Curso Propedéutico de Bioquímica

Curso Propedéutico de
Bioquímica
Dra. Laila Pamela Partida Martínez
25 al 29 de Junio, 2012
Curso Propedéutico de Bioquímica
Dra. Laila Pamela Partida Martínez
laila.partida@ira.cinvestav.mx, http://www.ira.cinvestav.mx/LMI.aspx
Las moléculas de la vida y su distribución típica en Escherichia coli
Componente
H2O
Iones
inorgánicos (Na+,
K+, Mg2+, Ca2+,
Fe2+, Cl-, PO44-,
etc.)
Carbohidratos y
precursores
Amino ácidos y
precursores
Nucleótidos y
precursores
Lípidos y
precursores
Otras moléculas
pequeñas
Proteínas
DNA
RNA
16SrRNA, 23S
rRNA, tRNA y
mRNA
% del peso
celular
PM Promedio
No. de tipos
diferentes
18
40
No. de
moléculas por
célula
4 x 1010
2.5 x 108
70
1
3
150
2 x 108
200
0.4
120
3 x 107
100
0.4
300
1.2 x 107
200
2
750
2.5 x 107
50
0.2
150
1.5 x 107
200
15
1
6
40,000
1.5 x 109
106
4
2000-3000
1
500 000; 1 000
000; 25 000; 1
000 000
3 x 104 ; 3 x 104 ;
4 x 105 ; 103
1; 1; 40; 1000
1
20
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Tema 2: Carbohidratos
Los carbohidratos son compuestos provenientes de la naturaleza que se caracterizan por tener enlaces
de carbono y grupos hidroxilo. A ellos pertenecen los azúcares monosacáridos (del griego saccharos, que
significa dulce) y sus polímeros (oligo y polisacáridos).
Monosacáridos: Aldosas y Cetosas
La más simple de las aldosas es el gliceraldehído, el cuál contiene un centro quiral en C-2 y por ende
presenta dos formas enantioméricas (D- y L- Gliceraldehído).
Casi todos los monosacáridos naturales provienen de la triosa Gliceraldehído.
Dependiendo del número de carbonos, los monosacáridos pueden ser triosas (3C), tetrosas (4C),
pentosas (5C) y hexosas (6C).
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Conformación
Fisher vs. Haworth
En las proyecciones de Fisher, la posición del OH más alejado del grupo más reducido (el aldehído),
puede ser a la derecha (D-) o a la izquierda (L-). En las proyecciones de Haworth, la posición D- de Fisher
equivale a el OH abajo (α) del plano y L- equivale a arriba (β).
En términos conformacionales (3 Dimensiones), la mayoría de los anillos no están planos, sino en forma
de sillón (su conformación más estable) y en la que los grupos hidroxilo están localizados
equatorialmente y sólo el OH en la posición C1 tiene una posición axial.
Dentro de las aldosas más importantes, tenemos:
a)
b)
c)
d)
e)
Pentosas: D-Ribosa (RNA), D-Xilosa, L-Arabinosa
Hexosas: D-Glucosa (uvas), D-Manosa y D-Galactosa
Desoxyaldosas: 2-Desoxy-D-Ribosa y L-Fucosa
Aminoazúcares acetilados: N-Acetil-D-Glucosamina y N-Acetil-D-Galactosamina
Monosacáridos ácidos: Ácido D-glucorónico, ÁcidoD-idurónico y Ácido N-acetilneuramínico
Mientras que dentro de las cetosas, encontramos a la D-Ribulosa y a la D-Fructuosa (miel, frutas)
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Reacciones que pueden llevar a cabo los monosacáridos
1. Las aldosas tienen en su forma anular (cuando forman anillos), un centro quiral en C1. Los
enantiómeros derivados de él, se denominan anómeros. Si el grupo OH en C1 se encuentra del
mismo lado que el grupo CH2OH en C6, entonces se reconoce como un ß-anómero y si están en
lados contrarios como un α-anómero. El cambio de un anómero a otro se conoce como el
fenómeno de mutarotación.
2. Si el grupo anómero de un azúcar reacciona con un alcohol, entonces se produce un Oglucósido.
3. Si el grupo anómero de un azúcar reacciona con un grupo NH2 se produce un N-glucósido tal
como los conocemos en los nucléotidos y en las glicoproteínas.
4. La reducción del anómero de la glucosa da como resultado el sorbitol.
5. La oxidación en C1 deriva en un ester (lacton) intramolecular conocido como un ácido glucónico
y si esta sucede en C6 da como resultado un ácido glucurónico, importante en las
biotransformaciones del hígado.
6. En soluciones alcalinas débiles, la glucosa se encuentra en equilibrio con la cetohexosa DFructuosa y la aldohexosa D-Manosa. La glucosa y la manosa sólo se diferencian en el C2. Esta
configuración los hace epímeros y su conversión de una a otro se llama epimerización.
7. Empleando ácidos, los grupos hidroxilo de los monosacáridos forman esteres. En el metabolismo
celular generalmente se forman esteres con ácidos fosfóricos, tal como la Glucosa-6-fosfato.
8. Utilizando ácidos y bases fuertes, los monosacáridos se descomponen en elementos pequeños
que pueden servir para su identificación. Con bases, se obtienen “reductonas” y con ácidos se
obtienen derivados del furanaldehídos (furfurales), los cuáles se pueden identificar con
reacciones colorimétricas.
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Polarimetría, mutarrotación
La técnica de la polarimetría es útil para la determinación de soluciones de azúcares. Esta técnica se
basa en los cambios que la luz polarizada lleva a cabo en los centros quirales. Para ello es necesario
contar con una fuente de luz (polarizador) y un analizador. El analizador es una especie de filtro que
dejará pasar la luz sólo cuando tanto el polarizador como él mismo se encuentren en la misma posición.
La rotación óptica de una solución depende de sus centros quirales, de su concentración y del tipo de
solución.
Ejemplo.- Una solución pura de α-D-Glucosa tiene un ángulo de rotación de +112° y una de β-D-Glucosa
de +19°. Estas rotaciones cambian espontáneamente con el paso del tiempo y terminan ambas en un
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valor de +52°. Esto se debe al fenómeno de la mutarrotación, en el que los anómeros cambian su
posición hasta alcanzar un equilibrio.
Nomenclatura, formas anulares
La nomenclatura de los carbohidratos se basa no sólo en el tipo de uniones, sino también en su
estereoquímica y la forma del anillo. Ver los ejemplos.
Disacáridos y polisacáridos
A través de la unión del grupo hidroxilo anómero de un monosacárido con algún grupo hidroxilo de otro
azúcar se obtienen los disacáridos. Este tipo de enlace se llama glicosídico y al formarse, previene el
fenómeno de la mutarrotación. Este tipo de enlaces se forman a través de enzimas específicas, lo que da
lugar a conformaciones α ó β propias. La unión de más monosacáridos da lugar a los oligosacáridos (320 monómeros) y finalmente a los polisacáridos (hasta más de 105 monómeros).
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Dentro de los disacáridos tenemos a la sacarosa, la cual se encuentra en abundancia en las plantas (caña
de azúcar) y se usa tanto como carbohidrato de transporte como reserva accesible de energía (disuelta).
Las abejas obtienen sacarosa del néctar de las flores y en su estómago la hidrolizan por medio de
enzimas para dar lugar a la miel, que es una mezcla aprox. equimolar de glucosa y fructuosa (azúcar
invertida).
La lactosa (la azúcar de la leche) es el carbohidrato más importante en la leche de los mamíferos. En la
leche de vaca, la lactosa representa aprox. el 4.5% mientras que en la leche materna humana es hasta el
7.5%. El enlace glicosídico en la lactosa se localiza en el C1-Galactosa con el C4-Glucosa y ambos anillos
piranos se encuentran en el mismo nivel. La galactosa se epimeriza a glucosa en el hígado a través de la
lactasa (β-D-galactosidasa), cuya ausencia lleva a la intolerancia a la lactosa en algunas personas.
Polisacáridos importantes
Los polisacáridos se encuentran abundantemente en la naturaleza. Dependiendo de su función, se
pueden agrupar en 3 grupos importantes:
Polisacáridos estructurales – los que dan estabilidad mecánica a los organismos, células u órganos. Ej.- la
celulosa y la quitina, ésta última presente en el exoesqueleto de los insectos y crustáceos, así como en
las paredes celulares de los hongos.
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Polisacáridos hidrofílicos – están altamente hidratados y evitan que las células o tejidos que cubren se
deshidraten. Ej.- agarosa de algas, la cual se usa además para la producción de geles (electroforesis).
Polisacáridos de reserva – son aquellos utilizados para guardar carbohidratos y liberarlos en forma de
monosacáridos cuando sea necesario. Polímeros hechos a base de sólo un monosacárido se llaman
homoglicanos, mientras que son heteroglicanos los que provienen de diferentes monómeros. Estos
polisacáridos pueden hallarse en forma lineal o bifurcada.
Polisacáridos vegetales
Dentro de los polisacáridos vegetales, los más importantes son la celulosa y el almidón.
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Celulosa: es un homoglicano lineal formado por monómeros de glucosa unidos por un enlace β1—4 y es
la sustancia más abundante en la naturaleza. Las paredes celulares de las plantas están compuestas de
40-50% de celulosa. La celulosa es un componente importante también del algodón y su fibra (hasta
98% celulosa). La celulosa puede contener hasta 104 unidades de glucosa, un peso molecular de 1-2* 106
y una longitud de 6-8 µm. Además, es mecánicamente muy estable y resiste en gran medida la hidrólisis
alcalina o enzimática (un reto en la era de los biocombustibles y la energía regenerativa!). Esta
estabilidad es conferida gracias a su estructura lineal y a la formación de puentes de hidrógeno a lo largo
de la cadena. En su biosíntesis, 50 a 100 moléculas de celulosa forman una fibra elemental (4nm de
diámetro) y 20 de ellas dan lugar a una microfibrilla, que a su vez son parte fundamental de la pared
celular primaria de las células vegetales. Otros polisacáridos como la hemicelulosa (una mezcla neutral
de heteroglicanos –xylanos, xyloglucanos, arabinogalactanos, etc.- ) y la pectina.
Almidón: es un polisacárido de reserva abundante en plantas y el carbohidrato más importante para la
alimentación humana. El almidón se encuentra en los cloroplastos de las hojas, en los frutos, semillas y
tubérculos. También se localiza en los amiloplastos en forma de gránulos pequeños. Los gránulos de
almidón son prácticamente insolubles en agua, sólo si éstos se calientan se pueden obtener hasta un
20% de amilosa (almidón soluble) y 80% permanece en la forma insoluble de amilopectina. La amilosa
está conformada por 200-300 monómeros de glucosa unidos solamente por enlaces α1—4 , los cuales
forman una hélice cada 6-8 unidades. Mientras que la amilopectina es un polisacárido ramificado gracias
a un enlace 6—α1 que une una cadena con otra.
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Glicoproteínas y glicosoaminoglicanos
Muchas proteínas localizadas en la superficie de las membranas plasmáticas contienen oligosacáridos,
los cuales son introducidos de forma post-translacional en el retículo endoplasmático y en el aparato de
Golgi. Las proteínas citoplasmáticas generalmente no se encuentran glicosiladas.
Las glicoproteínas pueden contener más de un 50% de carbohidratos, pero generalmente la parte
proteica es más alta. Un ejemplo de una glicoproteína es la Inmunoglobina IgG, en la cual el
oligosacárido se encuentra unido a la asparagina a través de un enlace N-glicosídico. En las
glicoproteínas este tipo de enlace prevalece, aun y cuando también existen algunas con enlaces OPágina 12
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glicosídicos cuando hay interacciones con serinas o treoninas. La parte violeta en la figura corresponde
a la parte medular de las glicoproteínas N-glicosiladas.
La glicólisis de las proteínas ocurre en el retículo endoplasmático con un oligosacárido que además de
contener la estructura base contiene seis unidades adicionales de manosa y 3 restos de glucosa en la
terminal. Estos restos adicionales son procesados y reemplazados por otros azúcares para dar lugar a las
glicoproteínas complejas (IgG) o a las de tipo manosa.
Los glicosoaminoglicanos o glicosaminglucanos, también llamados mucopolisacáridos, representan un
grupo de heteropolisacáridos ácidos caracterizados por contener un amino azúcar y ácido glucorónico ó
ácido idurónico. La mayor parte de estos polisacáridos forman esteres con sulfatos, lo que les confiere
un carácter ácido mayor. Son parte importante de los proteoglicanos, los cuales forman parte a su vez
de la matriz extracelular de animales. Un ejemplo sencillo de glicosaminoglicano es el ácido hialurónico,
el cual está formado por unidades de disacáridos (N-Acetilglucosamina y ác. glucorónico) que de forma
alternada se unen en enlaces β1—4 y β1—3. Este último enlace le confiere una forma helicoidal que
presenta grupos carboxilo hidrofílicos hacia afuera capaces de atraer iones de calcio. Además, tiene una
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gran capacidad para hidratarse, lo cual le confiere propiedades de gel resultando en un material
perfecto para los tejidos conectivos (mesodérmicos) y para la matriz extracelular.
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Prueba tu comprensión
Tema 2: Carbohidratos
1. ¿Quiénes son los carbohidratos? ¿qué funciones tienen los carbohidratos en los organismos
vivos?
2. Menciona los nombres de las Aldohexosas
3. Dibuja la estructura de la D- y L-Glucosa utilizando las proyecciones de Fisher.
4. Explica el fenómeno de la mutarrotación
5. ¿Cuántos isómeros existen en las Aldotetrosas, cuántos en las Cetotetrosas?
6. Dibuja las β-D-glucopiranosa utilizando el modelo de Tollens en su forma (más estable) de silla y
en su proyección Haworth
7. Dibuje la proyección de Fisher de la D-Fructosa.
8. ¿Cuáles son las reacciones básicas para transformar a la glucosa en diferentes hexosas?
9. Bajo qué mecanismo se convierten las Aldosas en Cetosas.
10. ¿Cómo se epimerizan los azúcares?
11. ¿Qué se entiende bajo los términos O-, S- y N-Glicósidos? Da ejemplos de ellos.
12. ¿Qué es una azúcar invertida?
13. Nombra polisacáridos que sirvan de reserva para animales y plantas
14. ¿Cómo se activan los azúcares para la biosíntesis de Glucósidos?
15. Investiga cómo funciona la prueba de yodo para los almidones. Explícala.
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Tema 3. Lípidos
Los lípidos son un grupo grande de sustancias biológicas que tienen como característica principal su
solubilidad en solventes orgánicos como el metanol, la acetona, el cloroformo, etc., y su baja o nula
solubilidad en agua. Esta baja o nula solubilidad en agua se debe principalmente a la falta de átomos
polarizables (O, N, P y S). Se pueden clasificar en lípidos hidrolizables y no hidrolizables como se muestra
en la figura.
Dentro de los lípidos hidrolizables se contabilizan los esteres sencillos dentro de los cuales están:
1. las grasas (glicerol + 3 ácidos grasos), las ceras (alcohol graso + ácido graso) y los esteroles
(esterol + ácido graso).
2. Los fosfolípidos, que incluyen un grupo fosfato polar: fosfoglicéridos (glicerol + 2 ácidos grasos +
fosfato + alcohol) y los fosfoesfingolípidos (esfingosina + ácido graso + fosfato + aminoalcohol)
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3. Los glucolípidos contienen esfingosina, pero también azúcares. La unidad fundamental es la
ceramida (ácido graso + esfingosina). Los cerebrósidos (cermida + monosacárido –glucosa ó
galactosa- ó polisacárido) y gangliósidos (ceramidas unidas a oligosacáridos con ácido siálico)
son representantes de este grupo. Los glucolípidos actúan como receptores y se localizan en la
cara externa de las membranas celulares.
Dentro de los lípidos no hidrolizables son aquellos que se derivan principalmente de los ácidos grasos.
Función Biológica
Los lípidos tienen una función muy importante como reservas de energía. Las grasas, sobretodo, se
almacenan en pequeñas gotas dentro de las células y son su combustible. Cuando se consume oxígeno,
los lípidos son transformados/oxidados en las mitocondrias a agua y dióxido de carbono, generando
ATP.
Los lípidos son fundamentales en la construcción de las membranas celulares. Lípidos de membrana
típicos son los fosfolípidos, los glicolópidos y el colesterol. Las grasas no forman membranas celulares.
Otra función de los lípidos es la de fungir como aislantes tanto térmicos como eléctricos. Algunos otros
lípidos tales como las vitaminas liposolubles y los ácidos grasos esenciales tienen una función especial
en la nutrición humana. Los esteroides y ecoisanoides tienen funciones como hormonas, mediadores y
factores de crecimiento.
Ácidos Grasos
Los ácidos grasos son ácidos carboxílicos unidos a largas cadenas de carbono. Forman parte
fundamental de los lípidos y se encuentran en todos los organismos. Los ácidos grasos forman esteres
principalmente con el glicerol, con la esfingosina ó el colesterol, pero también se pueden encontrar
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libres (free fatty acids). En la tabla siguiente se presentan los ácidos grasos alifáticos más comunes en
plantas y animales. Dentro de los ácidos carboxílicos más comunes están los de cadena con 16 y 18
carbonos. Debido a la biosíntesis basada en unidades C2, los ácidos grasos tienen un número par de
carbonos en la cadena. Algunos ácidos grasos contienen enlaces dobles (enlaces insaturados) y éstos
forman isómeros cis y trans. En la naturaleza, la mayor parte de estos compuestos toma la forma
isomérica cis, y ácidos grasos ramificados sólo se han encontrado en bacterias.
Tomando como ejemplo el ácido oleico, es posible visualizar el doble enlace entre los carbonos C9 y C10
y su forma isomérica cis. En la mayoría de los ácidos grasos insaturados, la primera insaturación se
presenta en el C9-C10, y los siguientes con un espacio de 3 átomos de carbono. En la naturaleza, existen
raros ejemplos de enlaces insaturados conjugados (espacio de 2 átomos de carbono).
La unión sencilla de carbono a carbono en estos compuestos, les permite girar libremente y tener una
conformación lineal. Sólo los ácidos grasos insaturados tienen un doblez en donde sucede la
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insaturación, aumentando la fluidez (por ejemplo en las membranas) y bajando su punto de fusión.
A través de la saturación de los dobles enlaces en los ácidos grasos, éstos se vuelven “duros”. Ej.margarina.
Los puntos de fusión de los ácidos grasos se incrementa al aumentar el número de carbonos en la
cadena, y decrece al aumentar el número de enlaces insaturados presentes.
Los ácidos esenciales son el ácido linoleico, linolénico y araquidónico, los cuales tienen que obtenerse de
la dieta, ya que los animales no los pueden sintetizar. El ácido araquidónico es el más importante de
ellos, ya que sirve a la síntesis de Eicosanoides (producción de hormonas tales como la prostaglandinas,
prostaciclinas y tromboxanos. Los ácidos linoleico y linolénico pueden sustituir al ácido araquidónico, ya
que los animales son capaces de incorporar dos carbonos más a la cadena.
Grasas ó glicéridos
Las grasas, los fosfolípidos y los glicolípidos tienen una composición química común.
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La función biológica de las grasas es ser vehículo de energía, de las vitaminas liposolubles, así como la
fuente de ácidos grasos esenciales. En el cuerpo, además de ser la reserva principal de energía, son el
suministro principal de carbono (unidades de acetato), así como aislante térmico, eléctrico e incluso
mecánico.
La hidrólisis de las grasas se puede llevar a cabo in vitro a través de la hidrólisis alcalina (saponificación)
que da como resultado glicerol y las sales de los ácidos grasos presentes (origen del jabón). En los seres
vivos, la hidrólisis sucede a través de las lipasas. En el intestino, una lipasa pancreática se encarga de
hidrolizar preferentemente en C1 y C3 dando lugar a monoglicerol y dos ácidos grasos libres, los cuales
pueden ser ahora reabsorbidos por el intestino.
Fosfolípidos y glicolípidos
Los fosfolípidos son parte fundamental de las membranas y la característica fundamental es que están
unidos a un grupo fosfato, ya sea teniendo como base al glicerol o a la esfingosina. Los grupos que se
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unen al fosfato pueden cambiar o influenciar la carga negativa que éste tiene, así por ejemplo se obtiene
una carga neutra con los residuos colina y etanolamina, mientras que la serina y el inositol confieren una
carga neta negativa.
Los esfingolípidos se encuentran de forma abundante en el cerebro y en los tejidos nerviosos. Estos
compuestos, a diferencia de otros fosfolípidos tienen como base a la esfingosina. Si esta esfingosina se
una a un ácido graso a través de un enlace amídico forma la ceramida. La ceramida es el precursos de
todos los esfingolípidos. El esfingolípido más importante es la esfingomielina, la cual es parte de la vaina
de mielina, que une y aisla los axones de las neuronas.
Los glicolípidos se encuentran en todos los tejidos en la capa exterior de las membranas plasmáticas. Los
gangliosidos son los glicolípidos más complejos y además de ser lípidos de membrana tienen función
como receptor.
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Isoprenoides
Los isoprenoides tienen su biosíntesis a partir del Acetil-CoA y con ello comparten con las grasas,
fosfolípidos y glicolípidos la piedra angular.
Los isoprenos se pueden clasificar en :
• Hemiterpenos: Unidad menor, contiene 5 C como el isopreno (unidad fundamental)
• Monoterpenos: C10, esencias volátiles de flores, aceites esenciales de hierbas y especias.
• Sesquiterpenos: C15, aceites escenciales, fitoalexinas, hormona vegetal como el ác. abscísico.
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•
•
•
•
Diterpenos: Terpenos de 20 Carbonos, fitol (lado hidrofóbico de la clorofila), algunas hormonas
giberelinas, etc.
Triterpenos: Terpenos de 30 Carbonos, esteroides como los fitoesteroles.
Tetraterpenos: Terpenos de 40 Carbonos, carotenoides
Politerpenos: más de 8 unidades de isopreno (40C), plastoquinona y la ubiquinona
Biosíntesis resumida
Acetil-CoA – Mevalonato – Iso-pentenil difosfato – Triterpenos – Colesterol
C2
3X
C6
-1C
5C
6x C30
-3C C27
Esteroides
Los 3 grupos principales de esteroides son: a) esteroles, b) ácidos biliares y c) las hormonas esteroidales.
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Los esteroles son esteroides con alcoholes. En su posición C3 tienen un β-OH y contienen uno o más
dobles enlaces en el anillo B y en la cadena lateral. El animales el más importante es el colesterol, pero
en plantas el fitoesterol es una mezcla de stigmasterol, sitosterol y campesterol. Los hongos y levaduras
contienen ergosterol. Son parte fundamental de las membranas.
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Los ácidos biliares son derivados del colesterol y se sintetizan en el hígado. Estos compuestos ayudan a
mantener al colesterol biliar en solución y promover la degradación de los lípidos.
Las hormonas esteroidales son también derivados del colesterol. Su función regulatoria y de
señalización es muy importante para el metabolismo, el crecimiento y la reproducción. Las hormonas
esteroidales mamíferas son la progesterona, el cortisol, la testosterona, el estradiol, etc.
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Prueba tu comprensión
Tema 3: Lípidos
1. ¿En qué estructuras celulares se pueden encontrar lípidos? ¿qué funciones tienen en los
organismos vivos?
2. ¿Cuántos átomos de carbono tiene el ácido linoleico, linolénico y araquidónico?
3. Dibuja la estructura del ácido cis-9,12,15-octadecatrienoico
4. ¿Cómo se biosintetizan los ácidos grasos de más de 16 carbonos?
5. ¿Cuáles son los ácidos grasos esenciales? ¿por qué son esenciales?
6. Explica los siguientes términos: ácidos grasos cis/trans, iso y anteiso, conjugados y “skipped”
7. ¿Qué se entiende bajo el término “Cera” y qué bajo el término “Grasa”?
8. Dibuja y describe el modelo sintético de los fosfolípidos. ¿Qué variaciones de los ácidos grasos y
de alcoholes pueden presentarse?
9. Nombra métodos analíticos para analizar las grasas.
10. ¿Cómo se producen los ácidos grasos insaturados? ¿qué enzimas en condiciones aeróbicas son
capaces de su biosíntesis? ¿pueden organismos anaeróbicos sintetizar ácidos grasos
insaturados?
11. ¿Qué organismos pueden sintetizar ácidos grasos alifáticos y cómo lo hacen?
12. ¿Qué sucede cuando un ácido graso entra en contacto con oxígeno/aire o una peroxidasa?
13. ¿Qué se entiende bajo los términos esfingolípidos, ceramidas y esfingoglicolípidos? ¿en dónde
se encuentran, cuál es su función y su biosíntesis general?
14. ¿A qué se refiere el proceso de “saponificación”? dibuja la reacción general.
15. ¿Cómo se forman los triglicéridos (ácidos grasos esterificados)?
16. ¿Cuál es la razón por la que los ácidos grasos y los lípidos tienen propiedades de detergente y
cuál es su consecuencia?
17. ¿Cómo es la biosíntesis de los ácidos grasos? ¿Cómo se llama la reacción para incrementar el
tamaño de la cadena?
18. ¿Qué grupos polares están presentes en lípidos complejos?
19. ¿Cómo se puede manipular el punto de fusión de los lípidos (biosíntesis, síntesis)?
20. ¿Qué funciones desempeñan los eicosanoides en el ser humano?
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Tema 4. Ácidos Nucleicos
Los ácidos nucleicos juegan un papel fundamental en la salvaguarda y expresión de la información
genética. Existen dos clases, el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). El primero
contiene y guarda la información genética, mientras que el segundo está involucrado en la expresión
génica y en la biosíntesis de proteínas. Ambos están formados por nucleótidos, los que a su vez están
compuestos de una base, un azúcar y un resto de fosfato.
Las Bases
Las bases de los ácidos nucleicos son heterociclos aromáticos derivados de las purinas y las pirimidinas.
Cinco de estas bases son comunes a ambos ácidos nucleicos y a todos los seres vivos a la vez. Las purinas
Adenina (A) y la Guanina junto con la pirimidina Citosina (C) se encuentran en ADN y ARN. Por el
contrario, la pirimidina Uracilo (U) sólo se presenta en el ARN, y su derivado 5 metilado – la Tiamina (T)en el ADN. Un gran número de otras bases se encuentran en el tARN y en otros tipos de ARN.
Nucleosidos
La unión de una base con ribosa o 2-desoxiribosa da lugar al nucleosido. De tal forma, la unión de la
Adenina con ribosa se llama Adenosin y si la unión fuera con la 2-desoxiribosa se llama deoxiadenosin
(dA). En las células la posición 5 de azúcar forma un ester con el grupo fosfato (Adenosin-5´monofosfato, AMP), de dA, el correspondiente dAMP. Si el grupo fosfato se une con otros fosfatos,
entonces da lugar al Difosfato de Adenosina (ADP) y al trifosfato de Adenosina (ATP). Importantes coenzimas del metabolismo. Todos los fosfatos de nucleosidos se agrupan en nucleótidos. Tanto en los
nucleosidos como en los nucleótidos la pentosa se encuentra como furanosa. La base se une al azúcar a
través de un enlace β-N-glicosídico.
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Oligonucléotidos, Polinucleótidos
Los grupos fosfatos de los nucleótidos pueden reaccionar entre ellos formando anhidros –
dinucleuótidos con estructura de fosfoanhidros). A este grupo de compuestos pertenecen las Coenzimas
NAD+, NADP+, FAD y la Coenzima A. Si por el contrario, el fosfato reacciona con el 3´-OH de un segundo
nucleótido se forma un oligonucleótido que en su extremo 5´tiene un grupo fosfato libre y en el
extremo 3’ un grupo OH libre. De esta manera se forman los oligonucleótidos y los polinucleótidos tanto
de ADN como de ARN. Para representar la estructura de los polinucleótidos de forma concisa, se
escriben las abreviaturas de las bases siguiendo la dirección de 5´a 3´. También es correcto utilizar el
siguiente formato para abreviar/escribir los polinucleótidos: 5´-pAU…-3´.
La función biológica del ADN se respalda en la capacidad de las bases para interactuar de forma
específica entre ellas. La primera evidencia de esto se basó en la observación de que en todo ADN, el
contenido de Adenina y Tiamina era el mismo y los contenidos de Guanina y Citosina también
guardaban esa relación, a pesar de que la suma de A+T y G+C difiere de organismo a organismo. El
modelo propuesto en 1953 por J. Watson y F. Crick permitió explicar la complementariedad de las bases
y la forma helicoidal del ADN. En cada par complementario, una pirimidina y una purina están unidas y
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se mantienen estables gracias a puentes de hidrógeno formados entre ellas. La unión AT tiene dos
puentes de hidrógeno y la GC tres, haciéndola más estable y energéticamente más demandante.
La complementariedad de las bases se da solamente cuando hay polaridad en las cadenas sencillas, esto
es, cuando las cadenas tienen diferentes sentidos o direcciones y además encuentran la conformación
de hélice. El ARN no puede formar dicha hélice debido a la conformación estérica del 2´-OH de la ribosa.
Por esta razón, la complementariedad de las bases de ARN se encuentra sólo en secuencias pequeñas y
su estructura general es menos regular que la del ADN.
Debido a que las cadenas sencillas del ADN se encuentran unidas no por enlaces covalentes, sino por
puentes de hidrógeno, es posible inducir su desnaturalización a través de la elevación de la
temperatura. Así mismo, al enfriar de nuevo la complementariedad de las bases puede volver a
restituirse (renaturalización). Esta característica físico-química tiene un gran valor en la Biología
Molecular.
Funciones de los Ácidos Nucleicos
Como se menciono anteriormente, los ácidos nucleicos son las biomoléculas más importantes para
conservar la información genética, controlar la expresión génica y la expresión de las proteínas.
En términos generales se puede decir que el ADN es la molécula que se encarga de guardar los genes.
Los miles de genes que tienen los organismos pueden codificar secuencias completas de proteínas.
Cada amino ácido es codificado por una secuencia de ADN de 3 bases consecutivas llamada codón. Por
ejemplo, el codón que codifica para la fenilalanina es TTC.
Para la expresión de los genes, esto es, la síntesis de proteínas asociadas a ellos, la información
contenida en el ADN tiene que ser traducida a una secuencia proteica. Debido a que el ADN no participa
en la síntesis de proteínas, la información para su codificación tiene que salir del núcleo celular para ser
llevada a la fábrica de proteínas, el ribosoma. Ahí se codifica primero el gen a ser expresado en un ARN
mensajero (mARN) a través del proceso de transcripción. La secuencia de este ARN mensajero es
complementaria a la de la cadena sencilla de ADN que se transcribe con las adecuaciones de bases
necesarias (T –U ). Triada de ADN – AAG, Codon mARN – UUC.
En los organismos eucariotas, el ARN mensajero sufre modificaciones antes de que pueda salir del
núcleo celular. Algunas de estas modificaciones están relacionadas con los ARN nucleares pequeños
(snRNA). Cuando el ARN mensajero está listo, sale del núcleo al citoplasma y se une entonces al
ribosoma. Los ribosomas contienen muchas proteínas y también varias moléculas de ARN de diferentes
longitudes denominadas ARN ribosomal (rRNA). El ARN ribosomal representa la mayor parte del ARN
celular y a diferencia del mensajero, tiene una vida relativamente larga. El ARN ribosomal juega un papel
no sólo como estructura del ribosoma, sino también en la unión del ARN mensajero con el ribosoma.
Para la síntesis de proteínas, el ARN de transferencia y el ARN mensajero deben de interactuar. El ARN
de transferencia cumple con la función de proveer el amino ácido necesario al ribosoma. Un ARN de
transferencia que en la terminal 3´cuente con una fenilalanina, se denomina Fen-rARN. Su sencuencia
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anticodón complementa al ARN mensajero y al suceder esto, pone en posición a la fenilalanina para que
otro ARN de transferencia vecino lo tome e incorpore a la creciente cadena de proteínas.
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Modelos de moléculas
Los modelos de Van der Waals son de los más utilizados para representar a los ácidos nucleicos.
A través del estudio de ADN sintético, se encontró que el ADN puede tomar diferentes conformaciones.
La conformación más común es la B-ADN (en la Figura). En esta conformación, las cadenas sencillas
están complementadas y formando la hélice. La columna vertebral formada por la desoxiribosa y el
fosfato unida (diester fosfídico ácido). También se presenta el modelo del ARN de transferencia (PherRNAPhe) .
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La extracción de DNA ó RNA
Cualquier experimento de biología molecular parte del uso de los ácidos nucleicos, ya sea del DNA o del
RNA. Por ello, los métodos para aislar estas moléculas son de suma importancia y constituyen en la
mayoría de los casos el primer paso para cualquier estudio.
A pesar de que los ácidos nucleicos están construidos de forma similar en todos los organismos, existen
diferencias en su manejo dependiendo de su origen y tamaño (Ver Tabla 1). Por ello, es más fácil
manejar un fragmento de 500 bp que uno de 500 000 bp, y el DNA genómico se obtiene de forma
diferente al DNA de un plásmido. Por esta razón, existen en la literatura muchos métodos para
obtenerlos, ya que uno sólo no es suficientemente bueno para todos los casos.
En general, el aislamiento de los ácidos nucleicos comienza con el rompimiento de las paredes celulares
y membranas de los organismos, sean estos virus, bacterias, células animales o vegetales. Para ello, se
prefieren métodos enzimáticos para destruir la pared celular o el empleo de detergentes para promover
la lisis de las membranas celulares. Los métodos físicos tales como la trituración son necesarios en
algunos casos, especialmente en algunos materiales vegetales, pero existe el riesgo de que el estrés
mecánico ejercido dañe y fragmente moléculas grandes de DNA, las cuáles son indispensables en
diversos estudios genómicos (construcción de librerías genómicas, hibridización, entre otros).
Después del rompimiento celular, se retiran generalmente las proteínas. Este paso se logra a través de
una o más extracciones empleando fenol o mezclas de fenol y cloroformo. Al mezclarse y emulsificarse
los ácidos nucleicos, las proteínas y el resto de los componentes celulares con el solvente orgánico, se
centrifuga para separar la solución en dos fases: la fase inferior de fenol se encuentra enriquecida con
proteína y mucha de ésta se localiza también en la interfase, mientras que los ácidos nucleicos se
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encuentran preferentemente en la fase acuosa superior y pueden ser posteriormente precipitados con
alcohol etílico o isopropanol.
En caso de querer recuperar únicamente el DNA, se puede utilizar la enzima ribonucleasa (RNasa) para
destruir el RNA contenido en la muestra. Si por el contrario, se requiere el mRNA para la síntesis de
cDNA, un paso adicional de limpieza con cromatografía de afinidad empleando como adsorbente
Oligo(dT)Celulosa es necesario. Esto se debe a que el mRNA pose en el extremo 5´ una cachucha (cap)
de 7-metilguanosina (5´Cap) y en el extremo 3´ una secuencia de poli-adenosina (la llamada cola poliA+).
Tabla 1. Ejemplos del tamaño del genoma y número de cromosomas contenidos de algunos seres vivos.
Número de cromosomas
Ser humano
Ratón
Mosca
Tabaco
Maíz
Saccharomyces
(Levadura)
Escherichia coli
Fago λ
cerevisiae
2 x 23
2 x 20
2x4
2 x 24
2 x 10
Ca. 17
Tamaño del Genoma
(pares de bases, bp)
3,2 x 109
2,7 x 109
1,8 x 108
4,8 x 109
3,9 x 109
1,5 x 107
1
1
4,64 x 106
48 502
DNA genómico: es el DNA que integra el genoma del organismo en cuestión, esto es, la colección de
genes de un organismo. En organismos superiores el DNA genómico se encuentra en el núcleo celular y
está ordenado en cromosomas. Cada cromosoma está formado por una cadena de DNA-doble, la cual
tiene una longitud de miles o millones de bases de pares cuya secuencia y orden es importante, sobre
todo en el caso de las proteínas que se unen directamente al DNA. Por ello, el reto más grande de este
tipo de preparación es eliminar las proteínas sin fragmentar el DNA durante la purificación.
Por otro lado, las bacterias cuentan también con DNA genómico, pero éste se encuentra de forma
circular (1 cromosoma) y se localiza en el citoplasma de la célula. Los plásmidos ocurren
frecuentemente en bacterias y son elementos circulares de DNA de un menor tamaño, que facilitan la
exportación e importación de genes entre bacterias.
Purificación y concentración de ácidos nucleicos
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La purificación de DNA y RNA son una de las actividades estándares que se realizan en los laboratorios
de biología molecular. Algunos de los métodos/técnicas más empleadas se describen a continuación:
1. Extracción con fenol-cloroformo
Las impurezas indeseables más comunes que acompañan a los ácidos nucleicos son las proteínas. El
método clásico de purificación es adicionando a la solución de DNA, un volumen equivalente de
fenol (pH 8), después se recupera la fase acuosa y se somete a una nueva extracción con Fenolcloroformo-isoamil alcohol (25:24:1, v/v)1. De esta extracción, se recupera también la fase acuosa y
ésta se somete a una extracción final con cloroformo. Las proteínas se localizan preferentemente
en la fase orgánica y en la interfase, por lo que es posible hacer n cantidad de extracciones
dependiendo de las impurezas que se detecten en la interfase. No se debe de olvidar, por otro lado,
que al aumentar el número de extracciones se incrementa la pureza, pero se reduce la cantidad de
DNA recuperada (rendimiento).
Una ventaja de este método es que está probado, es barato y no tiene problemas de capacidad
(como la de las columnas). Sus desventajas más importantes son que huele mal, irrita, puede dañar
la salud y los desechos son contaminantes y deben de tratarse de forma separada.
2. Columna de intercambio aniónico
Los ácidos nuecleicos al contener grupos fosfato están cargados negativamente arriba de un pH 2,
por lo que se pueden unir a un adsorbente (material cromatográfico) cuyos ligandos sean positivos.
La fuerza de unión de las proteínas, el DNA y el RNA al adsorbente es diferente y depende además
del pH y del buffer en el que se realice la adsorción. Por ello, resulta un método eficiente de
purificación incluso en lisados de células sin previo tratamiento.
En términos generales, la muestra con el DNA se prepara a una concentración de sal conocida y se
pasa por la columna. Los ácidos nucleicos se unen preferentemente al adsorbente ya que tienen
cargas negativas fuertes, mientras que las proteínas cargadas ligeramente negativas a estas
condiciones no se unen y salen de la columna. Con un buffer de mayor fuerza iónica se puede lavar
el RNA adsorbido y finalmente eluir el DNA empleando un buffer de aun mayor fuerza iónica o
bajando el pH. Para eliminar la sal, se precipita el DNA con alcohol (etanol o isopropanol). Los
buffers utilizados en el procedimiento dependen del material cromatográfico, por lo que se deben
de seguir las recomendaciones hechas por el proveedor. Desafortunadamente, algunos proveedores
no especifican la composición de los buffers que emplean, por lo que obligan a sus clientes a
comprar ciegamente sus materiales.
1
La adición de isoamil alcohol a la mezcla es deseada, pero no crítica.
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3. Gradiente de CsCl
Un método clásico que cada vez es menos usado es el empleo de un gradiente de cloruro de cesio
con centrifugación. Si se centrifuga a alta velocidad por un largo tiempo, el cloruro de cesio forma
un diferencial de densidades. Muy pesado hacia el fondo y más ligero hacia arriba. Debido a que las
proteínas, el DNA y el RNA tienen diferentes densidades, es posible utilizar este gradiente y separar
selectivamente cada uno de estos componentes. Incluso es posible utilizar este método para separar
DNA plasmídico del DNA bacterial.
4. Precipitación con PEG
La precipitación de DNA empleando PEG (polyethylene glycol) ha sido un método poco estimado y
utilizado, aun y cuando sus resultados son generalmente buenos. Este tipo de procedimiento puede
resultar útil para limpiar reacciones de PCR y en la obtención de plásmidos. Hay diferentes
protocolos, pero generalmente se utiliza PEG de masa molecular 6000 y 8000 y no menores.
Ejemplo: A una reacción de PCR de 50 µl, agregar 50 µl de solución PEG (20% PEG 8000, 2.5M NaCl)
y mezclar. Incubar a 37°C por 15 min y luego centrifugar a temperatura ambiente (15 min, 15000
rpm). Recuperar sobrenadante y precipitarlo con etanol frío. Centrifugar y secar pellet. Diluir pellet
en buffer TE. DNA listo para secuenciación.
5. Diálisis
Método útil para deshacerse de sales, restos de fenol e incluso fragmentos pequeños de DNA en la
preparación de DNA genómico. Las membranas de diálisis se venden secas y deben rehidratarse y
lavarse antes de ser empleadas. El proceso puede acortarse si la membrana se pone en agua
hirviendo por 10 min. Después se cierra un extremo y se introduce la muestra de DNA a dializar
cerrando al final el extremo superior. El “chorizo” así formado se sumerge en 1L de buffer TE y se
dializa a 4°C de 2 a 16 hrs, dependiendo del volumen de la muestra. En ocasiones es conveniente
cambiar el buffer durante el proceso y en todo caso se recomienda el uso de guantes para evitar
contaminación por nucleasas.
6. Perlas magnéticas
En principio, las perlas magnéticas son materiales cromatográficos que reúnen dos propiedades: el
de los ligandos de unión y el de poder ser manipulados por magnetismos. Esto permite por un lado
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ajustar la cantidad de perlitas a la muestra que se desea purificar así como la automatización. Para
saber más, ver las páginas de Invitrogen ChargeSwitch® Technology.
7. Filtros para proteínas
Un caso común es querer eliminar una enzima después de alguna reacción deseada en el DNA. Para
esto se puede emplear ahora un filtro (membrana) cuya afinidad es mucho mayor hacia las
proteínas que al DNA. Ver Micropure-EZ de Amicon (hoy Millipore).
8. Precipitación con alcohol
La precipitación con alcohol es el método clásico para concentrar DNA, pero estudios realizados
muestran que además de concentrar, el etanol ó isopropanol son excelentes para limpiar y purificar
nucleicos. Típicamente se utilizan para ello 2-2.5 volúmenes de etanol ó 0.3-0.8 vol. de isopropanol
por volumen de muestra.
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Prueba tu comprensión
Tema 4: Ácidos nucleicos
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
¿Cuáles son las bases fundamentales de los ácidos nucleicos?
¿A qué se le denomina complementariedad de las bases?
¿Cuál es la definición de un nucléotido, de un nucleosido y de una base?
¿Cuál es la función biológica del ADN?
¿Cuál es la función biológica del ARN?
¿Qué diferencias estructurales existen entre ellos?
Explica el proceso de transcripción y translación
¿Qué propiedades de los ácidos nucleicos se utilizan para su separación?
Investiga cómo funciona la hibridización de ácidos nucleicos y explícala con tus propias palabras.
¿En qué otras moléculas se utilizan bases y qué funciones tienen estas moléculas?
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Referencias
1. Koolman J, Röhm KH. Taschenatlas der Biochemie (1994). Thieme. Sttutgart, Alemania. Pp.
30-55, 78-85.
2. Mülhardt, Cornel. Der Experimentator. Molekularbiologie/Genomics, 6. Edición (2009).
Spektrum. Akademischer Verlag. Heidelberg, Alemania. 316 Páginas.
3. Nicholl, D.S.T. Gentechnische Methoden (1995). Spektrum. Akademischer Verlag.
Heidelberg, Alemania. 178 Páginas.
4. Purves WK, Sadava D, Orians GH, Craig Heller H. Life – The Science of Biology, 7ma. Edición
(2006). Spektrum. Akademischer Verlag. Heidelberg, Alemania.Pp. 46, 47, 57-69.
5. Bailey JE, Ollis DF. Biochemical Engineering Fundamentals. 2da. Edición (1986). Mc-Graw-Hill
International Editions. NY, USA. Pp. 27-46, 70-78.
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