Lab 3 Enzimología II Bioq Tec 2013

PRACTICO Nº 3
ENZIMOLOGÍA II
I. - INTRODUCCIÓN
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Para definir la actividad de una preparación enzimática se utiliza en la práctica distintas
expresiones. La cantidad de enzima se indica habitualmente en unidad de actividad enzimática (U).
Se define la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de un micromol de sustrato por minuto (μmol/min), bajo condiciones óptimas de
temperatura y pH. Normalmente, las unidades de actividad que contiene una solución se suele
expresar en función del volumen de la misma, en U/mL de solución o referida a la cantidad de
proteína presente en la solución, expresada en U/mg de proteína. En este último caso, la actividad
enzimática se denomina Actividad específica.
Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad
enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad
se llama katal (kat). Como 1 mol son 1x106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal
equivale a 60x106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los
submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).
La actividad de una enzima puede determinarse midiendo la cantidad de producto formando
(o de sustrato consumido) por unidad de tiempo. De esta manera existen distintos factores que
pueden modificar la actividad enzimática. Los factores que modifican la actividad enzimática, entre
otros, son:
1.2.3.4.5.-
Concentración de enzima
Concentración de sustrato
Temperatura
pH
Inhibidores
A continuación se detalla el efecto de cada uno de los factores mencionados anteriormente.
1.- Concentración de enzima
Cuando se determina la velocidad inicial de una reacción
catalizada por una enzima a distintas concentraciones de ésta, en
presencia de concentraciones saturantes de sustrato y
manteniendo constante los otros factores ambientales
(temperatura y pH) se puede establecer la relación entre cantidad
de enzima y actividad.
Cuanto mayor cantidad de enzima este presente, mayor
será la velocidad que se alcanzará, debido a que necesito más
cantidad de sustrato para alcanzar la saturación.
La velocidad de la reacción es directamente proporcional
a la concentración de la enzima a cualquier concentración de
sustrato. Por ejemplo, si la concentración de enzima es
disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reacción es
reducida también a la mitad de la original.
2.- Concentración de sustrato
A medida que aumenta la cantidad de sustrato la velocidad
aumenta en forma lineal (zona proporcional), luego si bien la
velocidad continúa aumentando ya no lo hace en forma lineal (zona
mixta) hasta que finalmente la reacción alcanza una velocidad
máxima que es constante, se vuelve independiente de la cantidad de
sustrato (zona de saturación). Esto ocurre debido a que los sitios
activos de las enzimas se encuentran todos interactuando con las
moléculas de sustrato, por lo tanto hasta que no finalice la reacción la
enzima no puede unirse a otro sustrato.
La cinética enzimática comienza a inicios del 1900 con la derivación de la Ecuación de
Michaelis-Menten, la que describe la relación entre la velocidad de la reacción y la concentración
de sustrato:
k1
E
+
S
k3
ES
E +
P
k2
Se asume que la constante de velocidad de la reacción inversa para k3 es insignificante y
que lo importante son los valores de velocidad inicial. Cuando estamos en velocidad inicial, la
cantidad de P es despreciable y, por lo tanto, la reacción inversa, E + P
ES, es también
despreciable. Las constantes de velocidad se combinan dando la siguiente constante:
Km =
k2 + k3
k1
Donde k1, k2 y k3 son constantes de velocidad
La velocidad de la reacción queda definida por la siguiente ecuación:
Donde
V =
[S ] V max
[S ] + Km
V = velocidad de la reacción
Vmax = velocidad máxima
[S] = concentración de sustrato
Km= constante de Michaelis-Menten
Km es un parámetro cinético muy importante al momento de determinar la actividad de
una enzima, ya que indica el grado de afinidad de la enzima por un sustrato. El valor de Km es
inversamente proporcional a la fuerza de unión entre la enzima y el sustrato. Un valor alto de Km,
indica baja afinidad de la enzima por el sustrato y un valor bajo, una alta afinidad.
Gráfico de Velocidad de Reacción versus Concentración de sustrato (V / [S])
La magnitud de Km es un valor característico para la combinación de cada enzima con su
sustrato. Al graficar V / [S] se tendrá:
V
V max
V max
----------2
Km
[S]
De este gráfico se desprende que la Km corresponde a la concentración de sustrato a la que
se obtiene la mitad de la velocidad máxima.
Además se pueden distinguir dos fases en la reacción.
•
•
Una primera fase, en que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la
concentración de sustrato, es decir, es de orden uno. Esto ocurre a bajas concentraciones
de sustrato, por lo que la enzima no está saturada de sustrato, de manera que si
aumentamos la concentración de sustrato, la velocidad aumenta.
En la segunda fase, la velocidad de la reacción se vuelve independiente de la
concentración de sustrato, es decir, es de orden cero. Esto ocurre cuando la enzima es
saturada por el sustrato, de manera que aunque aumentemos la concentración de
sustrato, la velocidad se mantiene constante.
Al tipo de curva obtenido por este gráfico se le llama hipérbola rectangular. Como no es una
representación lineal, es difícil trabajar con ella y obtener algunos datos. Lineaweaver-Burk,
proponen un tipo de gráfico que considera los inversos de la velocidad (1/V) y de la concentración
de sustrato (1/[S]), obteniéndose el siguiente tipo de gráfico
La pendiente de la
Recta es igual a
Km / Vmax
1
V
1
V max
−1
Km
1
S
A este gráfico, también se le conoce como de Dobles Recíprocos.
3.- Temperatura
Un aumento en la temperatura provoca un aumento de
la velocidad de reacción hasta cierta temperatura, la
temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, el
aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es
contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la
desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece
rápidamente hasta anularse. Las enzimas de muchos mamíferos
tienen una temperatura óptima de 37°C, por encima de esa
temperatura comienzan a inactivarse y se destruyen. Sin
embargo existen especies de bacterias y algas que habitan en
fuentes de aguas termales y en el otro extremo ciertas bacterias
árticas tienen temperaturas óptimas cercanas a 0°C.
4.- pH
Las graficas muestran que a pH extremos
las proteínas se desnaturalizan, por lo tanto la
actividad biológica decae. Algunas enzimas no
varían su actividad con el pH sino que esta se
mantiene constante en un amplio rango. Otra
tendrá el pH óptimo ácido o básico teniendo en
cuenta el medio en donde actúan.
5.- Inhibidores
Muchos tipos diferentes de moléculas inhiben las enzimas, y actúan de diversas formas.
Estos inhibidores pueden provocar una inhibición irreversible o una inhibición reversible.
¾ Inhibidores irreversibles: estos inhibidores se enlazan con fuerza a la enzima, se unen
COVALENTEMENTE a algún aminoácido del sitio activo. Producen cambios permanentes en
la molécula de enzima, con deterioro definitivo de su capacidad catalítica. (Ejemplos, son los
compuestos organofosforados utilizados como insecticidas, el alopurinol un inhibidor utilizado
en el tratamiento de la Gota, etc).
¾ Inhibidores reversibles: Los diversos modos de inhibición reversible implican todos ellos la
unión NO COVALENTE de un inhibidor a la enzima, pero difieren en los mecanismos por
medio de los cuales reducen la actividad enzimática y en la forma en que afectan la cinética de
la reacción. Dentro de este grupo encontramos los inhibidores competitivos, no competitivos y
incompetitivos. Sin embargo, los tipos de inhibición más frecuentes son la competitiva y la no
competitiva.
o Los inhibidores competitivos compiten con el sustrato por el sitio activo de la
enzima, y si aumentamos la cantidad de sustrato, el efecto inhibidor se revierte
alcanzándose la velocidad máxima.
o Los inhibidores no competitivos se enlazan a un sitio distinto del sitio activo, de
manera que el inhibidor se puede unir a la enzima libre o bien al complejo enzima
sustrato, pero en ninguno de los casos obtendremos productos. El efecto de estos
inhibidores no se revierte por el agregado de mayor cantidad de sustrato, de
manera que se llega a una velocidad máxima menor que si no tuviera el inhibidor.
o Los inhibidor incompetitivo se fijan a un sitio distinto al del sustrato, con la
diferencia que solamente se fija al complejo enzima-sustrato.
No es raro observar algunos inhibidores a los cuales no se les puede comprobar el
mecanismo exacto de inhibición, siendo en algunos casos un tipo de inhibición mixta.
II.- PARTE EXPERIMENTAL
1. Material de estudio
Entre las enzimas que se han conocido desde muy antiguo, se encuentran aquellas que
hidrolizan la sacarosa. En 1860, Berthelot purificó una enzima procedente de la levadura y que
hidrolizaba la sacarosa, La llamó Ferment inversif. Más recientemente se le ha llamado:
invertasa, sucrasa, sacarasa y O-fructofuranosidasa.
El sustrato de esta enzima es la sacarosa y se obtiene como productos, glucosa y fructosa.
En esta sesión experimental, se usará el procedimiento de análisis a tiempo fijo, que consiste
en detener la reacción usando el reactivo 3,5-DNS (ácido 3,5-dínitrosalicílíco) y medir el poder
reductor de los productos.
Influencia de la concentración de Sacarosa sobre la
Velocidad de la Reacción.
Objetivo:
Determinar el efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de una reacción enzimática.
Procedimiento:
1) Desarrolle el siguiente protocolo:
Reactivos
Buffer Acetato 0,1 M pH 4,7
Sacarosa 0,05 M
Sacarosa 0,10 M
Sacarosa 0,20M
Sacarosa 0,30 M
Sacarosa 0,50 M
Invertasa
2)
3)
4)
5)
6)
7)
1
2
3
4
5
Blanco
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
2 mL
1 mL
Incube por 5 minutos a temperatura ambiente.
Adicione 2 mL de 3,5 – DNS a cada uno de los tubos.
Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño termorregulado a 100ºC.
Enfríe los tubos.
Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo
utilizando el tubo “blanco”
Mida las absorbancias de los otros tubos ( del 1 al 5) y anote las lecturas en la siguiente tabla:
1
Absorbancia
2
3
4
5
Con los datos anteriores, extrapole los valores de Absorbancia en la curva de calibración
(práctico N°2), para obtener la cantidad de producto y complete la siguiente tabla:
8)
1
2
3
4
5
Producto
(µmol)
9) Determine la velocidad de reacción (V=Producto/5) y la cantidad de sustrato para completar la
siguiente tabla.
1
2
3
4
5
Cantidad de Sustrato (sacarosa)
(μmol)
Producto / 5 = Velocidad
10) Complete la siguiente tabla y confeccione un gráfico de 1/S
Lineweaver – Burk )
1
2
3
4
versus 1/V, (gráfico de
5
1 / Sustrato
1 / Velocidad
11)
A partir del gráfico anterior determine los valores de la Km y la Vmáx.
Efecto de la Temperatura sobre la Actividad
enzimática.
Objetivo:
Determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la Invertasa.
Procedimiento:
1) Desarrolle el siguiente protocolo:
TUBOS
Reactivos
Buffer Acetato 0,1 M
pH 4,7
Sacarosa
0,6 M
Invertasa
1
1e
2
2e
3
3e
1 mL
2 mL
1 mL
2 mL
1 mL
2 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
-
1 mL
-
1 mL
-
Temperatura de
Incubación (5 minutos)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
3ºC
Ambiente
99ºC
Registre la temperatura ambiente con un termómetro.
Adicione 2 mL de 3,5-DNS a cada uno de los tubos.
Desarrolle color calentando durante 5 minutos en baño termorregulado a 100ºC.
Enfríe los tubos.
Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo
utilizando el tubo “blanco” ( tubo 1e)
Mida la absorbancia del tubo 1y anote las lecturas en la siguiente tabla.
Repita el procedimiento 6) y 7) para las otras temperaturas
Anote las lecturas en la siguiente tabla.
1
Absorbancia
00000
2
3
00000
10) Con los datos anteriores, extrapole los valores de Absorbancia de la curva de calibración
(práctico N°2) para obtener la cantidad de producto y complete la siguiente tabla:
Temperatura
3ºC
Ambiente
Producto (µmol)
11) Grafique temperatura versus Producto
12) Determine el efecto de la temperatura sobre la actividad de la Invertasa
99ºC