!ice. rfc lfed. de la Uni1:. de J\arnrm VII!; 89, /(}(¡~ m: N\\.IHRI FACULTAD DE l!EV!Ui\A DEI' IRT l'!Ei\TO ll.lé \l!Cl\OHIOLOGI.\ Y P.\R\SITOLOGIA lL\l\EHSllJID Estudio sobre el diagnóstico inmunológico de fa hidatidosis (*) A. Chordi RESUMEN Las pruebas de la cosinofilia (E), intradermorreacción (IDR), fijación de complemento (FC). bentonita floculación (BF) y hemaglutinación (HA) para el diagnóstico d~ la hidatidosis se efectuaron en 420 individuos humanos y 131 óvidos. Entre ellos. 60 pacientes humanos y 11 óvidos eran portadores de quiste hidatídico. En los óvidos se estudiaban las pruebas con el fin de observar su comportamiento en la hidatidosis ovina incipiente y en los otros tipos de parasitosis. La E e ID R resultaron positivas en el 4 l y 86 °0 , respectivamente, de los portadores de hidatidosis. y en el 29 y el 45 ~;. de los no portadores. La elevada frecuencia de falsos r~sultados positivos es discutida. Se aconseja no efectuar un diagnóstico inmunológico solamente con estas pruebas. La especificidad de la FC, BF. y HA fue de 56. 71, 84 º 0 respectivamente, y la inespecificidad de 14, 17. y 3 ºn. Con la HA se consiguieron los mejores resultados en sensibilidad, e inespecificidad, así como en el diagnóstico de la hidatidosis incipiente. Finalmente se discute y s~ confirma la importancia práctica que para el diagnóstico de la hidatidosis tiene la positividad de la HA, y, en sentido inverso, la negatividad de la IDR. INTRODUCCIÓN Este trabajo fue presentando "in exten· so para obtener el grado de Doctor de la Facultad de Medicina de la Universidad de Navarra. La tesis doctoral fue dirigida por el Dr. J. González Castro. El tribunal estuvo presidido por el Prof. F. Reinoso (Vicedecano ele la Facultad de Medicina). actuando como vocales el Prof. E. de la Figuera (Decano de la Facultad de Medicina ele Zaragoza), el Profesor J. Jiménez Vargas y el Prof. C. Olivares. Actuó como Ponente el Prof. E. Ortíz de Landázuri (Decano de la Facultad de Medicina). La calificación obtenida fue de Sobresaliente cum laude. (*) 2 El diagnóstico inmunológico de la hidatidosis se basa prácticamente, desde i 910, en la intradermorreacción de Casoni (IDR) y en la fijación de complemento (FC). En el último decenio se han observado elevados resultados falsamente positivos en la IDR 7. is. 19. 21. ·'º· 37. 38. 09. 11. 12. so. si. 53, y resultados falsamente negativos en la FC i. i. 1. s. 17. 23. 29. 3o. 36. 4o. 16. 17 . .is. 19. Ello ha servido como base para A. CHORO! 90 un estudio más profundo de estas técnicas, para su standardización y modificación, y para la elaboración de nuevas pruebas diagnósticas con el fin de resolver estos inconvenientes. Durante un período de 6 años hemos ido estudiando los métodos diagnósticos y elaborando nuevas técnicas 12 • 13 • 14 · 26 • 27 • Los métodos de inmunodifusión, el test de precipitina. la prueba cutánea y el latex, con los que no obtuvimos resultados satisfactorios en los estudios experimentales, debido a su poca sensibilidad y a su deficiente reproductibilidad, no se han incluído en este estudio de aplicación clínica. El objeto del presente trabajo es el estudio comparativo de la sensibilidad e inespecificidad de las reacciones clásicas de IDR. FC, de las modernas inmunorreacciones de bentonita floculación (BF) y hemaglutinación (HA) y la presencia de la cosinofilia (E). Con este fin, 420 individuos humanos fueron estudiados con estas pruebas, de los cuales 60 eran portadores de quiste hidatídico. También estábamos interesados en conocer las causas de falsas reacciones positivas ligadas a otros parásitos con posible comunidad en el mosaico antigénico. y en estudiar el comportamiento de las pruebas serológicas en casos incipientes de hidatidosis, donde el diagnóstico clínico y serológico encuentra mayores dificultades. Para ello, fueron incluídos en el estudio serológico 131 óvidos que posteriormente fueron examinados por autopsia minuciosa, estudiando las lesiones descubiertas por técnicas histopatológicas. De ellos 11 padecían hidatidosis incipiente. MATERIAL Y MÉTODOS Se utilizó como antígeno para todas las pruebas el líquido hidatídico (LH) de quistes fértiles de cerdo o de vaca. Se obtenía mediante punción aséptica, y se al- Vol. VI!l macenaba a -20° C., con adición de merthiolato a una concentración final de 1/50.000. Los LH empleados poseían de 5 a 8 mg % de proteínas por microkjeldahl. Los sueros eran extraídos de la sangre obtenida por punción aséptica en los casos humanos, y en el momento de sacrificio en los animales, y se almacenaban a -20° C., o a 4° C. en caso de previa liofilización. Los sueros animales pertenecían a 131 óvidos. En el examen necrópsico se inspeccionaban las cavidades y vísceras en busca de lesiones o parásitos, a simple vista y con lupa. Las no identificadas por este procedimiento eran estudiadas histológicamente mediante cortes teñidos con hematoxilina-eosina. El contenido intestinal, el de la vesícula biliar y el traqueobronquial se examinaban microscópicamente en busca de larvas y huevos. De los 131 animales estudiados, 28 no estaban parasitados, 11 tenían quiste hidatídico y 92 presentaban otras helmintiasis. Las especies parasitarias halladas fueron Ascaris Ovis (Ao), Coenurus cerebralis (Ce), Dicrocelium lanceolatum (Dl), Moniezia expansa (Me), Fasciola hepática (Fh), Cysticercus tenuicol/is (Ct), Trichiuris avis (To), larva de Echinococus granulos11s (QH), especies del orden Strongilata (S) y especies de Metastrongilus (M). De los 11 animales con quiste hidatídico, 3 tenían una hidatídosis pura ; tres asociada con Dl; dos asociada con M y tres con Dl y S. El diámetro de los QH variaba entre 0,5 y 5 cm. En 7 animales no sobrepasaba 1,5 cm. La mayoría de las hidatídosis eran incipientes a juzgar por el tamaño de los quistes y la edad de los animales. Los sueros humanos pertenecían a 420 individuos. De estos, 60 tenían hidatídosis comprobada de diversa localización (35 hepática, 17 pulmonar, 2 renal, 1 preesofágica, 1 torneo-vertebral, 2 hepática y pulmonar asociadas, 2 múltiple). Los otros .l1111iu ] 1)64 JJI \GNOSTl<:O IN\lllNOLO(;](:o DE L.\ HIDATllJOSIS 260 sueros pertenecientes a pacientes con otros procesos. Los inmunosueros se obtuvieron en conejos mediante la técnica de inmunización de Boyd 6 con diferentes antígenos. En tres lotes de conejos fueron utilizados como antígenos, extracto de membranas en LH con 1,6 gr. % de proteínas, extracto de membranas en suero fisiológico con 1 gr. y LH concentrado con 0,65 gr. % de proteínas respectivamente. Seis días después de la última inoculación se efectuaba una sangría a muerte. El suero obtenido era almacenado a -20° C., o a 4" C. si era previamente liofilizado. La E relativa de la fórmula sanguínea se determinaba simultaneamente con la extracción de la muestra de sangre para las reacciones serológicas. Las cifras de eosinófilos superiores al 4 % eran consideradas como eosinofilia. La IDR se efectuaba por la técnica habitual mediante inyección de 0,3 ml. de LH estéril en la región anterior del brazo izquierdo. Al mismo tiempo, 0,3 ml de suero salino estéril era inyectado intradérmicamente en el brazo derecho como control. El resultado de las reacciones se expresaba en anotaciones de 1 a 4 cruces en relación con el diámetro del habón. La FC se efectuaba siguiendo la técnica de Muttermilch modificada por Suárez Peregrin si. El LH se utilizaba sin diluir. Los lotes de antígeno que mostraban po- Yi der anticomplamentario eran desechados. La prueba de bentonita floculación y de hemaglutinación fueron efectuadas de acuerdo con las técnicas que anteriormente hemos descrito B. 26. RESULTADOS Los resultados de las diferentes pruebas en los pacientes humanos se exponen en la tabla l. Solamente 19 de los 46 pacientes con hidatídosis mostraron E. La frecuencia de E fue mayor en los pacientes con hidatídosis. La cifra media de eosinófilos por individuo fue de 5,7 en los hidatidósicos y de 3,7 en el resto de los pacientes. La IDR mostró un 86 % de pruebas positivas en los individuos con QH. Un 45 % de los pacientes sin hidatídosis mostró IDR positiva. Esta elevada inespecificidad contrastaba con la manifiesta especificidad. La HA evidenció la menor inespecificidad (1 %) de todas las pruebas, y junto con la IDR la mayor especificidad (65 %). Los títulos oscilaron de 1/25 a 1/25.000. Los enfermos con título de 1/25 eran portadores de un quiste hepático calcificado y de un quiste pulmonar de dos centímetros de diámetro. Los sueros con HA negativa fueron obtenidos de un paciente con quiste pulmonar a los TABLA I Resultados de las pruebas en pacientes humanos Pacientes con hidatidosis E IDR FC BF Número Casos + Sensibilidad Pacientes sin hidatidosis Nú;1nro Casos + Incspecificidad 46 45 51 49 14 19 39 32 35 12 41 86 62 71 85 2C12 119 285 145 113 77 29 54 45 48 16 37 25 2 E: Eosinofilia. IDR: Intradermorreacción. FC: Fijación de complemento. EF: Bentonita floculación. HA: H~maglutinación. HA 1 Vol. VIII .\. CHOHJJI dos días de extracción operatoria, y de otro paciente con quiste calcificado. El primero de estos dos sueros mostraba un título de 1/5. Sin embargo, el suero de otro enfermo con hidatidosis hepática no mostró disminución del título (1 /2.500) a los 15 días de la operación, y el suero de otro paciente con quiste hidatídico calcificado dio un título de 1/25.000. La E y la FC mostraron la más baja sensibilidad y la IDR la más alta inespecificidad en los casos humanos. Los resultados ele las diferentes pruebas en los óvidos se exponen en la Tabla II. TABLA H Resultados de las pruebas en óvidos FC Animales COIJ hidafülosis Número Casos + Sensibilidad Animales sin hidatidosis Número Casos + l nespecificicJad HA 11 ll 5 3 27 8 4 72 80 120 9 58 120 7 5 7 males sin parásitos. Los 9 animales con falsa positividad en la BF padecían diversos ti pos de parasitación. De los 7 animales con cestodiasis pura, dos dieron BF falsa positiva. Sin embargo, de 24 animales con parasitosis pura por nematodes, solamente uno mostró una reacción inespecífica. Ninguno de los 14 animales parasítados exclusivamente por trematodes presentaron falsas positividades. La HA acusó la mayor sensibilidad en detectar casos de hidatídosis. La reacción fue negativa en todos los animales sin parasitosis. Ct M S, Dl M S, DI Fh S, y Ao fueron los tipos de parasitación hallados en los 4 casos de falsos resultados positivos. El título de HA en estos casos fue de l /25. La inespecificidad y sensibilidad conjunta, en humanos y óvidos, de los métodos de diagnóstico inmunológico se representa esquemáticamente en la fig. 1. La I DR y HA evidenciaron una mayor frecuencia (86 y 84 %) de reacciones positivas en individuos con hidatídosis. Sin em- 4 6 0 La sensibilidad de la FC en la hidatídosis ovina principalmente en la incipiente, fue poco efectiva (27 '% ). De los J 20 animales sin hidatídosis, 28 estaban libres de parásitos. En ninguno de ellos se encontró una falsa reacción positiva. Los tipos de parasitación Ct DI M S, Ct DI M, DI M, M S, Dl, Ct, y M fueron hallados en los 7 casos ele reacción inespecífica. Ninguna reacción positiva se observó en los 6 animales con M, ni en los 9 óvidos con parasitismo puro por S, ni en Jos animales que albergaban solamente parásitos intestinales de una o varias especies. La sensibilidad de la BF en óvidos con hidatídosis, fue similar a la encontrada en humanos (Tabla I). Ninguna falsa reacción positiva se encontró en los 28 ani- Percento de Inespecificidad /o • Diferencia entre sensibilidad e inespecificidad 90 70 50 ~ 30 10 E Fig. J ,- IDR FC BF HA -Sensibilidad e inespecificidad de las pruebas en humanos y óvidos Junio 1964 DI \(;'WSTICO li'i\IU'<OLOGICO DE L 1 HllJ bargo, la inespecificidad de ambas reacciones fue muy diferente. Los resultados falsamente positivos en la IDR y HA fueron 45 % y 3 ~·~ respectivamente. La diferencia entre sensibilidad e inespecificidad en la E fue muy escasa. En la FC se observó que la sensibilidad era del 56 '/(, y que la diferencia entre esta y la inespecificidad era del 42 'X,. Este margen diferencial de utilidad fue mayor en la BF, con sensibilidad del 71 % y con inespecificidad del 17 %. La HA fue la reacción que mostró menos inespecificidad y mayor margen diferencial de utilidad entre sensibilidad e inespecificidad. DISCUSIÓN La presencia de eosinofilia en los casos de hidatidosis (41 %) fue superior a la presencia de la eosínofilia en los pacientes sin hidatidosis (29 %). La cifra media de eosinófilos por individuo también puso de relieve una mayor tendencia al aumento en los casos con hidatido,,is (5'7, 3'7). Sin embargo, el bajo porcentaje de la sensibilidad en casos hidatídicos y el elevado porcentaje de la sensibilidad en los casos no hidatídicos desvaloriza esta prueba como método para detectar un QH. Siempre se ha afirmado que la eosinofilia carece de valor patognomónico, y solo puede ser valorada junto con los otros síntomas y signos clínicos. Los autores que han estudiado la eosinofilia periférica en esta enfermedad encuentran unos porcentajes de 61 a 25 4 · 2 1. :is. 15 · 51 . La frecuencia de eosinofilia en sujetos no hidatidósicos es un hecho corriente y conocido. Puede ser debido a otras enfermedades parasitarias, alérgicas y tumorales. Sanicof 33 estudiando individuos normales, encuentra eosinofilia en un 27 % de ellos. La sensibilidad de la IDR fue aparentemente alta (86 %), teniendo en cuenta los porcentajes de toda reacción seroló- \TllHJSJ~ 9.'l gica o alérgica. Sin embargo, el alto porcentaje de inespecificidades (45 %) resta eficacia a la prueba. En la literatura los porcentajes de sensibilidad varían del 70 al l 00 % .\. 8. JO. 18. 19. 21. 25. 28. :12. 3:1. :14._ 36. SO. s:i. 5 ''. La mayor casuística es la de Giromini y Granati sobre 5.048 casos de hidatidosis. Estos autores encuentran una sensibilidad del 87 'Y,, similar a la encontrada en este trabajo. Los percentos de inespecificidad han sido menos estudiados. Varían del 3 al 44 % 9 · 11 • 21. so. si. La IDR ha gozado de gran difusión por la simplicidad de su ejecución y por la frecuencia de resultados positivos en sujetos afectos de OH. Pero el 45 'j,', de posibilidades de que resulte positiva la reacción sin la presencia de QH, demuestra su poco valor diagnóstico. Por ello no debe realizarse de manera exclusiva para el diagnóstico inmunológico de la hidatidosis. En individuos operados de hidatidosis no debe valorarse una IDR positiva. En un enfermo nuestro permaneció positiva durante 5 años, y en un individuo citado por Magath 36 hasta después de 15 años de la extracción del quiste. En áreas endémicas como en la que se efectuó la encuesta, donde la puesta en contacto con el antígeno es más frecuente, los individuos con falsas reacciones positivas son también más abundantes. Esto explicaría el elevado porcentaje de inespecificidad hallado. De todo ello se deduce que un test positivo indica solamente la existencia de una exposición previa, pero no significa con seguridad una infección activa y que la negatividad de la IDR tiene una mayor importancia práctica para poder desechar un diagnóstico de hidatidosis en el 86 % de los casos. Las sensibilidades de la FC, BF y HA en humanos fueron de 62, 71 y 85 % que están dentro de la utilidad de una prueba inmunológica. En la literatura se encuentran porcentajes de sensibilidad de ..\. CHORDI 94 Vol. VIII % 2. 3. 4. s. 11. 29_ 3o. 35, 4o. 46, 47, 48. 49. un 22 % de inespecificidad en esta re% para la BF, y acción. de 100 a 72 % 13. 21. 22. 21. 29. 31, con una Los altos porcentajes de inespecificimedia de 85 % para la HA. La amplia dad hallados en humanos con la FC y BF 100 a 28 ·'5, con una media de 80 variación en la sensibilidad de la FC en la literatura puede explicarse en parte por el número reducido de algunas casuísticas, las distintas térnícas utilizadas y las diversas calidades de antígenos empleados. Los porcentajes fueron más elevados cuando se usaron técnicas en las que el antígeno estaba estandardizado 52 o cuando se utilizaba como antígeno una fracción rica en propiedades antigénicas 10 . El estudio de la sensibilidad en los óvidos presentaba la peculiaridad de poder conocer el grado de sensibilidad en la hidatidosis incipiente. En todos los animales con hidatidosis, la cuantía y el tamaño de los quistes, y la edad de los animales, eran indicio de una reciente infestación. Por ello cabe esperar que el estudio de las reacciones en estos animales, nos permita determinar la prueba más sensible para el diagnóstico de la hidatidosis incipiente en óvidos, y, por lo tanto, también en humanos, lo que tendría un gran interés, ya que las hidatidosis incipientes son las más difíciles de diagnosticar clínica y serológicamente. La sensibilidad en óvidos mostró ser de 27, 72 y 80 % para la FC, BF y HA. Estos resultados coinciden con la ya conocida sensibilidad teórica de estas pruebas, y con la sensibilidad encontrada en humanos. La inespecificidad de la FC, BF y HA en humanos fue de 16, 25 y l %. Destaca el porcentaje tan benigno hallado en la HA. Esta cifra es de gran valor para una reacción serológica. En la literatura se encuentran porcentajes de inespecificidad de O a 22 % 1 · 5 · 23 · 29 · 4º· 30 para la FC, del 5 al 76 % 2 º· 26 · 43 para la BF y de O al 8 % 13. 2 1. 22 · 23 para la HA. El estudio más amplio sobre la FC ha sido el de Norman, Sadun y Allain 40 sobre 4. 700 sueros humanos. Estos autores encuentran motivaron el estudio de la inespecificidad en óvidos. Este estudio presentaba la ventaja de poder conocer la relación existente entre las inespecificidades obtenidas y las enfermedades parasitarias. Antes de enjuiciar los resultados en óvidos, hay que tener en cuenta que las positividades en enfermedades por parásitos taxonómicamente próximos, más que inespecificidades, suelen ser resultados específicos debidos a la comunidad antigénica existente entre dichos parásitos 7 is. 19. 38. 39. 41. 42. -13. 44. 5o. si. En los óvidos se encontraron 5, 7 y 6 % de inespecificidad en la FC, BF y HA, respectivamente. Contrasta la inespecificidad de las reacciones en óvidos con la divergencia hallada en humanos (16, 35 y 1). El diferente comportamiento en humanos y óvidos puede ser explicado por presentar las tres pruebas un grado semejante de inespecificidad (comunidad antigénica) en relación con la parasitación, pero diferente relación con otros procesos (neoplasias, infecciones, enfermedades degenerativas, etc.). La menor inespecificidad de la HA en humanos, con pocos casos de parasitismo, y la similar especificidad de la HA en óvidos, induce a pensar que la HA se muestra más específica en sus resultados. Las inespecificidades obtenidas mantienen relación con las parasitosis, y más aún con parásitos de grupo toxonómico próximo (Cestodes) es decir, con antígenos posiblemente comunes. La utilidad o intervalo de aprovechamiento de una prueba inmunológica viene dado por la diferencia entre su sensibilidad y su inespecificidad. En la fig. 1 se expuso el intervalo de aprovechamiento encontrado en este trabajo para las distintas pruebas. La sensibilidad, como se observó, fue mayor en la IDR y en la HA, constituyendo las dos pruebas que }u.nio lll.\G"iOSTICO IN'1liNOLOGJCO DE LA HIDATIDOSJS 1964 mostraron mayor frecuencia de reacciones positivas. Sin embargo, los resultados falsamente positivos fueron mucho más acusados en la IDR que en la HA. Esto sugiere que la sensibilidad elevada de la IDR fue debida a la elevada inespecificidad de la población sana. En cambio, la baja inespecificidad de la HA 95 (3 %) de valor patognomónico a los resultados positivos. En cambio, el pequeño intervalo de aprovechamiento de la eosinofilia e IDR, junto con la elevada inespecificidad de ambas, indica que estas reacciones solamente tienen un valor da orientación, pero no un valor diagnóstico. SUMMARY Study on the inmunologic diagnosis of hydatidic disease 420 human and 131 sheep were tested with eosinophile determination (E), intradermoreaction (lDR), complement fixation (HA), bentonite floculation (BF) and hemagglutination (HA) tests for hydatic disease. Results showed seventy human and eleven sheep had hydatid disease. The study in sheep was introduced in order to know the behaviour of these tests in the early stage of the hydatic and of other parasite disease. E and IDR showed positive results in 41 and 86 per cent respectively in patients afected with hydatidic disease and in 29 and 45 per ..:en t respectively in non afected persons. The large amount of false positive results is discussed. The exclusive use of these two methods for serodiagnostical work is not advisable. C F, B F, and HA tests showed 56, 71 and 84 per cent respectively of specific results and 14, 17 and 3 per cent respectively of nonspecific positive results. The HA test showed better results in the dianosis of early hydatidic disease stage and in the presence of the specific reactivity. Finally de practica] use of l D R negative results and of the HA positive refülts are discussed. BIBLIOGRAFÍA l. ALES, J. M. y E. ARJONA. Rev. Clín. Esp. 10. 50: 5, 1953. 2. 3. 4. 5. 6. CASORZO, l., Arch. Soc. Cir. Chile. l: 4, 1949. APATHIE y LORENTZ. Sem. Med. 15 Oct. 1908. Citado por MoRELLINI, M y L. PERRI. Minerva Med. 51: 2433, 1960. BENSTED, H. I. y J. D. ATKINSON. Lancet. 11. 12. CuLBERTSON, J. T. y H. U. RosE. J. Clin. In vestg. 20: 249, 1941. CHORDI, A. y J. GoNZÁLEZ CASTRO, Rev. Med. E. G. Navarra. 5: 74, 1961. 1: 265, 1953. 13. BocCHET!, G. Arch. !tal. Se. Med. Trap. Parass. 32: 165, 1951. BoccHETI, G. y R. BEGANI. Nuovi Ann. Jg. Microb. 3: 234, 1952. BOYD, E. C. Fundamentals of lnmunolo- CHORDI, A., J. GoNzÁLEz CASTRO, J. ToRMo y R. DÍAz. Rev. Med. E. G. Navarre.. 14. CHORDJ, A., J. ÜONZÁLEZ CASTRO y J. TORMO. Rev. lber. Parasit. 22: 285, 1962. CHUNG, Nucr-LAN, T'UNG, TSUN, Rev. 6: 27, 1962. 15. gy. 3.ª Ed. Interscience Publishers. Lon- Soc. Tro. Med. Hyg. 32: 697, 1939. 16. 7. dres, 1956. BRISOU, J. Bull. Soc. Path. Exot. 39: 193, 1946. 8. CASONI, T. Folia Clin. Chi111. et Micro. 17. 18. DEVE, F. L' echinococcossi primitiva, Masson. París, 1951. ECKESTEJN, K. Lance!. 2: 377, 1910. FAJRLEY, K. D. Med. J. Australia. 2: '/.7, 9. CASONI, T. 19. FAIRLEY, M. 4: 5, 1911. 1941. 1923. Arch. lntem. Hidat. 5: 7, H. y F. E. W!LLIAMS. J. Ausl. 11: 20, 1929. 96 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. Vol. fillí \_ Ci-IORlll FISCHMAN, A. J. C/in. Path. 13: 72, 1959. G ARABEDIAN, A. A., C. M. M ALAKIAN y A. H. MATOSSIAN. Ann. Trop. Med. Par- sit. 54: 233, 1960. GARABEDIAN, G. A., A. H. MATOSSIAN y F. B. DJANIA. J. lmmuno/. 78: 269, 1957. ÜARABEDIAN, G. A., A. H. MATOSSIAN y F. G. SuIDAN. Am. Trop. J. Med. Hyg. 8: 67, 1959. GIROLANI, M. Arch. /t. Se. Med. Trop. Paras. 34: 89, 1953. GIROMINI, M. y A. GRANATI. Folia Med. 27: 746, 1954. GoNzÁLEZ CASTRO. J. y A. CHORDI. Rev. Med. E. G. Navarra. 4: 45, 1960. GONZÁLEZ CASTRO, J. y A. CHORDI. Rev. Med. E. G. Navarra. 5: 19, 1961. JoLLY, A. Maroc. Med. 37: 773, 1958. KAGAN, I. G., D. S. ALLAIN y L. NoRMAN. Am. Trop. Med. Hyg. 9: 248, 1960. KNIERIM, F. Bol. Chil. Parasit. 14: 75, 1959. KNIERIM, F., Bol. Chil. Parasit. 16: 6, 1961. LASS, N. y G. NITZANI. Harefuah. 51. (9), 205-209. En Hebrew English suman· pp. 208-9, 1956. LEMAIRE. Encvc/opop. Med. Chir. Paris. 1956. LURIDIANA, P. P/oc/ínico (Sez-Prat). 28: 41, 1921. MAKIE, T. T., G. w. HUNTER y c. B. WORTH. Manual de Medicina Tropical. l.ª Ed. México. Prensa Médica Mexicana. Pág. 522. 1956. MAGATH, T. B. M. C/in. North. América. 5: 549, 1921. MARTÍ, G. F. y A. PICCIOCHI. Po/ic!ínico !Sez. Chirug.) 34. 12: 17, 1959. 38. MEYER, K. lnmunit. li. exper. Therap. 9: 530, 1911. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 5l. 52. 53. 54. 55. 56. MORENAS, L. Compt. Rend. Soc. Biol. 110: 321, 1932. NORMAN, L.. E. H. SADUN y D. S. ALLAIN. Am. J. Trop. Med. Hrg. 8· 46. '' 1959. NúÑEZ, J. 0. y M. C. LÓPEZ. A 111. M ed 33: 16, 1933. CUTEIRINO, J. Ann. Med. 38: 493, 1935. PAUTRIZEL, R. Bu//. Soc. Pharm. Bordiaux. 86: 46, 1948. PAUTRIZEI, R. y C. SARREAU. Comp. Rend. Soc. Biol. 141: 1061, 1947. PETUKHOV. M. l. Sovetskava Meditsina. 22: 120, !958. PINELLI. Sasari. 1932. PIROSKY, I., R. R. PIROSKY y S. Y ALOV. Rev. lnst. Bact. Malhrau. 14: 287. 1949. PuNTONI, V. Soc. Mal. Chir. Bolog11e, 1911. PuTLO, F. Rif. Mee/. 7: 8. 1901. RosAs CosTA, G. A. Arch. /111. Hidatid. [3: 259, 1953. RosE, H. M. y J. T. CuLBERTSON. JAMA. 115: 594, 1940. Ru1z DEL RINCÓN. E. G. y J. GoNZÁLEZ CASTRO. Rev. !ber. Parasito/. 18: 129, 1958. SANNIKOV, Y. l. Meditz. Parasit. Parasit. Bolezni 30: 173, 1961. SuÁREZ PEREGRIN, E. Manual técnico de análisis Clínicos. 5." Ed. Prieto. Granada. WEINBERG, M. Compt. Rend. Soc. Biol. 66: 133, !909. ZoRIKHINA, V. I. Meditz. Parasit. Parasit. Bolezni. 30: 86, 1961.