticcharacteristics and treatment outcome. A pediatric oncology group study. Blood; 76: 489-94. 180 49. Cross, N. C., J. V. Melo, L. Feng, and J. M. Goldman. 1994. An optimized multiplex polymerase chain reaction (PCR) for detection of BCR-ABL fusion mRNAs in haematological disorders. Leukemia 8:186-189. 50. Dai Y, Yu C, Singh V, Tang L, Wang Z, McInistry R, Dent P, Grant S. 2001. Pharmacological inhibitors of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) kinase/MAPK cascade interact synergistically with UCN-01 to induce mitochondrial dysfunction and apoptosis in human leukemia cells. Cancer Res 61:5106-5115. 51. Dai, Q. Y., G. Souillet, Y. Bertrand, C. Galambrun, N. Bleyzac, A. M. Manel, B. Bruno, A. L. Souillet, E. Homole, M. P. Pages, P. Berlier, M. David, J. C. Berthier, B. Massenavette, B. Contamin, N. Philippe. 2004. Antileukemic and long-term effects of two regimens with or without TBI in allogeneic bone marrow transplantation for childhood acute lymphoblastic leukemia. Bone Marrow Transplant 34:667-673. 52. Dai, Y., M. Rahmani, S. J. Corey, P. Dent, S. Grant. 2004. A Bcr/Abl-independent, Lyndependent form of imatinib mesylate (STI-571) resistance is associated with altered expression of Bcl-2. J Biol Chem 279:34227-34239. 53. Dai, Y., M. Rahmani, X. Y. Pei, P. Dent, S. Grant. 2004. Bortezomib and flavopiridol interact synergistically to induce apoptosis in chronic myeloid leukemia cells resistant to imatinib mesylate through both Bcr/Abl-dependent and -independent mechanisms. Blood 104:509-518. 54. Dai, Y., M. Rahmani, X. Y. Pei, P. Khanna, S. I. Han, C. Mitchell, P. Dent, and S. Grant. 2005. Farnesyltransferase inhibitors interact synergistically with the Chk1 inhibitor UCN-01 to induce apoptosis in human leukemia cells through interruption of both Akt and MEK/ERK pathways and activation of SEK1/JNK. Blood 105:1706-1716. 55. Dai, Z. and et al. 1998. Oncogenic ABL and Src tyrosine kinasa elicit the ubiquitindependent degradation of target proteins through a Ras-independent patway. Genes dev. 12: 1415-1424. 56. Dai Z, P. Kerzic, W. G. Schroeder, I. K. McNiece. 2001. Deletion of the Src homology 3 domain and C-terminal proline-rich sequences in Bcr-Abl prevents Abl interactor 2 degradation and spontaneous cell migration and impairs leukemogenesis. J Biol Chem 276:28954-28960. 57. Darrell J y Kenneth A. 1997. Recent advances in flor cytometry: Application to the diagnosis of hematologic malignacy. The Journal of the American society of hematology. 90 (8) 2883-2892. 181 58. De Klein, A. van Kessel AG, Grosveld G, Bartram CR, Hagemeijer A, Bootsma D, Spurr NK, Heisterkamp N, Groffen J, Stephenson JR. 1982. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature.Dec 23; 300(5894):765-7. 59. Deininger MW, Druker BJ. 2003. Specific targeted therapy of chronic myelogenous leukemia with imatinib. Pharmacol; 55(3):401-23. 60. Deininger, M. W., S. Vieira, R. Mendiola, B. Schultheis, J. M. Goldman, and J. V. Melo. 2000. BCR-ABL tyrosine kinase activity regulates the expression of multiple genes implicated in the pathogenesis of chronic myeloid leukemia. Cancer Res 60:2049-2055. 61. Deininger, M., E. Buchdunger, B. J. Druker. 2005. The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia. Blood 105:2640-2653. 62. Deininger, M., T. Lehmann, R. Krahl, E. Hennig, C. Muller, D. Niederwieser. 2000. No evidence for persistence of BCR-ABL-positive cells in patients in molecular remission after conventional allogenic transplantation for chronic myeloid leukemia. Blood 96:779-780. 63. Demehri, S., P. Paschka, B. Schultheis, T. Lange, T. Koizumi, T. Sugimoto, S. Branford, L. C. Lim, T. Kegel, G. Martinelli, A. Hochhaus, B. J. Druker, M. W. Deininger. 2005. e8a2 BCR-ABL: more frequent than other atypical BCR-ABL variants? Leukemia 19:681-684. 64. Di Bacco, A., K. Keeshan, S. L. McKenna, T. G. Cotter. 2000. Molecular abnormalities in chronic myeloid leukemia: deregulation of cell growth and apoptosis. Oncologist 5:405-415. 65. Donato, N. J., J. Y. Wu, J. Stapley, G. Gallick, H. Lin, R. Arlinghaus, M. Talpaz. 2003. BCR-ABL independence and LYN kinase overexpression in chronic myelogenous leukemia cells selected for resistance to STI571. Blood 101:690698. 66. Dongen JJM, Macintyre EA, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G, Gottardi E, Rambaldi A, Dotti G, Griesinger F, Parreira A, Gamerio P, González M, malec M, langerak AW, San Miguel JF, Biondi A. 1999. Standardized RT-PCR analylisis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimalc residual disease. Leukemia. 13: 1901-1928. 67. Douer D. 2000. Transcription therapy for acute promyelocytic leukaemia. Expert Opin Investig Drugs 9(2):329-46. 182 68. Druker BJ, Sawyers CL, Capdeville R, Ford JM, Baccarani M, Goldman JM. 2001. Chronic myelogenous leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2001:87-112. 69. Druker, BJ, S. Tamura, E. Buchdunger, S. Ohno, G. M. Segal, S. Fanning, J. Zimmermann, N. B. Lydon. 1996. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med 2:561-566. 70. Dubrez L, Eymin B, Sordet O, Droin N, Turhan AG, Solary E. 1998. BCR-ABL delays apoptosis upstream of procaspase-3 activation. Blood. 91: 2415-2422. 71. Duncan, S. J., M. A. Cooper, D. H. Williams. 2003. Binding of an inhibitor of the p53/MDM2 interaction to MDM2. Chem Commun (Camb):316-317. 72. Dupont M, Goldsborough A, Levayer T, Savare J, Rey JM, Rossi JF, Demaille J, LavabreBertrand T. 2002. Multiplex fluorescent RT-PCR to quantify leukemic fusion transcripts. Biotechniques. Jul; 33(1):158-60, 162, 164. 73. Dvorak, P., D. Dvorakova, M. Doubek, J. Faitova, J. Pacholikova, A. Hampl, J. Mayer. 2003. Increased expression of fibroblast growth factor receptor 3 in CD34+ BCR-ABL+ cells from patients with chronic myeloid leukemia. Leukemia 17:2418-2425. 74. Ertmer A, Huber V, Gilch S, Yoshimori T, Erfle V, Duyster J, Elsasser HP, Schatzl HM. 2007. The anticancer drug imatinib induces cellular autophagy. Leukemia 21:936-942. 75. Faderl S, Hochhaus A, Hughes T. 2004. Monitoring of minimal residual disease in chronic myeloid leukemia. Hematol Oncol Clin. Jun;18(3):657-70. 76. Faderl S, Kantarjian HM, Talpaz M, O'Brien S. 2000. New treatment approaches for chronic myelogenous leukemia. Semin Oncol. 27(5):578-86. 77. Faderl S, Talpaz M, Estrov Z, Kantarjian HM. 1999. Chronic myelogenous leukemia: biology and therapy. Ann Intern Med. 131(3):207-19. 78. Fish EN, Uddin S, Korkmaz M, Majchrzak B, Druker BJ, Platanias LC. 1999. Activation of a CrkL-stat5 signaling complex by type I interferons. J Biol Chem. Jan 8;274(2):571-3 79. Galderisi U, Cascino A, Giordano A.1999. Antisense oligonucleotides as therapeutic agents. Journal Cell Physiology. 181: 251-257. 183 80. Gambacorti-Passerini C, Barni R, le Coutre P, Zucchetti M, Cabrita G, Cleris L, Rossi F, Gianazza E, Brueggen J, Cozens R, Pioltelli P, Pogliani E, Corneo G, Formelli F, D'Incalci M. 2000. Role of alpha1 acid glycoprotein in the in vivo resistance of human BCR-ABL (+) leukemic cells to the abl inhibitor STI571. J Natl Cancer Inst. Oct 18; 92(20):1641-50. 81. Goh HG, Hwang JY, Kim SH, Lee YH, Kim YL, Kim DW. 2006. Comprehensive analysis of BCR-ABL transcript types in Korean CML patients using a newly developed multiplex RT-PCR. Transl Res 148:249-256. 82. Golde, D. y Gulate, S. 1994. Enfermedades Mieloproliferativas. Hematología y oncología. Cap. 20. 2022-2028. 83. Goldman, J. 2004. CML resistance to tyrosine kinase inhibitors: how is the laboratory to tell? Lab Hematol 10:181-184. 84. Goldman, J. M. 2004. Chronic myeloid leukemia-still a few questions. Exp Hematol 32:210. 85. Goldman, J. M., y J. V. Melo. 2003. Chronic myeloid leukemia-advances in biology and new approaches to treatment. N Engl J Med 349:1451-1464. 86. Goldman, J. M., y J. V. Melo. 2001. Targeting the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 344:1084-1086. 87. Goldsby, R. Kindt, T y Osborne, B. 2000. Kuby immunology. W. H. Freeman and company. New York. 670pp. 88. Gonzalez FA, Villegas A, Asenjo S, Alvarez A, Ferro MT, Resino M. 1993. Study of the BCR/ABL rearrangement in patients with two Philadelphia chromosomes. Cancer Genet Cytogenet 70:153-154. 89. Gordon MY, Dowding CR, Riley GP, Goldman JM, Greaves MF. 1987. Altered adhesive interactions with marrow stroma of haematopoietic progenitor cells in chronic myeloid leukaemia. Nature 328:342-344. 90. Gorre, M. E., M. Mohammed, K. Ellwood, N. Hsu, R. Paquette, P. N. Rao, C. L. Sawyers. 2001. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science 293:876-880. 91. Gotoh, A., y H. E. Broxmeyer. 1997. The function of BCR/ABL and related protooncogenes. Curr Opin Hematol 4:3-11. 184 92. Gu, J. J., L. Santiago, B. S. Mitchell. 2005. Synergy between imatinib and mycophenolic acid in inducing apoptosis in cell lines expressing Bcr-Abl. Blood 105:32703277. 93. Guilhot, F., L. Roy, G. Martineua, J. Guilhot, and F. Millot. 2007. Immunotherapy in chronic myelogenous leukemia. Clin Lymphoma Myeloma 7 Suppl 2:S64-70. 94. Hakansson, P., C. Lassen, T. Olofsson, B. Baldetorp, A. Karlsson, U. Gullberg, T. Fioretos. 2004. Establishment and phenotypic characterization of human U937 cells with inducible P210 BCR/ABL expression reveals upregulation of CEACAM1 (CD66a). Leukemia 18:538-547. 95. Hakansson, P., D. Segal, C. Lassen, U. Gullberg, H. C. Morse, 3rd, T. Fioretos, P. S. Meltzer. 2004. Identification of genes differentially regulated by the P210 BCR/ABL1 fusion oncogene using cDNA microarrays. Exp Hematol 32:476482. 96. Harder T y M. Kuhn. 2001. Immunoisolation of TCR signaling complexes from Jurkat T leukemic cells. Sci STKE 2001:PL1. 97. Heid CA, Stevens J, Livak K, Williams PM. 1996. Real Time Quantitative PCR. Genome research 6; 986-994. 98. Hermans A, Heisterkamp N, von Linden M, van Baal S, Meijer D, van der Plas D, Wiedemann LM, Groffen J, Bootsma D, Grosveld G. 1987. Unique fusion of bcr and c-abl genes in Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia. Cell. 51(1):33-40. 99. Hershko, A. 1997. Roles of ubiquitin-mediated proteolysis in cell cycle control. Curr Opin Cell Biol 9:788-799. 100. Hochhaus A, Kreil S, Corbin AS, La Rosee P, Muller MC, Lahaye T, Hanfstein B, Schoch C, Cross NC, Berger U, Gschaidmeier H, Druker BJ, Hehlmann R. 2002. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy. Leukemia 16:2190-2196. 101. Hochhaus A. 2002. Detection and quantification of leukemia-specific rearrangements. Methods Mol Med 68:67-96. 102. Hochhaus A. 2002. Minimal residual disease in chronic myeloid leukaemia patients. Best Pract Res Clin Haematol 15:159-178. 185 103. Hochhaus, A., T. Lahaye, S. Kreil, U. Berger, G. Metzgeroth, R. Hehlmann. 2001. [Selective inhibition of tyrosine kinases - a new therapeutic principle in oncology]. Onkologie 24 Suppl 5:65-71. 104. Hofmann, T. G., A. Moller, H. Sirma, H. Zentgraf, Y. Taya, W. Droge, H. Will, M. L. Schmitz. 2002. Regulation of p53 activity by its interaction with homeodomaininteracting protein kinase-2. Nat Cell Biol 4:1-10. 105. Hofmann, W. K., L. C. Jones, N. A. Lemp, S. de Vos, H. Gschaidmeier, D. Hoelzer, O. G. Ottmann, H. P. Koeffler. 2002. Ph (+) acute lymphoblastic leukemia resistant to the tyrosine kinase inhibitor STI571 has a unique BCR-ABL gene mutation. Blood 99:1860-1862. 106. Hofmann, W. K., S. de Vos, D. Elashoff, H. Gschaidmeier, D. Hoelzer, H. P. Koeffler, O. G. Ottmann. 2002. Relation between resistance of Philadelphia-chromosomepositive acute lymphoblastic leukaemia to the tyrosine kinase inhibitor STI571 and gene-expression profiles: a gene-expression study. Lancet 359:481-486. 107. Holyoake TL, Freshney MG, Samuel K, Ansell J, Watson GE, Wright EG, Graham GJ, Pragnell IB. 2001. In vivo expansion of the endogenous B-cell compartment stimulated by radiation and serial bone marrow transplantation induces B-cell leukaemia in mice. Br J Haematol 114:49-56. 108. Hoover, R. R., F. X. Mahon, J. V. Melo, G. Q. Daley. 2002. Overcoming STI571 resistance with the farnesyl transferase inhibitor SCH66336. Blood 100:10681071. 109. Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, Branford S, Radich J, Kaeda J, Baccarani M, Cortes J, Cross NC, Druker BJ, Gabert J, Grimwade D, Hehlmann R, KamelReid S, Lipton JH, Longtine J, Martinelli G, Saglio G, Soverini S, Stock W, Goldman JM. 2006. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 108:28-37. 110. Hui CH, Goh KY, White D, Branford S, Grigg A, Seymour JF, Kwan YL, Walsh S, Hoyt R, Trickett A, Rudzki B, Ma DD, To LB, Hughes TP. 2003. Successful peripheral blood stem cell mobilisation with filgrastim in patients with chronic myeloid leukaemia achieving complete cytogenetic response with imatinib, without increasing disease burden as measured by quantitative real-time PCR. Leukemia 17:821-828. 111. Ito T, Tanaka H, Kimura A. 2007. Establishment and characterization of a novel imatinib-sensitive chronic myeloid leukemia cell line MYL, and an imatinib- 186 resistant subline MYL-R showing overexpression of Lyn. Eur J Haematol 78:417-431. 112. Jacquel, A., M. Herrant, L. Legros, N. Belhacene, F. Luciano, G. Pages, P. Hofman, P. Auberger. 2003. Imatinib induces mitochondria-dependent apoptosis of the BcrAbl-positive K562 cell line and its differentiation toward the erythroid lineage. Faseb J 17:2160-2162. 113. James, H A. y Gibson. I. 1998. The therapeutic potential of Ribozymes. Blood, 91: 371-382. 114. Jamieson, L., L. Carpenter, T. J. Biden, A. P. Fields. 1999. Protein kinase Ciota activity is necessary for Bcr-Abl-mediated resistance to drug-induced apoptosis. J Biol Chem 274:3927-3930. 115. Jiang J, Paez JG, Lee JC, Bo R, Stone RM, De Angelo DJ, Galinsky I, Wolpin BM, Jonasova A, Herman P, Fox EA, Boggon TJ, Eck MJ, Weisberg E, Griffin JD, Gilliland DG, Meyerson M, Sellers WR. 2004. Identifying and characterizing a novel activating mutation of the FLT3 tyrosine kinase in AML. Blood 104:18551858. 116. Jiang X, Zhao Y, Smith C, Gasparetto M, Turhan A, Eaves A, Eaves C. 2007. Chronic myeloid leukemia stem cells possess multiple unique features of resistance to BCR-ABL targeted therapies. Leukemia 21:926-935. 117. Jing, Y., N. Hellinger, L. Xia, A. Monks, E. A. Sausville, A. Zelent, S. Waxman. 2005. Benzodithiophenes induce differentiation and apoptosis in human leukemia cells. Cancer Res 65:7847-7855. 118. John M. Falletta M.D, Kenneth A. Starling M.D, Donald J. Fernbach M.D. 1973 Leukemia in twins. Pediatrics Vol. 52 No. 6 December, pp. 846-849. 119. Kaneta, Y., Y. Kagami, T. Tsunoda, R. Ohno, Y. Nakamura, T. Katagiri. 2003. Genome-wide analysis of gene-expression profiles in chronic myeloid leukemia cells using a cDNA microarray. Int J Oncol 23:681-691. 120. Kantarjian HM, Talpaz M, Giles F, O'Brien S, Cortes J. 2006. New insights into the pathophysiology of chronic myeloid leukemia and imatinib resistance. Ann Intern Med 145:913-923. 121. Kantarjian HM, Talpaz M. 1993. Therapy of chronic myelogenous leukemia. Stem Cells. 1993 Oct; 11 Suppl 3:8-9. Review. 187 122. Kantarjian, H., J. V. Melo, S. Tura, S. Giralt, M. Talpaz. 2000. Chronic Myelogenous Leukemia: Disease Biology and Current and Future Therapeutic Strategies. Hematology Am Soc Hematol Educ Program:90-109. 123. Kasper B, Fruehauf S, Schiedlmeier B, Buchdunger E, Ho AD, Zeller WJ. 1999. Favorable therapeutic index of a p210 (BCR-Abl)-specific tyrosine Kinase inhibitor; activity on linage-committed and primitive chronic myelogenous leukemia progenitors. Cancer Chemotherapy Pharmacology. 44: 433-438. 124. Keeshan, K., K. I. Mills, T. G. Cotter, S. L. McKenna. 2001. Elevated Bcr-Abl expression levels are sufficient for a haematopoietic cell line to acquire a drugresistant phenotype. Leukemia 15:1823-1833. 125. Kersey, J. 1997. Fifty years of studies of the biology and therapy of childhood leukemia. Blood. 90: 11. 4243-4251. 126. Kipreos ET, y Wang, JY. 1990. Differential phosphorilation of c-Abl in cell cycle determined by cdc2 Kinase and phosphatase activity. Science. 248: 217-220. 127. Kirk JA, Radich J, Edmands S, Lee A, VanDevanter DR, Reems JA, Bryant EM. 1996. Unusual expression of mRNA typical of Philadelphia positive acute lymphoblastic leukemia detected in chronic myeloid leukemia. Am J Hematol 52:129-134. 128. Kosugi, N., A. Tojo, H. Shinzaki, T. Nagamura-Inoue, S. Asano. 2000. The preferential expression of CD7 and CD34 in myeloid blast crisis in chronic myeloid leukemia. Blood 95:2188-2189. 129. Kreuzer, K. A., U. Lass, A. Bohn, O. Landt, C. A. Schmidt. 1999. LightCycler technology for the quantitation of bcr/abl fusion transcripts. Cancer Res 59:31713174. 130. Kussick SJ, y Wood BL. 2003. Four-color flow cytometry identifies virtually all cytogenetically abnormal bone marrow samples in the workup of non-CML myeloproliferative disorders. Am J Clin Pathol 120:854-865. 131. La Rosee P, Johnson K, Corbin AS, Stoffregen EP, Moseson EM, Willis S, Mauro MM, Melo JV, Deininger MW, Druker BJ. 2004. In vitro efficacy of combined treatment depends on the underlying mechanism of resistance in imatinibresistant Bcr-Abl-positive cell lines. Blood 103:208-215. 132. Lahaye T, Riehm B, Berger U, Paschka P, Muller MC, Kreil S, Merx K, Schwindel U, Schoch C, Hehlmann R, Hochhaus A. 2005. Response and resistance in 300 188 patients with BCR-ABL-positive leukemias treated with imatinib in a single center: a 4.5-year follow-up. Cancer 103:1659-1669. 133. Laurent, E., M. Talpaz, H. Kantarjian, R. Kurzrock. 2001. The BCR gene and philadelphia chromosome-positive leukemogenesis. Cancer Res 61:2343-2355. 134. Le Coutre, P., E. Tassi, M. Varella-Garcia, R. Barni, L. Mologni, G. Cabrita, E. Marchesi, R. Supino, C. Gambacorti-Passerini. 2000. Induction of resistance to the Abelson inhibitor STI571 in human leukemic cells through gene amplification. Blood 95:1758-1766. 135. Lee A, Kirk J, Edmands S, Radich J. 1995. Multiplex PCR of bcr-abl fusion transcripts in Philadelphia positive acute lymphoblastic leukemia. PCR Methods Appl 4:283-287. 136. Lemes A, Gomez Casares MT, de la Iglesia S, Matutes E, Molero MT. 1999. p190 BCR-ABL rearrangement in chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia. Cancer Genet Cytogenet 113:100-102. 137. Lengfelder E, Saussele S, Weisser A, Buchner T, Hehlmann R. 2005. Treatment concepts of acute promyelocytic leukemia. Crit Rev Oncol Hematol. 56(2):26174. 138. Lewis JM, Baskaran R, Taagepera S, Schwartz MA, Wang JY. 1996. Integrin regulation of c-Abl tyrosine kinase activity and cytoplasmic-nuclear transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Dec 24;93(26):15174-9. 139. Lewis, J. M., y M. A. Schwartz. 1998. Integrins regulate the association and phosphorylation of paxillin by c-Abl. J Biol Chem 273:14225-14230. 140. Liang DC, Shih LY, Yang CP, Hung IJ, Chen SH, Jaing TH, Liu HC, Chang WH. 2002. Multiplex RT-PCR assay for the detection of major fusion transcripts in Taiwanese children with B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Med Pediatr Oncol. Jul; 39(1):12-7. 141. Lionberger JM, Wilson MB, Smithgall TE. 2000. Transformation of myeloid leukemia cells to cytokine independence by Bcr-Abl is suppressed by kinase-defective Hck. J Biol Chem 275:18581-18585. 142. Lo Coco F, Diverio D, Falini B, Biondi A, Nervi C, Pelicci PG. 1999. Genetic diagnosis and molecular monitoring in the management of acute promyelocytic leukemia. Blood 94:12-22. 189 143. López, J. 2002. Leucemia mieloide crónica cambiando estrategias. Rev. Venez. Oncol. 14 (supl): S21- S88. 144. Luciano, F., M. Herrant, A. Jacquel, J. E. Ricci, P. Auberger. 2003. The p54 cleaved form of the tyrosine kinase Lyn generated by caspases during BCR-induced cell death in B lymphoma acts as a negative regulator of apoptosis. Faseb J 17:711713. 145. Macedo A, Orfao A, Vidriales MB, López-Berges MC, Valverde B, González M, Caballero MD, Ramos F, Martínez M, Fernandez-Calvo J, Martínez A, San Miguel JF. 1995. Characterization of aberrant phenotypes in acute myeloblastic leukemia. Ann Hematol; 70: 189-194. 146. Mahon, F. X., M. W. Deininger, B. Schultheis, J. Chabrol, J. Reiffers, J. M. Goldman, J. V. Melo. 2000. Selection and characterization of BCR-ABL positive cell lines with differential sensitivity to the tyrosine kinase inhibitor STI571: diverse mechanisms of resistance. Blood 96:1070-1079. 147. Martineau M, Berger R, Lillington DM, Moorman AV, Secker-Walker LM. 1998. The t(6;11)(q27;q23) translocation in acute leukemia: a laboratory and clinical study of 30 cases. EU Concerted Action 11q23 Workshop participants. Leukemia 12:788-791. 148. Maru Y, Kobayashi T, Tanaka K, Shibuya M. 1999. BCR binds to the xeroderma pigmentosum group B protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 260: 309-312. 149. Mayer BJ, Baltimore D. 1994. Mutagenic analysis of the roles of SH2 and SH3 domains in regulation of the Abl tyrosine kinase. Mol Cell Biol. May;14(5):288394 150. Meissner RV, Dias PM, Covas DT, Job F, Leite M, Nardi NB. 1998. A polymorphism in exon b2 of the major breakpoint cluster region (M-bcr) identified in chronic myeloid leukaemia patients. Br J Haematol 103:224-226. 151. Meissner RV, Covas DT, Dias PM, Job F, Leite M, Nardi NB. 1999. Analysis of mRNA transcripts in chronic myeloid leukemia patients. Genetic and Molecular Biology. 22, 4; 475-479. 152. Melo JV, Hochhaus A, Yan XH, Goldman JM. 1996. Lack of correlation between ABL-BCR expression and response to interferon-alpha in chronic myeloid leukaemia. Br J Haematol. Mar;92(3):684-6. 153. Melo JV, Hughes TP, Apperley JF. 2003. Chronic myeloid leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 132-52. 190 154. Melo JV, Myint H, Galton DA, Goldman JM. 1994. P190BCR-ABL chronic myeloid leukaemia: the missing link with chronic myelomonocytic leukaemia? Leukemia 8:208-211. 155. Melo JV, Yan XH, Diamond J, Goldman JM. 1995. Balanced parental contribution to the ABL component of the BCR-ABL gene in chronic myeloid leukemia. Leukemia Apr; 9(4):734-9. 156. Melo JV. 1997. BCR-ABL gene variants. Baillieres Clin Haematol 10:203-222. 157. Melo, JV. 1996. The diversity of BCR-ABL fusion proteins and their relationship to leukemia phenotype. Blood. Oct 1; 88(7):2375-84. 158. Melo, JV. 1996. The molecular biology of chronic myeloid leukaemia. Leukemia. May;10(5):751-6. 159. Mes-Masson AM, McLaughlin J, Daley GQ, Paskind M, Witte ON. 1986. Overlapping cDNA clones define the complete coding region for the P210c-abl gene product associated with chronic myelogenous leukemia cells containing the Philadelphia chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. Dec; 83(24):9768-72. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A 1987 Apr; 84(8):2507. 160. Meyn MA, 3rd, Wilson MB, Abdi FA, Fahey N, Schiavone AP, Wu J, Hochrein JM, Engen JR, Smithgall TE. 2006. Src family kinases phosphorylate the Bcr-Abl SH3-SH2 region and modulate Bcr-Abl transforming activity. J Biol Chem 281:30907-30916. 161. Moarefi I, LaFevre-Bernt M, Sicheri F, Huse M, Lee CH, Kuriyan J, Miller WT. 1997. Activation of the Src-family tyrosine kinase Hck by SH3 domain displacement. Nature. Feb 13;385 (6617):650-3. 162. Mondal BC, Majumdar S, Dasgupta UB, Chaudhuri U, Chakrabarti P, Bhattacharyya S. 2006. e19a2 BCR-ABL fusion transcript in typical chronic myeloid leukaemia: a report of two cases. J Clin Pathol 59:1102-1103. 163. Mow BM, Chandra J, Svingen PA, Hallgren CG, Weisberg E, Kottke TJ, Narayanan VL, Litzow MR, Griffin JD, Sausville EA, Tefferi A, Kaufmann SH. 2002. Effects of the Bcr/abl kinase inhibitors STI571 and adaphostin (NSC 680410) on chronic myelogenous leukemia cells in vitro. Blood 99(2):664-71. 164. Muller, M. C., G. Saglio, F. Lin, H. Pfeifer, R. D. Press, R. R. Tubbs, P. Paschka, E. Gottardi, S. G. O'Brien, O. G. Ottmann, H. Stockinger, L. Wieczorek, K. Merx, H. Konig, U. Schwindel, R. Hehlmann, A. Hochhaus. 2007. An international study to standardize the detection and quantitation of BCR-ABL transcripts from T 191 stabilized peripheral blood preparations by quantitative RT-PCR. Haematologica 92:970-973. 165. Mundhada S, Luthra R, Cano P. 2004. Association of HLA Class I and Class II genes with bcr-abl transcripts in leukemia patients with t(9;22) (q34;q11). BMC Cancer 4:25. 166. Nasedkina T, Domer P, Zharinov V, Hoberg J, Lysov Y, Mirzabekov A. 2002. Identification of chromosomal translocations in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays. Haematologica; 87: 363-372. 167. Nasedkina TV, Zharinov VS, Isaeva EA, Mityaeva ON, Yurasov RN, Surzhikov SA, Turigin AY, Rubina AY, Karachunskii AI, Gartenhaus RB, Mirzabekov AD. 2003. Clinical screening of gene rearrangements in childhood leukemia by using a multiplex polymerase chain reaction-microarray approach. Clin Cancer Res 9:5620-5629. 168. Neumann, F., C. Herold, B. Hildebrandt, G. Kobbe, M. Aivado, A. Rong, M. Free, R. Rossig, R. Fenk, P. Schneider, N. Gattermann, B. Royer-Pokora, R. Haas, R. Kronenwett. 2003. Quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction for diagnosis of BCR-ABL positive leukemias and molecular monitoring following allogeneic stem cell transplantation. Eur J Haematol 70:1-10. 169. Nieborowska-Skorska M, Wasik MA, Slupianek A, Salomoni P, Kitamura T, Calabretta B, Skorski T. 1999. Signal transducer and activator of transcription (STAT)5 activation by BCR/ABL is dependent on intact Src homology (SH)3 and SH2 domains of BCR/ABL and is required for leukemogenesis. J Exp Med. Apr 19;189(8):1229-42. 170. Nimmanapalli, R., M. Porosnicu, D. Nguyen, E. Worthington, E. O'Bryan, C. Perkins, K. Bhalla. 2001. Cotreatment with STI-571 enhances tumor necrosis factor alpha-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL or apo-2L)-induced apoptosis of Bcr-Abl-positive human acute leukemia cells. Clin Cancer Res 7:350-357. 171. Nowell PC, Hungerford DA. 1960. Chromosome studies on normal and leukemic human leukocytes. J Natl Cancer Inst. Jul; 25:85-109. 172. Ohmine K, Ota J, Ueda M, Ueno S, Yoshida K, Yamashita Y, Kirito K, Imagawa S, Nakamura Y, Saito K, Akutsu M, Mitani K, Kano Y, Komatsu N, Ozawa K, Mano H. 2001. Characterization of stage progression in chronic myeloid leukemia by DNA microarray with purified hematopoietic stem cells. Oncogene. 20. 8249-8257. 192 173. Ohmine, K. Nagai T, Tarumoto T, Miyoshi T, Muroi K, Mano H, Komatsu N, Takaku F, Ozawa K. 2003. Analysis of gene expression profiles in an imatinib-resistant cell line, KCL22/SR. Stem Cells. 2003;21(3):315-21. 174. Ohsaka A, Shiina S, Kobayashi M, Kudo H, Kawaguchi R. 2002. Philadelphia chromosome-positive chronic myeloid leukemia expressing p190 (BCR-ABL). Intern Med 41:1183-1187. 175. Olavarria E, Kanfer E, Szydlo R, Kaeda J, Rezvani K, Cwynarski K, Pocock C, Dazzi F, Craddock C, Apperley JF, Cross NC, Goldman JM. 2001. Early detection of BCR-ABL transcripts by quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction predicts outcome after allogeneic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia. Blood. Mar 15;97(6):1560-5. 176. Pane F, Frigeri F, Sindona M, Luciano L, Ferrara F, Cimino R, Meloni G, Saglio G, Salvatore F, Rotoli B. 1996 Neutrophilic-chronic myeloid leukemia: a distinct disease with a specific molecular marker (BCR/ABL with C3/A2 junction). Blood. Oct 1;88(7):2410-4 177. Pallisgaard N, Hokland P, Riishoj DC, Pedersen B Jorgensen P. 1998. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood. 92 (2) 574-588. 178. Parravicini, E., C. van de Ven, L. Anderson, M. S. Cairo. 2002. Myeloid hematopoietic growth factors and their role in prevention and/or treatment of neonatal sepsis. Transfus Med Rev 16:11-24. 179. Parravicini, V., M. Gadina, M. Kovarova, S. Odom, C. Gonzalez-Espinosa, Y. Furumoto, S. Saitoh, L. E. Samelson, J. J. O'Shea, J. Rivera. 2002. Fyn kinase initiates complementary signals required for IgE-dependent mast cell degranulation. Nat Immunol 3:741-748. 180. Paz-y-Miño C, Burgos R, Morillo SA, Santos JC, Fiallo BF, Leone PE. 2002. BCRABL rearrangement frequencies in chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia in Ecuador, South America. Cancer Genetic and Cytogenetic 132: 65-67. 181. Pelicci G, Lanfrancone L, Salcini AE, Romano A, Mele S, Grazia Borrello M, Segatto O, Di Fiore PP, Pelicci PG 1995. Constitutive phosphorylation of Shc proteins in human tumors. Oncogene. 11: 899-907. 182. Pierce A, Spooncer E, Wooley S, Dive C, Francis JM, Miyan J, Owen-Lynch PJ, Dexter TM, Whetton AD. 2000. Bcr-Abl protein tyrosine kinase activity induces 193 a loss of p53 protein that mediates a delay in myeloid differentiation. Oncogene 19:5487-5497. 183. Pluk H, Dorey K, Superti-Furga G. 2002. Autoinhibition of c-Abl. Cell. 108(2):247-59. 184. Pocaly M, Lagarde V, Etienne G, Ribeil JA, Claverol S, Bonneu M, Moreau-Gaudry F, Guyonnet-Duperat V, Hermine O, Melo JV, Dupouy M, Turcq B, Mahon FX, Pasquet JM. 2007. Overexpression of the heat-shock protein 70 is associated to imatinib resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia 21:93-101. 185. Prakash, O., y J. J. Yunis. 1984. High resolution chromosomes of the t(9;22) positive leukemias. Cancer Genet Cytogenet 11:361-367. 186. Puil, L., J. Liu, G. Gish, G. Mbamalu, D. Bowtell, P. G. Pelicci, R. Arlinghaus, T. Pawson. 1994. Bcr-Abl oncoproteins bind directly to activators of the Ras signalling pathway. Embo J 13:764-773. 187. Quackenbush, R. C., G. W. Reuther, J. P. Miller, K. D. Courtney, W. S. Pear, A. M. Pendergast. 2000. Analysis of the biologic properties of p230 Bcr-Abl reveals unique and overlapping properties with the oncogenic p185 and p210 Bcr-Abl tyrosine kinases. Blood 95:2913-2921. 188. Radich, J. P., H. Dai, M. Mao, V. Oehler, J. Schelter, B. Druker, C. Sawyers, N. Shah, W. Stock, C. L. Willman, S. Friend, P. S. Linsley. 2006. Gene expression changes associated with progression and response in chronic myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 103:2794-2799. 189. Rahmani M, Nguyen TK, Dent P, Grant S. 2007. The multikinase inhibitor sorafenib induces apoptosis in highly imatinib mesylate-resistant bcr/abl+ human leukemia cells in association with signal transducer and activator of transcription 5 inhibition and myeloid cell leukemia-1 down-regulation. Mol Pharmacol 72:788795. 190. Ravandi F, Cortes J, Albitar M, Arlinghaus R, Qiang Guo J, Talpaz M, Kantarjian HM. 1999. Chronic myelogenous leukaemia with p185 BCR/ABL expression: characteristics and clinical significance. Br. J. Haematol. 107: 581-586. 191. Ray S, Lu Y, Kaufmann SH, Gustafson WC, Karp JE, Boldogh I, Fields AP, Brasier AR. 2004. Genomic mechanisms of p210BCR-ABL signaling: induction of heat shock protein 70 through the GATA response element confers resistance to paclitaxel-induced apoptosis. J Biol Chem 279:35604-35615. 192. Ray, S., V. Ponnathpur, Y. Huang, C. Tang, M. E. Mahoney, A. M. Ibrado, G. Bullock, K. Bhalla. 1994. 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine-, mitoxantrone-, and 194 paclitaxel-induced apoptosis in HL-60 cells: improved method for detection of internucleosomal DNA fragmentation. Cancer Chemother Pharmacol 34:365371. 193. Ren SY, Bolton E, Mohi MG, Morrione A, Neel BG, Skorski T. 2000. Phosphatidylinositol 3-kinase p85{alpha} subunit-dependent interaction with BCR/ABL-related fusion tyrosine kinases: molecular mechanisms and biological consequences. Mol Cell Biol 25:8001-8008. 194. Robien K, y Ulrich CM. 2003. 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and leukemia risk: a HuGE minireview. Am J Epidemiol. Apr 1; 157(7):571-82. 195. Roche-Lestienne, C., V. Soenen-Cornu, N. Grardel-Duflos, J. L. Lai, N. Philippe, T. Facon, P. Fenaux, C. Preudhomme. 2002. Several types of mutations of the Abl gene can be found in chronic myeloid leukemia patients resistant to STI571, and they can pre-exist to the onset of treatment. Blood 100:1014-1018. 196. Rodriguez, A., N. Martinez, F. I. Camacho, E. Ruiz-Ballesteros, P. Algara, J. F. Garcia, J. Menarguez, T. Alvaro, M. F. Fresno, F. Solano, M. Mollejo, C. Martin, M. A. Piris. 2004. Variability in the degree of expression of phosphorylated IkappaBalpha in chronic lymphocytic leukemia cases with nodal involvement. Clin Cancer Res 10:6796-6806. 197. Rodriguez, C. I., J. G. Cheng, L. Liu, C. L. Stewart. 2004. Cochlin, a secreted von Willebrand factor type a domain-containing factor, is regulated by leukemia inhibitory factor in the uterus at the time of embryo implantation. Endocrinology 145:1410-1418. 198. Rosas-Cabral A, Martinez-Mancilla M, Ayala-Sanchez M, Vela-Ojeda J, BahenaResendiz P, Vadillo-Buenfil M, Avina-Zubieta JA, Salazar-Exaire D, MirandaPeralta E, Marroquin A, Longoria-Revilla E. 2003. [Analysis of Bcr-abl type transcript and its relationship with platelet count in Mexican patients with chronic myeloid leukemia]. Gac Med Mex 139:553-559. 199. Roumier, C., A. Daudignon, V. Soenen, B. Dupriez, M. Wetterwald, J. L. Lai, A. Cosson, P. Fenaux, C. Preudhomme. 1999. p190 bcr-abl rearrangement: a secondary cytogenetic event in some chronic myeloid disorders? Haematologica 84:1075-1080. 200. Rowley, J. D. 1973. Identificaton of a translocation with quinacrine fluorescence in a patient with acute leukemia. Ann Genet 16:109-112. 195 201. Rozman, C., y E. Carreras. 1995. Chronic myeloid leukemia (CML): a therapeutic dilemma. Med Clin (Barc) 105:24-26. 202. Rubnitz JE, Downing JR, Pui CH, Shurtleff SA, Raimondi SC, Evans WE, Head DR, Crist WM, Rivera GK, Hancock ML, Boyett JM, Buijs A, Grosveld G, Behm FG. 1997. Tel gene rearrangement in acute lymphoblastic leukemia: a genetic marker with prognostic significance. J Clin Oncol; 15: 1150-7. 203. Salesse, S., y C. M. Verfaillie. 2003. BCR/ABL-mediated increased expression of multiple known and novel genes that may contribute to the pathogenesis of chronic myelogenous leukemia. Mol Cancer Ther 2:173-182. 204. Salgia, R., N. Uemura, K. Okuda, J. L. Li, E. Pisick, M. Sattler, R. de Jong, B. Druker, N. Heisterkamp, L. B. Chen, and et al. 1995. CRKL links p210BCR/ABL with paxillin in chronic myelogenous leukemia cells. J Biol Chem 270:29145-29150. 205. Saussele S, Weisser A, Muller MC, Emgi M, La Rosee P, Paschka P, Kuhn C, Willer A, Hehlmann R, Hochhaus A. 2000. Frequent polymorphism in BCR exon b2 identified in BCR-ABL positive and negative individuals using fluorescent hybridization probes. Leukemia 14:2006-2010. 206. Sawyers CL, y Druker B. 1999. Tyrosine kinase inhibitors in chronic myeloid leukemia. Cancer J Sci Am 5:63-69. 207. Sawyers CL, McLaughlin J, Goga A, Havlik M, Witte O. 1994. The nuclear tyrosine kinase c-Abl negatively regulates cell growth. Cell. 77: 121-131. 208. Sawyers, CL. Callahan, W. y Writte, O. 1992. Dominant negative MYC blocks transformation by ABL oncogenes. Cell. 70: 901-910. 209. Sawyers, CL. Hochhaus, A. Feldman, E. Goldman, JM. Miller, CB. Ottmann, OG. Schiffer, CA. Talpaz, M. Guilhot, F. Deininger, MW. Fischer, T. O'Brien, SG. Stone, RM. Gambacorti-Passerini, CB. Russell, NH. Reiffers, JJ. Shea, TC. Chapuis, B. Coutre, S. Tura, S. Morra, E. Larson, RA. Saven, A. Peschel, C. Gratwohl, A. Mandelli, F. Ben-Am, M. Gathmann, I. Capdeville, R. Paquette, RL. Druker, BJ. 2002. Imatinib induces hematologic and cytogenetic responses in patients with chronic myelogenous leukemia in myeloid blast crisis: results of a phase II study. Blood. May 15;99(10):3530-9. 210. Schindler, T., W. Bornmann, P. Pellicena, W. T. Miller, B. Clarkson, J. Kuriyan. 2000. Structural mechanism for STI-571 inhibition of abelson tyrosine kinase. Science 289:1938-1942. 196 211. Schwartz MA, Schaller MD, Ginsberg MH. 1995. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annu Rev Cell Dev Biol.; 11: 549-99. 212. Scurto P, Hsu Rocha M, Kane JR, Williams WK, Haney DM, Conn WP, Shurtleff SA, Downing JR. 1998. A multiplex RT-PCR assay for the detection of chimeric trancripts encoded by the risk-stratifying translocations of pediatric acute lymphoblastic leukemia. Leukemia; 12 (12):1994-2005. 213. Selleri L, Von Linden M, Hermans A, Meijer D, Torelli G, Grosveld G. 1990. Chronic myeloid leukemia may by associated with several bcr-abl transcripts including the acute lymphoid leukemia- type 7kb transcripts. Blod 75: 1146-1153. 214. Selleri, C., J. P. Maciejewski, N. Montuori, P. Ricci, V. Visconte, B. Serio, L. Luciano, B. Rotoli. 2003. Involvement of nitric oxide in farnesyltransferase inhibitormediated apoptosis in chronic myeloid leukemia cells. Blood 102:1490-1498. 215. Sengupta A, Banerjee D, Chandra S, banerji SK, Ghosh R, Roy R, Banrrejee S. 2007. Deregulation and cross talk among Sonic hedgehog, Wnt, Hox and Notch signaling in chronic myeloid leukemia progression. Leukemia 21: 949-955. 216. Shah NP, Skaggs BJ, Branford S, Hughes TP, Nicoll JM, Paquette RL, Sawyers CL. 2007. Sequential ABL kinase inhibitor therapy selects for compound drugresistant BCR-ABL mutations with altered oncogenic potency. J Clin Invest 117:2562-2569. 217. Shah, N. P., J. M. Nicoll, B. Nagar, M. E. Gorre, R. L. Paquette, J. Kuriyan, C. L. Sawyers. 2002. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell 2:117-125. 218. Shangary, S., y D. E. Johnson. 2003. Recent advances in the development of anticancer agents targeting cell death inhibitors in the Bcl-2 protein family. Leukemia 17:1470-1481. 219. Shangary, S., E. C. Lerner, Q. Zhan, S. J. Corey, T. E. Smithgall, R. Baskaran. 2003. Lyn regulates the cell death response to ultraviolet radiation through c-Jun N terminal kinase-dependent Fas ligand activation. Exp Cell Res 289:67-76. 220. Shi RZ, Morrissey JM, Rowley JD. 2003. Screening and quantification of multiple chromosome translocations in human leukemia. Clin Chem. Jul; 49(7):1066-73. 221. Shinohara, A., E. Shimizu, M. Takada, S. Sone. 1996. Lack of c-mpl proto-oncogene transcripts and growth-stimulatory effects of thrombopoietin on human small cell lung cancer cell lines. Oncology 53:426-434. 197 222. Shtivelman E, Lifshitz B, Gale RP, Canaani E. 1985. Fused transcript of abl and bcr genes in chronic myelogenous leukaemia. Nature. Jun 13-19;315(6020):550-4. 223. Shurtleff SA, Buijs A, Behm FG, Rubnitz JE, Raimondi SC, Hancock ML, Chan GC, Pui CH, Grosveld G, Downing JR. 1995. TEL-AML fusion resulting from a cryptic t(12;21) is the most common genetic lesion in pediatric ALL and defines a subgroup of patients with an excellent prognosis. Leukemia; 9: 1985-9. 224. Sill H, Goldman JM, Cross NC. 1995. Homozygous deletions of the p16 tumor supresor gene are associated with lymphoid transformation of cronic myeloid leukemia. Blood. 85: 2013-2016. 225. Sirard, C., P. Laneuville, J. E. Dick. 1994. Expression of bcr-abl abrogates factordependent growth of human hematopoietic M07E cells by an autocrine mechanism. Blood 83:1575-1585. 226. Sirulink A, Silver RT, Najfeld V. 2001. Marked ploidy and BCR-ABL gene amplification in vivo in a patient treated with STI571. Leukemia 15:1795-1797. 227. Smith KM, Yacobi R, Van Etten RA. 2003. Autoinhibition of Bcr-Abl through its SH3 domain. Mol Cell 12:27-37. 228. Sompayrac, Lauran, PhD. 1999. How the Immune System Works. Malden, MA: Blackwell Science, Ltd. p. 37-38, 88. 229. Sorel N, Chazelas F, Brizard A, Chomel JC. 2005. Double-gradient-denaturinggradient gel electrophoresis for mutation screening of the BCR-ABL tyrosine kinase domain in chronic myeloid leukemia patients. Clin Chem 51:1263-1266. 230. Stanglmaier M, Warmuth M, Kleinlein I, Reis S, Hallek M. 2003. The interaction of the Bcr-Abl tyrosine kinase with the Src kinase Hck is mediated by multiple binding domains. Leukemia. 2003 Feb;17(2):283-9. 231. Takeda N, Shibuya M, Maru Y. 1999. The BCR-ABL oncoprotein potentially interact with the xeroderma pigmentosum group B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 203-207. 232. Talpaz, M., N. P. Shah, H. Kantarjian, N. Donato, J. Nicoll, R. Paquette, J. Cortes, S. O'Brien, C. Nicaise, E. Bleickardt, M. A. Blackwood-Chirchir, V. Iyer, T. T. Chen, F. Huang, A. P. Decillis, C. L. Sawyers. 2006. Dasatinib in imatinibresistant Philadelphia chromosome-positive leukemias. N Engl J Med 354:25312541. 198 233. Thomas D, Vadas M, Lopez A. 2004. Regulation of haematopoiesis by growth factors - emerging insights and therapies. Expert Opin Biol Ther 4:869-879. 234. Tobal K, Newton J, Macheta M, Chang J, Morgenstern G, Evans PA, Morgan G, Lucas GS, Liu Yin JA. 2000. Molecular quantitation of minimal residual disease in acute myeloid leukemia with t(8;21) can identify patients in durable remission and predict clinical relapse. Blood 95:815-819. 235. Topaly, J., W. J. Zeller, S. Fruehauf. 2001. Synergistic activity of the new ABLspecific tyrosine kinase inhibitor STI571 and chemotherapeutic drugs on BCRABL-positive chronic myelogenous leukemia cells. Leukemia 15:342-347. 236. Torigoe, T., R. O'Connor, R. Fagard, S. Fischer, D. Santoli, J. C. Reed. 1992. Interleukin 4 inhibits IL-2-induced proliferation of a human T-leukemia cell line without interfering with p56-LCK kinase activation. Cytokine 4:369-376. 237. Towatari M, Adachi K, Kato H, Saito H. 1991. Absence of the human\retinoblastoma gene product in the megakaryoblastic crisis of cronic myelogenous leukemia. Blood 78: 2178-2181. 238. Van Dongen JJM, Macintyre E, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G, Gottardi E, Rambaldi A, Dotti G, Griesinger F, Parreira A. Gameiro P, Diaz MG, Malec M, Langerak AW, San Miguel JF, Biondi A. 1999. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 concerted action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia; 13 (12): 1901-1928. 239. Van Etten, R. A. 1999. Cycling, stressed-out and nervous: cellular functions of c-Abl. Trends Cell Biol 9:179-186. 240. van Rhee F, Hochhaus A, Lin F, Melo JV, Goldman JM, Cross NC. 1996. p190 BCRABL mRNA is expressed at low levels in p210-positive chronic myeloid and acute lymphoblastic leukemias. Blood 87:5213-5217. 241. Verfaillie CM, Hurley R, Lundell BI, Zhao C, Bhatia R. 1997. Integrin-mediated regulation of hematopoiesis: do BCR/ABL-induced defects in integrin function underlie the abnormal circulation and proliferation of CML progenitors?. Acta Haematol. 97: 40-52. 242. Wan TS, So CC, Hui KC, Yip SF, Ma ES, Chan LC. 2007. Diagnostic utility of dual fusion PML/RARalpha translocation DNA probe (D-FISH) in acute promyelocytic leukemia. Oncol Rep 17:799-805. 199 243. Weisberg, E., y J. D. Griffin. 2000. Mechanism of resistance to the ABL tyrosine kinase inhibitor STI571 in BCR/ABL-transformed hematopoietic cell lines. Blood 95:3498-3505. 244. Wetzler, M., M. Talpaz, G. Yee, S. A. Stass, R. A. Van Etten, M. Andreeff, A. M. Goodacre, H. D. Kleine, R. K. Mahadevia, R. Kurzrock. 1995. Cell cycle-related shifts in subcellular localization of BCR: association with mitotic chromosomes and with heterochromatin. Proc Natl Acad Sci U S A 92:3488-3492. 245. Wilson-Rawls, J., S. Xie, J. Liu, P. Laneuville, R. B. Arlinghaus. 1996. P210 Bcr-Abl interacts with the interleukin 3 receptor beta(c) subunit and constitutively induces its tyrosine phosphorylation. Cancer Res 56:3426-3430. 246. Wolff, L., S. J. Ackerman, G. Nucifora. 2005. Meeting report: Sixth International Workshop on Molecular Aspects of Myeloid Stem Cell Development and Leukemia, Annapolis, May 1-4, 2005. Exp Hematol 33:1436-1442. 247. Wolff, N. C., D. R. Veach, W. P. Tong, W. G. Bornmann, B. Clarkson, R. L. Ilaria, Jr. 2005. PD166326, a novel tyrosine kinase inhibitor, has greater antileukemic activity than imatinib mesylate in a murine model of chronic myeloid leukemia. Blood 105:3995-4003. 248. Wong R, Giralt SA, Martin T, Couriel DR, Anagnostopoulos A, Hosing C, Andersson BS, Cano P, Shahjahan M, Ippoliti C, Estey EH, McMannis J, Gajewski JL, Champlin RE, de Lima M. 2003. Reduced-intensity conditioning for unrelated donor hematopoietic stem cell transplantation as treatment for myeloid malignancies in patients older than 55 years. Blood 102:3052-3059. 249. Wu LX, Xu JH, Wu GH, Chen YZ. 2003. Inhibitory effect of curcumin on proliferation of K562 cells involves down-regulation of p210(bcr/abl) initiated Ras signal transduction pathway. Acta Pharmacol Sin. Nov;24(11):1155-60 250. Yamanashi, Y., S. Fukushige, K. Semba, J. Sukegawa, N. Miyajima, K. Matsubara, T. Yamamoto, K. Toyoshima. 1987. The yes-related cellular gene lyn encodes a possible tyrosine kinase similar to p56lck. Mol Cell Biol 7:237-243. 251. Yang L, Zhao H, Li SW, Ahrens K, Collins C, Eckenrode S, Ruan QG, McIndoe RA, She JX. 2003. Gene expression profiling during all-trans retinoic acid-induced cell differentiation of acute promyelocytic leukemia cells. J Mol Diagn 5:212221. 252. Yasukawa, M., H. Ohminami, K. Kojima, K. Inokuchi, Y. Nishimura, S. Fujita. 2000. Analysis of HLA-DRB1 alleles in Japanese patients with chronic myelogenous leukemia. Am J Hematol 63:99-101. 200 253. Yoshida, C., y J. V. Melo. 2004. Biology of chronic myeloid leukemia and possible therapeutic approaches to imatinib-resistant disease. Int J Hematol 79:420-433. 254. Yu, C., M. Subler, M. Rahmani, E. Reese, G. Krystal, D. Conrad, P. Dent, S. Grant. 2003. Induction of apoptosis in BCR/ABL+ cells by histone deacetylase inhibitors involves reciprocal effects on the RAF/MEK/ERK and JNK pathways. Cancer Biol Ther 2:544-551. 255. Yuan, Z. M., H. Shioya, T. Ishiko, X. Sun, J. Gu, Y. Y. Huang, H. Lu, S. Kharbanda, R. Weichselbaum, D. Kufe. 1999. p73 is regulated by tyrosine kinase c-Abl in the apoptotic response to DNA damage. Nature 399:814-817. 256. Zeng Y, Graner MW, Thompson S, Marron M, Katsanis E. 2005. Induction of BCRABL-specific immunity following vaccination with chaperone-rich cell lysates derived from BCR-ABL+ tumor cells. Blood 105:2016-2022. 257. Zhao, R. C., R. S. McIvor, J. D. Griffin, C. M. Verfaillie. 1997. Gene therapy for chronic myelogenous leukemia (CML): a retroviral vector that renders hematopoietic progenitors methotrexate-resistant and CML progenitors functionally normal and nontumorigenic in vivo. Blood 90:4687-4698. 258. Zou, X. and et al. 1997. Induction of c-myc transcription by the v-ABL tyrosine kinase requires Ras, Raf1, and cyclin-dependent kinases. Gene Dev. 11: 654-662. Páginas web Consultadas: http://seer.cancer.gov/statfacts/ http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/stem/specific/specific02.htm. http://www.popularmechanics.com/science/health_medicine/1281066.html http://www.cancerinfo.es/index.php?textoid=21&orden=12, http://www.brachiterapia.it/ita/ ht ml/carci.htm, http://www.Germe s-online.com/catalog/41/594/115019/sell_arbutin.html, http://www.innovacionesleucemia.com/article 2.asp. http://www.chem.uoa.gr/chemicals/chem_imatinib.htm; www.leucemieespoir.org/spip/article2.html www.leucemie-espoir.org/spip/article2.html www.citometriadeflujo.com 201 http://www.rapidcycler.com/lightcycler_u/lectures/quantification_on_lc.htm http://www.idahotechnology.com/rapid/images/schematic.gif http://www.cancer.org 202 Anexos 204 Anexo A Esquema representativo del protocolo realizado durante la clonación de las diferentes variantes de BCR/ABL. 205 Anexo B Plásmido pGEM-T easy empleado en la clonación de las diferentes variantes BCR/ABL. A. B. 206 Anexo C Cálculo de los ratios de los diferentes genes a partir de cDNA Muestra Paciente FC FC AG AG FG LM ZB RB JS promedio desv Paciente FA DF C de C JH HP OH FA JC MR promedio desv Paciente en CB M la C GP AA ML JG NP GF promedio desv Normal S E C K L R K E G Para BCR/ABL Gen GAPDH Gen LYN ratio Ratioenfermo/ratio promedio normal 29.12 27.61 24.96 24.88 24.9 25.66 26.01 26.27 24.97 26.28 27.56 23.49 27.06 22.9 26.94 24.91 26.44 25.25 1.51086541 1.54511211 0.9481456 0.99679487 1.03052209 1.00999616 1.05246296 0.85232221 0.84626755 0.92464736 0.95764485 0.07860551 0.96600379 1.01556936 1.04993183 1.02901929 1.07228595 0.86837558 0.86220688 0.94206297 0.97568196 0.08008603 22.3 22.1 22.23 21.36 22.12 21.87 23.07 22.25 26.3 22.99 22.03 21.75 23.13 22.31 22.26 22.33 22.93 22.12 1.42520174 0.48275992 0.99103139 0.9608637 0.98869801 0.964456 0.87414449 0.98729006 0.96454821 1.00314465 0.96677206 0.0404233 1.00969733 0.97896143 1.00732 0.9826214 0.89060888 1.00588553 0.98271534 1.02203874 0.98498108 0.04118467 24.18 1.04 28.48 1.10216718 1.05958825 1.12292635 23.85 21.59 0.90524109 24.9 22.62 0.90843373 25.43 23.47 0.92292568 34.23 27.95 0.8165352 19.86 22.2 1.11782477 25.33714286 24.3557143 0.97330395 4.398907873 2.77046841 0.11394112 0.92229118 0.92554396 0.94030885 0.83191453 1.13887885 0.991636 0.11608718 23.25 25.84 27.98 25 27.18 20.58 27.11 22.64 26.28 28.8 22.6 26.76 24.18 22.73 21.42 23.18 23.54 27.06 29.58 27.26 0.95639743 0.9672 0.83627667 1.04081633 0.85503504 1.03975265 1.02968037 1.02708333 1.20619469 207 0.97441104 0.98541708 0.85202783 1.06041996 0.87113951 1.05933625 1.04907425 1.0464283 1.2289132 Y S2 F L2 promedio desv 27.67 22.91 0.82797253 22.56 24.46 1.08421986 29.23 24.67 0.84399589 25.75 26.91 1.04504854 25.64461538 24.9738462 0.98151333 2.756285591 2.34376314 0.11430382 208 0.84356728 1.10464099 0.85989244 1.06473189 1 0.11645672 Anexo D Secuencia nucleotídica y aminoacídica de ABL donde se resaltan los diferentes dominios de la proteína, el punto de fusión con BCR y los cebadores empleados para su amplificación. ABL 1: NM 005157 1 aaa K 61 tcc 21 S 121 cag 41 G 181 gaa 61 E 241 cta 81 L 301 tgt 100 C 361 aac 120 N 421 ctg 140 L 481 cag 160 G 541 tct 180 S 601 cat 200 H 661 cgc 220 R 721 acg 240 T 781 gtg 260 V 841 gtg 280 V 901 cag 300 Q 961 tac 320 Y 1021 ctg 340 L 1081 atc I 1141 gct A 1201 aag K 1261 tcc 1 atg M tcc S ggt G aat N agc S gaa E agt S ctg L agg R gat D cat H aac N gac D tgg W gaa E ctc L ggg G ctg L cac H gat D ttc F gac ttg L agc S ctg L gac D ata I gcc A ctg L agc S tcc S ggc G cat H aag K atc I aag K gag E ctt L aac N tac Y aga R ttt F ccc P gtc gag E tgt C agt S ccc P act T caa Q gag E agc S atc I aag K tca S ccc P acc T aaa K ttc F ggg G ctc L atg M gat D ggc G atc I tgg atc I tat Y gaa E aac N aaa K acc T aaa K ggg G tcg S ctc L acg T act T atg M tac Y ttg L gtc V ctg L gcc A ctt L ctg L aaa K gca tgc C ctg L gcc A ctt L ggt G aaa K cac H atc I ctg L tac Y gtg V gtc V aag K agc S aaa K tgc C gac D act T gct A agc S tgg W ttt ctg L gaa E gct A ttc F gaa E aat N tcc S aat N aga R gtc V gcc A tat Y cac H ctg L gaa E acc T tac Y cag Q gcc A agg R act T gga aag K gaa E cgt R gtt V aag K ggc G tgg W ggc G tac Y tcc S gac D ggt G aag K acg T gct A cgg R ctg L atc I cga R ttg L gca A gta ctg L gcc A tgg W gca A ctc L caa G tac Y agc S gaa E tcc S ggg G gtg V ctg L gtg V gca A gag E agg R tcg S aac N atg M ccc P ttg gtg V ctt L aac N ctg L cgg R ggc G cat H ttc F ggg G gag E ctc L tcc S ggc G gcc A gtc V ccc P gag E tca S tgc C aca T gag E ctt 209 ggc G cag G tcc S tat Y gtc Y tgg W ggg G ttg L agg R agc S atc I ccc P ggg G gtg V atg M ccg P tgc C gcc A ctg L ggg G agc S tgg tgc C cgg R aag K gat D tta L gtc Y cct P gtg V gtg V cgc R acc T aac N ggc G aag K aaa K ttc F aac N atg M gta V gac D ctg L gaa aaa K cca P gaa E ttt F ggc G cca P gtg V cgt R tac Y ttc F acg T tac Y cag Q acc T gag E tat Y cgg R gag E ggg G acc T gcc A att tcc S gta V aac N gtg V tat Y agc S tcc S gag E cat H aac N ctc L gac D tac Y ttg L atc I atc I cag Q tac Y gag E tac Y tac Y gct aag K gca A ctt L gcc A aat N aac N cgc R agt S tac Y acc T cat H aag K ggg G aag K aaa K atc I gag E ctg L aac N aca T aac N acc aag K tct S ctc L agt S cac H tac Y aat N gag E agg R ctg L tat Y tgg W gag E gag E cac H act T gtg V gag E cac H gcc A aag K tat ggg G gac D gct A gga G aat N atc I gcc A agc S atc I gcc A cca P gag E gtg V gac D cct P gag E aac N aag K ttg L cat H ttc F ggc ctg L ttt F gga G gat D ggg G acg T gct A agt S aac N gag E gcc A atg M tac Y acc T aac N ttc F gcc A aaa K gtg V gct A tcc S atg tcc S gag E ccc P aac N gaa E cca P gag E cct P act T ttg L cca P gaa E gag E atg M ctg L atg M gtg V aac N aag K gga G atc I tcc tcg S cct P agt S act T tgg W gtc V tat Y ggc G gct A gtt V aag K cgc R ggc G gag E gtg V acc T gtg V ttc F gta V gcc A aag K cct S D V W A F G V L L W E I A T Y G M S P 1321 tac ccg gga att gac ctg tcc cag gtg tat gag ctg cta gag aag gac tac cgc atg gag Y P G I D L S Q V Y E L L E K D Y R M E 1381 cgc cca gaa ggc tgc cca gag aag gtc tat gaa ctc atg cga gca tgt tgg cag tgg aat R P E G C P E K V Y E L M R A C W Q W N 1441 ccc tct gac cgg ccc tcc ttt gct gaa atc cac caa gcc ttt gaa aca atg ttc cag gaa P S D R P S F A E I H Q A F E T M F Q E Dominio SH3 Dominio SH2 Dominio SH1 o TK;Bolsillo de unión del ATP;Loop catalítico;Loop de activación Cebadores Punto de fusión Secuencia aminoacídica de ABL1 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 mleiclklvg ndpnlfvaly slekhswyhg dgklyvsses ditmkhklgg llgvctrepp hrdlaarncl dvwafgvllw sdrpsfaeih hrdttdvpem salikkkkkt kpsngagvpn cvphgakdte tppprlvkkn algtpaaaep pppaasagka patpkpqsak riasgaitkg fafreainkl ckskkglsss dfvasgdntl pvsrnaaeyl rfntlaelvh gqygevyegv fyiitefmty vgenhlvkva eiatygmspy qafetmfqes phskgqgesd aptppkrsss galresggsg wrsvtlprdl eeaadevfkd vtptskagsg ggkpsqspsq psgtpispap vvldstealc ennlrelqic sscyleealq sitkgeklrv lssgingsfl hhstvadgli wkkysltvav gnlldylrec dfglsrlmtg pgidlsqvye sisdevekel pldhepavsp fremdgqper frsphlwkks qstgrqfdss imesspgssp apggtskgpa eaageavlga vpstlpsass laisrnseqm patagsgpaa rpvasdfepq lgynhngewc vresesspgq ttlhypapkr ktlkedtmev nrqevnavvl dtytahagak llekdyrmer gkqgvrgavs llprkergpp rgageeegrd stltssrlat tfgghksekp pnltpkplrr eesrvrrhkh ktkatslvda alagdqpsst ashsavleag tqdfskllss Dominio de unión a F-actina 210 glseaarwns eaqtkngqgw rsislryegr nkptvygvsp eeflkeaavm lymatqissa fpikwtapes pegcpekvye tllqapelpt egglnederl isngalaftp geeegggsss alprkragen qvtvapasgl ssespgrdkg vnsdaakpsq afiplistrv knlytfcvsy vkeisdivqr kenllagpse vpsnyitpvn vyhyrintas nydkwemert keikhpnlvq meylekknfi laynkfsiks lmracwqwnp ktrtsrraae lpkdkktnlf ldtadpaksp krflrscsas rsdqvtrgtv phkeeagkgs klsrlkpapp pgeglkkpvl slrktrqppe vdsiqqmrnk Anexo E CONSENTIMIENTO PREVIA INFORMACIÓN (Hoja 1 de 3) Titulo del Estudio: Estudio molecular del encogen BCR/ABL t(9:22) en pacientes venezolanos con Leucemia Mieloide Crónica. Objetivos de la investigación: Usted está invitado a participar, donando una muestra de su sangre o médula ósea, en un estudio donde mediante análisis genéticos se detectará la presencia del encogen BCR/ABL que evidenciaría que el tipo de leucemia que presenta el paciente es la LMC. Procedimientos: El estudio tendrá una duración de cuatro años. Si usted acepta participar necesitaremos: 1. De una muestra de sangre o de médula ósea (2-5 ml). 2. Que le suministre al médico tratante la información requerida para rellenar la historia médica. 3. Que podamos contactarlo en caso de requerir una segunda muestra o datos adicionales que complementen dicho estudio. Con su muestra de sangre se procederá única y exclusivamente al análisis genético que permita determinar si usted posee la alteración genéticas conocidas que causa LMC. Los análisis genéticos serán realizados mediante técnicas de biología molecular que permitan identificar las alteraciones en los cromosomas 9 y 2 relacionados con la LMC. Las muestras serán almacenadas en Laboratorio de Genética Molecular Humana bajo la responsabilidad del Dr. René Utrera y el resto de la muestra será conservada hasta finalizar la investigación después de la cual será desechada. Importancia y beneficios de su participación: Mediante este estudio, que podrá realizarse gracias a su valiosa colaboración con sólo proporcionar una muestra de su sangre o médula ósea, se podrá avanzar en los estudios de diagnóstico y resistencia a esta enfermedad, lo cual permitirá la aplicación, por parte del médico responsable, de tratamientos más efectivos para evitar un avance de la enfermedad hacia una fase terminal. Conjuntamente con los beneficios mencionados anteriormente, que podrá proporcionarle a corto plazo este estudio, los resultados obtenidos con su muestra a su vez permitirán obtener datos que serán utilizados para establecer una estadística de esta patología en nuestro país. Los resultados obtenidos una vez finalizado este estudio serán publicados en revistas científicas especializadas. Riesgos: Su participación no implica riesgo ni inconveniente para su salud ni la de sus familiares. Confidencialidad: Todos los datos obtenidos de la investigación serán mantenidos en absoluto secreto y toda la información sobre su persona será solo accesible a los investigadores y médicos involucrados en el estudio. Su identidad no será hecha pública en ninguno de los manuscritos científicos o en las presentaciones que se realicen en eventos científicos. 211 CONSENTIMIENTO PREVIA INFORMACIÓN (continuación) (Hoja 2 de 3) Derecho a negarse a participar: La participación es este estudio es voluntaria. Usted puede negarse a participar en el estudio o interrumpir su participación en cualquier momento. Si usted se niega a participar en el estudio, esto no afectará el tipo de atención que recibirá por parte de su médico. Preguntas: Debido a que se utilizaron algunos términos técnicos en este formulario de consentimiento, si existe algo que usted no entienda, por favor pregunte sobre esto sin dudarlo. Por favor tome su decisión de participar en este estudio sólo después de haber examinado detenidamente el contenido de este formulario. En caso de emergencia o que tenga cualquier pregunta, en cualquier momento sobre el estudio por favor contacte al investigador principal: Investigador Principal: Dr. René Utrera Médico Responsable: Dr. José Luís López Centro de Investigación: Universidad Simón Bolívar Laboratorio de Genética Molecular Humana rutrera@usb.ve 0212 9064212 0412 7190731 Centro Asistencial Banco Municipal de Sangre de Caracas Esquina de pirineos, San José, Caracas fundasangre@cantv.net 0416 6237612 212 CONSENTIMIENTO PREVIA INFORMACIÓN (continuación) (Hoja 3 de 3) Consentimiento: Yo,______________________ portador(a) de la cédula de identidad _____________he sido informado(a) de manera amplia, clara y sencilla y mis preguntas han sido contestadas en relación al estudio sobre el Estudio molecular del encogen BCR/ABL t(9:22) en pacientes venezolanos con Leucemia Mieloide Crónica, que se llevará a cabo en forma conjunta entre el Laboratorio de Genética Molecular Humana de la Universidad Simón Bolívar (USB), el Banco Municipal de sangre de Caracas y la fundación instituto de estudio avanzados IDEA, coordinado por el Dr. René Utrera y por lo tanto manifiesto estar de acuerdo en participar en él, por lo que autorizo me sean tomadas las muestras sanguíneas necesarias para tal fin. He recibido una copia de este consentimiento. Nombre y apellido: ___________________________ Firma: _________________________ Fecha: / / ________________________ Firma del investigador principal Testigos: Nombre y apellido C.I. Firma 1. 213 2. 214