Tareas de Aula - Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas

Universidad Nacional de Rosario- Facultad de Ciencias
Bioquímicas y Farmacéuticas
Guía de ejercicios
Química Biológica
2016
0
QUÍMICA BIOLÓGICA - 2016
ESPECTROFOTOMETRÍA
1.
El coeficiente de extinción del NADH a 340 nm es de 6.22 mM-1.cm-1. Calcular las
concentraciones de las soluciones de NADH cuando los valores de absorbancia obtenidos son: a) 0.6;
b) 0.15. Exprese los resultados en nM y mM. Considere un paso óptico de 1 cm.
2.
Una solución que se encuentra en una cubeta de 1 cm de espesor contiene 2 g/l de una sustancia
absorbente de luz y transmite el 75 % de la luz incidente a una determinada longitud de onda. Calcular
la absorbancia de una solución que contenga a) 4 g/l; b) 1 g/l. Si el peso molecular del compuesto es
250, calcule el coeficiente de extinción molar.
3.
Una solución de proteína (0.3 ml) fue diluida con 0.9 ml de agua. A 0.5 ml de esa solución
diluida se le agregaron 4.5 ml del Reactivo de Biuret y se esperó hasta completarse la reacción de
color. La absorbancia de la mezcla a 540 nm fue de 0.18 en un tubo de ensayo de 1 cm de diámetro,
luego de restar el blanco. Una solución standard (0.5 ml conteniendo 4 mg de proteína/ml) a la que se
agregaron 4.5 ml del Reactivo de Biuret dio una absorbancia de 0.12 en un tubo de ensayo de iguales
características. Calcular la concentración de proteína en la solución desconocida.
4.
Un analista determinó la concentración de una solución pura de una proteína desconocida
empleando el método del Biuret y la absorbancia a 280 nm, utilizando para ambos procedimientos una
solución de albúmina sérica bovina de 0,5 mg/ml como patrón. Los resultados que obtuvo se muestran
en las tablas siguientes:
Método del Biuret
Alícuota
Cubeta(paso de luz)
Blanco de Rvos.
Lectura
Testigo(patrón)
50 µl
1 cm
0,080 UA
0,550 UA
Muestra Incógnita
40 µl
1 cm
0,080 UA
0,350 UA
Absorbancia a 280 nm
Testigo
0,5 cm
0,310 UA
Cubeta (paso de luz)
Lectura
Muestra Incógnita
0,5 cm
0,285 UA
a) Calcule la concentración proteica por ambos métodos. b) Interprete los resultados considerando
errores experimentales inferiores al 10 %.
5.
El ácido pirúvico puede determinarse colorimétricamente por conversión en su
2,4-dinitrofenilhidrazona seguido de la adición de álcali. La reacción se llevó a cabo en un volumen
final de 3 ml, con soluciones que contenían 1 ml de diversas cantidades de ácido pirúvico,
obteniéndose los siguientes resultados:
Ac. pirúvico (µg)
Lecturas
0
0.01
20
0.140
40
0.267
60
0.400
70
0.750
80
0.525
100
0.638
125
0.760
150
0.775
Se analizaron por este método una serie de soluciones desconocidas de ácido pirúvico (1 ml de cada
una) obteniéndose las siguientes lecturas de absorbancia a) 0.565; b) 0.125; c) 0.683; d) 0.889. Por
1
otro lado, 100 µl de una solución patrón 5 mM de ácido pirúvico (PM=88.06) mostró una lectura de
0.335 (considerar bco. de reactivos de 0.01) en un volumen final de 3 ml. Grafique la curva de
calibración con los resultados mostrados en la tabla. Calcule la concentración en g/ml de las
soluciones desconocidas usando la curva previamente realizada y el valor de la solución patrón como
único dato. Compare los resultados.
2
AMINOÁCIDOS
1.
Cada uno de los grupos ionizables de un aminoácido tiene dos estados posibles de ionización:
cargado y no cargado (por ejemplo, -COOH, -COO-). Por lo tanto una molécula con n de tales grupos
tiene 2n estados posibles de ionización. a) Escriba los cuatro estados posibles de ionización del
aminoácido Ser. b) A simple vista, indique cuál estado de ionización predomina a valores de pH=1,
pH=3, pH=pI, pH=7, pH=11.
2.
a) Una mezcla de los siguientes aminoácidos se somete a electroforesis a pH=3,9: Ala, Ser, Phe,
Leu, Arg, Asp, e His. ¿Cuál irá hacia el ánodo (positivo)? ¿Cuál irá hacia el cátodo (negativo)? b) A
menudo los aminoácidos con cargas idénticas se separan ligeramente durante la electroforesis: por
ejemplo la Gly se separa de la Leu. ¿Puede sugerir una explicación para esto?
3.
El grupo -amino de la Lys tiene un pKa de 10,8. a) ¿Qué fracción de estos grupos estará
protonada (es decir, -NH3+ en vez de -NH2) en una solución diluida de Lys a pH=9,5? b) ¿A pH=11.5?
c) Explique por qué el pKa del grupo -amino es mayor que el de un grupo -amino.
4.
El grupo -carboxilo del Glu tiene un pKa de 4,3. a) ¿Qué fracción de estos grupos podría estar
no protonada (es decir -COO- en vez de -COOH) en una solución diluida de Glu a pH=5,0? b) ¿A
pH=3,8? c) Explique por qué este pKa es mayor que el grupo -carboxilo.
Tabla de pKas de los grupos ionizables:
Aminoácido  Carboxilo  Amino Grupo R
Alanina
2.3
9.9
Glicina
2.4
9.8
Leucina
2.3
9.7
Fenilalanina
1.8
9.1
Serina
2.1
9.2
Valina
2.3
9.6
Aspartico
2.0
10.0
3.9
Glutamico
2.2
9.7
4.3
Histidina
1.8
9.2
6.0
Cisteina
1.8
10.8
8.3
Tirosina
2.2
9.1
10.9
Lisina
2.2
9.2
10.8
Arginina
1.8
9.0
12.5
3
PÉPTIDOS
1.
¿Cuál de los siguientes oligopéptidos es más soluble en agua?
a)Phe20 o Gly20; b) Asp20 o Glu20 a pH = 6.0; c) Phe20 o Tyr20
2.
Escriba en fórmulas el pentapéptido Phe-His-Met-Leu-Asp. Calcule su punto isoeléctrico.
Sometido el mismo a una electroforesis, ¿hacia qué electrodo migrará, a pH = 7? y a pH = 2? Indique
en cada caso si el aminoácido es polar, apolar, ácido, básico, alifático, aromático, etc
3.
Un tetrapéptido de punto isoeléctrico 7,7 posee un único aminoácido cargado en su estructura.
Considere los siguientes valores pKa α-COOH :2,3; α-NH2 :9,5. a) Prediga el pKa del grupo lateral de
dicho aminoácido; b) En base al dato anterior deduzca de qué aminoácido se trata y escriba su fórmula
estructural; c) Enuncie qué propiedad especial tiene el aminoácido en cuestión.
Escisión específica de cadenas polipeptídicas:
H H
H H
N C C N C C
R1 O
Aminoácido 1
Método
Tripsina
Quimotripsina
Termolisina
Bromuro de cianógeno
V8
Carboxipeptidasa
R2 O
Aminoácido 2
Enlaces peptídicos escindidos
Aminoácido 1 = Lys o Arg
Aminoácido 1 = Phe, Trp o Tyr
Aminoácido 2 = Leu, Ile o Val
Aminoácido 1 = Met
Aminoácido 1 = Glu o Asp
Aminoácido 2 = COO- terminal libre
4.
Considere el péptido cuya estructura primaria aparece en la figura: a) ¿Qué fragmentos son
producidos por la digestión con tripsina? b) ¿Qué fragmentos son producidos por la digestión con
tripsina después de la reducción y la alquilación del enlace disulfuro? c) ¿Qué fragmentos son
producidos por la digestión con termolisina?
Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Arg-Cys-Tyr
|
S-S
|
Glu-Met-Lys-Val-Trp-Gly-Cys-Ala
5.
Ud. aísla un péptido del cerebro que posee la propiedad de unirse a receptores del opio. Su
intención es encontrar la estructura primaria del péptido aislado. Para ello recurre a métodos utilizados
4
en la química de péptidos y encuentra que: a) Luego de la hidrólisis ácida del péptido, la composición
en aminoácidos es: Arg(1) Phe(2) Gly(2) Met(1) Tyr(1). b) El tratamiento del péptido con
quimotripsina generó un aminoácido libre, Phe y dos péptidos cuya composición en aminoácidos
resultó: Gly(2) Tyr(1) y Arg(1) Phe(1) Met(1). c) El tratamiento del péptido con Bromuro de
cianógeno, seguido de separación cromatográfica de los productos, arroja la presencia de dos péptidos
cuya composición en aminoácidos resulta ser: Arg(1) Phe(1) Met(1) y Gly(2) Phe(1) Tyr(1). Cuando
ambos péptidos fueron tratados con Cloruro de dansilo, solamente se encontró Phe dansilada. Deduzca
Ud. la secuencia del péptido.
6.
En base a los datos que se detallan, determine la estructura de un antibiótico polipeptídico del
Bacilus brevis. Este antibiótico forma complejos con iones metálicos y aparentemente destruye el
transporte iónico a través de las membranas, matando a ciertas especies bacterianas. En el análisis de la
estructura Ud. encuentra que: a) La hidrólisis ácida completa del péptido seguida del análisis de
aminoácidos dio cantidades equimoleculares de Leu, Pro, Phe, Orn, Val. b) La estimación del PM dio
1200 aprox. c) No se hidrolizó con Carboxipeptidasa. d) El tratamiento del péptido con
Fluorodinitrobenceno seguido de hidrólisis completa y cromatografía no generó ningún derivado
dinitrofenilado en N alfa. e) La hidrólisis parcial del péptido seguida de separación cromatográfica y
secuenciación generó los péptidos siguientes:
Leu-Phe
Val-Orn-Leu
Phe-Pro
Orn-Leu
Phe-Pro-Val
Val-Orn
Pro-Val-Orn
Deduzca la secuencia del péptido
7.
Ud. aisló de un homogenado de cerebro un péptido con actividad de encefalina (opioide). Estos
se unen a receptores localizados en el cerebro, que unen drogas derivadas del opio (morfina) que
disminuyen el dolor. Al analizarlo encuentra que: a) La hidrólisis completa en HCl 6 M, 110°C
seguida del análisis de aminoácidos indica la presencia de Gly, Leu, Phe y Tyr en una relación 2:1:1:1.
b) El tratamiento del péptido con 2,4-dinitrofluorobenceno seguido de hidrólisis completa y
cromatografía indicó la existencia de Tyr-DNP. No se encontró Tyr libre. c) La hidrólisis con
quimotripsina seguida de cromatografía indicó la presencia de Leu y Tyr libres, y un péptido cuya
composición en aminoácidos indicó la presencia de Gly y Phe en una relación 2:1. Determine la
secuencia de esta encefalina.
5
PROTEÍNAS
1.
Mientras la mayoría de las bacterias mueren a temperaturas superiores a 50 °C, algunas especies
termofílicas sobreviven entre 70 y 80°C. ¿De qué modo(s) general(es) esperaría que las proteínas de
las bacterias termofílicas difieran de las proteínas análogas de las bacterias comunes?
2.
Suponga que le han dado cantidades pequeñas de tres proteínas desconocidas, A, B y C. Su
instructor de Bioquímica le informa que una proteína es predominantemente hélice alfa, otra hoja beta
y la tercera de triple hélice de colágeno. Su laboratorio está equipado con un analizador de
aminoácidos.
Proteínas
Residuos no polares
Residuos polares
Glicina
Prolina + Hidroxiprolina
A
35
20
45
--
B
16
59
8
1
C
17
25
33
22
Asigne la estructura más probable para cada una de las tres proteínas.
3.
Como parte de un proyecto de laboratorio de Bioquímica de pregrado, Ud. purificó tres
polipéptidos de aproximadamente igual peso molecular, a partir de plasma humano. Usando varias
técnicas físicas Ud. estableció que en sus estados nativos uno de los polipéptidos es monomérico (una
molécula en forma de cigarro), el segundo es monomérico y casi esférico y el tercero es la subunidad
de un tetrámero de subunidades esféricas idénticas. Su compañero de laboratorio determinó las
composiciones aminoacídicas de las tres proteínas. Sin embargo, cuando le trae los datos indicados en
la TABLA, Ud. descubre que él no anotó la posición correspondiente a cada proteína. Su profesor le
dice que Ud. debería deducir cuál es cuál, simplemente a partir de las mismas composiciones de
aminoácidos. ¿Qué composición le asignaría a cada proteína y por qué?
Proteína
Residuos polares
Residuos no polares
Glicina
Prolina + Hidroxiprolina
4.
A
131
54
9
8
B
59
118
9
13
C
99
88
8
10
El análisis del PM de una proteína suministra la siguiente información:
Solvente
Buffer
Cloruro de Guanidina
Cloruro de Guanidina + 2-Mercaptoetanol
PM
200.000
100.000
25.000 + 75.000
Teniendo en cuenta que el cloruro de guanidina es un agente caotrópico (desnaturalizante) y el 2mercaptoetanol es un agente reductor, caracterice la estructura cuaternaria de esta proteína.
6
5.
El desplegado de la hélice alfa de un polipéptido para formar un ovillo al azar está acompañado
por un gran descenso de la rotación específica de la luz polarizada. Estudiando a los péptidos
poliglutamato y polilisina se obtuvo la siguiente gráfica:
a) Asigne cual de los gráficos corresponde a cada péptido. Prediga las conformaciones de la poliLys y
el poliGlu a pH 2 y 12. b) Explique el efecto de los cambios de pH en la conformación de los péptidos.
c) ¿Por qué las transiciones conformacionales ocurren en un rango tan estrecho de pH?
6.
Un investigador purifica una proteína monomérica estructural de músculo a homogeneidad. Con
el objeto de determinar la concentración de la solución obtenida, aplica el método de Sedmark y
Grossberg sobre 0,5 ml de la solución proteica y sobre 0.1 ml de un testigo de albúmina, obteniendo
valores de absorbancia (Abs620/Abs465) de 0,2 y 0,3, respectivamente. La solución de albúmina usada
como testigo presentó un valor de absorbancia a 280 nm de 0.05 (280 = 6,65 (g%)-1 cm-1). a) Exprese
la concentración de la proteína purificada por el investigador en µM, sabiendo que el PM de la misma
es 25.000 Da. b) Alícuotas de 1.0 ml de la solución proteica purificada son sometidos a oxidación o
reducción, y luego incubadas con un reactivo específico de restos sulfhidrilos (-SH)
(Eosin-5-maleimida, 523 = 85.000 M-1 cm-1), que reacciona en relación estequiométrica 1:1 con los
mismos. Luego de que las alícuotas reaccionan totalmente con el reactivo, se las dializa para eliminar
la eosin-5-maleimida que no se unió a la proteína (sin cambiar el volumen de la muestra proteica
dializada), y se realizan medidas de absorbancia a 523 nm, obteniéndose valores de absorbancia de
0,034 (proteína oxidada) y 0,105 (proteína reducida). Indique cuántos moles de residuos de cisteína
reaccionan por mol de proteína. ¿A qué se debe la diferencia de absorbancia obtenida en las distintas
condiciones?
7
SEPARACIÓN DE BIOMOLÉCULAS
1.
La cromatografía de filtración en gel o de tamiz molecular es un método de separación proteica
basado en sus tamaños (o, más precisamente, en sus radios efectivos en solución, los cuales son
proporcionales, para proteínas esféricas, a la raíz cúbica del peso molecular). Una solución proteica se
coloca en una columna empacada con pequeñas esferas de polímeros suficientemente hidratados y
entrecruzados (Sephadex). Las proteínas de tamaños diferentes varían en su capacidad de penetrar los
poros hidratados de las esferas. Las proteínas más pequeñas penetran más rápidamente estos poros y a
medida que bajan en la columna lo hacen más lentamente que las proteínas de mayor tamaño. Una
segunda técnica de separación de proteínas es la electroforesis en gel de poliacrilamida donde las
proteínas se someten a un campo eléctrico. Cuando se lleva a cabo la electroforesis en presencia de un
agente desnaturalizante, el dodecil sulfato de sodio (SDS), las moléculas proteicas se separan por
tamaño, las más pequeñas migran más rápidamente. (El SDS desnaturaliza las proteínas uniéndose a
ellas en forma no específica y dándoles una relación constante de carga/masa).
Ambos procedimientos separan las proteínas con base en el tamaño y utilizan polímeros entrecruzados
como medio de soporte. ¿Cómo es posible que en la filtración en gel, las moléculas pequeñas se
retarden con respecto a las mayores, mientras que en electroforesis en gel de poliacrilamida ocurre lo
contrario?
2.
Una mezcla de dos proteínas se sembró en una columna cromatográfica y se obtuvo el perfil de
elución mostrado. Las dos fracciones correspondientes a los máximos de los dos picos (n° 10 y 26) se
sometieron a ensayos de Gornall (0,2 ml muestra + 0,8 ml de H2O + 4 ml de reactivo) y Bradford (0,1
ml muestra + 0.4 ml de H2O + 0,5 ml de reactivo) para medir la concentración de proteínas, dando los
resultados mostrados en la tabla.
0 .4
Gornall (Abs 530nm) Bradford (Abs 595nm)
0,01
0,2
0,6
1,2
0 .3 5
Abs 280 nm
Fracción
10
26
0 .3
0 .2 5
0 .2
0 .1 5
0 .1
0 .0 5
0
0
5
10
15
N
20
25
30
35
fr a c c ió n
a) Utilizando las siguientes curvas de calibración calcule las concentraciones de proteínas en mg/ml de
las dos fracciones mencionadas. Si esto no fuera posible, explique cómo procedería experimentalmente
para determinar la concentración de proteínas en dicho caso. b) La muestra con mayor concentración
de proteínas es la que presenta menor absorbancia 280nm? Explique esta aparente contradicción.
Gornall
Bradford
0.5
0.30
0.4
0.25
Abs 595
Abs 530
0.20
0.3
0.2
0.15
0.10
0.1
0.05
0.00
0.0
0
500
1000
1500
proteina (g)
2000
2500
3000
0
5
10
15
20
25
30
35
proteina (g)
8
3.
Usted tiene una mezcla de tres proteínas A, B, C, con pI de 3,5; 6 y 10 respectivamente y quiere
separarlas por una columna de DEAE-celulosa. Teniendo en cuenta que el grupo DEAE tiene un pKa
= 9,5. ¿Qué pH usaría para la separación? ¿Qué orden de elución esperaría encontrar eluyendo con un
gradiente de KCl entre 0 a 1 M?
4.
La Carboximetilcelulosa es una resina de intercambio catiónico con un pKa de 4,5. Ud. tiene
tres proteínas A, B y C de pI 6, 8 y 10 (no estrictamente en ese orden). Al sembrarlas en esta resina y
eluir con un gradiente de pH de menor a mayor eluyeron en el siguiente orden: B A C. Estas mismas
proteínas, en una columna de Sephadex G-100 eluyeron cómo de un peso molecular 50.000, 100.000 y
75.000 y en el siguiente orden: A, B y C. En un gel con SDS, A y C presentaron una única banda de
PM 50.000 y B presentó dos bandas de PM 50.000 y 25.000. Identifique A, B y C.
5.
Suponga que desea purificar por cromatografía de intercambio iónico una enzima del
metabolismo del ADN, cuyo sustrato es ADN. ¿Seleccionaría una resina de intercambio aniónico o
catiónico? ¿Por qué?
6.
Un péptido aislado de cerebro tiene la siguiente secuencia:
Lys-Ser-His-Glu-Leu-Asp-Pro-Tyr-Glu-Gly
a) Determine la carga neta de la molécula a pH=3, 8 y 12. b) Estime el punto isoeléctrico del péptido.
c) Se somete al péptido a la acción de la termolisina. Escriba la fórmula estructural de los péptidos
resultantes. d) Los péptidos obtenidos en el item anterior se someten a una cromatografía de
intercambio iónico en sulfonil-celulosa (pKa=1,2). Si la columna está equilibrada a pH=5, ¿qué
péptido eluirá y cuál quedará retenido? ¿Cómo haría para eluir este último?
7.
Se aisló un péptido con actividad biológica a partir de una cepa de un bacilo:
Tyr-Gly-Arg-Ala-X-Val
a) Escriba la fórmula del aminoácido X si el pI del péptido es 6,7. b) Determine a que pH no migraría
en una electroforesis para X = Ser. c) Indique que fragmentos obtendría por digestión con:
i)Termolisina para X = Leu, ii) Quimotripsina para X = Phe. d) Los péptidos obtenidos en el ítem
anterior (en ambas digestiones) se encuentran en una mezcla con un 3er péptido (Péptido A con pI = 5)
Mediante que método separaría el péptido A. Explique.
8.
Tres proteínas de puntos isoeléctrico 5,0; 7,3 y 6,5 se denominaron con las tres primeras letras
del alfabeto griego según su posición en un isoelectroenfoque, siendo alfa la más cercana al ánodo y
gamma la más cercana al cátodo. a) ¿Cuál es el pI de cada uno? b) ¿Cuál de las proteínas eluirá
primero durante una cromatografía en carboximetilcelulosa a pH 5,8? ¿Por qué? c) Si alguna proteína
quedara retenida, ¿cuál o cuáles serían y cómo las eluiría? d) Durante una electroforesis en
poliacrilamida a pH 8, beta presentó la mayor movilidad electroforética. ¿Es posible? ¿Por qué?
9.
Usted recibe en su laboratorio una solución conteniendo el siguiente péptido:
Glu – Cys – Lys – Phe – Cys – Ala – Gly
S
S
9
Para corroborar que realmente se trata de dicho péptido y para chequear su pureza, decide realizar un
isoelectroenfoque empleando 4 alícuotas que fueron sometidas a distintos procedimientos: A) en
medio oxidante débil; B) en medio reductor; C) en presencia de tripsina (escinde enlaces peptídicos
del lado carboxilo de Lys o Arg); D) en presencia de tripsina en medio reductor. En base a estos datos
prediga cuales serán los resultados obtenidos al sembrar las 4 alícuotas en un gel de isoelectroenfoque
y esquematice el patrón de bandas que observaría finalizada la corrida electroforética en cada caso.
Justifique su respuesta.
10.
El cromatograma de una muestra de proteínas en Sephadex G-200 fue el siguiente:
Gliceraldehído
3-P-Deshidrogenasa
Concentración
de proteína
en el eluído
Aldolasa
Mioglobina
Catalasa
Ovoalbum.
175
213
234
244
285
N° fracción
Las proteínas marcadoras fueron las siguientes:
Proteína
Aldolasa
Catalasa
Ovoalbúmina
Mioglobina
PM (x104)
16
6
4
1.6
N° de fracción
175
213
234
285
Se recogieron fracciones de 1,6 ml. y el volumen vacío de la columna previamemte determinado con
azul de dextrano fue de 200 ml. VT = 500 ml. Se quiso determinar el PM de
gliceraldehído-3-P-dehidrogenasa. Utilizando la misma columna, en las mismas condiciones se
observó que la enzima apareció en la fracción 244.
Indique el peso molecular de la misma. Cómo procedería experimentalmente si quisiera estudiar la
estructura cuaternaria de dicha proteína?
11. Las proteínas denominadas histonas juegan un papel clave en el empaquetamiento del DNA: éste
se enrolla alrededor de las histonas para formar los nucleosomas, partículas engarzadas como las
cuentas de un collar. Una mezcla de tres proteínas globulares, entre ellas la histona H4, presenta la
siguiente composición de aminoácidos:
Proteína
A
B
C
Número de Residuos (totales)
Asp y Glu
Arg, Lys e His
Otros AA
90
5
105
50
10
60
6
27
69
Mediante un isoelectroenfoque se determinaron los puntos isoeléctricos de las tres proteínas
obteniéndose los siguientes valores: 3,0; 5,5 y 9,5 (no respectivamente). Los pesos moleculares
obtenidos por cromatografía de exclusión molecular fueron de 15 kD, 11,3 kD y 21,5 kD. a) lndique el
punto isoeléctrico, el peso molecular y el orden de elución de la columna cromatográfica de las tres
10
proteínas. b) ¿En qué consiste la cromatografia de exclusión molecular y cómo se pueden obtener
pesos moleculares a partir de ella? c) En base a sus conocimientos, ¿podría decir cuál de las tres
proteínas sería H4? Fundamente su respuesta.
12. Una proteína bacteriana purificada y de PM conocido se sometió a una filtración por gel. Se
recogieron fracciones de 2,5 ml y la proteína eluyó en la fracción 8. Previamente se determinó que las
proteínas marcadoras de 6, 35 y 250 kDa eluyeron en las fracciones 5, 10 y 14. El Vo determinado con
azul de dextrano fue de 1,8 ml, y el Vt de 45 ml. a) ¿Cuál es la masa estimada de la proteína bacteriana
purificada? b) Para determinar la concentración de la proteína pura se diluye 1:100 la muestra y se
ensaya una alícuota de 20 l por el método de Bradford dando una absorbancia de 0,25 descontado el
blanco. Como testigo se utilizaron 40 l de BSA 1mg/ml (PM 66 kDa) y se obtuvo una absorbancia de
0,85. Exprese la concentración en g/l de la proteína en la muestra.
13. Una alícuota de 0,1 ml de una mezcla de triglicéridos y una proteína pura se agitó en
benceno:agua (3 ml:2 ml). a) En qué fases se distribuyen los distintos componentes de la mezcla? Se
sembró una alícuota de la fase que contenía la proteína en una columna de Sepharosa 6-B previamente
equilibrada. Se recogieron fracciones de 2 ml. Las proteínas marcadoras fueron: A, B, C, D y E con
pesos moleculares de 160, 90, 60, 40, 16 kDa, respectivamente. La curva de calibración resultante se
muestra a continuación. El valor de Kav de la muestra se calculó en 0,28. Además, se corrió una
electroforesis con SDS en las siguientes condiciones: I) la proteína se hirvió previamente con DTT
(agente reductor), II) la proteína se hirvió sin agente reductor. El patrón electroforético se muestra en
la figura. b) Indique el peso molecular de la proteína nativa. c) Infiera la composición cuaternaria de la
proteína. Por otro lado se estimó la concentración de proteína por absorbancia a 280 nm, utilizando un
testigo de BSA de 0,5 mg / ml, con una alícuota de 1 ml y una cubeta de 0,5 cm de paso. Se obtuvo
una Abs. de 0,4 para el testigo y de 0,295 para la muestra. d) Teniendo en cuenta que toda la proteína
pasó a la fase correspondiente, determine la concentración de la misma en la mezcla original.
2.4
kDa
90
PM
II
I
2.2
60
40
2.0
Log
PM
1.8
1.6
1.4
16
1.2
1.0
0.25
0.3
0.35
0.40
0.45
Kav
14. A) Usted copurificó 2 enzimas ( y ) que catalizan la misma reacción (isoenzimas) y con el fin
de separarlas utiliza una columna de exclusión molecular en las siguientes condiciones: i) en presencia
de glicerol 20 % (un estabilizante de la estructura cuaternaria) y ii) en ausencia de éste. Usted
determina el perfil de elución de estas proteinas a través de absorbancia a 280 nm.
Esta columna fue previamente calibrada con diferentes proteínas generando la siguiente curva de
calibración. a) Prediga cuál sería el peso molecular y la probable estructura de ambas isoenzimas,
sabiendo que  es la de mayor peso molecular. b) ¿Qué otra técnica utilizaría para confirmar este
resultado o bien para obtener más información? Explique.
B) Ud. realiza un isoelectro-enfoque de las proteínas puras  y  determinando los puntos isoeléctricos
de ambas proteínas. Usted sabe por bibliografía que , tiene un rango de estabilidad de pH entre 6 y
11. a) Como paso alternativo en la purificación de ambas proteínas ¿podría usarse una columna de
CM-celulosa (pKa=4,5) para separar ambas proteínas? Si es así, explique qué pH usaría para equilibrar
esta columna. b) ¿Cómo haría para eluírlas?
11
ABS.
280 nm.
Con Glicerol
Sin glicerol
V. elución
27 (ml)
19
7
15. Se purificó una proteína estructural a partir de dos bacterias (A y B) aislados de diferentes
fuentes. Con las proteínas purificadas se corrió una electroforesis de poliacrilamida en presencia de
SDS en las siguientes condiciones, (+): la proteína se hirvió 10 minutos en presencia de
2-mercaptoetanol, (-): la proteína se hirvió 10 minutos sin agente reductor. Luego de la corrida
electroforética, el gel se tiño con Coomassie Blue y se observó el patrón indicado. Por otro lado, las
preparaciones proteicas se sembraron en una columna de exclusión molecular. La masa molecular de
los marcadores utilizados para calibrar esta columna fueron: 30, 100, 210 y 440 kDa. El cromatograma
obtenido es mostrado abajo. La proteína de interés eluyó en ambos casos en la fracción 133. Se
recogieron fracciones de 1,5 ml. a) Indique la masa molecular nativa de las proteínas aisladas.
b) Infiera la estructura de ambas proteínas c) considerando las estructuras propuestas en el ítem
anterior, y teniendo en cuenta que una de las bacterias fue extraída de una fuente termal, prediga cuál
proteína fue aislada de cada bacteria.
A
+
B
-
+
-
Abs 280 nm
210
70
50
30
117
142
156
190
N° de Fracción
16. Le han entregado una muestra supuestamente pura de la proteína monomérica lactato
deshidrogenasa. Para establecer su PM inyecta la muestra en una columna de Sephacryl (exclusión
molecular) y obtiene un único pico a un Ve de 34 ml, el cual es comparado con los datos obtenidos
para las proteínas marcadoras (fig1). Como paso siguiente realiza una electroforesis en dos
dimensiones de la muestra y luego de tinción por azul de Coomassie para proteínas totales, obtiene el
resultado indicado en la fig 2. Para calcular el pI grafica los valores de pH del gel en función de la
distancia desde el ánodo según los datos de la tabla. En base a estos experimentos: a) Exprese el PM
aparente de la proteína. b) ¿A qué puede deberse el resultado obtenido en base al gel 2D. ¿Qué puede
decir acerca de su muestra? ¿Podría calcular el pI de la lactato deshidrogenasa? Calcule un valor
probable. c) ¿Agregaría algún paso en la purificación de la lactato deshidrogenasa? ¿Cúal?
12
Distancia
PH
desde
el
ánod
LogPM(KDa)
(cm)
2
1
24
26
28
30
FIG 1
32
34
36
38
40
Ve (ml)
6
8,5
5,5
8,0
5,0
7,6
4,5
7,1
4,0
6,4
3,5
6,0
3,0
5,6
2,5
5,4
2,0
4,5
1,5
4,0
1,0
3,4
0,5
3,0
17. Se aislaron 2 isoenzimas (A y B) a partir de 2 bacterias provenientes de distintas fuentes. Con el
fin de caracterizarlas se llevó a cabo una columna de exclusión molecular en presencia y ausencia de
glicerol. En ambas condiciones la proteína A presentó un volumen de elución (Ve) de 16 ml, mientras
que la proteína B presentó Ve de 16 ml y 26 ml en presencia y ausencia de glicerol, respectivamente.
La curva de calibración obtenida con diferentes marcadores de masa molecular se indica en el gráfico.
Además, se corrió un gel de poliacrilmida en presencia de SDS en las siguientes condiciones: 1)
hirviendo las proteínas con DTT (agente reductor), 2) sin DTT. El patrón electroforético obtenido se
muestra en la figura. Con todos los datos obtenidos determine las posibles estructuras cuaternarias de
ambas isoformas.
La concentración de proteína determinada por Bradford considerando la masa molecular nativa fue de
0,25 µM para ambas preparaciones. Alícutas de 1,5 ml de las soluciones proteicas fueron sometidas a
oxidación y reducción, y luego se incubaron con Eosin-maleimida (compuesto que reacciona en
relación estequeométrica 1:1con grupos SH-, 523= 85.000 M-1 cm-1). Luego de que las alicuotas
reacionan totalmente con el reactivo, se las dializa y se realizan medidas de absorbancia. Las medidas
de absorbancia a 523 nm de las formas nativas de las enzimas fueron 0,042 para A y 0 para B.
Mientras que las formas reducidas de ambas proteinas presentaron un valor de absorbancia de 0,085.
Indique el estado redox de las Cys presentes en cada proteína y la posible disposición de los puentes
disulfuro.
2.4
+DTT
2.2
A
B
-DTT
A
B
90
60
2.0
1.8
Log PM
40
1.6
1.4
16
1.2
1.0
0
10
20
30
Ve
40
18. Ud. recibe una muestra pura de proteína y procede a determinar su concentración por el método
de Bradford. Prepara 2 ml de un testigo de albúmina pesando 2 mg de la misma. Toma 5 l de esta
solución y la diluye hasta 500 l de agua destilada y utiliza 150 l de esta solución como testigo
obteniendo una absorbancia a 595 nm de 0,22. Para 25 l de la solución proteica en estudio se obtiene
una abs de 0,25. Cuando se realiza una electroforesis en condiciones nativas se obtiene un PM de
13
600.000 daltons, mientras que cuando se prepara la muestra con cloruro de guanidina se obtiene una
única banda de 150.000 daltons. El mismo resultado es obtenido si, además, la muestra se trata con 2mercaptoetanol. Una alícuota de 1,5 ml de la solución proteica se incubó con eosinmaleimida
(reacciona con grupos -SH, 523= 85.000M-1 cm-1) obteniéndose, luego de diálisis exhaustiva, un valor
de absorbancia a 523 nm de 0,0384. Posteriormente, se trató una alícuota de 1,5 ml de la proteína con
un agente reductor y luego con eosinmaleimida, obteniéndose, en este caso, un valor de absorbancia a
523 nm de 0,1153 luego de diálisis exhaustiva de la muestra. a) Exprese la concentración de la
proteína en M. b) Indique la estructura cuaternaria de la proteína señalando el estado de óxidoreducción de cada Cys y el número de Cys por molécula.
19. Usted tiene una mezcla de 4 proteínas con las siguientes características (cada círculo representa
un polipéptido y todos los residuos de cisteínas se encuentran indicados):
A
-S-SPI
PM nativo (kDa)
PM subunidades (kDa)
6
60
30
B
-SH
4,5
60
60
SHSH7,1
400
100
C
-SH
-SH
D
S-S
S-S
5,2
650
2x 150
2x 175
i) Realiza una cromatografía de exclusión molecular en columna de Sephacryl (rango de exclusión:
25.000-160.000 Da) en las siguientes condiciones: a) con glicerol, b) sin glicerol y con urea, c) ídem
b) más tratamiento con 2-mercaptoetanol. Esquematice el cromatograma que obtendría en cada caso y
justifique. ii) ¿Cómo procedería experimentalmente si quisiera separar la proteína D en forma nativa
del resto de las proteínas en la mezcla? Para ello, además de la columna mencionada, Ud. dispone de:
otra columna de exclusión molecular (rango de exclusión es de 70.000-350.000 Da); resinas de DEAEcelulosa y carboximetil-celulosa y una solución saturada de (NH4)2SO4. Justifique su elección. Los
valores de pKa de la DEAE- y carboximetil-celulosa corresponden a 9,5 y 4,5, respectivamente. iii) Si
lograra separarlas, ¿qué proteínas mostrarían un valor positivo de absorbancia a =523 nm luego del
tratamiento con eosinmaleimida? Justifique.
20. Ud ha purificado a homogeneidad la enzima málica dependiente de NAD, la cual cataliza la
siguiente reacción: malato + NAD  piruvato + CO2 + NADH. Al sembrar esta proteína en presencia
de 20% glicerol en una columna de exclusión molecular (Sephadex) previamente calibrada (ver
figura), la proteína eluyó a los 70 ml (fracción A). Cuando se repitió el procedimiento en ausencia de
glicerol se obtuvieron picos a 115 y 152 ml (fracciones B y C, respectivamente). La fracción A
presentó actividad enzimática, no así B y C. Por otra parte se analizó mediante una electroforesis en
condiciones desnaturalizantes una alícuota de la proteína purificada previamentte tratada con SDS y mercaptoetanol, obteniéndose una banda correspondiente a 70 kDa y otra de 30 kDa. En base a estos
datos caracterice estructuralmente lo mejor posible esta enzima.
y = -0.01x + 6
log PM
6
5.5
5
4.5
4
30
50
70
90
110
130
150
170
190
Ve (ml)
14
QUÍMICA BIOLÓGICA – 2016- ENZIMOLOGÍA
DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS
Describa métodos continuos y discontinuos para la determinación de la actividad enzimática y dé
ejemplos. b) Indique y explique brevemente todos los métodos a través de los cuales usted puede
seguir la evolución de esta reacción, indicando si se trata de métodos continuos o discontinuos.
NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi + ½ O2  NAD+ + 3 ATP + H2O
1.
2.
Indique si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas:
a) La constante de Michaelis, Km
* Varía con la velocidad de la reacción enzimática
* Es constante para una enzima determinada sea cual fuera el sustrato usado.
* Es la constante de velocidad para la descomposición del complejo ES.
* Es la concentración de sustrato a la cual se obtiene una velocidad igual a la máxima.
b) Usando una concentración de sustrato equivalente al 20% de Km, se obtuvo en una reacción
enzimática una velocidad de reacción de 1 µmol/min. Para esta reacción enzimática, el valor de Vmax:
* es igual a 2 µmol/min
* es igual a 2Km
* es igual a 6 µmol/min
3.
Se estudió para una proteína X la dependencia de la actividad enzimática con la concentración de
sustrato y se obtuvieron los siguientes valores de velocidad (µmoles/min.mg):
[S] (mM)
V
0,25
33
0,50
50
0,67
57
1,00
67
Teniendo en cuenta que el peso molecular de la proteína es 300.000: a) Calcule los valores de Km,
Vmax. b) Exprese el valor de velocidad máxima en Katal/mg. c) Calcule el número de recambio y
explique el significado del mismo.
4.
Dos estudiantes (A y B) aislaron independientemente la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de
músculo de caballo. Esta enzima cataliza la siguiente reacción:
NAD + lactato  NADH + piruvato
Una vez obtenida una solución concentrada de enzima, midieron actividad (µmol/min.mg proteína) en
función de la concentración de sustrato obteniendo los siguientes datos:
[S](M)
Act.
A
B
2.10-6
5.10-6
1.10-5
5.10-5
1.10-4
2.10-4
1.10-3
16
25
33
50
50
75
83
125
90
136
99
148
100
150
a) Sin graficar, estime aproximadamente Km y Vmax. Justifique. b) Proponga una explicación para la
discrepancia observada entre los parámetros cinéticos estimados por A y B. c) ¿Qué variables
graficaría para obtener Km y Vmax? Justifique.
15
La actividad de una muestra de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) pura, de concentración
2 mg/ml, se ensayó por un método discontinuo midiendo la aparición de piruvato mediante un ensayo
colorimétrico. La dinitrofenilhidrazina (DNFH) y el piruvato forman una hidrazona que luego del
agregado de NaOH presenta un máximo de absorbancia a 505 nm. Así, 10 µl de la muestra se
incubaron a 30ºC con concentraciones saturantes de lactato y NAD+ en un volumen final de 3 ml.
Luego de 3 min la reacción enzimática se detuvo por el agregado de 0,5 ml de DNFH. Después de
10 min se adicionaron 1,5 ml de NaOH 0,4 N y se midió absorbancia de la hidrazona formada a
505 nm, obteniéndose un valor de absorbancia de 0,6 una vez restado el blanco.
Para realizar la curva de calibración del método colorimétrico se trabajó en idénticas condiciones
utilizando una solución de ácido pirúvico (PM = 88) 4,4 mg/ml. Los valores obtenidos se muestran en
la tabla.
5.
ml de testigo
Abs (505 nm)
0
0,05
0,05
0,15
0,10
0,25
0,20
0,44
0,30
0,66
0,40
0,85
Calcule el número de recambio de la LDH, considerando que el peso molecular de la enzima es de
130.000 y que posee dos sitios activos por molécula.
La actividad de la enzima malato deshidrogenasa (MDH) purificada de maíz fue medida por un
método discontinuo. La enzima cataliza la siguiente reacción:
Oxaloacetato + NADH  Malato + NAD+
La reacción se llevó a cabo en 1 ml de medio de reacción que contenía 50 mM Tris-HCl pH 8;
concentración saturante de NADH, 10 mM de oxaloacetato (OAA) y 10 µl de la preparación
enzimática (0,1 mg/ml de proteína). Luego de 1 min de incubación a 37°C, se agregaron 5 ml de un
reactivo de color que se utiliza para dosar OAA, obteniéndose luego de 10 min una absorbancia de 0,2
una vez restado el blanco. Como testigo se utilizó una alícuota de 1 ml de OAA 4,6 mM, al que se le
adicionaron 5 ml de reactivo de color, registrándose una absorbancia (ya restado el blanco) de 0,095
luego de 10 min. a) Calcule las U/ml de enzima que posee la preparación. b) Sabiendo que el valor de
Km para el OAA de la enzima es 10 µM, el peso molecular es 200.000 y que la enzima posee 4 sitios
activos por molécula, calcule el índice de recambio. c) Proponga un método continuo de medida de
actividad para esta enzima.
6.
Se purificó a homogeneidad la enzima málica dependiente de NADP (EM-NADP) de PM 15.000
Da que cataliza la siguiente reacción:
malato + NADP  piruvato + CO2 + NADPH.
Se estudió la actividad enzimática a concentraciones de sustratos saturantes midiendo el aumento de
absorbancia a 340 nm ( NADPH = 6,22 mM-1 cm-1)
El medio de reacción contenía 20 µl de Malato 200 mM, 2 µl de NADP 50 mM y 20 µl de la
enzima pura (2,2 mg/ml) en un volumen final de 1 ml. Al cabo de 2 min de reacción enzimática se
obtuvo una variación de absorbancia de 0,78. El índice de recambio de la proteína es de 10,5 min-1.
a) Determine la concentración (mM) de sitios activos de la preparación enzimática. b) Determine
cuántos sitios activos posee cada molécula.
7.
Una enzima cataliza la reacción S  P. Con los siguientes datos estime el valor de Km para dicha
enzima: I) Índice de recambio: 3800 min-1, II) PM de la enzima: 62 kDa. III) Número de sitios activos
8.
16
por molécula de enzima: 3 IV) concentración de enzima de 1,5 mg/ml y V) la actividad enzimática,
ensayada en un medio de reacción de 1,5 ml que contenía 10 µl de una solución del sustrato 200 mM
dio un valor de 12 UI/ml de la preparación enzimática.
9.
En mamíferos existen 5 isoenzimas LDH, cada una de ellas con diferentes propiedades cinéticas
y movilidad electroforética. Una de las isoenzimas se localiza en corazón (H4-LDH) y otra en músculo
(M4-LDH). Se han determinado las siguientes propiedades cinéticas para ambas isoenzimas de origen
humano purificadas a homogeneidad:
Isoenzima
H4-LDH
Km Piruvato (mM)
0,300
Act. Específica (U/mg)
2000
M4-LDH
0,025
4800
Ante un daño sufrido por un determinado tejido, hay liberación hacia el torrente sanguíneo de la
correspondiente isoenzima. Es así que suele ser importante, para realizar un diagnóstico, no solo
determinar un aumento de LDH en suero, sino establecer qué isoenzima está incrementada. Suponga
que usted está en un laboratorio clínico de guardia y le traen un paciente inconsciente, debiendo usted
determinar si ha sufrido un infarto cardíaco o si sólo se trata de un agotamiento por ejercicio muscular
excesivo. Luego de determinar que los niveles de LDH en suero están elevados usted realiza un
estudio cinético de la actividad LDH sérica. Utilizando alícuotas de 10 µl de suero que contenía
50 mg/ml de proteína usted mide la actividad LDH a distintas concentraciones de piruvato obteniendo
los siguientes resultados:
Piruvato (mM)
Actividad LDH (U/ml)
0,0125
0,33
0,0166
0,40
0,0250
0,50
0,0500
0,66
En base a estos datos indique qué diagnóstico haría del paciente: infarto de miocardio o
agotamiento por ejercicio muscular excesivo. Justifique su respuesta.
Se procedió a purificar a homogeneidad la enzima Glutamato-piruvato transaminasa a partir de
hígado de rata. La enzima cataliza la reacción:
-cetoglutarato + alanina  glutamato + piruvato
10.
Luego de varios pasos de purificación se midió actividad enzimática de la preparación, para lo cual se
contaba con dos métodos alternativos.
a) El primer método de medida acopla una segunda reacción catalizada por la enzima Lactato
deshidrogenasa (LDH): Piruvato + NADH + H+  Lactato + NAD+, midiéndose la disminución de la
absorbancia a 340 nm ( NADH = 6,22 mM-1 cm-1). Se incubaron 200 µl de la preparación enzimática en
un volumen final de 1 ml que contenía -cetoglutarato, Ala, NADH y LDH. La disminución de la
absorbancia obtenida fue de 0,62 por minuto. Calcule las UI/ml de la preparación enzimática; b) Por el
otro método alternativo de medida se preincubaron 100 µl de la preparación enzimática en un volumen
final de 1 ml con -cetoglutarato y Ala. A los 10 minutos, la reacción se detuvo con el agregado de
0,5 ml de 2,4 dinitrofenilhidrazina y además se agregaron 5 ml de NaOH 0,2 N, obteniéndose una
velocidad de 0,32 U/ml. Sabiendo que 1 ml de testigo de piruvato 1 mM presenta con el mismo
17
método de medida una absorbancia de 0,2, calcule la absorbancia que obtendría en este caso; c)
Describa las razones por las cuales los valores de velocidad obtenidos difieren entre los dos métodos
utilizados.
11. La acetil-CoA carboxilasa (ACCasa) cataliza la carboxilación, dependiente de ATP, del acetilCoA para formar malonil-CoA, primer intermediario en la síntesis de ácidos grasos:
Acetil-CoA + ATP + CO2 Malonil-CoA + ADP + Pi.
La enzima fue aislada a partir de hojas de trigo y se llevaron a cabo los siguientes estudios cinéticos:
Se determinó la actividad enzimática en un volumen final de 200 µl en las siguientes condiciones:
100 mM Tricina-KOH (pH 8,0), 40 mM ATP, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1mM DTT, 30 mM acetilCoA, 30 mM [14C] NaHCO3 (3,33x 108 cpm; cpm=cuentas por minuto) y 1,8 g de la proteína
purificada. La reacción comenzó con el agregado de la enzima, transcurrió durante 10 minutos a 30°C
y se interrumpió por la adición de 50 µl de 6 N HCl. La acidificación del medio provoca la
inactivación de la enzima y la eliminación del HCO3- remanente por conversión en CO2. Alícuotas de
50 µl de la mezcla de reacción fueron transferidas a discos de papel de filtro. Los papeles se secaron a
temperatura ambiente y su radioactividad se contó en un contador de centelleo. El valor promedio de
radioactividad por disco correspondió a 3,5 x 106 cpm. Determine la velocidad de reacción en U/mg.
18
TABLAS DE PURIFICACIÓN
La enzima malato deshidrogenasa dependiente de NADP cataliza la siguiente reacción:
Malato + NADP+  Oxaloacetato + NADPH
A partir de 500 g de hojas de espinaca se obtuvieron 1500 ml de un extracto crudo con una
concentración de proteínas de 20 mg/ml. La actividad se determinó midiendo la aparición de NADPH
a 340 nm en forma continua. Para la determinación se utilizó una alícuota de 30 µl del extracto en un
volumen final de 3 ml, obteniéndose un A/10 min = 1,24, NADPH = 6200 M-1.cm-1.
Se realizó luego una cromatografía en DEAE celulosa recogiéndose 180 ml que contenían 1800 U de
actividad enzimática y 2.250 mg de proteína. El paso posterior fue una columna de hidroxilapatita,
recogiéndose 10 tubos de 4 ml cada uno con actividad deshidrogenasa. La concentración de proteína
en el conjunto fue de 0,94 mg/ml con un rendimiento del 50 % respecto del paso anterior. Como
último paso se realizó una cromatografía en columna de Sepharosa 6B y se recuperaron 760 U de
enzima y 31,4 mg de proteína en un volumen de 15 ml.
En base a estos datos a) Construya la Tabla de Purificación, b) Indique la purificación y el rendimiento
total alcanzados; c) ¿Cuál es la etapa individual que dio mayor purificación y cuál la de mayor
rendimiento? d) Describa el método empleado en el segundo paso de purificación. e) Señale si todas
las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta.
1.
2.
Se realizó la purificación de la enzima glucosa-6-fosfatasa que cataliza la siguiente reacción:
Glucosa-6-fosfato  Glucosa + Fosfato
Se partió de 200 g de hígado de bovino obteniéndose un extracto inicial de 1200 ml, que tenía una
concentración de proteína de 10 mg/ml. Para medir actividad enzimática se incubó una alícuota de
50 µl con el sustrato a 30°C en 1 ml de medio. La reacción se cortó directamente a los 10 min por el
agregado de 2 ml de reactivo de color para fosfato. La reacción de color se lee a 740 nm en una cubeta
de 1 cm de camino óptico. La Abs740 fue de 0,49 con un blanco de medida de 0,12. El coeficiente de
extinción del producto de la reacción de color es de 3700 M-1.cm-1.
Se realiza luego un corte con (NH4)2SO4 al 50 % rescatándose la fosfatasa en el precipitado, el que fue
redisuelto en 80 ml, recuperándose 1680 mg de proteína con una actividad total de 504 U.
Posteriormente, se realizó una cromatografía en Sephadex G-25 recogiéndose 10 tubos de 12 ml cada
uno con actividad enzimática. La concentración de proteína en el conjunto fue de 10,8 mg/ml con un
rendimiento, respecto del paso anterior del 80%. Como último paso se efectuó una cromatografía de
afinidad y se obtuvieron 144 U de enzima con actividad específica de 3,6 U/mg en un volumen de
20 ml.
En base a estos datos a) Construya la Tabla de Purificación. b) ¿Cuál es la purificación y el
rendimiento total alcanzados? c) ¿Cuál es la etapa individual que dio mayor purificación y cuál la de
mayor rendimiento? d) Describa el fundamento del último paso de purificación empleado. e) Señale si
todas las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta f) Explique la importancia de
realizar la cromatografía de exclusión molecular Sephadex G-25.
La dihidropicolinato sintetasa (DHDPSasa) se purificó y caracterizó a partir de cultivos de trigo
en suspensión. Dicha enzima cataliza la siguiente reacción, donde ASA y DHDP representan a
aspartato β-semialdehído y ácido 2,3 dihidropicolínico, respectivamente.
3.
Piruvato + ASA  DHDP + 2 H2O
19
Durante la purificación de la DHDPSasa se obtuvieron 200 ml de extracto crudo, que contenían 0,5 g
de proteína. La actividad se ensayó midiendo piruvato remanente. La reacción se llevó a cabo en 3 ml
de medio de reacción, conteniendo 30 µl de enzima, Tris-HCl 100 mM pH 8, 40 mM de piruvato
sódico y concentración saturante de ASA. Luego de 10 minutos a 30°C, la reacción enzimática se
detuvo por el agregado de 0,5 ml de DNFH (reactivo de color). Después de 15 minutos se adicionaron
1,5 ml de NaOH 0,4 N y se determinó la absorbancia de la hidrazona a 505 nm, en una cubeta de 1 cm
de paso óptico. La absorbancia obtenida fue de 0,8. Como testigo se utilizó una alícuota de 100 µl de
una solución de concentración 31,55 mg/ml de piruvato a la que se le realizó el mismo tratamiento que
a la muestra, obteniéndose una absorbancia A 505 nm de 0,25. PM Piruvato = 88.
A este extracto se le realizó un corte con (NH4)2SO4, precipitando la enzima entre el 30 y 60 % de
saturación. El precipitado se redisolvió y luego de desalado se obtuvo un volumen final de 150 ml, con
una concentración de proteína de 2 mg/ml, y un rendimiento de 80 %. La muestra anterior se separó en
dos fracciones. El 60 % se sembró en una columna de DEAE-celulosa obteniéndose 50 ml de muestra
conteniendo 75 mg de proteína, y un rendimiento con respecto al paso anterior del 45%. El 40%
restante se sembró en una columna de afinidad, obteniéndose 25 ml de muestra que contiene 20 mg de
proteína, purificándose 5 veces con respecto al paso anterior.
En base a los datos: a) Realice la tabla de purificación, b) Indique rendimiento y purificación totales,
c) Justifique cuál de las etapas alternativas elegiría.
4.
Se intenta purificar la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP que
cataliza la reacción:
Gliceraldehído 3-fosfato + NADP + Pi  1,3-Difosfoglicerato + NADPH + H+
Se parte de 500 g de hojas de espinaca, obteniéndose 1.500 ml de un extracto crudo con una
concentración de proteína de 20 mg/ml. La medida de actividad se determinó con una alícuota de 30 µl
por un método continuo, midiéndose la aparición de NADPH (NADPH = 6200 M-1.cm-1) en una cubeta
de 3 ml y 1 cm de camino óptico, obteniéndose un A/10 min= 1,24.
Se realizó luego una cromatografía en DEAE-celulosa, recogiéndose 180 ml que contenían 1800 U de
actividad enzimática y 2250 mg de proteína. El volumen total de este paso (180 ml) fue dividido en
dos volúmenes iguales. I) Una de las fracciones fue sometida a cromatografía de adsorción
(hidroxilapatita), recogiéndose 5 tubos de 4 ml cada uno, con actividad deshidrogenasa. La
concentración de proteína en el conjunto fue de 0,94 mg/ml, con un rendimiento respecto al paso
anterior del 50%. II) La otra fracción de la columna de DEAE-celulosa fue sometida a una
cromatografía de afinidad; en la que se recuperaron 800 U de enzima y 4 mg de proteína en un
volumen de 15 ml.
a) Calcule el rendimiento y la purificación para cada uno de los procedimientos alternativos empleados
b) La electroforesis en gel de poliacrilamida mostró que la enzima proveniente de uno de los
procedimientos migraba como una única banda de proteína (Rf = 0,33), mientras que la proveniente
del otro procedimiento mostraba la presencia de tres bandas proteicas (Rf = 0,25; Rf = 0,325 y Rf =
0,65). En base a la tabla de purificación podría adjudicar a qué procedimiento de purificación
corresponde cada electroforesis obtenida. Justifique su respuesta.
5.
Dos grupos de trabajo presentan independientemente protocolos para la purificación de una
enzima desde un mismo tejido de plantas. Para medir la actividad enzimática se incuba una alícuota de
30 l de enzima con el sustrato en 1 ml de medio de reacción. La reacción se corta a los 5 minutos por
el agregado de 2 ml de reactivo de color específico para el producto de la reacción ( =3700 M-1 cm-1)
Se utiliza una cubeta de 1 cm de camino óptico. La medida del blanco de reacción da un valor = 0,1.
Los volúmenes indicados se refieren a la cantidad recuperada en cada paso.
20
Protocolo 1: I) Extracto Crudo: 200 ml, Abs=0,56, [proteína]= 50 mg/ml; II) Fraccionamiento con
PEG: 300 ml. Se purifica 10 veces la enzima, con un rendimiento de 80%; III) Cromatografía en
DEAE-celulosa: 280 ml, Act Específica = 5 y 280 U de enzima; IV) Cromatografía en columna de
Hidroxilapatita: 25 ml, 84 U de enzima y 8,4 mg de proteínas.
Protocolo 2: I) Extracto Crudo: 400 ml 2,5 U/ml y una Act Específica = 0,05; II) Columna de
Sephadex: 500 ml Se purifica 2 veces la enzima, con un rendimiento del 50%; III) Precipitación con
(NH4)2SO4 y desalado: 200 ml, 1 U/ml y 0,3 U/mg; IV) Cromatografía en Affigel Blue: 30 ml.
Purificación parcial de 10 veces, y un rendimiento parcial del 80%
a) Indique la purificación y rendimiento de cada protocolo y compárelos. b) Indique la purificación
parcial y rendimiento parcial de cada paso. c) Proponga un posible protocolo alternativo (consistente
en extracto crudo más tres pasos) para mejorar la purificación. Justifique brevemente.
Durante la purificación de la enzima ureasa (Urea + H2O  2 NH4+ + CO2) se obtuvo 900 ml de
Extracto Crudo (EC) con una concentración de proteína de 3,33 mg/ml. Su actividad se midió
siguiendo la disminución de la Absorbancia a 340 nm utilizando la reacción acoplada NH4+ + KG +
NADH + H+ Glu + NAD+ ( NADH = 6200 M-1 cm-1). El agregado de 20 l de EC a 1 ml de la mezcla
de reacción produjo un A = - 0,800 en 4 minutos en una cubeta de 1 cm de camino óptico. Un corte
con (NH4+)2SO4 dio lugar a un precipitado que se redisolvió con buffer hasta 150 ml de volumen final.
De esta manera la ureasa se purificó 10 veces con un rendimiento del 82,8 %. Luego de pasados por
una columna de Sephadex G-25 se recolectaron 80 ml con 45 mg de proteína, purificándose 50 veces
respecto del EC con un rendimiento del 90 % respecto del paso anterior. Su actividad se determinó por
el método discontinuo (NH4+ + Fenol + Hipoclorito  Azul de Indofenol) cuya curva de calibración
de NH4+ presentó una pendiente de 0,6557 UA/mol NH4+. Las condiciones de la colorimetría fueron
las mismas para la curva y la muestra. a) ¿Cuál fue la absorbancia al cabo de un minuto por este último
método para la muestra si se emplearon 40l de ureasa obtenida en la última etapa? Tenga en cuenta
que para la ureasa una unidad de actividad enzimática (1 UI) se define como la cantidad de enzima que
cataliza el consumo de 1 μmol de sustrato (urea) por minuto en las condiciones especificadas.
b) Realice la tabla de purificación.
6.
La enzima málica cataliza la reacción: Malato + NADP+  Piruvato + CO2 + NADPH + H+. Se
intentó purificar esta enzima a partir de hojas de maíz. Para ello se realizaron distintas etapas que
incluyeron la preparación de un extracto crudo, precipitación con (NH4)2SO4, cromatografía de
exclusión molecular en Sephadex G-100 y cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa. La
medición de proteínas se realizó por el método de Gornall. Para ello, alícuotas de 20 µl de la
preparación enzimática se incubaron con 2 ml del reactivo de Biuret durante 15 min a 37°C. El testigo
de ovoalbúmina (10 mg/ml) procesado de la misma manera produjo un valor de absorbancia de 0,650
medido a 545 nm. La actividad enzimática se determinó en 1 ml de medio de reacción que contenía
50 mM Tris-HCl pH 8,0, cantidades saturantes de los sustratos y 10 µl de la preparación enzimática. A
los 10 min de incubación a 30°C, la reacción se detuvo por el agregado de 2 ml de
dinitrofenilhidracina. Como testigo se utilizó 1 ml de piruvato (PM=88) de 0,5 mg/ml que produjo un
valor de absorbancia de 0,040 medido a 505 nm. En base a los datos suministrados, a) Construya la
tabla de purificación calculando el rendimiento y la pureza total alcanzados; b) Proponga otros dos
métodos de medida de la actividad enzimática. Explíquelos brevemente.
7.
21
Etapa
Volumen Abs 545 nm
(ml)
Abs 505 nm
Extracto crudo
30
0,390
0,050
(NH4)2SO4
Sephadex G-100
DEAE-celulosa
8
4
2
0,253
0,163
0,097
0,166
0,208
0,375
Se intenta purificar la enzima Gliceraldehído 3P deshidrogenasa que cataliza la siguiente
reacción:
Gliceraldehído-3P + NADP+  3P-Glicerato + NADPH + H+
Luego de obtener el extracto crudo y realizar varios pasos de purificación a partir de hojas de espinaca
se obtuvieron 75 ml con una concentración de proteína de 2 mg/ml. La medida de actividad se realizó
con una alícuota de 20 µl midiéndose por método continuo la aparición de NADPH a 340 nm
(ε= 6200 M-1. cm-1) en una cubeta de 4 ml y 1 cm de camino óptico, obteniéndose un A de 0,31 en
4 minutos.
Con el fin de elegir qué paso era más conveniente para continuar la purificación, se toman
distintas alícuotas de la muestra y se procede de la siguiente manera:
1.
40 ml fueron sometidos a una cromatografía de exclusión molecular en la que se recuperaron
100 ml que contenían 100 U de actividad y 80 mg de proteína.
2.
25 ml fueron sometidos a una cromatografía de adsorción obteniéndose un rendimiento del 50%
y recogiéndose 10 tubos de 1 ml, con una concentración de proteína de 0.03125 mg/ml.
3.
Con los últimos 10 ml se realizó una DEAE-celulosa obteniéndose 5 ml con una actividad
específica de 2.5 U/mg y 5 mg de proteína.
En base a los datos: a) Calcule rendimiento y purificación para cada uno de los tres procedimientos.
b) ¿Qué procedimiento elegiría si su objetivo fuera obtener la enzima lo más pura posible?
8.
22
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
1.
Luego de purificar la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa se procedió a determinar el
valor de Vmax y Km para el gliceraldehído 3-fosfato a pH 8,0. Los valores obtenidos fueron los
siguientes: Vmax = 20 U/ml; Km = 1 mM. Luego se volvieron a determinar estos parámetros cinéticos
en presencia de cuatro sustancias conocidas A, B, C y D, obteniéndose en cada caso los siguientes
valores:
Km (mM)
2,0
0,5
1,0
6,0
En presencia de A
En presencia de B
En presencia de C
En presencia de D
Vmax (U/ml)
20
10
10
10
En base a estos datos, indique que tipos de sustancias son A, B, C y D. Justifique.
La enzima hexoquinasa cataliza la siguiente reacción: Glucosa + ATP  Glucosa-6-P + ADP.
Al observar que la enzima es inhibida por piruvato, se intentó estudiar el mecanismo de la inhibición.
Para ello se determinó la velocidad de reacción a distintas concentraciones de glucosa, en ausencia y
en presencia del inhibidor y a concentraciones saturantes de ATP. Los resultados obtenidos se
muestran en la tabla que sigue:
2.
Glucosa (mM)
0,1
0,2
0,3
0,4
Piruvato (mM)
0
Actividad (U/mg)
9,98
15,02
17,89
20,05
0,4
7,14
10,72
12,86
14,28
a) Determine qué tipo de inhibición presenta el piruvato con respecto a la glucosa sobre la enzima y
esquematice el mecanismo de inhibición. b) Calcule Km, Vmax y la constante de disociación del
complejo hexoquinasa-piruvato. c) Calcule la velocidad de reacción cuando la concentración de
glucosa es igual al valor de Km aparente, si el piruvato está presente a una concentración de 0,4 mM.
3.
Sobre una enzima que cataliza la reacción S  P se prueba el efecto de dos inhibidores X e Y,
obteniéndose los siguientes datos de velocidad. Determine la naturaleza de cada inhibidor haciendo un
esquema de la inhibición. Calcule Km, Vmax y Ki.
[S] (mM)
2,00
2,50
3,33
4,00
5,00
Sin agregado
50,00
55,56
62,47
66,67
71,42
Velocidad (U/ml)
+ 12 µM X
40,00
45,45
52,63
57,14
62,50
+ 60 µM Y
22,22
25,00
28,56
30,77
33,33
23
4.
Cuando la reacción enzimática catalizada por la LDH (lactato deshidrogenasa) se lleva a cabo en
presencia de una concentración 0,3 mM de un inhibidor X, tanto Km como Vmax disminuyen a un
tercio del valor obtenido en ausencia del inhibidor. Responda el siguiente cuestionario: a) ¿Qué tipo de
inhibición presenta X sobre el sistema enzimático? b) ¿Cómo es la afinidad aparente de la enzima por
su sustrato en presencia del inhibidor, comparada con la afinidad real que se observa en ausencia del
inhibidor? ¿Por qué se produce ese cambio en la afinidad? c) Estime Ki del inhibidor X lo más
exactamente que pueda con los datos disponibles. Si usted necesitase calcular Ki con una exactitud
mayor ¿qué experimentos realizaría?
En un estudio de inhibición por GMP de la malato deshidrogenasa dependiente de NADP
(MDH) que cataliza la reacción:
5.
Oxaloacetato + NADPH + H+  Malato + NADP+
se obtuvieron los valores de A340 nm/min que figuran en la tabla. La actividad enzimática se midió con
10 µl de la MDH en una cubeta de 1 ml y 1 cm de camino óptico y concentraciones saturantes de
Oxaloacetato. En base a la misma: a) Indique qué tipo de inhibidor es GMP con respecto a NADPH. b)
Calcule Ki mendiante gráficos secundarios y de Dixon c) Calcule Km para NADPH y Vmax de la
enzima (U/ml). (0= 6200 M-1. cm-1).
NADPH (mM)
GMP (mM)
0,0
1,0
3,0
4,0
5,0
0,25
0,50
0,67
1,00
0,365
0,248
0,151
0,127
0,109
A340 nm/min
0,564
0,654
0,413
0,497
0,270
0,336
0,230
0,289
0,200
0,254
0,775
0,620
0,443
0,388
0,344
6.
La enzima málica dependiente de NADP es una proteína homotetramérica que cataliza la
reacción: L-malato + NADP  CO2 + piruvato + NADPH.
Para determinar el modo de acción de succinato con respecto a malato, se estudió la velocidad de la
reacción enzimática en ausencia y en presencia de distintas concentraciones del mismo, a
concentraciones saturantes de NADP. Los resultados se resumen en la siguiente tabla. En base a los
datos: a) Determine gráficamente los valores de Km Malato y Vmax de la enzima. b) Indique que tipo
de inhibidor es el succinato con respecto a malato y calcule su Ki. c) Represente los gráficos
secundarios y de Dixon para éste sistema.
Tabla
succinato
0
0,4
0,8
1,2
1,6
(mM)
malato
Actividad (U/mg)
(mM)
0,1
9,98
7,14
5,55
4,55
3,85
0,2
15,02 10,72
8,33
6,82
5,77
0,3
17,89 12,86 10,02
8,18
6,92
0,4
20,05 14,28 11,11
9,09
7,69
24
7.
Para el tratamiento de una enfermedad, un laboratorio farmacéutico está tratando de desarrollar
un nuevo medicamento consistente en un inhibidor que se combine únicamente con la forma libre de la
enzima E involucrada en dicha enfermedad. Para ello analiza a los inhibidores X e Y obteniendo los
siguientes resultados:
V (moles min-1 mg-1)
1/ S ( M )-1
X 0mM X 2 mM
0,33
10,4
6,0
0,20
14,5
9,1
0,10
22,5
15,15
0,03
33,8
28,4
0,01
40,5
37,9
Al medir velocidad inicial de la reacción enzimática (U/mg) en función de la concentración de sustrato
S en ausencia y en presencia de 2 mM de Y y luego de realizar la representación de Lineweaver-Burk,
se obtuvieron dos rectas intersectantes en un mismo punto en el eje de las ordenadas. La pendiente de
la recta obtenida en presencia de Y fue de 0,66.
En base a los datos: a) Calcule Km y Vmáx de la enzima E. b) ¿Qué tipo de inhibidores son X e Y?
Justifique. Indique los valores de Km y Vmáx en presencia de X e Y. C) ¿Cuál/es de los inhibidores sería
útil para el tratamiento de la enfermedad? En caso de que ambos lo sean, diga cuál sería el más
efectivo. Justifique su respuesta teniendo en cuenta el valor de Ki.
8.
Se estudia el efecto de dos inhibidores X e Y sobre la actividad de una enzima. Los resultados
del ensayo utilizando 5 µl de la solución enzimática se muestran en el gráfico. Además, se determina la
actividad en función de la cantidad de enzima en presencia de una concentración constante de cada
inhibidor y se obtienen los datos de velocidad que se detallan en la tabla. Explique los resultados
obtenidos.
1/v
[X]=100M
[Y]=100M
Sin inhibidor
Actividad (U)
µl de Enzima 100 µM X
100 µM Y Sin inhibidor
1
2
3
4
5
0
0
0
10
20
7,5
15
22,5
30
37,5
10
20
30
40
50
6
30
45
60
1/[S]
25
EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA
1.
El gráfico adjunto muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad máxima de una enzima.
a) Indique las causas por las que varía la actividad enzimática en función de la temperatura
estableciendo efectos directos y efectos indirectos. b) ¿Qué experimento le permitiría distinguir entre
efectos reversibles e irreversibles? c) Indique que zona del gráfico utilizaría para obtener la energía de
activación (Ea) de la reacción y como la calcularía. Defina Q10. ¿Cuál metodología considera más
apropiada para el cálculo de la Ea?
Vmax
Actividad (mol/min.mg)
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Temperatura (ºC)
2.
Al ensayar la actividad de una enzima a diferentes temperaturas se obtuvieron los datos
mostrados en la línea A. Cuando la enzima se preincubó a distintas temperaturas durante 15 min y
luego se determinó actividad a temperatura óptima, se obtuvieron los datos de la línea B. Ambos
experimentos se realizaron a concentraciones de sustratos iguales a 100 veces los valores de Km.
T (°C
Act. (U/mg)
A
B
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
1,1
2,5
2
2,5
4
5
10
30
15
30
22
30
30
30
25
20
20
10
12
7,5
6
2,5
2
1,5
En base a estos datos: a) Indique la T óptima de la enzima. b) ¿Por qué la actividad enzimática cuando
se ensayó a la temperatura óptima no fue constante para todas las muestras previamente incubadas a
las distintas temperaturas? c) Calcule el Q10 y la energía de activación.
3.
Cuando se realizó el estudio de la dependencia de la actividad enzimática con la temperatura de
una enzima, se obtuvieron los datos que figuran en la gráfica. Los experimentos se llevaron a cabo a
pH 4, 6 y 8. En base a los gráficos de Arrhenius que se muestran, hipotetice acerca del
comportamiento de esta enzima en las distintas condiciones, considerando que la misma es estable a
los pH evaluados y que contiene una His involucrada en la catálisis.
4.
Cuando se intenta purificar la enzima nucleótido pirofosfatasa de Proteus vulgaris se determina
que inevitablemente copurifica con un inhibidor. Debido a que el mencionado inhibidor es termolábil,
se decide calentar a 100 oC para eliminarlo. Sin embargo, al realizar este procedimiento se encuentra
que la enzima se desnaturaliza. Si se repite el calentamiento a 100 oC, con el agregado adicional de una
sustancia X (cuya unión a la enzima ha sido previamente descripta), se observa que la enzima no
pierde su actividad. a) Explique estos resultados. b) ¿Qué tipo de sustancia puede ser X?
26
5.
El gráfico adjunto muestra el efecto del pH sobre la actividad de una enzima medida a
concentraciones de sustrato constante y saturante. a) Enumere las causas por las que la actividad
enzimática puede variar en función del pH. b) Plantee un diseño experimental para distinguir entre los
posibles efectos del pH. c) De acuerdo al gráfico ¿a qué pH trabajaría para realizar los estudios
cinéticos de esta reacción enzimática? d) Si la enzima es estable y el sustrato no sufre cambios de
ionización en el rango de pH estudiados, ¿a qué corresponderían los puntos de inflexión de la curva
(pH 4 y 8)?
6.
Indique si los gráficos que se muestran sugieren ionización de la enzima libre o ionización del
complejo enzima-sustrato. Suponga que en ese rango de pH no hay desnaturalización de la enzima,
como así tampoco del sustrato. Justifique brevemente.
2.2
A
1.8
pKm
Log Vmax
2.0
1.6
1.4
1.2
1.0
2
4
5
6 7
pH
8
9 10 11
2.5
2.5
2.0
2.0
1.5
1.5
pKm
Log Vmax
B
3
3.0
2.7
2.4
2.1
1.8
1.5
1.2
0.9
0.6
1.0
2
3
4
5
6 7
pH
8
9 10 11
2
3
4
5
6 7
pH
8
9 10 11
1.0
0.5
0.5
0.0
0.0
-0.5
2
3
4
5
6 7
pH
8
9 10 11
27
1/Actividad (U/mg)
A
Actividad (U/mg)
10
-1
7.
Un investigador purifica a homogeneidad la enzima malato deshidrogenasa y realiza un estudio
de la actividad de la enzima en función del pH utilizando una concentración de sustrato subsaturante.
Obtiene la gráfica A. Sin embargo cuando preincuba la enzima a distintos valores de pH entre 2 y 10 y
luego mide la actividad a pH óptimo observa que la enzima presenta actividad máxima entre pH 4.0 y
8.0. Con el fin de determinar qué aminoácidos estaban implicados en la catálisis determina la actividad
de la enzima a concentraciones variables de sustrato y a tres valores de pH, obteniendo el gráfico B.
Teniendo en cuenta que el sustrato no sufre cambios de protonación en el rango de pH estudiado,
indique: a) El rango de estabilidad de la malato deshidrogenasa, el pH óptimo de la enzima. b)
Proponga un modelo (con un esquema) que explique los resultados obtenidos en la gráfica B.
c) Cuando el investigador grafica los distintos valores de Km a distintos valores de pH, obtiene que un
grupo con un pKa de 6,2 está implicado en la catálisis. Sin embargo, al estudiar la secuencia primaria
de la enzima y compararla con otras secuencias encuentra que, de todos los residuos ionizables, sólo
un residuo de Glu está conservado (pKa COO-=4,0). ¿Podría ser dicho grupo el responsable de los
cambios de la actividad de la enzima? ¿Por qué podría presentar ese valor de pKa?
8
6
4
12
pH 4.0
B
9
pH 6.0
6
pH 8.0
3
0
2 4 6 8 10 12
0
pH
1
2
3
4
1/[S] (mM)-1
8.
El gráfico A muestra los resultados de los estudios de la estabilidad de la enzima malato
deshidrogenasa purificada de mitocondrias y glioxisomas a distintos pH. Cuando se procedió a realizar
la determinación del pH óptimo se obtuvo el gráfico B a) Indique el pH óptimo de las isoenzimas y
establezca el rango de pH en el cual ambas enzimas son estables. b) Analice las posibles causas de la
disminución de la actividad a pH mayores y menores al pH óptimo en cada caso. c) Explique como
realizaría el estudio de estabilidad en función del pH, especificando todos los parámetros a tener en
cuenta. d) Según los resultados obtenidos en el caso de la enzima mitocondrial a pH mayores a 8,5
indique qué grupo/s ionizable/s de la enzima podría/n estar implicado/s en los cambios de actividad
observados. ¿Qué estado de ionización presenta dicho grupo en la enzima activa?
120
MDH mitocondrial
100
A
80
60
40
B
MDH mitocondrial
MDH glioxisomal
100
Actividad (%)
Actividad (%)
MDH glioxisomal
80
60
40
20
20
0
0
3
4
5
6
7
8
pH
9
10
11
12
3
4
5
6
7
8
9
10
11
pH
28
CINÉTICA DE DOS SUSTRATOS
1.
Describa tres modelos cinéticos para una reacción enzimática en la que participan dos sustratos.
Describa también métodos de diagnóstico para determinar el modelo cinético seguido por una reacción
enzimática que involucre dos sustratos.
2.
La glutamato-oxaloacetato aminotransferasa, llamada comúnmente transaminasa GOT, es una
enzima que interviene en el metabolismo de los aminoácidos y posee importancia clínica para el
diagnóstico de patologías hepáticas. La enzima posee fosfato de piridoxal como grupo prostético y
cataliza la siguiente reacción:
Glutamato + Oxaloacetato  Aspartato + 2-Cetoglutarato.
En una investigación sobre el mecanismo cinético se analizó la dependencia de la actividad enzimática
con la concentración de glutamato, a dos concentraciones diferentes de oxaloacetato. Los resultados
obtenidos se resumen en la tabla:
Glutamato (mM)
Experimento
+ 0,1 mM oxaloacetato
+ 0,2 mM oxaloacetato
0,1
0,2
2,0
2,2
3,4
4,2
0,3
0,4
0,5
Velocidad (U/mg)
4,4
5,0
5,8
6,6
0,8
5,8
8,0
6,6
10,0
Por otra parte, el aspartato se comportó como un inhibidor competitivo respecto del glutamato, cuando
se agregó oxaloacetato en concentraciones saturantes. Proponga en forma esquemática un modelo
cinético que sea compatible con estas observaciones experimentales.
3.
Una enzima cataliza la reacción S1 + S2  P1 + P2. Cuando se mide la actividad a
concentraciones variables de S2, manteniendo constante la concentración de S1 se obtienen los valores
de velocidad (µmoles/min.mg) que se presentan en la siguiente tabla:
[S2] (mM)
[S1] (mM)
5
10
1
4
7,7
2
4
6
10
Velocidad (µmoles/min.mg)
6,7
10
12
12,5
18,2
21,4
14,3
25
El efecto de los productos se resume en la tabla siguiente:
S1 Variable
S2 Subsat.
S2 Sat.
P1
P2
NC
NC
--NC
S2 Variable
S1 Subsat.
S1 Sat.
C
NC
C
AC
29
a) Indique si la reacción sigue un mecanismo secuencial o ping-pong. Justifique brevemente. b) En
caso que corresponda indique el orden de adición de sustratos y de salida de los productos.
Esquematice el modelo de reacción.
4.
La enzima citrato sintasa de mitocondrias participa en el metabolismo catabólico de los hidratos
de carbono en todos los organismos aeróbicos, catalizando la siguiente reacción:
Oxaloacetato + Acetil-CoA  Citrato + CoA
En una investigación sobre el mecanismo cinético de esta enzima se llevó a cabo un estudio de la
variación de la actividad enzimática en función de la concentración de oxaloacetato, a dos
concentraciones diferentes de Acetil-CoA. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla:
OAA (mM)
Experimento
+ 0,1 mM Acetil-CoA
+ 0,2 mM Acetil-CoA
0,5
0,67
2,00
1,0
1,5
2,0
2,5
4,0
1,10
3,35
V (U/mg)
1,45
1,65
4,15
5,00
1,85
5,55
2,2
6,65
Por otra parte, el citrato se comportó como un inhibidor competitivo tanto respecto a oxaloacetato
como respecto a acetil-CoA, y otro tanto ocurrió con la Coenzima A. Proponga en forma esquemática
un modelo cinético que sea compatible con estas observaciones experimentales.
5.
Un estudiante purifica una quinasa de un sustrato A (A + ATP  A-P + ADP) y decide estudiar
su mecanismo de reacción. Así, incuba la enzima con ATP marcado con 32P. Al cabo de 1 h precipita
la enzima, observando que la radiactividad inicial en el sobrenadante ha disminuido un 50%,
detectándose también ADP no marcado. a) Plantee un mecanismo de reacción posible de esta quinasa.
b) Indique qué tipo de gráficos esperaría obtener al graficar 1/v vs 1/[A] a distintas concentraciones de
ATP. c) ¿Esperaría obtener radiactividad en la fracción proteica? Explique su respuesta.
Una vez purificada la enzima L-Aspartato aminotransferasa, enzima que cataliza la reacción:
aspartato + oxoglutarato  glutamato + oxaloacetato
Se procedió a estudiar el efecto de la concentración de aspartato a concentraciones constantes de
Oxoglutarato sobre la velocidad inicial. Los valores de velocidad inicial obtenidos (µmol/min.mg) se
transcriben a continuación:
6.
[Aspartato]
0,5 mM
[Oxoglutarato]
Saturante
5 mM
1 mM
18,2
16,7
15,4
1 mM
2,5 mM
5 mM
Velocidad (µmol/min.mg)
33,4
66,6
100,0
28,6
50,0
66,6
25,0
40,0
50,0
10 mM
125,0
77,0
55,0
a) Determine gráficamente los valores de Vmax y Km para el aspartato. Indique el valor de Vmax en
UI/mg y en katal/mg. b) ¿Cuál es el índice de recambio, asumiendo que la enzima posee un PM de
50 kDa y que posee 2 sitios activos por molécula. c) Indique el mecanismo de reacción de esta enzima.
Fundamente brevemente.
30
7.
En un sistema enzimático multisustrato del siguiente tipo:
A
+ B
P
+
Q
Los reactivos A y B se adicionan al enzima E completamente al azar. Cuando se representa 1/v vs
1/[A] a distintas concentraciones de B, se obtienen rectas que se intersectan en un punto cuyo valor
sobre el eje de las abscisas es de –10 mM-1. El valor de  (el factor de interacción entre A y B) es
0,28. a) Esquematice el mecanismo de la reacción catalizada enzimáticamente. b) Calcule el valor de
Km para A y el valor de KA. c) La enzima posee 4 subunidades de 200 kDa cada una, con 1 sitio activo
por subunidad. Calcule el número de recambio, sabiendo que Vmax es 0,5 U. Considere que la
velocidad de reacción se mide por un método continuo en una cubeta de volumen final de 1 ml, y que
se utilizaron 20 l de una preparación enzimática pura de concentración 2 mg/ml. d) ¿Qué otros
experimentos deben realizarse para confirmar el mecanismo de la reacción enzimática?
8.
La enzima malato deshidrogenasa (MDH) cataliza la reacción:
Malato + NAD  Oxaloacetato (OAA) +NADH
Para caracterizar el mecanismo de reacción y el sitio activo de la enzima se llevaron a cabo dos
experimentos. En el 1° experimento se estudió el efecto de los productos de la reacción sobre la
actividad enzimática a concentraciones subsaturantes de malato obteniéndose los datos que figuran en
la Tabla 1. En el 2° experimento, 150 µg de enzima preincubada durante 30 min en presencia de los
productos de la reacción o en ausencia de los mismos fueron tratadas 2 hs con N-etilmaleimida (agente
modificador de residuos de cisteína) obteniéndose los datos de la Tabla 2. El control de la enzima sin
tratar con etilmaleimida dio un valor de actividad de 100U/ml. En base a los resultados: a) indique el
posible mecanismo de reacción de la enzima, justifique; b) ¿Qué puede concluir acerca de los
aminoácidos involucrados en el sitio catalítico?
Tabla 1
NAD (mM)
0,025
0,033
0,050
0,100
Sin agregados
33,3
40,0
50,0
66,7
Tabla 2
Sin agregados
+ NADH
+ OAA
Actividad (U/ml)
+ NADH
20,0
25,0
33,3
50,0
+ OAA
16,7
20,0
25,0
33,3
Actividad (U/ml)
16
91
34
31
REGULACIÓN, CINÉTICAS NO HIPERBÓLICAS y ESTUDIO DEL SITIO ACTIVO
1.
a) Describa 4 mecanismos diferentes para regular la actividad de las enzimas. b) Esquematice
de manera sencilla la regulación de la actividad enzimática por fosforilación.
2.
La enzima malato deshidrogenasa dependiente de NADP cataliza la siguiente reacción en
cloroplastos de células vegetales:
malato + NADP  OAA + NADPH
La enzima presenta una Km para el malato de 15 M durante el día, mientras que a la noche el
valores de Km para el mismo sustrato aumenta 10 veces. Por otra parte, el dosaje de residuos de Cys
con eosinmaleimida mostró que en condiciones de iluminación la enzima posee 7 residuos de Cys
libres por molécula de enzima, mientras que sólo se detectan 5 residuos por el mismo método en
condiciones de oscuridad. Proponga una posible causa del comportamiento descripto.
3. Un investigador purifica una enzima de una bacteria Gram-positiva (I) y de hígado de ratón (II).
Decide realizar la caracterización de la misma de ambas fuentes y realiza los siguientes estudios: a)
Determinación de la masa molecular en columna de exclusión molecular en condiciones nativas: I=
200 kDa; II= 200 kDa; b) Determinación de la masa molecular en SDS-PAGE: I= 50 kDa; II= 50
kDa; c) Medición de la velocidad de reacción a concentraciones infinitas del sustrato (S): I=10 U/mg;
II= 10 U/mg; d) Determinación de la concentración de S que da una velocidad de 5 U/mg: I= 1 mM;
II= 1 mM. Cuando estudia la cinética de la reacción obtiene los siguientes resultados mostrados en
las tablas. a) ¿Qué puede decir sobre la cinética seguida por cada enzima? b) Sabiendo que la enzima
tiene un solo sitio de unión del sustrato por subunidad, ¿qué puede decir acerca de las interacciones
de los sitios activos en cada caso? c) ¿Qué gráfico realizaría para avalar su propuesta? d) ¿Encuentra
alguna diferencia sobre la regulación que cada enzima podría presentar in vivo por la concentración
de sustrato? Explique.
Enzima II
V (U/mg)
S (mM)
0
0
0,5
0,5
1
5
2
9,5
4
10
10
10
4.
Caracterice a las enzimas A (círculos vacíos) y B (círculos
llenos) lo mejor posible indicando para cada una de ellas:
a) comportamiento cinético, b) gráfico de velocidad versus [S];
c) ecuación de velocidad; d) número de Hill.
log (Vmax-v)/v
Enzima I
[S] (mM)
V (U/mg)
0,1
0,9
0,5
3,3
1
5
2
6,6
4
8
10
9,1
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,8
A
B
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
log [S]
32
5.
En el esquema siguiente se indica una vía metabólica donde dos de las enzimas están sujetas a
regulación alostérica por el intermediario metabólico E.
Las letras mayúsculas simbolizan los sustratos y los números las
1
2
3
4
5
enzimas que catalizan las reacciones. a) Defina efector
A→B↔C↔D↔E→F
alostérico. b) Indique cuales de las enzimas de esta vía podrían
ser las reguladas y que efecto tendría E sobre ellas.
6.
Con la finalidad de estudiar una enzima homotetramérica, la misma fue incubada con un
modificador de residuos de cisteína en ausencia y en presencia de concentraciones saturantes de los
sustratos de la reacción. Periódicamente, se extrajeron alícuotas para la determinación de la actividad
enzimática y composición de aminoácidos. Los resultados se indican en la Tabla. a) ¿Qué puede
concluir acerca de los aminoácidos involucrados en el sitio catalítico? b) Indique cuantos residuos de
cisteína son modificados por sitio activo.
en ausencia de los sustratos
Tiempo
(minutos)
Actividad
(U/mg)
0
15
30
45
60
90
30,0
16,8
8,6
4,5
0,5
0,5
en presencia de los sustratos
moles de residuos
Actividad
moles de residuos
Cys no modificados / (U/mg) Cys no modificados /
mol enzima
mol enzima
28,0
30,0
28,0
24,2
29,3
28,0
22,3
28,5
28,0
20,5
27,8
27,9
19,9
27,0
27,8
19,8
27,0
27,8
33