libro de resúmenes

MICOLOGÍA
LIBRO DE RESÚMENES
20, 21 Y 22 DE JUNIO 2016
LLEIDA
Índice
Bienvenida................................................................................................................................... 5
Comités......................................................................................................................................... 7
Patrocinadores............................................................................................................................8
Conferencias................................................................................................................................9
Comunicaciones orales
Sesión I.................................................................................................................................. 19
Sesión II................................................................................................................................. 27
Sesión III............................................................................................................................... 33
Sesión IV...............................................................................................................................39
Sesión V................................................................................................................................44
Mesas Redondas paralelas
Micología Molecular.......................................................................................................... 53
Micología y Biotecnología...............................................................................................59
Micología Clínica I............................................................................................................. 66
Micología Clínica 2..............................................................................................................71
Pósteres......................................................................................................................................76
Índice de autores.....................................................................................................................153
Presentación
Apreciados compañeros y colegas:
Es un honor y una enorme satisfacción el poder anunciaros que el 13 Congreso Nacional de Micología se celebrará en Lleida el próximo año 2016 durante los días 20, 21
y 22 de Junio. El Auditori del Centre de Cultures i Cooperació Transfronterera situado
en el campus universitario de Cappont será la Sede del Congreso. Este edificio está
emplazado en uno de los márgenes del rio Segre desde donde se puede observar la
emblemática Catedral de Lleida, la Seu Vella, motivo de nuestro logo.
Así como en pasados encuentros, esperamos que esta ocasión reúna a gran número de científicos de todas las edades y de todo el entorno geográfico español para
poder compartir sus experiencias en el ámbito de la microbiología y convertir el
evento en un gran foro de discusión cordial que favorezca el intercambio y enriquecimiento científico de todos, siendo la Micología el denominador común.
Lleida es una ciudad acogedora y amable, rica en historia y tradiciones y con una
interesante cultura gastronómica que hará las delicias de muchos de vosotros. La
provincia de Lleida posee una gran belleza paisajística para los amantes de la naturaleza que merece la pena explorar si tenéis la ocasión de hacerlo, además la localización geográfica de Lleida permite un acceso relativamente sencillo por carretera
y transporte. De este modo, y además por supuesto del ámbito científico, confiamos
en que disfrutéis en gran medida de todos los aspectos monumentales, geográficos
y gastronómicos que esta tierra os puede ofrecer.
En esta ocasión, hemos realizado unos pequeños cambios con objeto de propiciar
la mayor participación posible, especialmente la de los jóvenes investigadores pre
o posdoctorales. Por este motivo observaréis una considerable reducción en el número de conferencias plenarias ya que hemos tratado de distribuir los tiempos para
dar cabida al mayor número posible de comunicaciones orales de corta extensión.
Tanto el Grupo Especializado de Hongos Filamentosos y Levaduras (GEHFL) como la
Asociación Española de Micología (AEM) participaran en la selección de las comunicaciones orales cuyas sesiones serán conjuntas en la presente edición, a excepción
de la tarde del día 21 que se dedicará a 4 mesas redondas simultáneas. Las ponencias
y las presentaciones de las mesas redondas serán seleccionadas por los miembros
de la Comisión Investigadora entre los resúmenes recibidos.
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Agradezco sinceramente a la Sociedad Española de Microbiología y al Grupo Especializado de Hongos Filamentosos y Levaduras de la SEM (con especial mención a su
presidente Humberto Martín y los miembros de la Junta Directiva) el haberme confiado encabezar la organización de este evento. A la Sociedad Española de Micología
(en especial a su presidente el Dr Guillermo Quindós) por su enorme ayuda y colaboración durante todo el proceso organizativo. Y por supuesto a la Universitat de
Lleida por facilitarnos toda la infraestructura y personal necesarios para el correcto
desarrollo del Congreso así como al Ajuntament y Diputació de Lleida y a todas las
entidades colaboradoras que de alguna manera han demostrado su apoyo e interés.
Quiero dedicar una mención especial a todos los colegas del Comité Organizador
que con su esfuerzo desinteresado están trabajando para que este Congreso sea del
agrado de todos vosotros.
Los miembros del Comité Organizador y yo os damos las gracias por vuestra presencia y ¡nuestra más sincera bienvenida a Lleida!
Mª Angeles de la Torre
Presidenta del 13 Congreso Nacional de Micología
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Comité Organizador
Presidenta:
Mª Angeles de la Torre-Ruiz (CMB-IRBLleida, UdL)
Vice-presidentas:
Gemma Bellí, Neus Colomina y Nuria Pujol (CMB-IRBLleida, UdL)
Vocales
Jesús Aramburu Microbiología y Parasitología, HUArnau de Vilanova
Ares Barbero CMB-IRBLleida, UdL
Elisa Cabiscol CMB-IRBLleida, UdL
Josep Manel Casanova Dermatología, HUArnau de Vilanova
Celia Casas CMB-IRBLleida, UdL
Francisco Ferrezuelo CMB-IRBLleida, UdL
Mercè García Microbiología y Parasitología, HUArnau de Vilanova
Mercedes Palomar Medicina Intensiva, HUArnau de Vilanova
Antonio Ramos ETSEA, UdL
Joaquim Ros CMB-IRBLleida, UdL
Jordi Tamarit CMB-IRBLleida, UdL
Jordi Torres CMB-IRBLleida, UdL
Mónica Adriana Mechoud CMB-IRBLleida, UdL
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Comité Científico
Martí Aldea (IBMB-CSIC), Barcelona
José Cansado Universidad de Murcia, Murcia
Francisca Colom Universidad Miguel Hernández, Alicante
Manuel Cuenca Instituto Carlos III, Madrid
Elena Eraso Universidad del País Vasco, Bilbao
Eduardo Espeso (CIB-CSIC), Madrid
Antonio di Pietro Universidad de Córdoba, Córdoba
Enrique Herrero Universitat de Lleida, Lleida
Humberto Martín Universidad Complutense de Madrid, Madrid
Mª Jesús Martínez (CIB-CSIC), Madrid
Javier Pemán Hospital La Fe, Valencia
José Pérez Universidad de Salamanca, Salamanca
Amparo Querol (IATA-CSIC), Valencia
Guillermo Quindós, Universidad del País Vasco, Bilbao
María José Linares Universidad de Córdoba, Córdoba
Emilio Mayayo Universitat Rovira i Virgili, Tarragona
Belén Patiño Universidad Complutense de Madrid
Ferran Sánchez Hospital Sant Pau, Barcelona
Vicente Sanchis Universitat de Lleida, Lleida
Antonio Ventosa Universidad de Sevilla, Sevilla
Rafael Zaragoza Hospital Dr. Pesset, Valencia
PATROCINADORES
Sociedad Española de Microbiología (SEM)
Grupo Especializado en Levaduras y Hongos Filamentosos de la SEM
Asociación Española de Micología (AEM)
Universitat de Lleida (UdL) Vicerectorat d’Activitats Culturals i Projecció Universitaria
Institut de Recerca Biomèdica de Lleida (IRBLleida)
Societat Catalana de Biologia (SCB)
Ajuntament de Lleida
Diputació de Lleida
Pearson
McGrawHill Education
Fisher Scientific España
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CONFERENCIAS
CONFERENCIA INAUGURAL
Las levaduras como modelo para el estudio de las respuestas celulares frente al estrés
oxidativo
Enrique Herrero
Departamento de Ciencias Médicas Básicas,
Universidad de Lleida/IRBLleida
El metabolismo aerobio implica la generación de especies reactivas de oxígeno capaces de
dañar diversos tipos de macromoléculas celulares, entre ellas las proteínas. En consecuencia,
los organismos aerobios han generado mecanismos enzimáticos por un lado pare eliminar
tales especies reactivas y por otro para reparar los daños generados por ellas. En las proteínas
los grupos sulfhidrilo son especialmente sensibles a la oxidación, con la consiguiente
formación de derivados algunos de los cuales no son reparables, resultando en la inactivación
de las moléculas proteicas. El tripéptido glutatión juega un papel central en las respuestas
frente al daño oxidativo, tanto en aquellas respuestas que resultan en la destoxificación
de las especies reactivas de oxígeno (peroxidasas dependientes glutatión) como en las
implicadas en la reparación del daño proteico (glutatión transferasas y glutaredoxinas).
Además, la glutationilación reversible de proteínas es una modificación post-traduccional
de éstas que las protege frente a potenciales daños irreversibles, además de poder modificar
su actividad funcional. Las glutaredoxinas, mediante su capacidad de interaccionar a nivel
de su centro activo con moléculas de glutatión, han sido consideradas convencionalmente
como enzimas reguladoras del estado redox de los grupos sulfhidrilo. Un amplio número
de estudios en la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae han indicado que este es el
caso de las así llamadas glutaredoxinas ditiólicas. Así, nuestro grupo ha demostrado su
papel protector frente a concentraciones tóxicas de selenio, un oligoelemento necesario en
humanos a bajas dosis pero que a elevadas dosis genera la formación de las citadas especies
reactivas de oxígeno y daño en ácidos nucleicos y proteínas. En cambio, existe otra subfamilia
de glutaredoxinas denominadas monotiólicas con funciones relacionadas con la formación
de centros hierro-azufre en mitocondrias o con la determinación del estatus intracelular de
los niveles de hierro y la consiguiente respuesta fisiológica. Tales funciones se han dilucidado
inicialmente también en levaduras y con posterioridad se ha demostrado su conservación
evolutiva, lo que ha ayudado a la comprensión de diversas patologías humanas. En cuanto
a las glutatión tranferasas, se trata de de una familia estructural y enzimáticamente muy
compleja, alguna de cuyas subfamilias se solapa bioquímicamente con las glutaredoxinas y
cuyos miembros desempeñan un papel importante en la respuesta frente a estrés oxidativo.
Este es el caso, por ejemplo, de las glutatión transferasas del tipo omega, también conservadas
evolutivamente, y que en células de Candida albicans experimentan un aumento drástico en
sus niveles en respuesta a la fagocitosis.
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CONFERENCIA INVITADA
¿Las micosis invasoras siguen siendo clínicamente relevantes? Debate Pros-Contras
Javier Pemán, Servicio de Microbiología, Hospital Universitario y Policlínico La Fe, Valencia:
peman_jav@gva.es
Guillermo Quindós, UFI 11/25 Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología,
Facultad de Medicina y Enfermería, Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Bilbao: guillermo.
quindos@ehu.eus
Los avances sociales, médicos y quirúrgicos han conseguido incrementar la esperanza de vida
y mejorar su calidad, pero comportan el excesivo arancel de un aumento del número de personas en riesgo de sufrir una micosis, sobre todo invasora. Las infecciones por levaduras y las
dermatofitosis son las micosis más frecuentes. El género que más casos de micosis superficiales e invasoras provoca en el ser humano es Candida, aunque otras levaduras también
tienen importancia en poblaciones más concretas de pacientes, en general con inmunodeficiencias o enfermedades subyacentes graves.
Se estima que la incidencia anual de las micosis invasoras más comunes, por cada millón de habitantes, es de 20-200 casos de candidiasis invasoras, 20-60 criptococosis meníngeas o diseminadas, y 10-30 aspergilosis invasoras. Una importante característica de las micosis invasoras es la
gravedad de sus cuadros clínicos a pesar de los avances diagnósticos y terapéuticos de las últimas
décadas. La mortalidad atribuida a las micosis invasoras es muy elevada, entre el 30% en las candidiasis invasoras, más del 50% en la aspergilosis invasora y el 90-100% en algunos cuadros de
mucormicosis o de escedosporiasis. La mayor mortalidad se observa en los enfermos con inmunodeficiencias o que están hospitalizados por enfermedades subyacentes graves. Entre los que
están en mayor peligro se encuentran los niños prematuros o recién nacidos de bajo peso por su
inmadurez inmunitaria, los ancianos que van desarrollando un proceso de inmunosenescencia,
los enfermos crónicos y los sometidos a cirugía mayor (especialmente de aparato digestivo), los
receptores de trasplante de progenitores hematopoyéticos o de órgano sólido, y los pacientes con
cualquier clase de inmunodeficiencia. La gran complejidad de los pacientes que presentan riesgos
importantes de sufrir una micosis invasora y la creciente diversidad de los hongos que pueden
causarlas suponen un importante reto para su diagnóstico y un gran desafío terapéutico.
En esta presentación queremos contrastar la relevancia clínica de las micosis invasoras con
otras infecciones graves causadas por bacterias, virus o protozoos. De hecho, considerando
como un referente las infecciones sistémicas cuyo diagnóstico en el laboratorio se basa todavía principalmente en el hemocultivo, muestra como Staphylococcus, Enterococcus, la familia
Enterobacteriaceae y otros bacilos gramnegativos preceden en frecuencia a Candida y otros
hongos. Pretendemos abordar la situación en diferentes escenarios que incluyen a diferentes
grupos de pacientes que tienen un mayor riesgo de padecer micosis invasoras graves, como
son niños y neonatos, los pacientes ingresados por enfermedades oncohematológicas, diabetes, los receptores de trasplantes de órganos sólidos o los que padecen cuadros respiratorios
crónicos como la EPOC o la fibrosis quística. Otro importante grupo de pacientes son los que
se engloban dentro de la categoría médica de pacientes críticos por diferentes circunstancias
como grandes quemaduras, cirugía abdominal intensa, politraumatismos, etc.
La importancia de las infecciones por etiologías diferentes a la fúngica, en muchas ocasiones precede e incluso predispone con el tratamiento utilizada para su curación a infecciones fúngicas, y
su conocimiento puede ser clave para la sospecha y diagnostico de las micosis invasoras en pacientes con graves enfermedades subyacentes que predisponen al padecimiento de infecciones.
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CONFERENCIA INVITADA
A-TRAPP-ados por el Golgi
Miguel A. Peñalva
Departamento de Biología Molecular y Celular del CSIC Centro de Investigaciones Biológicas,
Ramiro de Maeztu 9, Madrid 28040, España.
Pocos experimentos han tenido tanta influencia en biología celular como el cribado genético
de Schekman y colaboradores con la levadura Saccharomyces cerevisiae, el cual sirvió para establecer las bases moleculares de la secreción de proteínas en eucariotas. Pese a ello, la levadura
presenta el gran inconveniente de que no usa los microtúbulos (MTs) para el tráfico intracelular. Por el contrario los hongos filamentosos utilizan los motores dependientes de MTs para
el transporte de endosomas y ‘carriers’ exocíticos a larga distancia, y mantienen una ruta de
exocitosis permanentemente dirigida hacia el ápice de crecimiento. Resumiré los esfuerzos de
mi laboratorio para caracterizar los pasos finales de la exocitosis en Aspergillus nidulans: cómo
las cisternas del Golgi tardías (TGN) cambian su composición, perdiendo gradualmente identidad de Golgi para adquirir identidad post-Golgi, proceso que hemos conseguido documentar
por vez primera usando el reportero GFP-RabERAB11. Mediante análisis genéticos y bioquímicos
hemos demostrado que este paso es regulado por Trs120, un componente de la GEF oligomérica
TRAPPII, que activa, y por tanto recluta, RabERAB11 al TGN. La adquisición de identidad post-Golgi
trae asociado el transporte de esos dominios exocíticos de membrana al ápice. Estos ‘carriers’
exocíticos están cargados con kinesina-1, dineína y miosina-5, y se mueven en la red de MTs
como si se trataran de maletas en una cinta transportadora de recogida de equipajes. Esta cinta
los cede a filamentos de actina para enfocar la etapa final de su transporte al ápice.
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CONFERENCIA INVITADA
Candidiasis invasora: enigmas etiológicos, diagnósticos y terapéuticos
Ferran Sánchez-Reus 1,2
Servicio de Microbiología, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona, España; 2Departamento de Genética y Microbiología, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra (Barcelona),
España.fsanchezr@santpau.cat
1
Aunque Candida puede formar parte de la microbiota normal de las mucosas humanas y se
estima que entre el 25 y el 40% de la población está colonizada por diferentes especies de
Candida, este hongo es, en frecuencia, el primer agente causal de infección fúngica inavasiva
(IFI) y, en algunos países, el cuarto agente de bacteriemia, con una mortalidad atribuible que
puede alcanzar el 40%, incluso con tratamiento antifúngico adecuado.
De todos modos, la incidencia de IFI en individuos sanos es excepcional y, cuando ocurre, es
probablemente a resultas de una alteración genética que comporta un defecto inmune no
detectado. De hecho, las IFI cobran protagonismo a partir de la segunda mitad del siglo 20, cuando
empiezan a ser frecuentes los pacientes inmunodeprimidos, a resultas de los tratamientos
inmunosupresivos, la quimioterapia y el empleo de catéteres y otros cuerpos extraños.
Es evidente que la existencia de un factor predisponente facilita el acceso al torrente
sanguíneo de las candidas que colonizan las superficies cutáneo-mucosas, y que sus
diferentes factores de virulencia pueden condicionar la epidemiología y el pronóstico. Pero se
ha observado que no todos los pacientes tienen el mismo riesgo de desarrollar una candidosis
invasiva, aun teniendo idénticos factores de riesgo, por lo que parece ser que existe una cierta
predisposición genética, en la que portadores de ciertos polimorfismos podrían desarrollar
una IFI más fácilmente, al ver reducida, especialmente, su capacidad de fagocitosis, de inhibir
la germinación y/o de la producción de interleucinas específicas.
En lo que hace referencia al diagnóstico, los métodos diagnósticos basados en el cultivo
tienen múltiples limitaciones, por lo que se están desarrollando nuevas estrategias, basadas
en métodos alternativos, con las que poder detectar nuevos biomarcadores que permitan un
diagnóstico más rápido, sensible y específico.
Si bien la introducción de estas técnicas en los laboratorios de diagnóstico está cada vez más
extendida, muchas están todavía en fase de desarrollo y para aquellas más ampliamente
utilizadas (1-3-β-D-glucano, mananos/anti-mananos, técnicas moleculares) faltan estudios
que evalúen, sin lugar a dudas, su utilidad clínica.
En la actualidad, los avances en el diagnóstico molecular de las bacteriemias, incorporando a
la estrategia diagnóstica técnicas basadas en la hibridación, PCR múltiple, PCR combinadas
con hibridación, secuenciación o espectrometría de masas, también han supuesto un
notable avance en el diagnóstico de las fungemias, aunque también se encuentran en fase
de evaluación. Todavía no se dispone de un gold-standard que pueda afirmar o descartar
con absoluta seguridad la existencia de una IFI, siendo muy recomendable recurrir al uso
simultáneo de varias técnicas diagnósticas.
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En la actualidad se dispone de tres grupos de antifúngicos sistémicos efectivos para el
tratamiento de las candidiasis invasivas, los polienos, los triazoles y las equinocandinas.
Las indicaciones, posología y duración de los tratamientos han sido analizadas en múltiples
ensayos clínicos y las nuevas pautas terapéuticas han sido comparadas con las previamente
existentes, llegándose así a elaborar detalladas Guías de Práctica Clínica en las que se
recogen las diferentes pautas terapéuticas, se clasifican en función del grado de evidencia y
se efectúan recomendaciones precisas.
Sin embargo, como ya se ha comentado anteriormente, el porcentaje de fracasos terapéuticos
es excesivamente elevado, y aunque podría ser atribuible a la aparición de resistencias o el
desplazamiento de cepas sensibles por otras de resistentes, hay otros múltiples factores
que pueden justificar este fracaso. Factores, en su mayoría, atribuibles al fracaso del sistema
inmunitario del paciente pero también atribuibles a factores relacionados con el antifúngico
o con la propia técnica diagnóstica, como pueden ser diferencias en la estandarización de la
técnica del antifungigrama (CLSI, EUCAST) o la falta de puntos de corte clínicos adecuados.
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CONFERENCIA INVITADA
Micosis en animales domésticos
F. Javier Cabañes
Grup de Micologia Veterinària. Facultat de Veterinària. Departament de Sanitat i d’Anatomia
Animals. Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra.
Barcelona, E- 08193. javier.cabanes@uab.es
En los últimos años, dos de las micosis que más han llamado la atención, tanto a nivel
científico como en los medios de comunicación, afectan a fauna salvaje y amenazan con la
extinción de determinadas especies animales. En concreto las quitridiomicosis causadas por
Batrachochytrium spp. y las infecciones por Pseudogymnoascus destructans están diezmando la
población de determinados anfibios y murciélagos respectivamente que habitan en distintas
zonas del mundo. En el caso de las quitridiomicosis una de las mayores preocupaciones actuales
en el tema del control de la enfermedad está relacionado con el comercio y la importación de
animales, principalmente ranas y salamandras de zonas afectadas que se van a utilizar como
animales de compañía exóticos, de experimentación, o como alimento y que pueden llegar a
extender esta amenazadora epidemia a nuevos hábitats.
Por lo que respecta a aquellas micosis que afectan a animales domésticos también podemos
destacar algunas novedades. En las últimas dos décadas Brasil ha experimentado uno de
los mayores brotes epidémicos de esporotricosis que tiene claramente un origen zoonótico.
Estos brotes se correlacionan claramente con un incremento de casos de esporotricosis en
gatos. Clásicamente la esporotricosis se considera una micosis de implantación causada por
el hongo dimórfico Sporothrix schenckii cuyo reservorio es el suelo, determinadas plantas y
material vegetal en descomposición. En el hombre se considera una enfermedad ocupacional
de jardineros y agricultores en los que las espinas y astillas de origen vegetal facilitan la
entrada del patógeno en su forma miceliar. En el caso de la zoonosis los arañazos y mordeduras
producidas por los gatos tendrían un papel principal en la transmisión e incremento de la
incidencia de la enfermedad. Recientemente, estudios moleculares han permitido definir
nuevas especies entre las causantes de esta micosis, entre las que Sporothrix brasiliensis se
muestra claramente como la responsable de los brotes zoonóticos.
También es de destacar que en el caso de la criptococosis, hasta prácticamente finales del
siglo XX la mayoría de los casos en perros y gatos se relacionaban con infecciones producidas
por Cryptococcus neoformans. Era raro encontrar en la bibliografía casos por Cryptococcus
gattii, con la excepción de los descritos en Australia, en la que esta especie es predominante.
No obstante en la última década han ido apareciendo descripciones en distintas especies
animales como perros, gatos, cabras o hurones, producidas por esta última especie en otros
continentes. Recientemente se ha presentado una nueva propuesta de especiación de estos
patógenos en la que se subdividen en un total de siete especies que necesitan la ayuda de
técnicas del análisis del DNA para poder ser diferenciadas sin ambigüedad.
No obstante, las dermatofitosis siguen siendo las micosis más diagnosticadas en los animales
domésticos. En perros y gatos, Microsporum canis continua siendo la especie más aislada de
estas micosis típicamente superficiales. No obstante, esta especie puede llegar a producir
infecciones en localizaciones más profundas que se están detectando fundamentalmente
en gatos persas. Ya hace tiempo que se conoce que tanto Microsporum como Trichophyton
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son géneros polifiléticos. Por este motivo, y con el fin de adaptarse a las nuevas normas
de nomenclatura fúngica que desde 2013 no admiten la nomenclatura dual anamorfo/
teleomorfo (ICN, art. 59) se espera que próximamente determinadas especies como M.
gallinae, M. gypseum o M. nanum cambien de nombre. Otra de las causas más frecuentes
de infecciones fúngicas vistas en las consultas veterinarias de pequeños animales siguen
siendo las otitis externas y dermatitis asociadas a Malassezia pachydermatis. El año pasado
se reconocían 14 especies en el género Malassezia. Sin embargo, se desconoce la presencia
de estas levaduras en la mayoría de especies animales. Esto hace pensar que en breve este
número pueda ser fácilmente ampliado si se estudia principalmente fauna salvaje.
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CONFERENCIA DE CLAUSURA. PREMIO FLEMING
Regulación de la separación celular en las hifas de Candida albicans: una nueva función del
factor de transcripción Ace2.
Diana Calderón-Noreña1, Alberto González-Novo1, Sara Orellana-Muñoz1, Pilar Gutiérrez-Escribano2, Yolanda Arnáiz-Pita1, Encarnación Dueñas-Santero1, M. Belén Suárez1, Marie-Elisabeth
Bougnoux3,4, Francisco del Rey1, Gavin Sherlock4, Christophe d’Enfert3,, Jaime Correa-Bordes2*
and Carlos R. Vázquez de Aldana1*
1 Instituto de Biología Funcional y Genómica. (CSIC)/ (USAL). Salamanca, Spain.
2 Departamento de Ciencias Biomédicas. UEX. Badajoz, Spain.
3 Institut Pasteur, France.
4, Stanford University, CA, USA.
Candida albicans es un importante patógeno fúngico en seres humanos. Un factor de virulencia importante es su capacidad para cambiar entre distintas morfologías, levaduras e hifas, ya
que se piensa que las formas filamentosas son importantes en la penetración en los tejidos y
la invasión. Una característica de las hifas es la inhibición de la separación tras la citocinesis,
que permite que los compartimentos hifales se mantengan unidos formando largos filamentos, aunque poco se conoce sobre cómo se regula este proceso. En trabajos previos, demostramos que la inhibición de la separación depende de cambios en la dinámica del anillo de
septinas, en un proceso que depende de la septina Sep7 y del complejo Hgc1-Cdc28.
Sorprendentemente, en este trabajo (1) hemos encontrado que el factor de transcripción Ace2
también es necesario para regular la dinámica de los anillos de septinas. Ace2 activa la expresión de las quitinasas y glucanasas implicadas en la disolución del septo primario en levaduras,
aunque estos genes no se expresan en hifas. La regulación de la dinámica del anillo de septinas
en hifas por Ace2 es independiente de su actividad transcripcional y se debe a que en C. albicans
existen dos isoformas Ace2 que se producen por el uso de codones de inicio alternativos. La forma
larga (Ace2L) contiene 54 aa extra en el extremo N-terminal (con un posible dominio transmembrana) y es la responsable de la regulación de la dinámica de las septinas en hifas. La forma corta
(Ace2S) funciona como factor de transcripción regulando la expresión de los genes de separación.
Resultados preliminares indican que Ace2L regula la incorporación de Sep7 a los anillos de septinas en hifas para evitar la activación ilícita de separación durante el crecimiento filamentoso.
Curiosamente, un polimorfismo natural (SNP) presente en el fondo genético WO-1 fondo genera
un codón de parada en el noveno codón de Ace2L que imita el fenotipo de células que carecen
de Ace2L. Mediante el análisis de los genotipos de 144 aislados de cepas comensales o clínicas
distribuidas en 11 de los 18 clades de C. albicans, se encontró que la mayoría de los aislados (60%)
son similares a la cepa WO-1. Además, los distintos genotipos muestran una fuerte asociación con
los clades, lo que sugiere que la presencia de Ace2L ha surgido recientemente en la evolución. En
conjunto, nuestros resultados sugieren que Ace2L es un nuevo regulador de la dinámica de los
anillos de septinas en hifas para permitir la formación de cadenas de células, una característica
que parece haber evolucionado específicamente en algunos linajes concretos de C. albicans.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Science and Innovation
(BFU2010-15884) and Universidad de Salamanca. All Spanish funding was co-sponsored by
the European Union FEDER program.
1. Calderón-Noreña, D., González-Novo, A., Gutiérrez-Escribano, P., Dueñas-Santero., E., Arnáiz-Pita, Y.,
Suárez, B., Orellana-Muñoz, S., Bougnoux. ME., Rey, F. del., Sherlock, G., d’Enfert, C., Correa-Bordes, J.,
Vázquez de Aldana, CR. (2015). A single nucleotide polymorphism uncovers a novel function for the
transcription factor Ace2 during Candida albicans hyphal development. Plos Genet. 11(4): e1005152
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COMUNICACIONES
ORALES
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COMUNICACIONES ORALES: SESIÓN I
Análisis de los factores que inducen la formación de células gigantes Cryptococcus neoformans
in vitro
Nuria Trevijano-Contador 1, Suelen Andreia Rossi1, Inés Correia2, Jesús Plá2, Ángel Zaballos3,
Joaquín Ariño4 y Oscar Zaragoza1.
Laboratorio de referencia de Micología, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud
Carlos III, Majadahonda, Madrid, España.
1
2
Departamento de Microbiología II, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, España.
3
Unidad de Secuenciación, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III,
Majadahonda, Madrid, España.
Departamento de Bioquímica i Biología Molecular e Institut de Biotecnología i Biomedicina,
Universitat Autónoma de Barcelona, España.
4
Una de las principales características de la mayoría de los hongos es la capacidad de cambiar
de morfología. En el caso de hongos patógenos, estos cambios ocurren durante la infección y
juegan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad. Las transiciones morfológicas
pueden ocurrir por formación de hifas y pseudohifas, o por un crecimiento masivo de la
blastoconidia. Cryptococcus neoformans es una levadura patógena encapsulada y un ejemplo
de hongo que cambia de tamaño sin modificar la forma de la célula. En concreto, este hongo
puede incrementar su tamaño mediante 2 mecanismos diferentes: incrementando el tamaño
de la cápsula, o incrementando el diámetro de tanto la cápsula como el cuerpo celular. Este
último proceso resulta en la formación de células de gran tamaño que son denominadas
células gigantes. Resultados previos han caracterizado la formación de células gigantes durante
la infección pulmonar. Sin embargo, poco se conoce sobre el crecimiento de estas células
en condiciones in vitro. En este trabajo, mostramos diferentes condiciones que favorecen la
formación de células gigantes in vitro. Nosotros observamos, que diluyendo parcialmente el
medio de inducción de la cápsula (10% de Sabouraud tamponado a pH 7.3 con 50 mM de MOPS)
con suero bovino fetal junto con un inhibidor mitocondrial, resultaba en una alta proporción
de células gigantes. Además, otros factores como la limitación de oxígeno y una atmósfera
enriquecida con CO2 favorecen dicho cambio morfológico. La formación de células gigantes se
inhibió cuando los cultivos se inoculaban a una alta densidad celular, lo que sugiere que este
proceso está regulado por fenómenos de “quórum sensing”. De acuerdo a estos resultados,
comprobamos que el farnesol inhibe este cambio morfológico. Por último, hemos investigado
el perfil de expresión de genes en las células gigantes en comparación con células de tamaño
regular mediante RNAseq. Hemos encontrado 410 genes que se sobreexpresan en las células
gigantes, de los cuales 151 tienen función desconocida. El gen más expresado en estas células es
el Cig1, una manoproteína involucrada en la captación de hierro. Nuestros resultados muestran
una nueva alternativa para investigar la formación de células gigantes sin los problemas
bioéticos que conlleva la experimentación animal, lo que permitirá ahondar en la elucidación
de los mecanismos moleculares involucrados en este proceso.
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Interacciones entre la microglía y el hongo neurotrópico Lomentospora prolificans: papel de
los receptores Dectina-1 y Receptor de Manosa
Aize Pellon1, Andoni Ramirez-Garcia1, Idoia Buldain1, Aitziber Antoran1, Leire Martín-Souto1,
Carlos Matute2, Aitor Rementeria1 y Fernando L. Hernando1
1
Fungal and Bacterial Biomics Research Group. Departamento de Inmunología, Microbiología y
Parasitología. Facultad de Ciencia y Tecnología. Universidad del País Vasco (UPV/EHU).
Laboratorio de Neurobiología. Departamento de Neurociencias. Facultad de Medicina y Odontología. Universidad del País Vasco (UPV/EHU).
2
Bº Sarriena s/n, 48940 Leioa, Bizkaia
E-mail: aize.pellon@ehu.eus / fl.hernando@ehu.eus
Lomentospora prolificans es un ascomiceto filamentoso capaz de manifestarse como patógeno
principalmente en individuos inmunodeprimidos. En este tipo de pacientes, el hongo tiende a
diseminarse debido a la ausencia de una respuesta inmune eficaz y a la gran capacidad del microorganismo para esporular en los tejidos y fluidos del hospedador. Tras su diseminación por el
torrente sanguíneo, se ha observado que el hongo tiene tendencia a colonizar el Sistema Nervioso
Central (SNC), por lo que se le identifica como neurotrópico. Por todo ello, el objetivo general de
este estudio fue analizar las interacciones entre L. prolificans y la microglía, los fagocitos residentes en el SNC. Además, se evaluó el papel de dos importantes receptores de reconocimiento de
patrones (RRP), Dectina-1 (Dc-1) y Receptor de Manosa (RM), los cuales han sido descritos como
mediadores del reconocimiento de β-glucanos y residuos de manosa, respectivamente.
Para llevar a cabo el estudio, se co-cultivaron in vitro conidiosporas de L. prolificans con dos
modelos celulares de microglía, la línea celular BV-2 y cultivos primarios (CP) obtenidos de ratas, en DMEM/10% SBF/2 mM L-glutamina en atmósfera con humedad 95% y 5% CO2, y a 37ºC.
De esta manera, se estudiaron las interacciones hongo-fagocito evaluándose los siguientes
parámetros: porcentaje de fagocitosis, producción de citocinas proinflamatorias (TNF-α e IL6) y especies reactivas de oxígeno o nitrógeno (ROS y RNS), morfología y crecimiento fúngicos. Por otro lado, una vez descritos estos parámetros en condiciones normales, se estudió
el papel de los receptores Dc-1 y RM en el proceso de fagocitosis y la producción de citocinas
utilizando los inhibidores específicos laminarina y manano.
Los experimentos de co-cultivo mostraron que las células de la microglía, tanto BV-2 como CP,
fueron capaces de fagocitar los conidios de L. prolificans, pero con bajos porcentajes de fagocitosis. Además, se observaron diversas deficiencias por parte de la microglía en respuesta a la
infección, incluyendo descenso en la producción de TNF-α e IL-6, y de ROS, además de una baja
resistencia a la infección. Por otro lado, el uso de los inhibidores específicos para los receptores
Dc-1 y RM produjo un descenso de la fagocitosis de hasta el 84% y 71%, respectivamente. Esto
indicó que ambos receptores juegan un papel determinante en el reconocimiento de L. prolificans por parte de la microglía, mostrando la mayor relevancia de Dc-1 en este proceso. Además,
la inhibición conjunta de ambos receptores no resultó en un efecto sinérgico, observándose
valores de porcentaje de fagocitosis similares a los obtenidos bloqueando solamente la Dc-1,
resaltando la importancia de este RRP respecto al RM.
22
El estudio de las interacciones entre las células de la microglía y el hongo neurotrópico L.
prolificans ha permitido determinar que, tanto la fagocitosis, como la producción de moléculas relacionadas con la modulación de la respuesta inmune y la explosión oxidativa, son
deficientes. Por otra parte, hemos probado el papel determinante en el proceso de fagocitosis tanto del RM como de Dc-1, siendo éste último especialmente importante. Con todo ello,
estos datos permiten profundizar en la patobiología y neurotropismo de L. prolificans con el
objetivo final de desarrollar nuevos métodos diagnósticos y terapéuticos frente a las micosis
causadas por este hongo oportunista.
Financiación: proyectos EHUA13/14, UFI11/25, y GIU12/44 de la UPV/EHU y del Gobierno Vasco/
Eusko Jaurlaritza (GV/EJ). AP posee un contrato postdoctoral otorgado por la UPV/EHU, e IB y
AA poseen una beca predoctoral del GV/EJ.
23
La diversidad de Malassezia pachydermatis: ¿reflejo de un complejo críptico de especies?
Laura Puig, Gemma Castellá, M. Rosa Bragulat, F. Javier Cabañes
Grup de Micologia Veterinària, Departament de Sanitat i d’Anatomia Animals, Universitat
Autònoma de Barcelona, Bellaterra, España.
Malassezia pachydermatis es una especie de levaduras del género Malassezia que forma
parte de la microbiota normal de la piel y conducto auditivo de animales homeotermos. No
obstante, ciertas condiciones pueden predisponer al sobrecrecimiento de estas levaduras,
causando otitis y dermatitis, especialmente en carnívoros domésticos. La diversidad genética
dentro de la especie M. pachydermatis se ha estudiado usando métodos moleculares,
principalmente mediante la secuenciación de marcadores moleculares de cepas aisladas de
perros. Asimismo, este hecho ha sido poco estudiado desde la vertiente fenotípica.
En el presente estudio se analizaron 16 cepas de M. pachydermatis aisladas de distintos
animales domésticos sanos o con procesos de otitis o dermatitis. Por una parte, las cepas
fueron analizadas mediante un estudio filogenético multilocus, en el que se secuenciaron
cuatro marcadores moleculares (LSU rRNA, ITS rRNA, CHS-2 y b-tubulina). Paralelamente,
las mismas cepas fueron analizadas fenotípicamente, valorando la actividad de las enzimas
catalasa y b-glucosidasa, el test de difusión con distintos ésteres de poliexietilensorbitano y
el crecimiento de 32ºC a 45ºC.
La secuenciación permitió identificar distintos tipos de secuencias, algunos de ellos descritos
por primera vez. Combinando las secuencias de los cuatro genes se infirieron árboles
filogenéticos, en los cuales se observó la relación evolutiva entre las cepas analizadas. El estudio
multilocus permitió apreciar cierta relación entre algunos genotipos de M. pachydermatis y
la especie animal de la que se aislaron, aparentemente sin relación alguna con el estado de
salud de los animales. Del análisis fenotípico cabe destacar los diferentes perfiles obtenidos
respecto a la asimilación de algunos ésteres de poliexietilensorbitano ensayados. No se
observaron diferencias respecto a las actividades enzimáticas y el crecimiento a diferentes
temperaturas en las cepas ensayadas.
Los estudios realizados en cepas de M. pachydermatis ponen de manifiesto una gran diversidad intraespecífica a nivel genético, a la vez que una gran similitud fenotípica entre cepas de
la misma especie. Los datos presentados indican que podríamos encontrarnos delante de un
potencial complejo de especies crípticas. No obstante, se requieren estudios adicionales para
determinar si la diversidad entre cepas de M. pachydermatis es suficiente para describir nuevas especies o si sólo muestra que esta especie está en proceso de adaptación a diferentes
condiciones de vida relacionadas con los distintos hospedadores animales.
24
Distribución horaria y diaria de esporas de Coprinus en el aire
Alejandro Monroy Colín1, Santiago Fernández Rodríguez2, José María Maya Manzano1, Rafael
Tormo Molina1, Inmaculada Silva Palacios3, Ángela Gonzalo Garijo4
1. Departamento de Biología Vegetal, Ecología y Ciencias de la Tierra, Universidad de
Extremadura, 06071 Badajoz. bioamc@outlook.com, jmmaya@unex.es, ratormo@unex.es
2. Departamento de Construcción, Universidad de Extremadura, 10003 Cáceres, santiferro@
unex.es
3. Departamento de Física Aplicada, Universidad de Extremadura, 06007 Badajoz, insilva@
unex.es
4. Sección de Alergología. Hospital Universitario Infanta Cristina, 06080 Badajoz, magonzalog@
gmail.com
Introducción.
Las basidiósporas de tipo Coprinus se caracterizan por su forma elíptica, tamaño de 8-12 (15)
µm, pared lisa de y color negro o muy oscuro y presencia un poro conspicuo hacia la parte
más estrecha. En el SW de la península al menos una docena de especies se incluyen en
este género, aunque la descripción puede abarcar especies de otros géneros de la familia
Psathyrellaceae como Coprinellus, Coprinopsis, Parasola, Panaeolus o Psathyrella. Son hongos
saprófitos o micorrízicos cuyos carpóforos y liberación de esporas muestran una notable
estacionalidad. Este estudio pretende analizar la presencia de este tipo de esporas en el aire
y su patrón de distribución horaria, así como los factores meteorológicos que inciden en su
distribución.
Material y Métodos.
El muestreo de esporas aerovagantes se ha realizado utilizando un captador volumétrico
con metodología Hirst (10 litros por minuto de flujo de aspiración) ubicado en la terraza (16
m) de un edificio de 3 plantas en el campus universitario de Cáceres. El adhesivo utilizado ha
sido Petrolatum White (CAS 8009-03-8). El muestreo ha sido continuo durante el período de
1/10/2015 - 30/4/2016. Las esporas se han identificado y contabilizado mediante microscopía
óptica con dos barridos longitudinales a 400 aumentos de magnificación. La concentración
se proporciona en esporas por metro cúbico. Una estación meteorológica ubicada a escasos
metros del captador ha permitido la obtención de datos de temperatura, precipitación,
humedad relativa, velocidad y dirección del viento. Se ha calculado el coeficiente de correlación
de Spearman con valores diarios y horarios de temperatura y precipitación.
Resultados.
La concentración promedio en el período de estudio fue de 69.4 esporas/m3. El pico de
concentración diaria se alcanzó el 29 octubre con 950 esporas/m3. Aparecieron 3 períodos
de presencia de esporas bien diferenciados: 27 días (19/10-14/11) con más de 100 esporas/m3,
16 días (28/12-12/1) con más de 10 esporas/m3 y 8 días (19/4-26/4) con más de 20 esporas/m3.
Respecto a los datos diarios, la temperatura mínima mostró correlación positiva y significativa
con la concentración de esporas (r 0.166, p>0.001). La distribución horaria promedio muestra
valores altos al principio de la mañana y valores más bajos a media tarde; los valores nocturnos
fueron elevados excepto hacia el amanecer que bajaron de forma notable. El máximo horario
25
alcanzó un valor de 2246 esporas/m3 (19/10 24:00). La correlación con los datos horarios,
durante el primer período de aparición, mostró correlación significativa y positiva con la
humedad relativa (r 0.183, p<0.001) y negativa con la temperatura (r -0.253, p<0.001).
Conclusiones.
Las basidiósporas de Coprinus mostraron un patrón de distribución diaria intermitente,
con aparición máxima entre mediados de octubre y mediados de noviembre, una segunda
aparición en la primera quincena de enero y una tercera en la segunda mitad de abril. Las
lluvias precedentes condicionaron su presencia y su abundancia estuvo condicionada por
temperaturas mínimas, siendo alrededor de 10ºC el umbral para su aparición. Durante el día,
En promedio, la concentración de esporas se mantiene alta durante la noche y las primeras
horas de la mañana, excepto al amanecer que baja de forma significativa, los valores más
reducidos se consiguen a media tarde. Este patrón principalmente nocturno explica la
correlación negativa con la temperatura frente a la correlación positiva utilizando datos
diarios. Existe, sin embargo, una amplia variabilidad entre un día y otro.
26
Circinomyces, un nuevo género del orden Mucorales (subdivisión Mucoromycotina) procedente de suelos en la Ciudad de México
Emmanuel Rosas de Paz1, Dania García Sánchez1, Josep Guarro1 y Alberto Miguel Stchigel1.
Unidtat de Micologia i Microbiologia Ambiental, Facultad de Medicina y IISPV, Universitat
Rovira i Virgili, Sant Llorenç 21, 43201 Reus, Tarragona, España.
E-mail: emmrodepaz@gmail.com
1
Antecedentes.
La reconstrucción de la filogenia de los hongos basada en técnicas de biología molecular
ha demostrado que el phylum Zygomycota es de naturaleza polifilética. Actualmente sus
miembros se distribuyen entre el phylum Glomeromycota y cuatro subphylum insertae sedis:
Entomophthoromycotina, Kickxellomycotina, Mucoromycotina y Zoopagomycotina. El subphylum Mucoromycotina reúne la mayor diversidad de géneros dentro los hongos previamente llamados zigomicetos, algunos de los cuales incluyen especies de importancia clínica
e interés biotecnológico, tales como Mucor y Rhizopus. Cabe destacar que, a pesar de que
existen numerosos estudios sobre la biología y taxonomía de este grupo de hongos, dicho
conocimiento sigue siendo fragmentario, especialmente en cuanto a su biodiversidad en determinados nichos ecológicos como el suelo.
Objetivo.
Contribuir al conocimiento de las especies del subphylum Mucoromycotina en suelo de la
Ciudad de México.
Metodologia.
Las muestras de suelo (N = 55) fueron colectadas en el área metropolitana de Ciudad de México y áreas colindantes entre enero y agosto de 2015. Las muestras fueron recolectadas en
bolsas de polietileno estériles y conservadas a 4 ºC hasta su procesamiento. Para el aislamiento se utilizaron dos técnicas: diluciones seriadas y siembra directa por espolvoreado de 1 g de
suelo. Los medios utilizados para el aislamiento fueron: MEYE (agar con extracto de malta y
extracto de lavadura) y BEA (agar con bilis de buey y esculina). El estudio morfológico de los
aislados obtenidos se realizaron en CZK (agar de Czapek y Dox), MEA (agar con extracto de
malta), MEYE, PDA (agar con extracto de patata y glucosa) y SMA (agar sintético para Mucor),
y las características del cultivo y la micromorfología se evaluó a los 7 y a los 15 días de incubación a 15, 25 y 35°C. Las estructuras vegetativas y reproductivas fueron examinadas bajo el
microscopio de campo claro observando preparaciones montadas en ácido láctico (85%). La
identificación molecular de los aislados se realizó mediante la amplificación de la región ITS
(espaciadores intergénicos transcriptos), sometiendo las secuencias nucleotídicas obtenidas a
un análisis de similitud con otras depositadas en la base de datos GenBank/EMBL, mediante
el algoritmo BLAST. Posteriormente, utilizando las secuencias generadas en nuestro estudio
y las más similares depositadas en GenBank/EMBL, se construyó un dendrorama por el método de máxima verosimilitud, realizando también una inferencia bayesiana, utilizando los
programas MEGA 6.0 y Mr.Bayes 3.2.4, respectivamente.
27
Resultados.
En el presente estudio se reportan Absidia glauca, Absidia coerulea, Mucor fragilis, Mucor
circinelloides, Syncephalastrum racemosum, Mucor plumbeus, Rhyzopus oryzae, Actinomucor
elegans, Mucor racemosus, Mucor hiemalis y Rhizomucor variabilis. El análisis molecular de
los aislados FMR 14959 y FMR 14960 demostró que ambos pertenecen a un nuevo taxón filogenéticamente relacionado con el género Circinella. Sin embargo, las características microscópicas de estos aislados difieren de aquellas definitorias para este género. Nuestros aislamientos no presentan esporangióforos ramificados en umbelas, aunque sí se ha constatado
la presencia de espinas laterales inconspicuas. Un carácter distintivo de nuestros aislamientos es la formación de zigosporas a partir de cultivos monospóricos, lo que demostraría que
dichos aislados son homotálicos, carácter que hasta el momento no ha sido reportado para
el género Circinella.
28
COMUNICACIONES ORALES: SESIÓN II
Transcriptional and post-transcriptional regulation of iron deficiency response
Antonia M. Romero1, Daniel A. Medina2, José García-Martínez3, José Enrique Pérez-Ortín2,
María T. Martínez-Pastor2, and Sergi Puig1
Departamento de Biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA),
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Catedrático Agustín Escardino 7,
E-46980, Paterna, Valencia, Spain. 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, and 3Departamento de Genética, Universitat de València, Ave. Doctor Moliner 50, E-46100, Burjassot,
Valencia, Spain.
am.romero@iata.csic.es; spuig@iata.csic.es
1
Iron is an essential element for most organisms because it participates as a redox active cofactor in a large variety of metabolic pathways. Previous studies have shown that both transcriptional and post-transcriptional mechanisms regulate yeast response to iron deficiency.
Briefly, Aft1/Aft2 activate the transcription of a group of genes collectively referred as the “iron
regulon”, which include genes that function in iron acquisition and mobilization. Furthermore,
two mRNA-binding proteins denoted Cth1 and Cth2 specifically bind to AU-rich elements (AREs)
within the 3’untranslated region of many mRNAs encoding proteins that participate in iron-dependent processes such as respiration, and promote their degradation (Puig et al., 2005). To
ascertain the relative contribution of transcriptional and post-transcriptional strategies to
the adaptation to iron limitation, we have determined in parallel the mRNA levels (RA) and
transcription rates (TR) for the entire yeast transcriptome during the progress of iron deprivation. We have used the Genomic Run-On (GRO) technique to obtain genome-wide TR data
(Garcia-Martinez et al, 2004), whereas mRNA decay rates (DR) have been calculated from the
RA and TR experimental data. We have observed that during the progress of iron deprivation
global TR decreases. Global RA levels are moderately reduced in the first stage of deficiency,
and the reduction is striking during long times of deprivation. These results could indicate TR is
the main determinant of mRNA abundance in the response to iron starvation. A clustering of
genes according to similar TR and RA patterns confirms previous observations: the iron regulon
is up-regulated due to an increase in TR (Aft1/Aft2 effect), whereas genes that participate in the
mitochondrial electron transport chain are down-regulated by an increase in their DR (Cth1/
Cth2 effect). As previously shown for other stresses, genes involved in ribosome biogenesis,
rRNA metabolism and processing, and cytoplasmic translation decrease their TR. However, in
iron deficient conditions these genes maintain and even increase their RA. Experimental mRNA
half-life measurements demonstrate that mRNAs implicated in translation stabilize in iron deficient conditions. We are currently deciphering the underlying transcriptional and post-transcriptional mechanisms.
Puig S, Askeland E, and Thiele DJ (2005). Coordinated Remodeling of Cellular Metabolism
during Iron Deficiency through Targeted mRNA Degradation. Cell 120: 99-110.
Garcia-Martinez J, Aranda A, and Perez-Ortin JE (2004). Genomic Run-On Evaluates Transcription Rates for All Yeast Genes and Identifies Gene Regulatory Mechanisms. Mol. Cell 15: 303-313.
29
La expresión heteróloga de la quinasa de mamíferos Akt en levadura sobreestimula la señalización
dependiente de PtdIns4,5P2
Teresa Fernández-Acero, Isabel Rodríguez-Escudero, Víctor J. Cid, María Molina.
Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, UCM e Instituto Ramón y Cajal de
Investigaciones Sanitarias (IRYCIS). Plaza de Ramón y Cajal s/n, 28040, Madrid. teresafe@farm.
ucm.es
La proteína de mamíferos Akt es una serín/treonín quinasa perteneciente a la familia de AGC
quinasas y está implicada en el control de importantes procesos celulares como la regulación
de la síntesis proteica, la supervivencia celular, la progresión en el ciclo celular y la glicolisis.
Esta proteína se localiza en la membrana plasmática en respuesta a la producción de PtdIns3,4,5P3, un segundo mensajero clave generado por la fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K) de
clase I, y es posteriormente activada por fosforilación en la treonina 308 por la también
AGC quinasa PDK1 y en la serina 473 por el complejo mTORC2. Su activación conduce a la
fosforilación de numerosos efectores en la célula de mamífero para el control de los procesos
antes mencionados. Sin embargo, el exceso de estimulación de esta proteína está relacionado
con la aparición de tumores y desarrollo de cáncer en mamíferos.
La expresión de Akt de forma heteróloga en la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae bajo
el control del promotor inducible por galactosa no provoca ningún efecto aparente en la célula.
Sin embargo su co-expresión junto a una versión silvestre de la subunidad catalítica de PI3K de
clase I, p110α, causa una inhibición moderada del crecimiento de la levadura, que depende tanto
de su translocación a la membrana plasmática de la célula en respuesta a la aparición de PtdIns3,4,5P3 generado por PI3K, como de su posterior fosforilación por las homólogas de PDK1 en
levadura, las proteínas Pkh1/2 (Rodríguez-Escudero et al., 2005). Estos hallazgos han permitido
emplear nuestro sistema de levadura humanizada para el estudio de mutaciones oncogénicas y
para el análisis de la relación estructura-actividad de la proteína (Rodríguez-Escudero et al., 2009).
Hemos observado que la expresión y activación de Akt conduce a la aparición de invaginaciones
en la membrana plasmática donde se concentra esta proteína en su forma activa, las cuales se
generan de forma dependiente del citoesqueleto de actina y, a su vez, están asociadas a patches de
actina. Estas estructuras se encuentran revestidas ocasionalmente por pared celular y concentran
elementos de la ruta de integridad celular, como la proteín quinasa Pkc1, lo cual es característico de
una activación localizada de la ruta CWI (Cell Wall Integrity). Además las invaginaciones coinciden
con el colorante vital fluorescente FM4-64, están enriquecidas en los lípidos de membrana
PtdIns-4,5P2 y fosfatidilserina y contienen retículo endoplásmico cortical. Por otro lado, uno de los
efectores de PtdIns-4,5P2 en la célula de levadura, la proteína Slm1, que interacciona con este lípido
en la membrana plasmática y participa en el control de la integridad celular y la homeostasis
de esfingolípidos, se encuentra hiperfosforilado en condiciones de expresión y activación de Akt;
de hecho, su sobreexpresión mimetiza los efectos de la activación de dicha quinasa en levadura.
La detección de Slm1 con anticuerpos que reconocen la secuencia consenso de fosforilación de
Akt ha confirmado que se encuentra específicamente fosforilada en estas circunstancias. Estos
resultados sugieren que la activación de Akt en la célula de levadura genera una hiperactivación
de la señalización dependiente de PtdIns-4,5P2 causando severas alteraciones en la función y
homeostasis de la membrana plasmática.
30
Rodriguez-Escudero,I., Andres-Pons,A., Pulido,R., Molina,M., and Cid,V.J. (2009).
Phosphatidylinositol 3-kinase-dependent activation of mammalian protein kinase B/Akt in
Saccharomyces cerevisiae, an in vivo model for the functional study of Akt mutations. J. Biol.
Chem., 284, 13373-13383.
Rodriguez-Escudero,I., Roelants,F.M., Thorner,J., Nombela,C., Molina,M., and Cid,V.J. (2005).
Reconstitution of the mammalian PI3K/PTEN/Akt pathway in yeast. Biochem. J., 390, 613-623.
31
Distribución asimétrica del represor Nrg1 durante el crecimiento hifal de Candida albicans
T. Ciudad1; G. Bermejo-Pulido1; P. Rojo1; C.R. Vázquez de Aldana2 y J. Correa-Bordes1.
1
Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad de Extremadura. Avda. Elvas s/n 06006.
Badajoz. España. 2Instituto de Biología Funcional y Genómica. CSIC/Universidad de Salamanca.
aciudad@unex.es
El hongo ascomiceto C. albicans vive como comensal en diferentes mucosas de animales
de sangre caliente. Bajo determinadas circunstancias que provocan cambios en la
microbiota (estrés, variaciones de pH, tratamiento con antibióticos, etc.) puede proliferar
en los tejidos y generar infecciones superficiales, como la candidiasis vaginal. En individuos
inmunocomprometidos el acceso del hongo al torrente sanguíneo permite su diseminación
dentro del organismo y el desarrollo de candidiasis de carácter sistémico. Diferentes programas
transcripcionales influyen en la virulencia de este hongo y permiten su rápida adaptación a
cambios ocurridos dentro del hospedador. Uno de estos programas es la transición levadurahifa, donde la transcripción de los genes específicos de hifa (HSGs) está regulada por diferentes
rutas de señalización. Durante el crecimiento levaduriforme Nrg1 se une a los promotores de
dichos genes reprimiendo su expresión. En respuesta a inductores del crecimiento hifal este
represor es inactivado por un mecanismo poco conocido.
En nuestro grupo estamos estudiando la regulación de Nrg1 durante la transición levadurahifa. Mediante microscopía de fluorescencia y mutagénesis dirigida hemos demostrado
que durante el crecimiento levaduriforme Nrg1 se acumula en el núcleo de la célula y está
fosforilada en un grupo de 7 residuos SP del extremo N-terminal. Durante el crecimiento
hifal inducido por suero a 37°C el represor es regulado espacial y temporalmente de forma
compleja. En estadios iniciales (transición levadura-hifa) Nrg1 es desplazado del núcleo
celular y degradado totalmente, permitiendo así la formación del tubo germinativo. Durante
el crecimiento hifal sostenido, el represor se concentra nuevamente en el núcleo de las células
subapicales que conforman el micelio, pero permanece excluido del núcleo de la célula apical.
Dicha exclusión requiere fosforilación en los citados residuos SP.
Se sabe que la proteína Sok1 está implicada en la degradación de Nrg1 durante el crecimiento
hifal en ausencia de farnesol (Yang Lu et al., 2014). En nuestro grupo hemos comprobado
que sok1 y fosforilación en 7SP actuarían de forma paralela en la regulación de Nrg1. Así,
mientras que los mutantes simples sok1∆∆ y nrg1-7A son capaces de responder a suero, el
doble mutante exhibe graves defectos en crecimiento hifal en presencia del agente inductor.
Se discutirá la posible conexión entre Sok1 y la distribución asimétrica de Nrg1 en la hifa.
Este trabajo se ha financiado con las ayudas del Ministerio de Economía y Competitividad
(BFU2012-39910 y BIO2015-7095-C2-2R) y la ayuda a Grupos de Investigación de la Consejería
de Economía e Infraestructuras de la Junta de Extremadura (GR15008). Todas estas ayudas
han sido co-financiadas por el programa FEDER de la Unión Europea.
32
Reconocimiento diferencial de la manoproteína Kre9 en levaduras e hifas de Candida albicans
Aitziber Antoran, Andoni Ramirez-Garcia, Aize Pellon, Idoia Buldain, Marta Berroa, Aitor
Rementeria y Fernando L. Hernando.
Fungal and Bacterial Biomics Research Group. Dept. Inmunología, Microbiología y Parasitología.
Facultad de Ciencia y Tecnología. Universidad del País Vasco (UPV/EHU). Leioa, Bizkaia. aitziber.
antoran@ehu.eus.
Candida albicans es un hongo oportunista habitual en el ser humano capaz de crecer en
forma de levadura y de formar hifas verdaderas. Este rasgo es compartido únicamente con
otra de las levaduras de este género, C. dubliniensis, y es considerado un importante factor de
virulencia. La manoproteína Kre9, crucial para el crecimiento de C. albicans en presencia de
glucosa, se ha relacionado con la capacidad de formar hifas de esta levadura en presencia de
suero. Por ello, el objetivo de este trabajo fue evaluar el reconocimiento de la manoproteina
Kre9 en levaduras e hifas de C. albicans y otras especies fúngicas mediante el uso de un
anticuerpo monoclonal específico frente a ella.
Para realizar este objetivo, se produjo un anticuerpo monoclonal anti-Kre9 mediante la
tecnología de hibridomas utilizando para la inmunización de los ratones diferentes péptidos
sintéticos de la proteína. Una vez obtenido el anti-Kre9, se procedió a la comprobación
de la especificidad del anticuerpo mediante la detección de las proteínas reconocidas
tanto en levaduras como en hifas de C. albicans mediante electroforesis y Western Blot
en 1 y 2 dimensiones. Por otro lado, se llevó a cabo un estudio a nivel celular mediante
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) en 5 aislamientos de C. albicans, en C. dubliniensis y en otros
hongos filamentosos como Aspergillus fumigatus, Penicillium chrysogenum, Lomentospora
prolificans, Scedosporium aurantiacum y Scedosporium apiospermum. Para estudiar el efecto
de la glicosilación en el reconocimiento del anticuerpo, parte de las muestras fueron tratadas
con 50 mM de metaperiodato sódico para retirar los carbohidratos y facilitar la unión del
anticuerpo con la proteína.
En el estudio proteómico, se observó que anticuerpo monoclonal anti-Kre9 reconoció
patrones proteínicos diferentes en los extractos de levadura e hifa, así como en las muestras
tratadas con metaperiodato sódico. En relación a los estudios mediante IFI solo la hifa de C.
albicans fue reconocida por el anticuerpo. Sin embargo, tras retirar los carbohidratos con el
tratamiento de metaperiodato sódico, las levaduras también fueron detectadas. El mismo
procedimiento se llevo a cabo con C. dubliniensis, pero en este caso las hifas y levaduras solo
fueron débilmente reconocidas tras el tratamiento con metaperiodato, no siendo posible
visualizar ninguna célula del hongo en ausencia del tratamiento. Lo mismo ocurrió con las
otras especies de hongos filamentosos ensayados asociados a infecciones fúngicas. Los datos
obtenidos tanto del estudio a nivel proteico como del estudio a nivel celular parecen indicar
que el epítopo reconocido por el anticuerpo se encuentra oculto por los residuos glicosilados
principalmente en la morfología de levadura en la especie C. albicans, y que el epitopo parece
ausente o con un bajo nivel de expresión en el resto de especies ensayadas.
33
En conclusión, el anticuerpo monoclonal anti-Kre9 reconoce las hifas pero no los conidios
de C. albicans, lo que puede ser, al menos en parte, consecuencia de que la manosilación de
la proteína Kre9 es diferente en levaduras e hifas. Además, el anticuerpo tampoco reconoce
C. dubliniensis u otros hongos filamentosos. Por tanto, este anticuerpo podría facilitar la
diferenciación entre las diferentes formas de C. albicans, y entre la infección causada por esta
levadura y por C. dubliniensis.
AA e IB son receptoras de la beca predoctoral del Gobierno Vasco, y AP ha sido beneficiario de la
beca predoctoral de la UPV/EHU.
34
COMUNICACIONES ORALES: SESIÓN III
El complejo SAGA coopera con SWI/SNF en la regulación de la expresión génica mediada por
la ruta de integridad celular CWI
Ana Belén Sanz, Raúl García, Sonia Díez-Muñiz, Jose Manuel Rodríguez-Peña, César Nombela
y Javier Arroyo.
Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid,
IRYCIS, 28040 Madrid, España. absanzsa@ucm.es.
La respuesta transcripcional de la levadura Saccharomyces cerevisiae a situaciones de estrés
de pared está mediada principalmente por la ruta de integridad celular (CWI) a través de
la MAPK Slt2 y el factor de transcripción Rlm1. Una vez activado, Rlm1 interacciona con el
complejo remodelador de cromatina SWI/SNF para dirigir su asociación con los promotores
diana. Allí, SWI/SNF produce el desplazamiento de nucleosomas favoreciendo la entrada de
Rlm1 y en último lugar, de la RNA Pol II.
En este trabajo mostramos como el complejo acetilador de histonas SAGA juega, junto con
SWI/SNF, un papel fundamental en la regulación de la expresión génica en situaciones de
estrés sobre la pared celular. Mutantes saga pertenecientes al módulo con actividad histona
acetiltransferasa (HAT), como gcn5D, ada2D y ada3D, presentan hipersensibilidad a compuestos que interfieren con el correcto ensamblaje de la pared. Además, análisis transcripcionales
a gran escala indican que Gcn5 co-regula junto con Swi3 la mayor parte del programa transcripcional inducido en esta respuesta, a excepción de un grupo de genes que son sólo dependientes del complejo SWI/SNF. Sin embargo, en condiciones de estrés, el complejo SAGA es
reclutado al promotor de todos estos genes de manera Slt2, Rlm1 y SWI/SNF dependiente.
Este proceso no es esencial para el ensamblaje del complejo de pre-iniciación de la transcripción aunque incrementa la tasa de remodelación llevada a cabo por SWI/SNF únicamente
en los genes SAGA-dependientes. Por tanto, en el grupo de genes co-regulados por ambos
complejos, la salida de H3 y el reclutamiento de Rlm1 están completamente bloqueados en
un doble mutante swi3D gcn5D. Estos resultados indican que el complejo SAGA, a través de
su actividad histona acetiltransferasa, coopera con el complejo SWI/SNF para llevar a cabo el
desplazamiento de histonas necesario para permitir la adecuada expresión génica a través
de la ruta CWI.
35
Análisis proteómico del secretoma del hongo patógeno emergente Lomentospora prolificans
Idoia Buldain, Aize Pellon, Aitziber Antoran, Mikel Arana, Maria Jesus Sevilla, Aitor Rementeria,
Fernando L. Hernando y Andoni Ramirez-Garcia.
Fungal and Bacterial Biomics Research Group. Departamento de Inmunología, Microbiología
y Parasitología, Facultad de Ciencia y Tecnología, Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Leioa
48940, España.
Lomentospora prolificans es un hongo emergente que causa infecciones diseminadas con
una elevada mortalidad en pacientes inmunosuprimidos. Esto se debe principalmente a la
situación clínica del paciente, a la multirresistencia del hongo a los antifúngicos disponibles y a
la dificultad de realizar un diagnóstico rápido y certero. En este sentido, las proteínas secretadas
son de especial relevancia a la hora de diagnosticar una infección, ya que se secretan en grandes
cantidades, son accesibles al sistema inmunitario y, además, presentan una menor homología
con las proteínas humanas que las localizadas en el citosol o en la pared celular. Por ello, su
identificación es de gran importancia para seleccionar proteínas específicas y fácilmente
detectables, con el fin de desarrollar nuevas técnicas diagnósticas más sensibles y específicas.
Así, el principal objetivo de este trabajo fue la estandarización de la recogida de proteínas
secretadas por L. prolificans y su caracterización mediante electroforesis bidimensional.
Para la obtención de la fracción que contiene las proteínas secretadas se siguieron dos
metodologías. En primer lugar, se cultivaron 106conidios/ml en caldo Sabouraud dextrosa,
caldo patata dextrosa y medio de extracto de levadura y glucosa, y se recogió el sobrenadante
a diferentes tiempos (3, 7, 14, 21 días). Por otro lado se siguió la metodología empleada por da
Silva et al. (2012) para el hongo patógeno Pseudallescheria boydii. En este caso, tras el cultivo
del hongo en caldo Sabouraud durante 7 días, se recogió el micelio que fue posteriormente
cultivado en PBS-glucosa (1 g micelio/ml) durante 20 h. Tras la concentración y precipitación
de las proteínas obtenidas siguiendo ambas metodologías, se llevo a cabo una comparación
cualitativa y cuantitativa de los extractos. La concentración de proteínas fue medida y la
calidad de los extractos se analizó mediante electroforesis en una y dos dimensiones (2DE).
Los resultados obtenidos indicaron que el cultivo del hongo en caldo Sabouraud durante 14
días y, la metodología descrita en la bibliografía para P. boydii fueron las condiciones óptimas
para la recogida del secretoma de acuerdo a las características de los extractos obtenidos.
Concretamente, con el primer método se obtuvo mayor concentración proteica pero una
mayor diferencia de expresión, obteniéndose una elevada concentración de un reducido
número de ellas. Por otro lado, con la segunda metodología, se obtuvieron extractos con
una expresión de las proteínas más equilibrada y un menor grado de impurezas que puedan
interferir en su posterior análisis mediante 2DE. Por ello, a pesar de la utilidad de ambas
metodologías, el método empleado por da Silva et al. se utilizará para futuros análisis de
acuerdo a la calidad del secretoma obtenido.
La estandarización realizada en este trabajo permitirá que los secretomas obtenidos y
analizados sean utilizados para la identificación de los principales antígenos de L. prolificans,
con el objetivo de buscar nuevas dianas para el diagnóstico y tratamiento.
Referencia: da Silva, B. A. et al. (2012). J. Proteome Res.11 (1), 172–88.
36
Infección pulmonar por Aspergillus fumigatus en un modelo murino. Estudio histológico y
transcriptómico.
Xabier Guruceaga1, Guillermo Ezpeleta3, Saray Etxenagusia1, Mónica Sueiro-Olivares1, Jimena
V. Fernandez-Molina1, Andoni Ramirez-Garcia1, Ana Abad-Diaz de Cerio2, Javier Garaizar2, José
Manuel Aguirre4, Emilio Mayayo5, Fernando Luis Hernando1 & Aitor Rementeria1.
Fungal and Bacterial Biomics Research Group. Departamento de Inmunología, Microbiología
y Parasitología, 1Facultad de Ciencia y Tecnología, 2Facultad de Farmacia, UPV/EHU. 3Servicio
de Medicina Preventiva e Higiene Hospitalaria. Complejo hospitalario de Navarra. Pamplona,
Navarra. 4Unidad de Medicina Oral, Departamento de Estomatología II. Facultad de Medicina
y Enfermería, UPV/EHU.5Unitat de Anatomia Patològica. Facultat de Medicina i Ciènces de la
Salut, Universitat Rovira i Virgili.
e-mail: xguruceaga001@ikasle.ehu.eus / aitor.rementeria@ehu.eus
Antecedentes.
Aspergillus fumigatus es un hongo patógeno productor de conidios capaces de mantenerse
en suspensión en el aire durante largos periodos de tiempo debido a su pequeño tamaño e
hidrofobicidad, convirtiéndolo así en uno de los hongos filamentosos más ubicuos del planeta.
Estos conidios son la forma infectiva del hongo, que a través del tracto respiratorio llegan
a los alveolos pulmonares donde pueden causar distintas patologías en función del estado
inmunológico del individuo que los inhale, siendo la aspergilosis invasora la más grave.
Objetivo.
El objetivo de este trabajo es estudiar el comportamiento de este hongo y su patogenia
durante una infección pulmonar experimental utilizando para ello un modelo de infección
intranasal en ratones inmunosuprimidos.
Métodos.
Se infectaron por vía intranasal con dosis de 107 conidios ratones BALB/c previamente
inmunosuprimidos con dos dosis de ciclofosfamida. Cada día de infección se extrajeron los
pulmones de un animal, a fin de obtener por una parte ARN total de los pulmones y por otra
poder realizar cortes histológicos de los mismos. Este procedimiento se realizó durante los cuatro
días posteriores al momento de la infección y todos los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.
Para el estudio histológico de los pulmones, estos se incluyeron en parafina y se realizaron cortes
de 4 μm de grosor. Posteriormente, se tiñeron con Hematoxilina-Eosina, PAS y tinción de plata
metenamina. Por otra parte, en el estudio transcriptómico se utilizó la micromatriz AWAFUGE v.1
(Agilent-Technology), y los datos obtenidos se analizaron empleando modelos lineales incluidos
en las librerías Bioconductor y limma. Se validaron los resultados de la micromatriz mediante
técnicas de retrotranscripción-qPCR diseñadas al efecto.
Resultados.
El análisis de los resultados de expresión reveló que aproximadamente el 1% del genoma
del hongo estaba diferencialmente expresado con respecto al primer día de infección. Entre
estos genes se encontraban 5 de las principales proteínas con actividad lítica secretadas por A.
fumigatus (Asp f 1, Mep/Asp f 5, DppIV, DppV y ChiB1), las cuales presentaron sobreexpresión en
el primer día de infección. La progresión de la infección por A. fumigatus se verificó mediante la
evaluación macroscópica de los pulmones, que presentaron un aspecto necrótico que aumentaba
37
durante los días de ensayo. El estudio histológico de los mismos, objetivó una degradación de
la arquitectura del parénquima pulmonar con aparición de hifas en el mismo, una reducción
de la cantidad de mucina secretada y una clara angioinvasión mixta. Además de los hallazgos
descritos, se pudo constatar el crecimiento del hongo de manera agrupada y sostenida durante
todo el tiempo del ensayo, lo que se correlacionó con los datos de expresión de un grupo de 21
genes relacionados con la formación y producción de biopelículas, que mostraron una expresión
creciente a lo largo de los días de infección.
Conclusión.
Según nuestros resultados la posible estrategia de virulencia del hongo patógeno A.
fumigatus al alcanzar el tejido pulmonar, se basaría en la combinación de una secreción
inicial de proteínas líticas para la obtención de nutrientes, cuya necesidad va disminuyendo
a medida que avanza la infección, junto con un crecimiento agregado con tendencia a la
posterior formación de biopelículas.
Financiación
Este trabajo ha sido subvencionado por la UPV/EHU (GIU 15/36 y UFI 11/25). Xabier Guruceaga
y Mónica Sueiro-Olivares han sido financiados por La fundación Jesús Gangoiti Barrera y el
Gobierno del País Vasco respectivamente.
38
Fungal endophytes isolated from arid plants of Andalucía: Induction of exclusive antitumoral
and antifungal activities by the addition adsorptive polymeric resins.
Victor González-Menéndez, Nuria de Pedro, Caridad Díaz, Gloria Crespo, Jesus Martin, Clara
Toro, Francisca Muñoz, Carlos Justicia, Francisca Vicente, Fernando Reyes, Olga Genilloud and
José R. Tormo
Fundación MEDINA, Centro de Excelencia en Investigación de Medicamentos Innovadores en
Andalucía, PTS, Granada, Spain;
Arid zones in Andalucía have special edaphological and climatic conditions such as low
rainfall, high sunshine levels and specific lithology where loamy materials and evaporites
abound. Native plant communities from these arid zones possess distinctive characteristics
to survive in these special conditions, which have led to the existence of a high degree of
endemic plants poorly known. It is precisely this singularity which turns them into a potential
source for the isolation of novel fungal pathogens and/or symbionts as well as host-specific
endophytes not described yet. In our study, a total of 346 fungal strains isolated from 54
plant species characteristic of these ecosystems were characterized morphologically, as well
as on the basis of their ITS and 28S ribosomal gene sequences. Fungal strain isolates from
these plants were distributed among 18 orders including Basidiomycetes and Ascomycetes.
Phylogenetic and morphological analysis evidenced the presence of potential new species
within Kabatiella and Selenophoma genera (Dothideales), as well as a potential new genus.
Addition of adsorptive polymeric resins in fungal fermentations can determine the
production of exclusive secondary metabolites providing a tool to consistently generate new
compounds with potential antifungal and antitumoral activities. To evaluate these induction
effects on our collection of Andalusian fungal endophytes, all the strains were grown in four
different media by adding or not the most inducing resins according our previous results
[1]. Antitumoral and antifungal activities of the organic extracts generated from these
endophytes were evaluated against HEPG2 cell line and the human fungal pathogens
Aspergillus fumigatus and Candida albicans. Hit-rates obtained with and without the resins
were compared, and unique actives were selected for further characterization of possible
induced new active natural products.
After chemical dereplication of previously known compounds by LCMS database matching
(e.g. phomasetin or equisetin), the most promising active extracts were classified against a
wider panel of antitumoral and antifungal targets looking for specificities and selectivities.
Five of the strains were scaled-up and fractionated for the purification of their active
components. Twelve compounds were identified by this approach as active secondary
metabolites induced by the presence of adsorptive polymeric resins.
We discuss in this work the suitability of the use of adsorptive polymeric resins as additives
during the generation of collections of extracts from fungal fermentations for Drug Discovery.
Our results also confirm the biodiversity richness of the plants of the Andalucía deserts as
an untapped source of new host-specific fungal strains with the potential to produce new
antitumorals and antifungals.
39
References:
[1] González-Menéndez, V.; Asensio, F.; Moreno, C.; de Pedro, N.; Monteiro, M.C.; de la Cruz, M.;
Vicente, F.; Bills, G.F.; Reyes, F.; Genilloud, O.; et al. Assessing the effects of adsorptive polymeric
resin additions on fungal secondary metabolite chemical diversity. Mycology 2014, 5, 179–191
40
COMUNICACIONES ORALES: SESIÓN IV
Biolixiviación del mineral calcopirita con hongos filamentosos acidotolerantes para la
industria minera
Ronald Huarachi Olivera, 2Eduardo Alvarez Duarte, 1Mario Esparza
1*
Laboratorio de Biomineria, Departamento de Biotecnología. Facultad de Ciencias del Mar y
Recursos Biológicos. Universidad de Antofagasta, Chile.
1
Micologia, Universidad de Chile
*Dirección de correo electrónico: ronald.olivera@uantof.cl
2
Antecedentes:
Los hongos participan en la biolixiviación mediante dos mecanismos: 1º Acumulan iones
metálicos en sus estructuras celulares, manteniendo el equilibrio entre los metales sólidos y
disueltos. 2º Los ácidos orgánicos producidos por hongos, degradan el enlace metal- oxigeno
de los minerales; ambos mecanismos incrementan el porcentaje de recuperación del metal
en procesos de biolixiviación.
Objetivos:
Investigar la biolixiviación de calcopirita con hongos filamentosos acidotolerantes en sistema
estático y en reactor airlift para la industria minera.
Métodos:
Los experimentos de biolixiviación se llevaron a cabo en medio inorgánico 9K con una
densidad de pulpa del 4% en sistema estático y en reactores airlift a temperatura ambiente
durante 68 días, usando 4 tratamientos: T1= Control negativo; T2 = Bacterias; T3=Bacterias +
Hongos y T4= Hongos.
Resultados:
En los tratamientos 2 y 3 se observaron actividades significativas de biolixiviación. En
la biolixiviación estática en T2 se recuperó 476,09 mg/L de cobre con un porcentaje de
recuperación (56,68 %), en T3 se obtuvo una máxima recuperación de cobre (554 mg/L) con
un porcentaje de recuperación (65,97%) y en reactor airlift en T2 se obtuvo una máxima
recuperación de cobre (9623,16 mg/L) con un porcentaje (63,65 %) y en T3 se recuperó 11120,28
mg/L de cobre con un porcentaje de recuperación (73,55%).
Conclusiones:
En biolixiviación con hongos se carece de estudios sobre procesos de recuperación de
metales con hongos usando medios inorgánicos 9K, siendo la mayor parte de estudios de
recuperación de metales con hongos usando medios orgánicos. Por tanto, el presente estudio
indica la utilidad de los hongos filamentosos acidotolerantes en simbiosis con bacterias
ferrooxidantes en la biolixiviación de cobre en medio inorgánico 9K con un porcentaje
de recuperación más alto, siendo un gran potencial para futuros estudios de viabilidad y
desarrollo en la industria minera mejorando los procesos de extracción de metales.
Palabras clave: biolixiviación con Hongos, recuperación de cobre, medio inorgánico 9K.
41
Variación espacio-temporal de la distribución y abundancia del hongo formador de
micorrizas arbusculares (HMA) Scutellospora verrucosa
Alberto Guillén1 , Fernando Serrano1, Isabel Mendoza1, Vicente Sentandreu3 , Juan Bautista
Peris2 , Isabel Arrillaga1
Departamento de Biología Vegetal. ERI BiotecMed, 2Departamento de Botánica, 3Servicio
Central de Apoyo a la Investigación Experimental. Universitat de València. 46100 Burjassot,
Valencia. Spain (guibasal@uv.es)
1
Actualmente se estima que los Hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA) se
encuentran asociados con un 70-90% de las plantas vasculares [1]. Esta simbiosis, entre otros
beneficios, mejora la toma de nutrientes, fundamentalmente fósforo [2].
Este trabajo presenta los resultados del análisis de la distribución y abundancia espaciotemporal de las glomerosporas del HMA Scutellospora verrucosa (Koske & C. Walker) C. Walker
& F.E. Sanders en 6 sistemas dunares levantinos. Las muestras se recogieron en las cuatro
estaciones del año en los hábitats 2110 y 2120, protegidos según el anexo I de la Directiva
92/43/CEE de los sistemas dunares mediterráneos, así como en el ecotono que comparten
ambos hábitats. Las localidades muestreadas, El Saler (Parque Natural de la Albufera), El
Perelló, La Lotería, El Dosel, Sant Antoni y Oliva, pertenecen al golfo de Valencia. Se tomaron
muestras de la rizosfera de cuatro especies asociadas a los hábitat mencionados (Elymus
farctus subsp. farctus (Viv.) Runermark ex Melderis, Ammophila arenaria (L.) Link., Echinophora
spinosa L. y Otanthus maritimus (L.) Hoffmanns & Link). Cabe destacar que en el hábitat 2110,
la única especie vegetal detectada y analizada analizada fue E. farctus.
Para la identificación taxonómica se utilizaron caracteres morfológicos de las glomerosporas
tales como la ornamentación, tamaño, número de capas, etc. Para la identificación molecular
de la especie, se aisló el ADN y la posterior secuenciación se comparó con los datos del
GenBank. Los resultados confirmaron un 99% de identidad con un 99% de cobertura de
la región secuenciada (18S rRNA gen (parcial), ITS1 y 5.8S rRNA) con Scutellospora verrucosa
(syn. Racocetra verrucosa (Koske & C. Walker) Oehl, F.A. Souza & Sieverd), GenBank accesion
FN423704.
La distribución de la especie se restringió al hábitat 2120 y al ecotono. La abundancia de
las glomerosporas de S. verrucosa en los habitats 2120 y ecotono dependió del hábitat (p ≤
0.01) con una mayor abundancia en el habitat 2120 (5.0 % de muestras con S. verrucosa). La
localidad también influyó de forma significativa en la abundancia de la especie de HMA (p ≤
0.000), con una abundancia del 8.6 % de muestras con S. verrucosa en la playa de Sant Antoni
(Cullera). Finalmente, la estación del año también influyó de forma significativa (p≤ 0.001) en
la distribución del HMA estudiado, siendo las frecuencias más elevadas en los muestreos de
invierno y verano (5.5% y 6.6% de muestras con S. verrucosa, respectivamente), coincidiendo
con las épocas de temperaturas más extremas.
Referencias
Brundrett, 2009. Plant Soil, 320, 37-77; [2]Bucher, 2007. New Phytol, 173, 11-26.
Se agradece la beca predoctoral de Alberto Guillén (Subprograma Atracció de Talent de VLCCAMPUS, Universitat de València).
[1]
42
Importancia de los genes RAD51 y RAD52 en la longitud del telómero y en el potencial de Candida
tropicalis
Teresa Meza (Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas ICUAP, México)
Dr. M. Alonso Gil. Coordinación Autonómica de Trasplantes de Andalucía
Centro de Investigaciones en 1Ciencias Microbiológicas, Maestría en microbiología ICUAP, Puebla,
México. Departamento de 2Ciencias Biomédicas, Microbiología, Universidad de Extremadura, España.
Candida tropicalis comparte muchas características con C. albicans. El éxito de estas especies para
causar candidosis se basa en gran medida a su capacidad para adaptarse a distintos nichos en el
hospedero a través de cambios genéticos, principalmente mutaciones puntuales, pérdida de heterocigosidad (LOH) y aneuploidías. La LOH requiere de la recombinación homóloga (HR) donde participa el grupo espistásico RAD52, importante para la reparación de la rotura de la doble cadena (DSB).
La proteína Rad52 actúa como mediador en la invasión de la cadena de ADN por el nucleofilamento
Rad51 a través de su capacidad para catalizar la sustitución de la proteína RPA por Rad51.
Objetivo. Analizar la capacidad patogénica en modelo murino de Candida tropicalis MYA3404
y los mutantes de los genes RAD51 y RAD52.
Materiales y Métodos. Se inocularon grupos de 10 ratones Balb/c machos (18-21g) en la vena
lateral de la cola con la cepa MYA3404, los mutantes rad51ΔΔ y rad52ΔΔ con una suspensión
de células de 1x106. Se detectaron signos de morbilidad durante los 21 días post infección. Al
mismo tiempo se inocularon 9 ratones con una suspensión de células de 1x106, se sacrificaron
a las 24, 48 y 72 horas post infección extrayendo el riñón de cada ratón, pesando y homogenizando. Este homogenizado se sembró en YPD y se contabilizaron UFC.
Resultados. El porcentaje de sobrevivencia para la suspensión de células 1x106 con la cepa
MYA3404 fue del 20%, para los mutantes rad51ΔΔ 70% y rad52ΔΔ 100%. La cepa MYA3404 presento un mayor crecimiento de UFC/g de riñón a las 72h (6.74± 0.33) seguida de rad51ΔΔ (5.08
± 0.02) y por último rad52ΔΔ (2.42 ± 0.70). Los riñones se mostraron mas afectados a los 72 h.
Conclusión. Los resultados demuestran la importancia de las proteínas Rad52 y Rad51 ya que
la ausencia de cualquiera de ellas disminuyen la viabilidad y/o la adaptabilidad de C. tropicalis a diferentes estreses. La ausencia de estas proteínas disminuye la patogenicidad siendo
más marcada en la proteína Rad52 que Rad51 comparada con la cepa MYA3404.
1. Symington, L.S. 2002. Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination
and double-strand break repair. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:630-70.
2. García-Prieto, F., Gómez-Raja, J., Andaluz, E., Calderone, R. y Larriba, G. 2010. Role of the homologous recombination genes RAD51 and RAD59 in the resistance of Candida albicans to UV light,
radiomimetic and anti-tumor compounds and oxidizing agents. Fungal. Genet. Biol. 47:433-445.
Trabajo para cartel
43
Actividad in vitro de carvacrol, cinamaldehído, timol, anidulafungina e isavuconazol contra
biopelículas de Candida.
Autores: Katherine Miranda-Cadena, Cristina Marcos-Arias, Iker De la Pinta-Aresti, Elena Eraso y Guillermo Quindós
Laboratorio de Micología Médica (UFI 11/25-UPV/EHU). Departamento de Inmunología, Microbiología Parasitología. Facultad de Medicina y Enfermería. Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea UPV/EHU. Bilbao, Bizkaia. kmiranda001@ikasle.ehu.eus
Introducción: Las biopelículas de Candida, difíciles de eliminar con los tratamientos antifúngicos convencionales, se asocian con infecciones recalcitrantes. Ello hace necesaria la búsqueda de alternativas terapéuticas contra las candidiasis asociadas a biopelículas.
Objetivos: Evaluar la actividad in vitro de los compuestos carvacrol, cinamaldehído, timol y
los fármacos antifúngicos anidulafungina e isavuconazol contra las biopelículas de Candida.
Materiales y métodos: Se estudió la actividad in vitro de carvacrol, cinamaldehído, timol (Sigma, España), anidulafungina (Pfizer, España) e isavuconazol (Basilea, EEUU) contra las células
planctónicas, contra los estadios iniciales del desarrollo de la biopelícula (fase de adhesión) y
contra la biopelícula preformada de 10 aislamientos orales de Candida, que incluyeron ocho
aislamientos de Candida albicans, un aislamiento de Candida dubliniensis y uno de Candida
tropicalis. C. albicans SC 5314 y la cepa mutante Ca2 no productora de micelio, fueron utilizadas como control.
La actividad in vitro de anidulafungina e isavuconazol contra las células planctónicas de Candida se determinó mediante el método EUCAST de microdilución en caldo. Una modificación
del mismo se utilizó para carvacrol, cinamaldehído y timol. Las biopelículas se desarrollaron
sobre microplacas de poliestireno con diferentes diluciones de anidulafungina e isavuconazol
(0,12-16 μg/ml), carvacrol, cinamaldehído y timol (8-1024 μg/ml) durante 24 h en una incubadora microbiológica Bioscreen C (Labsystems, Finlandia) para evaluar su actividad durante la
fase de adhesión. Las biopelículas preformadas se desarrollaron durante 24 h y posteriormente se añadieron los compuestos antimicrobianos en las mismas concentraciones mencionadas y se evaluó su efecto tras 24 h de incubación. La actividad de los compuestos antimicrobianos sobre las diferentes fases de desarrollo de la biopelícula se determinó cuantificando
la reducción de la biomasa y de la actividad metabólica mediante los métodos de tinción con
cristal violeta (CV) y de reducción de sales de tetrazolio (XTT) a formazán, respectivamente. Se
comparó la disminución de la absorbancia media de la biopelícula tratada con el compuesto
antimicrobiano respecto del control sin tratamiento. La inhibición del crecimiento se expresó
como la concentración mínima inhibitoria a la cual eran inhibidas el 50% de las células planctónicas (CMI), pre-sésiles (CMIPS) o sésiles (CMIS) de cada uno de los aislamientos.
Resultados: Carvacrol, cinamaldehído y timol presentaron actividad contra las células planctónicas de todos los aislamientos estudiados (MG de la CMI de 128 μg/ml, 60,4 μg/ml y 107,6 μg/
ml, respectivamente), incluyendo los aislamientos resistentes a isavuconazol. Anidulafungina
fue activa en la reducción tanto de la biomasa como de la actividad metabólica de la fase de adhesión de todos los aislamientos (MG de la CMIPS 0,1 μg/ml con CV y XTT). Carvacrol, cinamaldehído y timol fueron activos inhibiendo la actividad metabólica de la biopelícula (MG CMIPS
44
107,6 μg/ml; 95,9 μg/ml y 101,6 μg/ml con XTT). Anidulafungina y cinamaldehído redujeron la
actividad metabólica de las células sésiles aunque la producción de la biomasa fue elevada (MG
CMIS 1,1 μg/ml con XTT y 15 μg/ml con CV; 82,3 μg/ml con XTT y 961,5 μg/ml con CV, respectivamente). Carvacrol y timol fueron activos contra la mayoría de la biopelículas preformadas de
los aislamientos estudiados reduciendo tanto la actividad metabólica como la biomasa (MG
CMIS 93,4 μg/ml con XTT y 397,9 μg/ml con CV; 99,5 μg/ml con XTT y 658,8 μg/ml con CV, respectivamente). Isavuconazol mostró menor actividad en la reducción de la biomasa y actividad
metabólica de las células sésiles de la biopelícula preformada (MG CMIS 8,6 μg/ml con XTT y
12,4 μg/ml con CV).
Conclusiones: Carvacrol, cinamaldehído y timol fueron activos contra las biopelículas de Candida. Anidulafungina mostró una excelente actividad contra las biopelículas de Candida mientras
que isavuconazol fue el compuesto menos activo.
Financiación: Este estudio ha sido financiado por la Fundación ONCE «Oportunidad al Talento»,
GIC12 210-IT-696-13 (Gobierno Vasco-Eusko Jaurlaritza) y UFI 11/25 (UPV/EHU).
45
COMUNICACIONES ORALES: SESIÓN V
Complejo Candida haemulonii: identificación y antifungigrama
Jesús Rodriguez-Lozano1, Jesús Agüero Balbín1,2, Carlos Ruiz de Alegría Puig1, Luis MartinezMartinez1,2.
1. Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla - IDIVAL. Santander.
España
2. Universidad de Cantabria. Santander. España.
e-mail: jesrodriguez@humv.es.
Introducción:
El complejo Candida haemulonii (Candida haemulonii (grupo I), Candida haemulonii var.
vulnera. (grupo II) y Candida duobushaemulonii (grupo III)) ha adquirido relevancia en
los últimos tiempos, no tanto por una alta incidencia en los cultivos de muestras clínicas
humanas sino por su notable resistencia a los antifúngicos. El objetivo de este estudio ha sido
comparar varios métodos de identificación de esta especie infrecuente de Candida y diversos
métodos para el estudio de sensibilidad a los antifúngicos.
Material y métodos:
Entre los años 2011 a 2015 se han aislado en nuestro laboratorio un total de 9 cepas de
Candida haemulonii, procedentes de cuatro hemocultivos, dos úlceras cutáneas, un líquido
articular, un exudado de pie diabético y un exudado de herida no quirúrgica. Tomando como
método de referencia la secuenciación de la región ITS para la identificación, se utilizaron
simultáneamente Vitek-MSTM (v3 SARAMIS MS-ID, bioMérieux, France), tarjetas Vitek 2 YST ID
(bioMérieux, France) y API32C (bioMérieux, France).
La sensibilidad antifúngica se testó mediante Vitek 2 (bioMérieux, France) utilizando tarjetas
AST-YS07, y también mediante SensititreTM YeastOne YO10 (TREK Diagnostic Systems, United
Kingdom). Para la interpretación del antifungigrama se utilizaron tanto criterios de EUCAST
como CLSI tomando como referencia los puntos de corte para C. albicans.
Resultados:
Mediante secuenciación se identificaron 4 C. haemulonii (grupo I), 1 C. haemulonii var. vulnera
(grupo II) y 4 C. duobushaemulonii (grupo III). Vitek-MSTM y Vitek 2 identificaron todas las
cepas como C. haemulonii, pero el primero con un porcentaje de identificación del 99.9%
mientras que el segundo lo hizo con un rango de porcentajes entre 92 y 98%. El sistema
API32C identificó a las 24 horas C. haemulonii (grupo I) como C. globosa, C. duobushaemulonii
(grupo III) como C. sake y no identificó C. haemulonii var. vulnera (grupo II). A las 48 horas la
identificación para C. haemulonii (grupo I) se mantuvo el obtenido a las 24 horas en tres cepas
y no identificó una cepa, en el caso de C. duobushaemulonii (grupo III) la identificación cambió
a C. intermedia en dos cepas y no identificó una cepa, para C. haemulonii var. vulnera (grupo
II) no se obtuvo variación del resultado.
Los resultados tanto de Vitek 2como de SensititreTM fueron similares, resultando resistente
todas las cepas tanto a anfotericina B como a los azoles.
46
Conclusiones:
Tanto Vitek-MSTM como Vitek 2 son métodos válidos para identificar el complejo Candida
haemulonii, aunque el primero lo hace con un porcentaje de identificación mayor y en menor
tiempo. Ninguno de los métodos testados identificó las diferentes especies que conforman
el complejo. Hay buena correlación en los métodos testados para realizar el antifungigrama,
confirmándose la resistencia a anfotericina B y a los azoles descrita para esta especie.
47
Infección urinaria de etiología fúngica en pacientes críticos
Begoña Balsera Garrido, Montserrat Vallverdú Vidal, Silvia Rodriguez Ruiz, Silvia
Iglesias Moles, Sulamita Carvalho Brugger, Mar Miralbés Torner, Pili Latre Romero
H. U. Arnau de Vilanova de Lleida. C Rovira Roure 84. 25198 Lleida.
mbbalsera.lleida.ics@gencat.cat
Introducción: La infección de orina es la infección nosocomial más frecuente en las UCIs en
España, según el registro ENVIN. Las Candidas, son el tercer germen más frecuente causante
de infección urinaria relacionada con sonda vesical (ITU-SV).
Material y método: se revisan los datos ENVIN de ITU-SV en los años 2010 hasta 2015, comparando los datos nacionales con nuestra unidad. Se comparan incidencias, el tipo de gérmenes
y dentro de los hongos, el subtipo de Candida.
Resultados: la IUT-SV en las UCIs españolas ha pasado a ser la infección nosocomial más frecuente a pesar de una disminución de incidencia (de 4,18 en 2010 a 3,61 en 2015 infecciones/1000 días de sonda vesical). A nivel nacional los gérmenes más frecuentes productores
de ITU-SV son los bacilos Gram negativos (más de 55%), con discreta tendencia a aumentar; los Gram positivos son el segundo grupo de gérmenes y los hongos el tercero con leve
tendencia a disminuir en incidencia. En nuestra unidad los gérmenes más frecuentes son
también los bacilos Gram negativos pero con tendencia a disminuir, los segundos los Gram
positivos con incidencia más elevada que a nivel nacional y los terceros los hongos con incidencia más baja. A nivel nacional, la mayor parte de las ITU-SV producidas por hongos son por
Candida albicans (50-65%), el segundo por C. glabrata (12-20%) y el resto, con escasa incidencia, es variable en los años estudiados. En nuestra unidad todas las ITU-SV por hongos fueron
producidas por C. albicans.
Discusión: la incidencia de ITU-SV en los últimos años va disminuyendo, aunque ha pasado a
ser la infección nosocomial más frecuente por la disminución de la NAVM y la estabilización
de bacteriemia relacionada con catéter tras la implementación de los programas Zero. Los
factores de riesgo más importantes para ITU-SV por Candida son la diabetes mellitus y el tratamiento previo con antibióticos de amplio espectro. El uso de fluconazol lleva a un aumento
de infecciones por Candida no albicans. La implementación de los programas Zero así como
una política uso de antibióticos y antifúngicos hace que nuestra unidad tenga unas tasas de
IUSV por hongos más bajas que a nivel nacional y sin haber detectado Candidas no albicans
en las ITU-SV de los años estudiados
Conclusión: La ITU-SV son la infección nosocomial más frecuente en UCI, siendo los hongos el
tercer tipo de germen productor y Candida albicans el hongo más frecuente. Los programas
de control de infección nosocomial y la política de control de antibióticos llevan a una disminución de incidencia de ITU-SV y dentro de éstas, disminución de C. no albicans.
48
Bibliografía
• Infección urinaria relacionada con sonda ureteral en pacientes críticos ingresados en UCI.
Datos descripitivos del estudio ENVIN-UCI. F. Álvarez-Lerma, M.P. Gracia-Arnillas, M. Paolomar, P. Olaechea, J. Insausti, M.J. lñopez-Pueyo, J.J. Otal, R. Gimeno, I. Seijas y Grupo de
Investigadores del Estudio Nacional de Vigilancia de Infección Nosocomial en UCI. Med
Intensiva. 2013;37(2):75-82
• Colonización e infección de la vía urinaria en el paciente críticamente enfermo. M.J. Lopez
y J.A: Cortés. Med Intensiva. 2012;36(2):143-151
• Candida urinary tract infections-Epidemiology. J.D. Sobel, J.F. Fisher, C.A. Kauffman, and C.A.
Newman. Clinical Infectious Diseasses 2011;52(S6):S433-S436
• Nosocomial candiduria: A review. T. Lundstrom and J. Sobel. Clinical Infectious Diseasses
2001;32:1602-7
49
Candida tropicalis resistencia a Voriconazol: Mecanismos moleculares e impacto in vivo
Patricia Navarro, Loida López, Javier Capilla, Josep Guarro.
Unitat de Microbiologia, Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, IISPV, Universitat Rovira
i Virgili, Reus, Tarragona, España. Teléfono: + 34 977759381. Fax: +34 977759322. E-mail: javier.
capilla@urv.cat
Antecedentes: Candida albicans es la especie fúngica más frecuentemente aislada en infecciones humanas, sin embargo en los últimos años ha aumentado el número Candida no-albicans involucradas en infecciones humanas como por ejemplo Candida tropicalis. Esta especie
es considerada un patógeno emergente oportunista causante de candidiasis invasiva en individuos inmunocomprometidos asociada a una elevada mortalidad (40% - 70%). Ocupa el
tercer o cuarto puesto de los aislados de Candida spp. más comunes siendo el más frecuente
en la región de Asia Pacífico y el segundo en Latinoamérica. Las equinocandinas y formulaciones lipídicas de anfotericina B son el tratamiento de primera línea para la candidiasis
invasiva, aunque el uso de triazoles es una alternativa en pacientes neutropénicos. Si bien, C.
tropicalis es sensible a la mayoría de antifúngicos de uso clínico, en los últimos años se ha reportado un aumento de aislados resistentes a azoles. La resistencia a azoles en Candida spp.
se relaciona con diferentes determinantes moleculares: (i) Mutaciones en el gen ERG11 que
codifica para el lanosterol 14-α-desmetilasa (diana de los azoles), (ii) sobreexpresión de ERG11
(iii) sobreexpresión de transportadores ABC (ATP- binding cassette (ABC) y transportadores
MFS (major facilitator superfamily). Concretamente en C. tropicalis la sobrexpresión en ERG11
y presencia de mutaciones puntuales no sinónimas, que causan cambios en un aminoácido,
han sido descritas en aislados clínicos resistentes a azoles.
Objetivo: Evaluar la actividad in vitro de voriconazol (VRC) frente a 21 aislados clínicos de C.
tropicalis, así como determinar la eficacia de dicho fármaco en un modelo murino de candidiasis diseminada. Además, estudiar los mecanismos relacionados con la resistencia al VRC
en aquellas cepas resistentes.
Metodología: Se evaluó la actividad in vitro de VRC frente a 21 cepas de C. tropicalis mediante determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de acuerdo al documento
M27-A3 del CLSI, para discriminar entre aislados resistentes (CMI ≥ 1μg/mL) de sensibilidad
intermedia (CMI 0,25-0,5 μg/mL) o sensibles (CMI ≤ 0,12 μg/mL) según los puntos de corte
clínicos propuestos (PCC).
Para el desarrollo de los modelos experimentales se utilizaron grupos de 10 ratones machos
OF-1, que fueron inmunosuprimidos 2 días antes de la infección con 200 mg/kg de ciclofosfamida vía intraperitoneal. Los animales fueron infectados con una suspensión de 1x105 células/animal vía intravenosa y tratados con VRC (40 mg/kg p.o. QD) durante 10 días. La eficacia
del fármaco se evaluó mediante reducción de la carga fúngica en riñón y bazo, y la supervivencia de los animales durante 15-20 días.
50
Resultados: Las CMIs de VRC frente a las 21 cepas de C. tropicalis oscilaron entre 0,06 y 16
μg/mL. Los modelos in vivo, mostraron eficacia del VRC frente aquellas cepas con CMI ≤ 0,25
μg/mL. En aquellas cepas cuya CMI fue superior a 2 μg/mL no mostró eficacia mientras que
frente aquellas cepas con CMI entre 0,5 μg/mL y 1 μg/mL la eficacia fue variable. Nuestros
resultados sugieren buena correlación con los PCC establecidos para C. tropicalis, no obstante
según nuestros resultados el PCC de sensibilidad para VRC estaría en ≤ 0,25 μg/mL en vez de
≤ 0,12 μg/mL establecido tanto en el CLSI como en el EUCAST.
51
Contenido de esporangios aerovagantes del orden Peronosporales en tres ciudades de Extremadura y diferentes factores que influyen en su distribución estacional
Maya Manzano JM1, Muñoz Triviño M1, Tormo Molina R1, Fernández-Rodríguez S2, Silva Palacios
I3, Gonzalo Garijo A4
1. Departamento de Biología Vegetal, Ecología y Ciencias de la Tierra, Universidad de
Extremadura, 06006 Badajoz. jmmaya@unex.es, marinnamt@gmail.com, ratormo@unex.es
2. Departamento de Construcción, Universidad de Extremadura, 10003 Cáceres, santiferro@
unex.es
3. Departamento de Física Aplicada, Universidad de Extremadura, 06006 Badajoz, insilva@
unex.es
4. Sección de Alergología. Hospital Universitario Infanta Cristina 06080.Badajoz, magonzalog@
gmail.com
Introducción. Las especies del orden Peronosporales actúan como agentes causantes de enfermedades en cultivos, algunos de ellos muy importantes económicamente, como el tabaco,
algunas hortalizas o la vid. Además, su influencia en el declive de las encinas en las dehesas,
también conocida como “la seca”, resulta de especial interés por la importancia y aprovechamiento de estos ecosistemas en Extremadura. Con frecuencia, sus propágulos pueden transportarse a través del viento, pudiendo ser recogidos por los captadores aerobiológicos, por
lo que su estudio constituye una herramienta útil para la determinación de los periodos con
mayor riesgo de enfermedad. Los objetivos fueron conocer la distribución estacional de esporangios aerovagantes de especies del orden Peronosporales en tres ciudades de Extremadura
y analizar los principales factores que pueden influir en su distribución, como la meteorología
y las coberturas del suelo.
Material y Métodos. Se utilizaron tres captadores volumétricos Hirst que operaban de forma
continua, recogiendo muestras de la atmósfera de Don Benito (DB), Zafra (ZA y Plasencia (PL),
desde el 01/01/2012 al 31/05/2014 (882 días). Se ha utilizado Petrolatum White (CAS 800903-8) como adhesivo, identificando y contabilizando los esporangios al microscopio óptico
mediante dos barridos longitudinales realizados con el objetivo de 400 aumentos. Los datos fueron obtenidos como valores diarios y horarios en concentraciones de esporangios por
metro cúbico. Los datos meteorológicos fueron suministrados por estaciones de la Agencia
Estatal de Meteorología (AEMET) cercanas a los captadores aerobiológicos. Se calcularon los
coeficientes de correlación de Spearman para comparar las concentraciones con los parámetros meteorológicos. También se analizó la influencia de las coberturas del suelo mediante
una comparación de su distribución con la dirección del viento predominante, usando para
ello software SIG.
Resultados. Los principales usos del suelo en los alrededores de las ciudades estudiadas fueron cultivos de regadío, de cereales y pastizales en DB, encinares y alcornocales junto con
olivares en PL y pastizales, olivares y dehesas de encinas en ZA. Las concentraciones de Peronospora más altas se registraron en PL (0.75 esporangios/m3) y DB (0.63 esporangios/m3),
mientras que las más bajas se registraron en ZA (0.51 esporangios/m3). La concentración au-
52
mentó durante 2013 en DB y PL, mientras que en ZA las mayores concentraciones se obtuvieron durante los primeros 5 meses de 2014. Las máximas concentraciones se registraron
durante la primavera en DB y ZA, mientras que ocurrieron en otoño en el caso de PL. Los análisis de los parámetros meteorológicos mostraron correlaciones positivas estadísticamente
significativas para las tres estaciones con la humedad relativa, negativas con la dirección del
viento para PL y negativas con la velocidad del viento en ZA.
Conclusiones. PL y DB fueron las localidades que registraron la mayor concentración de esporangios. En el primer caso, podría explicarse por la presencia de alcornocales y encinares
que pueden actuar como especies hospedadoras para el desarrollo de estos oomicetos. Las
áreas ocupadas con cultivos de regadío, con la consiguiente disponibilidad de condiciones
húmedas durante la mayor parte del año puede ser la razón de la abundancia en DB. Estos
dos factores pueden ser críticos para explicar las diferencias de concentración de propágulos
aerovagantes de Peronosporales registrados en Extremadura.
53
MESAS REDONDAS
PARALELAS
MESA REDONDA DE MICOLOGÍA MOLECULAR
Utilización de una versión mutante sensible a análogos de ATP para identificar nuevos
sustratos y funciones de la MAPK Slt2 de la ruta de integridad celular de Saccharomyces
cerevisiae
Esmeralda Alonso-Rodríguez, Elena Jiménez, Pablo Fernández-Piñar,
Humberto Martín y María Molina
Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, UCM e Instituto Ramón y Cajal de
Investigaciones Sanitarias (IRYCIS). Plaza de Ramón y Cajal s/n, 28040, Madrid.
molmifa@ucm.es
Las células utilizan las rutas de transducción de señales para detectar, amplificar e
integrar las señales procedentes del exterior y generar una respuesta adecuada, a través
de modificaciones de su patrón de expresión génica o de su actividad celular, con el fin de
adaptarse a las condiciones ambientales. En Saccharomyces cerevisiae existen 5 rutas de
señalización mediadas por MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases). Una de ellas, en
la que interviene la MAPK Slt2, es responsable del mantenimiento de la integridad celular
(ruta CWI) en presencia de un estrés sobre la pared celular (1). Aunque se conocen varios
de los sustratos fosforilados por esta MAPK, existen algunas funciones y respuestas de esta
ruta cuyos efectores no se han identificado todavía. Además, la caracterización funcional
de Slt2 se ha realizado hasta el momento bien mediante deleción del gen o bien mediante
mutación puntual en el sitio catalítico de unión a ATP. Sin embargo, estos mutantes no son
viables si se combinan con mutaciones en genes como FKS1 o GAS1, que codifican una glucan
sintasa y una glucanosil transferasa implicadas en la biosíntesis y maduración del β-1,3
glucano respectivamente, lo que dificulta el estudio de la relación funcional de Slt2 con la
generación de este polímero de la pared celular. Por ello, resulta de gran interés el desarrollo
de estrategias que permitan inhibir una quinasa de manera selectiva y reversible. El grupo
de Shokat describió hace unos años un método químico-genético basado en la modificación
del sitio activo de las proteín quinasas que permite la entrada de análogos voluminosos de
inhibidores de quinasas que bloquean específicamente la actividad enzimática de estas
versiones mutantes y no de la proteína silvestre o de otras quinasas no modificadas (2). Estas
versiones sensibles a análogos (as) también son capaces de acomodar derivados del ATP con
un grupo tiofosfato en la posición ϒ, lo que les permite tiofosforilar selectivamente a sus
sustratos en ensayos quinasa in vitro (2).
En este trabajo describimos el desarrollo de una versión as de la MAPK Slt2, que nos ha permitido estudiar el fenotipo de pérdida de actividad quinasa de Slt2 en combinación con mutaciones gas1Δ y fks1Δ. El efecto más interesante que hemos observado es que cuando se
inhibe Slt2-as con 2,3-DMBPP1 (2,3-dimetilbencil-pirazol-pirimidina 1) en estos mutantes se
produce un incremento significativo en el porcentaje de células con yema pequeña y una deslocalización de la septina Cdc10 que, en lugar de situarse en el anillo, aparece dispersa por el
citoplasma. Esto no ocurre, sin embargo, con otras septinas como Cdc3, ni tampoco se afecta
la localización del anillo de miosina ni el citoesqueleto de actina.
Además, utilizando Slt2-as en ensayos de tiofosforilación con N6-(fenetil)-ATP-ϒ-S en lugar
de ATP sobre 15 posibles candidatos, tanto expresados en E. coli como en las células de levadura, hemos identificado 3 de ellos como nuevos sustratos de esta MAPK: el regulador de
calcineurina Rcn2, el represor de la traducción de tipo 4E-BP Caf20, y la proteína adaptadora
55
de clatrina asociada al aparato de Golgi Gga1 (3). Estas tres proteínas resultan selectivamente
tiofoisforiladas por Slt2-as y además interaccionan físicamente con Slt2 en ensayos de co-purificación.
1. Molina M, Cid VJ and Martín H. 2010. Fine regulation of Saccharomyces cerevisiae MAPK
pathways by post-translational modifications. Yeast 27:503-511
2. Bishop A, Ubersax J, Petsch D, Matheos D, Gray N, Blethrow J, et al. 2000. A chemical switch
for inhibitor-sensitive alleles of any protein kinase. Nature 407:395-401.
3. Alonso-Rodríguez E, Fernández-Piñar P, Sacristán-Reviriego A, Molina M, Martín H. 2016. An
Analog-sensitive Version of the Protein Kinase Slt2 Allows Identification of Novel Targets
of the Yeast Cell Wall Integrity Pathway. J Biol Chem. 291:5461-5472.
56
Regulación de la NDR quinasa Cbk1 durante la transición levadura-micelio de Candida
albicans
Rojo, P1.; Ciudad, T.1; Vázquez de Aldana, C.R2. y Correa-Bordes J1.
1
Departamento Ciencias Biomédicas, Universidad de Extremadura. Avda Elvas sn. 06007,
Badajoz. España.2Instituto de Biología Funcional y Genómica. CSIC/Universidad de Salamanca
jcorrea@unex.es
El Ascomiceto C. albicans forma parte de la microbiota de mucosas en humanos, donde puede
producir infecciones superficiales como las candidiasis vaginales, o infecciones sistémicas
como las candidemias en pacientes inmunocomprometidos. A lo largo de su co-evolución
con el hospedador, este hongo ha desarrollado numerosos programas de diferenciación que
le han permitido adaptarse a las señales ambientales que encuentra en el hospedador. Entre
estos, la transición levadura-hifa es uno de los más estudiados ya que mutantes incapaces de
realizar esta transición dimórfica son avirulentos en modelos de ratón. El crecimiento hifal
se produce en respuesta a numerosas señales ambientales que, a través de varias rutas de
transducción de señales, activan la transcripción de un grupo de genes específicos de hifas
(HSGs) entre los que se encuentran numerosos factores de virulencia.
Las quinasas NDR (Nuclear Dbf2-Related) forman parte del módulo efector de rutas de
señalización implicadas en morfogénesis y control del ciclo celular y que se encuentran
altamente conservadas desde levaduras a humanos. En nuestro grupo hemos puesto de
manifiesto que la NDR quinasa Cbk1 y la fosfatasa Cdc14 son esenciales para el crecimiento
hifal de C. albicans.
En este trabajo ponemos de manifiesto que Cbk1 y Cdc14 interaccionan in vivo a través de la
subunidad reguladora de Cbk1 denominada Mob2. Resultados previos del grupo demostraron
que el complejo Cbk1/Mob2 es sustrato de la Cdk Cdc28. Ahora, demostramos que el estado
de fosforilación de Cbk1 depende el tipo de crecimiento. Al inicio del crecimiento hifal, Cbk1
es desfosforilado por la fosfatasa Cdc14 para ser posteriormente refosforilada por el complejo
Cdk/Ciclina Cdc28/Hgc1 específico de miceliación. El análisis fenotípico de diferentes mutantes
fosfodeficientes de Cbk1 nos permitirá discutir un modelo sobre la relevancia fisiológica de estas
modificaciones postraduccionales del complejo Cbk1/Mob2 durante la transición levadura-hifa.
Este trabajo se ha financiado con las ayudas del Ministerio de Economía y Competitividad
(BFU2012-39910 y BIO2015-7095-C2-2R) y la ayuda a Grupos de Investigación de la Consejería
de Economía e Infraestructuras de la Junta de Extremadura (GR15008). Todas estas ayudas
han sido co-financiadas por el programa FEDER de la Unión Europea.
57
Identificación de nuevos estímulos y componentes reguladores de la ruta de integridad de la
pared celular de Saccharomyces cerevisiae mediante un circuito genético sintético de retroalimentación positiva.
Esmeralda Alonso-Rodríguez, María Molina, Humberto Martín
Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid, IRYCIS Pza de Ramón y Cajal s/n 28040 Madrid. humberto@ucm.es.
La ruta de integridad celular (CWI, Cell Wall Integrity) es esencial para que las células de la levadura S. cerevisiae sobrevivan en condiciones de estrés de la pared celular. Esta vía presenta
una arquitectura integrada por componentes típicos de las rutas de MAPKs: una MAPK, Slt2,
que es activada por las MAPKKs Mkk1 y Mkk2, a su vez fosforiladas por la MAPKKK Bck1. La
señal llega a este módulo de MAPKs a través de la proteín quinasa Pkc1, activada por Rho1. En
esta ruta, los receptores Mid2, Wsc1/2/3 y Mtl1 son los encargados de detectar las alteraciones en la pared celular y, a través de las GEFs Rom1/Rom2, transmitir esta señal a la GTPasa
Rho1. Mkk1 es la principal MAPKK responsable de la activación de Slt2, lo que conduce a la
fosforilación de diversos sustratos. Entre ellos, probablemente el más relevante es el factor
de transcripción Rlm1, responsable de la mayor parte de la respuesta transcripcional que se
genera como mecanismo compensatorio para salvaguardar la integridad de la pared celular,
y que incluye la inducción de genes implicados en biosíntesis de componentes de pared o por
ejemplo en señalización, como MLP1, que codifica un parálogo de Slt2 y uno de los genes que
más se induce en condiciones de activación de la ruta (1).
Con el fin de disponer de una herramienta adicional que nos permita profundizar en la fisiología de la vía CWI hemos desarrollado un circuito genético de retroalimentación positiva de
esta ruta que hemos denominado “IPAC” (Integrity Pathway Amplification Circuit). Este circuito
está compuesto básicamente por el alelo hiperactivo MKK1S386P (2) bajo el control del promotor
de MLP1. Tras la activación de la ruta CWI, el IPAC produce una amplificación continua de la señal, que resulta letal y que por tanto convierte a las células que lo portan en extremadamente
hipersensibles a daños en la pared celular o a estímulos de la ruta. Tras rastrear un centenar de
compuestos, esta hipersensibilidad nos ha permitido identificar la neomicina, el clotrimazol,
el SDS, el EDTA, el cloruro de Litio, el cloruro de Zinc, el cloruro de Cobalto o la difenilhidramina
como activadores de la ruta, así como caracterizar algunas particularidades de estos nuevos
estímulos de la ruta CWI. Por otra parte, hemos rastreado una subcolección de mutantes de
deleción en genes relacionados con señalización, buscando aquellos capaces de aliviar la inhibición del crecimiento que provoca el IPAC en presencia de estímulos de la ruta CWI. Así hemos
identificado entre otros a los mutantes scp160Δ y bud27Δ, afectados en proteínas relacionadas
con la traducción o el metabolismo de RNA, y a sic1Δ, mutado en un gen que codifica un regulador del ciclo celular. En definitiva, mostraremos la utilidad de los circuitos genéticos sintéticos
para incrementar nuestro conocimiento sobre las rutas de MAPKs.
1. Levin DE. Regulation of cell wall biogenesis in Saccharomyces cerevisiae: the cell wall integrity signaling pathway. Genetics. 2011. 189:1145-75.
2. Watanabe Y1, Irie K, Matsumoto K. Yeast RLM1 encodes a serum response factor-like protein that may function downstream of the Mpk1 (Slt2) mitogen-activated protein kinase
pathway. Mol Cell Biol. 1995. 15:5740-9.
58
Grx3/Grx4 interaccionan físicamente con Slt2 formando un complejo necesario en respuesta a
estrés oxidativo en Saccharomyces cerevisiae.
Núria Pujol-Carrión y Mª Angeles de la Torre-Ruiz.
Institut de Recerca Biomèdica de Lleida (IRBLleida).
Av.Alcalde Rovira Roure,80 - 25198 Lleida.
nuria.pujol@cmb.udl.es
Las células eucariotas hacen uso de diversas vías de señalización para responder eficientemente a cambios ambientales. En condiciones aeróbicas, las especies reactivas de oxigeno
(ROS) generan estrés oxidativo causando importantes daños a las diferentes estructuras intracelulares. El hierro es un elemento esencial para todos los organismos, dado que es necesario para llevar a cabo procesos tales como la respiración, biogénesis y reparación del DNA,
metabolismo…entre otros. Por ese motivo, en los diversos sistemas biológicos existen mecanismos que mantienen la correcta regulación de la homeostasis del hierro para así preservar
la supervivencia celular. La vía de integridad celular (CWI) se encarga de detectar y transducir
una amplia variedad de estímulos, entre ellos el estrés oxidativo, en cuyo caso la actividad de
la ruta es esencial para la supervivencia de las células.
Grx3 y Grx4 son dos glutaredoxinas monotiólicas de Saccharomyces cerevisiae que participan
en la homeostasis del hierro regulando la función transcripcional de Aft1 (1,2,3). Existe una
relación funcional entre Slt2, Grx3 y Grx4 con respecto a las funciones de organización del
citoesquelo de actina y biogénesis vacuolar en respuesta al estrés oxidativo (1,4,5).
En este estudio demostramos que la ausencia simultánea de Grx3 y Grx4 causa una elevada
sensibilidad a agentes oxidantes y una notable reducción en la actividad Slt2 en respuesta a
dichos agentes. Además, ambas glutaredoxinas Grx3 y Grx4 interaccionan físicamente con la
MAP quinasa Slt2 (la última quinasa de la ruta CWI) formando un complejo necesario para la
viabilidad celular en respuesta a estrés oxidativo. Resultados “in vivo” e “in vitro” muestran que
Slt2 se une tanto a Grx3 como a Grx4 y que esta unión puede suceder en ausencia de la otra
glutaredoxina, lo que significa que en la célula podemos encontrar complejos integrados por
las tres proteínas que respondan tanto a una estructura heterodimérica (Slt2/Grx3, Slt2/Grx4)
como a una heterotrimérica (Slt2/Grx3/Grx4). Hemos determinado que dichos complejos están
ligados por un cluster Fe/S ya que en ellos intervienen las cisteínas de los centros activos de
cada una de las dos glutaredoxinas, cisteínas específicas de la quinasa Slt2 y el glutatión. Las
interacciones que describimos son relevantes en respuesta a estrés oxidativo, puesto que mutantes puntuales en las cisteínas que participan en la formación de los complejos son sensibles
al peróxido de hidrógeno y a la depleción de glutatión y deficientes en la activación de Slt2.
Además, demostramos que es principalmente la glutaredoxina Grx4 quien regula la fosforilación de Slt2 y afecta a la viabilidad celular en condiciones oxidativas. Así pues, nuestros estudios
contribuyen a ampliar las funciones que ambas glutaredoxinas monotiólicas ejercen sobre la
regulación de la ruta CWI, en concreto sobre la MAPK Slt2, en respuesta a estrés oxidativo.
1. Pujol-Carrion N, Belli G, Herrero E, Nogues A, de la Torre-Ruiz MA.2006. J Cell Sci, 119: 4554-64.
2. Outten CE, Albetel AN. 2013. Curr Opin Microbiol,16: 662-8.
3. Couturier J, Przybyla-Toscano J, Roret T, Didierjean C, Rouhier N. 2016. Biochim Biophys
Acta, 1853:1513-27.
4. Pujol-Carrion N, de la Torre-Ruiz MA.2010. Appl Environ Microbiol, 76:7826-35.
5. Pujol-Carrion N, Petkova MI, Serrano L, de la Torre-Ruiz MA. 2013. Appl Environ Microbiol,
79:6459-71.
59
El polifosfato y su papel en el ciclo celular de Saccharomyces cerevisiae
Samuel Bru, Javier Jiménez Mariana PC Ribeiro y Josep Clotet
Dpto de Ciències Bàsiques, Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, Universitat Internacional
de Catalunya. Barcelona.
El polifosfato es una molécula lineal a base de fosfato inorgánico que puede alcanzar una
longitud de hasta varios cientos de residuos. Está presente en todos los tipos celulares desde
arqueas hasta mamíferos e involucrado en una gran variedad de funciones fisiológicas entre
las que podríamos destacar su papel biosintético en la formación del RNA y de los fosfolípidos, y -se acepta- que es la forma a través de la cual las células almacenan fosfato.
En este estudio presentamos una nueva función del polifosfato en células eucariotas basándonos en la observación de que la cantidad de polifosfato varía en función del ciclo celular
en S. cerevisiae y, en que aquellos mutantes que no pueden sintetizar (vtc4D) o metabolizar
(ppn1D, ppx1D) el polifosfato, presentan alteraciones en la progresión del ciclo celular. Los
mencionados “mutantes en polifosfato”, además, presentan alteraciones en la producción
de nucleótidos e inestabilidad genómica. Por tanto concluimos que las células eucarióticas
requieren la presencia de polifosfato para la duplicación oportuna y precisa de DNA.
60
MESA REDONDA DE MICOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
Mutantes de Candida albicans en la pared celular como potenciales vacunas en el tratamiento de
candidiasis invasivas
María Concepción Martínez-Esparza Alvargonzález, 3Ruth Sánchez-Fresneda Pinto, 2Ana Tapia Abellán,1 Eulogio Valentín Gómez
2
(1) Departemento de Microbiología, Universidad de Valencia. Av Vicente Andrés Estellés s/,
46100-Burjassot (Valencia). Eulogio.Valentin@uv.es. (2) Departamento de Bioquímica, Biología
Molecular (B) e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Murcia,Campus Espinardo
30100-Murcia. maria@um.es, ana.tapia@um.es (3) Departamento de Genética y Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Murcia, Campus Espinardo, 30100-Murcia. Ruth.sanchez1@um.es.
Las candidiasis invasivas son la tercera causa más común de infecciones del sistema circulatorio a nivel mundial. La mortalidad de la candidiasis invasiva supera el 50% de mortalidad,
incluso con terapias antifúngicas adecuadas. De todas las especies de Candida, Candida albicans es la especie más frecuentemente encontrada en episodios de candidemia. C. albicans
es un microorganismo comensal humano y su interacción con el sistema inmunitario juega
un papel importante en el comensalismo y la infección. Las candidiasis sistémicas ocurren de
una manera predominante como consecuencia de prácticas médicas de alto riesgo como el
empleo de cateterismos, terapias que conllevan una inmunosupresión, intervenciones quirúrgicas mayores, enfermedades que afectan al sistema inmunitario, tratamientos prolongados con antibióticos de amplio espectro... En los últimos años, han aparecido publicaciones
acerca del empleo de vacunas contra candidiasis en modelos animales. La pared celular de C.
albicans es la primera estructura que interacciona con las células del hospedador y que protege al protoplasto de los cambios de presión osmótica y a la célula de agentes dañinos que
puedan haber en el medio ambiente. Esta estructura es, posiblemente, la única estructura
que diferencia a la célula fúngica de la célula del hospedador, es por ello que su estudio es
de gran importancia y por lo que polisacáridos de la pared celular, proteínas así como cepas
atenuadas mutantes en factores de virulencia se han investigado como potenciales vacunas.
En el presente trabajo se han empleado mutantes de pared celular avirulentos como posibles
agentes protectores empleando modelos murinos. Se han empleado mutantes de C. albicans
en el gen PIR1 (presentada patente número P201630250), así como otro mutante que denominaremos EVG3 para inmunizar ratonas Swiss CD1. Las ratonas, previamente inoculadas con el
mutante C. albicans pir1Δ/pir1Δ, presentaban una supervivencia del 100% al cabo de 30 días
mientras que las ratonas control (inyectadas con PBS) presentaban una supervivencia del
0% al cabo de 5 días tras ser infectadas ambas con con C. albicans SC5314. Estos resultados en
su conjunto, demuestran que la inmunización con la cepa avirulenta C. albicans pir1Δ/ pir1Δ
protege completamente de la muerte por infección sistémica en modelo murino. En estudios
proteómicos hemos identificado la proteína que denominamos EVG 3 el mutante homocigótico C. albicans evg3Δ/ evg3Δ resultó ser avirulento inyectado vía intravenosa; estudios de
inmunización preliminares realizados con este mutante confieren una inmunización del 40%
de la población; estos datos indican que esta cepa puede ser otro candidato, además de C.
albicans pir1Δ/ pir1Δ, para la inmunización contra C. albicans. Este tipo de investigaciones tienen un indudable interés en el ámbito de la investigación clínico-sanitaria, ya que enfermos
con candidiasis invasora, aparte del peligro vital, suponen unos elevados costes directos ocasionados por su ingreso hospitalario (estancias prolongadas) y costes indirectos derivados.
61
”Este trabajo ha sido financiado por el proyecto PI12/01797, integrado
en el Plan Nacional de I+D+I 2008-2011 y cofinanciado por el ISCIII-Subdirección General de Evaluación y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER)”
62
La homeostasis lipídica: un tema candente en la tolerancia a frío
Francisca Randez-Gil1, Isaac Córcoles-Sáez1†, Francisco Estruch2 y Jose Antonio Prieto1
Departamento de biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (CSIC).
Av. Agustín Escardino, 7. 46980 Paterna (Valencia) randez@iata.csic.es y prieto@iata.csic.es
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universitat de València.
Dr. Moliner, 50. 46100 Burjassot (Valencia) estruch@uv.es
2
Present address: Department of Biological Sciences, Bangor University, Gwynedd, UK i.corcoles@bangor.ac.uk
†
La composición lipídica de la membrana plasmática es clave para numerosos procesos celulares
que dependen de su funcionalidad, desde el trasporte de solutos, la endocitosis o la percepción
y transmisión de señales. La membrana biológica es además, la primera estructura alterada por
la exposición a estrés. Como consecuencia de esto, S. cerevisiae pone en marcha mecanismos
de homeostasis de la membrana, que incluyen mayoritariamente cambios en la composición
lipídica dirigidos a mantener la funcionalidad de esta estructura. Resultados previos de nuestro
grupo han revelado cómo variaciones en el contenido de PI(4,5)P2 mediante mutación del gen
INP51, una 5-fosfatasa de PI(4,5)P2, causan una reducción de la actividad del complejo quinasa
Pho80-Pho85 y de la abundancia de uno de sus substratos, la fosfatidato fosfatasa de levadura
Pah1, una enzima clave en la biosíntesis de trigliceridos y fosfolípidos.
Nuestra hipótesis es que la variación en los niveles de PI(4,5)P2 es percibida como una señal
de estrés de membrana, que dispara mecanismos de regulación y homeostasis de clases y
sub-clases de fosfolípidos y esfingolípidos. Al contrario de lo observado en respuesta a heatshock, la exposición a frío reduce los niveles de PI(4,5)P2. Como resultado, la actividad de Pah1
disminuye y se incrementa la expresión de INO1 y la síntesis de fosfolípidos. Además, el contenido de Orm2 y la localización subcelular de la quinasa Ypk1, reguladores clave en la biosíntesis de esfingolípidos, se altera en respuesta a un descenso de temperatura, sugiriendo una
regulación de la homeostasis de estos lípidos. En conjunto, nuestros resultados suponen un
importante avance en el conocimiento de los mecanismos de homeostasis lipídica y de regulación de las propiedades de la membrana de S. cerevisiae y abren la posibilidad de obtener
levaduras con mayor tolerancia a estrés y nuevos bioproductos e ingredientes basados en
biomasa de levadura o de sus fracciones.
63
Nuevos retos en el estudio de las micotoxinas
Dr. Antonio J. Ramos Girona
Dpto. Tecnología de Alimentos, Unidad de Micología Aplicada, XaRTA-UTPV, Agrotecnio
Center. Universidad de Lleida. ajramos@tecal.udl.es
Las micotoxinas son metabolitos fúngicos secundarios que cuando son ingeridos, inhalados
o absorbidos a través de la piel pueden causar enfermedades, o incluso la muerte, tanto en
hombres como en animales. En estos momentos en la Unión Europea, y para alimentación
humana, solo se encuentran legisladas unas pocas micotoxinas: las aflatoxinas, la ocratoxina
A, la zearalenona, las fumonisinas, la patulina y, dentro del grupo de los tricotecenos, el
deoxinivalenol y las toxinas T-2 y HT-2. En el caso de la alimentación animal sólo se encuentra
regulado el nivel máximo de aflatoxina B1.
Esta ponencia aborda cuatro de los retos a los que se ha de enfrentar el estudio de la
micotoxicología en los próximos años: las micotoxinas emergentes, las micotoxinas
conjugadas, la detoxificación de los piensos contaminados y el efecto del cambio climático.
En cuanto a las micotoxinas emergentes, se trata de un conjunto de micotoxinas recientemente
descubiertas, o cuya importancia se está reevaluando, producidas principalmente por
especies de Fusarium, de las cuales aún se desconocen muchos datos sobre su presencia,
niveles de contaminación y toxicidad, y entre las que destacan la beauvericina, las
enniatinas, la moniliformina y la fusaproliferina. Además, en los últimos años se ha visto que
algunas micotoxinas ya conocidas de antiguo están cobrando una importancia renovada,
conociéndose ahora por ello como “micotoxinas re-emergentes”, entre las que se encuentran
las toxinas producidas por Alternaria spp., y el numeroso grupo de los alcaloides del ergot.
Por otra parte, el descubrimiento de las denominadas “micotoxinas conjugadas”, que son
derivados de las micotoxinas principales cuya estructura ha cambiado debido al metabolismo
de la planta, del hongo, o del procesado de los alimentos, ha hecho reflexionar recientemente
sobre la necesidad de reevaluar los niveles máximos de las micotoxinas legisladas. En
algunos casos se ha visto que la molécula conjugada regenera la toxina original en el tracto
gastrointestinal, lo que en la práctica supone que se puedan estar ingiriendo mayores
cantidades de toxina de la que cabría esperar teniendo en cuenta los análisis de micotoxinas
habitualmente realizados.
En cuanto a la posibilidad de efectuar tratamientos preventivos contra las micotoxinas en
alimentación animal, el Reglamento 386/2009 ha determinado un nuevo grupo funcional
de aditivos para piensos cuya función es la de reducir la contaminación por micotoxinas
mediante la reducción de su absorción, la promoción de su excreción, o la modificación de su
modo de acción. El uso de estos compuestos, principalmente adsorbentes, no significa que se
puedan utilizar piensos que excedan los niveles legales.
64
El último reto al que nos vamos a tener que enfrentar va ligado al efecto que el cambio
climático está teniendo sobre la micobiota predominante en los productos agrícolas. El
cambio hacia una situación con una mayor temperatura, un incremento en el CO2 atmosférico
y un mayor estrés hídrico puede conllevar la sustitución de las comunidades autóctonas de
mohos filamentosos por otras con diferente capacidad para producir micotoxinas, efecto que
va a ser necesario evaluar en el futuro.
Agradecimientos
A.J. Ramos agradece la ayuda prestada por el Ministerio de Economía y Competitividad a
través de los proyectos AGL2014-55379-P y RTC-2015-3508-2 (Proyecto cofinanciado por el
Fondo Europeo de Desarrollo Regional- FEDER).
65
Proteomic analysis of hyperadhesive Candida glabrata and Candida parapsilosis clinical
isolates reveals a core wall proteome and differential incorporation of adhesins.
Ana Moreno-Martínez1, Emilia Gómez-Molero1,2, Albert D. De Boer1, Henk L.
Dekker3, Iker de la Pinta4, Oliver Bader2, Guillermo Quindós4 and Piet W.J. De Groot1
Regional Center for Biomedical Research, Albacete Science & Technology Park, University of Castilla–La Mancha, Albacete, Spain. piet.degroot@uclm.es; 2Institute for Medical Microbiology, University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany; 3Swammerdam Institute for Life Sciences,
University of Amsterdam, The Netherlands; 4Department of Inmunología, Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina y Odontología, Universidad del País Vasco UPV/EHU, Bilbao, Spain.
1
Abstract:
Candida glabrata and Candida parapsilosis are frequent causes of mucosal and life-threatening bloodstream infections in immunocompromised individuals. The cell wall of Candida
plays an important role in the host-pathogen interactions that lead to the establishment of
infections. Attachment to human host tissues or abiotic medical devices is the first step in
this process and is mediated by cell wall-localized adhesins. By analyzing the wall proteomes
of hyper-adhesive clinical isolates using mass spectrometry and comparison to reference
strains, we tested the hypothesis that hyperadhesive isolates display differential incorporation of adhesins. Wall proteome analysis identified a core proteome of about 20 proteins
present in each strain under all analyzed conditions. In addition, proteomic analysis of hyper-adherent strains under biofilm-forming conditions showed (i) higher levels of adhesins
that are also found in the reference strains and (ii) incorporation of novel adhesins that are
not found in the reference strains. Thus, the hyperadhesive capacity of hyper-adherent Candida isolates seems to be correlated with increased and differential incorporation of cell wall
adhesins. Current studies in our laboratory are aimed at performing functional and structural
characterizations of the novel adhesins and at elucidating their role in primary host-pathogen interactions, antifungal drug resistance, and virulence.
This work is supported by grants of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness
(MINECO) [SAF2013-47570-P] and the Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha [PPII2014-007-P].
66
Biosíntesis de ocratoxina A y expresión del gen de la poliquétido sintasa en Aspergillus niger
G. Castellá,M. R. Bragulat, M.L. Abarca y F. J. Cabañes
Grup de Micologia Veterinària, Department de Sanitat i d’Anatomia Animals, Universitat
Autònoma de Barcelona, Bellaterra, España. Gemma.Castella@uab.cat
Aspergillus niger es un hongo que se utiliza en la industria biotecnológica para la obtención
de de ácido cítrico y diferentes enzimas. También se encuentra habitualmente en diferentes
materias primas y alimentos. Algunas cepas de A. niger son capaces de producir ochratoxina A
(OTA), una micotoxina con efectos nefrotóxicos y potencialmente carcinogénica. Actualmente
se conoce poco la ruta biosintética de la OTA y los genes que están involucrados. Entre los
hongos ocratoxigénicos se ha descrito una poliquétido sintasa (PKS) que es necesaria en los
primeros pasos de la síntesis de la OTA. La secuenciación del genoma de la cepa CBS 513.88
reveló la presencia de una PKS muy parecida a la PKS involucrada en la síntesi de OTA de otras
especies ocratoxígenas como A. ochraceus y A. carbonarius. Asimismo, la secuenciación del
genoma de la cepa no ocratoxígena de A. niger ATCC 1015, evidenció una deleción de 21-kb en
dicha PKS. En nuestro laboratorio constatamos que un fragmento de este gen era específico
para las cepas ocratoxígenas de A. niger, estando presente solo en las cepas de A. niger
capaces de producir OTA. En un estudio sobre la funcionalidad de este gen, demostramos que
la expresión de la PKS se correlacionaba con la producción de OTA, pudiéndose detectar un
aumento de su expresión 12 horas antes que el incremento de la concentración de OTA. En
el presente trabajo evaluamos el efecto de tres medios de cultivo y de tres temperaturas de
incubación sobre la producción de OTA y la expresión de la PKS. Los resultados preliminares
muestran que la temperatura óptima de producción de OTA es de 25ºC en el medio YES,
coincidiendo con la expresión máxima del gen de la PKS.
Este estudio ha estado financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad del
Gobierno de España (AGL2014-52516-R).
67
MESA REDONDA DE MICOLOGÍA CLÍNICA 1
Importancia de los cambios taxonómicos en Micología clínica
Ana Alastruey-Izquierdo
Servicio de Micología, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III.,
Majadahonda, Madrid, España.
E-mail: anaalastruey@isciii.es
Durante años los caracteres fenotípicos (macro y microscópicos) han guiado la clasificación
de los hongos. Así, debido a las diferencias morfológicas entre la fase sexual (teleomorfo) y
la asexual (anamorfo), una misma especie de hongo podía tener varios nombres científicos.
Sin embargo la revolución en el campo de la biología molecular y las herramientas de
secuenciación, así como el abaratamiento de sus costes ha provocado que hayamos pasado
de un sistema de clasificación basado en caracteres fenotípicos (observación microscópica)
a basarnos en el estudio de los caracteres genotípicos. De esta manera la taxonomía actual
de los hongos está guiada por las diferencias genéticas estudiadas mediante relaciones
filogenéticas. Esto ha puesto de manifiesto la redundancia del sistema y la necesidad
de consensuar una clasificación en la que una especie de hongo tenga un único nombre
científico. Así en 2011 con la declaración de Amsterdam se llegó al consenso de utilizar un
único nombre para cada especie de hongo. Bajo lema “One Fungus One name” diversos
comités de expertos trabajan desde entonces en la adaptación de estas nuevas reglas a la
práctica micológica. Debido a esto, se han producido numerosos cambios en la nomenclatura
de hongos, afectando a algunas de las especies más frecuentes en infecciones humanas y
que son por tanto relevantes para la práctica de la micología clínica.
68
Importancia del diagnóstico anatomopatológico en las micosis invasoras.
Emilio Mayayo Artal
Catedrático de Patología. URV.
En Medicina, la cualidad fundamental y por la que estamos volcados todos los profesionales
que en ella trabajamos, es devolver la salud a los pacientes. Este hecho se realiza básicamente
por medio del tratamiento. Antes de proceder a activar las terapias pertinentes, es primordial
la realización del diagnóstico. La manera de poder llegar al diagnóstico es muy diversa y por
múltiples metodologías, pero hay dos premisas muy importantes: la rapidez y la precisión. La
rapidez es muy importante para poder aplicar las terapias lo antes posible y la precisión para
actuar con grandes posibilidades de éxito.
Muchas son las etiologías que producen patologías en el ser humano. Excluyendo las genéticas,
tres son las causas que provocan lesiones: los agentes físicos, los agentes químicos y los agentes
biológicos. De ellos, los agentes biológicos son innumerables y cada vez más importantes, ya
que causan un amplio abanico de lesiones, desde leves a muy graves y son causa de elevada
mortalidad, sobre todo en pacientes inmunocomprometidos. Dentro de los agentes biológicos
(microbios), los hongos son un factor a tener muy en cuenta y se les debe considerar una causa
importante de patología en los humanos.
De los dos millones de especies descritas, afortunadamente unas ochocientas son
patógenas, aunque con las metodologías modernas cada vez se están describiendo más con
causantes de lesiones o enfermedades. El profundizar en su estudio es básico para conocer
las peculiaridades de cada especie ya sean morfológicas, diagnósticas o terapéuticas. Los
nuevos avances hacen que se conozcan los pormenores de los hongos, de las micosis y de sus
enfermedades. Esto es primordial en medicina.
Una de las herramientas importantes de cara a precisar el diagnóstico es el estudio
histopatológico de las micosis. De los tres grandes capítulos que tiene la Patología, como son:
la citopatología, la histopatología y el estudio autópsico, son las dos primeras las que deben
tener una consideración especial ya que se realizan sobre enfermos y no sobre fallecidos. Con
una metodología sencilla y realizable en casi la mayoría de servicios de Patología, se puede
llegar a precisar un diagnóstico específico de un gran número de micosis. Será la morfología
expresada en las lesiones la que oriente la especie de hongo. No sólo se especificará la causa
de la patología, también el tipo de lesión que produce, la respuesta inmunológica que activa y
el grado de inmunidad que posee el paciente. Además, muchas veces es la única herramienta
posible para llegar al diagnóstico o bien por no haber realizado los pertinentes cultivos o bien
porque algunos hongos no son cultivables.
Si importante es, como hemos comentado más arriba, la precisión del diagnóstico, más
importante es la prontitud. Así, por medio del estudio citológico se puede realizar en muchas
ocasiones un diagnóstico muy rápido, en menos de diez minutos, lo que en enfermos críticos o
muy críticos es primordial para iniciar una terapia específica con prontitud que puede favorecer
en gran medida al paciente, que a la fin es para el que estamos trabajando en medicina clínica.
69
Epidemiología de la Candidiasis Invasiva (CI)
Montserrat Vallverdú Vidal
Servicio Medicina Intensiva. Hospital Unviersitario Arnau de Vilanova. C/ Avda Rovira Roure, 80,
(25198) Lleida. E-mail: mvallver@gmail.com
En las últimas décadas se ha producido un incremento global de las infecciones fúngica invasoras (EFI) de origen nosocomial y asociadas a cuidados sanitarios a consecuencia de terapias
médicas y quirúrgicas y amplio uso de tratamientos eficaces pero más agresivos.
La mayoría de las EFI están causadas por dos grandes géneros: Aspergillus spp y Candida spp,
pero cada vez son más frecuentes por otros hongos como fusarium spp, Scedosporium spp,
mucorales, Pneumocystis jirovecii y Cryptococcus neoformans.
Las podemos agrupar en oportunistas que pueden ir des de infecciones localizadas a generalizadas y graves, y endémicas habitualmente en áreas geográficas del continente americano.
La candidiasis invasora representan el 80-90% de las EFI nosocomiales aunque en la última
década la incidencia se mantiene estable o incluso ha disminuido, debido a las mejoras tanto
diagnósticas como terapéuticas. Su mortalidad sigue siendo elevada y conlleva consigo un
aumento de los costes, de la morbimortalidad y de la estancia hospitalaria. Sin lugar a dudas
la infección sistémica por Candida spp, con o sin candidemia asociada, es la EFI más frecuente
en todas las latitudes.
Existen más de 100 especies de Candida spp, aunque el 95-97% están producidas por tan sólo
cinco especies que son C. albicans,C. glabrata, C. parapsilosis, C. krusei y C. tropicalis.
En los últimos años se está viendo un incremento de la incidencia de aislamientos de Candida
no albicans, lo que debería invitarnos a la reflexión en el momento de instaurar un tratamiento antifúngico empírico. Hacernos pensar en el riesgo que corren ciertos pacientes, por
ejemplo los tratados previamente con azoles, de ser portadores de alguna de las cepas de las
especies en cuestión, e impulsarnos a controlar estrictamente los catéteres intravasculares,
sobre todo en pacientes que reciben nutrición parenteral.
Los pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos (UCI), son de por si un factor
de riesgo para sufrir dicha enfermedad dado que la mayoría son portadores de disposistivos
como catéteres vasculares, sondas urinarias, ventilación mecánica, están sometidos a terapias de reemplazo renal, nutrición parenteral,… Las tasas de inicdencia de CI según el estudio
EPIC-II en pacientes críticos, oscilan en un 6.9 episodios / 1.000 pacientes.
70
Micosis emergentes: mito o realidad
María Francisca Colom
Facultad de Medicina. Universidad Miguel Hernández. Edifico Muhammad Al Shafra. Lab.
Micología médica. Sant Joan d’Alacant 03550. Alicante
colom@umh.es
Las denominadas enfermedades emergentes y concretamente las enfermedades infecciosas
emergentes, son aquellas cuyos agentes causales son conocidos, pero que recientemente (en
los últimos 20 años), han adquirido un carácter epidémico, mayor incidencia o gravedad, o se
han extendido a regiones en las que antes no existían. Cuando estos procesos son causados
por hongos microscópicos, estamos ante Micosis emergentes.
Es una realidad constatada que en las últimas décadas estamos asistiendo a un importante
cambio en la incidencia y en la causalidad de las tradicionalmente denominadas micosis profundas, es decir, aquellas que afectan órganos y tejidos internos. Este fenómeno se está produciendo por varios motivos bien identificados. Por una parte debido a factores del hospedador, destacando el aumento de población susceptible de padecer procesos infecciosos graves
por microorganismos con débiles mecanismos de virulencia. Por otro los cambios sociales,
con un considerable aumento de las migraciones humanas, lo que facilita la dispersión de
microorganismos y la transmisión entre poblaciones tradicionalmente muy alejadas. También los cambios en el ámbito sanitario, tanto en las capacidades terapéuticas que permiten
a la población una mayor supervivencia, aún con graves problemas de salud, como en el importante desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas con mayor capacidad discriminativa. Por
último, los cambios en los propios agentes causales, destacando el desarrollo de resistencias
a antifúngicos, especialmente a los triazoles.
La aparición de enfermedades fúngicas diseminadas asociadas a alteraciones de la respuesta
inmunológica, tuvo un espectacular inicio en la década de los ’80 con la aparición del sida,
al que se asociaron especialmente infecciones fúngicas por Cryptococcus y Pneumocystis. El
control de esos procesos con la denominada terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA),
hizo caer la incidencia de los mismos casi al mismo tiempo que crecía la detección de candidiasis y aspergilosis invasivas. Estas últimas más relacionadas con afecciones oncohematológicas y pacientes sometidos a terapia inmunosupresora por trasplante de órgano u otras
causas. Desde el inicio del siglo XXI, este último colectivo de individuos constituye el grupo
más importante en riesgo de padecer Infección (o Enfermedad) Fúngica Invasiva (IFI o EFI) y
actualmente los hongos más frecuentemente implicados en estos procesos corresponden a
los géneros Candida, Aspergillus, Fusarium, Lomentospora/Scedosporium y los mucorales. No
obstante, hay que tener también en cuenta un importante incremento en la incidencia de
patología debida a levaduras del filo Basidiomicetos (Trichosporon, Malassezia, Rhodotorula) así como la re-emergencia de Cryptococcus y Pneumocystis. En cuanto a estos últimos, el
estudio y comparación de aislamientos de medio ambiente y clínica de estos hongos, está
desvelando interesantes fenómenos de dispersión, de superviviencia en el entorno natural
y, lo que es más interesante, de su posible persistencia en vías respiratorias de individuos
sanos, como parte del microbioma de los mismos. Estos hallazgos abren un nuevo ámbito de
interpretación de la patogenia de algunas de las EFIs más trascendentes y por tanto, de las
posibilidades de manejo de las mismas.
71
Micosis superficiales: Dermatofitosis y algo mas
María José Linares-Sicilia
Departamento de Microbiología Médica. Facultad de Medicina y Enfermería. Universidad de
Córdoba.mi1lisim@uco.es
Las micosis que afectan a la piel y a las mucosas son las infecciones fúngicas más frecuentes.
A lo largo de la vida un número importante de personas pueden padecer por lo menos una
de estas micosis.
Las micosis superficiales están causadas por hongos que colonizan las capas más superficiales y queratinizadas de la piel, los cabellos o las uñas. Dentro de estas micosis podemos
distinguir tres grandes grupos: Dermatofitosis, Micosis superficiales propiamente dichas y
dermatomicosis. Dentro de los responsables de las dermatofitosis se incluyen tradicionalmente las especies incluidas en los géneros: Trichophyton, Microsporum, y Epidermophyton,
que en las últimas décadas han sufrido algunos cambios taxonómicos. Las formas teleomorfas , perfectas o sexuales de algunas de estas especies se incluyen en el género Arthroderma.
Por ejemplo, La taxonomía actual de Trichophyton mentagrophytes sensu lato es compleja .
Antiguamente, este complejo de especies agrupaba un grupo de dermatofitos con diferentes
variedades antropofílicas y zoofílicas. Actualmente se cree que incluye especies morfológicamente muy similares, solo diferenciadas por técnicas moleculares. Epidemiológicamente
en los dermatofitos se incluyen especies antropofilicas (se contagian a través de personas),
zoofilicas (derivadas del contagio a través de animales) y geofílicas o telúricas (se adquieren
a partir de tierra o suelo contaminados). Actualmente la incidencia de especies antropfílicas
supera a las especies de los otros orígenes. Igualmente en las últimas décadas se ha producido un decrecimiento gradual en la frecuencia de tinea cruris, tinea corporis y tinea capitis.
Paralelamente se ha producido un incremento en la frecuencia de tinea pedis y especialmente tinea ungium.
Las micosis superficiales propiamente dichas, incluye la pitiriasis versicolor , producida por
las especies de hongos levaduriformes lipofilicos del género Malassezia, la más frecuente. La
tiña negra producida por Hartaea werneckii, la piedra negra, producida por Piedraia hortae
y la piedra blanca o trichosporonosis en la que está implicada algunas especies de género
Trichosporon.
Varias especies de hongos levaduriformes, dimórficos o filamentosos septados producen cuadros micóticos cutáneos que se denominan dermatomicosis.
El diagnostico de estas micosis se basa en la visualización directa, aislamiento e identificación por las técnicas tradicionales o quizás, hoy día cada vez más utilizadas, PCR secuenciación de ADN o la espectrometría de masas o MALDI-TOF.
El tratamiento tópico con antifúngicos, tales como terbinafina o azoles (econazol, ketoconazol, clotrimazol, miconazol), se manifiestan eficaces en el tratamiento de estas micosis cuando no afecta al cabello o las uñas. En los casos de lesiones extensas se utiliza tratamiento oral
con itraconazol, fluconazol y terbinafina.
72
MESA REDONDA DE MICOLOGÍA CLÍNICA 2
Nuevos Antifúngicos
Jesús Guinea
Los pacientes con infecciones fúngicas invasoras (IFI) presentan una elevada mortalidad que
se relaciona con el retraso en el inicio de una terapia antifúngica efectiva. La mayoría de
pacientes con IFIs se tratan con polienos, azoles, o equinocandinas; los tres grupos de fármacos difieren en el espectro de actividad antifúngica, las características farmacocinéticas, y su
perfil de seguridad. Los antifúngicos disponibles están limitados por el espectro de actividad,
el aumento de cepas resistentes a antifúngicos, sus características farmacocinéticas, la toxicidad, o su moderada eficacia clínica. Estas situaciones, junto con el aumento del número
de casos de IFI, hacen necesaria la búsqueda de fármacos antifúngicos que superen estas
limitaciones.
Los últimos años no han sido prolíficos en lo que se refiere a la comercialización de nuevas
moléculas. Sin embargo, en este escenario parece estar cambiando puesto que recientemente se ha comercializado nuevas formas de administración de antifúngicos ya disponibles
(posaconazol), se ha aprobado un nuevo azol (isavuconazol) y existen diversas moléculas
pertenecientes a nuevas familias que está en fases preclínicas o en ensayos clínicos en la
actualidad.
El objetivo de esta presentación es revisar los fármacos antifúngicos que han sido recientemente comercializados así como aquellos que están en evaluación en la actualidad y que
probablemente se sumarán al arsenal terapéutico disponible para el tratamiento de las IFIs.
73
Avances en el estudio de la sensibilidad in vitro a los fármacos antifúngicos
Alicia Gómez López
Instituto Carlos III, Madrid
Las pruebas de sensibilidad in vitro a antifúngicos están recomendadas para predecir la respuesta al tratamiento establecido de la infección fúngica de gravedad. También se recomiendan en la realización de estudios en la práctica clínica y en programas de vigilancia epidemiológica para detectar la aparición de resistencias a antifúngicos, que aunque es un problema
menor, está empezando a alcanzar dimensiones a vigilar en algunos países.
La utilidad de estas determinaciones solo puede ser considerada si se dispone de metodologías o procedimientos estandarizados de referencia que permitan comparar resultados
procedentes de distintos laboratorios. Este proceso de estandarización, muy activo durante
los últimos años ha proporcionados a día de hoy, métodos de calidad que han permitido establecer puntos de corte que se están empleando con éxito para interpretar los resultados
generados. El compromiso de los actuales comités internacionales activos en este campo es
el de establecer puntos de corte para todos los antifúngicos y las especies fúngicas que con
mayor probabilidad causan enfermedad fúngica de gravedad.
En los laboratorios asistenciales se utilizan sin embargo, algunos de los muchos métodos
comerciales con validación clínica de más fácil manejo y buena correlación para establecer la
sensibilidad de las cepas fúngicas aisladas, aunque se recomienda confirmar las resistencias
in vitro detectadas mediante procedimientos estandarizados, generalmente disponibles en
centros de referencia.
Es importante además destacar que en los últimos años se han desarrollado herramientas
novedosas, aprovechando nuevas tecnologías para facilitar el estudio de la sensibilidad a antifúngicos. Algunos de estos nuevos métodos, entre los que destacan la citometría de flujo, el
MALDI-TOF, la microcolorimetria isotérmica, son más flexibles, rápidos y ofrecen resultados
útiles para predecir la respuesta a la infección fúngica. Aunque todavía en desarrollo y proceso de validación, pueden suplir las deficiencias de los métodos clásicos y ofrecer importantes
ventajas.
74
Métodos diagnósticos sin base en el cultivo fúngico
Elena Eraso
Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología, Unidad de formación e investigación multidisciplinar ‘Microbios y Salud’ (UFI 11/25), Facultad de Medicina y Enfermería, Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea (UPV/EHU), Bilbao.
elena.eraso@ehu.eus
Las enfermedades fúngicas invasoras son un importante problema debido al aumento
en el número de pacientes susceptibles y su elevada mortalidad. El diagnostico de estas
enfermedades es difícil por la ausencia de síntomas patognomónicos de la enfermedad y
la dificultad para aislar el hongo en cultivo, lo que induce al uso de una terapia antifúngica
empírica. Un diagnóstico micológico precoz es necesario para realizar un tratamiento dirigido
contra el agente etiológico concreto y así mejorar la supervivencia de los pacientes. Debido
a las limitaciones del cultivo microbiológico, la aplicación de técnicas de biología molecular
y la espectrometría de masas (MALDI-TOF) son esperanzadoras. Se han desarrollado técnicas
alternativas al cultivo basadas en métodos inmunológicos o en la detección de componentes
fúngicos estructurales o metabólicos. Entre estas técnicas destacan la detección de ADN
fúngico o de biomarcadores circulantes como el glucuroxilomanano de Cryptococcus, el
galactomanano de Aspergillus, el manano de Candida, el 1,3-beta-D-glucano, componente
presente en numerosos hongos patógenos humanos, o la detección de anticuerpos
antimanano y antimicelio de Candida.
El objetivo del desarrollo de estas técnicas es alcanzar una mayor rapidez, sensibilidad y
especificidad que las técnicas tradicionales, y el reto es que aporten información valiosa
sobre las características más importantes del agente patógeno, como la resistencia potencial
a los fármacos antifúngicos, factores de virulencia u otros datos que mejoren la comprensión
de la patogenia y de la epidemiología de las micosis invasoras.
Algunas de estas técnicas, como la determinación de la mayoría de los biomarcadores
mencionados, están disponibles comercialmente por lo que están al alcance de casi todos los
laboratorios clínicos. Sin embargo otras técnicas como la amplificación y secuenciación de
ácidos nucleicos requieren equipos y métodos más complejos.
La detección directa de ciertos componentes de los hongos en las muestras clínicas permite
un diagnóstico más rápido de la infección invasora que con los métodos basados en el cultivo,
aunque debido a la naturaleza ubicua de los hongos en el medio ambiente es posible la
detección de falsos positivos y los resultados deben ser interpretados en el contexto de los
pacientes y el entorno clínico.
75
Estado actual de los modelos experimentales de micosis invasoras
Javier Capilla
Unitat de Microbiologia, Universitat Rovira i Virgili, IISPV, Reus, España.
1
La problemática actual de las infecciones fúngicas invasoras (IFIs) no difiere en demasía a
la de las últimas décadas. Si bien se han realizado importantes avances en su diagnóstico,
tratamiento y en el establecimiento de guías de actuación frente a las infecciones más
frecuentes en clínica humana, no se ha alcanzado un nivel plenamente satisfactorio. Junto
a las escasas opciones terapéuticas y la falta de nuevos fármacos (los últimos compuestos
comercializados, las equinocandinas, lo fueron en 2001) cabe añadir la emergencia de nuevas
especies patógenas y el incremento de resistencias a los fármacos usados en clínica. El
desarrollo de técnicas diagnósticas específicas, y de predicción del éxito o fracaso terapéutico
son la antesala para la correcta elección y aplicación de tratamientos efectivos que permitan
alcanzar niveles de curación aceptables entre la población afectada. El uso de modelos
animales de infecciones fúngicas ha permitido el avance en el conocimiento de la patogénesis,
respuesta inmunitaria, diagnóstico y tratamiento de dichas infecciones aportando datos
que en numerosas ocasiones equivalen a las observaciones realizadas en clínica humana. Si
bien el uso de animales de experimentación, y especialmente el uso de mamíferos, conlleva
importantes implicaciones éticas, éstos son a menudo la única herramienta disponible para
acercarnos a la realidad en clínica humana, especialmente en el caso de aquellas infecciones
con escasa presencia en la población.
En la presente ponencia se expondrán y debatirán las principales contribuciones que la
experimentación animal al manejo de las IFIs y como puede contribuir a retos futuros.
76
Nuevos métodos de identificación fúngica: el papel relevante del MALDI-TOF
Manuel A. Rodríguez Iglesias
UGC de Microbiología y Enf. Infecciosas, HHUU Puerta del Mar y de Puerto Real, Cádiz
La identificación de los hongos ha estado asociada de forma convencional a la caracterización
fenotípica del crecimiento en medios de cultivo, con la descripción detallada de la morfología macroscópica y microscópica, y la identificación con pruebas bioquímicas en sistemas
manuales o automatizados. Estos procedimientos tienen la limitación de requerir días o semanas, lo que supone un retraso inaceptable en el diagnóstico y la toma de decisiones terapéuticas.
En este escenario ha irrumpido la espectrometría de masas mediante MALDI-TOF revolucionando la rutina de trabajo diagnóstica del laboratorio. Su aplicación en la identificación
fúngica supone obtener resultados en minutos a partir del cultivo. Con procedimientos preparativos de la muestra cada vez más simplificados y bases de datos que son progresivamente actualizadas se obtienen excelentes rendimientos en la identificación de levaduras y se
hacen progresos importantes en la identificación de hongos filamentosos, incluidos los dermatofitos. Existen hasta cuatro sistemas de identificación comercializados (MALDI Biotyper,
Andromas, Saramis y Vitek MS) sobre dos plataformas instrumentales (Bruker y Shimadzu)
que consiguen resultados diferentes en función de sus algoritmos de identificación y la base
de datos utilizada.
La identificación de levaduras supera a los métodos convencionales, aunque requiere mejoras en la identificación de algunos géneros como Cryptococcus y Trichosporon, y permite
discriminar complejos de especies en Candida que aportan nuevos datos sobre especies poco
conocidas en relación con la clínica humana. Sin embargo, es necesario completar las bases
de datos en los hongos filamentosos y dermatofitos. Se obtiene mejor resultado utilizando
bases de datos propias, lo que sugiere la necesidad de un repositorio de acceso libre, similar a
las bases de datos de nucleótidos. Si dichas bases de datos estuvieran ampliamente disponibles, la identificación de hongos basada ​​en MALDI-TOF permitiría comparar con perfiles más
precisos y comprobar la diversidad de especies recuperada en muestras clínicas.
Otras aplicaciones adicionales de MALDI-TOF para el diagnóstico de la enfermedad fúngica se
encuentran actualmente en desarrollo, incluyendo la identificación de hongos directamente
de las muestras de pacientes y los estudios de susceptibilidad fúngica, aunque solo están introducidas para fluconazol y caspofungina en una algunas especies de hongos. La detección
de marcadores de resistencia directamente en los espectros de identificación, así como la
posibilidad de establecer sistemas de tipado abre la posibilidad de realizar el seguimiento y
control en la detección de brotes en la práctica clínica habitual.
En conclusión, la tecnología de MALDI-TOF, con unos sistemas de validación y estandarización
adecuados, será un soporte fundamental en el laboratorio de micología clínica mejorando los
tiempos de respuesta y aportando información trascendente para el manejo de los pacientes.
77
PÓSTERES
1. Modelos invertebrados para el estudio de la candidiasis invasiva producida por especies
del complejo Candida glabrata
Ainara Hernando, Marcelo Ortega-Riveros, Lucia del Río, Estibaliz Mateo-Alesanco, Elena Eraso y Guillermo Quindós
Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología, UFI 11/25 “Microbios y Salud”,
Facultad de Medicina y Enfermería, Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea
(UPV/EHU), Bilbao. ainara.hernando@ehu.eus
Introducción: El complejo Candida glabrata está compuesto por Candida glabrata sensu stricto, Candida nivariensis y Candida bracarensis. Candida glabrata es la segunda o tercera causa
de candidiasis invasora y ha adquirido gran importancia clínica debido a su reducida sensibilidad a algunos fármacos antifúngicos.
Objetivo: Estudiar la virulencia de las especies C. glabrata, C. nivariensis y C. bracarensis en los
modelos invertebrados Galleria mellonella y Caenorhabditis elegans de candidiasis invasiva.
Materiales y métodos: Para realizar el estudio se utilizaron larvas de G. mellonella y la cepa
doble mutante AU37 de C. elegans. La infección se llevó a cabo con las siguientes cepas de
referencia: Candida glabrata ATCC 90030 y NCPF 3203, Candida nivariensis CBS 9984 y CECT
11998 y Candida bracarensis NCYC 3397 y NCYC 3133. Para la infección en G. mellonella se utilizaron inóculos de 1x106 células/ml y se incubaron a 37 ºC. Los nematodos se infectaron por
ingestión durante 2 h y se incubaron a una temperatura de 25 ºC. Se comprobó la supervivencia de los animales cada 24 h, hasta un total de 120 h. La supervivencia obtenida con cada
cepa fue analizada estadísticamente mediante curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y la
estimación de las diferencias entre ellas mediante la prueba log-rank (p≤0,05).
Resultados: La supervivencia de los invertebrados a las 120 h se muestra en la siguiente tabla:
Especie
Cepa
Control sanos
Candida
glabrata
Candida
nivariensis
Candida
bracarensis
Supervivencia en
Galleria mellonella (n)
Supervivencia en
Caenorhabditis elegans (n)
81,9% (344/420)
99,6% (1043/1047)
ATCC 90030
26,7% (16/60)
40,6% (52/128)
NCPF 3203
23,3% (14/60)
63,6% (117/184)
CBS 9984
32,5% (26/80)
75% (138/184)
CECT 11998
43,3% (26/60)
72,9% (132/181)
NCYC 3397
45% (36/80)
97,6% (280/287)
NCYC 3133
51,7% (31/60)
89,4% (161/180)
En todos los casos se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre los invertebrados sanos utilizados como control y los infectados (p≤0,05). La supervivencia tras la infección con las cepas utilizadas en el estudio en el modelo en C. elegans fue superior a la
supervivencia en el modelo en G. mellonella (p≤0,05).
79
Conclusiones: C. glabrata fue la especie más virulenta en los modelos en C. elegans y G. mellonella, mientras que C. bracarensis fue la de menor virulencia. G. mellonella tiene mayor
susceptibilidad a la infección por el complejo de especies de C. glabrata que C. elegans.
Financiación: Proyectos GIC12 210-IT-696-13 (Departamento de Educación, Universidades e
Investigación, Gobierno Vasco), PI11/00203 (Acción Estratégica de Salud 2011, FIS), S-PE13UN121
(Departamento de Industria, Comercio y Turismo, Gobierno Vasco) y UFI 11/25 (UPV/ EHU).
80
2. Aislamientos de levaduras y hongos filamentosos en una unidad de cuidados intensivos
Calleja Fernández R, Bernet Sánchez A, Aixalà Culleré N, Recuero Garcia P, Prieto Labiano J,
Balsera Garrido B, Garcia González M.
Sección de Microbiología del Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida. Avenida Alcalde
Rovira Roure 80,25198 (Lleida). jprieto.lleida.ics@gencat.cat
Objetivo
Revisar los aislamientos de microorganismos levaduriformes y filamentosos en la unidad de
cuidados intensivos (UCI) de nuestro hospital.
Material y Métodos
Revisión retrospectiva de 1 año (2015) de todos los aislamientos de las muestras procedentes
de la UCI de nuestro hospital, que consta de 18 camas. Las muestras se procesaron de forma
convencional y los aislamientos se identificaron por espectrometría de masas (Maldi-Toff,
BRUKER)
Resultados
Aislamos 186 levaduras, siendo el 97 % de todos los aislamientos fúngicos y 5 filamentosos. La
especie más frecuente fue C. albicans (55%), seguida de C. glabrata (15%) y C. tropicalis (13%).
La mayoría de las cepas se aislaron en muestras respiratorias (56%). Otras localizaciones fueron orina (17%), sangre (6%) , liquidos estériles (6%) y otras varias (15%). Se recibieron 537
muestras respiratorias para cultivo, siendo positivas el 20 %: 104 levaduras (C. albicans (48%),
C. glabrata (14%), C. tropicalis (11%), C. parapsilosis (7%), otras (20%) y 5 aspergillus (2 A. terreus,
2 A. fumigatus y 1 Aspergillus sp).
Se recibieron 519 muestras de orina para cultivo, el 6% de las cuales fueron positivas, siendo la especie más frecuente fue C. albicans (62 %), seguida de lejos por C. tropicalis (19%), C. glabrata (6.5%) y C.
parapsilosis (6.5%) y otras (6%). En sangre se aislaron 11 cepas: 3 C. albicans, 3 C. glabrata, 4 C. tropicalis,
1 C. krusei y estos hemocultivos positivos suponen el 1.7% del total de hemos recibidos de uci (635
en total), y el 58% de las fungemias del hospital. Las 4 cepas de C.tropicalis fueron las únicas de esta
especie aisladas de todo el hospital.
Conclusiones
C. albicans es la especie aislada con mayor frecuencia, y lo fue sobre todo en muestras respiratorias. El único hongo filamentoso aislado ha sido Aspergillus sp.
En sangre, cabe destacar los 3 aislamientos de C. glabrata, importante debido a su mayor
resistencia, y las 4 cepas de C. tropicalis.
Desde la implantación de la espectrometría de masas, la identificación microbiológica ha experimentado una notable mejora.
81
3. LaeA y VeA en Alternaria alternata y su potencial como posible diana para controlar el
crecimiento fúngico y la biosíntesis de alternariol y alternariol monometil éter en tomate
Núria Estiarte, Sonia Marín, Vicente Sanchis, Ana Crespo-Sempere y Antonio J. Ramos
Unidad de Micología Aplicada, Departamento de Tecnología de Alimentos, Universitat de Lleida.
UTPV-XaRTA, Centro Agrotecnio. Av. Rovira Roure 191. 25198 Lleida. nestiarte@tecal.udl.cat
La contaminación fúngica de los productos alimentarios en el campo representa un importante problema económico para los agricultores y, a su vez, para la industria alimentaria ya
que, a menudo, la materia prima que se usa en la industria alimentaria llega contaminada
con diferentes tipos de mohos filamentosos, entre los que se encuentran especies de Alternaria. No obstante, por regla general, el riesgo para los consumidores no reside tanto en la
presencia de los mohos, que pueden ser fácilmente destruidos con un tratamiento térmico
sencillo, sino en los metabolitos tóxicos, las denominadas micotoxinas, que éstos pueden
producir. Dos de la micotoxinas que se encuentran con más frecuencia en productos alimentarios son el alternariol (AOH) y el alternariol monometil éter (AME). Para controlar y prevenir
la proliferación de Alternaria en campo se usan fungicidas, los cuales pueden llegar a resultar
ineficaces con el tiempo, ya que los mohos pueden devenir resistentes. Es por ello que es necesario hallar nuevas dianas que permitan desarrollar nuevas sustancias fungicidas.
Con el objetivo de hallar nuevos elementos diana eficaces para controlar la proliferación de
Alternaria y evitar la biosíntesis de sus micotoxinas, en este estudio se ha investigado el papel
que desempeñan los genes veA y laeA en A. alternata. Ambos componentes forman parte
del complejo velvet, el cual se ha observado que está involucrado en diversos procesos fisiológicos en otros géneros fúngicos en respuesta a la luz. Como matriz de crecimiento se han
usado tomates, ya que es una fruta altamente sensible a la contaminación por Alternaria en
el campo, en parte, debido a su piel especialmente fina.
Para estudiar la influencia de VeA y LaeA en A. alternata, se diseñaron sendos mutantes deficientes del gen veA o laeA en dos cepas distintas de A. alternata mediante recombinación
homóloga mediada por Agrobacterium tumefaciens. Las cepas salvajes y los mutantes (ΔveA
y ΔlaeA) de ambas cepas de A. alteranta se inocularon en tomates para estudiar su fenotipo. Los resultados demostraron que ambos componentes influían en el crecimiento fúngico.
Ahora bien, mientras que en una cepa tanto LaeA como VeA favorecían el crecimiento, en la
otra cepa ambos transformantes no mostraron diferencias significativas respecto a las cepas control. También se observaron fenotipos distintos en relación a la biosíntesis de AOH y
AME. Mientras que los mutantes de ΔveA mostraron una significativa reducción tanto de la
producción de AOH como de AME en las dos cepas, los mutantes ΔlaeA mostraron un comportamiento distinto dependiendo de la cepa. Así, en una cepa la producción de micotoxinas
disminuyó mientras que en la otra aumentó. En definitiva, los resultados apuntan que LaeA y
VeA podrían están implicados en el crecimiento fúngico y la biosíntesis de AOH y AME. Será
necesario estudiar más a fondo su papel para determinar su idoneidad como posible diana
para controlar la infección provocada por las especies de Alternaria en campo.
82
4. Caracterización de la adaptación a fluconazole en cepas clínicas de Candida tropicalis
Suelen A. Rossi1, Leticia Bernal-Martínez1, Daniel Agreda-Mellon1, Agustina Forastiero2, Emilia
Mellado1 y Oscar Zaragoza1.
1
Laboratorio de referencia de Micología, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud
Carlos III, Majadahonda, Madrid, España.
2
Servicio de Micología, Hospital Británico de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina.
Candida tropicalis es una levadura patógena que tiene una mortalidad asociada muy
alta, próxima al 50%. Se ha visto que una proporción muy significativa de aislados de C.
tropicalis pueden adaptarse a altas concentraciones de fluconazol, originando el fenómeno
denominado como arrastre o “trailing”. Este fenómeno se da cuando concentraciones de
antifúngico por encima de la concentración mínima inhibitoria (MIC), no logran inhibir
totalmente el crecimiento del hongo. Los mecanismos que están involucrados en el efecto
trailing a fluconazol (FLU) no están caracterizados aunque parecen no estar relacionados
con el genotipo en C. tropicalis o C. albicans. El trailing interfiere en la determinación de
la CMI, algo que dificulta la posible correlación de sensibilidad in vitro - in vivo. Por ello, en
este trabajo caracterizamos el efecto trailing con fluconazol en C. tropicalis y estudiamos
si el efecto en estudio se correlaciona con los resultados in vivo utilizando el modelo de
Galleria mellonella. Para ello, utilizamos un total de 10 aislados clínicos, así como cepas con
mecanismos de resistencia conocidos, (CL6835; TP13650) y sensibles (ATCC 750) a FLU. En
primer lugar, estudiamos si el efecto trailing se observaba con diferentes metodologías de
determinación de sensibilidad antifúngica (EUCAST, CLSI y E-test). Cuando se compararon los
datos obtenidos de la CMI de los aislados con crecimiento residual, se constató que éstos
varían dependiendo del procedimiento utilizado, y que ese fenotipo no está relacionado con
la concentración de inóculo. La secuenciación del gen diana de los azoles (ERG11, 14-esterolα-demetilasa) descartó la presencia de mutaciones que pudieran estar involucradas en el
fenotipo observado. A continuación, investigamos si la adaptación a altas concentraciones
de FLU modificaba la morfología de las células. Para ello, realizamos microscopía in vivo, y
observamos que C. tropicalis es capaz de formar pseudohifas e hifas en ausencia de FLU. Sin
embargo, en presencia del antifúngico, las levaduras crecieron, pero no fueron capaces de
formar hifas. Por otra parte, se ha comprobado que inicialmente el FLU afecta al crecimiento
de los aislados que presentan trailing, y que posteriormente, ese crecimiento se mantiene,
posiblemente porque las células se adaptan al medio con el antifúngico. Por último, datos
preliminares sugieren que larvas del lepidóptero Galleria mellonella infectados con C.
tropicalis (que presentan trailing) responden a dosis terapéuticas de fluconazol. En resumen,
los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que el efecto trailing a FLU en C. tropicalis
ocurre mediante la expresión de mecanismos adaptativos que conllevan alteración en
algunos rasgos fenotípicos, como el tiempo de generación o la morfogénesis. Los resultados
preliminares sugieren que esta adaptación no tendría un efecto significativo en la eficacia
del tratamiento, aunque se requieren nuevos estudios para poder identificar la causa de este
crecimiento residual. Por último, la posible implicación clínica que presenta este fenómeno
plantea la necesidad de estandarizar métodos alternativos de determinación de sensibilidad
antifúngica para especies de Candida que presenten este fenómeno.
83
5. Biosíntesis de ocratoxina A y expresión del gen de la poliquétido sintasa en Aspergillus niger
G. Castellá, M. R. Bragulat, M.L. Abarca y F. J. Cabañes
Grup de Micologia Veterinària, Department de Sanitat i d’Anatomia Animals, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, España. Gemma.Castella@uab.cat
Aspergillus niger es un hongo que se utiliza en la industria biotecnológica para la obtención
de de ácido cítrico y diferentes enzimas. También se encuentra habitualmente en diferentes
materias primas y alimentos. Algunas cepas de A. niger son capaces de producir ochratoxina
A (OTA), una micotoxina con efectos nefrotóxicos y potencialmente carcinogénica. Actualmente se conoce poco la ruta biosintética de la OTA y los genes que están involucrados. Entre
los hongos ocratoxigénicos se ha descrito una poliquétido sintasa (PKS) que es necesaria en
los primeros pasos de la síntesis de la OTA. La secuenciación del genoma de la cepa CBS 513.88
reveló la presencia de una PKS muy parecida a la PKS involucrada en la síntesi de OTA de otras
especies ocratoxígenas como A. ochraceus y A. carbonarius. Asimismo, la secuenciación del
genoma de la cepa no ocratoxígena de A. niger ATCC 1015, evidenció una deleción de 21-kb en
dicha PKS. En nuestro laboratorio constatamos que un fragmento de este gen era específico
para las cepas ocratoxígenas de A. niger, estando presente solo en las cepas de A. niger capaces de producir OTA. En un estudio sobre la funcionalidad de este gen, demostramos que
la expresión de la PKS se correlacionaba con la producción de OTA, pudiéndose detectar un
aumento de su expresión 12 horas antes que el incremento de la concentración de OTA. En
el presente trabajo evaluamos el efecto de tres medios de cultivo y de tres temperaturas de
incubación sobre la producción de OTA y la expresión de la PKS. Los resultados preliminares
muestran que la temperatura óptima de producción de OTA es de 25ºC en el medio YES, coincidiendo con la expresión máxima del gen de la PKS.
Este estudio ha estado financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (AGL2014-52516-R).
84
6. Análisis del aislamiento de aspergillus spp. En muestras no invasivas del tracto respiratorio
inferior en pacientes epoc: significado clínico y pronóstico
Itziar Angulo López, Marina Fernández Torres, José Alberto Espinoza Pérez, Luis Pueyo
Sorribas, María Pía Roiz Mesones.
Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. itzupitzu@gmail.com. Dirección postal: Servicio
de Microbiología, Pabellón 20, 2ª planta, Avda.Valdecilla nº25, 39008, Santander (Cantabria)
Introducción y Objetivos: El aislamiento de Aspergillus spp. en muestras respiratorias no
invasivas se ha considerado habitualmente como contaminación. Sin embargo, cada vez hay
mayor evidencia de que los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)
en grado avanzado constituyen un grupo de riesgo para desarrollar formas invasivas de
aspergilosis1. Nuestros objetivos son:
1) Analizar los aislamientos Aspergillus spp. en las muestras de tracto respiratorio inferior
no invasivas de pacientes con EPOC recibidas en el Servicio de Microbiología de nuestro
hospital.
2) Describir las características clínicas, tratamiento y evolución y determinar los factores
asociados a aspergilosis invasiva probable vs colonización de este grupo de pacientes.
Métodos: Se realizó un estudio retrospectivo de los hongos filamentosos identificados como
Aspergillus spp. entre Enero de 2013 y Abril de 2016 en las muestras de tracto respiratorio
inferior no invasivas de pacientes con EPOC como enfermedad de base. Se revisaron las
historias clínicas para obtener datos demográficos, grado de obstrucción del EPOC (según la
guía de GesEPOC 20122), necesidad de oxígeno domiciliario, ingresos y tratamiento antibiótico
en los 3 meses previos, tratamiento antifúngico recibido y mortalidad. Se clasificaron los
casos en aspergilosis invasiva probable o colonización en función de los criterios de Bulpa
et al.1 Se utilizó la prueba del χ² para determinar la significación estadística de cada factor
asociado a aspergilosis probable vs colonización.
Resultados: Del número total de muestras respiratorias de pacientes con EPOC recibidas en
el período estudiado, se identificaron hongos filamentosos en 96 de ellas. Dichas muestras
correspondían a 69 pacientes. Se aisló A. fumigatus en la mayoría de las muestras (79,2%),
identificándose también A. terreus (12,5%), A. niger (7,3%), A. flavus (1%) y Aspergillus sp. (5,2%).
Los datos demográficos de los pacientes y los factores que se relacionaban con aspergilosis
probable y colonización se recogen en la Tabla 1.
85
Tabla 1.
Sexo
Edad (media ± DE)
FACTORES ASOCIADOS A
ENFERMEDAD
Nº pacientes (% del total, n = 69)
Masculino: 55 (79,7)
Femenino: 14 (20,3)
74,5 ± 11,4
Aspergilosis probable (n = 23)
Colonización (n = 46)
16 (69,6)
25 (54,3)
Oxígeno domiciliario
5 (21,7)
16 (34,8)
Ingresos hospitalarios <3 meses
8 (34,8)
14 (30,4)
Antibiótico amplio espectro <3
meses
8 (34,8)
15 (32,6)
>2 muestras respiratorias con
Aspergillus sp.
9 (39,1)
11 (23,9)
Coinfección bacteriana
5 (21,7)
8 (17,4)
Gravedad de la obstrucción
(Grados III/IV)
Voriconazol: 14 (60,9)
Tratamiento antifúngico
recibido*
Fluconazol: 3 (13)
Anfotericina B: 2 (8,7)
Mortalidad asociada al
episodio*
*p<0,05
10 (43,5)
Voriconazol: 8 (17,4)
Fluconazol: 2 (4,3)
5 (10,9)
Conclusiones: El significado clínico del aislamiento de Aspergillus sp. en las muestras
respiratorias no invasivas de nuestra serie no está totalmente esclarecido, no habiéndose
encontrado factores microbiológicos o clínicos asociados que permitan predecir si realmente
se trata de una colonización o de una probable aspergilosis.
Bulpa, P, Dive A. and Sibille Y. Invasive pulmonary aspergillosis in patients with chronic obstructive pulmonary disease”. Eur Respir J. 2007; 30: 782–800.
1
Guía de Práctica Clínica para el Diagnóstico y Tratamiento de Pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) - Guía Española de la EPOC (GesEPOC).Arch Bronconeumol. 2012; 48 Supl 1:2-58.
2
86
7. Esporas y propágulos fúngicos aerovagantes en la ciudad de Cáceres
Elena María Berciano Ramírez1, Alejandro Monroy Colín1, Santiago Fernández Rodríguez2, José
María Maya Manzano1, Rafael Tormo Molina1, Inmaculada Silva Palacios3, Ángela Gonzalo
Garijo4
1. Departamento de Biología Vegetal, Ecología y Ciencias de la Tierra, Universidad de
Extremadura, 06071 Badajoz. ebercian@alumnos.unex.es, bioamc@outlook.com, jmmaya@
unex.es, ratormo@unex.es
2. Departamento de Construcción, Universidad de Extremadura, 10003 Cáceres, santiferro@
unex.es
3. Departamento de Física Aplicada, Universidad de Extremadura, 06007 Badajoz, insilva@
unex.es
4. Hospital Infanta Cristina, 06080 Badajoz, magonzalog@gmail.com
Introducción. Los bioaerosoles constituyen una parte relevante del total de aerosoles del aire.
Los propágulos fúngicos, incluyendo distintos tipos de esporas, esporangios e hifas, componen
numéricamente la parte más importante. Sus efectos incluyen alergias, micosis, fitopatologías
y biodeterioro. Este estudio pretende una valoración aerobiológica de la presencia de esporas de
tamaño medio (> 15 µm) incluyendo un análisis de su dinámica estacional en el aire de una ciudad
del SW de la Península Ibérica.
Material y Métodos. La captura de esporas aerovagantes se ha realizado utilizando un
captador volumétrico con metodología Hirst (10 litros por minuto de flujo de aspiración). El
adhesivo utilizado ha sido Petrolatum White (CAS 8009-03-8). El muestreo ha sido continuo
durante un año (1/10/2014 - 30/9/2015). Las esporas se han identificado y contabilizado
mediante microscopía óptica con un barrido longitudinal a 400 aumentos de magnificación.
La concentración se proporciona en esporas o propágulos por metro cúbico. Se ha identificado
y contabilizado un total de 21 tipos de esporas y propágulos fúngicos, incluyendo conidios
(Alternaria, Drechslera, Epiccocum, Fusicladium, Pithomyces, Polythrincium, Stemphyllium),
ascósporas (Pleospora), uredósporas, aeciósporas (2 tipos), basidiósporas (Agrocybe, Coprinus,
Cortinarius, Entoloma, Ganoderma, Pisolithus, Russula, Thelephora), además de esporangios
(Peronospora) e hifas fúngicas.
Resultados. La concentración promedio para los tipos fúngicos seleccionados fue superior a
los 100 propágulos/m3. Se observa una marcada estacionalidad, con valores máximos entre
octubre y noviembre y mínimos en enero y febrero. 4 tipos superan los 10 propágulos/m3
en promedio, en orden decreciente: Agrocybe, hifas, Alternaria y Ganoderma. Los conidios
mostraron una distribución bimodal, con máximos en primavera y en otoño (Alternaria,
Drechslera y Fusicladium) o viceversa (Polythrincium, Pithomyces y Stemphyllium), con
valores medios en verano y bajos o nulos en invierno. Las ascósporas de Pleospora también
mostraron máximos primaverales y otoñales, valores medios en verano y mínimos en otoño.
Las aeciósporas aparecieron fundamentalmente en primavera y las uredósporas al final del
verano. Las basidiósporas mostraron máximos casi exclusivamente en otoño. Ganoderma
mostró valores igualmente altos en verano y Pisolithus estuvo presente casi de forma
87
constante todo el año. Los esporangios de Peronospora aparecieron fundamentalmente en
otoño y primavera. Las hifas tuvieron una presencia constante durante todo el período de
estudio, con valores máximos en verano y mínimos en invierno.
Conclusiones. Las esporas y propágulos fúngicos estudiados muestran una estacionalidad
marcada. Otoño en primer lugar y primavera en segundo son los períodos en los que aparecen
los valores más elevados. En invierno se obtuvieron los valores más reducidos. En el caso de
las uredósporas, es finales de verano cuando aparecen los valores más elevados. De los tipos
analizados, las hifas corresponden a los propágulos fúngicos más frecuentes y abundantes.
88
8. Papel de las Fosfolipasas D en la virulencia de Fusarium oxysporum
Dámaris Lorenzo, Loida López-Fernández, Adela Martin, Javier Capilla, Josep Guarro
Unitat de Microbiologia, Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, Universitat Rovira i Virgili,
Reus
1
Fusarium oxysporum es un hongo oportunista para el ser humano capaz de dar lugar a infecciones sistémicas graves en pacientes inmunocomprometidos. Una característica de dichas
infecciones es la dificultad en su tratamiento ya que las especies de Fusarium presentan una
elevada resistencia a los antifúngicos comercializados. Poco se conoce acerca de los factores de virulencia en Fusarium spp. por lo que, la búsqueda y el estudio de factores de patogenicidad involucrados en la infección de mamíferos por F. oxysporum permitirá ampliar el
conocimiento sobre la patogénesis de la fusariosis y por lo tanto diseñar nuevas estrategias
terapéuticas para su control.
Entre la maquinaria enzimática producida por hongos patógenos, las fosfolipasas juegan un
papel importante en patogénesis con funciones variadas como señalización celular, lisis de
membranas lipídicas, regulación de la secreción, adhesión o inmunomodulación de la respuesta del huésped [1]. Se trata de un grupo heterogéneo de enzimas líticas que hidrolizan
fosfolípidos y pueden estar localizadas tanto a nivel extracelulares como intracelular. Entre
ellas algunas fosfolipasas intracelulares han sido recientemente estudiadas en Cryptococcus
neoformans y Aspergillus fumigatus por su implicación en virulencia [2] y en Candida albicans, por su relación con resistencia a antifúngicos y dimorfismo [3, 4].
Mediante un análisis in silico del genoma de F. oxysporum se han identificado doce posibles
genes codificantes de fosfolipasas D ortólogos a la secuencia proteica deducida del gen CAGL0L03135g de C. albicans, identificado como una fosfolipasa D intracelular involucrada en virulencia. Estos resultados revelaron procesos de duplicación génica con un 99 % de identidad
entre diez de las proteínas deducidas en F. oxysporum, mientras dos de las hipotéticas fosfolipasas presentaron mayor divergencia. Con el fin de estudiar el papel de estas fosfolipasas en
la fisiología y virulencia de F. oxysporum, se ha llevado a cabo la deleción de uno de los genes
(FOXG_04151) que no presenta parálogos en el genoma de Fusarium.
En este estudio se demostró la atenuación de la virulencia en cepa defectiva en la fosfolipasa
D (Δpld#159) utilizando un modelo de fusariosis sistémica en ratones infectados en comparación con la cepa silvestre. Además, el mutante Δpld#159 mostró mayor sensibilidad in vitro
a compuestos tóxicos, tales como H2O2, SDS y benomilo. Concluimos que la fosfolipasa D
juega un papel relevante en la virulencia de Fusarium oxysporum que merece ser estudiada
en profundidad.
[1]
Djordjevic JT. Role of phospholipases in fungal fitness, pathogenicity, and drug development - lessons from cryptococcus neoformans. Frontiers in microbiology. 2010;1:125.
Ghannoum MA. Potential role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis. Clinical microbiology reviews. 2000 Jan;13(1):122-43, table of contents.
[2]
89
Romero C, Desai P, DeLillo N, Vancura A. Expression of FLR1 transporter requires phospholipase C and is repressed by Mediator. The Journal of biological chemistry. 2006 Mar
3;281(9):5677-85.
[3]
Vermitsky JP, Earhart KD, Smith WL, Homayouni R, Edlind TD, Rogers PD. Pdr1 regulates multidrug resistance in Candida glabrata: gene disruption and genome-wide expression studies.
Molecular microbiology. 2006 Aug;61(3):704-22.
[4]
90
9. Aspergillus carbonarius: detección temprana de la producción de ocratoxina A in vitro
M. Rosa Bragulat y F. Javier Cabañes
Grup de Micologia Veterinària. Departament de Sanitat i d’Anatomia Animals, Universitat
Autònoma de Barcelona, Bellaterra, Cerdanyola del Vallès.
Rosa.Bragulat@uab.cat
La ocratoxina A (OTA) es una micotoxina nefrotóxica que está presente en un amplia gama
de alimentos y materias primas. Entre las especies productoras de esta micotoxina, Aspergillus carbonarius es la responsable de la contaminación por OTA en uvas pasas y vino en las
principales zonas vitivinícolas del mundo. Aunque la producción de OTA por esta especie es
una propiedad muy consistente, recientemente, en nuestro laboratorio, aislamos cepas no
ocratoxígenas. Existen diversos estudios en los que se ha demostrado la capacidad ocratoxígena en amplios rangos de temperatura, de actividad de agua, de pH o en diferentes sustratos. Con cierta variabilidad en los resultados, la mayoría de autores destacan como valores
óptimos en la producción de OTA las temperaturas de 15 y 25ºC. En general, para determinar
la concentración de OTA acumulada, la extracción suele realizarse desde los 5 días y hasta los
15 o 20 días de incubación. En este estudio se valoró la capacidad de elaboración de OTA por
4 cepas de A. carbonarius, 3 con distinta capacidad ocratoxígena y 1 cepa no productora de
esta micotoxina. Para ello se sembraron en placas con medio Czapek Yeast Extract Agar y se
incubaron a 15º, 25º y 30ºC realizándose las determinaciones a los 3 y a los 30 días de incubación. La detección y cuantificación se llevó a cabo mediante HPLC acoplado a un detector
de fluorescencia. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. De los resultados obtenidos
podemos destacar que a los 3 días se detectó OTA a 25º y 30ºC en los extractos de las 3 cepas
ocratoxígenas. Ninguna elaboró OTA a 15ºC a los 3 días de incubación. Asimismo dichas cepas
presentaron la capacidad de elaborar OTA a niveles elevados a los 30 días a las 3 temperaturas ensayadas. Aunque existió cierta variabilidad en la concentración de OTA detectada, las
3 cepas elaboraron significativamente más OTA a 15ºC que a 25 y 30ºC. No se detectó OTA en
los extractos de la cepa no ocratoxígena a ninguna de las temperaturas ensayadas a los 3 y
30 días de incubación.
Financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2014-52516-R).
91
10. Electrochemical characterization of vegetal species generating symbiotic structures with
fungi forming arbuscular micorrizes
Antonio Doménech-Carbó1, Esteban Guillén1, Alberto Guillén2, Juan Bautista Peris3, Isabel
Arrillaga2
Departamento de Química Analítica, 2Departamento de Biología Vegetal. ERI BiotecMed,
Departamento de Botánica. Universitat de València, 46100 Burjassot, Valencia, Spain
(antonio.domenech@uv.es)
1
3
Identification of plant species is of crucial interest to study the formation of symbiotic
structures with fungi forming arbuscular micorrizes (HMA). This target is attained by means
of chemical biomarkers is a taxonomic strategy which can be performed on the basis of
techniques such as high performance liquid chromatography coupled to mass spectroscopy
(HPLC/MS) and nuclear magnetic resonance. The application of these methodologies
involves extraction pre-treatments, which requires the use of solvents and a relatively long
time of experimentation, as well as relatively sophisticated instrumentation and often
complicated data analysis. Additionally, the relatively long time of analysis may favor the
aerobic degradation of some natural compounds with the concomitant decrease of the
representativity of the analytical data.
In order to complement the existing chemotaxonomic techniques, we applied the voltammetry
of microparticles (VMP) methodology for characterizing vegetal species and varieties from
microparticulate films of ethanolic extracts of leaves. Here, we report the application of this
methodology to characterize vegetal species from extracts of the roots applied to Carpobrotus
edulis (L.) N.E.Br., Ammophila arenaria (L.) Link, and Echinophora spinosa L. The voltammetric
response of the resulting microparticulate deposits on glassy carbon electrodes in contact
with acetate and phosphate aqueous buffers provided well-defined voltammetric patterns.
The voltammetric signals, mainly associated to the oxidation of polyphenolic compounds
(flavonoids, flavones, etc.), exhibited an excellent repeatability and provided a way for
discriminating between vegetal species.
Referentes
Doménech-Carbó A, Ibars, AM, Prieto-Mossí J, Estrellés E, Scholz F, Cebrián-Torrejón G, Martini
M. 2015. Electrochemistry-based chemotaxonomy in plants using the voltammetry of
microparticles methodology. New Journal of Chemistry, 39, 7421-7428.
Ackonwledgement: We thank the grant to Alberto Guillén (Subprograma Atracció de Talent
de VLC-CAMPUS, Universitat de València).
92
11. Evaluación del genotipado por microsatélites en el diagnóstico de candidemia
por Candida parapsilosis sensu stricto asociada a catéter
Camino Trobajo-Sanmartín1, Guillermo Ezpeleta2,3, Emilia Cantón4, Elena Eraso1 & Guillermo
Quindós1
Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología, UFI 11/25 “Microbios y Salud”
Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Facultad de Medicina y Enfermería,
Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea (UPV/EHU), Bilbao. 3Servicio de
Medicina Preventiva e Higiene Hospitalaria, Complejo Hospitalario de Navarra, Pamplona.
4
Unidad de Microbiología Experimental-Centro de Investigación, Hospital Universitario La Fe,
Valencia. Email: camino.trobajo@ehu.eus
1
2
Introducción: Candida parapsilosis es un complejo de especies de levaduras filogenéticamente
relacionado que causa candidiasis invasoras en pacientes con dispositivos intravasculares
(por ejemplo catéteres) y/o nutrición parenteral. Diversos estudios realizados en España han
reflejado un aumento en la prevalencia de las candidiasis causadas por este complejo, con
diferencias epidemiológicas y geográficas.
Objetivo: Determinar la utilidad de la genotipificación de aislamientos de C. parapsilosis
sensu stricto de pacientes con sospecha de candidemia asociada a catéteres mediante
microsatélites o Short Tandem Repeats (STR), con el fin de determinar si la candidemia está
relacionada o no con el catéter.
Materiales y métodos: Se estudiaron aislamientos de 38 pacientes ingresados en
el Hospital Universitario y Politécnico de La Fe de Valencia que presentaron episodios de
candidemia asociada a catéter, de acuerdo con los criterios clínicos establecidos por los CDC,
cuya etiología fue C. parapsilosis sensu stricto, aislándose dicha especie simultáneamente
en hemocultivo y en la punta del catéter. Se realizó la genotipificación mediante el análisis
de los microsatélites de 76 cepas (38 aisladas en hemocultivos y 38 en la punta de catéter)
mediante el protocolo descrito por Sabino y colaboradores (J Clin Microbiol. 2010; 48:16771682) con ligeras modificaciones, empleando un panel de cuatro marcadores (CP1, CP4, CP6 y
B5). El tamaño de los alelos fue determinado automáticamente empleando el software Peak
Scanner 1.0, y la relación filogenética entre cepas se determinó mediante un dendrograma
realizado con el programa versión web POPTREEW (Mol Biol and Evol. 2014 31:1622-1624). Para
el análisis de los datos obtenidos, se definieron dos cepas como iguales cuando mostraron
alelos idénticos para cada uno de los locus estudiados y diferentes cuando presentaron al
menos una diferencia en algún loci. Además se validaron los criterios de definición clínica
de candidemia asociada a catéter tomando como patrón oro los resultados del genotipado
mediante la estimación de su sensibilidad, especificidad, además del cálculo del índice de
concordancia entre ambos procedimientos.
Resultados: En 24 pacientes (63,16%) el genotipo de la cepa aislada tanto en el hemocultivo
como en la punta de catéter fueron idénticos, mientras que 14 pacientes (36,84%) presentaron
genotipos diferentes con diferencias en uno y/o dos marcadores. Sólo uno de ellos presentó
diferencias en todos los loci estudiados. Dos de los 24 pacientes (8,33%) infectados por
genotipos idénticos presentaron realmente una infección policlonal que incluía además del
genotipo aislado en la punta del catéter otro genotipo diferente, lo que sugiere otro origen
93
adicional de la candidemia y /o colonización del catéter. La sensibilidad de los criterios de
diagnóstico clínico fue del 100%, con un valor predictivo positivo del 68,57%. Sin embargo, el
índice Kappa fue tan sólo de un 24,45%.
Conclusión: En nuestro estudio, sólo dos de los pacientes presentó una candidemia policlonal
asociada a catéter por C. parapsilosis sensu stricto. A pesar de la baja concordancia diagnóstica
entre los criterios clínicos y el genotipado para la definición de candidemia asociada a
catéter, nuestros datos sugieren que el genotipado mediante microsatélites presenta buena
capacidad de discriminación y es una herramienta útil en el diagnóstico clínico tanto para el
estudio de brotes intrahospitalarios, como para establecer el origen de una candidemia.
Financiación: Este trabajo ha sido en parte financiado por la Fundación Jesús de Gangoiti
Barrera y los proyectos GIC12 210-IT-696-13, UFI 11/25 (UPV/EHU).
94
12. Papel de la proteólisis en el circuito regulador de la respuesta a estrés catiónico y alcalino
en Aspergillus nidulans.
Eduardo A. Espeso, Laura Mellado Maroñas.
Centro Investigaciones Biológicas. CSIC. Ramiro de Maeztu, 9. 28040 Madrid.
eespeso@cib.csic.es.
La capacidad del hongo Aspergillus nidulans de crecer en medios alcalinos o con altos niveles
de cationes mono o divalentes, requiere de la integridad de la ruta mediada por el factor
transcripcional SltA. Hemos descubierto un segundo elemento en dicha ruta codificado
por el gen sltB. En este trabajo presentamos la relación funcional entre SltB y SltA. SltB es
una proteina señalizadora con dos dominios funcionales bien definidos, pseudoquinasa y
proteasa. La actividad del factor transcripcional SltA está supeditada a la presencia de SltB
en a célula. La proteína SltA se encuentra en tres formas, una de aproximadamente 78kDa
que corresponde a la proteína completa y dos de 32kDa como consecuencia de un corte
proteolítico y de un proceso de fosforilación. La proteina SltB participa en dicho procesamiento
proteolítico mediante su dominio proteasa que es del tipo quimotripsina. Adicionalmente,
descubrimos que la proteina SltB también se proteoliza encontrando separados los dominios
proteasa y pseudoquinasa. Dicho proceso es realizado por el propio dominio de la proteína
SltB. Nuestros datos demuestran que la modificación postraduccional irreversible mediante
proteólisis controlada es un elemento regulador esencial de esta ruta señalizadora y de
respuesta a estrés, la cuál está presente únicamente en hongos del subfilo Pezizomycotina.
95
13. Onicomicosis por hongos filamentosos no dermatofitos. Revisión de seis años (2010-2015).
Freyre Carrillo Carolina, Martínez Rubio Carmen, Rodríguez Iglesias Manuel.
UGC Microbiología. Hospital Universitario de Puerto Real Cádiz. CN IV Km. 665.
C.P.: 11510. E mail: carokarola@hotmail.com
Introducción: La onicomicosis es la causa más común de enfermedad ungueal. Los principales
agentes productores de onicomicosis son los dermatofitos y las levaduras. Sin embargo,
existe un grupo, los mohos filamentosos, muy heterogéneo y de dudosa patogenicidad, dado
que en su mayoría son reconocidos como hongos saprofitos. Por lo tanto, su patogenicidad
debería ser valorada en cada caso. La prevalencia de este tipo de gérmenes es muy variable,
pudiendo oscilar del 1% al 22%, atendiendo a diferencias geográficas y criterios diagnósticos.
Objetivo: Analizar los aislamientos de hongos causantes de onicomicosis durante un periodo
de seis años (2010-2015) en el área sanitaria de Puerto Real, con especial interés en el grupo
de los hongos filamentosos no dermatofitos.
Material y métodos: Las muestras ungueales fueron tomadas y cultivadas directamente en la
consulta de dermatología de nuestro centro (en medios de cultivo Saboureaud-cloranfenicol
y Saboureaud-cloranfenicol-cicloheximida, Becton Dickinson) o en Atención Primaria,
procediéndose en esos casos a la siembra en el Laboratorio. En todos los casos, las muestras
se incubaron durante 4 semanas a 25º C. La identificación se realizó teniendo en cuenta las
características macroscópicas y microscópicas.
Resultados: Se han procesado en el Laboratorio de Microbiología un total de 459 peticiones
correspondientes a 426 pacientes con sospecha de infección ungueal (indistintamente
de muestras de las manos o pies). La mayor parte de las muestras fueron de mujeres, en
una proporción 2,2:1 (293 vs 133 de hombres). La media anual de muestras recibidas se ha
mantenido constante durante los años 2010-2013, con un valor de 69 muestras/año, cifra que
se ha incrementado en los dos últimos años a 101 muestras/año. Precisamente en los años
2014 y 2015, el porcentaje de muestras positivas ha aumentado ligeramente de 39% a 48%
de media. El total de muestras con cultivo positivos fue de 181 (39%), registrándose además
19 muestras contaminadas (4%), y 260 con resultado negativo (57%). En cuanto a la etiología
de los agentes implicados, destacan en primer lugar las levaduras, con un 59% de los casos,
fundamentalmente C. parapsilosis (27%), seguido por los dermatofitos (21%), entre los que
predominan los del género Trichophyton (87%), (la mitad de los cuales son T. rubrum), y por el
grupo de hongos filamentosos no dermatofitos (35 aislamientos, 19%). Dentro de este último
grupo, los gérmenes aislados fueron: 16 Aspergillus spp (46%), de los cuales el mayoritario es,
con 10 casos, A. níger (62.5%), 8 Acremonium spp (23%), 7 Penicillium spp (20%) y 4 Scopulariosis
brevicaulis (11%).
96
Conclusiones:
1. Las onicomicosis en nuestro medio son producidas fundamentalmente por especies del
género Candida, con predominio de Candida parapsilosis.
2. Entre los dermatofitos, predominan los del género Tricophyton, sobre todo a expensas de
T. tubrum (50%).
3. Los hongos filamentosos no dermatofitos ocupan un porcentaje importante de nuestros
aislamientos (19%), lo cual coincide con las publicaciones de otros autores de nuestra
misma área geográfica.
4.Los aislamientos de Aspergillus spp suponen el 9% de todas las muestras de uñas con
resultado positivo.
5. Una correcta toma de este tipo de muestras, así como el envío de muestras repetidas en
los casos de aislamientos de microorganismos de dudosa significación, nos ayudaría a
poder establecer mejor los criterios de análisis y por lo tanto optimizar el diagnóstico de
las onicomicosis.
97
14. Interacción funcional entre las rutas de MAP quinasas de integridad celular y TORC2 en
Schizosaccharomyces pombe.
Marisa Madrid, Beatriz Vázquez-Marín, Alejandro Franco, Teresa Soto, Elisa Gómez-Gil, Jero
Vicente-Soler, Mariano Gacto y José Cansado.
Grupo de Fisiología de levaduras. Departamento de Genética y Microbiología. Universidad de
Murcia. Campus de Espinardo 30071 Murcia. jcansado@um.es
La diana de rapamicina (TOR) y las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) constituyen rutas de señalización esenciales que en los organismos eucariotas regulan procesos
clave relacionados con el control del crecimiento, la proliferación, y la adaptación celular en
respuesta a cambios ambientales intra- y extracelulares. Por tanto, no parece sorprendente
que ambas rutas interaccionen in vivo, tal como se ha demostrado en el caso del complejo
TORC1 y las MAP quinasas de las familias ERK o p38. Sin embargo, el conocimiento actual sobre la posible interacción funcional entre MAP quinasas y el complejo TORC2 es mucho más
limitado. La levadura Schizosaccharomyces pombe es un modelo particularmente útil para
el estudio de la señalización mediada por TORC2, ya que a diferencia de otros sistemas, los
mutantes carentes de componentes fundamentales de este complejo son viables. Además, la
activación de TORC2 en este organismo es llevada a cabo por la Rab GTPasa Ryh1, un ortólogo
a Rab6 en células superiores que regula el tráfico de proteínas en el aparato de Golgi, y que
constituye el único activador de TORC2 conocido hasta la fecha perteneciente a esta clase de
proteínas.
En este trabajo describimos que TORC2 y la ruta de MAP quinasas integridad celular (una
de las tres rutas de MAP quinasas presentes en S. pombe) interaccionan funcionalmente a
distintos niveles de forma positiva y negativa durante el crecimiento celular, en respuesta
al ayuno de glucosa, y tras el daño en la pared celular. En estas condiciones la AGC quinasa
Gad8, ortóloga a AKT en organismos superiores y principal diana de TORC2, promueve el incremento de la síntesis de la isoforma de PKC Pck2 y la consecuente activación de Pmk1, la
MAP quinasa de la ruta de integridad celular en este organismo. Este novedoso proceso necesita la cooperación del complejo TORC1 y su diana la S6 quinasa Psk1, y es realizado desde el
ribosoma mediante un mecanismo independiente de la función de la proteína ribosomal S6.
Sorprendentemente, Ryh1 también activa la ruta de integridad celular mediante un mecanismo independiente de TORC2, y que implica la modulación de los niveles de PI(4,5)P2 y la
correcta localización en la membrana plasmática de activadores aguas arriba del módulo
de MAP quinasas como Ksg1 (PDK), Rgf1 (GEF de Rho1) y Pck2. Además el metabolismo de
fosfoinosítidos desencadena la activación de la señalización mediada por TORC2-Gad8. Por
último, una vez activado, Pmk1 regula negativamente a TORC2 actuando aguas arriba de Ryh1
e independientemente de su ciclo de activación/desactivación. Este mecanismo de regulación negativa permite la supervivencia celular en respuesta a cambios en el metabolismo de
fosfoinosítidos. En resumen, nuestros resultados ponen de manifiesto como la regulación
interdependiente de la señalización por MAP quinasas y TOR juega un papel esencial durante
la adaptación celular frente a situaciones adversas.
98
15. Revisión Bibliogràfica: Estudios sobre los procesos de biolixiviación con hongos para la
industria minera
Ronald Huarachi Olivera, 2Eduardo Alvarez Duarte, 1Mario Esparza
1*
Laboratorio de Biomineria, Departamento de Biotecnología. Facultad de Ciencias del Mar y
Recursos Biológicos. Universidad de Antofagasta, Chile.
1
Laboratorio de Micología, Universidad de Chile
*Dirección de correo electrónico: ronald.olivera@uantof.cl
2
Los procesos de biolixiviación se basan en la capacidad de los microorganismos (tales
como bacterias y hongos) en transformar los compuestos sólidos en elementos solubles y
extraíbles que se puedan recuperar. Por tanto, los hongos son buenos agentes lixiviantes
acumulando en sus estructuras celulares el ion metálico de la solución manteniendo el
equilibrio entre los metales sólidos y disueltos, favoreciendo la solubilización continua del
metal, llegando a incrementar el porcentaje de recuperación del metal por la acidez generada
por los metabolitos celulares (ácidos orgánicos) de los hongos implicado en la degradación
del enlace metal - oxígeno de los minerales. La mayoría de los estudios sugieren que los
ácidos orgánicos como el ácido cítrico y el ácido oxálico, son los principales metabolitos
orgánicos producidos por los hongos heterótrofos, cumpliendo un papel fundamental en
la biolixiviación de metales a partir de minerales oxidados. Los hongos heterotróficos tales
como las especies de Aspergillus y Penicillium revelan un efecto positivo en la aceleración
del proceso de biolixiviación en biominería. Generalmente, el mecanismo de la biolixiviación
de hongos se basa en la excreción de ácidos orgánicos en el proceso de acidólisis. Los
hongos acidifican el medio de crecimiento durante el crecimiento en compuestos orgánicos
(excreción de protones, la absorción de nutrientes a cambio de protones, la excreción de
ácidos orgánicos, y la acidificación por la formación de dióxido de carbono).
El objetivo fue conocer el estado del arte de los procesos de biolixiviación con hongos para
la aplicación en la industria minera. Para ello se realizó una búsqueda en las bases de datos
Web of Science y Scopus para los periodos 1943-2016, utilizando un perfil de búsqueda con las
palabras bioleaching, fungi, mycohidrometallurgy, heterotrophic microorganisms, acidolysis,.
Se encontraron 20 trabajos investigativos sobre el tema en consideración utilizando medios
de cultivos orgánicos favorables para el crecimiento de los hongos, notando que existe un
gran déficit en la biolixiviación de metales con el uso de medios inorgánicos, siendo muy
importantes en áreas de estudio como la Micohidrometalurgia. Por otro lado, no se ha
abordado mucho sobre estudios de biolixiviación con hongos en sistema estático (simulando
el proceso en pilas) y en biorreactores. Esto implica que existe un gran desafío en poder
conocer la capacidad de biolixiviación con hongos frente a la capacidad de biolixiviación con
bacterias en diferentes sistemas.
Palabras clave: Biolixiviación, Hongos, Micohidrometalurgia.
Agradecimientos: Ronald Huarachi Olivera es becario del programa de Magister en Biotecnología de la Universidad de Antofagasta, Chile. Este estudio es financiado por el Fondo de
Investigación para Tesis 2015 MEM; ATI15-02/ ATI15-03.
99
16. Revisión de los aislamientos fúngicos de muestras clínicas en un Hospital Universitario
Prieto J, Cruellas ML, Lupiañez A, Bernet A, Calleja R, Galán B, García M
Sección de Microbiología del Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida. Avenida Alcalde Rovira Roure 80,25198 (Lleida). jprieto.lleida.ics@gencat.cat
Objetivo
Revisar los aislamientos fúngicos de 2015, y ver si existen diferencias respecto a los datos de
2005 en la región sanitaria de Lleida.
Material y métodos
Hemos realizado un estudio descriptivo retrospectivo de 2 años, con un intervalo de 10 años
(2005 y 2015) de los aislamientos fúngicos en las muestras de nuestro laboratorio, que es
centro de referencia para todo el territorio de Lleida.
Las muestras se procesaron de manera convencional según el protocolo establecido, añadiendo
según el caso cultivo en agar Saboureaud (SGC-2 Bio-mèrieux®) y Agar DTM (Dermatophyte test
medium, BD®). En 2005 la identificación de los hongos filamentosos se realizó por visualización y
la de organismos levaduriformes mediante el medio selectivo Chromagar (CAND Bio-mèrieux®)
y las galerías API 32C (Bio-Mérieux), mientras que en 2015 se utilizó la espectrometría de masas
(EM) MALDI-TOF-MS (Bruker®).
Resultados
En 2015 se aislaron 728 microorganismos (94 % levaduras y 6 % filamentosos), lo que supone
menos del 1% del total de muestras recibidas en nuestro laboratorio, similar a los resultados
obtenidos en 2005.
Dentro de las levaduras, C.albicans representa un 72%, seguida de lejos por C. glabrata (9%), C.
parapsilosis (6%), C. tropicalis (5%), otras especies (5%). El 3 % no se pudo identificar, aunque
en 2005, esta cifra fue del 19 %.
Dentro de los filamentosos, los dermatofitos representan el 61%, el género Aspergillus un
33%, y otros filamentosos 6%.
En los dermatofitos aislados en 2015, el 95% pertenecen al género Trichopyton sp , siendo el
más frecuente T.rubrum (27%) seguido de T.tonsurans (17%). No se pudo identificar el 50% de
las especies de Trychophiton sp, pero en 2005 esta cifra fue del 73 %. Los resultados de 2005
muestran que el dermatofito más frecuente fue T.mentagrophites, (13%), y que no se informaron especies de T. rubrum ni T. tonsurans.
De los Aspergillus en 2015, el 50% es de la especie A.fumigatus, el 25% A.terreus, 8% A.niger. y
el 17% no se pudo identificar. En 2005 no se llegó a identificar la especie en el 45% de las cepas.
Por tipo de muestra, en 2015, el 42% eran vaginales, seguido por muestras respiratorias (20%),
orinas (11%), hemocultivos (3%) y otros 14%. En 2005 predominaron los aislamientos de muestras respiratorias (41%), seguido por vaginales (24%), orina (6%), hemocultivos (3%), otras
(16%)
100
Conclusión
La especie más frecuente con diferencia es C.albicans. El grupo de especies no identificadas
en 2005 disminuye notablemente en 2015 tanto en las levaduras como en los filamentosos.
Esto es debido a la implantación de la EM para identificación de microorganismos clínicos.
La diferencia en el tipo de especies aisladas en los dermatofitos (ausencia de T. rubrum y de T.
tonsurans en 2005, y en cambio la presencia de T.mentagrophytes) también podrían deberse
a un error en la identificación de las especies antes de la EM. Sin embargo, todavía existe un
importante número de cepas de dermatofitos que la EM no ha podido resolver.
101
17. Dermatomicosis. Revisión de diez años (2006-2015) en el área del Hospital Universitario
de Puerto Real (Cádiz)
Freyre Carrillo Carolina, Martínez Rubio Carmen, Del Prado Montoro César, Rodríguez Iglesias
Manuel.
UGC Microbiología. Hospital Universitario de Puerto Real Cádiz. CN IV Km. 665. C.P.: 11510
E mail: carokarola@hotmail.com
Introducción: Las micosis superficiales son infecciones clínicas de la capa de queratina
cornificada inerte de la piel y de la queratina de pelo y uñas. Comprenden las infecciones de la
piel y de los anejos cutáneos causadas por hongos parasitarios. Afectan fundamentalmente
a personas que viven en climas cálidos, y son un importante motivo de consulta
médica. El carácter oportunista de estos microorganismos y su incremento en personas
inmunocomprometidas (terapias citotóxicas, VIH…) hace que se incremente el número de
hongos relevantes como agente causal de dermatomicosis.
Objetivo: Estudiar los aislamientos de hongos causantes de infecciones micóticas de piel y
anejos durante un periodo de diez años (2006-2015) en el área sanitaria de Puerto Real.
Material y métodos: Las muestras se sembraron en medio de cultivo Saboureaudcloranfenicol y Saboureaud-cloranfenicol-cicloheximida para inhibir el crecimiento de
posibles contaminantes. La identificación se realizó teniendo en cuenta las características
macroscópicas y microscópicas.
Resultados: Se han recibido, en el Laboratorio de Microbiología 940 muestras correspondientes
a 856 pacientes con sospecha de infección micótica procedentes de distintas localizaciones:
Uñas (500), Pelo (70) y Escamas (370). La mayor parte de las muestras (58%) fueron de mujeres.
Si desglosamos la información, las muestras de pelo y escamas corresponden a hombres en
su mayoría (67 y 55% respectivamente), mientras que las de uñas predominan en las mujeres
(70%). Las muestras con cultivo positivos fueron 509 (54%). De las 70 muestras de pelo, 43
(62%) fueron positivas; el porcentaje de positivos en muestras de escamas y de uñas fue algo
inferior (53%).
Los agentes etiológicos implicados fueron fundamentalmente:
1.- Levaduras (224 casos, 44%). La más frecuentemente aislada fue C. parapsilosis (35%)
seguida de Candida albicans (23%). 2.- Detectamos 180 aislamientos de dermatofitos (35%),
fundamentalmente Trichophyton (113, 63%), siendo el más frecuente T. rubrum (53, 47%),
seguido de T. mentagrophites (36, 32%). Es de destacar que la media de casos anuales de T.
rubrum, se ha incrementado en los tres últimos años, pasando de 3 a 10 aislados/ año. También
se aislaron 61 Microsporum (34%), principalmente M. canis (55, 90%) y 6 Epidermophyton
floccosum (3%). 3.- El nº de aislados de hongos filamentosos no dermatofitos fue de 66
(13%). De ellos el más frecuente fue el género Aspergillus spp (39 casos), destacando A. níger,
siguiendo los del género Penicillium spp (12 cepas), Acremonium spp (8 cepas), Scopulariosis
brevicaulis (6 casos) y Fusarium spp. (1 aislado). 4.- Encontramos además un 7% de muestras
contaminadas.
102
Conclusiones:
1. El grupo de hongos que con más frecuencia produce dermatomicosis en nuestro medío
son las levaduras del Género Candida. De ellas, la más frecuente es C. parapsilosis, lo que
coincide con la casuística existente en nuestro medio.
2. Los dermatofitos ocupan el segundo lugar. Los del género Trichophyton son los más
frecuentemente aislados, pero en cuanto a porcentajes se detectan casi por igual las
especies de M. canis y T. rubrum.
3. Se ha incrementado en los últimos 3 años el número de aislados de T. rubrum.
4. Detectamos un 13% de muestras con resultados de difícil interpretación, por tratarse
de hongos que se consideran habitualmente saprofitos. Mejorar sobre todo la toma de
muestra, redundaría en un aumento del diagnóstico etiológicos de las dermatomicosis.
103
18. Conidios aerovagantes de Alternaria y Drechlera en el aire de Cáceres durante inverno y
otoño
Alejandro Monroy Colín1, Santiago Fernández Rodríguez2, José María Maya Manzano1, Rafael
Tormo Molina1, Inmaculada Silva Palacios3, Ángela Gonzalo Garijo4
1. Departamento de Biología Vegetal, Ecología y Ciencias de la Tierra, Universidad de
Extremadura, 06071 Badajoz. ebercian@alumnos.unex.es, bioamc@outlook.com, jmmaya@
unex.es, ratormo@unex.es
2. Departamento de Construcción, Universidad de Extremadura, 10003 Cáceres, santiferro@
unex.es
3. Departamento de Física Aplicada, Universidad de Extremadura, 06007 Badajoz, insilva@
unex.es
4. Hospital Infanta Cristina, 06080 Badajoz, magonzalog@gmail.com
Introducción. Los conidios del tipo Alternaria y Drechslera son de los que alcanzan mayor
tamaño, sin embargo al formarse gradualmente en cadenas, muestran un amplio rango de
dimensiones. Presentan formas predominantemente piriformes y oblongas, respectivamente,
con tabiques transversales o también longitudinales en el primer caso. Corresponden a
hongos principalmente saprófitos, pero también incluyen algunos parásitos, principalmente
fitopatógenos. La alergia respiratoria a Alternaria es la más frecuente en relación a partículas
fúngicas aerovagantes. Este estudio pretende analizar su presencia en el aire la ciudad de
Cáceres durante el invierno y el otoño, se ha realizado conjuntamente para estos dos tipos de
esporas por su semejanza morfológica.
Material y Métodos. El muestreo de se ha realizado utilizando un captador volumétrico con
metodología Hirst (10 litros por minuto de flujo de aspiración) ubicado la terraza (16 m) de la
Escuela Politécnica de la Universidad de Extremadura en Cáceres. Se ha utilizado Petrolatum
White (CAS 8009-03-8) como adhesivo. El muestreo ha sido continuo durante el período de
1/10/2015 - 30/4/2016. Las esporas se han identificado y contabilizado mediante microscopía
óptica con dos barridos longitudinales a 400 aumentos de magnificación. La concentración
se proporciona en esporas por metro cúbico. Una estación meteorológica ubicada a escasos
metros del captador ha permitido la obtención de datos de temperatura, precipitación,
humedad relativa, velocidad y dirección del viento. Se ha calculado el coeficiente de correlación
de Spearman con valores diarios y horarios de temperatura y precipitación.
Resultados. La concentración promedio en esporas/m3 durante el período de estudio fue
de 1.1 para Alternaria y 0.7 para Drechslera. Los valores máximos llegaron a las 11 esporas/m3
tanto para Alternaria (7/11) como para Drechslera (31/10). La distribución diaria de los conidios
de Alternaria mostró correlación significativa y positiva con la lluvia (r 0.185, p 0.004) y las
temperaturas máxima (r 0.217, p<0.001), mínima (r 0.338, p<0.001) y media (r 0.301, p<0.001),
sin embargo no se obtuvieron valores significativos para Drechslera, a pesar de la correlación
entre ambos tipos (r 0.216, p 0.001). En de 79 días del total de 213 del período de estudio estuvo
presente la lluvia, con un total de 441.6 mm, el máximo de precipitación se recogió el 18/10
con 39 mm. La suma de valores diarios del período de estudio estuvo repartida en un 44% en
104
los días de lluvia y un 56% en los días sin lluvia para Alternaria, en el caso de Drechslera los
valores fueron de 48% y 52% respectivamente. Los patrones de distribución horaria muestran
una gran variabilidad, se observa sin embargo con más frecuencia valores más altos durante
la tarde en el caso de Alternaria y durante la mañana en el caso de Drechslera.
Conclusiones. La presencia de conidios de Alternaria y Drechslera durante el otoño y el
invierno en el aire de Cáceres ha sido reducida durante el período de estudio. La aparición
de lluvia parece ejercer un efecto positivo en la concentración de conidios de Alternaria, así
como la temperatura. En Drechslera estos efectos no son significativos a pesar de mostrar una
dinámica temporal similar. En cualquier caso los días de lluvia no representaron en ningún
caso una reducción de la concentración de conidios.
105
19. Empleo de aceites esenciales y sus subproductos para prevenir la producción de ocratoxina A en Aspergillus steynii.
Marta García-Díaz 1, Jessica Gil-Serna 1, Covadonga Vázquez 1, David Herraiz2, Belen Patiño1
Departamento de Microbiología III, Universidad Complutense de Madrid.
Centro de investigación agroforestal de albaladejito (Cuenca).
belenp@ucm.es
1
2
Las micotoxinas suponen un grave riesgo para la seguridad alimentaria y provocan elevadas pérdidas económicas cada año. La ocratoxina A (OTA) es una de las micotoxinas más impor-tantes debido a sus propiedades tóxicas y su frecuente aparición en los productos alimenticios. Diferentes
especies del género Aspergillus y Penicillium son capaces de producir OTA. En di-versos trabajos
llevados a cabo en nuestro grupo, se ha demostrado que A. steynii es uno de los principales hongos productores de OTA, porque casi todas las cepas son capaces de pro-ducir la toxina y siempre a niveles muy elevados. Estas toxinas son producidas durante el desarrollo de dichos hongos
sobre las matrices alimentarias, por lo que la mejor estrategia para evitar la contaminación de
los productos con micotoxinas, es impedir el crecimiento fúngico. Los métodos tradicionales más
utilizados para controlar dicho crecimiento son los fungicidas químicos, aunque su uso se está
restringiendo mucho debido a los problemas que ocasionan tanto para la salud humana, como
para el medio ambiente. Por lo tanto, es imprescindible la búsqueda de métodos alternativos más
sostenibles. Varios aceites esenciales de plantas han demostrado tener propiedades fungicidas
frente a diversos hongos y reductoras de la concen-tración de toxinas.
En este trabajo se ha estudiado el efecto in vitro de aceites esenciales e hidrolatos de plantas
aromáticas sobre del crecimiento y la capacidad de producir OTA de A. steynii. Los ensayos
se llevaron a cabo en medio CYA suplementado con distintas concentraciones de aceite (10,
100, 500 y 1.000 ppm) e hidrolato (100, 1.000, 5.000 y 10.000 ppm) de tres plantas aromáticas: Thymus vulgaris (tomillo), Satureja montana (ajedrea) y Origanum virens (oregano). Las
solu-ciones madre de aceites esenciales se prepararon diluyendo en PEG300, mientras que
los hi-drolatos se diluyeron en agua destilada estéril. En todos los casos, se usaron placas
control. Se sembraron 1,5 μl de una suspensión de esporas (106esporas/ml) de la cepa 3.53 de
A. steynii en cada una de las placas y se incubaron a 28 ºC durante 8 días, realizándose tres
repeticiones por concentración. Pasado este periodo se determinó la tasa de crecimiento y la
concentración de OTA en el medio mediante HPLC.
La tasa de crecimiento de A. steynii en presencia de los aceites esenciales estudiados se re-dujo
de forma significativa en todos los casos, observándose una reducción máxima del 80, 73 y 27
% con los aceites de ajedrea, orégano y tomillo respectivamente a 1.000 ppm. Por el con-trario
ningún hidrolato afectó significativamente el crecimiento del hongo. No se detectó OTA en el
medio a 1.000 ppm en ajedrea y orégano, sin embargo, en el caso del aceite esencial de to-millo
no se observó ninguna reducción en los niveles de la misma. En el caso de los hidrolatos fueron
necesarias al menos 5.000 ppm para observar una reducción significativa en la concen-tración
de ocrotaxina A. Por tanto, el uso de aceites esenciales como método alternativo a los productos
químicos tendrá que ser estudiado más profundamente, pues como se ha podido percibir en este
trabajo, el uso in vitro de algunos de ellos a determinadas concentraciones po-dría ser efectivo.
Este trabajo fue apoyado por el MINECO (AGL2014-53928-C2-2-R).
106
20. Nuevos biomarcadores quimio-taxonómicos de especies de Preussia (Sporormiaceae)
aisladas en la península Ibérica
Victor González-Menéndez, Jesus Martín, Clara Toro, Rachel Serrano, Catalina Moreno, Jose R.
Tormo y Olga Genilloud
Fundación MEDINA, Centro de Excelencia en Investigación de Medicamentos Innovadores en
Andalucía, Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Granada, España. victor.gonzalez@
medinaandalucia.es
La familia Sporormiaceae incluye aproximadamente 100 especies divididas en ocho
géneros (Chaetopreussia, Pleophragmia, Preussia, Pycnidiophora, Sporormia, Sporormiella,
Spororminula y Westerdykella). Se caracteriza por presentar esporas septadas, de color marrón
oscuro y con línea germinal. El género con mayor número de especies descritas dentro de la
familia es Preussia, propuesto por Funkel en 1866. Existen más de 36 especies de Preussia [1]
descritas en la península ibérica formando parte de la comunidad microbiana de diversos
hábitats (especies coprófilas, endófitas o saprófitas del suelo). Los análisis filogenéticos de las
regiones ribosomales ITS y LSU han confirmado que los caracteres morfológicos clásicos para
la distinción entre especies y géneros dentro de esta familia no son concluyentes.
Este estudio se ha centrado en la clasificación de 22 especies de Preussia (37 cepas) aisladas
en la Península Ibérica en base a sus caracteres morfológicos, posición filogenética y a sus
perfiles de metabolitos (quimiotaxonomía) obtenidos mediante espectrometría de masas
ESI-QTOF acoplada a un equipo uHPLC. Los espectros de masas se obtuvieron en el rango
de 150 a 1500 Da en modo positivo para cada cepa cultivada en dos medios de cultivo con
diferentes fuentes de C y N a fin de inferir su potencial metabólico. A partir de esta matriz
de datos se realizó un análisis estadístico multivariable utilizando el software Bionumerics®,
que permitió generar un dendrograma comparable con la agrupación de las cepas obtenida
mediante el análisis de sus regiones ribosomales ITS y LSU.
La metodología aquí aplicada de quimiotaxonomía por espectrometría de masas, nos ha permitido
identificar varios metabolitos secundarios que pueden ser utilizados como biomarcadores para la
discriminación entre las distintas especies dentro del género Preussia: Sporminarin A y B, Similin
A, Preussochromone o Spiropreussione, así como otros nuevos productos naturales que se
describen por primera vez en esta familia.
Los resultados nos han permitido describir una nueva especie de Preussia, así como identificar
tres especies de este género, no citadas anteriormente en España. Hemos podido, además,
clasificar mediante quimiotaxonomía especies que no han sido capaces de alcanzar su estadio
telomórfico y que solo han desarrollado en cultivo su estado anamorfo con dos morfologías
distintas (Phoma-like y Chrysosporium), así como varias especies crípticas, que en base a esta
aproximación polifásica pueden tratarse de especies de Preussia aún no descritas.
107
El presente estudio nos ha permitido confirmar que el análisis de los perfiles de metabolitos
secundarios de las especies del género Preussia permiten establecer una clasificación de las
mismas análoga y complementaria a la obtenible mediante análisis filogenético. Así mismo,
se han podido identificar diferentes biomarcadores metabolómicos específicos de especie
que permiten mejorar la clasificación taxonómica las diferentes especies existentes dentro
de este amplio género.
References:
[1]
Valdoserra, M., and Guarro, J. “Estudios sobre hongos coprófilos aislados de España XV. El
género Preussia (Sporormiella)“. Bol. Soc. Micol. Madrid 14:81-94. (1989).
108
21. Efecto de los sideróforos en el fenotipo de Sporothrix schenckii.
Alejandra Espinosa Texis1, Valeria Mariscal1, María de la Cruz Meneses1, Dalia Castillo2.
1
Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas. ICUAP-BUAP. Puebla, México. 2 Centro de
investigación en biotecnología aplica –IPN-Tlaxcala. alejandra.espinosa@correo.buap.mx
La esporotricosis es una micosis subcutánea, de evolución subaguda o crónica, que generalmente se adquiere por inoculación traumática con la forma infectante de un grupo de hongos dimórficos incluidos en el complejo del género Sporothrix, pero ocasionalmente puede
ser adquirida por inhalación, en cuyo caso podrá desarrollarse a nivel pulmonar. Sporothrix,
incluye además de la especie schenckii a S. albicans, S. inflata, S. lurei, S. brasiliensis, S. globosa
y S. mexicana. Dentro de los factores que contribuyen a la virulencia de S. schenckii se han
descrito los sideróforos, los cuales son agentes quelantes del hierro, son de tipo hidroxamato
y parecen favorecer el desarrollo de la fase micelial.
El objetivo fue determinar el efecto de los sideróforos en el fenotipo de S. schenckii, para lo
cual se adicionaron diferentes concentraciones de sideróforos en cajas de Petri conteniendo
agar glucosa Sabouraud y tubos con medio bajo en hierro (LIM) sembrados con la fase micelial de S. schenckii; la fase levaduriforme fue sembrada en agar infusión cerebro corazón
(BHI) y medio LIM.
En la morfología macroscópica no se observaron diferencias al adicionar sideróforos. En la
morfología microscópica observada con microscopio óptico y microscopio electrónico de barrido se observaron cúmulos de micelio, micelio, conidios simples, en forma simpodial y clamidoconidios en cultivos adicionados con sideróforos en la fase micelial.
En la fase levaduriforme adicionada de sideróforos se observaron levaduras simples, unigemantes, bigemantes, multigemantes y cúmulos de levaduras.
Los sideróforos no afectan la morfología macroscópica de S. schenckii, pero si la morfología
microscópica de la fase micelial y levaduriforme.
Agradecimientos
Trabajo financiado por VIEP, proyecto ESTA-NAT16-I.
109
22. Relación temporal entre la germinación, la fase de latencia, el tiempo para crecimiento
visible y las probabilidades de crecimiento y producción de aflatoxina B1 por Aspergillus
flavus en agar extracto de pistacho
Laila Aldars-García, Vicente Sanchis, Antonio J. Ramos, Sonia Marín
Unidad de Micología Aplicada, Departamento de Tecnología de Alimentos, Universitat de
Lleida. UTPV-XaRTA, Centro Agrotecnio. Av. Rovira Roure 191. 25198 Lleida.
Las aflatoxinas son metabolitos secundarios producidos por algunas especies de Aspergillus
capaces de crecer en determinados alimentos, principalmente cereales y frutos secos.
La necesidad del reducir/evitar su presencia en los alimentos es de gran importancia
para la industria alimentaria ya que estas toxinas presentan una elevada toxicidad y
carcinogenicidad. Es por ello que las aflatoxinas están muy reguladas a nivel mundial y la
búsqueda de herramientas que faciliten su prevención es esencial en todos los niveles de la
cadena alimentaria. El objetivo del presente trabajo consistió en estudiar la relación temporal
entre los parámetros de crecimiento y germinación, tiempo para crecimiento visible, y las
probabilidades de crecimiento y producción de aflatoxina B1 (AFB1) por Aspergillus flavus,
como estrategia para prevenir y disminuir la presencia de esta toxina en pistachos desde las
primeras etapas de una posible contaminación fúngica.
En micología predictiva, tradicionalmente se han utilizado concentraciones elevadas de
inoculación en la generación de datos, del orden de 102-106 esporas/mL. Sin embargo, en
realidad, la contaminación fúngica de un alimento en un determinado punto suele ser mucho
menor, a menudo de una sola espora. Es por ello que el estudio del comportamiento de una
sola espora en una matriz alimentaria puede ser de gran importancia a la hora de extrapolar
los resultados obtenidos en el laboratorio a una posible contaminación durante la cadena de
producción y distribución del alimento.
El presente estudio se llevó a cabo a 25 ºC, a dos actividades de agua (0,85 y 0,87), en agar
con extracto de pistacho al 3% y mediante siembra en superficie. Los resultados obtenidos
proceden siempre de colonias originadas a partir de una única espora. En total se estudiaron
aproximadamente 250 colonias. Los resultados mostraron un espacio de tiempo bastante
amplio entre todos los eventos estudiados. El tiempo de germinación sólo abarcó el 13-14%
de la fase de latencia, con lo que se observó un gran retraso hasta el inicio del crecimiento
una vez acabada la germinación. Además, en cuanto a la sucesión germinación>crecimiento>
producción de AFB1, los resultados mostraron también un retraso entre los 3 eventos, siendo
aún mayor el tiempo entre el inicio de crecimiento y la producción de AFB1 que entre el
tiempo de germinación y el de crecimiento.
El empleo de los modelos de crecimiento para predecir la posible presencia de AFB1 y así
disminuir el tiempo y los costes de los estudios podría conducir a sobreestimar la probabilidad
de presencia de esta toxina en el alimento. Aún así, el uso de estas herramientas puede ser de
gran ayuda para productores y distribuidores.
110
23. Detección de hongos de interés agrícola mediante unidades caninas
Lluís Pons Anglada, Maria dels Àngels Calvo Torras
Universitat Autònoma de Barcelona, Departament de Sanitat i Anatomia Animals, Grup de
Recerca en Microbiologia Aplicada i Medi Ambiental. Campus de Bellaterra s/n, Edifici V. 08193
(Bellaterra). Lluis.ponsan@gmail.com
Introducción
Los perros, debidamente adiestrados, pueden ser utilizados por los humanos para detectar
y localizar una gran variedad de sustancias de origen biológico, entre las que destacan los
compuestos orgánicos volátiles emitidos por hongos miceliares.
Objetivos del estudio
Determinar de forma objetiva la capacidad y aplicabilidad de perros debidamente adiestrados
para detectar hongos miceliares de interés en el sector agrícola.
Materiales y métodos
Tres perros procedentes de protectoras y con edades comprendidas entre los 14 y 18 meses
han sido seleccionados y adiestrados durante 6 meses mediante técnicas basadas en el
condicionamiento operante e instrumental para detectar muestras olorosas procedentes de
cultivos puros de Penicillium rugulosum, Trichoderma viride y Verticillium dahliae.
Tras el adiestramiento, se ha determinado su sensibilidad y especificidad de detección
mediante un ensayo doble ciego en el que se presentan de forma aleatoria un total de 100
muestras positivas y negativas. Durante dicho ensayo, cualquier respuesta dudosa del perro
se ha considerado negativa.
Durante todo el proceso se han tomado las precauciones de seguridad necesarias, tanto para
el perro como para su instructor, entre las que se incluyen muestreos microbiológicos de a
cavidad nasal y radiografías pulmonares de los perros, así como el uso de muestras olorosas
inocuas.
Resultados y Discusión
La sensibilidad de detección, que permite conocer el porcentaje de veces que el perro realiza
un marcaje positivo ante una muestra positiva, es del 98% para P. rugulosum, del 94% para
T. viride y del 95% para V. dahliae. La especificidad, que permite determinar el porcentaje
de muestras negativas en las que el perro no realiza ningún marcaje, es del 94% para P.
rugulosum, del 92% para T. viride y 91% para V. dahliae.
La detección de P. rugulosum, que actúa como hongo indicador de condiciones ambientales
inadecuadas y que favorecen el crecimiento de otros géneros de hongos, se propone como
método de prevención de podredumbres húmedas en almacenes de fruta. La detección de T.
viride permite determinar la efectividad de su implantación en el suelo cuando es inoculado
como agente de biofertilizaión y fitoestimulación, así como controlar su crecimiento en
cultivos de champiñones (Agaricus bisporus), en donde actúa como parásito y es introducido
accidentalmente a través del compost. Finalmente, la detección de V. dahliae se propone
111
como método de control de la verticilosis en el olivar, enfermedad que cursa de forma
asintomática hasta que el árbol está gravemente infectado y para la cual no existe ningún
tratamiento curativo.
Conclusiones
Los perros, correctamente adiestrados, pueden detectar y localizar hongos miceliares
en distintos entornos de trabajo, ofreciendo una elevada sensibilidad y especificidad y
convirtiéndose en una forma de trabajo económica, fiable, de fácil implantación y con un
amplio margen de posibilidades de aplicación, particularmente en el sector agrario.
112
24. Las proteínas Rga7 y Rga8 son dos RHO-GAP que regulan la integridad celular y la citocinesis de la levadura de fisión
Natalia García-García, Rebeca Martín-García y Pilar Pérez
Instituto de Biología Funcional y Genómica. CSIC/ Universidad de Salamanca, Salamanca.
España.
Rga7 y Rga8 son dos de las nueve proteínas GAP (GTPase Activating Protein) que regulan
negativamente a las GTPasas de la familia Rho en la levadura de fisión Schizosaccharomyces
pombe. Estas GTPasas están involucradas en el control del citoesqueleto de actina y participan en muchos procesos biológicos de las células eucariotas.
Rga7 es una proteína GAP de Rho2 que regula la citocinesis y la integridad celular. Rga8 es una
proteína GAP de Rho1 que es la GTPasa activadora de la síntesis de la pared celular y nosotros
hemos visto que Rga8 es también GAP de Rho2. Además del dominio característico de las
proteínas GAP, Rga7 y Rga8 tienen un dominio F-BAR en su extremo N-terminal y ambas se
localizan en el sitio de división y en los polos de la célula. Si bien, Rga7 está en la membrana
plasmática y Rga8 aparece también en vesículas intracelulares que podrían ser endosomas.
Las células mutantes que carecen de Rga7 tienen defectos en citocinesis, que se ven agravados por la ausencia simultánea de Rga8, y también tienen defectos de integridad celular.
Mediante ensayos de co-immunoprecipitación hemos visto que Rga7 y Rga8 forman un complejo. En S. pombe se ha descrito que la MAPK de integridad celular, Pmk1, está activada tanto
en células carentes de Rga7 como de Rga8. De hecho, la eliminación de la MAPK Pmk1 suprime
por completo los defectos de integridad de las células mutantes rga7Δ y parcialmente los
de células rga8Δ aunque en ambos casos aumenta la proporción de células con defectos de
citocinesis. Pmk1 es antagonista de la función de la calcineurina y las células carentes de Rga7
son hipersensibles al inhibidor de la calcineurina FK506 como cabría esperar. Por el contrario,
las células carentes de Rga8 no son hipersensibles a FK506 aunque Pmk1 esté activada. Mediante ensayo de doble híbrido hemos detectado interacción de Rga7 con Rho2, y también
con Pek1, la MAPKK que actúa como un activador de la señalización de Pmk1. En conjunto,
nuestros datos sugieren que Rga7 y Rga8 tienen distintas funciones en la integridad celular y
en la citocinesis de la levadura de fisión que pueden ser debidas a la regulación de la ruta de
MAPK, de forma dependiente e independiente de Rho2.
113
25. Papel de la ruta Slt de respuesta a estrés catiónico en el proceso de Aspergillosis Invasiva
causado por Aspergillus nidulans.
Eduardo A. Espeso, Laura Mellado, Patricia Hernández-Ortiz.
Centro Investigaciones Biológicas. CSIC. Ramiro de Maeztu, 9. 28040 Madrid.
eespeso@cib.csic.es.
Aspergillus nidulans es un hongo modelo y también un patógeno oportunista. La ruta de
respuesta de estrés catiónico está mediad el factor transcripcional con dedos de zinc, SltA.
Esta ruta está presente únicamente en hongos del subfilo pezizomycotina, grupo que incluye
numerosos hongos de interés industrial o clínico.
En este estudio se determinado el papel de la ruta Slt en la capacidad de A. nidulans de generar
Aspergillosis Invasiva en un modelo murino inmunodeprimido. Se han generado cepas mutantes
prototrofas que no expresan el factor SltA o que han sido reconstituidas mediante integración
dirigida del gen sltA. Los experimentos de supervivencia muestran que los ratones inoculados
con la cepa nula sltA son capaces de sobrevivir al proceso infectivo del hongo mientras que un
75% de la muestra no supera los cinco días tras el inóculo de la cepa silvestre o reconstituida
SltA. La reducida virulencia de la cepa nula sltA puede ser explicada por la baja penetración
observada en epitelio pulmonar. También se ha estudiado el papel de la proteína quinasa HalA,
puesto que actúa concertadamente con el factor SltA en la respuesta a estrés salino. La deleción
del gen halA no modifica la capacidad infectiva del hongo, pero incrementa la de la cepa nula
sltA. Los datos muestran la importancia de la ruta Slt en la virulencia de Aspergillus nidulans y
por extensión en otros hongos patógenos.
114
26. La diversidad en el género Aspergillus; estudio de genómica comparativa con 23 especies
Laura Puig1, Walter Sanseverino2, F. Javier Cabañes1
Grup de Micologia Veterinària, Facultat de Veterinària, Departament de Sanitat i de Anatomia
Animals, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, Barcelona
2
Sequentia Biotech SL, Barcelona.
laura.puig@uab.cat
1
Aspergillus es un género fúngico con una gran diversidad, constituido por especies que
colonizan hábitats muy distintos. Mientras que algunas de estas especies son conocidas
por sus usos biotecnológicos y son utilizadas para la producción de antibióticos, enzimas,
alimentos fermentados, etc., otras especies tienen la capacidad de actuar como patógenos
humanos y animales, contaminar alimentos o producir micotoxinas.
Entre las micotoxinas producidas por especies del género Aspergillus se encuentra la
ocratoxina A (OTA), especialmente relevante para la salud humana debido a su actividad
principalmente nefrotóxica, immunosupresora y carcinógena.
En el presente estudio se analizaron los genomas de 23 especies de Aspergillus desde un
enfoque de genómica comparativa. El objetivo de este trabajo consistió en el estudio
comparativo de los genomas de distintas especies de Aspergillus para la identificación de
reordenamientos cromosómicos y la organización de bloques de genes conservados entre los
genomas. A la vez, se determinaron diferencias entre los genomas de cepas productoras de
OTA y cepas no productoras.
Se determinó la homología entre los genes de las especies estudiadas. Posteriormente, se
reconstruyeron bloques de sintenia entre los genomas de cada especie, es decir, grupos de genes
homólogos, el orden de los cuales se ha conservado entre genomas, realizada por comparación
de genomas por pares. La reconstrucción de bloques de sintenia permitió observar grupos de
genes conservados entre los genomas, así como la determinación de diferencias entre especies
ocratoxigénicas y especies no productoras de OTA. Mediante este proceso se identificaron
grupos de genes potencialmente involucrados en la producción de OTA.
Este trabajo constituye el primer estudio realizado con 23 especies de Aspergillus desde
una perspectiva de genómica comparativa. La metodología desarrollada en este trabajo
ha demostrado ser de gran utilidad para la identificación de genes de interés en genomas
fúngicos, ya que mediante las técnicas aplicadas se han destacado genes concretos de
interés partiendo de todo el conjunto de genes que conforman el genoma de las especies.
Financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2014-52516-R)
115
27. Dos nuevas especies del género Malassezia aisladas de loros
F. Javier Cabañes1, S. Dall’ Acqua Coutinho2, Laura Puig1, M. Rosa Bragulat1, Gemma Castellá1
Grup de Micologia Veterinària. Facultat de Veterinària. Departament de Sanitat i de Anatomia
Animals. Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra. Barcelona, E- 08193.
1
Laboratório de Biologia Molecular e Celular, Faculdade de Medicina Veterinária Universidade
Paulista University, São Paulo, Brazil
javier.cabanes@uab.es
2
Todas las especies reconocidas como válidas del género se han aislado de mamíferos. Sin
embargo, tan solo unas pocas de ellas se han aislado de aves. De hecho, las aves han sido
estudiadas con menos frecuencia como portadoras de estas levaduras que los mamíferos. En
este congreso presentaremos dos nuevas especies del género aisladas de loros, sp. nov. y sp.
nov., incluyendo sus características morfológicas y fisiológicas. La secuenciación y el análisis
de los fragmentos génicos D1/D2 26S e ITS-5.8S del ADN ribosómico y del gen de la β-tubulina
respaldan la validez de estas dos nuevas especies. Además se confirma la existencia de
especies lipodependientes de este género en loros.
116
28. Estudio de proteínas de Lomentospora prolificans reconocidas por IgA humana y su reactividad cruzada con Aspergillus fumigatus
Idoia Buldain, Aize Pellon, Aitziber Antoran, Vanessa Rodriguez, Maria Jesus Sevilla, Aitor
Rementeria, Fernando L. Hernando y Andoni Ramirez-Garcia.
Fungal and Bacterial Biomics Research Group. Departamento de Inmunología, Microbiología
y Parasitología, Facultad de Ciencia y Tecnología, Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Leioa
48940, España.
En las últimas décadas, la incidencia de las micosis invasoras ha aumentado considerablemente,
llegando a causar hasta medio millón de muertes anuales. De especial importancia es el
aumento de los casos clínicos producidos por el hongo patógeno Lomentospora prolificans
y la elevada mortalidad derivada, la cual puede llegar al 87,5% en infecciones diseminadas.
Esta falta de éxito en el tratamiento de la enfermedad está asociada a la situación clínica de
los pacientes, a la dificultad de realizar un diagnóstico rápido y certero, y a la multiresistencia
intrínseca del hongo a los antifúngicos disponibles. Teniendo en cuenta que L. prolificans
raramente infecta a individuos inmunocompetentes, el estudio de la respuesta inmunitaria
de esta población podría proporcionar información importante para el desarrollo de nuevos
tratamientos frente a esta infección. En este sentido, ya que L. prolificans penetra en el
cuerpo humano principalmente por las vías respiratorias en forma de conidios, el objetivo
principal de este estudio fue la identificación de los antígenos conidiales más prevalentes del
hongo L. prolificans reconocidos por IgA de individuos sanos, y el estudio de su expresión y su
reactividad cruzada con otros hongos patógenos.
Los antígenos conidiales más prevalentes de L. prolificans fueron detectados mediante
Western Blot (WB) bidimensional utilizando para ello 20 salivas de donantes sanos. De esta
forma, aquellos que reaccionaron con más del 50% de las muestras, fueron identificados
posteriormente mediante LC-MS/MS. Entre ellos, la ciclofilina y la enolasa fueron los antígenos
más prevalentes, reaccionando con el 85 y el 80% de las muestras utilizadas, respectivamente.
De hecho, todas las salivas utilizadas mostraron reactividad al menos frente a una de las dos
proteínas y por lo tanto, los anticuerpos contra dichas enzimas podrían ofrecer una cobertura
del 100% contra L. prolificans. Así mismo, se realizó la extracción de proteínas asociadas a la
pared celular de los conidios del hongo, y se detectaron los antígenos reconocidos por IgA
salivares mediante WB bidimensional. En este caso, tanto la ciclofilina como la enolasa fueron
identificadas como antígenos asociados a la pared. Por otro lado, se llevo a cabo un estudio
comparativo con los hongos patógenos y filogenéticamente relacionados, Scedosporium
apiospermum y S. aurantiacum, identificando en el proteoma e inmunoma nuevamente
las ciclofilinas y la enolasa. Con el fin de clarificar la alta prevalencia de estas enzimas y su
presencia como antígenos en otras especies, se llevo a cabo un estudio de reactividad cruzada
entre conidios de L. prolificans y del hongo filamentoso patógeno con mayor presencia en el
ambiente, Aspergillus fumigatus. Para ello, se obtuvieron IgA anti-A.fumigatus mediante la
incubación de los conidios de A. fumigatus con un pool de muestras salivares y una posterior
recuperación con HCl-glicina (pH 2,5). Estos anticuerpos se hicieron reaccionar con un extracto
proteico de conidios de L. prolificans mediante WB bidimensional, detectando de esta forma
la reactividad cruzada entre la ciclofilina y la enolasa de estas especies.
117
En conclusión, éste trabajo representa un paso más en la búsqueda de nuevas alternativas
terapéuticas frente a estas devastadoras infecciones, proponiendo la enolasa y las ciclofilinas
como interesantes candidatas para ser evaluadas como dianas y para el desarrollo de vacunas.
Además, tratándose de enzimas tan conservadas, estas proteínas podrían ser eficaces para
proteger no solo frente a L. prolificans sino frente a otras especies fúngicas.
118
29. Mucormicosis renal grave en un paciente immunocompetente.
Vallverdú Vidal, Montserrat; Iglesias Moles, Silvia; Balsera Garrido, Maria Begoña; Miralbes
Torner, Mar; Carvalho Brugger, Sulamita; Palomar Martínez, Mercedes
Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida.
A PROPOSITO DE UN CASO
La mucormicosis es una infección fúngica oportunista que ocurre raramente en
pacientes inmunocompetentes. La afectación aislada de un órgano es rara y solo en
muy pocos casos la mucormicosis renal ha sido publicada.
Presentamos el caso de un varón de 71 años de edad, con antecedentes de hipertensión
arterial, diabetes mellitus, cardiopatía isquémica, insuficiencia renal crónica leve y colocación
de un catéter ureteral por hidronefrosis izquierda 10 dias antes del ingreso hospitalario.
Ingresa por dolor lumbar, fiebre, fracaso renal agudo y piuria iniciándose tratamiento con
ceftriaxona. La ecografía renal evidencia quistes renales izquierdos y el TAC informa de
hidronefrosis grado III/IV. A la semana presenta anemización (Hb 6.5g/dl) junto con clínica
de bacteriemia. Un TAC objetiva hematoma en celda renal izquierda que se extiende por
la región perirrenal y músculo psoas. Con estos hallazgos se decide cambio de antibiótico
a meropenem y cirugía urgente practicándose nefrectomía y ureterectomía ipsilateral
por aspecto necrótico y gangrenoso e identificándose punto de sangrado en arteria iliaca
izquierda. Intraoperatoriamente presenta inestabilidad hemodinámica que precisa de drogas
vasoactivas, politransfusión de hemoderivados e ingreso en UCI. Los cultivos son negativos y
a las 48 horas la histopatología evidencia presencia de mucorales, iniciándose Anfotericina B
liposomal (10mg/Kg/dia). Ante dichos resultados se solicita estudio de TAC toracoabdominal,
craneal y facial que descarta mucormicosis diseminada. La evolución posterior viene marcada
por dos aspectos. Uno, el empeoramiento de la función renal a pesar de disminuir dosis de
Anfotericina B lipososmal (5mg/Kg/d), lo que llevó a añadir al tratamiento anidulafungina, y
otro, hematuria persistente y dolor en flanco, motivos por los cuales se realiza nuevo TAC, que
mostró el resto del uréter dilatado hasta vejiga, y citoscopia que evidenció presencia de hifas
en zona del meato, decidiendo cirugía urgente con ureterectomía y cistoprostatectomia. La
histopatología objetivó mucormicosis vesical con afectación ambos meatos ureterales. Tras
3 meses de ingreso hospitalario el paciente fue dado de alta vivo.
119
30. Epidemiología y sensibilidades a antifungicos del genero aspergillus.
María José Linares Sicilia, Rafael Méndez Natera, Rocío Tejero García y Manuel Casal Román.
Departamento de Microbiología. Facultad de Medicina y Enfermería. Servicio de Microbiología.
Hospital Universitario Reina Sofía (HURS). Universidad de Córdoba. Avda. Menéndez Pidal s/n.
14004 Córdoba. e-mail: mi1lisim@uco.es
El objetivo de este estudio ha sido determinar la prevalencia y la distribución de las especies del género Aspergillus spp. en el Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba (HURS) y
analizar las sensibilidades y resistencias in vitro a antifúngicos de dichas especies en nuestro medio.
Para ello, hemos llevado a cabo un estudio descriptivo y transversal a partir de las cepas
de Aspergillus spp. aisladas de muestras clínicas en el Servicio de Microbiología (Sección
de Micología) del HURS durante los años 2011-2015. Dichas cepas fueron cultivadas e identificadas macro y microscópicamente y se les realizó un estudio de sensibilidades in vitro
mediante el panel de microdilución colorimétrica SentititreYeastOne® , tras incubación a
35ºC durante 24-48 horas según la especie. Los antifúngicos testados fueron anfotericina
B (AMB); azoles: itraconazol (ITC), voriconazol (VRC), posaconazol (PSC) y fluconazol (FLC);
5-fluorocitosina (5-FT); y equinocandinas: caspofungina (CPF), micafungina (MCF) y anidulafungina (ANF). En el estudio se aplicaron los puntos de corte epidemiológicos (ECVs) establecidos por el Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). En el caso de las equinocandinas (micafungina y anidulafungina), se empleó el valor de referencia correspondiente
a la caspofungina.
La prevalencia media de las infecciones fúngicas fue del 0.002%. Se aislaron un total de 874
cepas durante el estudio distribuidas de la siguiente manera: 166 en 2011, 163 en 2012, 148
en 2013, 208 en 2014 y 189 en 2015. La especie más frecuentemente aislada fue Aspergillus
fumigatus con 307 aislamientos (35.1%), seguido de Aspergillus flavus y Aspergillus terreus,
ambos con 174 aislamientos (19.9%) y Aspergillus niger con 123 (14%). Destaca también Aspergillus candidus con 48 aislamientos (5.5%) y Aspergillus lentulus con 14 (1.6%), el resto de
especies presentaron menos de 100 aislamientos. Aspergillus fumigatus fue la especie más
hallada en los cuatro primeros años, siendo superada solamente en 2015 por Aspergillus
terreus. Igualmente, Aspergillus flavus presentó un mayor número de aislamientos que Aspergillus niger en todas las series, a excepción del año 2011.
Todos los Aspergillus fumigatus fueron sensibles a las equinocandinas. Respecto a los azoles, la sensibilidad de Aspergillus fumigatus osciló del 98,4% para voriconazol y posaconazol, al 98,7% para itraconazol. Ningún Aspergillus terreus fue resistente a anfotericina B,
itraconazol o voriconazol, y tan sólo uno lo fue a posaconazol (0,6%). Ningún Aspergillus
niger mostró resistencias a voriconazol o posaconazol y tan sólo dos a itraconazol (1,6%).
Así mismo, fueron calculadas las CMI50, CMI90, la moda y el rango de cada antifúngico para
Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. terreus y A. niger.
A la vita de los resultados se observa una baja prevalencia de infecciones por el género
Aspergillus en nuestro medio, siendo Aspergillus fumigatus la especie más frecuentemente aislada, y una mayor incidencia en los 5 últimos años de A. flavus, terreus y niger.
120
Así mismo, se demuestra la excelente actividad de las equinocandinas frente a las especies
de este género, especialmente a Aspergillus fumigatus y las escasas resistencias que presentan los azoles. Aconsejamos la identificación genética de las especies crípticas para conocer
con más detalle los mecanismos de distribución de resistencias en dichas especies del género Aspergillus.
121
31. Actividad in vitro de la combinación de fluconazol y ciclosporina A contra Candida
Juan Daniel Carton, Asier Domínguez, Nerea Jaureguizar*, Elena Eraso y Guillermo Quindós
Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología, Unidad de formación e
investigación multidisciplinar ‘Microbios y Salud’ (UFI 11/25) y *Departamento de Farmacología,
Facultad de Medicina y Enfermería, Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea
(UPV/EHU), Bilbao.
juandaniel.carton@ehu.es
Objetivo: Evaluar la actividad in vitro de la combinación de fluconazol y ciclosporina A
(inhibidor de la calcineurina) contra aislamientos clínicos de Candida resistentes a fluconazol.
Métodos: Se estudiaron un total de 22 aislamientos de Candida, de los cuales 5 eran Candida
albicans resistentes a fluconazol, 5 Candida glabrata, 4 Candida parapsilosis, 2 Candida krusei, 2
Candida nivariensis y 1 Candida orthopsilosis. Se utilizaron como controles de calidad Candida
krusei ATCC 6258 y Candida parapsilosis ATCC 22019. Se determinó la concentración mínima
inhibitoria (CMI) de acuerdo al método de microdilución descrito en el documento EDef
7.2 del European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing (EUCAST). Como CMI se
consideró la concentración de compuesto antifúngico que causaba el 50% de la inhibición del
crecimiento del hongo. Se estudiaron diferentes combinaciones de fluconazol y ciclosporina
A mediante el método de tablero de ajedrez. Los rangos de concentraciones ensayados
variaron dependiendo del fármaco siendo para el fluconazol de 1 a 64 μg/ml y para la
ciclosporina A de 0,25 a 128 μg/ml. La interacción in vitro de la combinación de los fármacos se
interpretó mediante el índice de concentración inhibitoria fraccionada (FICI). La combinación
se consideró sinérgica cuando el valor FICI fue menor o igual que 0,5, antagónica cuando fue
mayor que 4 e indiferente cuando el valor fue mayor que 0,5 y menor o igual que 4.
Resultados: La tabla muestra los resultados obtenidos. La combinación de la ciclosporina
A con el fluconazol reducía notablemente las CMI de fluconazol desde 16->128 a 1-4 μg/ml
para la mayoría de los aislamientos de Candida. Se observó en tres de los aislamientos de
Candida albicans que la combinación era más eficaz, dado que la diferencia de las CMI de los
fármacos solos frente a la de los fármacos combinados era la más elevada. La combinación
mostraba un efecto sinérgico contra 4 de los 5 aislamientos de Candida glabrata y contra 3
de los 4 aislamientos de Candida parapsilosis resistentes a fluconazol. También se observó un
sinergismo al combinar ambos fármacos contra los dos aislamientos de Candida nivariensis.
122
Tabla. Actividad antifúngica in vitro del fluconazol (FLC) y ciclosporina A (CSA) contra Candida
CMI ( μg/ml )
Solo
En combinación
FLC
CSA
FLC
CSA
FICI
Interpretación
C. albicans ATCC
64124
>128
>128
2
>128
0,5156
Indiferente
C. albicans UPV 15-147
>128
>128
4
0,5
0,0117
Sinergismo
C. albicans UPV 15-154
>128
>128
2
2
0,0156
Sinergismo
C. albicans UPV 15-157
>128
>128
2
2
0,0156
Sinergismo
C. albicans UPV 15176
>128
>128
2
>128
1,0078
Indiferente
C. glabrata UPV 07185
>128
>128
2
2
0,1328
Sinergismo
C. glabrata UPV 07200
16
>128
1
4
0,0804
Sinergismo
C. glabrata UPV 11452
64
>128
16
1
0,2539
Sinergismo
C. glabrata UPV 15202
64
>128
4
2
0,0703
Sinergismo
C. glabrata UPV 16032
>64
>128
1
>128
1,0078
Indiferente
C. krusei ATCC 6258
32
>128
16
2
0,5078
Sinergismo
C. krusei NCPF 3321
64
>128
2
>128
1,0313
Indiferente
C. krusei UPV 03-263
64
>128
2
>128
1,0313
Indiferente
C. nivariensis CBS
9983
16
>128
4
2
0,2578
Sinergismo
C. nivariensis CBS
9984
16
>128
4
4
0,2656
Sinergismo
C. parapsilosis ATCC
22019
1
>128
2
>128
3,0000
Indiferente
123
C. parapsilosis NCPF
3104
>128
>128
2
4
0,0234
Sinergismo
C. parapsilosis UPV
09-273
>128
>128
2
2
0,0156
Sinergismo
C. parapsilosis UPV
15-177
8
>128
2
>128
1,2500
Indiferente
C. parapsilosis CDC
317
16
>128
4
16
0,3125
Sinergismo
C. ortopsilosis UPV
09-242
4
>128
1
>128
1,2500
Indiferente
Conclusiones: La ciclosporina A mejora el efecto del fluconazol contra los aislamientos de
Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis y Candida nivariensis resistentes al
fluconazol.
Financiación: PI11/00203 (FIS, Gobierno de España), GIC12 210-IT-696-13 (Gobierno Vasco-Eusko Jaurlaritza) and UFI 11/25 (UPV/EHU).
124
32. Sensibilidad a fluconazol de levaduras aisladas de exudados vaginales
Luz Balsalobre, Ana Miqueleiz, Josefa Barba y Buenaventura Buendía
Hospital Universitario de La princesa. Diego de León 62, Madrid.
luzbalsalobre@gmail.com
Introducción y Objetivos
La candidiasis vulvovaginal es una de las infecciones más frecuentes del tracto genital
femenino, siendo Candida albicans el agente etiológico implicado con mayor frecuencia.
Sin embargo, en los últimos años el número de infecciones atribuidas a otros miembros
del género se ha incrementado notablemente. El tratamiento de elección de esta patología
infecciosa es el fluconazol, por lo que la aparición de aislados de C. albicans resistentes, junto
con el incremento de las infecciones causadas por especies de Candida no albicans, algunas
de las cuales presentan resistencia intrínseca al fluconazol, complica el tratamiento de la
candidiasis vaginal.
El objetivo de este estudio fue identificar las especies de Candida aisladas de pacientes con
sospecha de candidiasis vaginal y determinar su sensibilidad a fluconazol. Así como, analizar
las características de la flora vaginal de las pacientes mediante tinción de Gram.
Materiales y Métodos
Se estudiaron todos los exudados vaginales positivos para Candida spp (26,1%; n=114), de
los 436 recibidos durante marzo y abril de 2016 en el Servicio de Microbiología del Hospital
Universitario de La Princesa, para tinción de Gram y cultivo en agar Sabouraud con
cloranfenicol. La identificación de la especie C. albicans se realizó por CHROMagar y la de
las especies no albicans por MALDI-TOF. La sensibilidad a fluconazol se determinó mediante
el método de difusión disco-placa, siguiendo las indicaciones del documento M44-A2 del
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Se consideraron sensibles a fluconazol los
aislados con diámetros del halo de inhibición iguales o superiores a los 19 mm. Asimismo, se
determinó la sensibilidad a diferentes antifúngicos, utilizando el sistema de microdilución en
caldo Sensititre YeastOne, a todos los aislados de C. albicans resistentes a fluconazol por la
técnica de difusión disco-placa.
Resultados
La mediana de edad de las pacientes fue de 31 años (rango 18-93 años). Las levaduras aisladas
correspondieron a las siguientes especies: 101 (88,6%) C. albicans, 9 (7,9%) C. glabrata, 2 (1,7%)
C. parapsilosis, 1 (0,9%) C. krusei y 1 (0,9%) C. lusitaniae.
En cuanto a las características de la flora vaginal, en 96 (84,2%) de los 114 frotis se observaron
polimorfonucleares en el Gram, en 57 (50,0%) lactobacilos, en 28 (24,6%) pseudohifas y en 14
(12,3%) flora anaerobia y/o células clave compatibles con vaginosis bacteriana.
En cuanto a la sensibilidad a fluconazol, 3 (23,1%) de los 13 aislados no albicans, resultaron
resistentes a fluconazol (C, glabrata, C. krusei y C. lusitaniae). De los 101 aislados de C. albicans,
4 (4,0%) resultaron resistentes a fluconazol, confirmándose por Sensititre. Excepto un aislado
sensible a posaconazol, los otros 3 fueron resistentes a los demás azoles y sensibles al resto
de los antifúngicos ensayados. Sólo una, de las 4 pacientes de las que procedían los aislados
de C. albicans resistentes a fluconazol, presentó recurrencias.
125
Conclusiones
El estudio de la sensibilidad a fluconazol mediante difusión disco-placa es un método sencillo
al alcance de cualquier laboratorio clínico.
Los aislamientos de C. albicans sensibles a fluconazol continúan representando un
porcentaje muy alto de las casos de candiadiasis vulvovaginal por lo que en nuestro medio
sólo estaría indicado el estudio de sensibilidad en casos de recurrencia o falta de respuesta
al tratamiento y, ante el aislamiento de Candida no albicans. Por tanto, el cultivo resulta
esencial en el diagnóstico de la candidiasis vaginal en pacientes sintomáticas, ya que permite
la identificación a nivel de especie, dato a tener en cuenta en la instauración del tratamiento.
Es aconsejable la realización periódica de estudios de sensibilidad a fluconazol de levaduras
obtenidas de muestras mucocutáneas.
126
33. Evaluación de la producción de factores de patogenicidad por aislamientos clínicos del complejo de especies Candida parapsilosis.
Nerea Pena-Fernández, Cristina Marcos-Arias, Camino Trobajo-Sanmartín, Estibaliz
Mateo-Alesanco, Emilia Cantón, Elena Eraso y Guillermo Quindós.
Laboratorio de Micología Médica, Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología, Unidad de formación e investigación multidisciplinar ‘Microbios y Salud’ (UFI 11/25), Facultad de Medicina y Enfermería, Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea (UPV/
EHU), Bilbao 1, Camino Trobajo-Sanmartín1, Estibaliz Mateo-Alesanco1, Elena Eraso1, Emilia
Cantón2 y Guillermo Quindós1
1
2
Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia. cristina.marcos@ehu.eus
La incidencia de las candidiasis invasoras producidas por Candida parapsilosis ha aumentado
notablemente y el conocimiento de los factores implicados en la patogenia de las infecciones
producidas por el complejo de especies de Candida parapsilosis es de gran relevancia.
Objetivos:
Evaluar la capacidad de producir enzimas hidrolíticas, como esterasas, hemolisinas, fosfolipasas y proteasas, de aislamientos clínicos del complejo de especies C. parapsilosis.
Métodos:
Se han estudiado 89 aislamientos clínicos que incluyen 77 aislamientos de C. parapsilosis, 11
aislamientos de C. orthopsilosis y un aislamiento de C. metapsilosis procedentes del Hospital
Universitario y Politécnico La Fe. La actividad esterasa de los aislamientos clínicos se determinó mediante cultivo en agar Tween-20 según el método descrito por Aktas [1]. La producción
de fosfolipasa fue determinada mediante cultivo en agar malta suplementado con yema de
huevo según lo descrito por Polak et al. [2]. La actividad hemolítica se evaluó utilizando el
método de cultivo en agar glucosado de Sabouraud suplementado con glucosa y sangre de
cordero descrito por Luo et al [3]. La actividad lipasa y la actividad hemolítica se interpretaron
como positivas cuando era visible una zona de precipitación o un halo translúcido alrededor
del crecimiento, respectivamente. La actividad enzimática (expresada por el valor Pz) fue determinada mediante la medida del ratio del diámetro de la colonia entre el diámetro total
incluyendo la zona de precipitación. Se consideraron los aislamientos como muy productores
cuando el valor de Pz estaba entre 0,5 y 0,35; y de producción moderada cuando el valor de Pz
estaba entre 0,51 y 0,74. Para la detección de la actividad proteasa se utilizó agar suplementado con seroalbúmina bovina [4]. La proteólisis se midió como la presencia de una zona de
clarificación alrededor del crecimiento, siendo negativa cuando no hay lisis. Los aislamientos
se clasificaron como poco productores cuando el halo medía 1-2 mm, como productores moderados cuando el diámetro era superior a 2 mm y muy productores cuando era superior a 4
mm. La producción de las enzimas hidrolíticas de cada aislamiento fue ensayada por triplicado. Las placas para el estudio de las actividades esterasa, fosfolipasa y proteasa se incubaron
a 37 ºC durante seis días, mientras que las placas para ensayar la actividad hemolítica se
incubaron durante 48 h a 37 ºC y 5% de CO2.
127
Resultados:
Un único aislamiento de C. parapsilosis (1,1%) mostró una producción moderada de esterasa
y ninguno de los aislamientos produjo fosfolipasas. Diecisiete de los 89 aislamientos (19,1%)
mostraron actividad hemolítica, de los cuales un aislamiento de C. parapsilosis fue muy productor mientras que 15 aislamientos de C. parapsilosis y uno de C. orthopsilosis mostraron
una actividad hemolítica moderada. La actividad proteolítica se observó en 37 aislamientos
(41,6%) de los cuales dos aislamientos de C. parapsilosis fueron muy productores, seis aislamientos de C. parapsilosis mostraron producción moderada y 27 aislamientos de C. parapsilosis y dos de C. orthopsilosis mostraron menor actividad proteolítica.
Conclusiones:
La patogenia de las infecciones causadas por el complejo de especies C. parapsilosis podría
estar relacionada con la actividad proteolítica, ya que aproximadamente la mitad de los aislamientos mostraron capacidad productora. Además, entre las especies del complejo, C. parapsilosis, que es la que presenta mayor actividad proteolítica, es también la más patógena.
Financiación:
Este estudio ha sido financiado por la Fundación ONCE «Oportunidad al Talento», GIC12 210IT-696-13 (Gobierno Vasco-Eusko Jaurlaritza) y UFI 11/25 (UPV/EHU).
Bibliografía:
1. Aktas et al. J Int Med Res 2002.
2. Polak, A. Mycoses 1992.
3. Luo G et al. J Clin Microbiol 2001.
4. Cassone et al. J Infect Dis 1987.
128
34. Comparación de los métodos de microdilución en caldo de CLSI y EUCAST para el estudio de
la actividad antifúngica in vitro contra Candida.
Katherine Miranda-Cadena, Iñigo Terren-Martínez, Cristina Marcos-Arias, Estibaliz
Mateo-Alesanco, Elena Eraso y Guillermo Quindós.
Laboratorio de Micología Médica, Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología, Unidad de formación e investigación multidisciplinar ‘Microbios y Salud’ (UFI 11/25),
Facultad de Medicina y Enfermería, Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea
(UPV/EHU), Bilbao , Estibaliz Mateo-Alesanco, Elena Eraso y Guillermo Quindós
Correo electrónico: cristina.marcos@ehu.eus
La progresiva armonización de los métodos estandarizados para el estudio de la actividad
antifúngica contra Candida incluye mejoras como la validación de la lectura de la CMI a las
24h, la propuesta de nuevos puntos de corte clínicos específicos de especie y el uso de puntos
de corte epidemiológicos para la detección de aislamientos de Candida que han desarrollado
mecanismos de resistencia contra los fármacos antifúngicos.
Objetivo:
Comparar los valores de CMI in vitro de anfotericina B, anidulafungina, caspofungina, fluconazol, micafungina, posaconazol y voriconazol contra aislamientos clínicos de Candida
mediante el método EUCAST de microdilución en caldo con los resultados obtenidos por el
método de microdilución en caldo del CLSI.
Métodos:
Se estudió la actividad antifúngica mediante el método EUCAST y CLSI de microdilución en
caldo de anfotericina B, fluconazol (Sigma, España), anidulafungina, voriconazol (Pfizer, España), micafungina (Astellas Pharma, España), caspofungina y posaconazol (MSD, España)
contra 50 aislamientos de sangre de Candida que incluyen 28 aislamientos de Candida albicans, 10 de Candida parapsilosis, siete de Candida dubliniensis y cinco de Candida krusei.
Candida parapsilosis ATCC 22019 y Candida krusei ATCC 6258 se incluyeron como control. Se
compararon las CMIs obtenidas mediante ambos métodos para determinar el acuerdo esencial definido como las discrepancias en los resultados de la CMI no mayores de dos diluciones
dobles seriadas. Además, se evaluó la correlación entre resultados mediante el coeficiente
de correlación intraclase (CCI) en un intervalo de confianza del 95%. Para este análisis, los valores de las CMIs se aproximaron a una distribución normal mediante su transformación en
valores log2. Un valor de CCI de 1 indica una correlación perfecta mientras que el valor mínimo -1 indica ausencia de correlación. Se cuantificó el número de discrepancias para aquellos
antifúngicos en los que no se han definido puntos de corte por ambos métodos de referencia,
clasificando como discrepancias no sustanciales las diferencias de tres o cuatro diluciones y
como sustanciales cuando la diferencia es mayor de cuatro diluciones.
Resultados:
El acuerdo esencial general entre los resultados obtenidos por ambos métodos de referencia a las 24h fue del 90,7%. Anidulafungina, micafungina y voriconazol alcanzaron tasas de
acuerdo esencial mayores del 95% a las 24h, mientras que a las 48h las mayores tasas de
acuerdo se observaron para anidulafungina, caspofungina, fluconazol y voriconazol. La ma-
129
yor correlación significativa se observó para anidulafungina tanto a 24 como a 48h (0,977 y
0,972 respectivamente, P < 0,00) y fluconazol a las 24h (0,923, P < 0,00), mientras que para
posaconazol se observó la menor correlación tanto a 24 como a 48h (-0,292, -0,227, P> 0,01).
Respecto al acuerdo categórico, el mayor número de discrepancias sustanciales se observó
para posaconazol a las 48h contra Candida albicans (12 de 28 aislamientos, 42,8%). Anfotericina B mostró mayor número de discrepancias no sustanciales contra Candida albicans y Candida dubliniensis (5 de 28 aislamientos, 7,1% y 2 de 7 aislamientos, 28,6%, respectivamente).
En presencia de puntos de corte establecidos por los dos métodos se observaron diferencias
para anidulafungina y micafungina contra Candida parapsilosis clasificándose los aislamientos con sensibilidad intermedia por EUCAST como aislamientos sensibles por el método CLSI.
Conclusiones:
El estudio de la actividad in vitro de las candinas contra Candida muestra alto nivel de acuerdo esencial por los métodos CLSI y EUCAST. Ambos métodos de referencia también pueden
ser de gran fiabilidad para la detección de resistencias a fluconazol y voriconazol.
Financiación: Este estudio ha sido financiado por la Fundación ONCE «Oportunidad al Talento», GIC12 210-IT-696-13 (Gobierno Vasco-Eusko Jaurlaritza) y UFI 11/25 (UPV/EHU).
130
35. Aislamientos clínicos de Aspergillus spp.
Lupiáñez A., Cruellas M.L., Giro C., Garcia Solé M., Bernet A., Aramburu J.
Sección de Microbiología del Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida
Avenida Alcalde Rovira Roure, número 80, 25198 Lleida (España)
aran.1413@gmail.com
INTRODUCCIÓN
El género Aspergillus engloba un gran número de especies de hongos filamentosos, hialinos
y ubicuos. Es un patógeno oportunista causante de infecciones locales y superficiales como
micosis y aspergiloma. En pacientes immunodeprimidos puede producir infecciones invasivas como aspergilosis.
OBJETIVO
Revisar la procedencia de los aislamientos de Aspergillus spp. así como sus especies más frecuentes.
MATERIAL Y MÉTODOS
Estudio descriptivo y retrospectivo de los Aspergillus aislados en nuestro laboratorio, durante el
periodo comprendido entre enero de 2013 y diciembre de 2015, procedentes de un hospital universitario, centros de larga estancia y de atención primaria.
Las muestras se han procesado de manera convencional y los aislamientos han sido
identificados visualmente, mediante el aspecto de la colonia y microscopía, los primeros 11 meses
y mediante el método MALDI-TOF Biotyper (BRUKER) hasta diciembre de 2015.
RESULTADOS
Se han aislado 177 cepas de Aspergillus spp. correspondientes a 170 pacientes. La
procedencia de las muestras fue: óticas (72%), respiratorias (26%) y otras (2%). La especie más
frecuente en las muestras óticas ha sido A. niger (56%) y en las respiratorias A. fumigatus
(63%).
De las muestras respiratorias un 95% procedían de hospitalización, mientras que de las óticas
sólo un 50%.
Del total de pacientes hay un 59% hombres y un 41% mujeres, con una media de edad de 46
años, siendo el 9% menores de 14 años.
CONCLUSIONES
• Las muestras que hemos recibido con más frecuencia son los exudados óticos.
• A. fumigatus ha sido la especie predominante en las muestras respiratorias y A. niger en
las muestras óticas.
• Sólo el 9% de los aislamientos procedían de pediatría.
• La incorporación de la espectrometría de masas en la rutina diaria de los laboratorios de
microbiología clínica ha supuesto una mejora considerable a la hora de identificar estos
microorganismos.
131
36. Introducción de la espectrometria de masas (maldi-tof) en la identificación de especies
de hongos dermatofitos
Inmaculada Guerrero Lozano, Fátima Galán Sánchez, Francisca de la Rubia Martín, Teresa
Trujillo Soto, Jorge Arca Suárez y Manuel Rodríguez Iglesias.
UGC de Microbiología y Enfermedades Infecciosas. H.U. Puerta del Mar, Cádiz.
Avda. Ana de Viya, 21. CP:11009. e-mail:conchaguelo@hotmail.com
INTRODUCCIÓN
Los hongos dermatofitos son responsables de una gran variedad de infecciones de la piel,
uñas y pelo en mamíferos. Aunque se trata de un grupo homogéneo presentan cierta dificultad para su identificación utilizando los métodos convencionales. A partir del crecimiento
en medios de cultivo la espectrometría de masas puede ofrecer una identificación de hongos
dermatofitos de manera rápida, objetiva y fiable.
OBJETIVO
Analizar la identificación de hongos dermatofitos utilizando la técnica de espectrometría de
masas (MALDI-TOF), en comparación con las especies identificadas anteriormente de manera
convencional.
MATERIAL Y MÉTODO
Revisamos desde 2010 los hongos dermatofitos aislados antes (2010-2012) y después (2013-marzo 2016) de la introducción de MALDI-TOF (Bruker Daltonic MS) en la rutina del laboratorio. De
forma convencionale las muestras se procesaron mediante siembra en agar de Sabouraud con
cloranfenicolC y en agar de Sabouraud con cloranfenicol y cicloheximida, siendo conservados
a temperatura ambiente. La identificación de las diferentes especies se realizó mediante la observación de las características macroscópicas y microscópicas del hongo. Una vez introducida
la espectrometría de masas como técnica diagnóstica las muestras, tras crecimiento en los mismos medios de cultivo, se procesaron para identificarlas mediante (MALDI-TOF), depositando
una parte de la colonia en la placa de acero, extrayendo con 1μl de ácido fórmico y un realizando la identificación proteómica con 1μl de matriz HCCA (ácido ciano-4-hidroxicinamico).
Considerando fiable un score superior 1,7. Esta identificación se realiza al inicio del crecimiento
del hongo dermatofito en agar Sabouraud. Teniendo en cuenta que no todos tienen la misma
velocidad de crecimiento.
RESULTADOS
En el periodo de estudio anterior a MALDI-TOF, se aislaron 102 hongos dermatofitos: Trichophyton rubrum (53,3%); Microsporum canis (20,4%), T. mentagrophytes (16,3%), M. gypseum (4,8%); T. interdigitale (4,8%), Epidermophytum floccosum (2%), T. tonsurans (2%), T.
soudanense (1%), T. violaceum (1%) y Trichophytum sp. (1%). Tras la introducción de MALDI-TOF
se aislaron 95 hongos dermatofitos y fueron identificados como: Trichophyton rubrum
(46,5%), Microsporum canis (16,1%), T. tonsurans (10,4%) T. interdigitale (6,6%), T. mentagrophytes (5,7%), M. gypseum (3,8%) y Epidermophytum floccosum (0,9%). La proporción anual
de los aislamientos se mantuvieron constantes (una media de 33.8 aislamientos/año), con
un ligero descenso en 2015 con solo 24 aislamientos. En todos los aislamientos se obtuvo un
score comprendido entre 1,8 y 2,1.
132
CONCLUSIONES
La introducción de MALDI-TOF, aunque proporciona una amplia base de datos, no ha aumentado la diversidad de especies aisladas, como ocurre con otro tipo de hongos filamentosos.
Esto podría deberse a una baja variedad de hongos dermatofitos en muestro medio. Sin embargo esta técnica aporta rapidez en el diagnóstico, ya que la identificación puede llevarse a
cabo con un mínimo crecimiento del hongo en la placa, antes de que se puedan observar las
características macroscópicas y microscópicas en el medio de cultivo. Así mismo, esta técnica
permite la identificación de todos los aislamientos a nivel de especie de manera fiable y
objetiva.
133
37. Miocarditis aguda candidiásica en un paciente crítico
Miralbes Torner, Mar; Vallverdú Vidal, Montserrat; Iglesias Moles, Silvia; Balsera Garrido, Maria
Begoña; Carvalho Brugger, Sulamita; Palomar Martínez, Mercedes
Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida.
Presentamos el caso de un varón de 75 años, diabético, con úlcera perianal recidivante
que precisó 2 intervenciones quirúrgicas y varios tratamientos antibióticos. Ingresa por
agudización, recibiendo tratamiento con ceftriaxona y posteriormente amoxicilinaclavulánico. A los 15 días se realizó colostomía terminal y 7 días después presentó supuración
por herida de colostomía con signos isquémicos. La Tomografía axial computarizada mostró
signos de suboclusión intestinal de intestino delgado, neumoperitoneo e infección de pared
abdominal pericolostomía, iniciándose piperacilina-tazobactam. A las 48 horas desarrolló
shock séptico ingresando en UCI en situación de fracaso multiorgánico. A su llegada, se inicia
tratamiento con Meropenen, Linezolid y Fluconazol. Posteriormente se recibió Hemocultivo
positivo a Candida albicans. Sin respuesta al tratamiento, el paciente fue éxitus a las 12 horas
del ingreso en UCI.
El estudio histopatológico mostró presencia de hifas tabicadas y esporas PAS positivas
en vejiga, riñón y corazón; sin afectación de otros órganos. En el corazón, lesiones en
subendocardio y entre las fibras miocárdicas. La presencia de infiltrado linfocítico T CD3
positivo en un contaje de más de 14 linfocitos/campo fue diagnóstico de miocarditis aguda
candidiásica (MAC).
134
38. Análisis del tratamiento antifúngico en pacientes críticos no neutropénicos con patología
abdominal complicada.
Carmen Castro (1), Ismail Zakariya-Yousef (1), Elena Marin (1), Desire Macias (1), Ana Loza (1),
Alejandro Ubeda (1), Manuel Parra (1), Emilio Valverde (2), Alfredo Esteban (2), Ana Isabel
Suarez (3), Josefina Ayats (4), David Navarro (5), Estrella Martin-Mazuelos
(1), Grupo De Estudio Cava-Trem (1)
(1)Hospital Universitario de Valme, Sevilla, (2)Complejo Asistencial de León, León, (3)Hospital
Universitario Virgen de la Macarena, Sevilla, (4)Hospital Universitari de Bellvitge, L´Hospitalet
de Llobregat, (5)Hospital Clínico Universitario, Valencia.
Unidad de Microbiología Clínica, H.U. Valme, Sevilla. Ctra. Cádiz s/n. 41018. Sevilla.
mariac.castro.sspa@juntadeandalucias.es
Objetivos
Analizar las diferencias relacionadas con el tratamiento antifúngico (TAF) en pacientes
críticos no neutropénicos con patología abdominal quirúrgica o pancreatitis no intervenida.
Método
Estudio prospectivo, de cohortes, observacional, y multicéntrico, realizado durante 18 meses
en UCIs (9) y REAs (3). Se recogieron datos demográficos, tipo de paciente, APACHE II y SOFA,
comorbilidades, factores de riesgo, características del TAF y evolución clínica. Clasificación:
no colonizados/infectados (NCI), colonización candidiásica bajo (CCBG) y alto grado (CCAG),
e infección documentada (CI) [(Candidemia: (C); Candidiasis intra-abdominal: (CIA)].
Análisis estadístico: variables categóricas (frecuencias y porcentajes) y numéricas [medias
y desviaciones estándar (SD) o medianas y rangos intercuartílicos (IQR)]. Comparaciones:
test de la χ2 (porcentajes), test de Student (medias) y test de Kruskal-Wallis (medianas).
Significación estadística con p < 0.05.
Resultados
Pacientes tratados (n=119)/no tratados (n=114). Se hallaron diferencias estadísticamente
significativas entre los pacientes tratados y no tratados en las siguientes variables: APACHE II
máximo (19.7 ± 6.3 vs 17.6 ± 6.1; p=0.01), SOFA máximo (8 [5; 10] vs 7 [4;10]; p= 0.03), Candida
score máximo (4 [3; 4] vs 3 [2; 4]; p <0.001), estancia media en UCI, días (18 vs 12; p= 0.002) y
hospitalaria, días (43 vs 30 d; p < 0.001), dos o mas intervenciones quirúrgicas (52.1 VS 31.6%;
p=0.03), ATB empírica (100% vs 95.6%, p=0.027), VM (89.1% vs 78.9%, p=0.034) y NP (91.6% vs
74.6%, p<0.001) y en la clasificación microbiológica (p<0.001): NC/NI (17.6% vs 23.7%). CCBG
(48.7% vs 63.2%) y CCAG (9.2% vs 11.4%).
Conclusiones
El 51% de los pacientes recibieron TAF, en su mayoría en monoterapia. Éstos presentaron
mayor APACHE II, SOFA y CS máximos, uso mayor de ATB de amplio espectro, NP y VM, fueron
sometidos a mayor número de procedimientos quirúrgicos y presentan mayor estancia en
UCI y hospitalaria. No se hallaron diferencias en cuanto a mortalidad. El 75% de los pacientes
tratados no tenían CI. El 93.5% de las CI recibieron TAF.
Instituto Salud Carlos III. Beca FIS (PI:13/1168)
135
39. Identificación rápida de levaduras a partir de frascos de hemocultivo positivos mediante
MALDI TOF Vitek MS
Alba Cecilia Ruiz Gaitán, Rabab Chouman Arcas, Miguel Martínez Huguet, Adolfo Magraner
Martínez, José Miguel Sahuquillo Arce, José Luis López Hontangas, Javier Pemán García
Hospital Universitario La Fe. Avenida Abril de Fernando Abril Martorell, 106, 46026, Valencia.
alruga514@yahoo.es
INTRODUCCIÓN:
Las técnicas diagnósticas basadas en el cultivo precisan 48-96 horas para llegar a la
identificación de la especie causal de una candidiasis invasora. Esta demora en el diagnóstico
influye negativamente en el pronóstico de los pacientes pues retrasa la instauración de un
tratamiento antifúngico apropiado. Por esta razón, el desarrollo de métodos rápidos de
identificación podría permitir la elección temprana del tratamiento más adecuado, y reducir
significativamente la morbilidad, mortalidad y costes sanitarios asociados.
OBJETIVO:
Aplicar directamente la espectrofotometría de masas (Maldi Tof MS) en el frasco de hemocultivo y evaluar su utilidad práctica en la correcta identificación de las especies de Candida
aisladas en hemocultivos.
MATERIALES Y METODOS:
Se incluyeron en el estudio todos los hemocultivos positivos con levaduras mediante el sistema BacT/ALERT PLUS® VIRTUO TM (bioMérieux) durante el periodo octubre 2015 a enero
de 2016. El método de extracción utilizado en este estudio fue una adaptación del protocolo
descrito por Lavergne et al 1 para la identificación de especies del genero Candida. Los análisis
se realizaron mediante MALDI- TOF Vitek MS según las instrucciones del fabricante. La identificación de especies se realizó por duplicado utilizando el algoritmo clasificador espectro de
bioMérieux y la base de datos versión MS- ID 1. La identificación fue considerada correcta si
por lo menos una de las dos muestras “spots” tenían una puntuación > 95 % paralelamente
las especies se identificaron mediante las técnicas habituales del laboratorio (MALDI- TOF
desde subcultivos, secuenciación 16S rRNA y pruebas bioquímicas).
RESULTADOS:
Se analizaron un total de 50 hemocultivos. El tiempo medio empleado en la realización del
Maldi Tof directo del frasco de hemocultivo fue de 30 min aproximadamente. Se llegó a
una identificación correcta en 38 (76%) casos por el método directo. La distribución de las
especies aisladas e identificación (BQ-MT subcultivo/ MT directo) fue Candida albicans 9/8
(89%), Candida parapsilosis 26/23 (88%), Candida glabrata 5/3(60%), Candida guillermondii
1/1 (100%), Candida lusitanie 1/1 (100%), Candida tropicalis 3/2 (67%), Cryptococcus neoformans 1/0 (0%) y Candida auris 2/0 (0%). En 12 (24%) casos no se llegó a identificar la especie
(3 especies no estaban incluidas en la base de datos, 7 por dificultad para la obtención del
pellet y 2 infecciones mixtas).
136
CONCLUSIONES:
• La identificación directa de los hemocultivos positivos por técnica MALDI-TOF ofrece resultados fiables equivalentes a la identificación de microorganismos a partir de subcultivo.
• Esta técnica es rápida y eficiente para la identificación de levaduras en hemocultivos en
menos de 30 minutos, tiene un bajo coste en su implementación y proporciona información útil a la hora de iniciar y a optimizar la terapia antifúngica; por lo tanto, ayuda a reducir la morbilidad y la mortalidad.
• Nuestras tres principales limitaciones fueron la dificultad para obtener el sedimento después sucesivas centrifugaciones, la incubación de la sangre con SDS 0,5 % y los hemocultivos con más de un microorganismo.
• C. neoformans y C. auris no pudieron ser identificadas porque no están incluidas en la base
de datos del Maldi tof MS.
137
40. Estudio de la sensibilidad antifúngica de Aspergillus niger complex aisladas en muestras
respiratorias en Andalucía y Extremadura.
Carmen Castro1., Fátima Galan2., Dulce Miralles2., Mª José Linares3, Maye Ruiz4, MªLuisa
Serrano5., Mercedes Ramirez6., Waldo Sánchez-Yedra7., Carmen Pazos8., Carolina Freyre9.
Manuel Rodríguez-Iglesias2 y 9., Estrella Martín-Mazuelos1. GRUPO FUNGAE-IFI1.H.U.Valme,
Sevilla; 2.H. U. Puerta del Mar, Cádiz; 3.H.U. Reina Sofía, Córdoba; 4. H. U. V. Rocío, Sevilla; 5 H.U.
Virgen de las Nieves, Granada; 6. H. San Juan de Dios, Bormujos, Sevilla; 7. H. Torrecardenas,
Almería; 8 H. San Pedro de Alcantara, Cáceres; 9H. U. Puerto Real, Cádiz.
Unidad de Microbiología Clínica, H.U. Valme, Sevilla. Ctra. Cádiz s/n. 41018. Sevilla.
Ctra. Cádiz s/n 41014. Sevilla.
mariac.castro.sspa@juntadeandalucias.es
Objetivo
Estudiar la sensibilidad de especies cripiticas del complejo nigri, aisladas en muestras
respiratorias de pacientes ingresados en 16 hospitales de Andalucía y 2 de Extremadura,
mediante el método de referencia (MD) (Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI
M38-A2) y el método comercial E-test® (E).
Método
Se han estudiado 34 aislados de Aspergillus niger complex (24 A. tubingensis, 9 A. níger “sensu
stricto” y 1 A. carbonarius). La identificacion se ha realizado por métodos convencionales y
mediante secuenciación molecular de los genes de la b-tubulina. La sensibilidad in vitro se ha
se ha determinado por MD y E, siguiendo las instrucciones del documento CLSI M38-A2 y del
fabricante respectivamente. Los puntos de corte han sido los establecidos por el CLSI (Lass-Florl
C. Clin Microbiol Infect 2014). Cepas control: A. flavus ATCC204304 y C. parapsilosis ATCC 22019.
Resultados
ESPECIE
Anfotericina
(MD/E)
Micafung
(MD/E)
Caspofung
(MD/E)
Posaconazol
(MD/E)
Voriconazol
(MD/E)
Itraconazol
(MD/E)
0.22/1.43
0.03/0.007
0.03/0.104
0.07/0.26
0.39/0.74
0.16/2.13
0.5-1 /
1-3
≤0.03-2/
0.19-3
≤0.03/
0.008-0.06
≤0.03/
≤0.003-0.125
≤0.03/
0.125-0.25
≤0.03-0.19/
≤0.003-0.25
0.06-1/
0.25-1.5
≤0.03-1/
0.047-1.5
0.5-2/
1-2
≤0.03-2/
0.19-12
0.5-1/
2-6
≤0.03-1/
0.5-16
0.57/1.44
0.03/0.005
0.03/0.015
0.19/0.34
0.85/0.40
0.28/1.90
1-2/
1-3
0.03-2/
0.75-4
≤0.03/
≤0.003-0.004
≤0.03/
≤0.003-0.125
≤0.03/
≤0.003-.125
≤0.03/
≤0.003-0.19
0.25-0.5/
0.5-1
0.06-0.5/
0.125-1
1-2/
0.38-0.75
0.5-2/
0.25-1
0.5-1/
2-3
≤0.03-1/
1-3
≤0.008/0.03
≤0.008-0.06
≤0.03/0.125
0.25/0.25
0.06/0.38
A. tubingensis (n=24)
GM
CMI 50/90
Rango
A. níger (n=9)
GM
CMI 50/90
Rango
A. carbonarius (n=1)
CMI
0.6/5
• GM: media geométrica.
138
Conclusiones
1. Encontramos un alto número de aislados de A. tubingensis dentro del complejo niger.
2. A. tubingensis presentó menor susceptibilidad a los azoles que A. niger, mientras que la
susceptibilidad a anfotericina B fue mayor.
3. Los valores de CMI a los azoles por Etest fueron 1-2 diluciones superiores que las obtenidos
por microdilución.
4. Los valores de MEC para equinocandinas fueron similares por ambas técnicas.
5. Grupo de estudio FUNGAE-IFI
139
41. Caracterización feno y genotípica de levaduras del género candida aisladas de diferentes
sitios anatómicos.
Alejandra Espinosa1, Monserrat Domínguez1, Joaquín Camacho Proo1, Eva María Vidal1, Teresa
de Jesús Meza1.
1
“Laboratorio de Micología.” Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas. ICUAPBUAP. Puebla, México.
jejeproo@hotmail.com
alejandra.espinosa@correo.buap.mx
En años recientes el aislamiento de especies de Candida no-albicans ha aumentado, Candida
tropicalis, ha sido reportada como la primera o segunda de este grupo de especies que se aísla
con mayor frecuencia en candidosis y/o candedemias en humanos y cuya incidencia está en
función de su distribución geográfica y el grupo de pacientes en estudio.
Con la finalidad de conocer la frecuencia de levaduras del género Candida, se tomaron 60
muestras de pacientes con candidosis de diferentes sitios anatómicos: uñas, orina, vagina,
y faringe entre otros. Se realizaron exámenes directos, cultivos en agar glucosa Sabouraud.
Los cultivos fueron identificados y caracterizados mediante formación de tubos germinales,
biopelículas, el crecimiento en chrom-agar, la detección y amplificación de las regiones ITS1 e
ITS2 del RNA ribosomal (Luo y Michel, 2002).
De las muestras estudiadas se obtuvieron 60 levaduras del género Candida, 13 Candida tropicalis, 13 C. albicans, 32 C. glabrata y 2 C. krusei.
Todas las muestras identificadas como C. albicans formaron tubos germinales, en C. tropicalis,
C. glabrata y C. krusei no se observaron estas estructuras.
La formación de biopelículas fue positiva para la mayoría de los aislados.
C. glabrata se aisló con mayor frecuencia, seguida de C. albicans, C. tropicalis y C. krusei.
Los métodos utilizados chom-agar, formación de biopelículas, tubo germinal y PCR especie
especifica, son de gran utilidad para identificar y caracterizar las levaduras del género Candida.
Agradecimientos
Trabajo financiado por VIEP, proyecto # 47, DES: Ciencias Naturales.
140
42. Nuevos taxones de hongos celomicetos provenientes de aislamientos clínicos de los Estados Unidos de América.
Nicomedes Valenzuela-López1, Deanna A. Sutton2, Pedro Crous3, Josep Guarro1, José Francisco
Cano-Lira1 y Alberto Miguel Stchigel1.
Unidad de Micología y Microbiología, Facultad de Medicina y IISPV, Universitat Rovira i Virgili,
Sant Llorenç 21, 43201 Reus, Tarragona, España.
2
Fungus Testing Laboratory, Department of Pathology, University of Texas Health Science
Center, 7703 Floyd Curl Dr., San Antonio, Texas 78229-3900, USA.
3
CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands.
E-mail: nicomedes.vl@gmail.com
1
Los hongos celomicetos son principalmente organismos parásitos de plantas, pero pueden
ser aislados a partir de muestras de suelo, de agua y otros sustratos naturales y artificiales.
Ocasionalmente, han sido reportados produciendo infecciones en animales, incluyendo el
hombre. En los últimos años se ha documentado un incremento del número de infecciones
humanas debido a éstos hongos (Stchigel y Sutton, 2013). Hoy en día se sabe que, taxonómicamente, los celomicetos pertenecen a diferentes clases y órdenes de la división Ascomycota
(Wijayawardene et al., 2016; Chowdhary et al., 2014). Sin embargo, la gran mayoría de ellos
pertenece al orden Pleosporales, de la clase Dothideomycetes. La familia Cucurbitariaceae, propuesta por Winter en 1885, pertenece a dicho orden y comprende seis géneros: Cucurbitaria,
Curreya, Pyrenochaeta, Pyrenochaetopsis, Rhytidiella y Syncarpella (Doilom et al., 2013). En el
presente estudio, se analizaron 26 cepas identificadas molecularmente cómo pertenecientes
a la familia Cucurbitariaceae, de los cuales trece provienen de especímenes de origen clínico y
de diferentes zonas anatómicas, y el resto son cepas tipo o de referencia de distintos orígenes
geográficos y sustratos. Las cepas fueron sembradas en agar con harina de avena y en agar
con extracto de malta, e incubadas a 25ºC durante 14 días. Las preparaciones se montaron sobre medio de Shear, y las microfotografías se obtuvieron con un microscopio Axio Imager-M1.
Para documentar las características macro- y microscópicas de cada hongo se siguieron las
directrices del manual de Boerema et al. (2004). El análisis filogenético se basó en un estudio
multi-locus incluyendo cuatro loci: los dominios D1 y D2 del gen 28S del nrRNA, el gen 5.8S y
sus dos espaciadores intergénicos (ITS), y fragmentos de los genes btubulina (TUB) y de la subunidad II de la ARN polimerasa (RPB2). En dicho estudio se empleó el programa SeqMan para
la obtención de las secuencias consenso de cada locus, el MEGA 6.06 para los alineamientos
y la reconstrucción de la filogenia mediante máxima verosimilitud, y MrBayes 3.2.4 para determinar la probabilidad posterior. Como resultado del estudio multi-locus se describen cinco
nuevas especies para el género Pyrenochaetopsis, dos para Pyrenochaeta y un género nuevo
para la familia. Hasta la fecha, tan solo existen reportes de infecciones en el hombre debidas
a especies del género Pyrenochaeta, razón por la cual se puede considerar al género Pyrenochaetopsis como un género patógeno oportunista emergente.
141
Referencias
• Boerema, G. H., Gruyter, J. D., Noordeloos, M. E., & Hamers, M. E. (2004). Phoma identification manual. Differentiation of specific and infra-specific taxa in culture. CABI publishing.
• Chowdhary, A., Perfect, J., & De Hoog, G. S. (2014). Black molds and melanized yeasts pathogenic to humans. Cold Spring Harb Perspect Med, 5, a019570.
• Doilom, M., Liu, J. K., Jaklitsch, W. M., et al. (2013). An outline of the family Cucurbitariaceae.
Sydowia, 65, 167-192.
• Stchigel, A. M., & Sutton, D. A. (2013). Coelomycete fungi in the clinical lab. Current Fungal
Infection Reports, 7, 171-191.
• Wijayawardene, N. N., Hyde, K. D., Wanasinghe, D. N. et al (2016). Taxonomy and phylogeny
of dematiaceous coelomycetes. Fungal Diversity, 1-316. DOI 10.1007/s13225-016-0360-2.
142
43. Formación de biopelícula por aislamientos orales de Candida
Katherine Miranda-Cadena, Lucía del Río, Cristina Marcos-Arias, Elena Eraso y Guillermo
Quindós
Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología, Unidad de formación e investigación multidisciplinar ‘Microbios y Salud’ (UFI 11/25), Facultad de Medicina y Enfermería, Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea (UPV/EHU), Bilbao.
kmiranda001@ikasle.ehu.eus
Introducción: Candida es un patógeno oportunista, colonizador de mucosas en humanos,
capaz de formar biopelículas con mayor resistencia a las defensas del hospedador y al tratamiento con fármacos antifúngicos convencionales.
Objetivos: Comparar la producción de biopelícula de los aislamientos orales de diferentes
especies de Candida.
Métodos: Se estudió la producción de biopelícula de 35 aislamientos orales de Candida que
incluían 10 Candida albicans, 10 Candida glabrata, cinco Candida parapsilosis sensu lato, tres
Candida dubliniensis, tres Candida krusei y dos aislamientos de cada una de las especies Candida guilliermondii y Candida tropicalis. Además se incluyeron Candida africana ATCC 2669,
C. albicans ATCC 90028, C. dubliniensis NCPF 3949, C. glabrata ATCC 90030, C. krusei ATCC
6258 y C. parapsilosis ATCC 22019. Se empleó el método de desarrollo de biopelículas descrito
por Ramage y cols. [1] en medio RPMI tamponado con MOPS (Sigma, EEUU) en placas de microtitulación de 100 pocillos durante 24 y 48 h en una incubadora microbiológica BioScreen
C (Labsystems, Finlandia). Tras la eliminación de las células planctónicas, se determinó la biomasa y la actividad metabólica de la biopelícula formada por cada aislamiento mediante los
métodos de tinción con cristal violeta (CV) y reducción de sales de tetrazolio (XTT) a formazán, respectivamente. Como controles se utilizaron C. albicans SC 5314 y la cepa mutante Ca2
de C. albicans no productora de micelio. Los aislamientos se clasificaron por su capacidad
productora de biopelícula como muy productores, productores intermedios y no productores
de acuerdo a los valores medios de la absorbancia medidos por cada método.
Resultados: El 94,5% de los aislamientos de Candida albicans produjo biopelículas con abundante biomasa (CV) y alta actividad metabólica (XTT). Todos los aislamientos de Candida
tropicalis también produjeron abundante biomasa pero mostraron actividad metabólica intermedia y baja. Un aislamiento de Candida dubliniensis fue clasificado como muy productor
de biopelícula con alta actividad metabólica y abundante biomasa, mientras que el resto de
los aislamientos mostraron una producción intermedia o escasa de biopelícula. El 98,8 % de
los aislamientos de Candida glabrata produjeron biopelículas con baja actividad metabólica
y poca biomasa; sin embargo, un aislamiento resistente a fluconazol mostró una producción
intermedia de biomasa aunque la actividad metabólica fue muy baja. Todos los aislamientos
de Candida krusei mostraron poca actividad metabólica y produjeron escasa biomasa excepto uno que mostró una producción intermedia. Un aislamiento de Candida guillermondii
presentó producción intermedia y el otro mostró poca producción de biopelícula. Un aislamiento de Candida parapsilosis sensu stricto fue muy productor de biomasa pero al igual
que el resto de especies del complejo Candida parapsilosis, esta biopelícula tenía baja actividad metabólica. No se encontraron diferencias significativas en la producción de biopelícula
entre Candida albicans, Candida tropicalis, Candida dubliniensis y Candida guillermondii (p:
143
>0,9999, >0,8279 y 0,2439; p: >0,9999, >0,9999 y 0,2266; con CV y XTT, respectivamente). Sin
embargo, Candida albicans fue más productora que Candida krusei, Candida glabrata y los
aislamientos orales del complejo Candida parapsilosis y esta diferencia sí fue significativa (p
<0,0001). No se encontraron diferencias significativas entre las absorbancias medidas por los
métodos de CV y XTT a 24 h y 48 h (p: 0,8803 CV y p: 0,7253 XTT).
Conclusiones: Candida albicans es la especie con mayor capacidad formadora de biopelícula
sobre poliestireno seguida por Candida dubliniensis y Candida tropicalis que mostraron una
capacidad productora similar. Sin embargo, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida
glabrata y Candida parapsilosis son especies con una capacidad productora de biopelícula
intermedia o escasa.
Financiación: Este estudio ha sido financiado por la Fundación ONCE “Oportunidad al Talento”, GIC12 210-IT-696-13 (Gobierno Vasco-Eusko Jaurlaritza) y UFI 11/25 (UPV/EHU). Referencias: [1] Ramage G, VandeWalle K, Wickes BL, López-Ribot JL. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev Iberoam Micol. 2001; 18: 163-170.
144
44. Mucormicosis rino-cerebral en paciente crítico tras implante dental.
Vallverdú Vidal, Montserrat; Iglesias Moles, Silvia; Balsera Garrido, Maria Begoña; Miralbes
Torner, Mar; Carvalho Brugger, Sulamita; Palomar Martínez, Mercedes.
Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida.
Presentamos el caso de un paciente de 72 años con antecedentes de diabetes tipo II
evolucionada y colocación puente dental superior derecho hace 4 meses. Ingresa por cuadro
dolor, edema facial, ptosis palpebral derecha rapidamente progresiva complicada con
oftalmoplegia total OD con midriasis, inestabilidad en la marcha y shock séptico. Se realiza
TAC facial/senos que demuestra sinupatía etmoido-maxilar derecha. Resonancia magnética
axial en T2 evidencia ocupación del seno maxilar derecho con centro hipointenso en T2
compatible con sinusitis fúngica/mucormicosis con extensión del proceso infeccioso a la
órbita y foco de difusión restringida a nivel frontal derecho que brilla en difusión en relación
con cerebritis. Tras dichos hallazgos se inicia cobertura antibimicrobiana y antifúngica con
piperacilina-tazobactam, vancomicina y anfotericina B lipososmal junto con amplia exéresis
quirúrgica de las lesiones accesibles. Se realiza maxiloetmoidectomia medial externa con
exéresis de tejido necrótico en etmoides anterior y posterior, drenaje de fosa pterigomaxilar
derecha con extracción de tornillo de implante dentario derecho. Evolución marcada por
hipotensión arterial que requirió soporte con drogas vasoactivas y fracaso renal agudo
durante las primeras 72 horas de ingreso. La anatomía patológica confirmó el diagnóstico de
mucormicosis, por lo que se retiró vancomicina y piperaciclina-tazobactam y se ajustó dosis
de Anfotericina B liposomal. La evolución fue favorable y tras 33 dias de ingreso hospitalario
el paciente fue dado de alta vivo.
145
45. Identificación de Candida parapsilosis sensu lato mediante PCR-RFLP.
Nerea Pena-Fernández, Camino Trobajo-Sanmartín, Cristina Marcos-Arias, Estibaliz
Mateo-Alesanco, Emilia Cantón y Guillermo Quindós.
1
Laboratorio de Micología Médica, Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología, Unidad de formación e investigación multidisciplinar ‘Microbios y Salud’ (UFI 11/25), Facultad de Medicina y Enfermería, Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea (UPV/
EHU), Bilbao1, Estibaliz Mateo-Alesanco1, Elena Eraso1, Emilia Cantón2 y Guillermo Quindós1
Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia
Correo electrónico: cristina.marcos@ehu.eus
2
La reciente descripción de las especies crípticas relacionadas Candida metapsilosis y Candida
orthopsilosis, indistinguibles mediante los métodos micológicos convencionales, hace necesario el desarrollo de técnicas moleculares para su identificación. Conocer el papel etiológico de
estas especies crípticas es esencial ya que Candida parapsilosis es una causa importante de
candidiasis invasora y es la segunda especie más frecuentemente aislada de sangre en España.
Objetivo: Estudiar la prevalencia de Candida parapsilosis sensu stricto, C. metapsilosis y C.
orthopsilosis entre los aislamientos clínicos previamente identificados como Candida parapsilosis sensu lato comparando dos métodos moleculares basados en una PCR y posterior digestión con endonucleasas de restricción (PCR-RFLP).
Métodos: Se evaluaron 95 aislamientos clínicos procedentes del Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Candida parapsilosis ATCC 22019, Candida metapsilosis ATCC 96143 y Candida
orthopsilosis ATCC 96139 fueron utilizadas como controles. Se amplificó un fragmento de 716
pb del gen que codifica la enzima alcohol deshidrogenasa secundaria (SADH) mediante el método descrito por Tavanti et al (SADH-RFLP) [1] que posteriormente fue digerido con la enzima
de restricción BanI. C. parapsilosis, C. metapsilosis y C. orthopsilosis contienen uno, tres y ningún
sitio de restricción, respectivamente. El método descrito por García-Effron et al [2] amplifica un
fragmento del gen FKS1 (FKS1-RFLP) de 1032 pb que posteriormente se digiere con la endonucleasa EcoRI y genera fragmentos que contienen cuatro, tres y ningún sitio de restricción correspondientes a C. metapsilosis, C. orthopsilosis y C. parapsilosis respectivamente. Cuando se
obtuvieron resultados de identificación dudosos (probable coaislamiento mixto), se procedió
a la resiembra del aislamiento en el medio cromógeno Candida Chromogenic Agar y amplificación del dominio D1/D2 de la subunidad LSU 26S con los primers NL1 y NL4 para su posterior
secuenciación.
Resultados: La identificación fue concordante por ambos métodos en 81 de los 95 aislamientos analizados (85,2%), de los cuales 70 aislamientos fueron identificados como C. parapsilosis
(86,4%) y 11 aislamientos como C. orthopsilosis (13,6%). Cinco aislamientos (5,3%) mostraron
resultados de identificación discrepantes, de los cuales dos aislamientos identificados como C.
parapsilosis mediante SADH-RFLP fueron identificados como C. orthopsilosis mediante FKS1RFLP y dos aislamientos identificados como C. orthopsilosis mediante SADH-RFLP fueron identificados como C. parapsilosis mediante FKS1-RFLP. Un aislamiento mostró una banda de tamaño
similar a C. orthopsilosis mediante SADH-RFLP y fue identificado como C. metapsilosis por FKS1RFLP. La secuenciación de este aislamiento confirmó su identificación definitiva como C. me-
146
tapsilosis. Cuatro aislamientos no amplificaron mediante FKS1-RFLP y sí lo hicieron por SADHRFLP identificándose como C. parapsilosis. Además, tres aislamientos que no amplificaron o
mostraron resultados de amplificación dudosos fueron resembrados en medio cromógeno y
se separaron dos morfotipos diferentes que amplificaron como C. parapsilosis y C. orthopsilosis
mediante SADH-RFLP. Cuatro aislamientos puros identificados como C. parapsilosis por SADHRFLP y un aislamiento identificado como C. orthopsilosis por FKS1-RFLP generaron un patrón de
bandas híbrido cuando se analizaron por el método alternativo.
Conclusiones: C. orthopsilosis es la especie críptica más frecuentemente aislada y puede
coaislarse con C. parapsilosis. Ambos métodos de PCR-RFLP son útiles para la identificación
de las especies crípticas del complejo C. parapsilosis y pueden utilizarse de forma complementaria.
Financiación: Fundación ONCE «Oportunidad al Talento», GIC12 210-IT-696-13 (Gobierno Vasco-Eusko Jaurlaritza) y UFI 11/25 (UPV/EHU).
Referencias: [1] Tavanti et al. JCM 2005; [2] Garcia-Effron et al. JCM 2011
147
46. Onicomicosis en ancianos diabéticos: diagnóstico por métodos convencionales vs. moleculares
Tania Ibáñez1, Consuelo Ferrer1,2; Esther Chicharro1 y Mª Francisca Colom1
Universidad Miguel Hernández.Campus de Sant Joan d’Alacant. Alicante 03550.
Centro Inmunológico de Alicante. Sant Joan d’Alacant, Alicante 03550
colom@umh.es
1
2
La onicomicosis, es una infección micótica de las uñas causada por levaduras u hongos
filamentosos. Se estima que un tercio de los pacientes diabéticos padecen esta afección,
frente a una prevalencia de aproximadamente el 10% en la población general. El diagnóstico
de este proceso infeccioso mediante técnicas convencionales de micología, se basa en la
detección de elementos fúngicos por visualización directa de las muestras y por cultivo en
Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) u otros medios. Existe también la posibilidad de realizar esta
detección mediante técnicas de biología molecular con amplificación y secuenciación de las
regiones barcode de los genes ribosómicos (rDNA) y sus espaciadores (ITS1-2).
En nuestro centro estamos llevando a cabo un estudio de prevalencia de onicomicosis en pacientes
mayores de 65 años, seleccionando distintos aspectos de esta población en cuanto a factores de
riesgo que predispongan la aparición de esta micosis. En el estudio que se presenta, se estudiaron
las muestras correspondientes a 23 ancianos diabéticos que presentaron algún síntoma sugerente
de onicomicosis. Por otra parte, se consideraron diferentes factores clínicos generales (hipertensión,
hipercolesterolemia, enfermedades cardiovasculares, respiratorias, etc) y factores podológicos
(tipo de calzado, hábito de caminar, hábitos higiénicos, etc) para evaluar su posible relación con el
desarrollo de la enfermedad. Se obtuvieron 50 muestras de uñas de los pies de los 23 pacientes.
Estas se sometieron a examen microscópico con KOH 10%, azul de lactofenol y blanco de calcoflúor.
Se cultivaron en SDA y se sometieron a extracción de DNA y posterior amplificación por PCR.
En el 34.8% (n=8) de los pacientes, el diagnóstico de onicomicosis fue positivo en uno o
ambos pies y por alguno o todos los métodos diagnósticos ensayados. De las 50 muestras
analizadas, el 6.0% (n=3) fueron positivas por microscopía, el 6.0% (n=3) por cultivo, y 16.0%
(n=8) por PCR. Las especies fúngicas detectadas fueron: Aspergillus sydowii (7 muestras – 14%)
y Trichophyton interdigitale (1 muestra – 2%).
No se encontró relación estadísticamente significativa entre el desarrollo de onicomicosis y
ninguno de los aspectos clínicos y podológicos considerados en el estudio, excepto el de partida,
que es la diabetes mellitus. El porcentaje de pacientes positivos en nuestro estudio, es similar al
descrito previamente en esta población. El método diagnóstico más sensible y específico fue la
amplificación de secuencias ITS por PCR. En cuanto a las especies fúngicas detectadas, todas han
sido antes descritas como agentes de onicomicosis en uñas de los pies. No obstante, cabe destacar
la elevada prevalencia de Aspergillus sydowii y la baja detección de géneros de hongos dermatofitos.
Consideramos necesario ampliar el número de muestras y pacientes estudiados para llegar a
conclusiones firmes sobre la prevalencia de onicomicosis en ancianos y, especialmente para
descartar la relación entre esta patología y otros factores de salud general y podológica. Por otra
parte, un amplio estudio con identificación precisa de géneros y especies implicados, permitirá
valorar el significado patológico de especies como Aspergillus sydowii y otras rara vez descritas en
clínica hasta el momento.
148
47. Candidemias en un hospital universitario: revisión de 16 años
Aixalà N, Cruellas ML , Lupiañez A., Garcia Solé M, Garcia González M, Aramburu J
Sección de Microbilogía del Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida.
Avenida Alcalde Rovira Roure, número 80, 25198 Lleida (España)
nuriaaixala@hotmail.com
INTRODUCCIÓN
Las infecciones sistémicas por Candida sp son una causa importante de morbilidad y mortalidad en pacientes ingresados.
OBJETIVO
Estudiar los aislamientos del género Candida en muestras de hemocultivos en nuestro hospital.
MATERIAL Y METODOS
Revisión retrospectiva y descriptiva de 16 años (2000-2015) de los aislamientos de Candida sp
en la sección de Microbiologia de nuestro Hospital. Los hemocultivos se procesaron en sistema ESP (Difco) (2000-2005), Versatrek (Difco) (2003 a 2012) y Bactec 9240 (Becton-Dickinson)
(desde 2013). La identificación hasta noviembre de 2013 se realizó por galerías de pruebas API
32C (Bio-Mérieux) y a partir de entonces por espectrometría de masas Maldi-Toff (Bruker). Se
consideró 1 aislamiento por paciente.
RESULTADOS
Hemos aislado en total 179 Candida sp en sangre de otros tantos pacientes, con un promedio
de 11 aislamientos por año. La especie más frecuente ha sido C.albicans (48%), predominando
todos los años excepto en 2005 y en 2015. En 2005 sólo representó el 14% de las especies aisladas en detrimento de C.glabrata (que supuso el 36%) y en 2015 se igualó a C.glabrata en 6
cepas de cada especie (entre ambas especies supusieron el 63 % de las cepas). En el año 2012,
hubo un predominio casi absoluto de C.albicans (89%).
Dentro de las especies no albicans, las más frecuentes son C. glabrata (14%), C.parapsilosis
(13%), C.krusei (6%) y otras (19%).
La distribución a través de los años muestra un pico entre los años 2007-2010. Sólo estos 3
años concentran el 36% de todos los aislamientos del estudio.
CONCLUSIONES
Las 3 especies más prevalentes C.albicans, C.glabrata y C.parapsilosis configuran las ¾ partes
de los aislamientos.
Entre las especies “no albicans”, C.glabrata es la más frecuente, hecho a tener en cuenta,
ya que esta especie presenta mayor resistencia a algunos antifúngicos de uso habitual en
clínica.
La complejidad de los pacientes atendidos en nuestro hospital acentúa la importancia del seguimiento de candidemias, especialmente en servicios como la Unidad de Cuidados Intensivos.
149
48. Aislamientos fúngicos en pacientes con fibrosis quística durante 52 meses en un hospital
terciario.
Marina Fernández Torres, 1Itziar Angulo López, 1Asunción Rodríguez Feijoo, 1Jesús Agüero
Balbín, 2Esther González Escartín, 2Rocío Sancho Gutiérrez, 2Elena Pérez Belmonte, 2María
Jesús Cabero Perez, 3José Alberto Espinoza Pérez, 3David Iturbe Fernández, 1María Pía Roiz
Mesones,
1
Servicio de Microbiología y Parasitología, Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. 2Servicio
de Pediatría, Hospital Universitario Marqués de Valdecilla.3Servicio de Neumología,
1
Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. marinafernandezt@humv.es.
Dirección postal: Servicio de Microbiología, Pabellón 20, 2ª planta, Avda. Valdecilla nº25, 39008,
Santander (Cantabria)
Introducción y objetivos: El tratamiento prolongado con antimicrobianos en los pacientes
con fibrosis quística (FQ) facilita el asentamiento de agentes fúngicos (levaduras y hongos
filamentosos) que complican aún más el patrón de colonización bronquial. En dichos pacientes
las levaduras suelen considerarse microorganismos saprofitos sin interés clínico. Sin embargo,
el aislamiento de Aspergillus fumigatus puede estar asociado en estos pacientes con la
Aspergilosis Broncopulmonar Alérgica.
Nuestros objetivos han sido: 1) Conocer la prevalencia de hongos en muestras respiratorias de
pacientes con FQ procesadas en nuestro centro hospitalario. 2) Describir los hongos aislados
y su distribución por sexo y edad de los pacientes. 3) Analizar la coexistencia de bacterias de
interés clínico en las muestras estudiadas.
Material y métodos: Estudio observacional retrospectivo de muestras del tracto respiratorio
inferior de pacientes con FQ analizadas en el Servicio de Microbiología de nuestro centro desde
el 01/01/2012 al 30/04/2016. Las muestras se sembraron de forma cuantitativa en medios de
cultivo generales y selectivos para el crecimiento de hongos. La identificación de los hongos
aislados se realizó mediante estudio morfológico macro y microscópico, pruebas bioquímicas
y/o espectrometría de masas (MALDI-TOF Vitek® MS). Se llevó a cabo identificación molecular
si no se logró una identificación definitiva por los anteriores métodos y si se consideró
clínicamente relevante (secuenciación de las regiones espaciadoras internas, ITS 1 y 2, del
DNA ribosómico).
Resultados: Durante el periodo del estudio se procesaron 703 muestras del tracto respiratorio
inferior (esputo, esputo inducido, lavado broncoalveolar y broncoaspirado) correspondientes
a 67 pacientes. Se evidenció el crecimiento de hongos patógenos en 127 (18,21%) de las
muestras. Estas muestras correspondieron a 26 (38,80%) pacientes de los cuales un 38%
fueron hombres y un 62% mujeres. La edad media de los pacientes fue de 22 años, con una
desviación estándar de 13,4.
150
Se identificaron 158 hongos, de los cuales 118 (74,7%) fueron hongos filamentosos (HF) y 40
(25,3%) hongos levaduriformes (HL). Los HF que se aislaron fueron: 53 (44,90%) Aspergillus
fumigatus, 25 (21,20%) Aspergillus terreus, 21 (17,8%) Aspergillus flavus, 6 Aspergillus spp., 3
(2,50%) Scedosporium apiospermum, 1 (0,8%) Rhizopus spp, 1 (0,8%) Mucor spp, y 8 (6,80%)
HF en los que no se llegó a identificar género/especie. Los HL aislados fueron: 21 (52,50%)
Candida albicans, 7(17,5%) Candida parapsilopsis, 5 (12,50%) Candida guillermondii y 7 (17,50%)
HL en los que no se llegó a determinar género/especie.
En cuanto a las bacterias que se aislaron simultáneamente fueron: 55 (34,80%), Staphylococcus
aureus, 53 (33,50%) Pseudomonas aeruginosa, 23 (14,60%), Stenotrophomonas spp y 6 (3,80%)
Burkholderia spp.
Conclusiones: Los aislamientos fúngicos de las muestras respiratorias de pacientes con
FQ procesadas en nuestro centro son más comunes en mujeres jóvenes, y los hongos más
frecuentemente aislados, tal y como se describe en la literatura, son A. fumigatus, A. terreus y
C. albicans. La coexistencia de aislamientos bacterianos fue muy frecuente, siendo S. aureus, P.
aeruginosa, Stenotrophomonas spp y Burkholderia spp las especies más prevalentes.
151
49. Estudio de la sensibilidad de cepas de fusarium spp a isavuconazol mediante e-Test
Inmaculada Guerrero Lozano, TeresaTrujillo Soto, Fátima Galán Sánchez, Jorge Arca Suárez ,
Francisca De La Rubia Martín y Manuel Rodríguez Iglesias.
UGC de Microbiología. H.U. Puerta del Mar, Cádiz.
Avda. Ana de Viya, 21. CP:11009. e-mail:conchaguelo@hotmail.com
INTRODUCCIÓN
Fusarium es un hongo fitopatógeno que puede infectar al humano de forma ocasional,
manifestándose como infecciones de tipo alérgico (sinusitis), intoxicaciones alimentarias,
queratitis, onicomicosis e, incluso, fusariosis invasoras. Isavuconazol en un antifúngico
indicado para el tratamiento de aspergilosis y/o mucormicosis invasoras en adultos y que
presenta actividad frente al género Fusarium aunque no de forma absoluta.
OBJETIVO
Evaluar la actividad de isavuconazol frente a aislados clínicos de Fusarium spp.
MATERIAL Y MÉTODO
Se utilizaron para el estudio 22 cepas de Fusarium spp. aisladas en nuestro hospital en
diferentes muestras superficiales como uñas, pelos, escamas, exudados de heridas y raspado
corneal/liquido de lentillas, correspondiendo las siguientes especies: F. solani, (9) F. oxysporum,
(8) F. moniliforme, (3) F. proliferatum (1) y F. chlamydosporum (1). Fueron identificadas mediante
características macroscópicas, microscópicas y por espectrometría de masas (MALDI-TOF). Se
realizó fungigrama mediante E-test (Diagnostici Liofichen s.v.l) de isavuconazol a todas las
cepas con un inóculo al 1% McFarland y se sembró en medio RPMI 2% glucosado. La lectura se
realizó a las 48 y 72 horas de incubación a 37ºC.
RESULTADOS
La lectura de CMI (concentración mínima inhibitoria) se realizó a las 48 horas, tomando como
referencia una inhibición del crecimiento mayor o igual al 80%. Las CMI obtenidas fueron las
siguientes. Para F. solani CMI >32 mg/L en 8 cepas y 1 cepa con CMI=3 mg/L. F. oxysporum CMI
>32 mg/L en 3 cepas, 4 cepas con CMI=1.5 mg/L y una cepa con CMI=2 mg/L. F. moniliforme
CMI=1.5 mg/L en las tres cepas estudiadas. La única cepa de F. proliferatum fue resistente
(CM I>32 mg/L) y la única cepa de F. chlamydosporum tenía una CMI=1 mg/L). La especie con
mayor actividad frente a isavuconazol fue F. moniliforme, así como cuatro aislamientos de F.
oxysporum.
CONCLUSIONES
Las CMI obtenidas son superiores a los puntos de corte clínicos descritos para Aspegillus, en
la Versión 8.0 de EUCAST. Aunque harían falta estudios con mayor número de cepas así como
trabajos donde se diferencien entre las distintas especies de Fusarium, parece que existen
diferencias entre las distintas especies de este género.
152
50. Candidiasis sitémica orígen renal.
Vallverdú Vidal, Montserrat; Iglesias Moles, Silvia; Balsera Garrido, Maria Begoña; Miralbes
Torner, Mar; Carvalho Brugger, Sulamita; Palomar Martínez, Mercedes.
Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida.
Presentamos el caso de un paciente de ­­­79 años, alérgico a la penicilina con antecedentes de
HTA, dislipemia, DM II mal controlada, cardiopatía isquémica, insuficiencia renal crónica leve
con estenosis de la unión pielocalicial crónica, EPOC moderado. Ingresa por dolor a nivel de
flanco izquierdo sin irradiación, con astenia y anorexia de 5 dias de evolución, con fracaso renal
agudo, leucocitosis con PCR elevada y caogulopatia, Combur test compatible con infección
del trato urinario, iniciándose antibioterápia con Ciprofloxacino.Ecografia renal que muestra
riñones de medida globalmente preservada con importante dilatación pielocaliciliar izquierda
atribuible a estenosis de la unión pielocaliciliar. TAC abdominal simple muestra aumento de
tamaño de la pelvis renal izquierda con contenido hipodenso y alta densidad periférica, con
dificultad para determinar las caracteríticas de la lesión. Se decide colocación catéter ureteral
sin éxito por lo que se procede colocación Nefrostomía percutánea izquierda. Los cultivos
y la histopatologia son negativos. En planta el paciente permanece hemodinamicamente
estable con diuresis correcta, mejoría de la función renal, descenso de los reactantes de fase
aguda, tolerando la ingesta oral y la deambulación pudiendo ser dado de alta a domicilio con
nefrostomía y habiéndose retirado antibioterápia.
A los 12 días de ser dado de alta, reingresa por fiebre con mal estado general, astenia, leve
empeoramiento de la función renal y elevación de los reactantes de fase aguda, se inicia
antibioterápia con Ceftriaxona. Ecografía +TAC abdominal muestra quiste renal izquierdo
/ tumor quístico izquierdo complicado (probable absceso dada la clínica del paciente).
Se procede a drenaje del foco, con colocación Pig-Tail y extracción muestras para cultivo y
citología. Citologia negativa para células malignas, Hemocultivo, Urinocultivo y absceso renal
E.faecalis, recambiándose antibioterápia a Amoxicilina-clavulánico. El décimo día de ingreso
empeoramiento clínico, sudoración profusa, mala perfusión periférica, frialdad cutanea,
relleno capilar > 2sg, hipotensión y oligoanúria, con deterioro de la función renal, aumento
de los reactantes de fase aguda, acidosis metabólica y coagulopatía, ingresa en UCI. TACPAAF muestra persistencia colección pararrenal izquierda, por lo que se recoloca Pig-Tail y
toma de cultivos. Hemocultivo Cándida glabrata, Urinocultivo Cándida albicans y absceso
renal Cándida glabrata y Cándida albicans, se inicia terapia con Anidulafungina+Linezolid.
Ecocardiografía sin evidencia de endocarditis, Fondo de ojo que descarta endoftalmitis.
Evolución marcada por empeoramiento clínico con fiebre de hasta 40ºC, bacteriemia,
somnolencia e inestabilidad hemodinámica. Se realiza nuevo TAC abdominal­­­­objetivándose
persitencia de la colección pararenal izquierda. Dados los hallazgos y empeoramiento clínico
se realiza nefrectomía izquierda urgente. La histopatología objetivó pielonefritis crónica con
gran abscesificación de quiste renal con esporas de hongos en su interior con tinción PAS+
para microorganismos fúngicos. Tras 31 días de ingreso hospitalario el paciente es dado de
alta vivo a la unidad de convalescencia.
153
51. Nuevas perspectivas sobre el papel de FluG en la inducción del desarrollo asexual en Aspergillus nidulans
Mikel Iradi, Marc S. Cortese y Unai Ugalde
Unidad de Bioquímica II, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad del País Vasco, Paseo Manuel de Lardizabal, 20018, San Sebastián-España.
El desarrollo asexual de Aspergillus nidulans está condicionado por estímulos ambientales,
como son la luz, la emergencia al aire, la densidad celular y a limitación de nutrientes. El gen
fluG es uno de los factores de inducción temprana en la respuesta a estos estímulos (Adams
et al., 1998).
Estudios anteriores constataron que un mutante nulo fluG da lugar a un fenotipo aconidial
(Lee and Adams, 1994). Mutaciones puntuales en este gen pueden resultar en defectos parciales como la falta de respuesta a la luz roja (Yager et al., 1998) o la sensibilidad a la temperatura (Lee and Adams, 1994). El extremo C-terminal del gen fluG, cuya secuencia muestra
similitud con una glutamina sintetasa bacteriana, es suficiente para inducir la esporulación
(D’Souza et al., 2001)
Estudios bioinformáticos actualizados predicen dos dominios diferenciados en fluG. El primero
reside en el extremo N-terminal y tiene similitud con una amidohidrolasa de Lactobacillus casei.
El extremo C-terminal, tiene similitud con una glutamina sintetasa de Bacillus subtilis. La conservación de residuos a los que se adscribe actividad catalítica, sostiene la hipótesis que ambas
zonas puedan tener actividad enzimática.
En este trabajo, ambos dominios han sido separados y expresados por separado bajo el promotor nativo de fluG, con el objeto de determinar el papel que pueden jugar en la funcionalidad
de la proteína. Los resultados obtenidos, indican que el dominio C-terminal es esencial para la
esporulación, si bien la ausencia del dominio N-terminal da lugar a un fenotipo de conidiación
retardada. Este resultado es coherente con un modelo según el cual, las dos actividades enzimáticas actuarían de manera consecutiva en la producción de un factor de señalización que le
ha sido atribuido a FluG en estudios anteriores (Lee and Adams, 1994).
Referencias
Adams,T.H., Wieser,J.K., and Yu,J.H. (1998) Asexual sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiol
Mol Biol Rev 62: 35-54.
D’Souza,C.A., Lee,B.N., and Adams,T.H. (2001) Characterization of the role of the FluG protein in
asexual development of Aspergillus nidulans. Genetics 158: 1027-1036.
Lee,B.N., and Adams,T.H. (1994) The Aspergillus nidulans fluG gene is required for production
of an extracellular developmental signal and is related to prokaryotic glutamine synthetase I.
Genes Dev 8: 641-651.
Yager,L.N., Lee,H.O., Nagle,D.L., and Zimmerman,J.E. (1998) Analysis of fluG mutations that affect
light-dependent conidiation in Aspergillus nidulans. Genetics 149: 1777-1786.
ÍNDICE DE
AUTORES
Índice de Autores
A
Abad-Diaz de Cerio, Ana 35
Acqua Coutinho, S. Dall’ 114
Agreda-Mellon, Daniel 81
Agüero Balbín, Jesús 44, 148
Aguirre, José Manuel 35
Aixalà, N 147
Alastruey-Izquierdo, Ana 66
Aldars-García, Laila 108
Alonso-Rodríguez, Esmeralda 53, 56
Alvarez Duarte, Eduardo 39, 97
Angulo López, Itziar 83, 148
Antoran, Aitziber 20, 31, 34, 115
Aramburu J 129, 147
Arana, Mikel 34
Arca Suárez, Jorge 130, 150
Ariño, Joaquín 19
Arnáiz-Pita, Yolanda 17
Arrillaga, Isabel 40, 90
Arroyo, Javier 33
Asier Domínguez 120
Asunción Rodríguez Feijoo 148
Ayats, Josefina 133
B
Bader, Oliver 64
Balsalobre, Luz 123
Balsera Garrido, Maria Begoña 46, 79, 117,
132, 143, 151
Barba, Josefa 123
Bautista Peris, Juan 40, 90
Berciano Ramírez, Elena María 85
Bernal-Martínez, Leticia 81
Bernet A. 98, 129
Bernet Sánchez, A. 79
Berroa, Marta 31
Bougnoux, Marie-Elisabeth 17
Bragulat, M. Rosa 22, 65, 82, 89, 114
Bru, Samuel 58
Buendía, Buenaventura 123
Buldain, Idoia 20, 31, 34, 115
C
Cabañes, F. Javier 15, 22, 65, 82, 89, 113, 114
Cabero Perez, María Jesús 148
Calderón-Noreña, Diana 17
Calleja Fernández, R. 79
Calleja, R. 98
Calvo Torras, Maria dels Àngels 109
Camacho Proo, Joaquín 138
Cano-Lira, José Francisco 139
Cansado, José 96
Cantón, Emilia 91
Capilla, Javier 48, 74, 87
Carton, Juan Daniel 120
Carvalho Brugger, Sulamita 46, 117, 132, 143,
151
Casal Román, Manuel 118
Castellá, Gemma 22, 65, 82, 114
Castillo, Dalia 107
Castro, Carmen 133, 136
Chicharro, Esther 146
Chouman Arcas, Rabab 134
Cid, Víctor J. 28
Ciudad, T. 30, 55
Clotet, Josep 58
Colom, Mª Francisca 146
Colom, María Francisca 69
Consuelo Ferrer 146
Córcoles-Sáez, Isaac 61
Correa-Bordes, Jaime 17, 30, 55
Correia, Inés 19
Cortese, Marc S. 152
Crespo, Gloria 37
Crespo-Sempere, Ana 80
Crous, Pedro 139
Cruellas ML, 98, 129, 147
Culleré N, Aixalà 79
D
De Boer, Albert D. 64
De Groot, Piet W.J. 64
Dekker, Henk L. 64
de la Pinta-Aresti, Iker 42, 64
de la Rubia Martín, Francisca 130, 150
de la Torre-Ruiz, Mª Angeles 57
Del Prado Montoro César 100
del Rey, Francisco 17
del Río, Lucía 77, 141
D’Enfert Christophe 17
de Pedro, Nuria 37
Díaz, Caridad 37
Díez-Muñiz, Sonia 33
Doménech-Carbó, Antonio 90
Domínguez, Monserrat 138
156
Dueñas-Santero, Encarnación 17
E
Eraso, Elena 42, 73, 77, 91, 120, 141
Esparza, Mario 39, 97
Espeso, Eduardo A. 93, 112
Espinosa, Alejandra 138
Espinosa Texis, Alejandra 41, 107
Espinoza Pérez, José Alberto 83, 148
Esteban, Alfredo 133
Estiarte, Núria 80
Estruch, Francisco 61
Etxenagusia, Saray 35
Ezpeleta, Guillermo 35, 91
F
Fernández-Acero, Teresa 28
Fernandez-Molina, Jimena V. 35
Fernández-Piñar, Pablo 53
Fernández-Rodríguez S 50
Fernández Rodríguez, Santiago 23, 85, 102
Fernández Torres, Marina 83, 148
Forastiero, Agustina 81
Franco, Alejandro 96
Freyre, Carolina 136
Freyre Carrillo Carolina 94, 100
G
Gacto, Mariano 96
Galán B, García M 98
Galan, Fátima 136
Galán Sánchez, Fátima 130, 150
Garaizar, Javier 35
García-Díaz, Marta 104
García-García, Natalia 111
Garcia González M 79, 147
García-Martínez, José 27
García, Raúl 33
García Sánchez, Dania 25
Garcia Solé M 147
Garcia Solé M. 129
G. Bermejo-Pulido 30
Genilloud, Olga 37, 105
Gil-Serna, Jessica 104
Giro C. 129
Gómez-Gil, Elisa 96
Gómez López, Alicia 72
Gómez-Molero, Emilia 64
Gonzales, Zurisadai 41
González Escartín, Esther 148
González-Menéndez, Victor 37, 105
González-Novo, Alberto 17
Gonzalo Garijo A 50
Gonzalo Garijo, Ángela 23, 85, 102
Grupo De Estudio Cava-Trem 133
GRUPO FUNGAE-IFI 136
Guarro, Josep 25, 48, 87, 139
Guerrero Lozano, Inmaculada 130, 150
Guillén, Alberto 40, 90
Guillén, Esteban 90
Guinea, Jesús 71
Guruceaga, Xabier 35
Gutiérrez-Escribano, Pilar 17
H
Hernández-Ortiz, Patricia 112
Hernando, Ainara 77
Hernando, Fernando L. 20, 31, 34, 115
Hernando, Fernando Luis 35
Herraiz, David 104
Herrero, Enrique 10
Huarachi Olivera, Ronald 39, 97
I
Ibáñez, Tania 146
Iglesias Moles, Silvia 46, 117, 132, 143, 151
Iradi, Mikel 152
Iturbe Fernández, David 148
J
Jaureguizar, Nerea 120
Jiménez, Elena 53
Jiménez, Mariana 58
Justicia, Carlos 37
L
Larriba Calle, Germán 41
Latre Romero, Pili 46
Linares, Mª José 136
Linares Sicilia, María José 118
Linares-Sicilia, María José 70
López-Fernández, Loida 87
López Hontangas, José Luis 134
157
López, Loida 48
Lorenzo, Dámaris 87
Loza, Ana 133
Lupiañez A. 98, 129, 147
Moreno, Catalina 105
Moreno-Martínez, Ana 64
Muñoz, Francisca 37
Muñoz Triviño M 50
M
N
Macias, Desire 133
Madrid, Marisa 96
Magraner Martínez, Adolfo 134
Marcos-Arias, Cristina 42, 125, 127, 141, 144
Marin, Elena 133
Mariscal, Valeria 107
Martin, Adela 87
Martínez-Esparza, María Concepción 59
Martínez Huguet, Miguel 134
Martinez-Martinez, Luis 44
Martínez-Pastor, María T. 27
Martínez Rubio Carmen 94, 100
Martín-García, Rebeca 111
Martín, Humberto 53, 56
Martin, Jesus 37
Martín, Jesus 105
Martin-Mazuelos, Estrella 133
Martín-Mazuelos, Estrella 136
Martín-Souto, Leire 20
Mateo-Alesanco, Estibaliz 77
Matute, Carlos 20
Maya Manzano JM 50
Maya Manzano, José María 23, 85, 102
Mayayo Artal, Emilio 67
Mayayo, Emilio 35
Medina, Daniel A. 27
Mellado, Emilia 81
Mellado, Laura 112
Mellado Maroñas, Laura 93
Méndez Natera, Rafael 118
Mendoza, Isabel 40
Meneses, María de la Cruz 107
Meza Dávalos, Teresa 41
Meza, Teresa de Jesús 138
Miqueleiz, Ana 123
Miralbes Torner, Mar 117, 132, 143, 151
Miralbés Torner, Mar 46
Miralles, Dulce 136
Miranda-Cadena, Katherine 42, 127, 141
M.L. Abarca 65, 82
Molina, María 28, 53, 56
Monroy Colín, Alejandro 23, 85, 102
Navarro, David 133
Navarro, Patricia 48
Nombela, César 33
O
Orellana-Muñoz, Sara 17
Ortega-Riveros, Marcelo 77
P
Palomar Martínez, Mercedes 117, 132, 143, 151
Parra, Manuel 133
Patiño, Belen 104
Pazos, Carmen 136
PC Ribeiro, Javier 58
Pellon, Aize 20, 31, 34, 115
Pemán García, Javier 134
Pemán, Javier 11
Pena-Fernández, Nerea 125, 144
Peñalva, Miguel A. 12
Pérez Belmonte, Elena 148
Pérez-Ortín, José Enrique 27
Pérez, Pilar 111
Plá, Jesús 19
Pons Anglada, Lluís 109
Prieto J 98
Prieto, Jose Antonio 61
Prieto Labiano J. 79
Pueyo Sorribas, Luis 83
Puig, Laura 22, 113, 114
Puig, Sergi 27
Pujol-Carrión, Núria 57
Q
Quindós, Guillermo 11, 42, 64, 77, 91, 120, 141
R
Ramirez-Garcia, Andoni 20, 31, 34, 35, 115
Ramirez, Mercedes 136
Ramos, Antonio J. 80, 108
158
Ramos Girona, Antonio J. 62
Randez-Gil, Francisca 61
Recuero Garcia P 79
Rementeria, Aitor 20, 31, 34, 35, 115
Reyes, Fernando 37
Rodríguez-Escudero, Isabel 28
Rodríguez Iglesias Manuel 94, 100
Rodríguez Iglesias, Manuel 130, 150
Rodríguez-Iglesias, Manuel 136
Rodríguez Iglesias, Manuel A. 75
Rodriguez-Lozano, Jesús 44
Rodríguez-Peña, Jose Manuel 33
Rodriguez Ruiz, Silvia 46
Rodriguez, Vanessa 115
Roiz Mesones, María Pía 83, 148
Rojo, P. 30, 55
Romero, Antonia M. 27
Rosas de Paz, Emmanuel 25
Ruiz de Alegría Puig, Carlos 44
Ruiz Gaitán, Alba Cecilia 134
Ruiz, Maye 136
S
Sahuquillo Arce, José Miguel 134
Sánchez-Fresneda Pinto, Ruth 59
Sánchez-Yedra, Waldo 136
Sanchis, Vicente 80, 108
Sancho Gutiérrez, Rocío 148
Sanseverino, Walter 113
Sanz, Ana Belén 33
Sentandreu, Vicente 40
Serrano, Fernando 40
Serrano, Mª Luisa 136
Serrano, Rachel 105
Sevilla, Maria Jesus 34, 115
Sherlock, Gavin 17
Silva Palacios I 50
Silva Palacios, Inmaculada 23, 85, 102
Sonia Marín 80, 108
Soto, Teresa 96
Stchigel, Alberto Miguel 25, 139
Suarez, Ana Isabel 133
Suárez, M. Belén 17
Sueiro-Olivares, Mónica 35
Suelen Andreia Rossi 19
Suelen A. Rossi 81
Sutton, Deanna A. 139
T
Tapia Abellán, Ana 59
Tejero García, Rocío 118
Terren-Martínez, Iñigo 127
Tormo 37
Tormo, Jose R. 105
Tormo Molina, R 50
Tormo Molina, Rafael 23, 85, 102
Toro, Clara 37, 105
Trevijano-Contador, Nuria 19
Trobajo-Sanmartín, Camino 91, 144
Trujillo Soto, Teresa 130, 150
U
Ubeda, Alejandro 133
Ugalde, Unai 152
V
Valentín Gómez, Eulogio 59
Valenzuela-López, Nicomedes 139
Vallverdú Vidal, Montserrat 46, 68, 117, 132,
143, 151
Valverde, Emilio 133
Vázquez, Covadonga 104
Vázquez de Aldana 55
Vázquez de Aldana, Carlos R. 17
Vázquez de Aldana, C.R 55
Vázquez de Aldana, C.R. 30
Vázquez-Marín, Beatriz 96
Vicente, Francisca 37
Vicente-Soler, Jero 96
Vidal, Eva María 138
Z
Zaballos, Ángel 19
Zakariya-Yousef, Ismail 133
Zaragoza, Oscar 19, 81
159