UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA EVALUACIÓN DEL FACTOR MASCULINO EN LOS TRATAMIENTOS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA MEDIANTE INYECCIÓN INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZOIDES TESIS DOCTORAL ELISA ESCALANTE BERMÚDEZ MADRID 2015 Dña Antonia María Fernández Peralta, Catedrática de Genética del Departamento de Biología de la Universidad Autónoma de Madrid, y Dña Laura de la Fuente Bitaine, Coordinadora de la Unidad de Reproducción Humana del Hospital 12 de Octubre y Profesora Asociada de la Universidad Complutense de Madrid, certifican que Dña Elisa Escalante Bermúdez ha realizado, bajo su dirección, el trabajo de Tesis Doctoral titulado: "Evaluación del factor masculino en los tratamientos de reproducción asistida mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides". Revisado el presente trabajo, consideran que tiene la debida calidad para su presentación y defensa. Dra. Dña. Antonia María Fernández Peralta Dra. Dña. Laura de la Fuente Bitaine A Uxío Caminante, son tus huellas el camino, y nada más; Caminante, no hay camino, se hace camino al andar. ANTONIO MACHADO Emprendí este camino hace muchos años fundamentalmente animada por mi padre, he cambiado de idea muchas veces, ha sido largo y duro pero lo he conseguido, sólo lamento que no puedas verlopapá. Gracias a la Dra. Fernández Peralta y a la Dra.dela Fuente Bitaine que me han guiado y acompañado durante el camino. Sin su ayuda la culminación de este proyecto no hubiera sido posible. Gracias Juanjo y Toñi, por vuestra dedicación, porque fuisteis vosotros los que me introdujisteis en el mundo de la ciencia, los que me enseñasteis a desenvolverme en un laboratorio hace ya mucho, mucho tiempo. Por ser un ejemplo al que intentar parecerme, por vuestro cariño y por vuestro apoyo en este y en otros muchos momentos importantes de mi vida. Gracias Laura por tu presencia, tu disponibilidad absoluta, por caminar conmigo por la vida, por la suerte de tenerte a mi lado. Gracias a mis compañeras de trabajo por vuestrainmensa paciencia, por vuestra compresión, por vuestra generosidad infinita, por empujarme cuando me desanimaba. Por los buenos ratos que pasamos juntas, por tantas risas y porque sois una parte importante de me guste mi trabajo. Gracias Pilar por tu sensatez sin límites, por facilitarme tanto las cosas, por tus consejos y por tu apoyo constante, por disfrutar conmigo de los momentos buenos y apoyarme en los malos, por la suerte que tuve al conocerte. Gracias Nerea por estar siempre dispuesta, por ayudarme en muchos momentos y aspectos de este trabajo, por sustituirme cuando no he podido estar en dos sitios a la vez y por asumir en muchas ocasiones mi trabajo con una sonrisa. Gracias a mis amigos y a mis amigas por alegrarme la vida, por vuestro interés, por vuestra preocupación, por los miles de buenos momentos que hemos compartido. A Bruno, a Marta y a Alicia porque hacéis mi vida mejor, por lo agradecida que estoy de que forméis parte de ella y por todo lo que nos queda por vivir juntos . A mis amigas Isabel y Esther por todo lo que hemos vivido juntas, por poder contar con vosotras en los buenos momentos y en los no tan buenos y por la suerte que tuve de que aparecieseis un día en mi vida. A Cris, Jaime, Itziar y todo el resto de amigos y familiares por poder contar siempre con vosotros y por estar siempre a mi lado. Gracias a mis padres por ser un ejemplo de esfuerzo y de trabajo y por apoyarme en todas los proyectos que he ido emprendiendo en la vida. Gracias a mis abuelos por su cariño infinito, porque todo lo que somos os lo debemos a vosotros. Gracias a mi madre por ser un ejemplo, por lo orgullosa que me hacía sentir cuando era pequeña que fueras médico y lo que eso influyó en mis ganas de estudiar una carrera y de trabajar como tú y porque, sin ti, mamá, no sería quien soy. Gracias a mi padre por llevarme hacia el mundo de la medicina, por ser un ejemplo de superación profesional, por insistir tanto y por la certeza de que te habrías sentido muy orgulloso de mí en este momento y hubieras disfrutado un montón con esto. Papá, si siguieras aquí, esto seguramente no habría sido tan largo, te echo muchísimo de menos y me hubiese encantado que estuvieras conmigo. Gracias a mis hermanas por ser una parte tan importante en mi vida, porque los malos momentos son menos malos al dividirse entre tres y los buenos son mejores al multiplicarlos. Por la tranquilidad que me da saber que podría pediros cualquier cosa, porque todo es mejor al contar con vosotras, por lo que enriquecéis mi vida y porque yo iría al fin del mundo por vosotras. Por haber aprendido juntas a reírnos de todo y porque juntas podemos con todo. Gracias a mi hermana Susana por ser una de las mejores personas que conozco, porque te he tenido siempre a mi lado, porque durante mucho tiempo estábamos siempre juntas y he tenido la suerte de compartir un montón de cosas contigo, por enriquecer, junto con Jose, nuestra vida con Julia y Alberto. Gracias a mi hermana Virginia por todo el tiempo que me has dedicado,por cederme tu cerebro privilegiado durante tantas horas, por estar siempre dispuesta a dejarlo todo para ayudarme, porque sin ti parecía imposible y contigo lo he conseguido. Porque a tu lado es más divertido reír y duele menos llorar. Gracias a Uxío, por tu apoyo y tu insistencia, por confiar siempre en mí, por recoger el testigo de mi padre y no dejarme flaquear. Por obligarme a relativizar, porque nada es tan grave y todo es mejor al estar tú. Por el lujo de vivir la vida contigo, por todo lo que significas en mi vida, por todo lo que me haces reír yporque me haces ser mejor persona y por tantas y tantas cosas... Gracias a todos vosotros y a muchos más porque mire donde mire siempre hay gente dispuesta a rescatarme. RESUMEN La esterilidad es un problema que afecta, aproximadamente, al 9-15% de las parejas, pudiendo ser responsable el factor masculino del 50% de los casos. El factor masculino se evalúa fundamentalmente mediante el estudio de las características seminales. El análisis de la integridad del ADN espermático se ha incorporado, en los últimos años, al diagnóstico de la infertilidad masculina. En esta tesis, se han estudiado 41 parejas con objeto de determinar la relación entre los parámetros seminales convencionales y la integridad del ADN espermático, así como la influencia que en estos tienen la edad y el consumo de tabaco. Se ha evaluado cómo afecta la técnica de recuperación espermática de swim-up a los niveles de fragmentación basal de las muestras. Se ha analizado el efecto que tienen tanto los parámetros seminales, como la fragmentación basal del ADN espermático y la fragmentación post swim-up (ambas medidas mediante el test SCD), en los resultados del ciclo ICSI. La evaluación de los parámetros clásicos del seminograma que definen la calidad seminal, como son el volumen del eyaculado, la concentraciónespermático, motilidad progresiva y morfología espermática, y el REM, se han mostrado como factores que no permiten predecir el grado de integridad del ADN espermático. Esto indicaría que los parámetros seminales y la fragmentación del ADN espermático son variables independientes, mientras que la edad del varón ejerce una influencia, incrementando el daño del ADN espermático. La técnica swim-up de procesamiento de muestras seminales disminuyósignificativamente los porcentajes de fragmentación del ADN espermático y esta disminución de los niveles de fragmentación es proporcionalmente mayor cuanto mayor sea el porcentaje de fragmentación basal del paciente. Esto indicaría que la técnica de procesamiento mejora la calidad de la muestra en cuando al porcentaje de fragmentación del ADN, aun cuando dicha técnica se estableció en su origen para seleccionar una muestra enriquecida en espermatozoides con mejor movilidad y mejor morfología. Finalmente se ha valorado el resultado de los ciclos de ICSI mediante los parámetros tasa de fecundación, calidad embrionaria, tasa de implantación y gestación, y su relación con las variables masculinas analizadas (factor masculino). Se encontró que la tasa de fecundación guardó relación inversa con la edad y relación directa con la morfología espermática. La tasa de gestación y la normozoospermia se comportaron como variables positivamente dependientes. Sin embargo, el resultado de los ciclos de ICSI no se correlacionó con la fragmentación del ADN de la muestra seminal, con lo que el nivel de integridad del ADN espermático se mostró como un factor independiente del éxito del tratamiento de reproducción asistida mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides. ÍNDICE Índice INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 3 1. Esterilidad e infertilidad ............................................................................................... 3 2. El factor masculino....................................................................................................... 4 3. Espermatogénesis y espermiogénesis ......................................................................... 5 4. El espermatozoide humano ......................................................................................... 7 5. El ADN espermático ..................................................................................................... 9 5.1. El ADN nuclear y la cromatina del espermatozoide .......................................... 9 5.2. El ADN mitocondrial ......................................................................................... 15 6. Análisis y alteraciones del semen .............................................................................. 15 7. Fragmentación del ADN espermático ........................................................................ 17 7.1. Mecanismos de inducción de la fragmentación del ADN espermático ........... 18 7.2. Técnicas de detección y cuantificación de la f. del adn espermático .............. 24 7.3. Significado clínico de la fragmentación del ADN espermático ........................ 34 8. Técnicas de reproducción asistida ............................................................................. 36 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 37 MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................. 41 1. Población de estudio ................................................................................................. 43 2. Seminograma .............................................................................................................. 43 3. Preparación de las muestras (swim-up) ..................................................................... 53 4. Test SCD (sperm chromatin dispersión) ..................................................................... 55 5. Tinción ........................................................................................................................ 56 6. Evaluación de la fragmentación................................................................................. 56 7. Recuperación y preparación de los ovocitos .............................................................. 58 8. Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) ......................................... 60 9. Evaluación de los embriones ..................................................................................... 62 10. Transferencia embrionaria ....................................................................................... 65 11. Criopreservación embrionaria .................................................................................. 66 12. Análisis estadístico.................................................................................................... 70 RESULTADOS .................................................................................................................. 71 1. Análisis descriptivo .................................................................................................... 73 1.1. Análisis descriptivo de los varones .................................................................. 73 1.2. Análisis descriptivo de las mujeres y del ciclo ICSI .......................................... 75 1.3. Analisis descriptivo de resultados del ciclo ICSI .............................................. 76 2. Análisis de los parámetros del seminograma y características de los varones ......... 80 2.1. Normozoospermia ........................................................................................... 80 2.2. Alteraciones en los parámetros del seminograma .......................................... 81 2.3. Recuento de espermatozoides móviles (REM) ................................................ 83 2.4. Correlaciones entre los parámetros seminales. .............................................. 84 3. Fragmentación del adn espermático y parámetros masculinos ............................... 86 3.1. Análisis de la fragmentación basal................................................................... 86 3.1.1. Fragmentación basal y calidad seminal ........................................................... 89 3.1.2. Fragmentación basal y REM ............................................................................ 91 3.1.3. Fragmentación basal y correlación con los parámetros seminales ................. 92 3.2. Análisis de la fragmentación post swim-up ..................................................... 93 3.2.1. Fragmentación post swim-up y calidad seminal............................................. 96 3.2.2. Fragmentación post swim-up y rem ............................................................... 97 3.2.3. Fragmentación post swim-up y fragmentación basal ..................................... 98 3.2.4. F. post swim-up y correlación con la f. basal y los parámetros seminales ..... 99 3.3. Variación de la fragmentación tras el procesamiento mediante swim-up ... 100 3.3.1. Variación de la fragmentación y calidad seminal ......................................... 103 3.3.2. Variación de la fragmentación y rem ............................................................ 105 3.3.3. Variación de la fragmentación y fragmentación basal .................................. 106 3.3.4. Variación de la fragmentacion y correlaciones ............................................. 106 4. Resultado de los tratamientos de reproducción asistida (TRA) mediante ICSI ....... 108 4.1. Resultados de los TRA mediante ICSIy parámetros seminales ..................... 112 4.2. Resultados de los TRA mediante ICSI y fragmentación del adn espermático 118 4.2.1. Fragmentación basal y resultados de ICSI ..................................................... 118 4.2.2. Fragmentación post swim-up y resultados de ICSI ........................................ 122 4.2.3. Variación de la fragmentación y resultados de ICSI ...................................... 125 4.3. Resultados de tra mediante ISCI en mujeres de buen y mal pronóstico ...... 127 4.3.1. Tasa de fecundación en mujeres de buen y mal pronóstico ......................... 127 4.3.2. Embriones de buena calidad en mujeres de buen y mal pronóstico ............ 127 4.3.3. Tasa de implantación en mujeres de buen y mal pronóstico ........................ 128 4.3.4. Gestación en mujeres de buen y mal pronóstico .......................................... 128 DISCUSIÓN .................................................................................................................... 131 1. Parámetros seminales y características de los varones .......................................... 133 1.1. Parámetros seminales y edad ........................................................................ 134 1.2. Parámetros seminales y tabaquismo ............................................................. 136 2. Fragmentación basal del ADN espermático ............................................................ 139 2.1. Fragmentación basal y parámetros seminales .............................................. 140 2.2. Fragmentación basal y edad .......................................................................... 142 2.3. Fragmentación basal y tabaquismo ............................................................... 144 3. Fragmentación del ADN espermático tras el procesamiento mediante swim-up .. 146 3.1. Fragmentación post swim-up y fragmentación basal ................................... 148 3.2. Variación de la fragmentación, edad y tabaco .............................................. 151 3.3. Variación de la fragmentación y características seminales ........................... 152 4. Factor masculino en los resultados de los ciclos de ICSI ......................................... 153 4.1. Resultados del ciclo ICSI y edad del varón ..................................................... 153 4.2. Resultados del ciclo ICSI y características seminales ..................................... 154 4.3. Resultados del ciclo ICSI y fragmentación del adn espermático ................... 155 5. Factor femenino en los resultados de ciclos de ICSI................................................ 158 CONCLUSIONES ............................................................................................................ 161 BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................... 165 ABREVIATURAS ............................................................................................................ 185 INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 1. ESTERILIDAD E INFERTILIDAD La esterilidad se define como la imposibilidad de concebir tras 1 año de relaciones sexuales regulares sin emplear ninguna medida anticonceptiva,mientras que la infertilidad se refiere a la incapacidad para completar un embarazo. Tanto la American Society of Reproductive Medicine (ASRM) como laOrganización Mundial de la Salud (OMS/WHO) la catalogan como una enfermedad del sistema reproductivo que inhibe la capacidad del cuerpo de cumplir con la función básica de la reproducción(ZegersHochschild et al, 2009). Aunque la ASRM, la Sociedad Española de Fertilidad (SEF),la Sociedad Española de Obstetricia y Ginecología (SEGO) y la OMSestán de acuerdo en establecer el límite en 12 meses (OMS, 2000), otras sociedades científicas como la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO)y la European Societyfor Human Reproduction and Embryology (ESHRE) prefieren definir el límite en 24 meses(The ESHRE Capri Workshop, 1996). Es un problema frecuente que afecta aproximadamente al 9-15% de las parejas(Boivin et al., 2007; Evgeni et al., 2014).Según los últimos datos publicados se estima que la esterilidad afectaba, en el año 2010, a 48.5 millones de parejas a nivel mundial(Mascarenhas et al., 2012).En los países occidentales la prevalencia de la esterilidad es del 10 al 20%, y en España se estima que alrededor de un 14-15% de las parejas en edad reproductiva tienen problemas de esterilidad. El 85% de las parejas que intentan una gestación la consiguen en el periodo de un año, el 92% después de dos años y el 93% tras tres años de relaciones (De la Fuente, 2011).Estos porcentajes de prevalencia de la esterilidad según los expertos se irán incrementando, debido fundamentalmente al retraso en la edad en las que las mujeres comienzan a intentar tener descendencia, pero también a una disminución en la facilidad para concebir y a un deterioro en la calidad del semen en los últimos años señaladopor algunos autores(Andersen et al., 2008). La edad media de maternidad (EMM) se ha ido incrementando hasta situarse en 31,12 años. Todo esto tiene como consecuencia que el número de pacientes que acuden a los centros de reproducción asistida se haya ido incrementando y que se produzca un avance y una mejora continuos en las distintas técnicas de reproducción asistida. Probablemente en el 2020entre un 18 y un 25%de las 3 INTRODUCCIÓN parejas en edad fértil tendrá problemas de infertilidad y se generarán del orden de 18.500 nuevos casos al año(Matorras R., 2011). Como consecuencia se producirá un incremento en la demanda de este tipo de tratamientos y un aumento del número de centros especializados. En Españala natalidad se redujo a más de la mitad entre 1960 y 2011, pasando de 21,7 a 10,6 nacimientos por mil habitantes y se ha establecido en 9,14 en el 2014(INE, 2015), lo que sitúa al país por debajo de la media de la Unión Europea. El índice de fecundidad (número medio de hijos por mujer), en nuestro país ha descendido paulatinamente hasta llegar a 1,32 hijos por mujer en el 2014 (INE, 2015).Esto está contribuyendo al envejecimiento de la población ya que se establece el número necesario para mantener el tamaño de la población en 2,1 hijos por mujer (nivel de reemplazo generacional) y que esto dará lugar aproblemas socioeconómicos(INE, 2006). Muchos estudios han demostrado que los problemas de esterilidad afectan tanto a hombres como a mujeres,y queel factor masculino tiene gran importancia y parece ser el responsable, al menos en parte, del 50% de los casos aproximadamente (CortésGutiérrez el al., 2007). De este 50%, el 20% es debido exclusivamente a problemas masculinos y el otro 30% se debe a una combinación de factores masculinos y femeninos(Poongothai et al., 2009). 2. EL FACTOR MASCULINO Con este término se engloba el conjunto de causas atribuibles al varón que inciden de forma completa o parcial sobre la esterilidad de la pareja. En la práctica puede considerarse sinónimo de infertilidad masculina. A pesar de agrupar normalmente un variado conjunto de alteraciones seminales también puede aparecer cuando el seminograma es normal (Practice committee of ASRM, 2015). Aunque la infertilidad se considera un problema de pareja, en los últimos años el llamado factor masculino ha ido incrementando su importancia, un cambio que ha sido acompañado por una mayor concienciación por parte del varón. Efectivamente, la responsabilidad del varón en el descenso de la natalidad parece cada vez más evidente debido a un deterioro en la salud reproductiva masculina, tanto por el descenso de 4 INTRODUCCIÓN lacalidad del semen (Irvine et al., 1996) como por enfermedades asociadas al aparato reproductor. La infertilidad masculina es un síndrome multifactorial que abarca una amplia variedad de trastornos. Aunque en más de la mitad de los varones infértiles se desconoce el origen de esa infertilidad (idiopática) ya sea congénita o adquirida (Poongothai et al., 2009), existen muchas causas posibles de que afectan a la producción espermática, al transporte o a la función espermática. Entre las causas más comunes encontramos: varicocele, anomalías que afectan al aparato reproductor (criptorquidia,obstrucciones, traumatismos, etc.), eyaculación retrógrada, enfermedades infecciosas o infecciones del tracto reproductor que pueden ser o no de transmisión sexual (epididemitis, orquitis, prostatitis, vesiculitis), disfunciones sexuales, efectos adversos de determinados medicamentos, factores ambientales y estilo de vida (exposición a contaminantes, tabaco, alcohol, drogas, etc.), enfermedades o alteraciones genéticas que se asocian, directa o indirectamente, con anomalías en el semen, disfunciones hormonales y alteraciones en el semen. Cuando una pareja acude a una consulta de esterilidad hay que realizar un estudio de los dos miembros de la pareja. El estudio básico del varón debe incluir una completa historia médica, una exploración física y al menos dos seminogramas realizados con un intervalo de 2 a 4 semanas (Bassas Arnau, 2011). 3. ESPERMATOGÉNESIS Y ESPERMIOGÉNESIS La espermatogénesis o gametogénesis masculina es el proceso mediante el cual se desarrollan los gametos masculinos o espermatozoides,y tiene lugar en la gónada masculina llamada testículo.La espermatogénesis empieza en la pubertad y desde entonces tiene lugar de manera continua hasta la vejez.Este proceso tiene lugar en los túbulos seminíferos, situados en el interior delos testículos, donde también se encuentran las células de Sertoli que dan sostén, nutren y protegen a las células germinales formando la barrera hematotesticular. La espermatogénesis consta de tres etapas: etapa de proliferación, etapa meiótica o fase de reducción y etapa de diferenciación o espermiogénesis (Fig. 1). 5 INTRODUCCIÓN En la etapa de proliferación, como su propio nombre indica, las células germinales primordiales ogonocitos, proliferan y se multiplican mediante divisiones mitóticas y dan lugar a las espermatogonias.Algunas espermatogonias, las espermatogonias tipo A, se dividen mitoticamente de forma continuada para producir más espermatogonias, mientras que las de tipo B dan lugar a los espermatocitos primarios (espermatocitos I o espermatocitos de primer orden), que son células de mayor tamaño que entrarán en meiosis. Durante toda esta etapa se mantiene la dotación cromosómica diploide de todas las células que se van generando, ya que únicamente se dividen mediante divisiones mitóticas. Como resultado final de esta fase nos encontramos con unas células diploides llamadas espermatocitos primarios. La fase meiótica se caracteriza por la reducción en el número de cromosomas. Se parte de espermatocitos primarios, que son células diploides (2n), y el producto final son espermátidas, que tienen una dotación cromosómica haploide (n). Como cualquier división meiótica hay que diferenciar dos periodos, la primera y al segunda división.La primera división meiótica comienzaa partir de espermatocitos primarios,ypor cada uno de ellos que inicia este proceso se obtienecomo resultado dos espermatocitos secundarios (espermatocitos II o espermatocitos de segundo orden). Los espermatocitos secundarios son ya células haploides (n) ya que esta primera etapa de la meiosis, la meiosis I, es la etapa reductora, se separan los homólogosy disminuye el número de cromosomas a la mitad. En la segunda división meiótica a partir de cada espermatocito secundario, ya haploide, se obtienen dos espermátidas también haploides. En resumen, partir de cada espermatocito primario diploide que se incorpora a la fase meióticase obtienen cuatro espermátidas haploides como resultado final. La última etapa es la de diferenciación, también conocida como espermiogénesis. Es la fase final de la espermatogénesis y comprende la diferenciación y especialización de las espermátidas que culminancon la formación de los espermatozoides ya libres del epitelio germinal. Durante esta fase se producen un serie de cambios, como la condensación de la cromatina nuclear, la formación del acrosoma y el desarrollo del flagelo,que van a posibilitar la liberación de los espermatozoides de los túbulos seminíferos. Esta liberación de las espermátidas maduras, 6 ahora llamadas INTRODUCCIÓN espermatozoides, se denomina espermiación y está controlada por las células de Sertoli.A partir de cada espermátida haploide (n), que entra en la espermiogénesis, se originan dos espermatozoides, también haploides (n). La espermatogénesis es un proceso altamente organizado con una cinética específica que dura 74 días. Los espermatozoides, una vez liberados, son transportados a través del epidídimo durante otros 12 días más. Por lo tanto, un ciclo de espermatogénesis completo, desde espermatogonia a espermatozoide maduro tiene una duración mínima de 86 días (Holstein et al.,2003). Figura 1.- Espermatogénesis 4. EL ESPERMATOZOIDE HUMANO El espermatozoide maduro, o gameto masculino, es una célula haploide, altamente especializada cuya función es la formación del cigoto al fusionar su núcleo con el del gameto femenino, para lo que es deseable que la copia del genoma paterno 7 INTRODUCCIÓN se cree, se transporte y llegue hasta el ovocito en perfecto estado. En el proceso de fecundación es fundamental no sólo la integridad genética materna sino también la paterna, y la transmisión de la molécula de ADN integra e intacta del espermatozoide al óvulo es crucial tanto para conseguir una fecundación con ciertas perspectivas de éxito (Cortés-Gutiérrez et al., 2007), como para que se desarrolle correctamente el embrión y el feto. Para que un espermatozoide se considere normal según las directrices de la OMS(1999), la cabeza, el cuello, la pieza media y la cola tienen que ser morfológicamente normales. La cabeza del espermatozoide normal tiene que ser lisa, de contorno regular y en general de forma ovalada, con una longitud entre 4,0 y 5,0µm y su anchura debe estar entre 2,5 y 3,5µm. El coeficiente largo/ancho debe ser de 1,5 a 1,75. La cabeza está constituida por el acrosoma y el núcleo. La región acrosómica debe estar bien definida,de color más claro, y ocupar entre el 40 y el 70% del área total de la cabeza. La pieza media(también llamada pieza intermedia) tiene que ser delgada,regular, con una anchura menor que 1µm y de longitud generalmente similar a la de la cabeza (y como máximo no superando la longitud de una cabeza y media) a la que se debe unir axialmente(los ejes mayores de la cabeza y de la pieza intermedia deben de estar alineados entre si).Si existecitoplama residual (también llamado gota citoplásmica), éste no debe superar el volumen de media cabeza normal. La cola o flagelodel espermatozoide debe tener un grosor uniforme a lo largo de toda su longitudy sermás estrecha que la pieza media. Su longitud tiene que ser de 45µm y debe estar desenrollada. 8 INTRODUCCIÓN Figura 2.-Espermatozoide humano 5. EL ADN ESPERMÁTICO El espermatozoide humano contiene en su interior dos tipos de ADN con una organización muy diferente, el ADN nuclear(ADNn) y ADN mitocondrial (ADNmt). Mientras que ADN mitocondrialespermático no ha sido muy estudiado, el ADN nuclear ha sido objeto de numerosas investigaciones, en parte para relacionarlo con los resultados de las técnicas de reproducción asistida (TRA) (Morris et al., 2002; Miller et al., 2010; Wright et al., 2014). 5.1. EL ADN NUCLEAR YLA CROMATINA DEL ESPERMATOZOIDE La estructura de la cromatina contenida en el núcleo del espermatozoide tienecaracterísticas diferenciales con respecto a las células somáticas(Fuentes-Mascorro et al. 2000; Boissonneault, 2002) tanto en su composición como en su enorme compactación, hasta 6 veces superior a la que encontramos enloscromosomas mitóticos (Cortés-Gutiérrez et al., 2007), su escaso volumen (40 veces menos que una célula somática) y su gran estabilidad (Gil Villa et al., 2007).Mientras que el ADN de las células somáticas está asociado a un tipo de proteínas llamadas histonas el del espermatozoide lo hace a otro tipo de proteínasdenominadas protaminas.Las protaminas son las responsables de este grado de compactación ya que generan bucles de menor tamaño que los que generan las histonas en las células somáticas. Durante la espermiogénesiscasi todas las histonas son reemplazadas por unas proteínas llamadas 9 INTRODUCCIÓN de transición y éstas serán posteriormente sustituidas a su vez por protaminas. Aunque el proceso de permuta de las histonas por protaminas ha sido estudiado por muchos investigadores no se sabe exactamente como se desarrolla. Se han diseñado numerosos modelos para tratar de explicar el gran empaquetamiento que sufre el ADN para que se pueda introducir en el núcleo del espermatozoide. Para sustituir a las histonas es necesario eliminar los nucleosomas que forman la cromatina y,aunque no se conoce el mecanismo molecular exacto por el que se produce,si parece que tienen lugar una serie de procesos comoacetilación, metilación, fosforilación o ubiquitinización.Al ir eliminando los nucleosomas es necesario deshacer la tensión provocada por el superenrrollamiento de la molécula de ADN. Una vez que los nucleosomas se han eliminado, las histonas se sustituyen por proteínas de transición (Meistrich et al.,2003). Las proteínas de transición son un grupo heterogéneo de proteínas básicas, de las quese han identificado cuatro aunque las más conocidas son TP1 y TP2. LaTP1 es una proteína rica en lisina, serina y arginina (Brewer et al., 2002).La TP2 es una proteína de mayor tamaño que la TP1. Aunque su función exacta no se conoce parece que in vitroactúan en la reparación de roturas (Caron et al., 2001; Boissonneault, 2002), en la descondensación del ADN en los nucleosomas (TP1) (Singh and Rao, 1988), en la posterior condensación del ADN (TP2) y en su estabilización(Kundu and Rao, 1995).Hay autores que defienden que la ausencia de una de estas dos proteínas queda compensada por una mayor presencia de la otra aunque no hay certeza de ello (Adham et al., 2001). El siguiente paso es la sustitución de las proteínas de transición por las protaminas. Las protaminas son nucleoproteínas básicas insolubles de bajo peso molecular cargadas positivamente que sustituyen, casi totalmente, a las histonas a las que está asociado normalmente el ADN y que, además, estabilizan la estructura mediante los puentes disulfuro que forman entre ellas.Son responsables del empaquetamiento del ADN en el núcleo del espermatozoide maduro.La compactación del ADN espermático en el interior del núcleo es una cuestión muy relevante a la hora de analizar la fragmentación del ADN. En mamíferos se han identificadodos tipos de protaminas, P1 y P2, productos de los genes PRM1 y PRM2, respectivamente.P1 se 10 INTRODUCCIÓN expresa en todos los mamíferos y es una proteína rica en arginina y cisteina. P2, de mayor tamaño que P1, sólo se expresa en algunos mamíferos, entre ellos en humanos(Balhornet al., 1977; Balhorn, 2007; Oliva, 2006) y es rica en histidina.Elespermatozoide maduro es el único tipo celular en el que están presentes las protaminas. Se ha demostrado la elevada protección que estas proteínas aportan a la cromatina del espermatozoide cuando se unen a ella (Kuretake et al.,1996).Parece que proporcionan protección mecánica al ADN al unirse ael y formar los complejos ADNprotaminas. Para formar estos complejos las protaminasse unen a lo largo del surco menor de la molécula de ADN y con su carga positiva neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato de manera que pueden unirse unos complejos a otros (Balhorn, 1982). En el ADN del espermatozoide, para eliminar los nucleosomas y intercambiar las histonas por protaminas,se necesita hacer frente al fenómeno de superenrollamiento, que produce tensiones por excesiva torsión que van a dificultar la compactación. Eliminando los superenrollamientos las protaminas pueden acceder al ADN y sustituir a las histonas(McPherson and Longo, 1993), previamente reemplazadas por las proteínas de transición. Para eliminar los superenrollamientos hay autores que han descrito la existencia de roturas en la molécula de ADNque aparecen en etapas intermedias de la espermiogénesis y que posteriormente deben ser repararadas porque se ha comprobado que no se mantienen durante todo el proceso (McPherson and Longo, 1993; Sakkas et al.,1995; Marcon and Boissonneault, 2004). Las roturas pueden ser tanto de cadena sencilla como de cadena dobleyla enzima que parece originar las roturas y posteriormente repararlases la topoisomerasa II (Laberge and Boissonneault, 2005). Se han propuesto varios modelos complejos para intentar explicar la regulación de estas roturas (Meyer-Ficca et al.,2011). Una vez sustituidas las histonas por protaminas, estas empaquetan y compactan el ADN en unas estructuras denominadas toroides, cada uno de los cuales contiene aproximadamente 50 kb de ADN (Hud et al.,1993).Según la cantidad de protaminas presenteshabrá mayor o menor grado de compactación. Se desconoce el modo exacto en el que se constituyen y se organizan los toroides de protaminas para formar la 11 INTRODUCCIÓN estructura final de la cromatina del espermatozoide. Sí se sabe que se establecen una serie de bucles llamados dominios que se unena la matriz nuclear cada 20-120 kb (Ward, 2010). Cada bucle o dominio contiene ADN funcional, corresponde a un toroide y se unen entre ellos por una secuencia de ADN (toroid linker),asociada a histonas,que es mássensible a la acción enzimática de determinadas endonucleasas como la DNAsa I(Sotolongo et al., 2003). Estas secuencias son también los sitios por los que los toroides de protaminas, además de unirse entre ellos, se anclan a la matriz nuclear, y reciben el nombre de matrix attachment regions (MARs) (Fig.3). La matriz nuclear espermática está formada por una estructura proteica que no se conoce completamenteaunque hay evidencia de la existencia entre otros componentes de topoisomerasa IIB, actina, miosina, citoqueratinas, espectrinay posiblemente algunos enzimas como la transcriptasa inversa entre otros.Cada vez se incide más sobre suimportancia en la organización estructural del ADN y en su relación con la función nuclear.Juega un papel crucial en la regulación de la fragmentación y la degradación del ADN espermático antesde la fecundación (Sharman et al., 2007). También parece que debe actuar para mantener de la integridad del ADN espermático tras la fecundación (Ward, 2010).Es necesaria para la replicación del ADNdel pronúcleo masculinoque se forma en el ovocito una vez fertilizado y para que los embriones que se originen sean viables (Sharman et al., 2007). 12 INTRODUCCIÓN Figura 3.- Tres principales elementos estructurales de la cromatina espermática. A: Durante la espermiogénesis, las histonas se sustituyen por protaminas y condensan el ADN en toroides altamente empaquetados. Cada toroide de protamina es un dominio de bucle. B: Los toroides de protamina se pueden organizar apilándose unos al lado de otros. Algunas secuencias grandes de ADN conservan histonas (solenoide verde) que pueden ser dominios de bucle enteros que no se condensan por protaminas. C: Las cadenas de ADN que unen los toroides de protamina son sensibles a lasnucleasas y pueden estar unidos a histonas; son las regiones de unión a la matriz (MARs) (Ward, 2010). Aunque la gran mayoría, el 85%, del ADN espermático está unido a protaminas formando toroides, como ya hemos visto hay algunas histonas que no son reemplazadas por protaminas y se conservan en el espermatozoide maduro. Estas secuencias de ADN asociadas a histonas no se distribuyen al azar y parecen tener funciones específicas, pudiendo corresponder a telómeros o a genes funcionales de la espermiogénesis o de la fecundación, o de alguna función en el embrión(Arpanahi et al.,2009; Hammoud et al.,2009). Se desconoce si estas histonas que permanecen asociadas al ADN espermático se mantienen en el zigoto tras la fecundación aunque hay modelos como el de Ward del 13 INTRODUCCIÓN 2010 que sugieren que algunas estructuras de ADN espermático unido a histonas y asociado a la matriz nuclear se mantienen en el momento de la reestructuración de la cromatina durante la formación del pronúcleo masculino y es necesaria para que se produzca la replicación del ADN del pronúcleo masculino (Ward et al., 1999) y para proteger el ADN del espermatozoide una vez que ha fecundado al ovocito (Ward, 2010) (Fig. 4). Figura 4.- Herencia de los elementos estructurales de la cromatina espermática.Arriba:En espermátidas redondas las histonas empaquetan el ADN. En medio:Durante la espermiogénesis, la mayoría de histonas se sustituyen por protaminas (rojo). Abajo: Después de la fertilización, se eliminan las protaminas y son reemplazas por histonas suministradas por el ovocito (verde claro). Sin embargo, algunas histonas que se mantienen en el espermatozoide (verde oscuro) probablemente también se mantenganen el pronúcleo paterno, al igual que las regiones de anclaje a la matriz nuclear (MARs) (Ward, 2010). 14 INTRODUCCIÓN Las protaminas que están asociadas al ADN espermático se eliminan y son sustituidas completamente por histonas del ovocito poco tiempo después, entre 2 y 4 horas, de producirse la fecundación(Perreault and Zirkin, 1982). 5.2. EL ADN MITOCONDRIAL El ADN mitocondrial presente en el espermatozoide está localizado en la pieza media dentro de las mitocondrias. Es una molécula circular de doble cadena que contiene 16.5 kb. En ella encontramos 37 genes que codifican 2 ARNr, 22 ARNt y 13 polipéptidos que forman distintas subunidades de enzimas que intervienen en la fosforilación oxidativa. Este ADN está involucrado en que las mitocondrias provean al espermatozoide del ATP necesario para la propulsión flagelar. No está asociado ni a histonas ni a protaminas, es muy susceptible al daño por ROS, aunque también puede producirlo durante el proceso de formación de ATP. Los daños que se pueden ocasionar en el ADN mitocondrial por el efecto de ROS se pueden traducir en un cambio en el potencial de membrana de las mitocondrias que afectará a la motilidad y al desplazamiento del espermatozoide (Henkel, 2011).Este ADN mitocondrial es destruido, tras la fecundación, en las primeras etapas del desarrollo embrionario por lo que no afectará mucho al embrión (Aitken and Krausz, 2001). 6. ANÁLISIS Y ALTERACIONES DEL SEMEN Para evaluar y diagnosticar el factor masculino en parejas que acuden a la consulta de esterilidad se recurre rutinariamente al análisis del semen mediante elseminograma que actualmente sigue siendo la prueba más importante que se realiza en los laboratorios de andrología para estudiar la infertilidadmasculina. El seminograma o espermiograma es un examen del esperma que consiste en el analizar una muestra de semen que corresponda a un eyaculado completo. En este procedimiento se examinan una serie de parámetros que corresponden no sólo a los espermatozoides contenidos en esa muestra si no a todo el conjunto de la misma. En un seminograma básico se estudian tanto aspectos macroscópicos como microscópicos de la muestra. Dentro de las características macroscópicas se evalúan los siguientes parámetros: volumen, 15 INTRODUCCIÓN viscosidad, liquefacción, color y pH de la muestra. El examen microscópico consiste en analizar los siguientes aspectos: concentración, motilidad y morfología de los espermatozoides.Todas estas determinaciones, una vez evaluadas, se comparan con los estándares de normalidad que publica y actualiza periódicamentela OMS, lo que nos permitirá tomar una serie de decisiones sobre la trayectoria a seguir y las opciones más adecuadas que podremos ofertar al paciente. Aunque el seminograma hoy por hoy sigue siendo la prueba por excelencia que se realiza en el laboratorio de andrología para analizar la calidad espermática, no permite determinar a ciencia cierta si un individuo es fértil o no lo es.Parámetros básicos como concentración, motilidad y morfologíano son capaces de diagnosticar la esterilidad masculina (Guzick et al., 2001). Los estándares de referencia que publica la OMS no son valores de referencia de esterilidad o de fertilidad; hay varones con valores inferiores al umbral mínimo establecido por la OMS cuya fertilidad está demostrada y, viceversa, hay muchos varones cuyos valores están dentro de los límites marcados y no logran conseguir un embarazo.Se calcula que alrededor de un 15% de los varones con parámetros seminales dentro de los límites de la normalidad son estériles(Guzick et al., 1998;Cortés-Gutiérrezel al.,2007). Sin embargo, los hombres fértiles tienen, por lo general, valores medios de los parámetros seminales (concentración, movilidad y morfología) más elevadosy normalesque losde los hombres infértiles(Zini et al., 2001a). Como hemos dicho anteriormente, utilizando únicamente los resultados del seminograma para valorar la capacidad reproductiva de un individuo se escapan alteraciones quepadecen los espermatozoidesy que afectan a la fertilidad masculina. Como el seminograma carece de capacidad absoluta para diagnosticar la esterilidad, actualmente no se cuenta con una prueba definitiva que se pueda utilizar en los laboratorios de andrología para determinar si un varón es fértil o infértil.Ante la necesidad de disponer de pruebas diagnósticas precisas capaces de diagnosticar la infertilidad masculina, y predecir el potencial fértil de un varón, continuamente se están estudiando nuevos marcadores que ayuden a proporcionar información adicional sobre la capacidad fecundante de los pacientes y a predecir, según las características del semen, los resultados de las TRA. Entre las técnicas que han suscitado,en las últimas 16 INTRODUCCIÓN décadas, mayor interés para estudiar la calidad espermática entre los profesionales de la reproducción asistida está, sin lugar a dudas, la integridad del ADN y de la cromatina espermática. 7. FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO Se conoce como fragmentación del ADN espermático al fenómeno que tiene lugar cuando se producen roturas tanto de cadena sencilla como de doble cadena en la molécula de ADN del espermatozoide. Como consecuencia de las roturas en el material genético del espermatozoide se produce una fragmentación en el ADN del mismo.Existen multitud de estudios que intentan establecer como el daño producido en el ADN podría influir en la infertilidad masculina y en que medida afectaríaa las posibilidades de embarazo y a los resultados de los tratamientos de reproducción asistida en general. Hay numerosos estudios que comparan la fragmentación del ADN espermático con los principales parámetros analizados en el seminograma. Algunos de estos estudios aseguran que existe una relación negativa directa entre la fragmentación cromosómica y parámetros seminales tales como la concentración, la motilidad o la morfología(Irvine et al., 2000; Zini et al., 2002; Smit et al.,2007; Evgeni et al.,2014).Otros autores no encuentranrelaciónentre la mala calidad seminal y el daño del ADN espermático (Evenson et al.,1999;Salehet al., 2002a; Benchaib et al., 2007).La existencia de alteraciones en el ADN, como los fallos en la condensación de la cromatina, las anomalías en la integridad, la fragmentación del ADN en una o en las dos cadenas, o las anomalías cromosómicas (aneuploidías o reordenaciones estructurales) afectan a la fertilidady hay evidencias del impacto negativo que tiene la fragmentación del ADN de los espermatozoides sobre la fertilidad (Zini et al., 2001b; Zini et al., 2002) y sobrelos resultados de los tratamientos de reproducción asistida, tanto en las tasas de fertilización como en las de embarazo(Bellver et al., 2010; Simon et al., 2011). Incluso la fragmentación puede relacionarse también con enfermedades que afectan a la descendencia (Aitken and Krausz, 2001;Silber and Repping, 2002; Cortés-Gutiérrez et al., 2007).Aunque realmente el fenómeno de fragmentación es algo común y se observa en 17 INTRODUCCIÓN el ADN espermático de los varones en general, lo que hacediferentes a unos individuos de otros es que se produce en distinta proporción. Al ir aumentando el número de lesiones en el ADN van disminuyendo las posibilidades de éxito de las técnicas de reproducción asistida. Así se ha descrito que índices de fragmentación superiores al 30% dan lugar a anomalías en el desarrollo embrionario y a fallos de implantación, y que los hombres infértiles tienen un porcentaje mayor de espermatozoides con el ADN fragmentado que los varones fértiles. (Irvine et al. 2000, Saleh et al.,2002a,Zini et al., 2006). En parejas con tasas de fragmentaciones altas (30-40%) se observa un potencial muy bajo de fertilidad natural (Evenson et al., 1999; Spano et al., 2000; Zini et al., 2002; Zini et al., 2006).El ovocito tiene capacidad, en sí mismo, para reparar el daño que presenta el ADN del espermatozoide tras la fecundación y en algunos casos es capaz de hacerlo. La competencia del ovocito a la hora de reparar una determinada lesión va a depender del tipo de rotura, del porcentaje de fragmentación y de la propia calidad del ovocito. El problema viene enlos casos en los que el ovocito no es capaz de reparar las lesiones en el material genético del espermatozoide, en cuyo caso esas alteraciones pasarán al embrión con los consiguientes efectos que esto suponga para el desarrollo del embrión y, en el caso de que se produzca un embarazo y este llegue a término,en el feto (Sakkas and Álvarez,2010). En la actualidad hay numerosos estudios que analizan y comparan las distintas técnicas de las que se dispone para el análisis de la fragmentación del ADN espermático. Muchos son los centros que, analizando las ventajas y desventajas de cada una de ellas, intentan dilucidar cuál de ellas es la que más se adapta a sus condiciones y cuál de ellas es la más apropiada para su medio de trabajo. 7.1. MECANISMOS DE INDUCCIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO El origen de la fragmentación del ADN espermático es de naturaleza multifactorial aunque se desconoce el mecanismo exacto que la produce. Hay autores que han propuesto hasta seis mecanismos distintos que pueden inducir la fragmentación del ADN, tanto nuclear como mitocondrial, del espermatozoide (Sakkas and Álvarez, 2010) (Fig. 5). 18 INTRODUCCIÓN La primera causa es la apoptosis producida durante la espermatogénesis. La apoptosis es un proceso de muerte celular programada que permite eliminar células que no son necesarias, senescentes o aberrantes (Kerr et al., 1972). Es un mecanismo genético que provoca una serie de alteraciones morfológicas y bioquímicas en la célula, que la conducen al suicidio (Nagata, 1997; Sinha Hikim et al., 1999). Durante el proceso de maduración espermática las células de Sertoli inducen la apoptosis que elimina aproximadamente el 50 o 75% de las células germinales. Este mecanismo es necesario en la espermatogénesis normal para poder mantener el equilibrio necesario entre células de Sertoli y células germinales y que éstas últimas no proliferen excesivamente, controlando así la calidad de la espermatogénesis (Russell and Peterson, 1984; Braun, 1998; Aitken and Baker, 2013). Las células germinales sobrantes y/o defectuosas entran en apoptosis y van a ser destruidas por la vía extrínseca (Fas/FasL), expresando elreceptor Fas (CD95)que es reconocido y al que se unen las células de Sertoli y así las fagocitan (Billig et al., 1996; Pentikäinen et al., 1999).Cuando este mecanismo por algún motivo falla se generan espermatozoides con el ADN defectuoso (aunque pueden ser morfológicamente normales) que, aunque no deberían conseguirlo, pasan al eyaculado, fenómeno denominado apoptosis abortiva (Sakkas et al., 1999; González-Marín et al., 2012). 19 INTRODUCCIÓN Figura 5.- Principales mecanismos de inducción del daño Del ADN en espermatozoides. Durante la producción o el transporte: (i) apoptosis durante la espermiogénesis; (ii) roturas durante la remodelación de la cromatina espermática durante la espermiogénesis; (iii) fragmentación post-testicular inducida principalmente por los radicales de oxígeno, durante el transporte de los espermatozoides a través de los túbulos seminíferos y del epidídimo (incremento del daño señalizado según el tamaño los rayos rojos y la intensidad del oscurecimiento en el recorrido); (iv) fragmentación inducida por caspasas y endonucleasas endógenas; (v) daño inducido por radioterapia y quimioterapia; y (vi) daños inducidos por sustancias tóxicas ambientales. (Sakkas and Álvarez, 2010) En segundo lugar, como otra posible causa del daño en el ADN espermático, tenemos las roturas ocasionadas mientras se produce la remodelación de la cromatina en la espermiogénesis. Durante el proceso de espermiogénesis se tiene que condensar mucho el núcleo de la espermátida para transformarse en un espermatozoide. Se pueden producir fallos en el complejo intercambio de histonas por protaminas que podrían dar lugar a daños en el ADN espermático ya que para realizar este intercambio y liberar el estrés torsional que se provocaes necesario que se produzcan roturas que luego tienen que reparase (Meyer-Ficca et al.,2005;Meyer-Ficca et al.,2011). Si falla el mecanismo que controla este proceso de cortar y ligar el ADN nos podemos encontrar con un porcentaje variable de espermatozoides que presentan roturas residuales, no 20 INTRODUCCIÓN reparadas, y alteraciones en el empaquetamiento de la cromatina, cuya existencia está asociada a varios grados de subfertilidad (Meyer-Ficca et al.,2009). La existencia de roturas en el material genético puede apuntar a una maduración incompleta de los espermatozoides durante el proceso de espermiogénesis(Nijset al., 2009; Sakkas et al., 2010). El tercer mecanismo intervendría ya a nivel post-testicular yes la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante el paso de los espermatozoides a través del epidídimo. Las ROS son agentes oxidantes (radical hidoxilo, anión superóxido, peróxido de hidrógeno etc.), altamente reactivos, generados como resultado del metabolismo del oxígeno que tienen, a pesar de que su vida media es muy corta, la capacidad de oxidar otras moléculas muy rápidamente. Niveles altos de ROS pueden provocar lesiones en el ADN,tanto nuclear como mitocondrial (Sawyer et al.,2003), debido a la gran sensibilidad que tienen los espermatozoides al estrés oxidativo y a que al liberarse del testículo ya no cuentan con la protección que supone la capacidad antioxidante que presentan las células de Sertoli. Numerosos autores defienden la utilización de espermatozoides de testículo para su uso en técnicas de reproducción asistida frenteal uso de espermatozoides procedentes de eyaculado en pacientes con valores elevados de fragmentación de ADN y fallo de FIV o ICSI. Estos autores aseguran que estos últimos pueden experimentar un daño de gran trascendencia clínica al pasar por el epidídimo que los espermatozoides testiculares no tendrían (Álvarez, 2007). Valores elevados de ROS puedendañar, además del ADN,la membrana plasmática del espermatozoide (Ollero et al., 2001; Aitken et al.,1989).El que estas ROS lleguen a ocasionar estrés oxidativo se produce por una falta de equilibrio entre el volumen de producción de especies reactivas de oxigeno y la capacidad que tiene la célula de eliminarlas utilizando los mecanismos antioxidantes de defensa que posee(Gharagozloo and Aitken, 2011). Hay estudios que demuestran que espermatozoides inmaduros que producen niveles elevados de ROS pueden inducir daño en el ADN de espermatozoides maduros cuando están en contacto con ellos, por ejemplo durante la migración de espermatozoides maduros e inmaduros juntos desde los túbulos seminíferos al epidídimo (Ollero et al., 2001). A pesar de lo cual también hay evidencias de que se necesita,al menos, una 21 INTRODUCCIÓN pequeña cantidad de ROS para que se provoquen mecanismos tan importantes en la fecundación como la capacitación, la hiperactivación y la reacción acrosómica en los espermatozoides (de Lamirande and Gagnon, 1995; Lamirande et al.,1997). Una vez que los espermatozoides ya están inmersos en el plasma seminal se benefician de las altas propiedades antioxidantes que este tiene. Hay otras células como los leucocitos o incluso los espermatozoides inmaduros,que generan cantidades de ROS elevadas (Gharagozloo and Aitken, 2011).A esto hay que unir el que en las muestras espermáticas, ya procesadasque utilizamos para las técnicas de reproducción asistida losmetabolitos procedentes de los espermatozoides que deberían pero que no han sido eliminados por apoptosis se acumulan y tienen un efecto negativo enel resto de espermatozoides (Cortés-Gutiérrezet al., 2007). Además estas manipulaciones que requieren la preparación de las muestras para utilizarlas en las Técnicas de reproducción asistida (TRA), como por ejemplo centrifugaciones,hacen que coexistan, en contacto directo, espermatozoides inmaduros, que liberan gran cantidad de ROS, con espermatozoides maduros(Aitken et al., 1994) que ven su ADN dañado significativamente como consecuencia de esta exposición in vitro a valores elevados de ROS. Además de las roturas en el ADN de cadena sencilla y de doble cadena, las ROS pueden producir también otros tipos de daño como son modificaciones o pérdidas de alguna bases, interacciones entre una o entre varias cadenas de ADN o interacciones entre ADN y proteinas (Aitken et al., 2010; Gharagozloo and Aitken, 2011) (Fig.6). Numerosos autores aseguran que el daño observado en la línea germinal masculina está fundamentalmente motivado por el daño oxidativo (Thomson et al.,2011). 22 INTRODUCCIÓN Figura 6.- Tipos de lesiones que podrían encontrarse en el ADN de espermatozoides humanos. (Aitken et al., 2010) El cuarto mecanismo implicadoes causado por las caspasas y endonucleasas endógenas, propias del espermatozoide (Sakkasand Álvarez, 2010). Las caspasas son proteasas implicadas en la apoptosis y, junto con las endonucleasas, pueden inducir la fragmentación del ADN del espermatozoide al ser activadas por ROS. Estos dos tipos de enzimas también se pueden activar por factores fisicoquímicosexternos como son la temperatura y determinados agentes ambientales tóxicos (Sakkas and Álvarez, 2010). En quinto lugar tenemos la radio y la quimioterapia como causas externas. La exposición, como consecuencia de tratamientos médicos, a agentes quimio o radioterápicos puede inducir la fragmentación del ADN espermático (Cai et al., 1997; Harrouket al., 2000). Además puede también afectar negativamente a la fertilidad masculina al reducir el número de espermatozoides por el efecto citotóxico que estos agentes tienen en el testículo (Morris, 2002). En ambos casos las consecuencias, tanto a 23 INTRODUCCIÓN corto como a largo plazo dependerán de los fármacos utilizados, de las dosis y de la duración del tratamiento. Por último se situaríaotra causa externa, la sexta, que son los tóxicos ambientales que podrían aumentar el estrés oxidativo. Están dentro de este apartado agentes como la contaminación atmosférica, exposición a pesticidas y otros agentes tóxicos, el tabaquismo, las ondas electromagnéticas de los teléfonos móviles etc.(De Iuliis et al., 2009; Taha et al., 2012; Pant et al., 2014).Su efecto en el incremento del daño en el ADN espermático dependerá del tipo de exposición y del tipo de contaminante. 7.2. TÉCNICAS DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DELA FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO Actualmente existen numerosos y diferentes métodos para analizar la integridad del ADN espermático y cuantificar elgrado de fragmentación que presenta el ADN de los espermatozoides (Fig. 7). Las metodologías que miden la fragmentación del ADN se pueden englobar en tres grupos: 1.Técnicas que marcan las roturas, tanto de cadena doble como de cadena sencilla, de la molécula de ADN.Entre ellas se encuentran: TUNEL y ISNT. 2.Técnicas que miden la susceptibilidad diferencial del ADN para ser desnaturalizado al exponerlo a distintos tratamientos.En este grupo se incluyen: SCSA,ensayo COMETA, test SCD y DBD-FISH. 3.Otras técnicas, menos utilizadas, que se basan en los efectos de distintos colorantes. A este grupo corresponden: NA, AT y CMA. 24 INTRODUCCIÓN Figura 7.-Metodologías utilizadas para evaluar alteraciones en el ADN espermático. (Cortés-Gutiérrez et al., 2007) 1. Técnicas que marcan las roturas, tanto de cadena doble como de cadena sencilla, de la molécula de ADN: -TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyUridine triphosphateNick-End Labelling) Introducida por Gorczyca en 1993 (Gorczycaet al., 1993). Esta técnica, al igual que el test SCD, también está comercializada en kit para su aplicación en espermatozoides. Radica en la incorporación denucleótidos, a partir de desoxiuridina trifosfato (dUTP)marcada con fluorocromos (biotina o digoxigenina), a los puntos de rotura de ADN (en los extremos 3´OH de las cadenas afectadas), tanto de cadena doble como de cadena sencilla mediante la acción de una enzimatransferasa terminal, la desoxinucleotidil transferasa (TdT). Los resultados se analizan o bien con un microscopio de fluorescencia (Fig. 8) o bien con un citómetro de flujo. En este caso, se cuantifica la 25 INTRODUCCIÓN cantidad de nucleótidos incorporados, de manera quecuántas más roturas mayor será la incorporación deestosnucleótidos y mayor la intensidad de la señal fluorescente.Mediante microscopía de fluorescencia se cuantifica el número de espermatozoides verdes (con ADN fragmentado e incorporación de la fluoresceína), mientras que las cabezas azules corresponden a espermatozoides con ADN íntegro contrateñidos con DAPI (4’,6-diamino-2-phenylindole). Los resultados obtenidos se comparan además respecto a un control negativo, incubando en ausencia de la TdT, y a un control positivo de muestras tratadas previamente con DNasa I (Evenson et al., 2002). Figura 8.-Técnica TUNEL. Núcleos espermáticos con ADN fragmentado (verde) y núcleos espermáticos con ADN íntegro (azul). (Jee et al., 2011) En cualquier caso,para poder utilizar esta metodología se necesitan equipos sofisticados y personal especializado. Además, presenta otros inconvenientes, entre los que destacan que es necesario fijar la cromatina para poder realizar esta técnica, y que los kits comerciales se desarrollaron para células somáticas, cuyo ADN presenta un grado de compactación mucho menor que el espermático,lo que puede dificultar el acceso de la enzima a la cromatinay puede subestimarse el daño. Hay diversos estudios 26 INTRODUCCIÓN sobre el valor predictivo de este ensayo adaptado para mejorar la sensibilidad de la técnica en las TRA, tanto en IAH (Duran et al., 2002) como en ICSI (Evenson et al., 2002). -ISNT (In SituNick Translation) Fue implantada por Bianchiy colaboradores en 1993 (Bianchi et al., 1993).Consiste en la incorporación de nucleótidos de desoxiuridina trifosfato (dUTP) marcados con un biotina o digoxigenina a las roturas de cadena sencilla,usando como molde la cadena complementaria de ADNmediante la acción exonucleasa (5’-3’) y polimerasa de la ADN polimerasa I. Identifica la cantidad de ADN dañado cuantificando la intensidad de señal producida (Gorczyca et al., 1993). Los resultados se analizan con un microscopio de fluorescencia o citometría de flujo. Esta tecnología tiene la misma base y los mismos inconvenientes que el ensayo TUNEL aunque la incorporación de nucleótidos en este caso es mayor. 2. Técnicas que miden la susceptibilidad diferencial del ADN para ser desnaturalizado al exponerlo a distintos tratamientos: -SCSA (SpermChromatin Structure Assay) El ensayo de la estructura de la cromatina espermática se introdujo en 1980 por el grupo de Evenson para analizar la cromatina espermática en mamíferos (Evenson et al, 1980). La tecnología se fundamenta en el incremento de susceptibilidad a la desnaturalizaciónin situ de la cromatina que se produce como consecuencia delas roturas en el ADN. Se deja actuar una solución ácida o una temperatura elevada sobre las cabezas de los espermatozoidespara así desnaturalizar su ADN y posteriormente se tiñe. Mide la susceptibilidad a desnaturalizarse, se desnaturalizará el ADN que presente roturas, mientras que el que está intacto no se descondensa.La tinción se realiza con naranja de acridina (NA), fluorocromo que puede intercalarse entre las dos cadenas de ADN y que tiene la cualidad de ser metacromático, capaz de teñir de un color distinto al propio colorante. Emite fluorescencia verde o roja a distinta longitud de onda y esta dependerá de si el ADN esta en forma de doble cadena o de cadena sencilla, intacto o fragmentado, respectivamente. Si este fluorocromo se incorpora a ADN de cadena sencilla lo hace formando agregados y emite color rojo-anaranjado y si lo que emite es color verde se 27 INTRODUCCIÓN ha incorporado a cadenas dobles de ADN en forma de monómero. Se analizan 5000 espermatozoides utilizando un citómetro de flujo que calcula el cociente entre fluorescencia roja y la fluorescencia total (fluorescencia verde+fluorescencia roja) (Evensonet al., 1980). Lo que mide es laratio de cadena simple y cadena doble en cada espermatozoide, la relaciónentre espermatozoides con el ADN fragmentadoeintacto, respectivamente. Un mayor grado de desnaturalización indica un ADN con estructura más frágil, es decir una proporción de cadena sencilla mayor que la proporción de cadena doble.El porcentaje de fragmentación de ADN (%DFI: ADNFragmentation Index) que proporciona esta técnica indica la proporción de espermatozoides que tiene el ADN desnaturalizado en un porcentaje medio-alto. Como resultado de esta técnica también obtenemos otro parámetro, el HDS (Hight DNA stability), que indica el porcentaje de espermatozoides inmaduros.A la hora de aplicar esta técnica a la práctica clínica y como resultado de numerosas investigaciones se estableció el punto de corte en 30 que corresponde a un porcentaje de fragmentación (30%) por encima del cual el individuo vería comprometida su fertilidad (Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000). Índices superiores al 30% están relacionados además con abortos en el primer trimestre.Actualmente las muestras se clasifican en calidad excelente, con %DFI menor o igual al 15%, buena calidad si el %DFI se encuentra entre 15 y 30% y por último calidad pobre si el índice supera al 30% (Evenson and Wixon, 2006a). -Ensayo COMETA(comet assay) oSCGE (Single Cell Gel Electrophoresis) Se introdujo por primera vez en 1984 por Ostling y Johanson (Ostling and Johanson, 1984). Se basa en el mismo principio que la electroforesis de ADN desnudo,en que las moléculas de ADN tienen distinta capacidad para moverse a través de un gel al ser sometidas a un campo eléctrico dependiendo de su tamaño. La técnica consiste, básicamente, en incluir la muestra de espermatozoides dentro de un microgel de agarosa sobre un portaobjetos. Se desnaturaliza y a continuación se somete a una solución de lisis con un agente reductor de grupos sulfidrilo, por ejemplo el ditiotreitol (DTT). La cromatina se descondensa al romperse lospuentesdisulfuro existentes en las protaminas de los espermatozoides por la acción del DTT. Después,el microgel es sometido a una electroforesis y tras eso se realiza una 28 INTRODUCCIÓN tinción sobre el mismo con un fluorocromo del tipo DAPI (4,6 diamino-2-phenylindole), IP (Ioduro de Propidio) o SYBR-Green. Al someter al ADN descondensado de un espermatozoide a la acción de un campo eléctrico se mueve desde el polo negativo al positivo. Los múltiples fragmentos de ADN de los núcleos de los espermatozoides fragmentados se van desplazando formando una imagen que recuerda a la cola de un cometa (de ahí su nombre), de mayor tamaño a medida que el grado de fragmentación es mayor. Por el contrario, los núcleos de los espermatozoides que no presenten roturas no generan colas o las que generan son muy discretas (Fig. 9). La cantidad de daño o el porcentaje de fragmentación se cuantifican midiendo la longitud y densidad de la cola del cometa (Singh et al., 1988). Los resultados se analizan con un microscopio de fluorescencia y pueden ser interpretados o bien por un observador experimentado o bien utilizando un software de análisis de imágenes específico. Esta técnica debido a su compleja metodología se utiliza fundamentalmente en investigación. Sise realiza la desnaturalización en condiciones neutras de pH se evidencian las roturas de cadena doble, pero si lo hacemos en condiciones alcalinastambién podremos visualizarroturasde cadena sencilla y la existencia de puntos lábiles alcalinos,ya quelos ambientes con pH altos ayudan a desnaturalizar el ADN. Existe una variante de esta técnica, el ensayo cometa bidimensional, que combina los dos tipos de desnaturalización; en primer lugar se utilizan condiciones neutras y posteriormente condiciones alcalinas evidenciando así tanto las roturas de cadena sencilla como de cadena doble. 29 INTRODUCCIÓN Figura 9.- Ensayo COMETA.Arriba: Núcleo espermático con ADN íntegro. Abajo: Núcleo espermático con ADN fragmentado, se observa el desplazamiento de los fragmentos de ADN al ser sometidos al campo eléctrico. (Cortés-Gutiérrez et al., 2007) - Test SCD (Sperm Chromatin Dispersion test) Fue introducido por Fernández y colaboradores en 2003 (Fernández et al., 2003).Existe una versión comercial y se conoce comoel kit Halosperm® (Fernández et al., 2005).Se basa en que al romper los puentes disulfuro que forman las protaminas, y utilizar una solución de lisis que extraiga las proteínas, los bucles de ADN se relajan y forman halos alrededor del núcleo.Los espermatozoides con ADN fragmentado ven impedida la relajación de los bucles y muestran halos muy reducidos o inexistentes, contrariamente a lo observado en espermatozoides sin fragmentación. Técnicamente,los espermatozoides se fijan con un gel de agarosa de bajo punto de fusión en un portaobjetos pretratado. Se somete a las preparaciones a una solución ácida que induce la desnaturalizacióndel ADN en losespermatozoides. Tras ese tratamiento inicial y por el efecto de una solución de lisis se desproteiniza la preparación eliminando la mayor parte de las proteínas nucleares. Las preparaciones se lavancon una solución tamponada, se deshidratan y se dejan secar al aire. Como último pasose tiñen las preparaciones conel kit Diff-Quik o concolorante deWrighten el caso de ir a utilizar microscopía de campo claro, o con fluorocromos específicos tipo DAPI si se recurre a un microscopio de fluorescencia. En las cabezas de los espermatozoides cuyoADN no está 30 INTRODUCCIÓN fragmentado se producen halos, de distinta magnitud, como consecuencia de la dispersión de los bucles de ADN (Fig. 10). Por el contrario, en aquellos espermatozoides en los que no se producen halos o estos son muy pequeños se considera quepresentan el ADN fragmentado (Fernández et al., 2003;Fernández et al., 2005). Los resultados se analizan con un microscopio de campo claro o uno de fluorescencia (según el tipo de tinción utilizada) y pueden ser interpretados o bien por un observador experimentado o bien utilizando un software de análisis de imágenes específico que valorará la presencia o ausencia de halos y la magnitud de los mismos. Figura 10.- Test SCD.Núcleos espermáticos procesados con SCDt teñidos con DAPI (arriba) y con Wright (abajo): (a) halo grande, (b) halo mediano, (c) halo pequeño, (d) sin halo y (e) núcleo sin halo y degradado. (Fernández et al., 2005) Esta tecnología tiene la misma base que el ensayo cometa con la diferencia de que en este caso no se necesita realizar una electroforesis, lo que facilita notablemente su realización, sin perder por ello capacidad predictiva ya que los resultados obtenidos mediante esta técnica se correlacionan con los obtenidos utilizando otras metodologías como el SCSA o el TUNEL (Chohan et al., 2006). Este proceso no requiere de aparataje específico diferente al que se utiliza de rutina en un laboratorio de andrología, ya que 31 INTRODUCCIÓN con un microscopio de campo claro, que forma parte de la dotación indispensable de cualquiera de estos laboratorios, sería suficiente. -DBD-FISH (DNA Breakage Detection-Fluorescence in Situ Hybridization) Fue introducida por Fernández en 1998 (Fernández et al., 1998). El método radica en la exposición del ADN de los espermatozoides a soluciones alcalinas que son capaces de desnaturalizar la molécula tanto en lugares sensibles como en extremos 3´OH que han quedado libres por una rotura de cadena doble o sencilla. Las células, que están sobre un portaobjetos e incluidas en una delgada capa de agarosa se incuban en una solución alcalina capaz de realizar una desnaturalización suave de la molécula de ADN. Una vez detenida la desnaturalización se incuba la preparación en una solución de lisis para extraer las proteínas y dejar la molécula de ADN en forma de cadena sencilla. Esta hebra sencilla de ADN, obtenida a partir del punto de rotura, se hibrida con una sonda específica de ADN marcada con un fluorocromo como, por ejemplo, el DAPI (Fig. 11). Al aumentar el porcentaje de fragmentación, mayor número de roturas y mayor proporción de ADN de cadena sencilla, mayor intensidad tendrá el marcaje en el ADN en el núcleo de la cabeza de ese espermatozoide en concreto. Los resultados son analizados e interpretados, como en el caso anterior, con un microscopio de fluorescencia y por un observador experimentado. La intensidad de la señal puede ser cuantificada con un programa de análisis de imágenes, a mayor intensidad en la señal mayor será el porcentaje de roturas. Esta técnica se utiliza fundamentalmente en el campo de la investigación y permitir analizar cada célula en secuencias específicas de ADN (Cortés-Gutiérrez et al., 2007). 32 INTRODUCCIÓN Figura 11.- DBD–FISH combinado con SCD.a: Espermatozoides teñidos con DAPI con ADN íntegro: 1,2,5 y 6 y con ADN fragmentado: 3 y 4.b: Espermatozoides procesados con DBD-FISH con ADN fragmentado (3 y 4). (Cortés-Gutiérrez et al., 2007) 3. Otras técnicas:En este apartado se englobarían otros métodos alternativos quese utilizan menos porque son menos fiables, debido que son poco reproducibles y son muy susceptibles a la subjetividad del observador. -NA (naranja de Acridina) Introducida por Tejada en 1984 (Tejada et al., 1984).Los espermatozoides se tiñen con este colorante metacromático, el ADN fragmentado emite fluorescencia naranja y el no fragmentado verde, según el mismo principio utilizado en la técnica SCSA. Se analizan mediante microscopía de fluorescencia,y es difícil de evaluar porque existen muchos colores intermedios y los resultados no son muy reproducibles (Evenson and Wixon, 2006a). -AT (azul de Toluina) Descrita por Andreetta en 1995 (Andreetta et al., 1995).Los espermatozoides se colorean con este colorante básico que tiene cualidades metacromáticas igual que la NA. Tiñe de violeta azulado intenso al unirse a cromatina rica en histonas o de azul más pálido al unirse a cromatina rica en protaminas. Se basa en que los espermatozoides más inmaduros presentarán más roturas y eso es lo que realmente evalúa, el grado de maduración según la condensación del ADN del núcleo. Se puede evaluar mediante 33 INTRODUCCIÓN microscopia de campo claro o con citometría de flujo (Erenpreisa et al., 2003). Al igual que en el caso de la NAlos resultados son poco reproducibles. -CMA-3 (CMA3) Se trata de un fluorocromo específico que presenta afinidad preferencial a unirse a regiones ricas en pares GCy compite con las protaminas por los mismos lugares en el ADN. Los espermatozoides que muestran coloración intensa presentan niveles bajos de protaminación. Se ha relacionado la fragmentación del ADN espermático con espermatozoides deficientes en protaminas.Al igual que en el caso anterior evalúa la maduración, el nivel de empaquetamiento de la cromatina nuclear(Manicardi et al., 1995). La valoración de los resultados se realiza mediante microscopía de fluorescencia. Realmente detecta espermatozoides morfológicamente normales que pueden presentar anomalías en la compactación de la cromatina. Una de sus mayores limitaciones es la subjetividad del observador a la hora de delimitar clases de espermatozoides. 7.3. SIGNIFICADO CLÍNICO DE LA FRAGMENTACIÓN DELADN ESPERMÁTICO Hasta la actualidad se han utilizado los parámetros clásicos del seminograma para predecir la fertilidad del varón, pero últimamente el análisis de la integridad del ADN espermático está cogiendo más protagonismo por la información adicional que puede proporcionar sobre la evaluación y el diagnóstico de la fecundidad masculina, (Saleh et al., 2002a). Se han publicado numerosos trabajos intentando relacionar la fragmentación del ADN espermático con los distintos parámetros convencionales del seminograma con resultados, sin embargo, muy contradictorios. Así, algunos estudios indican que niveles elevados relacionadospositivamente con de daño alteraciones en el seminales ADN de espermático todo tipo están (como concentración, motilidad, aspectos morfología del espermatozoide, etc.) (Tomlinson et al., 2001; Sheikh et al., 2008; Tandara et al., 2013), mientras en otras ocasiones, contrariamente a lo anterior, se establecen relaciones negativas entre el porcentaje de fragmentación y parámetros básicos del seminograma (Kidd et al., 2001; Johnson et al., 2015, Benchaib et al., 2007). Incluso se han intentado establecer valores umbrales de fragmentación por debajo de los cuales el éxito de cualquiera de las TRA estaría 34 INTRODUCCIÓN seriamente comprometido, sin haberse logrado un consenso tampoco en ese aspecto (Evenson et al., 1999, Spanòet al., 2000;Evenson and Wixon, 2006a, Collins et al., 2008). En cuanto a su repercusión sobre el resultado de las TRA, numerosos autores relacionan niveles altos de fragmentación espermática con peores resultados en tasas de embarazo tras IA (Duran et al. 2002;Bungum et al.,2004; Zini, 2011). Sin embargo, en el caso de la FIV convencional, al contrario que lo que sucede en la IA, los resultados son polémicos, encontrándose desde relaciones significativas con distintos parámetros, como la tasa de fecundación (Hostet al.,2000) o la tasa de embarazo(Tarozzi et al.,2009), hasta la no concordancia(Bungum et al., 2004). Si nos centramos en estudios realizados en pacientes sometidas a ICSI, al igual que en FIV, los resultados son también controvertidos. De este modo, hay autores que no encuentran relación entre la fragmentación del ADN espermático y los resultados del ciclo, tanto en tasas de fecundación como de embarazo(Zini, 2011), mientras, contrariamente, otros investigadores sí que encuentran asociación entre la fragmentación y los resultados de ICSI(Micinski et al.,2009), así como con los resultados de pérdida gestacional (Bhattacharya, 2008). Con todas estas controversias, parece sensato profundizar en el análisis dela fragmentación en los varones que se van a someter a TRA, y eso adquiere especial importancia sobre todo en los casos de ICSI, en los que es el biólogo el que elige el espermatozoide, basándose únicamente en criterios morfológicos. De momento el estudio de la fragmentación del ADN espermático no está instaurada como técnica rutinaria en los laboratorios y todavía no se ha llegado a un consenso sobre si su incorporación al estudio seminal convencional permitiría ayudar a diferenciar los varones fértiles de los infértiles. A pesar de que se ha investigado mucho actualmente sigue siendo un tema muy controvertido. Hay autores que defienden la incorporaciónde esta técnica a la rutina de pruebas que se deben realizar al varón (Lewis, 2015), mientras que otros abogan por lo contrario al no existir suficiente evidencia científica de su implicación (Drobnis and Johnson, 2015). 35 INTRODUCCIÓN 8. TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA Una vez completado el estudio de la pareja estéril y examinando la totalidad de las pruebas realizadas a ambos miembros se decide hacia qué técnica de reproducción asistida se les va a dirigir. Las tres técnicas fundamentales de reproducción asistida son la inseminación artificial (IA), la fecundación in vitroconvencional (FIV) y la inyección intracitoplasmática de espermatozoides, en inglésIntracytoplasmic Sperm Injection(ICSI).La inseminación artificial consiste en la introducción de una selección de los espermatozoides que tengan mejor calidad en el interior de la cavidad uterina de la mujer. La muestra seminal puede provenir del marido, hablamos entonces de inseminación artificial homóloga o conyugal(IAH o IAC)oproceder de un donante (IAD). En la fecundación in vitro convencional los ovocitos se incuban en un medio de cultivo que contiene espermatozoides previamente preparados, uno de los cuales fecundará cada ovocito in vitro. El ICSI consiste en introducir mediante un sistema de micromanipulación un espermatozoide dentro de cada uno de los ovocitos maduros. Cuando se utiliza,de manera rutinaria, cualquiera de estas técnicas de reproducción asistida, especialmente el ICSI, en los laboratorios de FIV se eluden muchos mecanismos de selección natural y esto tiene como consecuencia que aumenten las posibilidades de que el material genético de los espermatozoides (que el biólogo ha elegido)que fecunden a los ovocitos contenga alteraciones. Por todas las circunstancias referidas consideramos que puede resultar de gran interés, no solo científico sino también de aplicación a la práctica clínica, seguir profundizando en el conocimiento de los factores que inciden y pueden mejorar los resultados de los tratamientos de reproducción asistida, un área de enorme relevancia sociosanitaria. 36 OBJETIVOS OBJETIVOS El presente trabajo tiene como objetivo general la evaluación del impacto del factor masculino sobre los resultados clínicos tras los tratamientos de reproducción asistida, utilizando como técnica de inseminación la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Para ello se pretenden llevar a cabo los siguientes objetivos específicos: 1.- Analizar las características y parámetros seminales de los varones de la serie. 2.- Establecer las posibles relaciones entre la fragmentación del ADN espermático y los parámetros clásicos del seminograma. 3.- Evaluar las consecuencias que tiene el procesamiento espermático mediante la técnica de swim-up sobre la fragmentación de la muestra seminal. 4.- Evaluar los resultados de los ciclos de fecundación in vitro mediante la técnica de inyección intracitoplasmática de espermatozoides en relación con las características de las parejas, los parámetros seminales y la fragmentación del ADN espermático. - 39 MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y MÉTODOS 1. POBLACIÓN DE ESTUDIO La población estudiada está compuesta poruna serie de41 parejas de pacientes que acudieron a la consulta de Fecundación In Vitro de la Unidad de Reproducción Humana del HOSPITAL 12 DE OCTUBRE de Madrid en un periodo que abarca desde 20 de Octubre del 2008 hasta 2 de febrero del 2010. Todas estas parejas fueron sometidas durante este periodo a uno o a varios ciclos de fecundación in vitro, la mayoría de ellas con transferencia de embriones en fresco y en algunos casos con un ciclo posterior de transferencia de embriones congelados procedentes de esos ciclos previos de fecundación in vitro. Ninguna de las parejas estudiadas teníahijos anteriores ni con estas ni con otras parejas y todas acudieron a la consulta tras un periodo de esterilidad igual o superior a un año. Los varones que forman parte del estudio tienen una edad comprendida entre los 25 y los 51 años, con una edad media de 38,51 ± 0,94 años.La edad de las mujeres osciló entre los 21 y los 40 años, con una edad media de 34,46 ± 0,71 años. A todos los sujetos, tanto hombres como mujeres se les realizó una serología de hepatitis B y C y VIH y, en el caso de los varones, también un seminograma previode estudio antes de empezar el ciclo. Todas las parejas firmaron un consentimiento informado elaborado en la Unidad de reproducción Humana siguiendo las directrices de la SEF y reconocido por la Unidad de calidad y Comité de historias clínicas del Hospital 12 de Octubre. Los datos de este trabajo se han tratado siempre de manera confidencial y en ningún caso se ha hecho referencia a la filiación de los mismos, respetando así losrequisitos contemplados en la legislación de la Agencia Española de Protección de Datos. 2. SEMINOGRAMA El análisis seminal se realizó siguiendo las recomendaciones de la OMSvigentes en el momento de la recogida de los datos(OMS, 1999).Actualmente, los valores de referencia han sufrido algunas variaciones debido a la revisión realizada recientemente 43 MATERIAL Y MÉTODOS (OMS, 2010).La muestra se obtuvo por masturbación tras un periodo de abstinencia sexual de 2 días como mínimo y 5 días como máximo, intentando mantener las máximas condiciones de asepsia posibles. El eyaculado, que tiene que ser completo, se recogió en un recipiente estéril y con un tiempo máximo de traslado al laboratorio de entre 30 minutos y 1 hora, evitando en lo posible las fluctuaciones de temperatura. Cada una de las muestras se registró, etiquetándola con el nombre y número de historia de ambos miembros de la pareja. Se completan los datos sobre la recogida con información que facilitaron los varones sobre los días de abstinencia, el lugar y la hora exacta a la que se hasido obtenido y también se incorpora a la hoja de recogida cualquier otro dato que facilite el paciente, como la aparición de fiebre en los últimos días, la ingesta de cualquier tipo de fármaco, situaciones de estrés, etc.; así como cualquier incidencia que haya tenido durante el proceso de recogida y/o traslado al laboratorio. Una vez que la muestra llega al laboratorio se conserva en una incubadora a 37°C para su licuefacción, después de lo cual comienza el procesamiento.El eyaculado se empieza a procesar, más o menos, entre los 25 o 30 minutos después su obtención y 1 hora como máximo para prevenir la deshidratación y los cambios de temperatura que afectan a la calidad espermática. El estudio de la muestra se dividió en dos etapas, y los parámetros principales recogidos en ellas se resumen en la Tabla 1. 44 MATERIAL Y MÉTODOS Parámetro Licuefacción Aspecto Valores de referencia Alteraciones Total a los 60 min. * Homogéneo * Rojizo-marrón* Color: gris-opalescente Amarillento* Opacidad disminuida* Hipospermia Volumen ≥ 2,0ml Aspermia (ausencia de eyaculado) Viscosidad pH Concentración espermática Número total de espermatozoides Motilidad Morfología Caída por gravedad en gota o filamentos <2 cm Hiperviscosidad seminal ≥ 7,2 * Oligozoospermia** ≥ 20 x 106/ml Azoospermia (ausencia de espermatozoides) ≥ 40 x 106/eyaculado Oligozoospermia** ≥ 50% (a + b)*** Astenozoospermia o ≥ 25% (a) ≥ 15% formas normales Teratozoospermia Tabla 1.- Valores de referencia (OMS, 1999) * No existe denominación consensuada para las alteraciones. ** Suficiente con que uno de los dos parámetros esté alterado. *** a: motilidad progresiva rápida, b: motilidad progresiva lenta o perezosa. Pormenorizando los parámetros recogidos: Análisis macroscópico: Este apartado comprende la observación de las siguientes características de la muestra seminal: ▪ Licuefacción: Para evaluar una muestra de semen esta debe estar licuada. La licuefacción es un fenómeno espontáneo que se produce gracias a una sustancia liberada en el eyaculado denominada fibrinolisina.Aunque la licuefacción completa ocurre normalmente alrededor de los 15 minutos post-eyaculación a temperatura 45 MATERIAL Y MÉTODOS ambiente, una muestra normal puede tardar hasta 60 minutos en licuarse. Si pasado ese periodo no se ha producido tiene que quedar registrado. En algunos casos aparecen cuerpos gelatinosos que no se licuan, lo que parece carecer de importancia o significado clínico y no dificultan el análisis. En algunas ocasiones este fenómeno de licuefacción no ocurre de manera natural, de modo que transcurrido el tiempo máximo (60 minutos), si la muestra no se ha licuado completamente, en nuestro caso hemos procedido a diluir el eyaculado en una solución salina tamponada (Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline, Gibco®, Life Technologies, Paisley, UK) en proporción 1:1ymezclar repetidamente con una pipeta de calibre ancho hasta conseguir la licuefacción completa. Existen otros métodos, como la adición de bromelina (1g/L), o el paso deleyaculado por una aguja de calibre 18 o 19 (0.84 mm o 0.69 mm de calibre interno, respectivamente)unida a una jeringa,se desaconsejan porque puede producir daño a los espermatozoides.Cualquier procedimiento adicional utilizado deberá ser registrado. ▪ Aspecto: Una muestra normal debe ser homogénea y de color gris opalescente. Puede parecer menos opaca cuando la concentración de espermatozoides es muy baja, o tener una tonalidad rojizo-marrón que indicaría la presencia de hematíes, o amarillenta como consecuencia del consumo de vitamina B o en el caso de pacientes con ictericia. (Tabla 1). ▪ Volumen: Se calcula utilizando el peso total del recipiente con la muestra y restándole el peso del recipiente vacío. La medida se registraen ml utilizando un decimal. Para que un volumen se considere normal debe ser igual o superior a 2,0 ml (Tabla 1). ▪ Viscosidad:Para evaluar este parámetro, también llamado “consistencia”,se aspirala muestra con una pipeta de plástico ancha ( ̴1.5 mm de diámetro) y el contenido de la pipeta se deja caer por gravedad. Se considera viscosidad normal la caída en gota o produciendo filamentos menores de 2 cm de longitud. Si los filamentos superan los 2 cm de largo se considera una viscosidad aumentada(Tabla 1)indicando posiblemente algún tipo de disfunción prostática y pudiendo interferir en la valoración de otros 46 MATERIAL Y MÉTODOS parámetros como la concentración o la motilidad. Los métodos para reducir la viscosidad son los mismos que los descritos para facilitar la licuefacción. ▪ pH: Debe ser medido antes de transcurrir una hora de la eyaculaci6n y se realiza utilizandotiras de papel específicas para medir pH que tengan un rango de entre 6.0 y 10.0. Se homogeniza bien la muestra con una pipeta, se pone una gota encima del papel pH y esperamos 30 segundos a que el papel se impregne y cambie de color. Pasado ese tiempo se comparael tono obtenido con la tabla de colores de referencia para saber con qué pH se corresponde.El pH debe ser superior a 7,2(Tabla 1 ). Los valores inferiores a 7,0en muestras azoospérmicas pueden indicar una obstrucción de las vías eyaculatorias o la ausencia bilateral congénita de los vasos deferentes. Análisis microcópico: ▪ Motilidad espermática: Se depositan 10 µl de la muestra , muy bien homogeneizada, en un portaobjetos limpio y atemperado y se cubre con un cubreobjetos de 22 x 22 mm para obtener una profundidad ̴ 20 µm. Esperar aproximadamente un minuto para que la muestra se estabilice. La motilidad se evaluó utilizando un microscopio Nikon Eclipse E200 con contraste de fases y un objetivo 40x. Se evalúan por lo menos 5 campos aleatorios para clasificar 200 espermatozoides. La OMS establece cuatro categorías de espermatozoides (a, b, c y d) según su movilidad.Se cuantifican en cada campo los espermatozoides progresivos y con movimiento rápido (trayectoria rectilínea y velocidad mayor o igual a 25 µm/seg o velocidad mayor o igual a 5 veces la longitud de la cabeza por segundo) que se clasifican como clase a, los progresivos lentos o perezosos(velocidad menor de 25 µm/seg) que se incluyen en la clase b, los no progresivos (velocidad < 5 µm/seg) catalogados como clase c, y por último los de la clase d que corresponden a los espermatozoides inmóviles (Tabla 2). La movilidad se registra expresando los porcentajes de espermatozoides de la muestra que se incluyen en cada una de las cuatro categorías de movilidad espermática. 47 MATERIAL Y MÉTODOS Categoría OMS Tipo de movilidad Velocidad a Progresiva rápida ≥ 25 µm/s (≥ 5 veces la longitud de la cabeza) b Progresiva lenta 5 - 24 µm/s c No progresiva d Inmóviles < 5 µm/s (< 1 vez la longitud de la cabeza) - Tabla 2.- Categorías de motilidad espermática (a 37°C) según la OMS (1999) Una vez cuantificados 200 espermatozoides en una primera preparación se repite el proceso, es decir, se prepara un nuevo portaobjetos de la misma muestra seminal y se vuelven a valorar otros 200 espermatozoides. La movilidad se registra expresando los porcentajes de espermatozoides de la muestra que se incluyen en cada una de las cuatro categorías. Se considera que una muestra tiene una motilidad normal si la suma de espermatozoides con motilidad “a + b” esigual o superior al 50%, o bien si el porcentaje de espermatozoides que tienen motilidad “a” es igual o superior al 25%. Por debajo de esos valores se considera que existe astenozoospermia (Tabla 2). ▪ Concentración espermática: Para el cuantificar el número de espermatozoides se utilizó la cámara de contaje de Makler® (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel) (Fig 12).Es una cámara específica de recuento de espermatozoides compuesta de dos partes, una base de metal donde se sitúa la muestra y una cubierta de cristal que actúa de cubreobjetos. En el centro hay una rejilla de 1mm2, subdividida en 100 cuadrados, cada uno de 0,1 x 0,1 mm. Se deposita en la cámara 5 μl de muestra previamente homogeneizada y se contabiliza en un microscopio con contraste de fasesNikon Eclipse E200con un objetivo 20x o 40x, contabilizando únicamente los espermatozoides intactos. El número de espermatozoides (n) cuya cabeza esté dentro del área comprendida en 10 cuadros equivale al número de millones (nx106)de espermatozoides por mililitro.Este recuento se realizó 3 veces para poder establecer una media. Para aumentar la fiabilidad del análisis este proceso se puede duplicar cargando de nuevo la cámara con otros 5 μl de la misma muestra y repitiendo el contaje. El número total de espermatozoides en todo el eyaculado es el producto de la concentración espermática y el volumen de la muestra. Se refleja en el informe tanto la concentración de 48 MATERIAL Y MÉTODOS espermatozoides por mililitro como el número total de espermatozoides contenidos en la muestra. El límite inferior que marca la OMSpara semen normales de 20x106 espermatozoides/ml y 40x106 espermatozoides/eyaculado. Por debajo de estos niveles se consideraque existeoligozoospermia. En los casos de muestras oligozoospérmicas, se cuentan los espermatozoides que se localizan en toda la superficie de la cuadrícula (en los 100 cuadros), y el número obtenido multiplicado por 105 representaría la concentración de espermatozoides por mililitro. Si no se encuentra ningún espermatozoide en toda la cámara hay que centrifugar el total del eyaculado (15 minutos a 800g) para examinar al microscopio el sedimento completo en una preparación con cubreobjetos utilizando contraste de fases y el objetivo 40x. Figura 12..- Cámara Makler (izda) y rejilla vista al microscopio (izda) ▪ Morfología: Este parámetro se evalúa examinando extensiones de las muestras en un microscopio Nikon Eclipse E200 con un objetivo 40x. Para preparar las extensiones se deposita una gota de 10 µl de la muestra previamente homogeneizadaen el final del portaobjetos limpio y libre de grasa para que el material se adhiera al cristal. Con la ayuda de otro portaobjetos dispuesto con un ángulo de 45° sobre el anterior se estira la gota a lo largo de toda la superficie en un tiempo aproximado de 1 segundo (hay que arrastrar la gota con el portaobjetos “de arrastre” por delante tirando de ella, no hay que empujar la gota presionando sobre ella).Si partimos de muestrascon baja concentración de espermatozoides es aconsejable concentrar la muestra mediante centrifugación(se tiene que registrar ya que pude afectar a la morfología). Una vez realizadas dos extensiones por muestra se dejan secar al aire y posteriormente se 49 MATERIAL Y MÉTODOS tiñen para poder ser estudiadas.Existen diversos tipos de tinciones aplicables a los espermatozoides como la tinción de Papanicolau, la tinción de Shorr o la tinción DiffQuik. Esta última es la tinción, cuyo protocolo se detalla a continuación, elegida en nuestro laboratorio. Tinción Diff-Quik (Allegiance Healthcare Corp, McGraw Park, IL, USA): El protocolo seguido, siguiendo las instrucciones del proveedor, ha sido el siguiente: -Inmersión de la preparación durante 15 segundos en solución fijadora, consistente en colorante verde rápido (Fast Green FCF) (0,002 g/l de sal disódica de la familia de los triarilmetanos) disuelto en metanol. Sacar y dejar escurrir la preparación verticalmente sobre un papel absorbente. - Inmersión de 10 segundos en la Solución de tinción I: Eosina Y (1,22 g/l) en una solución tamponada con fostato (pH 6,6) y 0,1% (p/v) de azida sódica como conservante. Sacar el porta. -Introducir el porta durante 5 segundos en la Solución de tinción II: Colorante de tiazina (1,1 g/l) en solución tamponada con fosfato (pH 6,6). -Sacar y eliminar el exceso de colorante lavando con agua corriente del grifo 10 o 15 veces, escurrir en vertical sobre un papel absorbente y dejar secar al aire. Las preparaciones pueden examinarse directamente sin necesidad de montaje si no se van a almacenar. Las preparaciones también se pueden montar, utilizando medio de montaje permanente,para su almacenamiento durante largos periodos de tiempo. Uno de los problemas más comunes que se encuentran a la hora de valorar la morfología es la falta de objetividad y las variaciones en la interpretación que dan lugar a malos resultados. Se recomienda clasificar a los espermatozoides de una manera simple en normales/anormales y de manera opcional introducir en la clasificaciónlos tiposde anomalías (Fig 13). Un espermatozoide normal, según el manual de la OMS (1999) consta de cabeza, cuello, pieza media y flagelo o cola, y está perfectamente definido en aspecto y medidas de todas sus partes. En la tabla 3 se resumen los parámetros morfológicos de normalidad ya detallados en la introducción. Cualquier desviación de sus 50 MATERIAL Y MÉTODOS características determina que el espermatozoide sea considerado como anormal. Los tipos de anomalías más importantes en la cabeza, serían defectos de tamaño, de forma, presencia de vacuolas, acrosomas de tamaño alterado, etc. o distintas combinaciones de todas las anomalías anteriores. Dentro de las anomalías del cuello y de la pieza media encontramos inserciones asimétricas, alteraciones de tamaño, de contorno, de forma o combinaciones de estos defectos. Las anomalías del flagelo son muy variadas, pueden ser de tamaño, de forma como colas enrolladas sobre si mismas, anguladas o rotas, de espesor irregular y cualquier combinación entre ellas. Existe otra anomalía que consiste en la presencia de un exceso de citoplasma residual, grandes acúmulos de citoplasma teñidos de manera desigual, sobrepasando más de la mitad de la longitud de la cabeza, se encuentran generalmente asociadas a piezas medias defectuosas. En la Fig. 13 se representan los principales tipos de anomalías encontradas en los espermatozoides humanos. Forma Longitud Anchura Partes Región acrosómica: más clara, Cabeza - Ovalada - Contorno regular y liso 4 - 5 µm 3,5 - 4,5 µm bien definida, 40-70% del volumen de la cabeza. Núcleo Pieza media - Delgada - Si gota citoplasmática volumen ≤ 1/2 cabeza 1,5 < 1 µm cabezas - - Uniforme Cola - Más estrecha que pieza media 45 µm - - Desenrollada Tabla 3.- Principales parámetros morfológicos de un espermatozoide normal. 51 MATERIAL Y MÉTODOS Figura 13.- Principales tipos de anomalías morfológicas espermáticas Una vez teñida y analizada la morfología hay que determinar el porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales de la muestra, sin que sea necesario especificar el tipo de anomalía ni el porcentaje que corresponde a cada una de ellas. Se analizan todos los espermatozoides de las áreas seleccionadas con óptica de campo claro,con el objetivo de 40x, hasta completar un número mínimo de 200 células evaluadas. Se cuantifica el número de espermatozoides normales, reflejándose finalmente el porcentaje de espermatozoides normales que se expresa como número entero. Sólo se contabilizan los espermatozoides que están intactos, aquellos en los que se vea la morfología claramente, los que no estén pegados, ni superpuestos a otros, ni situados en el borde. Las preparaciones que estén muy sucias hay que volver a lavarlas para eliminar todos los restos de material que dificultan el análisis. Para evaluar la morfología espermática, como ya hemos anticipado, normalmente es suficiente con determinar el porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales. No es necesario cuantificar por separado los distintos tipos de anomalías que aparecen en la cabeza, la pieza media y en la cola. El número mínimo de espermatozoides morfológicamente normales que tiene que tener una muestra es del 15%, en el caso de que la muestra no alcance este número mínimo hablamos de teratozoospermia. 52 MATERIAL Y MÉTODOS 3. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS (SWIM-UP) Toda muestra que vaya a ser usada en cualquiera de las TRA debe ser procesada. Este procesamiento se suele denominar capacitación espermática con la oposición de algunos autores que defienden que ese nombre debe corresponder exclusivamente al conjunto de cambios que se producen en el espermatozoide, dentro del tracto reproductor femenino, mediante los cuales adquiere la capacidad fecundante. La técnica consiste en eliminar el plasma seminal que contiene componentes que afectan negativamente al comportamiento de la muestra en el caso de que esta se vaya a utilizar TRA. Mediante las distintas técnicas de preparación de las muestras también conseguimos aislar y concentrar un alto porcentaje de los espermatozoides con mejor movilidad y morfológicamente normales así como eliminar suciedad, espermatozoides inmóviles y otros tipos de células. Existen varias técnicas de preparación espermática, basadas en migración, centrifugación o lavado, y en cada laboratorio se decide cual de ellas elegir, según el tipo de muestra y la técnica en la que se va a utilizar, según sus propios protocolos y su experiencia. Una de las más utilizadas es la técnica de los gradientes de densidad discontinuos, basadaen la separación de las células según su capacidad para vencer la resistencia que ofrecen las distintas capas de densidades diferentes. Se suelen utilizar columnas de dos o tres densidades diferentes. Como producto final y tras un proceso de centrifugación se obtiene una solución con espermatozoides móviles sin la presencia del resto de componentes y otros tipos celulares que están presentes en el semen en fresco. Otra de las técnicas más comúnmente utilizada en todos los laboratorios de fecundación in vitro es la técnica de swim-up y este es el procedimiento de preparación espermática que se ha elegido en el laboratoriopara procesar todas las muestras de este estudio. Esta técnica se basa en la capacidad de los espermatozoides con buena movilidad para nadar hacia el medio de cultivo. El swim-up estándar es un procedimientode realización sencilla que permite una buena recuperación de espermatozoides móviles. La secuencia de pasos a seguir queda relatada a continuación: 53 MATERIAL Y MÉTODOS - En un tubo de fondo redondo mezclar la muestra con medio de cultivo G-GAMETE™ suplementado con HSA(Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden)en proporción 1:1. - Centrifugar a 300-500g durante 10 minutos. - Descartar el sobrenadante decantándolo. - Añadir al pellet que ha quedado en el fondo del tubo 0.5 mlde medio de cultivo suavemente (el volumen de medio que se añade es variable según la calidad de la muestra), dejando que se vaya deslizando lentamente por las paredes para no remover el sedimento. - Introducir en la incubadora a 37°C y con el porcentaje de CO2 específico para el tipo de medios utilizados, el tubo inclinado en un ángulo de 45° durante 45-60 minutos. - Rescatar el sobrenadante (hacia donde se habrán desplazado los espermatozoides con mejor movilidad) y pasarlo a un tubo limpio. El volumen de sobrenadante que hay que recuperar dependerá de la cantidad de medio que añadimos en un principio pero siempre rescataremos menos cantidad de la añadida para así evitar mezclar las dos fases y llevarnos parte del pellet al apurar demasiado. - Homogeneizar el medio recuperado y calcular el número de espermatozoides móviles que se han recuperado, denominado REM (Recuento de espermatozoides móviles). Habitualmente, se establecen tres grupos de pacientes según su REM, el primero incluye a los pacientes en los que hemos recuperado menos de 1 x 10 6 espermatozoides móviles/ml, el segundo contiene a aquellos en los que el REM está comprendido entre 1 y 5 x 106 y en el último están los varones en los que se recuperan más de 5 x 106 espermatozoides móviles. Una vez concluido el proceso pasar 100 µl del semen preparado a otro tubo y ajustar la concentración a 5-10x106espermatozoides/ml para posteriormente analizar la fragmentación. El resto del preparado se utiliza para realizar la microinyección espermática de los ovocitos recuperados de la pareja. Todo el proceso anterior se debe realizar en la campana de flujo laminar y condiciones de máxima esterilidad. 54 MATERIAL Y MÉTODOS 4. TEST SCD (Sperm Chromatin Dispersión) La fragmentación del ADN espermático se analiza utilizando el Kit Halosperm® (Halotech Dna, SL; Madrid, Spain). Es un kit de utilización muy sencilla, barata y rápida que permite estudiar la fragmentación del ADN de los espermatozoides. El funcionamiento de este kit está basado en el test SCD (Fernández et al., 2003; Fernández et al., 2005). La técnica se realizó según las instrucciones del fabricante: - Colocar la solución de lisis (LS) a temperatura ambiente (22°C). - Diluir la muestra de semen en medio de cultivo hasta alcanzar una concentración de 5-10 millones por mililitro. - Situar el eppendorf con agarosa (ACS) en un flotador y mantenerlo en un baño de agua a 90°-100°C durante 5 minutos hasta que la agarosa se disuelva (también se puede fundir en el microondas). - Trasladar el eppendorf con la agarosa, insertado en el flotador, a un baño de agua con una temperatura controlada de 37°C y mantenerlo ahí durante 5 minutos hasta que la temperatura sea uniforme. - Añadir 25 µl de la muestra de semen al eppendorf que contiene la agarosa y mezclar bien. Extraer de la mezcla (SCS) 20 µl y colocarlo en el portaobjetos pretratado con agarosa tapándolo con un cubreobjetos de 22 x 22 mm. - Mantener el portaobjetos en posición horizontal durante todo el proceso. - Poner el portaobjetos sobre una superficie de metal fría (̴4°C). Meter la superficie de metal con el portaobjetos encima en el frigorífico y mantener durante 5 minutos para que la agarosa solidifique. - Preparar la solución de desnaturalización (AD): Añadir 80 µl de la solución de desnaturalización (HCl) a 10 µl de agua destilada, mezclar bien y volcar a una cámara de incubación. - Eliminar el cubreobjetos deslizándolo suavemente. De ahora en adelante hay que mantener el portaobjetos lo más horizontal posible. - Sumergir inmediatamente el portaobjetos en la solución de desnaturalización en posición horizontal y mantener ahí durante 7 minutos a temperatura ambiente. 55 MATERIAL Y MÉTODOS - Después, cambiar el portaobjetos a otra cámara de incubación que contenga 10 ml de solución de lisis, previamente atemperada, e incubar durante 25 minutos. - Sacar el portaobjetos y sumergirlo en una nueva cámara de incubación que contenga abundante agua destilada durante 5 minutos para eliminar los restos de solución de lisis. - Deshidratar la preparación en baños crecientes de etanol: Cambiar el portaobjetos a una cámara de incubación que contenga etanol al 70% durante 2 minutos, a continuación pasarlo a otra cámara con etanol al 90% otros 2 minutos y, por último, a una cámara con etanol absolutodurante otros 2 minutos. - Dejar secar al aire a temperatura ambiente y teñir. 5. TINCIÓN Para teñir los portaobjetos tratados se utilizó la tinción Diff-Quik(Allegiance Healthcare Corp, McGraw Park, IL, USA), que ya ha sido descrita en el apartado 3.1 de Material y Métodos. 6. EVALUACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Las preparaciones se analizaron, con un microscopio Nikon Eclipse E200, con objetivo de 100X, hasta completar el número necesario (500) de células evaluadas.Tras someter a los espermatozoides a este tratamiento se detectanhalos alrededor de la estructura nuclear central en las cabezas de las células que no presentan fragmentación o en las que muestren una fragmentación escasa, formados por bucles de ADN que se han originado al romper los enlaces disulfuro, eliminar las proteínas celulares y relajar así la molécula de ADN. En los espermatozoides que presenten fragmentación no se observará este halo o bien este será mínimo ya que la existencia de numerosas roturas impide la dispersión de la molécula de ADN y la formación de esos largos bucles. Como consecuencia del tratamiento de fragmentación del ADN y de la tinción al observar al microscopio encontramos espermatozoides que presentan el flagelointacto 56 MATERIAL Y MÉTODOS y alrededor de la estructura de sus cabezas halos de distinto tamaño. Según la existencia y el tamaño de los espermatozoides se clasifican en: 1- Espermatozoides sin fragmentación del ADN. Dentro de este grupo se diferencian: - Espermatozoides que presentan un halo grande: aquellos cuyo halo es de tamaño similar o superior al diámetro menor de su cabeza. - Espermatozoides con un halo de tamaño medio: en el caso en que tengan un halo comprendido entre el diámetro menor de su cabeza y 1/3 del mismo. 2- Espermatozoides con el ADN fragmentado.Entre ellos podemos encontrar: - Espermatozoides que muestran un halo pequeño: en los que este es igual o inferior a 1/3 del diámetro menor de su cabeza. - Espermatozoides sin halo. - Espermatozoides degradados. Pueden aparecer también en la muestra espermatozoides que presentan una cabeza teñida débil e irregularmente e incluso otro tipo de células que no son espermatozoides. Se analizaron un mínimo de 500 espermatozoides evitando clasificar los espermatozoides localizados en el borde de la preparación (Fernández et al., 2005). Se calcula finalmente el número de espermatozoides que presentan el ADN fragmentado, que corresponde a la suma de las células con halo pequeño, sin halo y las degradadas, y se expresa en forma de porcentaje. En este estudio se recogieron en cada paciente dos datos diferentes, por un lado el correspondiente a la fragmentación del ADN de los espermatozoides procedentes de la muestra de semen en fresco (fragmentación basal)y por otro lado el que corresponde a la fragmentación del ADN de la misma muestra conlos espermatozoides recuperados una vez realizado el swim-up(fragmentación post swimup). El procesamiento de los dos tipos de muestras diferentes en cada paciente se realizó simultáneamente justo antes de llevar a cabo el proceso de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (también denominada microinyección espermática). 57 MATERIAL Y MÉTODOS 7. RECUPERACIÓN Y PREPARACIÓN DE LOS OVOCITOS Las estimulaciones ováricas se realizaron utilizando FSH-r (Gonal-F®; Merck Serono S.A., Madrid, España o Puregon®; MSD, España), LH-r (Luveris®; Merck Serono S.A., Madrid, España); FSH-r y LH-r combinadas (Pergoveris®; Merck Serono S.A., Madrid, España) o HMG up (Menopur®; Ferring, S.A.U., Madrid, España). Las pacientes se estimularon según sus características utilizando protocolos de estimulación cortos con antagonistas GnRH o largos con agonistas GnRH. En los protocolos largos con agonistas se realizó una supresión hipofisaria con Nafarelina intranasal (Synarel®; Pfizer S.A., Madrid, España) o triptorelina subcutánea (Decapectyl® diario 0,1; Ipsen, Barcelona, España) desde la fase lútea del ciclo previo. En los protocolos de estimulación con antagonistas de la GnRH, se utilizó cetrorelix subcutáneo (Cetrotide®; Merck Serono S.A., Madrid, España) o ganerelix (Orgalutran®;MSD, España). Las gonadotropinas fueron suministradas en el 2º o 3er día del ciclo, cuando la concentración de estradiol en sangre era menor de 50 pg/ml y la ecografía vaginal no mostraba ningún folículo de tamaño superior a 10 mm de diámetro. Cuando la FSH y la LH se suministraron de manera combinada las concentraciones fueron variables según se tratara de pacientes calificadas de normorespondedoras (FSH 150-225 UI y LH 0-150 UI) o de bajas respondedoras (FSH 300-450 UI y LH 75-150 UI) y los tratamientos tuvieron una duración similar. En el caso de protocolos cortos en mujeres estimuladas con una sola gonadotropina (FSH), las normorespondedoras comenzaron con una dosis de 150-225 UI que seaumentó a 300-450 UI en las bajas respondedoras y se mantuvieron durante 10 u 11 días. La introducción del antagonista se realizó con protocolo flexible cuando un folículo superaba los 14 mm o el E 2 era mayor de 400-500 pg/ml, con una valoración individualizada de cada caso. En los ciclos largos con agonistas se inició el tratamiento entre el día 17-22 del ciclo previo (ciclo natural o con anticonceptivo), se realizó un control de frenaje tras la menstruación y otro después de 10 días de tratamiento para confirmar la supresión hipofisaria. En el momento de inicio de las gonadotropinas se redujo la dosis de análogos a la mitad. En resumen, el protocolo de estimulación fue individualizado y se adaptó a los datos de reserva ovárica de cada mujer con el fin deoptimizar la respuesta ovárica. Se 58 MATERIAL Y MÉTODOS siguieron pautas de estimulaciónespecíficas para mujeres con perfil de normo, bajo e hiperrespuestacombinando diferentes dosis y tipos de gonadotropinas tanto en ciclo con antagonistas GnRH como en ciclo largo con análogos. El criterio para la administración de la hCG (Ovitrelle®; Merck Serono S.A., Madrid, España), común a todos los ciclos, fue la presencia de 3 o más folículos con un diámetro mayor o igual a 18 mm. La recuperación ovocitaria se realizó a las 35 o 36 horas de la administración de la hCG. El día de la punción folicular (día 0) el procedimiento de extracción se realizó mediante una aspiración transvaginal guiada por una ecografía vaginal en un quirófano reservado únicamente para este uso. Los líquidos foliculares se procesaron en el laboratorio contiguo.Los ovocitos se extrajeron del líquido folicular utilizando para su localización una lupa binocular(Nikon SMZ 800) situada dentro de una cabina de flujolaminar bajo estrictas condiciones de esterilidad y se procesaron para su posterior utilización en la técnica de ICSI. Estos ovocitos obtenidos se depositaron y se limpiaron en primer lugar en una placa de lavado para eliminar los restos de líquido folicular.La placa de lavado esta compuesta por gotas deG-GAMETE™ suplementado con HSA(Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden) cubierto con OVOIL™ (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden) Una vez limpios se pusieron en una placa de cultivoseparando y situandocada uno en una gotadiferente. En nuestro caso la placa se preparó con medio G-IVF™ PLUS suplementado con HSA (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden) equilibrado, cubierto con OVOIL™ (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden) que protege las gotas en las que están los ovocitos yretrasa la perdida de temperatura y el cambio del pH. La placa de cultivo con los ovocitos se mantuvo en la incubadora a 37°C, 6% de CO2y 95% de humedad,condiciones que pueden variar según el tipo de mediosutilizados, hasta el momento de prepararlos para la microinyección, entre 2 y 3 horas después de su obtención. Se fabrica una placa de decumulación compuesta por microgotas de una solución que contiene hialuronidasa HYASE™ -10X (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden), enzima que se utiliza para degradar las células del cúmulo cuyo efecto, combinado con la acción mecánica que resulta de pasar el cúmulo por un capilar de 59 MATERIAL Y MÉTODOS diámetro pequeño, consigue que el ovocito se deshaga de todas las células de su alrededor y quede liberado. 8. INYECCIÓN INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZOIDES (ICSI) Una vez que todos los ovocitos de la paciente están decumulados se realiza elproceso deICSI. La placa destinada a la microinyección está compuesta por microgotas de un medio específico que contiene PVP (polivinilpirrolidona) para la inmovilización de los espermatozoides antes de la microinyección ICSI™ (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden), se trata de un medio muy viscoso que ralentiza el movimiento de los espermatozoides y así se facilita su manipulación, y por gotas de medio G-GAMETE™ suplementado con HSA(Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden)cubierto con OVOIL™ (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden), dentro de las que se realiza la microinyección propiamente dicha. Se prepara el microscopio(Nikon Eclipse Ti-U), comprobando el buen funcionamiento tanto de la óptica como de los sistemas de microinyección, atemperándolo y situando las micropipetas, en nuestro caso ICSI y Holding micropipets (Origio a/sMåløv, Denmark). A continuación se comienzacon la inmovilización de los espermatozoides. Se coloca una pequeña cantidad del semen capacitado en una gota de PVPy en el microscopio de microinyección se extraende esa gota uno a uno, aspirándolos por la cola con la pipeta de microinyección, eligiendo aquellos espermatozoides que parezcan de mejor calidad, los que tengan mejor morfología y mejor movilidad. Los espermatozoides elegidos se pasan individualmente a una gota limpia de PVP. Cada espermatozoide seleccionado se inmoviliza ejerciendo presión con la micropipeta situada encima del flagelo contra la placa de microinyección y dejándolos preparados en esa nueva gota. Al inmovilizar los espermatozoides se consigue la desestabilización y la permeabilización de la membrana plasmática y se facilita así la descondensación nuclear. Se repiteesta operación hasta que tengamos un número suficiente de espermatozoides (siempre se seleccionan espermatozoides en exceso por si alguno se daña o se pierde durante el proceso) para asegurar microinyectar con un espermatozoide cada uno de los ovocitos obtenidos de cada paciente. Una vez 60 MATERIAL Y MÉTODOS inmovilizados los espermatozoides se distribuyen los ovocitos en las gotas del medio en el que se va ha realizar la microinyección, un ovocito por gota. Se dispone el ovocito de manera que el corpúsculo polar (CP) quede situado en las posiciones 12 o 6 siguiendo el esquema de las agujas del reloj para evitar dañar la placa meiótica al introducir la pipeta. La pipeta de sujeción (holding) se desplaza hasta que quede pegada a la zona pelúcida (ZP) del ovocito y se fija ejerciendo una ligera aspiración. Una vez comprobado que el ovocito está bien sujeto se aproxima el espermatozoide que está dentro de la pipeta de microinyección lo más cerca posible de la punta y se presiona sobre la zona pelúcida del ovocito hasta penetrar en el interior del citoplasma atravesando tanto la ZP como la membrana. Antes de introducir el espermatozoide hay que asegurarse de que realmente se está en el interior del ovocito aspirando si es necesario parte del citoplasma y comprobando que realmente las membranas se han roto. A continuación se deposita suavemente el espermatozoide intentando no arrastrarlo hacia fuera al sacar la micropipeta y dejar la menor cantidad posible de PVP dentro del citoplasma ya que es tóxico para el ovocito (Fig. 14). Figura 14.- Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) Se microinyectan uno por uno, cada ovocito con un espermatozoide, anotando cualquier característica destacable del ovocito o cualquier incidencia ocurrida durante 61 MATERIAL Y MÉTODOS el proceso. Una vez que se han microinyectados todos los ovocitos de una paciente se trasladana una placa de cultivo nueva, formada por microgotas de un nuevo medio de cultivo, en nuestro caso G-1™ PLUS suplementado con HSA (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden) y equilibradocubierto con OVOIL™ (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden),y se separa cada ovocito en una gota para poder seguir su evolución individualmente. La placa debe mantenerseen la incubadora a 37°C, 6% de CO2y 95% de humedad hasta la valoración de la fecundación. 9. EVALUACIÓN DE LOS EMBRIONES La evaluación de la fecundación se realiza al día siguiente (día+1) en un intervalo que va desde las 16 a las 19 horas post-microinyección. La visualización en este estadio, estadio de zigoto, permite desechar aquellos ovocitos que no hayan fecundado o aquellos que presentan una fecundación anómala. Los zigotos que presenten signos claros de una fecundación correcta, es decir en los que se visualicen claramente 2 pronúcleos (PN) y 2corpúsculos polares (CP) se pasan a una nueva placa de cultivo. La evaluación y clasificación de los embriones en los distintos estadios evolutivos se ha realizado siguiendo los criterios que estableceLa Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción (ASEBIR 2007). La valoración de distintos parámetros que se analizan en el caso de los zigotos no influye en la catalogación final, únicamente se tendrá en cuenta para establecer diferencias a la hora de elegir entre embriones que luego tengan la misma calidad el día de la transferencia que es cuando realmente hay que dar una clasificación definitiva. ASEBIR establece como criterios favorables en día +1 la presencia de halo citoplasmático y la división temprana (la aparición de un preembrión con dos blastómeras iguales que no presenten multinucleación y sin fragmentación entre 25 y 27 horas post-microinyección) y como aspectos desfavorables la presencia de un sólo precursor nucleolar, que los pronúcleos estén separados y que tengan tamaño desigual. Una vez analizados los zigotos y preembriones y registradas las características morfológicas de cada uno de ellos se mantienen en la incubadora hasta la siguiente valoración. 62 MATERIAL Y MÉTODOS La evaluación en día +2 debe realizarse en un intervalo de observación que debe estar entre las 44 y las 47 horas post-inseminación. Los embriones en día +2 se clasifican en cuatrocategorías (Fig. 15): - embriones de grado 1 o calidad A: son los de mejor calidad y por tanto los que tienen mayores probabilidades de implantación. Para poder estar incluidos en esta categoría los embriones deben tener 4 células iguales o de tamaño semejante sin vacuolas ni multinucleación, si presentan fragmentación esta no puede superar del 10% del volumen total del embrión y la zona pelúcida tiene que ser normal. - embriones de grado 2 o calidad B: son aquellos que siguen siendo de buena calidad pero tienen una capacidad de implantación inferior a los de grado 1. Pertenecen a esta categoría todos los embriones que presenten de 2 a 5 células (mejor calidad los de 5 células que los de 2) iguales o semejantes, sin multinucleación ni vacuolas, cuya zona pelúcida sea normal y que muestren una fragmentación comprendida entre el 11% y el 25%. También se incluyen en esta categoría los embriones, que aún teniendo 4 células, no se puedan incluir en la categoría 1 por presentar una fragmentación superior al 10%. - embriones de grado 3 o calidad C: son embriones de calidad intermedia y con potencial de implantación por debajo de los de las categorías anteriores. Los embriones de esta categoría tienen que tener 2, 4 o 5 células (si presentan un porcentaje de fragmentación de entre el 26 y el 35%) o bien 3 o 6 (mejor 6 células que 3); si aparecen fragmentos, su proporción no debe superar el 35%, ni ser de tipo IV. Las células no deben presentar multinucleación. Siempre que en el embrión aparezcan células distintas, vacuolas escasas o que la zona pelúcida sea anormal lo encuadraremos en esta categoría. - embriones de grado 4 o calidad D: son los de peor calidad y por lo tanto poseen una capacidad implantatoria baja. Corresponden a esta categoría los embriones que tienen 1 o más de 6 células, o bien 3 células semejantes y todos aquellos que independientemente del número de células que presenten tengan vacuolas abundantes, una fragmentación superior al 35% o del tipo IV, multinucleación o anillo acitoplasmático. 63 MATERIAL Y MÉTODOS Los embriones de día +3 también se clasifican en cuatro categorías(Fig. 15): - embriones de grado 1 o calidad A: pertenecen a esta categoría los embriones que presentan 7 u 8 células (siempre que provengan de un embrión de 4 células en día +2). Tienen que tener como máximo un 10% de fragmentación celular, sus células tienen que ser iguales o semejantes y sin multinucleación ni vacuolización y la zona pelúcida debe ser normal. - embriones de grado 2 o calidad B: en este grupo están los embriones que tienen 7 células o más (si han evolucionado a partir de un embrión de 2 o 5 células en día +2) y aquellos que poseen 9 células o más (si tenían 4 células en día +2). Estos embriones tienen entre un 11 y un 25% de fragmentación, las células como en el grupo anterior también tienen que ser iguales o semejantes, no deben tener ninguna célula multinucleada, ni vacuolas y su zona pelúcida tiene que ser normal. - embriones de grado 3 o calidad C: se incluyen en esta clase aquellos que están formados por 7 células o más (derivados de embriones de 2, 4 o 5 células en día +2), 6 células (formados a partir de embriones de 2 células o de 4 en día +2), 8 o más células (resultado de embriones con 6 células en día +2) y 6 células o más (originados a partir de embriones de 3 células en día +2). En este grupo la fragmentación oscila entre el 26 y el 35%. Incluiremos en esta categoría a los que presenten desigualdad en el tamaño de sus células, vacuolas escasas y su zona pelúcida sea anormal. -embriones de grado 4 o calidad D: formado por embriones que en día + 2 ya tenían 6 células (independientemente de las células que tengan en día +3), embriones con 5 células o menos (independientemente del número de células que tuvieran en día + 2) y embriones que sólo hayan aumentado 1 célula en el paso de día +2 a +3. Pertenecen a esta clase todos los embriones que tengan una fragmentación superior al 35% o esta sea de tipo IV, presenten multinucleación, vacuolas abundantes o anillo acitoplasmático. 64 MATERIAL Y MÉTODOS Calidad asignada si transf. D+2 Nº cels D+3 Calidad asignada si transf. D+3 B 3 cel 4 cel 5 cel 6 cel 7 cel 8 cel D D D C B B % frag D+2 o D+3 A..........< 10% B........... 11-25% C........... 26-35% D..........> 35% D...........tipo IV 4 cel 5 cel 6 cel 7 cel 8 cel 9 cel Cualquier valor D D C C C C D Vacuolas A.........no B.........no C.........escasas D........abundantes A 5 cel 6 cel 7 cel 8 cel 9 cel 10 cel D C A A B B 5 cel B 6 cel 7 cel 8 cel 9 cel 10 cel D B B B B 6 cel C 7 cel 8 cel 9 cel 10 cel 11 cel D C C C C >6 cel D Cualquier valor D Nº cels D+2 2 cel 3 cel 4 cel 2 pequeñas 1 grande C 3 iguales D Modificar asignación a la baja si: Multinucleación A.........no B.........no C.........no D........Cualquier multinucleación Semejanza (2 ; 4 ; 8 ; 16) A.......iguales o semejante C..... diferentes ZP A.....normal B.....eclosion C.....anormal Anillo acitoplasmático D+3 D Asignar la letra mas baja Figura 15.- Esquema de gradación de la calidad embrionaria (ASEBIR, 2007) Es imprescindible hacer evaluaciones seriadas de la evolución de los preembriones para poder clasificarlos correctamente y esto implica mantenerlos durante cierto tiempo fuera de la incubadora. Hay que minimizar al máximo el tiempo de observación e intentar retornarlos lo antes posible a las condiciones óptimas de cultivo para disminuir lo máximo posible los efectos nocivos que puedan afectar a su evolución. 10. TRANSFERENCIA EMBRIONARIA Una vez analizados y clasificados todos los embriones de la paciente se decide el número de embriones a transferir y el resto se crioconservan. La elección del número de embriones a transferir es un asunto complejo, decidido por el ginecólogo y consensuado con la pareja. Siempre se transfieren los embriones de mejor calidad pero el número va a depender de muchos factores como la edad de la paciente, si ha tenido transferencias anteriores, el número y la calidad de los embriones transferidos en otras ocasiones, la calidad y el número de los embriones que tenemos para transferir, la presencia de alguna patología o enfermedad, etc. Una vez decidido el número de embriones a transferir hay que eligir los que tienen mejor 65 MATERIAL Y MÉTODOS calidad para separarlos del resto y pasarlos a una placa de transferencia, en nuestro caso, con medio G-2™ PLUS suplementado con HSA (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden) cubierto con OVOIL™ (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden), y se mantiene en la incubadora hasta el momento de cargarlos en el catéter de transferencia. La transferencia embrionaria se realiza, como en el caso de la punción folicular, en el quirófano contiguo al laboratorio. Se sacan los embriones de la incubadora, se lavan en medio G-2™ PLUS suplementado con HSA (Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden) limpio y se cargan en un catéter de transferencia previamente lavado con el mismo medio en un volumen de medio muy pequeño. Los catéteres que utilizamos son de dos tipos, GYNETICS Emtrac A o GYNETICS Emtract Set (GYNETICS®, Gynetics Medical Products N.V., Lommel, Belgium). La transferencia se realiza, una vez limpio el cervix y eliminado el moco, introduciendo el catéter con los embriones a través del cuello y depositándolos cuidadosamente en el útero guiándose por una ecografía abdominal. Una vez realizada la transferencia se comprueba en el laboratorio que no ha quedado ningún embrión retenido en el catéter, en caso contrario se lavan los embriones en medio limpio y se carga un nuevo catéter para repetir el proceso, hasta estar seguros de que todos los embriones están dentro de la cavidad uterina. La fase lútea se mantiene suministrando a las pacientes óvulos de progesterona (Utrogestan®; Seid S.A., Barcelona, España) (Progeffik®; Effik, Madrid, España) por vía vaginal a una dosis de 400 mg cada 12 h comenzando su administración el día de la punción folicular y manteniéndola hasta la menstruación, si no se produce gestación, o durante las 12 primeras semanas de embarazo. Los embarazos se diagnosticaron por un aumento de la concentración de ß-hCG en orina a los 14 días post-transferencia, que posteriormente se confirmará en sangre y por la presencia de saco gestacional intrauterino con latido positivo verificado por ecografía vaginal. 11. CRIOPRESERVACIÓN EMBRIONARIA Los embriones viables que no se han transferido se conservan para poder utilizarlos en futuros intentos, en caso de no lograr un embarazo con la transferencia de embriones “en fresco”. Para conservar los embriones es necesario criopreservarlos 66 MATERIAL Y MÉTODOS y almacenarlos a temperaturas muy bajas utilizando equipos especiales. Los embriones que se van a criopreservar se tienen que describir exhaustivamente en la hoja de congelación, detallando de la manera más precisa posible todas sus características morfológicas (número de células, porcentaje de fragmentación, presencia de vacuolas, multinucleación, aspecto de ZP, etc.). La criopreservación se realizó siguiendo en protocolo lento, utilizando el kit comercial (FREEZE-KIT 1™, Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden) que consta de tres soluciones. Preparamos una placa de cuatro pocillos Nunclon™ Delta (NUNC®, Roskilde, DenmarK), en el pocillo número uno ponemos 0,7 ml de la solución de congelación 1, en el dos 0,7 ml de la solución número 2 y en el tres 0,7 ml de la 3, los pasos se realizaron siguiendo las indicaciones del fabricante: - La solución 1 (Cryo-PBS) está compuesta por: CryoPBS + 25mg/ml HSA + penicilina G. Cuando introducimos los embriones que vamos a criopreservar en esta solución hay que observar y registrar todos los datos relativos a su morfología. Los embriones deben permanecer en esta solución entre 2 y 5 minutos. - La solución 2 o Embryo freezing solution 1 (EFS-1) está compuesta por: CryoPBS + 1.5 M 1,2 Propanediol. Las células de los embriones al entrar en contacto con esta solución se retraen al expulsar agua para intentar equilibrar las altas concentraciones de solutos extracelulares del medio y posteriormente se hinchan cuando el crioprotector penetra en el interior de las células. En esta solución tienen que estar un tiempo no inferior a 10 minutos y no superior a 20 minutos. - La solución 3 o Embryo freezing solution 2 (EFS-2) está compuesta por: CryoPBS + 1.5 M 1,2-Propanediol + 0.1 MSucrose. Es la solución final y una vez que se pasan los embriones a esta solución se cargan directamente sin tener que permanecer nada más que el tiempo necesario para introducirlos dentro de la pajuela de congelación que es el receptáculo en el que se mantendrán mientras permanezcan criopreservados. Para cargar la pajuela es necesario aspirar primero un poco de medio de congelación (EFS-2) a continuación introducir aire para hacer una burbuja, seguidamente entran los embriones sumergidos en una pequeña cantidad de medio, para aislarlos se vuelve a hacer otra burbuja de aire, continuamos con una mínima 67 MATERIAL Y MÉTODOS cantidad de medio (donde se realizará el seeding durante el proceso de congelación) y se termina con aire hasta llenarla por completo. Los embriones quedan en un volumen pequeño de medio y flanqueados por dos burbujas de aire, una a cada lado, que los aíslan y evitan la posibilidad de que puedan desplazarse por la pajuela. Una vez cargada cada pajuela se sella por los dos extremos utilizando una selladora eléctrica que combina presión y calor. De esta manera el extremo por el que están los embriones queda herméticamente cerrado para evitar la pérdida de material y las posibles contaminaciones en el banco de embriones. El extremo opuesto que también tiene que quedar selladolleva un identificador de color en el que aparecen los datos de la paciente (Nombre, número de historia, número de embriones que contiene la pajuela, etc.). Una vez preparadas todas las pajuelas (cargadas con los embriones y selladas), para criopreservarlas se utilizan congeladores programables que controlan rigurosamente el descenso de la temperatura mediante un programa informático. Los embriones se sitúan en una cámara dentro del congelador a la que van entrando pulsos de vapores de nitrógeno líquido (N2) desde un depósito a demanda del programa de congelación y así, va descendiendo la temperatura de los embriones según las indicaciones del programa hasta su completa crioconservación. Una vez que ha finalizado el programa de congelación los embriones se sumergen en N2, a -196°C, dentro de los bancos de embriones, donde se conservan hasta su posterior utilización. Los sistemas de almacenamiento de embriones constan de varios compartimentos para facilitar la localización de los embriones. Un banco de embriones contiene un número variable de recipientes que están numerados llamados canister y dentro de ellos hay otros receptáculos más pequeños, los gobelets, de colores diferentes donde se almacenan las pajuelas, cada una con su identificador de color y los datos de la paciente. De esta manera cada pajuela tendrá un código formado por colores y números que sólo tendrá ella (Ubicación de cada embrión: nº del banco, nº/color del canister, color del gobelet y color de la pajuela). Si no se ha tenido éxito con la transferencia de embriones en fresco y la pareja posee embriones criopreservados estos se utilizan para una nueva transferencia. Se 68 MATERIAL Y MÉTODOS prepara el endometrio de la paciente con un tratamiento hormonal con estrógenos hasta confirmar ecográficamente un endometrio de más de 7 mm de aspecto proliferativo, o con el simple seguimiento ecográfico del ciclo natural . Una vez confirmada la proliferación endometrial adecuada se continúa con gestágemos durante 2 o 3 días antes de la fecha prevista para la transferencia y así asegurar un endometrio secretor. Para poder realizar la transferencia es necesario retornar a los embriones a las condiciones fisiológicas, es decir a las que tenían antes de su crioconservación. La descriopreservación se realizó siguiendo también el protocolo lento, utilizando el kit comercial complementario al de criopreservación (THAW-KIT 1™, Vitrolife Sweden AB Göteborg, Sweden). Preparamos una placa de cuatro pocillos Nunclon™ Delta (NUNC®, Roskilde, DenmarK), en cada ponemos 0,7 ml de cada una de las cuatro soluciones y se siguieron los pasos y los tiempos recomendados por el fabricante según el siguiente esquema: -Una vez localizada, extraer la pajuela del nitrógeno líquido, manteniéndola a temperatura ambiente durante 30 segundos e introducir en un baño a 30°C durante otros 45 segundos. -La solución 1 o Embryo thawing solution 1 (ETS-1) está compuesta por:CryoPBS + 1.0 M 1,2-Propanediol+ 0.2 MSucrose. Sumergir y mantener los embriones entre 1 y 5 minutos en esta solución. -La solución 2 o Embryo thawing solution 2 (ETS-2) está compuesta por:CryoPBS + 0.5 M 1,2-Propanediol+ 0.2 MSucrose. Introducir los embriones durante un tiempo de entre 2 y 5 minutos. -La solución 3 o Embryo thawing solution 3 (ETS3) está compuesta por:CryoPBS+ 0.2 MSucrose. Los embriones deben permanecer en este medio entre 5 y 10 minutos. -La solución 4 (Cryo-PBS) está compuesta por:CryoPBS + 25mg/ml HSA + penicilina G. El tiempo que permanezcan dentro de esta solución tiene que ser entre 5 y 10 minutos. -Los embriones que tengan un porcentaje de células intactas pot- congelación/descongelación ≥ al 50% se podrán transferir si la transferencia se hace el mismo día de la descongelación. El resto de embriones, los que tengan más porcentaje 69 MATERIAL Y MÉTODOS dañado, se descartarán. Si la transferencia está programada para el día siguiente se dejaran en una placa de cultivo y se evaluarán al día siguiente para transferir únicamente los embriones que hayan evolucionado y se hayan dividido, el resto se desechará. La técnica de criotransferencia es idéntica, tanto a nivel del laboratorio como a nivel del ginecólogo en el quirófano, a la utilizada para transferir embriones en fresco. De igual modo, también son idénticos el tratamiento y las recomendaciones posteriores. 12. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para la realización de los análisis estadísticos se ha utilizado el programa informático SPSS (IBM SPSS Statistics for Windows, Version 22.0. Armonk, NY). Se usaron tests paramétricos o no paramétricos según las variables analizadas siguieran o no una distribución normal, para lo cual se aplicó previamente la prueba de Kolmogorov-Smirnov. La asociación entre variables se llevó a cabo mediante la prueba de Chi cuadrado (χ2) (con la corrección de Yates cuando fue necesario) o el test exacto de Fisher. Para la comparación de medias se utilizó la t de Student, la U de Mann-Witney, test de comparación de proporciones (Prueba Z) o Análisis de Varianza (ANOVA). Las curvas ROC se determinaron para calcular la utilidad diagnóstica de la fragmentación en el ADN espermático. Para la correlación entre variables se utilizó el test de correlación lineal (r) de Pearson. Para el análisis de los factores que afectaban al éxito de embarazo se realizó un test de regresión logística multivariante. En todos los casos, los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando el valor P fue menor de 0,05 (P<0,05). 70 RESULTADOS RESULTADOS 1. ANÁLISIS DESCRIPTIVO La población estudiada está formada por 41 parejas que fueron sometidas a un ciclo de Fecundación in Vitro utilizando la técnica de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Analizando las indicaciones clínicas por las que estas parejas se sometieron a un tratamiento de ICSI encontramos que el 34,15% corresponde a causas femeninas, el 17,07% a causas masculinas y el 48,78% a causas mixtas. 1.1. ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE LOS VARONES El 65,85% de las parejas se sometieron al ciclo de ICSI por indicación únicamente masculina o por indicación mixta. En la Tabla 4 se muestra un resumen de las características de los varones, indicándose los valores medios de los parámetros más importantes del seminograma.En todos los casos en los que en la indicación estuvo presente el factor masculino se debió a alteraciones en uno o más de un parámetro del seminograma básico realizado antes de decidir el tipo de tratamiento que se debía ofertar a esa pareja en particular. La edad media de los varones estudiados fue de 38,51 ± 0,94 [24,5-51,4] años. Al analizar los antecedentes urológicos de estos pacientes se encontró un porcentaje de pacientes con varicocele del 9,76%. En cuanto a los hábitos tóxicos se analizó el consumo de tabaco y se obtuvo un porcentaje de fumadores del 46,34%. Las muestras utilizadas en el estudio fueron analizadas el mismo día en el que se iban a utilizar. Se realizó un seminograma a los 41 pacientes analizados, el 19,51%de ellospresenta todos los valores de los parámetros del seminograma dentro de la normalidad, catalogándose como muestras normozoospérmicas. El 80,49%restante presentó uno o varios de estos parámetros alterados. Dentro de este grupo el 18,92% corresponde a alteraciones únicas. De estas muestras que presentan un único parámetro alterado, más de la mitad, el 57,14%, presenta alteraciones la motilidad espermática (astenozoospermia), el 28,57% corresponde a 73 RESULTADOS una alteración en la morfología (teratozoospermia) y el 14,29 restante no alcanza la concentración de espermatozoides necesaria para llegar a la normalidad (oligozoospermia). El resto de las muestras alteradas tenían valores alterados en dos o más parámetros del seminograma. El volumen medio de eyaculado fue de 2,67± 0,14 [0,5-4,5] ml. La concentración media de espermatozoides en la muestra fue de 51,1± 6,3 [4,6 143]x106 espermatozoides/ml. El porcentaje medio de motilidad progresiva (a+b)fue del 31,83 ± 1,9 [10 - 50] %. La media ponderada del porcentaje de espermatozoides con morfología normalfue de 13,82 ± 1,60 [2 - 45] % de espermatozoides. Todas las muestras analizadas fueron procesadas mediante la técnica de preparación espermática denominada swim-up. A partir de esta se recuperan los espermatozoides de mejor calidad que serán los que se empleen para la TRA, en este estudio fue en todos los casos ICSI. La media de espermatozoides recuperados tras swim-up fue de 6,1± 1,2 [0,5-38] x106espermatozoides/ml. El porcentaje medio de fragmentación basal de estas muestras, es decir, el calculado antes de su preparación, pre swim-up, fuede 31,83 ± 2,97 [5,50-95,20] % de espermatozoides fragmentados. Seanalizaron también los porcentajes de fragmentación de ADN espermático en cada una de estas muestras después de ser procesadas, es decir, post swim-up. La media de fragmentación de las muestras una vez preparadas fue de 10,03 ± 1,83 [0,10-8,90] % de espermatozoides fragmentados. 74 RESULTADOS Variables Media ± ST Rango 38,51 ± 0,94 25-51 51,1± 6,3 4,6 - 143 2,67 ± 0,14 0,5 - 4,5 6,1 ± 1,2 0,5 - 38 Motilidad progresiva (%) 31,83 ± 1,91 10 - 50 Formas normales (%) 13,82 ± 1,60 2 - 45 Fragmentación basal (%) 31,83 ± 2,97 5,5 - 95,2 Fragmentación tras swim-up (%) 10,03 ± 1,83 0,1 - 8,9 Edad Concentración de espermatozoides (x 106/ml) Volumen medio eyaculado (ml) REM(x 106/ml) Variables Porcentaje Antecedentes urológicos (%) 9,76 Consumo de tabaco (%) 46,34 Pacientes normozoospérmicos (%) 19,51 Tabla 4.- Análisis descriptivo de las características biológicas y seminales de los varones de la serie. 1.2. ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE LAS MUJERES Y DEL CICLO ICSI Las mujeres estudiadas tenían una edad media de 34,38 ± 0,71 [20,9 – 39,9] años.La mayoría de las pacientes, el 53,66%, se sometían por primera vez a un ciclo de Fecundación In Vitro. Para el 24,39% este era su segundo ciclo, era el tercero para el 17,07% y para el 4,88% restante era la cuarta vez que lo intentaban. La media de folículos mayores de 16 mm, que son los que teóricamente son susceptibles de punción, de nuestras pacientes es de 9,12 ± 0,82 [0-28] folículos. La media de valores máximos de estradiol sérico, E2 o 17β-estradiol, alcanzados al final de la estimulación ovárica en nuestras pacientes fue de 2809,54 ± 151,33 [9424638] pg/ml. Se puncionan un total de 472 folículos; la media de folículos puncionados es de 11,51 ± 0,559 [7-21] folículos/paciente. 75 RESULTADOS De los 472 folículos puncionados se obtienen 355 ovocitos en total, lo que equivale al 75,21% de los folículos puncionados. Se obtuvo una media de 8,66 ± 0,41 [4-16] ovocitos/paciente. Los ovocitos obtenidos estaban en distintos estadios madurativos. Para poder realizarICSI es necesario que el ovocito que se vaya a utilizar esté en un estadio madurativo concreto, en metafase de la segunda división meiótica, metafase II (MII) teniendo que descartar todo el resto de gametos femeninos que se encuentren en cualquier otra fase de división. De los 355 ovocitos obtenidos, 276 ovocitos, es decir el 77,75%, tenían el grado madurativo correcto. La media por paciente es de 6,73 ± 0,36 [3-12] ovocitos MII. Se dividió la población femenina en dos grupos, mujeres de buen o de mal pronósticopara el análisis de los resultados del ciclo ICSI. El grupo de mujeres de buen pronóstico (mujeres con reserva ovárica normal o riesgo de hiperrespuesta) está formado por aquellas pacientes que tenían una edad menor de 38 años, un recuento de folículos antrales de más de 7, una FSH basal < 10 mUI/ml. o que no habían tenido resultados desfavorables en ciclos previos. El grupo de mujeres de mal pronóstico lo constituyen aquellas que no cumplían dichos criterios.No se siguieron de forma estricta los criterios de Bolonia puesto que el estudio se hizo antes de la aparición de dicho consenso y porque se incluyen también pacientes potencialmente bajas respondedoras que logran una respuesta folicular adecuada con un protocolo de estimulación específico para bajas respondedoras. Este segundo grupo fue estimulado con dosis altas de gonadotropinas (FSH y acción LH) en protocolo con antagonistas GnRH. De nuestra serie, 23 mujeres (56%) fueron incluidas en esta categoría de peor pronóstico y, las restantes 18, en la de bueno. 1.3. ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE RESULTADOS DEL CICLO ICSI Para valorar el resultado de los ciclos, son utilizaron los siguientes indicadores: tasa de fecundación, calidad embrionaria, tasa de implantación y tasa de gestación. Se define tasa de fecundación como elcociente entre el número de zigotos obtenidos y el número de ovocitos MII inseminados o microinyectados expresado en 76 RESULTADOS tanto por ciento.Se define tasa de implantación como elcociente entre el número de sacos gestacionales y el número de embriones transferidos. La variable calidad embrionaria se refiere a las características morfológicas de los embriones que determinan su potencial implantatorio, como se explicó en el apartado Material y métodos.La tasa de embarazo o de gestación utilizada en este estudio, corresponde a la tasa de gestación por transferencia que se define como elcociente entre el número de embarazos clínicos y el número de transferencias realizadas. En este estudio se utilizó en el 100% de los casos elICSI como TRA. Por lo tanto se microinyectaron 276 ovocitos MII, que habían extruido el corpúsculo polar y por lo tanto habían alcanzando el estadio correcto de maduración. Los embriones correctamente fecundados son aquellos que presentan 2 pronúcleos en el interior del citoplasma, uno de origen materno y otro paterno y dos corpúsculos polares localizados en el espacio perivitelino. Cuando la TRA que se utiliza esel ICSI, la presencia de 2PN y 2 CP tiene que observarse en un rango estricto de tiempo que va desde las 16 a las 19 horas postICSI. La tasa media de fecundación fue del 57,24%, es decir, 158 de esos 276 ovocitos, con una tasa media de fecundación por mujer de 57,44 ± 4,38 de MII microinyectados presentaban los signos de fecundación correcta 2PN y 2 CP. Encontramos fallo total de fecundación en el 7,32% de las pacientes analizadas. El 96,2% de los ovocitos fecundados evoluciona correctamente, el otro 3,8% que no lo hacey, por lo tanto, se desecha. Se analiza por lo tanto la evolución de 152 embriones que se desarrollan y evolucionan correctamente hasta el momento en que se decide su destino, transferencia o criopreservación. Los embriones obtenidos se clasificaron siguiendo los criterios de ASEBIR en cuatro categorías (G1, G2, G3 y G4) de menor a mayor calidad y potencial implantatorio. Los embriones analizados en este estudio se distribuyen en las categorías anteriores de la siguiente manera: 9 embriones de grado 1 (5,92%), 57 embriones de grado 2 (37,5%), 59 embriones de grado 3 (38,82%) y 27 embriones de grado 4 (17,76%). Agrupando los embriones en 2 categorías principales, “embriones 77 RESULTADOS buenos” (G1+G2) y “embriones no buenos” (G3+G4); tendemos 66 embriones (43,42%) y 86 embriones (56,58%) respectivamente. El destino de estos embriones puede variar entre la transferencia a 2 o 3 días después de la punción o bien la criopreservación de los mismos. A todas las pacientes del estudio que tenían embriones(92,68%) se les ha realizado una transferencia, en día+2 o +3 tomando como día 0 el día de la punción folicular; el otro 7,32% corresponde a las pacientes en las que se ha producido un fallo de fecundación y por lo tanto no hemos obtenido ningún embrión. Se han transferido un total de 87 embriones (57,24%) en 38 transferencias. Se transfirieron 9 embriones de grado 1 (10,34%), 43 embriones de grado 2 (49,43%), 22 embriones de grado 3 (25,29%) y 13 embriones de grado 4 (14,94%). Agrupándolos en dos categorías principales tenemos 52 embriones G1 + G2 (59,77%) y 35 embriones G3 + G4 (40,23%). De esas transferencias el 10,53% corresponde a transferencias de 1 único embrión, al ser el único embrión que teníamos no se trata de transferencias electivas. En la mayoría de los casos (50%) se transfirieron 2 embriones, en este grupo el 89,47% corresponde a una transferencia electiva porque contábamos en con más de 2 embriones y pudimos elegir los 2 mejores para transferir, en el 10,53% restante la transferencia se realizó de los únicos 2 embriones de los que disponíamos. El 39,47% de las transferencias fueron de 3 embriones, de ellas el 66,66% fueron no electivas y en el resto (33´33%) se pudo elegir entre más de 3 embriones los mejores para transferir. Del total de transferencias, el 57,89% eran transferencias electivas, pudimos elegir los mejores embriones porque contábamos con más embriones de los que se decidió transferir para elegir. Los 65 embriones que no se transfirieron (42,76%) se criopreservaron para poder ser utilizados en criotransferencias en el caso de no obtener embarazo. Se consiguió embarazo clínico en 12 de las 38 transferencias embrionarias realizadas (31,58%), únicamente 1 paciente tuvo un embarazo bioquímico (2,63%). De los embarazos obtenidos el 75% son gestaciones únicas, el 25% corresponde a gestaciones gemelares y el porcentaje de embarazos triples es del 0%. La tasa de 78 RESULTADOS abortos fue del 8,33%, sólo uno embarazo único finalizó en aborto. Se transfieren en total 87 embriones, 4 de ellos se transfirieron en 4 transferencias no electivas de un embrión único. Se realizaron 19 transferencias de 2 embriones transfiriendo un total de 38 embriones. El resto, 45 embriones se transfirieron en 15 transferencias de 3 embriones cada una (triples). La tasa de implantación total es del 17,4%, la tasa de implantación media por paciente fue de 19,30 ± 5,17. De las mujeres a las que se realiza una transferencia de un único embrión se embaraza el 25%, el 42,10% de las pacientes a las que se transfieren 2 embriones y el 20% de las mujeres con transferencia de tres embriones. El 11,11% de los embarazos únicos provienen de una transferencia única, el 66,66% de una transferencia doble y el 22,22% de una triple. De los embarazos gemelares, el 66,66% es consecuencia de una transferencia doble y el 33,33% de una triple. No se transfirieron el 42,76% de los embriones, debido a un excedente de los mismos,se contaba con más embriones de los que se decidió transferir; en ningún caso se anuló la transferencia teniendo embriones disponibles. Todos los embriones que no se transfirieron en el ciclo se criopreservaron. El 53,66% de las pacientes de este estudio criopreservaron embriones.El 18,60% de ellos se dañó durante el proceso de congelación/descongelación y se desechó, como consecuencia del total de embriones descriopreservados se recuperaron 35 embriones viables que se pudieron transferir; únicamente en 2 mujeres no se pudo realizar la criotransferencia porque ningún embrión era viable al final del proceso de descriopreservación. La tasa de supervivencia embrionaria post criopreservación fue del 81,40%. Se realizaron 16 criotransferencias con resultado de 2 gestaciones clínicas (12,5%), una única y otra gemelar y una gestación bioquímica (6,25%). La tasa de implantación de estos embriones fue del 8,57%. El 36,36% de las pacientes que criopreservaron siguen manteniendo 1 o varios embriones que han quedado almacenados en nuestro banco, forman un total de 22 embriones que pertenecen a 8 pacientes; de esas mujeres el 75% consiguió un embarazo en la transferencia de embriones que llegó a término. El resumen de todos estos resultados se muestra en la tabla 5. 79 RESULTADOS Variables Media ± ST Rango Edad 34,46 ± 0,71 20,9-39,9 Ovocitos recuperados/paciente 8,66 ± 0,41 4-16 Ovocitos MII/paciente 6,73 ± 0,36 3 - 12 Embriones obtenidos/paciente 3,71 ± 0,32 0-8 Tasa media de fecundación 57,44 ± 4,38 0 - 100 Tasa media de implantación 19,30 ± 5,17 0 - 100 Variables Valor Embriones G1 + G2/embriones totales (%) 43,42 Tasa de gestación/transferencia (%) 31,58 Tabla 5.- Análisis descriptivo del ciclo de ICSI 2. ANÁLISIS DE LOS PARÁMETROS DEL SEMINOGRAMA Y CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DE LOS VARONES 2.1. NORMOZOOSPERMIA Los pacientes se dividieron en dos grupos según su edad, un primer grupo lo formaron los pacientes más jóvenes, con edades inferiores a 40 años y el otro grupo los varones con 40 años o más. Al comparar los pacientes que son normozoospérmicos, sin alteraciones de los parámetros seminales, y los que no lo son no se observan diferencias significativas entre los dos grupos de edad. Sin embargo, al analizar la posible repercusión del hábito de fumar sobre la calidad de la muestra espermática se encuentran diferencias significativas entre los varones fumadores y no fumadores. Los pacientes que fuman tienen alguno de los parámetros del seminograma alterado en un porcentaje significativamente mayor que aquellos que no lo hacen (P= 0,03) (Tabla 6). 80 RESULTADOS ≥ 40 años < 40 años Normo N N Sí 1 7 No 13 20 Total 14 27 P 0,15 No fumador Fumador N N 7 1 15 18 22 19 P 0,03 Tabla 6.- Varones normozoospérmicos en relación con la edad y el consumo de tabaco 2.2. ALTERACIONES EN LOS PARÁMETROS DEL SEMINOGRAMA (oligozoospermia, astenozoospermia y teratozoospermia) En este apartado se han realizado las comparaciones de las principales alteraciones de los parámetros del seminograma (Volumen y concentración espermática, movilidad progresiva y morfología espermática) estableciendo los grupos de pacientes de la serie analizada con oligozoospermia, astenozoospermia y teratozoospermia, respectivamente, en relación con la edad y consumo de tabaco. Al estudiar la relación entre la edad de los pacientes masculinos conoligozoospermia y sin ella no existieron diferencias significativas para ninguno de los dos grupos de edad, mayores y menores de 40 años.Del mismo modo, al realizar esta comparación con los datos referentes alconsumo de tabaco,entre los pacientes oligozoospérmicosy los que tienen muestras con una concentración normal de espermatozoides nose encuentran diferenciasestadísticamente significativas(Tabla 7). ≥ 40 años < 40 años Oligo N N Sí 3 10 No 11 17 Total 14 27 P 0,30 No fumador Fumador N N 8 5 14 14 22 19 P 0,49 Tabla 7.- Varones oligozoospérmicos en relación con la edad y el consumo de tabaco 81 RESULTADOS Si se hace referencia a aquellas alteraciones que afectan a la motilidad espermática (astenozoospermia) y se comparan los dos grupos de edad, no se encuentran diferencias significativas en este grupo de pacientes en relación con dicho parámetro. Si se realiza una comparación similar acerca de la relación del hábito de fumar y la existencia o no de alteraciones en la motilidad espermática, se observan diferencias significativas entre el grupo de fumadores y el de no fumadores (Tabla 8). ≥ 40 años < 40 años Asteno N N Sí 12 21 No 2 6 14 27 Total P 0,54 No fumador Fumador N N 15 18 7 1 22 19 P 0,03 Tabla 8.- Varones astenozoospérmicos en relación con la edad y el consumo de tabaco Finalmente, al comparar las alteraciones de la morfología espermática que establece la categoría de varones teratozoospérmicos en relación con la población de hombres menores de 40 años y la de los varones de 40 años o más, no encontramos diferencias significativas entre los pacientes de los dos grupos de edad.Del mismo modo, los hombres fumadores y no fumadores se distribuyen de manera similar en los dos grupos, el grupo de teratozoospérmicos y el grupo de los que no lo son, no existiendo diferencias significativas entre ellos(Tabla 9). 82 RESULTADOS ≥ 40 años < 40 años Terato N N Sí 9 18 No 5 9 14 27 Total P 0,87 No fumador Fumador N N 14 13 8 6 22 19 P 0,74 Tabla 9.- Varones teratozoospérmicos en relación con la edad y el consumo de tabaco 2.3. RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES MÓVILES (REM) Después de realizar el swim-upse calculó el REM dividiendo la población de hombres en tres grupos distintos según el REM obtenido, el primero incluye a los pacientes en los que se recupera menos de 1x106 espermatozoides móviles, el segundo contiene a aquellos en los que el REM está comprendido entre 1 y 5x106 espermatozoides móviles recuperados y en el último están los varones en los que se recuperan más de 5x106 espermatozoides móviles. Al analizar los datos obtenidos (Fig. 16)en relación con los dos grupos de edad establecidos no se encuentrandiferencias significativas en el número de espermatozoides móviles recuperados. En relación al valor medio de REM las diferencias que se encuentran entre los dos grupos no son estadísticamente significativas. En relación con el consumo o no de tabaco las diferencias de REM igualmente no fueron significativas (Tabla 10). ≥ 40 años < 40 años REM (x 106) N N <1 1 4 1-5 7 16 >5 6 7 Media ± SE 7,7 ± 0,59 5,3 ± 0,44 Rango 0,75 - 38 0,5 - 30 Total 14 27 No fumador Fumador P 0,49 0,35 N N 4 1 13 10 5 8 5,5 ± 0,49 6,8 ± 0,52 0,5 - 38 0,5 - 30 22 19 P 0,26 0,6 Tabla 10.- REM y sus valores medios en relación con la edad y el consumo de tabaco. 83 RESULTADOS Figura 16.- Gráfica de dispersión de REM respeco a edad y consumo de tabaco. 2.4. CORRELACIONES ENTRE LOS PARÁMETROS SEMINALES. Se realizaron las comparaciones cruzadas para correlacionar entre sí, los distintos parámetros seminales: volumen del eyaculado y concentración espermática (que definen a los varones oligozoospérmicos), morfología normal, medida en el porcentaje de formas espermáticas normales en cada individuo (que marca los límites de la teratozoospermia), la motilidad progresiva (% clases a+b)y el REM, cuyos resultados se resumen en la Tabla 11. Concentración Volumen eyaculado Concentración r=-0,229 P=0,150 Motilidad progresiva (% a+b) r=0,201 P=0,208 r=0,131 P=0,415 Motilidad progresiva (% a+b) Morfología (% f. normales) Morfología (% f. normales) r=0,303 P=0,054 r=0,015 P=0,928 r=0,305 P=0,048 Recuento espermatozoides móviles (REM) r=0,127 P=0,428 r=0,302 P=0,049 r=0,420 P=0,006 r=0,336 P=0,032 Tabla 11.- Análisis de correlaciones lineales entre distintos parámetros seminales. 84 RESULTADOS Se encontró una correlación lineal positiva estadísticamente significativa entrela motilidad progresiva y la morfología espermática (r= 0,305, P= 0,048) y entre los valores de REM y la concentración espermática (r= 0,302, P= 0,049) y la morfología espermática (r= 0,336, P= 0,032)y la motilidad progresiva (r=0,420, P=0,006). Las gráficas representativas se recogen en la Fig. 17. Figura 17.- Gráficas de dispersión de distintos parámetros seminales entre sí. 85 RESULTADOS 3. FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO Y PARÁMETROS MASCULINOS 3.1. ANÁLISIS DE LA FRAGMENTACIÓN BASAL Todas las muestras recibidas en el laboratorio el día de la punción folicular se sometieron a un primer test de fragmentación de ADN antes de ser procesadas, calculándose el porcentaje de fragmentación basal del ADN espermático que tiene cada una, lo que puede representarse gráficamente (Fig. 18).Para analizar este parámetro se dividen a los pacientes en dos grupos según el porcentaje de espermatozoides fragmentados que presenten en el eyaculado. El punto de corte utilizado para considerar que una muestra está patológicamente fragmentada es el 30% (Evenson, 1999).A partir de ello se han establecido en este estudio dos grupos de varones, uno formado por aquellos pacientes que presentaron una fragmentación basal de espermatozoides menor del 30% (< 30%) ( = 17,8 ± 1,32)y otro que contenía a los pacientes con un porcentaje de fragmentación igual o mayor al 30% (≥ 30%) ( =46,57 ± 3,58) (Tabla 12).Las diferencias entre ambas medias fueron altamente significativas(P= 0,003). Fragmentación basal (%) Media ± SE Rango 17,8 ± 1,32 5,5 - 28,8 ≥ 30% 46,57 ± 3,58 31,0 - 95,2 <30% P 0,003 Tabla 12.- Fragmentación basal en dos grupos 86 RESULTADOS Figura 18.- Representación gráfica de la fragmentación basal, medias (general y en tramos) y umbral Al analizar si la edad del varón influía en la fragmentación basal del ADN espermático se encontrarondiferencias estadísticamente muy significativas entre los dos grupos de edad en los que se dividió a la población masculina de la serie analizada (Tabla 13, Fig. 19). Sin embargo, los porcentajes medios de fragmentación calculados en los dos grupos de edad (28,28 y 38,69), aunque son claramente diferentes, dichas diferencias no alcanzaron la significación estadística, y al analizar de forma global el porcentaje de fragmentación basal de cada muestra en comparación con la edad de cada individuo, no se observó correlación entre ambos parámetros (r = 0,175, P= 0,273). Se observó también que la mayoría de hombres jóvenes tenían fragmentaciones basales menores de 30 (18 de 27, 66,67%), mientras que la mayoría 87 RESULTADOS de hombres mayores tenían fragmentaciones basales patológicas (11 de 14, 78,58%), con grandes diferencias entre las medias de cada uno de los subgrupos como se aprecia en al Fig. 20. Al analizar la relación entre lafragmentación basal y el consumo de tabaco no se encontraron diferencias significativas, ni tampoco al comparar los porcentajes medios de fragmentación entre los dos grupos (fumadores y no fumadores) (Tabla 13 y Fig. 19). ≥ 40 años < 40 años Frag. basal N N < 30% 3 18 ≥ 30% 11 9 Media ± SE 38,69 ± 0,60 28,28 ± 0,45 Rango 7,6 - 71,7 5,5 - 95,2 Total 14 27 P 0,01 0,09 No fumador Fumador N N 9 12 13 7 35,27 ± 0,49 27,86 ± 0,52 5,5 - 95,2 7,3 - 68,7 14 27 Tabla 13.- Relación entre fragmentación basal y la edad y el hábito de fumar. Figura 19.- Gráfica de dispersión de la fragmentación basal con la edad y el hábito de fumar. 88 P 0,15 0,21 RESULTADOS Figura 20.- Diagrama de barras de la fragmentación basal por intervalos de edad. 3.1.1.. FRAGMENTACIÓN BASAL Y CALIDAD SEMINAL -VARONES NORMOZOOSPÉRMICOS Se analizaron las muestras de pacientes que eran normozoospérmicos y los que no lo eran con respecto al punto de corte de fragmentación establecido, evidenciándosediferencias significativas entre ellos. En lo referente al porcentaje medio de fragmentación basal los resultados obtenidos mostraron medias semejantes en ambos casos (Tabla 14). Fragmentación basal < 30% ≥ 30% Normo N N Sí 7 1 No 14 19 21 20 Total P 0,02 Fragmentación basal (%) Media ± SE Rango 31,80 ± 1,01 5,5 - 95,2 31,84 ± 0,39 7,3 - 71,7 P 0,99 Tabla 14.- Fragmentación basal y porcentaje medio defragmentación en varones normozoospérmicos 89 RESULTADOS -VARONES CON ALTERACIONES EN LOS PARÁMETROS DEL SEMINOGRAMA Tras comparar la fragmentación basal del ADN espermático entre el grupo de pacientes que tenían una concentración de espermatozoides normal y el grupo de pacientes oligozooospérmico, no se observaron diferencias significativas entre ellos.Si cotejamos las medias de fragmentación basal que encontramos en el grupo de pacientes oligozoospérmicos con la que obtenemos en el grupo de pacientes con una concentración de espermatozoides normal en el eyaculado, del mismo modo no se encontraron diferencias significativas entre ellos (Tabla 15). Fragmentación basal < 30% ≥ 30% Oligo N N Sí 6 7 No 15 13 Total 21 20 P 0,65 Fragmentación basal (%) Media ± SE Rango 33,01 ± 0,62 14 - 68,7 31,29 ± 0,44 5,5 - 95,2 P 0,57 Tabla 15.- Fragmentación basal y porcentaje medio de fragmentación basal en varones oligozoospérmicos De igual manera se comparó la fragmentación basal que tenía el grupo de pacientes astenozoospérmicos con aquellos pacientes que presentaron movilidad normal,y la distribución de los pacientes fue muy similar en los dos grupos en relación con ese parámetro de fragmentación, sin encontrarse diferencias significativas, circunstancia que se mantuvo en la comparación de los porcentajes medios de fragmentación basal(Tabla 16). 90 RESULTADOS Fragmentación basal < 30% ≥ 30% Asteno N N Sí 17 16 No 4 4 21 20 Total P 0,93 Fragmentación basal (%) Media ± SE Rango 31,03 ± 0,41 7,3 - 71,7 35,14 ± 0,75 5,5 - 95,2 P 0,71 Tabla 16.- Fragmentación basal y porcentaje medio de fragmentación basal en varones astenozoospérmicos El último parámetro referente a la calidad seminal que se analizó en relación con la fragmentación basal fue la morfología espermática en los varones del estudio. La mitad de la población teratozoospérmica está incluida en cadagrupo de fragmentación basal y ocurre algo prácticamente similar paralos varones no teratozoospérmicos. Del mismo modo, se observaron medias similares de fragmentación basal entre el grupo de varones teratozoospérmicos y el grupo de varones que no lo son, sin encontrarse diferencias significativas en ningún caso (Tabla 17). Fragmentación basal < 30% ≥ 30% Terato N N Sí 14 13 No 7 7 21 20 Total P 0,91 Fragmentación basal (%) Media ± SE Rango 31,33 ± 0,45 7,3 - 71,7 32,81 ± 0,59 5,5 - 95,2 P 0,84 Tabla 17.- Fragmentación basal y porcentaje medio de fragmentación basal en varones teratozoospérmicos 3.1.2.. FRAGMENTACIÓN BASAL Y REM Para comparar la fragmentación basal con el REM se mantuvieron, de este último parámetro, los tres grupos anteriormente descritos (< 1 x 10 6, 1 - 5 x 106 y 5 x 91 RESULTADOS 106) (Fig), no encontrándose relación entre ambas variables. Aunque se observaron diferencias en la fragmentación basal media calculada en los tres grupos de REM, apreciándose como porcentaje medio de fragmentación va disminuyendo a medida que aumenta el número de espermatozoides recuperados, las diferencias no llegaron a ser significativas (Tabla 18). Fragmentación basal < 30% ≥ 30% REM(x 106) N N <1 2 4 1-5 10 10 >5 9 6 21 20 Total Fragmentación basal (%) P Media ± SE Rango P 35,28 ± 0,91 18,1 - 55,1 0,53 33,16 ± 0,48 7,1 - 95,2 0,72 28,15 ± 0,62 5,5 - 53,2 Tabla 18.- Fragmentación basal y porcentaje medio de fragmentación basal y REM 3.1.3. FRAGMENTACIÓN BASAL Y CORRELACIÓN CON LOS PARÁMETROS SEMINALES Se realizó un análisis de la correlación lineal en la población de varones objeto de este estudio, con la intención de medir el grado de relación entre el porcentaje basal de ADN fragmentado de cada muestra con los parámetros seminales de esas mismas muestras: volumen, concentración espermática, morfología y REM, sin encontrar relaciones estadísticamente significativas con ellos (Tabla 19 y Fig. 21). %Fragmentación basal ADN espermático Volumen del eyaculado Coeficiente de P Correlación (r) -0,051 0,751 Concentración espermática -0,014 0,928 Motilidad progresiva -0,037 0,825 Morfología espermática (%Formas normales) -0,036 0,823 Recuento espermatozoides móviles (REM) -0,092 0,566 Tabla 19.- Análisis de correlación lineal entre el porcentaje de fragmentación basal y los parámetros seminales. 92 RESULTADOS Figura 21.- Gráfica de dispersión de la Fragmentación basal conparámetros seminales. 3.2. ANÁLISIS DE LA FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Una vez preparada la muestra espermática mediantela técnica deswim-up, se hizo un segundo análisis de la fragmentación para evaluar el efecto que tenía la técnica sobre el daño en el ADN de los espermático y se observó una disminución general en los porcentajes de fragmentación de este ADN con respecto al primer análisis (Fig.22). 93 RESULTADOS Figura 22.- Representación gráfica de la fragmentación post swim-up y su media A pesar de que aparecen diferencias en los porcentajes medios de fragmentación del ADN espermático post swim-up en los varones menores de 40 años respecto a los que tienen 40 años o más (Fig. 23), siendo la fragmentación más alta en estos últimos, las diferencias encontradas no alcanzaron la significación estadística (Tabla 20), y al analizar globalmente el porcentaje de fragmentación post swim-up de cada muestra en comparación con la edad de cada individuo, no se observó correlación lineal estadísticamente significativa entre ambos parámetros (r = -0,045, P= 0,781). 94 RESULTADOS Fragmentación post swim-up (%) Edad varón Media ± SE Rango < 40 9,44 ± 0,45 0,1 - 48,9 ≥ 40 11,16 ± 0,59 0,1 - 45,1 P 0,36 Tabla 20.- Fragmentación post swim-up media y edad Como en el caso de la fragmentación basal, los porcentajes medios de fragmentación no diferían significativamente entre varones fumadores y los no fumadores (Tabla 21 y Fig. 23). Fragmentación post swim-up (%) Media ± SE Rango No fumador 10,46 ± 0,49 0,1 - 48,9 Fumador 9,53 ± 0,52 0,4 - 45,1 P 0,80 Tabla 21.- Fragmentación post swim-up media y consumo de tabaco Figura 23.- Gráficas de dispersión de la fragmentación post swim-up con edad y consumo de tabaco 95 RESULTADOS 3.2.1.. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y CALIDAD SEMINAL -VARONES NORMOZOOSPÉRMICOS El porcentaje medio de fragmentación de las muestras una vez procesadas fue diferente entre el grupo de varones normozoospérmico y el grupo de los que no lo son, el porcentaje más alto lo encontramos en los pacientes que están diagnosticados de normozoospermia, a pesar de lo cual las diferencias no son significativas (Tabla 22). Fragmentación post swim-up (%) Normo Media ± SE Sí 13,58 ± 1,01 No 9,65 ± 0,39 Rango 0,1 - 48,9 0,1 - 45,1 P 0,53 Tabla 22.- Fragmentación post swim-up media y Normozoospermia -VARONES CON ALTERACIONES EN LOS PARÁMETROS DEL SEMINOGRAMA Los porcentajes medios de fragmentación en varones con las diferentes alteraciones en los parámetros seminales y sus comparaciones con las muestras normales se indican en la Tabla23. Las muestras oligozoospérmicas presentaron un porcentaje mediode fragmentación post swim-up menor que la del grupo de pacientes que tenían una concentración de espermatozoides normal (Tabla 23).Lo mismo ocurre en el caso de analizar la motilidad, la fragmentación post swim-up media entre los hombres que no son astenozoospérmicos es mayor que la encontrada en los astenozoospérmicos, a pesar de lo cual las diferencias encontradas no son significativas. Por último, en relación con las muestras con alteraciones en la morfología espermática (varones teratozoospérmicos) tampoco se encuentran diferencias significativas, a pesar de ser más altos los porcentajesde fragmentación post swim-up en los varones con morfología normal (Tabla 23). 96 RESULTADOS Fragmentación post swim-up (%) Oligo Asteno Terato Media ± SE Rango Sí 6,41 ± 0,62 0,1 - 30,8 No 11,71 ± 0,44 0,1 - 48,9 Sí 9,32 ±0,41 0,1 - 45,1 No 12,96 ± 0,75 0,1 - 48,9 Sí 9,57 ± 0,45 0,1 - 45,1 No 10,91 ± 0,59 0,1 - 48,9 P 0,18 0,43 0,73 Tabla 23.- Porcentajes medios de Fragmentación post swim-upy alteraciones del seminograma. 3.2.2.. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y REM Como en los casos anteriores, para comparar el porcentaje medio de fragmentación después del swim-upsegún el REM hemos dividido la población masculina en tres grupos según el REM. Aún siendo mayor el porcentaje de fragmentación en las muestras que tienen los valores de REM más bajos, esto no se mantiene en los dos grupos de REM superiores a 1x 10 6, no obstante las diferencias no son significativas (Tabla 24). Fragmentación post swim-up (%) REM (x 106) Media ± SE Rango <1 13,54± 0,91 1,3 - 30,8 1-5 8,26± 0,48 0,1 -48,9 > 5 11,81 ± 0,62 0,1 - 45,1 P 0,54 Tabla 24.- Fragmentación post swim-up media y REM 97 RESULTADOS 3.2.3. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y FRAGMENTACIÓN BASAL La media de la fragmentación post swim-up fue mucho menor que la media de la fragmentación basal, siendo la diferencia entre ambas altamente significativa (Tabla 25). El análisis de correlación entre ambos tipos de fragmentaciones del ADN espermático estableció una correlación positiva altamente significativa entre ambos parámetros (r = 0,463, P= 0,002). Esta relación se muestra en la Fig. 24. Media ± SE Fragmentación basal (%) Rango 31,83 ± 2,97 5,50 - 95,20 Fragmentación post swim-up (%) 10,03 ± 1,83 0,10 - 48,90 P 0,00 Tabla 25.- Fragmentación post swim-up media y fragmentación basal media Figura 24.- Fragmentación post swim-up media y fragmentación basal media La fragmentación post swim-up en porcentaje medio fue inferior en las muestras que tenían una fragmentación basal inferior al 30% que en aquellas que la tenían igual o superior (Fig. 25). El nivel de fragmentación descendió más en el grupo de muestras más fragmentadas y las diferencias que se encontraron fueron estadísticamente significativas (Tabla 26). 98 RESULTADOS Fragmentación post swim-up (%) Fragmentación basal Media ± SE Rango < 30% 6,41 ± 0,50 0,1 - 27,2 ≥ 30% 13,83 ± 0,51 0,2 - 48,9 P 0,04 Tabla 26.- Fragmentación post swim-up media y fragmentación basal Figura 25.Representación gráfica de Fragmentación post swim-up y fragmentación basal con fragmentación basal ordenada. La línea roja marca el límite de los valores de fragmentación basal patológica (30%) 3.2.4. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y CORRELACIÓN CON LA FRAGMENTACIÓN BASAL Y LOS PARÁMETROS SEMINALES Se realizó un análisis de correlación lineal en los pacientes, para profundizar en el grado de relación entre el porcentaje de fragmentación del ADN espermático tras someter a las muestras al proceso de preparación, mediante la técnica de swim-up, con los parámetros seminales de esas mismas muestras: volumen, concentración espermática, motilidad progresiva, morfología y REM, sin encontrar relaciones estadísticamente significativas con ellos (Tabla 27 y Fig. 26). Sin embargo, al comparar los porcentajes de fragmentación post swim-up con los correspondientes porcentajes encontrados en el semen antes del procesamiento (%fragmentación basal) se encontró una fuerte correlación positiva, estadísticamente significativa (Tabla 27). 99 RESULTADOS %Fragmentación post swim-up del ADN espermático Volumen del eyaculado Coeficiente de P Correlación (r) -0,159 0,322 Concentración espermática 0,020 0,901 Motilidad progresiva (a+b) -0,037 0,816 Morfología espermática (%Formas normales) 0,198 0,216 Recuento espermatozoides móviles (REM) -0,092 0,566 % Fragmentación basal del ADN espermático 0,463 0,002 Tabla 27.- Análisis de correlación lineal entre la fragmentación post swim-up y la fragmentación basal y los parámetros seminales Figura 26.-Gráficas de dispersión de fragmentación post swim-up respecto a fragmentación basal y parámetros seminales 3.3. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN TRAS EL PROCESAMIENTO MEDIANTE SWIMUP Al comparar los resultados de los dos test de fragmentación, el realizado antes del procesamiento de la muestra y el posterior después de someter la muestra al procesamiento por la técnica de swim-up puede observarse cómo afecta esta técnica al porcentaje de fragmentación. En casi todas las 100 muestras el porcentaje de RESULTADOS fragmentación espermática disminuye drásticamente excepto en dos pacientes, el 6 y el 20 (Fig. 27). Figura 27.- Representación gráfica de la variación de la fragmentación espermática con la fragmentación basal ordenada y sin ordenar 101 RESULTADOS Se analizó la variable variación de la fragmentación calculada como la diferencia, medida en puntos porcentuales (p.p.), entre el porcentaje de fragmentación post swim-up y el porcentaje de fragmentación basal. En la Fig.27 se incluye también la variación porcentual (%): diferencia entre fragmentaciones dividido entre fragmentación basal. Si bien se perciben diferencias de casi nueve puntos enla variación de los porcentajes medios de fragmentación entre los dos grupos de edad de los varones, las diferenciasencontradas no alcanzaron la significación estadística (Tabla 28 y Fig. 28). Variación de fragmentación Edad varón Media ± SE Rango < 40 -18,84 ± 3,0 -58,3 - +6,4 ≥ 40 -27,53 ± 4,5 -65,6 - -2,3 P 0,10 Tabla 28.- Variación en los porcentajes de fragmentación y edad A continuación se analizó de forma global la variación media del porcentaje de fragmentación separando a los varones en fumadores y no fumadores (Fig. 28). A pesar de ser más efectivo el swim-up para descartar espermatozoides con el ADN fragmentado en los no fumadores las diferencias no son estadísticamente significativas con respecto al otro grupo (Tabla 29). Variación de fragmentación Media ± SE Rango No fumador -24,81 ± 0,49 -65,6 - +6,4 Fumador -18,33 ± 0,52 -58,3 - +0,8 P 0,21 Tabla 29.- Variación media de fragmentación y consumo de tabaco 102 RESULTADOS Figura 28.--Gráfica de dispersión de variación de la fragmentacióncon consumo de tabaco y edad 3.3.1.. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y CALIDAD SEMINAL - VARONES NORMOZOOSPÉRMICOS Una vez analizado el porcentaje medio en el que ha variado la fragmentación en relación a si la muestra es o no es normozoospérmica localizamos un descenso similar aunque ligeramente mayor en el porcentaje de fragmentación en las muestras que provienen de pacientes no normozoospérmicos. El swim-up parece ligeramente menos efectivo en la eliminación de espermatozoides con el ADN fragmentado en el caso de que las muestras sean normales (Tabla 30). Variación de fragmentación Normo Media ± SE Rango Sí -18,22 ± 9,6 -46,3 - -5,4 No -22,19 ± 2,7 -65,6 - +6,4 P 0,65 Tabla 30.-Variación media de fragmentación y Normozoospermia 103 RESULTADOS -VARONES CON ALTERACIONES EN LOS PARÁMETROS DEL SEMINOGRAMA Las variaciones en los porcentajes medios de fragmentación espermática en varones con las diferentes alteraciones en los parámetros seminales y sus comparaciones con las muestras normales se indican en la tabla 31. El descenso medio en el porcentaje de fragmentación es mayor en las muestras oligozoospérmicas que en las que no lo son, aunque las diferencias encontradas no son significativas (Tabla 31). Mediante el swim-up se eliminan más espermatozoides con el ADN fragmentado en muestras con la concentración inicial de espermatozoides alterada que en las que son normales para este parámetro. En relación con las alteraciones en la motilidad espermática, tantolas muestras que tienen alterada la motilidad (astenozoospermia) como las que no la tienen se comportan de manera similar; en ambos grupos el porcentaje medio en el que ha disminuido la fragmentación es semejante, la diferencia no llega al medio punto (Tabla), de manera que las muestras astenozoospérmicas y las que no lo son se comportan igual frente a la técnica de swim-up. Finalmente, al comparar la variación media de la fragmentación entre individuos cuya muestra tiene alterada la morfología espermática (teratozoospérmicos) frente a los que no la presentan alterada, se encuentra con valores muy similares en ambos casos (Tabla), con lo que el procedimiento del swimup es igualmente efectivo en el caso de utilizarlo para procesar muestras teratozoospérmicas que para preparar las que no lo son a la hora de eliminar fragmentación. 104 RESULTADOS Variación de fragmentación Oligo Asteno Terato Media ± SE Rango P Sí -26,60 ± 4,2 -58,3 - -10,8 No -19,58 ± 3,2 -65,6 - +6,4 Sí -21,71 ± 2,7 -65,6 - +6,4 No -22,17 ± 7,0 -51,4 - -0,2 Sí -21,75 ± 3,0 -65,6 - +0,8 No -21,91 ± 4,9 -51,4 - +6,4 0,20 0,94 0,98 Tabla 31.- Variación media de fragmentación y alteraciones de los parámetros seminales 3.3.2.. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y REM Se halló la variación media del DFI en cada uno de los grupos en los que se ha dividido la población según el REM post swim-up. Mientras la fragmentación disminuye de manera parecida en los dos grupos de REM inferiores a 5x 10 6 en el caso de muestras cuyos REM sobrepasan los 5x 106 el porcentaje medio en el que disminuye la fragmentación es menor (Tabla 32). Variación de fragmentación REM (x 106) Media ± SE Rango < 1 -21,74 ± 0,91 -34,6 - -11,7 1 - 5 -24,90 ± 0,48 -65,6 - +6,4 > 5 -16,35 ± 0,62 -45,3 - -0,2 P 0,33 Tabla 32.Tabla .- Variación media de fragmentación y REM 105 RESULTADOS 3.3.3. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y FRAGMENTACIÓN BASAL Tomando como referencia si la fragmentación basal estaba o no por debajo del 30%, se encontraron diferencias muy significativas en cuanto a la variación media de la fragmentación en los dos grupos (Tabla 33). En las muestras que tienen fragmentaciones basales altas, después delswim-upse eliminan por término medio un mayor número de espermatozoides fragmentados que en el grupo de pacientes con fragmentaciones basales por debajo del 30% y las ambos parámetros presentan una correlación lineal positiva estadísticamente significativa (r = 0,791 P= 0, 000) como se aprecia claramente en la gráfica de dispersión entre ambas variables (Fig). Variación de fragmentación Fragmentación basal Media ± SE Rango < 30% -11,39 ± 0,50 -4,3 - +6,4 ≥ 30% -32,75 ±0,51 -65,6 - -2,3 P 0,00 Tabla 33.- Variación media de fragmentación y fragmentación basal 3.3.4.VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACION Y CORRELACIONES CON LOS PORCENTAJES DE FRAGMENTACIÓN BASAL, POST SWIM-UP Y CON LOS PARÁMETROS SEMINALES Se realizó un análisis de correlación lineal para profundizar en las relaciones entre la variación de la fragmentación, como consecuencia del swim-up,y los parámetros seminales (volumen, concentración espermática, motilidad progresiva, morfología), REMy la fragmentación (basal y post swim-up) de las muestras (Fig. 29).Se encontró una correlación negativa muy significativa entre las variación de la fragmentación del ADN espermático de los varones, y los correspondientes porcentajes de fragmentación basal, a mayor fragmentación basal corresponde menor variación, es decir, una variación más negativa, una diminución mayor (Tabla 34). Esta relación lineal se aprecia claramente en la gráfica de dispersión entre ambas variables (Fig. 29) 106 RESULTADOS Variación de la fragmentación post swim-up Volumen del eyaculado Coeficiente de P Correlación (r) 0,054 0,737 Concentración espermática -0,031 0,847 Motilidad progresiva (a+b) 0,015 0,926 Morfología espermática (%Formas normales) 0,050 0,758 Recuento espermatozoides móviles (REM) 0,168 0,294 % Fragmentación basal del ADN espermático -0,791 0,000 % Fragmentación post swim-up del ADN espermático 0,049 0,760 Tabla 34.- Análisis de correlación lineal entre la variación de la fragmentación yla fragmentación basal, post swim-up y parámetros seminales. Figura 29.- Gráficas de dispersión de variación de la fragmentación respecto aparámetros seminales, fragmentación basal, fragmentación post swim-up 107 RESULTADOS 4. RESULTADO DE LOS TRATAMIENTOS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA (TRA) MEDIANTE ICSI El resultado o éxito clínico de los tratamientos de reproducción asistida (TRA) mediante la técnica de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) se midenmediante unos parámetros indicadores que son la tasa de fecundación, la calidad embrionaria, la tasa de implantación y la gestación. La tasa de fecundación media de las 41 pacientes analizadas fue 57,44 ± 4,38 y la tasa de implantación media de las 38 pacientes a las que se realizó transferencia embrionaria (las otras 3 pacientes correspondían a fallos de fecundación), 19,30 ± 5,17. El 63% de las 41 pacientes obtuvieron embriones de buena calidad. El 31,58% de las 38 pacientes a las que se realizó transferencia, se embarazaron. Estos resultados fueron analizados en relación con la edad de ambos miembros de la pareja (Fig. 30 y Fig. 31), los parámetros seminales, la fragmentación del ADN espermáticoy en relación con las características de las mujeres del estudio. La edad del varón se relacionó con la tasa de fecundación y no lo hizo con la de implantación, aunque para ambas variables se observa una tasa más elevada para aquellos varones de menor edad (Tabla 35). Las correlaciones lineales entre la edad de los varones y ambos parámetros, no fueron estadísticamente significativas (r= -0,248, P= 0,118 y r= -0,146, P= 0,382, respectivamente). Sin embargo, para ambas correlaciones se observó la misma tendencia de valores negativos, de manera que tasas mayores de ambos parámetros se encontraron en los pacientes más jóvenes. Tasa de fecundación Edad N Media ± SE Rango < 40 años 27 62,64 ± 5,77 0 - 100 ≥ 40 años 14 47,39 ± 5,68 0 - 85,71 Total Tasa de implantación P N 0,049 41 Media ± SE Rango 25 24,00 ± 6,60 0 - 100 13 10,25 ±7,90 0 - 100 38 Tabla 35.- Edad del varón en relación con tasa de fecundación y tasa de implantación 108 P 0,193 RESULTADOS Tampoco se encontró relación entre la edad del varón distribuidos en grupos de edad (< 40 años y ≥ 40 años) y embriones de buena calidad (G1+G2), y con embarazo (Tabla 36). Aun así se observó que el porcentaje de parejas con embriones de buena calidad era algo superior para el grupo de varones jóvenes (20 de 27, 74,1%) que para el de varones mayores de 40 (9 de 14, 64,3%) y la tasa de embarazo muy superior (40% y 15,4%, repectivamente) (Tabla 36 y Fig 30). Embriones (G1 + G2) Sí No Edad varón N N < 40 años 20 7 ≥ 40 años 9 5 Total 29 12 P 0,77 Gestación Sí No N N 10 15 2 11 12 26 P 0,23 Tabla 36.- Edad del varón en relación con embriones de buena calidad y gestación Figura 30.- Diagramas de barras de embriones G1 + G2 y embarazo por intervalos de edad del varón 109 RESULTADOS Figura 31.- Gráficas de dispersión de resultado del ciclo de ICSI en función de la edad del varón En cuanto a la edad de la mujer, se establecieron dos rangos (≤ 35 años y > 35 años). Nose encontró relación, estadísticamente significativa, entre la edad de las mujeres y la tasa de fecundación ni tampoco con la de implantación (Tabla 37 y Fig. 32), aunque en este segundo caso, la tasa media de implantación disminuye a la mitad en el grupo de mujeres mayores de 35 años y los tres fallos de fecundación corresponden a mujeres mayores de 35 años. Las correlaciones lineales entre edad y ambos parámetros no fueron significativas (r= -0,048, P= 0,766 y r= -0,175, P= 0,294), respectivamente. Tal como ocurre con las edades de los varones, en ambas correlaciones se observó la misma tendencia de valores negativos de coeficientes de correlación, de forma que las mayores tasas de ambos parámetros se encontraron en las mujeres más jóvenes. 110 RESULTADOS Tasa de fecundación Edad N Media ± SE Rango ≤ 35 años 21 62,18±6,05 14,29 - 100 > 35 años 20 52,45± 6,30 Total Tasa de implantación P 0 - 100 0,27 41 N Media ± SE Rango 21 24,60±7,59 0 - 100 17 12,74±6,63 0 - 100 P 0,25 38 Tabla 37.- Edad de la mujer en relación con tasa de fecundación y tasa de implantación Del mismo modo, no se encontró relación entre la edad de la edad de la mujer con la existencia de embriones de buena calidad (G1+G2) (χ2= 0,01,P= 0,92), ni con embarazo (χ2= 0,92, P= 0,48) (Tabla 38 y Fig. 32). No se observaron tampoco diferencias en los porcentaje de parejas con embriones de buena calidad en ambos grupos de mujeres, la tasa de embarazo de las mujeres jóvenes fue superior a la encontrada en el grupo de mujeres mayores (38,1% y 23, 53%, respectivamente) (Tabla 38 y Fig 33). Embriones (G1 + G2) Sí No Edad mujer N N ≤ 35 años 15 6 > 35 años 14 6 Total 29 12 P 0,92 Gestación Sí No N N 8 13 4 13 12 26 P 0,48 Tabla 38.- Edad de la mujer en relación con embriones de buena calidad y gestación 111 RESULTADOS Figura 32.- Gráficas de dispersión de resultado del ciclo de ICSI en función de la edad de la mujer Figura 33.- Diagrama de barras de embriones G1 + G2 y embarazo por intervalos de edad de la mujer 4.1. RESULTADOS DE LOS TRA MEDIANTE ICSI Y PARÁMETROS SEMINALES Se realizó un análisis de la relación los resultados de los tratamientos de reproducción asistida mediante la ICSI y los distintos tipos de semen (Normo, oligo, 112 RESULTADOS asteno y teratozoospérmico) y el REM, no encontrado diferencias en ninguno de estos parámetros respecto a la presencia de embriones de buena calidad (G1+G2) (Tabla 39). Presencia/ausencia de embriones de buena calidad (G1 + G2) χ² P Semen Normal 1,83 0,30 Semen Oligozoospérmico 1,77 0,27 Semen Astenozoospérmico 1,35 0,40 Semen Teratozoospérmico 2,30 0,16 Recuento Espermatozoide Móviles (REM) 0,23 0,89 Tabla 39.- Relación entre los tipos de varones (normozoospérmicos, oligozoospérmicos, astenozoospérmicos y teratozoospérmicos) y el REM contrastados con la existencia o no de embriones de buena calidad (G1 + G2) Sin embargo la comparación entre los distintos tipos de varones y el REM respecto a la gestación se encontraron diferencias significativas en la consecución de embarazo en relación con el semen normal y con el semen de morfología alterada (Tabla 40). 113 RESULTADOS EmbarazoSí Embarazo No Normo Oligo Asteno Terato REM (x 106) N N Sí 5 3 No 7 23 Sí 5 7 No 7 19 Sí 10 20 No 2 5 Sí 4 21 No 8 7 <1 1 5 1-5 8 12 >5 3 9 Total 12 26 χ² P 4,48 0,03 0,83 0,36 0,20 0,65 8,21 0,04 3,78 0,15 Tabla 40.- Relación entre los tipos de varones (normozoospérmicos, oligozoospérmicos, astenozoospérmicos y teratozoospérmicos) y el REM en relación con la gestación Las correlaciones lineales para medir el grado de relación entre los distintos parámetros cuantitativos seminales, volumen del eyaculado (Fig. 34), concentración espermática (Fig. 35), motilidad progresiva (Fig. 36), morfología (Fig. 37) y el REM (Fig. 38), y las tasas de fecundación e implantación, resaltaron la existencia de una correlación lineal positiva significativa entre el porcentaje de formas normales y la tasa de implantación (Tabla 41). 114 RESULTADOS Volumen del eyaculado Tasa implantación Coeficiente de P Correlación (r) -0,270 0,294 Tasa de Fecundación Coeficiente de P Correlación (r) 0,038 0,811 Concentración espermática -0,013 0,939 0,024 0,880 Motilidad progresiva -0,044 0,247 0,085 0,845 Morfología (% formas normales) 0,396 0,014 -0,030 0,851 REM -0,140 0,402 0,180 0,761 Tabla 41.- Análisis de correlación lineal entre la tasa de implantación y la tasa de fecundación y los parámetros seminales. Figura 34.- Graficas de dispersión de indicadores del resultados del ciclo en función del volumen del eyaculado. 115 RESULTADOS Figura 35.- Indicadores del resultado del ciclo en función de la concentración. Figura 36.- Gráfica de dispersión de Indicadores del resultado del ciclo con motidad progresiva. 116 RESULTADOS Figura 37.- Gráficas de dispersión deIndicadores del resultado del ciclo en función de la morfología. Figura 38..-Gráficas de dispersión deIndicadores del resultado del ciclo en función de REM. 117 RESULTADOS 4.2. RESULTADOS DE LOS TRA MEDIANTE ICSI y FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO En este apartado se ha estudiadosi la fragmentación del ADN espermático fue determinante o afectó en alguna medida a los resultados de los tratamientos de reproducción asistida mediante la ICSI, que se analizan en este trabajo (Fig. 40). 4.2.1. FRAGMENTACIÓN BASAL Y RESULTADOS DE ICSI 4.2.1.1. FRAGMENTACIÓN BASAL Y TASA DE FECUNDACIÓN La tasa de fecundación fue ligeramente más elevada en el caso de utilizar muestras con porcentajes de fragmentación basal igual o superior al 30% en comparación con las que se encontraron cuando la muestra analizada tenía un porcentaje menor (Tabla 42). Tasa de fecundación Fragmentación basal Media ± SE Rango < 30% 56,38 ± 0,50 0,00 - 88,89 ≥ 30% 58,55 ±0,51 0,00 - 100,00 P 0,80 Tabla 42.- Tasa de fecundación media y fragmentación basal 4.2.1.2. FRAGMENTACIÓN BASAL Y EMBRIONES DE BUENA CALIDAD Contrastando la existencia o no de embriones de buena calidad (G1+G2) entre los dos grupos de fragmentación basal, no se observaron diferencias significativas entre los dos grupos distribuyéndose los embriones buenos de manera similar.Comparando las medias de fragmentación basal entre el grupo de pacientes que tiene embriones G1+G2 y el grupo que no los tiene, no se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos, aunque se encontraron valores ligeramente superiores en el grupo que tiene embriones de buena calidad (Tabla 43). 118 RESULTADOS Fragmentación basal < 30% ≥ 30% Embriones G1 + G2 N N Sí 14 15 No 7 5 21 20 Total P 0,55 Media ± SE Rango 32,41 ± 3,89 5,5 - 95,2 30,44 ± 4,01 10,3 - 55,1 P 0,76 Tabla 43.- Fragmentación basal y Fragmentación basal media en relación con embriones de buena calidad (G1+G2) Para analizar si el test de fragmentación basal era una prueba capaz de predecir la obtención de embriones de buena calidad se recurrió a una curva ROC. El área bajo la curva (AUC) fue 0,48, con lo que se concluyó que la realización de un análisis de fragmentación basal no era prueba capaz pronosticar que esa paciente tuviera embriones de buena calidad (Fig.39). F. basal F. post swim-up Figura 39.- Curva ROC de la fragmentación basal (azul) y fragmentación post swim-up en las pacientes que tienen embriones de buena calidad (G1 + G2) 119 RESULTADOS 4.2.1.3. FRAGMENTACIÓN BASAL Y TASA DE IMPLANTACIÓN El estudio de la diferencias de tasas medias de implantación entre los dos grupos de fragmentación reveló que, a pesar de que la tasa de implantación era más elevada en el caso de las muestras del grupo de fragmentación basal menor respecto a la del otro grupo, las diferencias no alcanzaron la significación (Tabla 44) Tasa de implantación Fragmentación basal Media ± SE Rango P < 30% 22,50 ±0,51 - ≥ 30% 15,74 ±0,54 - 0,52 Tabla 44.- Tasa media de implantación y fragmentación basal 4.2.1.4. FRAGMENTACIÓN BASAL Y GESTACIÓN Las pacientes que no consiguieron embarazo estaban equitativamente distribuidas entre los dos grupo de fragmentación basal establecidos. En lo referente al número de embarazosaunque fue mayor en el grupo que presenta una fragmentación basal menor las diferencias fueron pequeñas con el otro grupo (Tabla 45) . Fragmentación basal < 30% ≥ 30% Gestación N N Sí 7 5 No 13 13 20 18 Total P 0,63 Tabla 45.- Fragmentación basal y gestación La tasa media de gestación fue como consecuencia ligeramente superior en el grupo que tenía una fragmentación < 30% .En cambio la media de fragmentación basal fue superior aunque también en un porcentaje pequeño en el grupo de mujeres que no se embarazaron (Tabla 46) . 120 RESULTADOS Fragmentación basal (%) Gestación Media ± SE Rango Sí 30,42 ±5,01 14,9 - 68,7 No 32,18 ± 3,99 5,5 - 95,2 P 0,79 Tabla 46.- Fragmentación basal media y gestación Figura 40..- Gráfica de dispersión deindicadores de los resultados del ciclo en función de la fragmentación basal Para analizar si el test de fragmentación basal era una prueba capaz de predecir la obtención de gestación, se recurrió a una curva ROC. El área bajo la curva (AUC) fue 0,46, con lo que se concluyó que la realización de un análisis de fragmentación basal no era prueba capaz pronosticar que se vaya a producir embarazo (Fig.41). 121 RESULTADOS F. basal F. post swim-up Figura 41.- Curva ROC de la fragmentación basal y post swim-up en las pacientes que consiguen embarazo 4.2.2. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y RESULTADOS DE ICSI 4.2.2.1. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y TASA DE FECUNDACIÓN Para valorar si la el porcentaje de fragmentación post swim-up afectaba a la tasa de fecundación obtenida tras la técnica de ICSI se realizó el análisis de correlación lineal que arrojó resultados no significativos (r = 0,180; P= 0,26) (Fig. 42). 4.2.2.2. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y EMBRIONES DE BUENA CALIDAD Con objeto de conocer si existía alguna relación entre la fragmentación post swim-up y la calidad embrionaria hemos calculado la fragmentación media en los dos grupos, no obteniéndose ningún resultado significativo (Tabla 47). 122 RESULTADOS Fragmentación post swim-up (%) Embriones G1 + G2 Media ± SE Rango Sí 11,37 ± 0,43 0,1 - 48,9 No 6,78 ± 0,63 0,2 - 20,5 P 0,26 Tabla 47.- Fragmentación post swim-up media y embriones de buena calidad (G1+G2) Como en el caso de la fragmentación basal también se analizó si el cálculo del porcentaje de fragmentación después del swim-up era un buen predictor de la obtención de embriones de buena calidad. El valor de AUC fue de 0,57, a pesar de ser un valor más elevado que el que se obtuvo al analizar la fragmentación basal, el resultado demuestra que en este caso tampoco nos encontramos delante de una prueba con un alto valor de predicción (Fig.39). 4.2.2.3. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y TASA DE IMPLANTACIÓN Para valorar si el porcentaje de fragmentación post swim-up del ADN espermático afectaba a la tasa de implantación que se obtenía mediante la técnica de ICSI se realizó el análisis de correlación linealcon resultados no significativos (r=-0,035; P= 0,84). 4.2.2.4. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y GESTACIÓN De la comparación de medias realizada entre el grupo de mujeres que se embarazaron y el que no, se encontró que, a pesar de ser superior la media de fragmentación post swim-up en el segundo grupo, las diferencias obtenidas no fueron significativas (Tabla 48). 123 RESULTADOS Fragmentación post swim-up (%) Gestación Media ± SE Rango Sí 8,57 ± 0,63 0,4 - 27,2 11,15 ± 0,46 0,1 - 48,9 No P 0,55 Tabla 48.- Fragmentación post swim-up media y gestación Figura 42.- Gráfica de dispersión deindicadores de los resultados ciclo en función de la fragmentación post swim-up El AUC (0,49) del estudio de la curva ROC demuestra que el test de fragmentación post swim-up no es una prueba válida para pronosticar el resultado del ciclo en cuanto a la obtención de gestación (Fig. 41). 124 RESULTADOS 4.2.3. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y RESULTADOS DE ICSI 4.2.3.1. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y TASA DE FECUNDACIÓN El análisis de la correlación entre las variaciones de los porcentajes de fragmentación del ADN espermático en relación con el parámetro que refleja la tasa de fecundación resultante de la técnica de ICSI en las parejas del estudio dio resultados no significativos (r=- 0,018; P=0,91) (Fig. 43). 4.2.3.2. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y EMBRIONES DE BUENA CALIDAD Las medias de variaciones de fragmentación, debido al procesamiento mediante swim-up, fueron similares en los dos grupos de embriones y las diferencias no fueron significativas (Tabla 49). Variación de fragmentación Embriones G1 + G2 Media ± SE Rango Sí -21,04 ± 0,43 -65,6 - +6,4 No -23,66 ± 0,64 -45,3 - -0,2 P 0,65 Tabla 49.- Variación de fragmentación media y embriones de buena calidad (G1+G2) 4.2.3.3. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y TASA DE IMPLANTACIÓN Los parámetros variación de los porcentajes de fragmentación del ADN espermático y tasa de implantación resultante de la técnica de ICSI en las parejas del estudio no se encontraban significativamente correlacionados (r = -0,095; P= 0,57). 4.2.3.4. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y GESTACIÓN Al analizar la variación de la fragmentación del ADN espermático una vez procesada la muestra no se encontraron diferencias significativas entre el grupo de mujeres que se embarazaban y el grupo de aquellas que no obtuvieron un embarazo (Tabla 50). 125 RESULTADOS Variación de fragmentación Gestación Media ± SE Rango Sí -21,85 ± 0,64 -58,3 - +6,4 No -21,03 ± 0,46 -65,6 - +0,8 P 0,88 Tabla 50.- Variación de fragmentación media y gestación Figura 43.- Gráfica de dispersión de indicadores de los resultados ciclo en función de variación de la fragmentación Finalmente, para valorar en su conjunto el factor masculino en relación con la obtención de embarazo, se realizó un test de regresión logística multivariante con edad, tipos de anomalías seminales, porcentajes de fragmentación basal y post swimup. Los resultados de este análisis evidenciaron que el fracaso en la consecución de 126 RESULTADOS embarazo se asoció significativamente a varones oligozoospérmicos (P= 0,005) y a teratozoospérmicos (P= 0,012). 4.3. RESULTADOS DE TRA MEDIANTE ICSI EN MUJERES DE BUEN Y MAL PRONÓSTICO La población femenina de estudio, como se explicó en el apartado de análisis descriptivo, se dividió, para el análisis de los resultados del ciclo ICSI, en función de su edad, el recuento de folículos antrales, la FSHbasal y resultados de ciclos previos. 4.3.1. TASA DE FECUNDACIÓN EN MUJERES DE BUEN Y MAL PRONÓSTICO La comparación de la tasa de fecundación entre las mujeres de buen y mal pronóstico no arrojó diferencias significativas entre ambos grupos, aunque la media fue más elevada para aquellas mujeres clasificadas como de buen pronóstico (Tabla 51). Tasa de fecundación Pronóstico de la mujer N Media ± SE Bueno 18 64,09 ± 7,50 Malo 23 52,23 ± 5,03 P 0,182 Tabla 51.- Tasa media de fecundación y pronóstico de la mujer 4.3.2. EMBRIONES DE BUENA CALIDAD EN MUJERES DE BUEN Y MAL PRONÓSTICO Analizando la obtención de embriones de buena calidad (G1+G2) según las mujeres sean de buen o mal pronóstico, se observaron valores medios muy similares en ambos grupos, las diferencias encontradas entre las medias no fueron significativas (Tabla 52). 127 RESULTADOS Embriones G1+G2 Pronóstico de la mujer N Media ± SE Bueno 18 1,67 ± 0,40 Malo 23 1,57 ± 0,26 P 0,623 Tabla 52.- embriones de buena calidad (G1+G2) y pronóstico de la mujer 4.3.3. TASA DE IMPLANTACIÓN EN MUJERES DE BUEN Y MAL PRONÓSTICO Los resultados obtenidos en cuanto a la tasa de implantación, reflejan valores medios con diferencias de hasta 12 puntos entre las 17 mujeres de buen (una mujer de las 18 totales con fallo de fecundación) y las 21 de mal pronóstico (dos mujeres con fallo de fecundación), con mayor tasa de implantación para el grupo de mujeres clasificadas como de buen pronóstico, no siendo esta diferencia estadísticamente significativa (Tabla 53). Tasa de implantación Pronóstico de la mujer N Media ± SE Bueno 17 27,45 ± 8,91 Malo 21 15,74 ± 5,73 P 0,175 Tabla 53.- Tasa media de implantación y pronóstico de la mujer 4.3.4. GESTACIÓN EN MUJERES DE BUEN Y MAL PRONÓSTICO La tasa de gestación por transferencia (sólo 38 transferencias porque hubo 3 fallos de fecundación), fue superior para el grupo de mujeres clasificadas como de buen pronóstico (7 gestantes de 17 de buen pronóstico, tasa de 41,2%) que para el otro grupo (5 gestantes de 21 de mal pronóstico, tasa de 23,8%). Además, la mayoría de las gestaciones corresponden a las mujeres de buen pronóstico (7 de buen pronóstico de 12 gestaciones, 58,3% de las gestaciones) y, entre las mujeres que no gestaron, hay más de las pertenecientes al grupo de mal pronóstico (16 de mal 128 RESULTADOS pronóstico de 26 no gestantes, 61,5% de los fallos de gestación). A pesar de las diferencias, no se obtuvo significación estadística entre ambas variables (Tabla 54). Pronóstico Bueno Malo Gestación N N Sí 7 5 No 10 16 17 21 Total P 0,63 Tabla 54.- Mujeres de buen y mal pronóstico en relación con la gestación Finalmente, para profundizar en los factores femeninos que pudieran afectar al éxito de embarazo, se realizó un test de regresión logística multivariante con los parámetros femeninos como número de ovocitos obtenidos, número de embriones de buena calidad, número de embriones transferidos y edad materna, encontrando que el éxito de embarazo se asoció significativamente a la edad materna (P= 0,05) y muy significativamente al número de embriones (P= 0,002). 129 DISCUSIÓN DISCUSIÓN 1. PARÁMETROS SEMINALES Y CARACTERÍSTICAS DE LOS VARONES Algunos aspectos cuantitativos y cualitativos de la muestra de semen denominados parámetros seminales, se han utilizado de forma rutinaria para evaluar la fertilidad y se han considerado un indicador de la misma(Eskenazi et al., 2003). Los parámetros analizados en un seminograma rutinario son el volumen del eyaculado, la concentración espermática de la muestra, la motilidad y morfología de los espermatozoides que definen la calidad seminal. Otro indicador habitual de la calidad espermática es el recuento de espermatozoides móviles (REM). Al estudiar las correlaciones en comparaciones cruzadas entre los parámetros del seminograma en los varones de nuestra serie se encontró que el REM se correlacionaba lineal y positivamente tanto con la concentración espermática como con la motilidad progresiva (% de espermatozoides con motilidad a+b), con la morfología (medida en % de formas normales) (r= 0,420, P=0,06 y r= 0,336, P= 0,032, respectivamente) (Tabla 11). Algo esperable teniendo en cuenta que, generalmente, cuanto más elevada sea la concentración inicial de espermatozoides, mayor número se recuperará y que existen determinadas alteraciones morfológicas que dificultan la motilidad del espermatozoide disminuyendo el número de ellos recuperados. Se estableció también una correlación positiva entre motilidad progresiva y morfología espermática (r= 0,305, P= 0,048) (Tabla 11), probablemente debido a que existen ciertas anomalías morfológicas que compromenten el desplazamiento de los espermatozoides. Independientemente de la posible influencia de los factores analizados, existe una tendencia global al deterioro de la calidad seminal en el tiempo, para cada franja de edad. Un estudio sobre más de 26000 hombres realizado en Francia a lo largo de 17 años determinó la existencia de una disminución continua significativa en la concentración espermática de alrededor del 1,9% al año así como una disminución significativa no cuantificable en el porcentaje de formas normales y una ligera disminución de la motilidad pero sin una tendencia clara (Rolland et al., 2013). 133 DISCUSIÓN 1.1. PARÁMETROS SEMINALES Y EDAD Numerosos estudios han analizado el efecto de la edad sobre el deterioro de los parámetros seminales. La cuestión de la edad avanzada es un tema que va adquiriendo más importancia a medida que las parejas van retrasando el momento de tener descendencia, debido al aumento de la esperanza de vida, a los avances en el campo de la reproducción asistida y a un conjunto de cambios sociológicos (Sartorius and Nieschlag, 2010). Está comprobado que la fertilidad femenina se reduce en las mujeres a partir de los 35 años, a pesar de estar mucho menos investigado, también hay evidencias que sugieren que el aumento de la edad del varón está asociado a una disminución en la fertilidad con independencia de la edad materna (Aitken, 2014). La Rochebrochard, en dos análisis sobre 6188 parejas europeas y 1938 hombres con parejas estériles, respectivamente, establece los 40 años como la edad paterna a partir de la cual se observa mayor riesgo de infertilidad (La Rochebrochard and Thonneau, 2003; La Rochebrochard et al., 2006). La primera parte de este estudio analizó si la calidad seminal del grupo total de pacientes se veía afectada por la edad. Analizando los datos de nuestro trabajo no observamos que la edad influya en el hecho de presentar un seminograma normal o no (Tabla 6). Estos datos no coinciden con otros investigadores, cuyos estudios revelan que a medida que la edad aumenta la calidad seminal disminuye (Eskenazi et al., 2003; Kuhnertet al., 2004). Sin embargo, hay que considerar que el rango de edad de la población estudiada osciló entre 24,5 y 51,4 años,con una media de 38,51 ± 0,94, y el efecto deletéreo de la edad en el varón si bien es progresivo es más manifiesto a partir de la cuarta década. Al analizar por separado los parámetros más importantes del seminograma como la concentración, la motilidad y la morfología también encontramos que son variables independientes de la edad (Tablas 7, 8 y 9). Los datos que hemos obtenido coinciden con algunos estudios realizados por otros grupos que tampoco encuentran asociación entre la edad y la concentración, concluyendo que en concreto el conteo de espermatozoides no disminuye al aumentar la edad del sexo masculino (Kidd et al., 134 DISCUSIÓN 2001;Johnson et al., 2015). Incluso hay autores que hablan de un aumento en la concentración espermática asociada al incremento de edad en hombres infértiles que, sin embargo, no se produce en hombres fértiles (Brahem et al., 2011). En el estudio del grupo de Johnson se ha detectado que este sorprendente aumento que se produce de la concentración está asociado en muchos casos a una disminución en el volumen de la muestra. Lo que se estaría produciendo es un aumento en el número de espermatozoides por mililitro más que un incremento real del número de espermatozoides totales en el eyaculado (Johnson et al., 2015).Nosotros, sin embargo, no encontramos que la edad afecte negativamente a la concentración pero tampoco que el volumen de eyaculado disminuya con la edad de nuestros pacientes. Todos los pacientes hipospérmicos de nuestro estudio tenían una edad inferior a la edad media de la muestra (38,51 años). A pesar de que la concentración parece ser para algunos autores la variable menos afectada por la edad (Kiddet al., 2011; Johnson et al., 2015), muchos estudios encuentran una correlación negativa con otros parámetros del seminograma, observando descensos asociados con la edad en parámetros tan importantes como motilidad y morfología (Kidd et al., 2001; Johnson et al., 2015). A pesar de eso, y basándonos en los datos obtenidos, nosotros no podemos establecer correlación alguna, coincidiendo con otros autores que tampoco encuentran evidencias de que la edad afecte a ninguno de estos dos parámetros (Nijs et al., 2011; Brahem et al., 2011). En un metanálisis publicado por Li y colaboradores en el 2001 en el que se incluían 57 estudios y casi 30000 pacientes de 26 países encontraron que la edad no afectaba de manera consistente ni a la concentración de espermatozoides ni a la morfología de los mismos (Li et al., 2011). Lógicamente, al no encontrar relación entre la edad y los parámetros seminales en nuestros pacientes, tampoco observamos relación alguna con el resultado del REM. En este caso, los resultados están dentro de lo esperado ya que el REM es una consecuencia de la calidad de la muestra (Tabla 10). Los resultados de los estudios sobre el efecto de la edad en los parámetros seminales son heterogéneos y controvertidos. Hay autores que señalan que la mayoría 135 DISCUSIÓN de estos estudios están realizados en pacientes que provienen de las consultas de andrología o de las consultas de fertilidad (Kidd et al., 2001) lo que supondría un sesgo importante que distorsionaría los resultados. Es difícil separar el efecto de la edad de otros posibles contaminantes ambientales u otros disruptores endocrinos, patología asociada y estilos de vida que podrían afectar negativamente a los parámetros seminales. Estos factores externos pueden generar confusión y su efecto quedar enmascarado, atribuyendo, en determinados casos, el descenso de la calidad espermática únicamente al aumento de la edad. A esto hay que añadir el hecho de que, en muchos casos, no se han tenido en cuenta aspectos importantes como periodos de abstinencia sexual excesivamente elevados (Levitaset al., 2007), además de que es raro encontrar estudios que incluyan a pacientes mayores de 60 años (Brahem et al., 2011). 1.2. PARÁMETROS SEMINALES Y TABAQUISMO Existen varios agentes externos que pueden afectar negativamente a la espermatogénesis y como consecuencia influyen en la calidad seminal, y uno de los más estudiados es el tabaco. El tabaquismo se ha identificado desde hace tiempo como factor asociado con una disminución de los valores de los parámetros básicos del seminograma que determinan el estudio de la infertilidad masculina como son la concentración, motilidad y morfología de los espermatozoides. La mayoría de las publicaciones coinciden en que el tabaco afecta negativamente a los parámetros seminales aunque la afectación es más o menos severa según el estudio en concreto (Liet al., 2011; Taha et al., 2012; Al‑Turki, 2015). Sin embargo, hay autores que no encuentran relación entre el tabaquismo y la calidad del semen a no ser que su efecto se combine con el consumo de alcohol (Martini et al., 2004; Pasqualottoet al., 2005), o ni siquiera en esos casos (de Jong et al., 2014). El 46,34% de los varones que componen la población de estudio son fumadores. En nuestroestudio encontramos que los pacientes que fumaban tenían alteración en alguno de los parámetros del seminograma en un porcentaje significativamente mayor que aquellos que no eran fumadores (P = 0,03) (Tabla 6), de 136 DISCUSIÓN modo que existe una relación inversa entre el consumo de tabaco y la normozoospermia (normalidad en los parámetros del seminograma), es decir, el consumo de tabaco influye negativamente en la normozoospermia. Al analizar por separado los distintos parámetros seminales, las diferencias encontradas en la concentración y en la morfología con respecto al consumo de tabaco, no son significativas. Ambas son, por separado, variables independientes del consumo de tabaco (Tablas 7 y 9). En el caso de la concentración, nuestros resultados coinciden con otros estudios en los que encuentran que el consumo de tabaco no tiene efectos significativos sobre estos dos parámetros (Pasqualottoet al., 2005; de Jong et al., 2014). No ocurre lo mismo con otros autores que observan un descenso significativo en la concentración de espermatozoides en los varones fumadores con respecto a los no fumadores (Caserta et al., 2013). Si analizamos la morfología espermática y también coincidiendo con los datos publicados por los grupos de Caserta y Pasqualotto, encontramos que el porcentaje de espermatozoides con morfología normal se redujo en los fumadores pero no lo hizo de manera clínicamente relevante(Caserta et al., 2013; Pasqualotto et al., 2005). La motilidad, en cambio, disminuyó en el grupo de fumadores de nuestra población de un modo significativo (P= 0,03) (Tabla 8). Nuestros resultados coinciden con grandes series como la del grupo deCaserta, con 296 pacientes (Caserta et al., 2013), observándose una relación positivaentre la astenozoospermia y el consumo de tabaco. La elevada concentración de óxido nítrico o de malondialdehido u otros agentes peróxidos ha sido descrita en varones fumadores, incluso con normozooospermia, y se postula como uno de los mecanismos por los que se podría afectar la motilidad espermática (Ghaffari and Rostami, 2012).Otros grupos no encontraron correlación del tabaquismo con la movilidad al estudiar varones infértiles (Künzle et al., 2003;de Jong et al., 2014) o población de fertilidad probada (de Jong et al., 2014). Por otra parte, en nuestra muestra,no se aprecia dependencia entre la alteración en la motilidad y la intensidad del consumo. Dentro del grupo de los 137 DISCUSIÓN fumadores no se observa dependencia entre el daño producido en la motilidad y el número de cigarrillos consumidos(dato no mostrado). En este aspecto, un estudio realizado por Pasqualotto y cols. concluyen que no hay diferencias entre los distintos grupos de fumadores en función de la intensidad de consumo, y los parámetros seminales (Pasqualottoet al., 2005). No es descartable que la información aportada por los pacientes en relación a la intensidad de consumo de tabaco, sea inexacta. Por otro lado, analizando la posible relación entre consumo de tabaco y el REM encontramos que esteparámetro eraindependiente de la condición o no de fumador. Sin embargo, como explicábamos anteriormente, sí hallamos asociación entre el consumo de tabaco y la motilidad. Estos hechospueden deberse a que, a pesar de que el REM está muy asociado a la motilidad espermática, tanto la concentración como la morfología también intervienen en su resultado. El efecto del tabaco sobre la motilidad podría verse compensado por los otros dos parámetros, que en nuestra población no se ven perjudicados. Según la OMS el consumo de tabaco mata a más de 5 millones de personas al año y es responsable de la muerte de 1 de cada 10 adultos. A esto hay que unir los elevados gastos de salud pública relacionados con el tratamiento de enfermedades causadas por el tabaco. Además, a pesar de que se continúa investigando, parece probable que el consumo de tabaco afecte a los parámetros seminales,y sí se ha detectado que determinados componentes del tabaco atraviesan la barrera hematotesticular (Vine et al., 1993), pero se desconocen los mecanismos fisiopatológicos por los que el tabaco afecta a la calidad seminal. Hay trabajos que evalúan el efecto que tiene en los fumadores el dejar de fumar y encuentran que pasados 3 meses algunos parámetros seminales mejoran en los exfumadores (Santoset al., 2011). Por otra parte el efecto nocivo del tabaco puede manifestarse a otros niveles que determinan la capacidad fecundante o la calidad del material genético del espermatozoide que no son detectables en el estudio básico seminal. 138 DISCUSIÓN 2. FRAGMENTACIÓN BASAL DEL ADN ESPERMÁTICO En los últimos años, se ha unido al estudio de las variables clásicas del seminograma, la posibilidad del análisisde la fragmentación del ADN espermático. La integridad del material genético, tanto del gameto femenino como masculino, es esencial para el correcto desarrollo del embrión. El daño en el ADN de los espermatozoides se puede producir, como ya se ha relatado, por numerosos factores. Entre los más comunes encontramos deficiencias en el empaquetamiento de la cromatina espermática, mal funcionamiento del proceso apoptótico previo a la eyaculación y la acción de las ROS. El test SCD ha sido la técnica de estudio elegida en este trabajo para evaluar la fragmentación del ADN espermático. Esta técnica es sencilla, reproducible, económica y que, además, no necesita invertir en aparataje muy costoso como ocurre con otras disponibles en el mercado. Se trata, por tanto, de una técnica fácilmente incorporable a los laboratorios de fecundación in vitro ypuede constituir una herramienta valiosa. Otros métodospara medir la fragmentación, como SCSA y TUNEL,proporcionan resultados similares (Chohan et al., 2006; Ribas-Maynou et al., 2013) pero requieren equipos costosos y, SCSA, también capacitación especializada. El establecimiento de un punto de corte para la interpretación del test de fragmentación basalha sido objeto de debate desde que se popularizó el estudio de la fragmentación espermática.Se ha utilizado como punto de corte para nuestro estudio el valor umbral de fragmentación que estableció Evenson (30%) por debajo del cual se reducían mucho las probabilidades de conseguir un embarazo (Evenson et al., 2002; Bungum et al., 2008).Ese punto de corte ha sido bastante discutido y hasta el momento no se ha conseguido precisar el valor exacto por encima del cual no se consiga embarazo. El nivel de corte para los valores de fragmentación del DNA propuesto por Evenson establece que la probabilidad de la fertilización in vivo es cercana a 0 si la proporción de espermatozoides con daño excede el 30%. Utilizando este mismo punto de corte, hemos obtenido dos subgrupos con el mismo número de individuos (21 y 20, respectivamente), y el valor medio de fragmentación basal del grupo de pacientes que no alcanzaron el umbral del 30% de 139 DISCUSIÓN fragmentación de su ADN espermático fue de 18% mientras que la del otro subgrupo fue de 47% (29 puntos superior) y las diferencias entre ambos fueron altamente significativas (P= 0,003) (Tabla 12).El umbral del 30% se describe como el efecto “punta del iceberg”, esto es, el daño en el ADN identificado en el 30% de los espermatozoides indica una anormalidad en la población entera que causa infertilidad in vivo (Evenson et al. 2002).Los resultados del análisis de fragmentación basal mostraron que el 50% de nuestra población presentaba valores de fragmentación del ADN espermático patológicos (≥ 30%). 2.1. FRAGMENTACIÓN BASAL Y PARÁMETROS SEMINALES Los datos obtenidos en nuestro estudio muestran que los varones que han tenido los parámetros seminales convencionales de concentración, motilidad y morfología dentro de los valores normales (normozoospérmicos) en relación con los que no lo eran (no normozoospérmicos) se distribuyeron de modo diferente entre los dos grupos de fragmentación basal, con un sesgo a encontrarse más pacientes normozoospérmicos en el grupo de fragmentación basal <30% que en el otro, evidenciándose diferencias significativas en la distribución, aunque presentaron porcentajes medios de fragmentación similares (P= 0,02) (Tabla 14).Basándonos en estos datos, parece que el resultado de un seminograma básico, por sí sólo, no predice los valores mediosde fragmentación. No podría garantizarnos menores tasas de fragmentación en el caso de pacientes normozoospérmicos, ni prever que los varones no normozoospérmicos van a presentan mayor daño espermático. Estas circunstancias son coincidentes con lo encontrado en otros trabajos previos, en los que, hombres con muestras de semen normales pueden tener un nivel elevado de fragmentación basal, mientras que otros con una calidad espermática inferior pueden tener niveles mínimos de daño en el ADN(Brahem et al., 2011) o que no observan relación entre el daño en el ADN espermático y los parámetros seminales (concentración, motilidad y morfología) (Zini et al., 2005). Del mismo modo, los pacientes oligozoospérmicos de nuestro estudio presentan una tasa media de fragmentación basal sólo ligeramente más elevada que 140 DISCUSIÓN los que tienen una concentración espermática normal y algo similar en sentido contrario ocurriría para pacientes astenozoospérmicos y teratozoospérmicos, y en todos los casos sin tratarse de diferencias significativas (Tablas 15, 16 y 17). Lo que indicaría que los parámetros seminales y la fragmentación del ADN espermático son variables independientes (Brahem et al., 2011). Sin embargo, otros estudios previos señalan que los pacientes normozoospérmicos presentan un porcentaje menor de espermatozoides con el ADN dañado que varones que no lo son, en concreto, oligozoospérmicos o teratozoospérmicos (Tomlinson et al., 2001). Por otro lado, cuando se correlacionaron los parámetros seminales, por separado, las alteraciones seminales ya sea de concentración, de motilidad o de morfología, eran independientes de la fragmentación del ADN de los espermatozoides (Tablas 15, 16 y 17).También en esto coincidimos con otros trabajos en los que no existió relación entre la fragmentación basal y parámetros clásicos analizados por separado, como la morfología (Irvineet al, 2000) o la concentración (Sheikh et al., 2008; Tandara et al., 2013). Otros, por el contrario, encuentran una fuerte correlación entre motilidad y fragmentación (Palermo et al., 2014). El estudio de la posible relación entre el REM y el daño basal en el ADN espermático encontramos una tendencia entre ellos, cuanto mayor es el número de espermatozoides recuperados menor es el porcentaje de fragmentación basal de la muestra, a pesar de lo cual no se demuestra que las variables sean estadísticamente dependientes. El estudio revela diferencias de hasta 8 puntos porcentuales de fragmentación basal media entre los subgrupos de mayor y menor REM (Tabla 18). El análisis de correlación evidenció que tampoco existe relación lineal entre la fragmentación del ADN espermático y ninguna de las variables de calidad seminal analizadas (Tabla 19). Los numerosos y variados resultados que hemos encontrado publicados son, en muchos casos, contradictorios y ponen de manifiestoque los análisis convencionales de las muestras seminales no siempre son predictivos de los niveles de daño en el ADN espermático (Lewis, 2007), lo cual coincidiría con lo encontrado por nosotros en el análisis de la fragmentación basal y los parámetros de calidad del seminograma. Esta 141 DISCUSIÓN disparidad en la bibliografía puede tener su origen en varios factores que limitan el estudio. Por un lado, la heterogeneidad que existe en una población de espermatozoides dificulta mucho el examen de las posibles interacciones entre los parámetros seminales (Tomlinson et al., 2001). Además, se ha comprobado que los niveles de fragmentación pueden fluctuar en el tiempo y encontrarse valores diferentes en muestras del mismo individuo obtenidas en diferentes días (Lewis, 2007). Por otro lado,la mayoría de estos estudios están realizados en varones incluidos en consultas de andrología o de fertilidad (Kidd et al., 2001), lo que podría sesgar la muestra. En cualquier caso, no se ha llegado a determinar que la fragmentación del ADN espermático esté relacionada con los parámetros seminales, lo que justificaría el análisis de ambos durante una evaluación integral de la infertilidad masculina (Evgeni, 2014). En los últimos años, se ha intentado profundizar en la repercusión que tiene la integridad de la cromatina en la fertilidad del varón para intentar incorporarla a los parámetros tradicionales de las pruebas seminales. Lamentablemente, ningún parámetro, por sí sólo, parececapaz, hoy por hoy, de predecir la infertilidad masculina. Se sigue investigando para intentar encontrar la prueba o el conjunto de ellas que nos permitan, por fin, determinar con rigor absoluto si un varón es fértil o no lo es. 2.2. FRAGMENTACIÓN BASAL Y EDAD La edad de los varones es una de las variables de nuestro estudio que más afecta a los niveles de fragmentación del ADN espermático (P= 0,01) (Tabla 13). A pesar de que los riesgos potenciales que implica la edad avanzada de la mujer sobre los resultados reproductivos están perfectamente descritos (Smith et al., 1996; Berkowitz et al., 1990; Breart, 1997) , no existe la misma cantidad de bibliografía referente a la edad del hombre. La edad puede afectar, además de a la calidad del semen, también a la integridad del ADN de los espermatozoides. Como ya hemos visto al comienzo de esta discusión, en nuestra población, los parámetros seminales son independientes de la edad, pero no ocurre lo mismo si lo que analizamos es la fragmentación basal del ADN espermático.Nuestros resultados 142 DISCUSIÓN evidencian que la proporción de espermatozoides con el ADN fragmentado fue, de media,10 puntos porcentualessuperior en pacientes con edades superiores a los 40 años que en los pacientes más jóvenes(Tabla 13), aunque no llegue a ser una correlación lineal la relación existente entre ambos parámetros. La mayoría de los autores llegan a la misma conclusión y encuentran una relación positiva entre la edad y el daño en el ADN espermático (Sánchez Toledo et al., 2013, Johnson et al., 2015), aunque otros las consideran variables independientes tanto en varones fértiles como en infértiles (Nijs et al., 2011; Khalili, et al., 2006; Brahem et al., 2011). El aumento en el porcentaje de fragmentación basal del ADN que hemos observado en nuestro trabajo, coincide con los resultados que cabría esperar, ya que se sabe que con la edad se producen cambios en todo el sistema reproductor masculino, producción de hormonas reproductivas, función sexual, morfología testicular, parámetros seminales, integridad del ADN, fertilidad, etc.(Sartorius et al., 2010; Sharma et al., 2015). Muchos autores han especulado sobre que las asociaciones de estos parámetros no son únicamente consecuencias directas del envejecimiento sino también de los efectos acumulativos que tiene la exposición a tóxicos y contaminantes (Kidd et al., 2001). A pesar de que numerosos autores han estudiado cómo afecta la edad avanzada del varón a la integridad del ADN de los espermatozoides, los resultados aún no son concluyentes. Hay estudios que sugieren que la fragmentación del ADN debe ser un análisis de rutina para varones de edad avanzada, a los que se debe avisar de los riesgos potenciales que su edad implica (Das et al., 2013; Johnson, et al., 2015). Es preciso considerar que además del posible aumento del porcentaje de espermatozoides con el ADN dañado, la influencia negativa de la edad puede determinar un incremento de alteraciones genéticas en la descendencia como, por ejemplo, en la tasa de aneuploidías (Sartorius et al., 2010). Se desconoce exactamente el impacto del incremento de la edad paterna en la integridad del ADN espermático y, aunque se trata de un elemento muy presente en la investigación de la fertilidad masculina, se necesitan más estudios al respecto. Para evitar sesgos muestrales, se debería ampliar el muestreo, evitando ceñirse a pacientes 143 DISCUSIÓN que provengan de las consultas de esterilidad o de andrología, aumentando el tamaño de las muestras e incluyendo en ella pacientes de edades avanzadas. A la vista de nuestros resultados y coincidiendo los resultados obtenidos por la mayor parte de los investigadores, sería conveniente proponer a los pacientes de edad avanzada, independientemente de que tengan los parámetros seminales normales o no, la realización de una prueba de fragmentación como complemento al seminograma y como parte de la evaluación de la pareja. Si bien la edad límite del varón para la solicitud de esta prueba no está claramente establecida, su realización se considera en protocolos de estudio de fallo de implantación, incluso ante seminogramas normales. En los programas de ovodonación, en los que la edad media de las parejas es más avanzada y especialmente ante un ciclo fallido, muchos centros recomiendan el estudio de la fragmentación del ADN para descartar la interferencia de un factor masculino a menudo inadvertido. 2.3. FRAGMENTACIÓN BASAL Y TABAQUISMO Al análisis del efecto del tabaco sobre los parámetros clásicos del seminograma se ha añadido el estudio de cómo puede verseafectada la fragmentación del ADN. Para la mayoría de los estudios, el tabaco tiene un efecto perjudicial tanto en los parámetros seminales clásicos, como se ha relatado antes, como en la integridad del ADN del espermatozoide (Tabla 13). Se han descrito efectos perjudiciales sobre la motilidad del esperma, la fragmentación del ADN y se han correlacionado directamente con la cantidad de cigarrillos y la duración del hábito, incluso en hombres fértiles (Taha et al., 2012). Otros estudios, a pesar de encontrar diferencias en el nivel de fragmentación entre fumadores y no fumadores, no aprecian relación con el nivel de consumo (Caserta et al., 2013). Aunque todavía se desconocen los mecanismos exactos mediante los cuales los componentes del humo del tabaco afectan a la espermatogénesis, se conoce que produce alteraciones en la producción de hormonas en los testículos, aumenta la concentración de radicales libres en el testículo yaumenta el estrés oxidativo en el tracto reproductivo masculino. Este estrés oxidativo se podría traducir, a su vez, en la 144 DISCUSIÓN inducción de altos niveles de daño oxidativo del ADN en los espermatozoides (Aitken, 2014). La nicotina y otros agentes oxidantes pueden producir un aumento de la fragmentación del ADN contenido en la cabeza del espermatozoide y una mayor muerte celular perjudicando así la calidad de los gametos masculinos, que puede también tener un impacto negativo en los resultados de las TRA. Se han desarrollado estudios para intentar comprender de qué manera concreta el tabaco altera a la cromatina del espermatozoide. Hay autores que encuentran una alteración en la relación de histonas y protaminas en un número mayor de espermatozoides en el caso de varones fumadores, lo que podría, en parte, explicar el efecto nocivo del tabaco sobre los parámetros seminales y la fragmentación del ADN espermático Simon et al.,2011; Hamad et al., 2014).Algunos autores encuentran más fragmentación en fumadores que en no fumadores pero sin diferencias suficientes como para hablar de correlación entre estas variables (Saleh et al., 2202b). Otros autores no han detectado que el tabaco tenga ningún efecto, no encuentran diferencias ni entre fumadores y no fumadores, ni tampoco entre los que fuman más o menos; llegando a encontrar incluso tasas mayores de fragmentación en los varones no fumadores (Sergerie et al., 2000). Los resultados obtenidos en este trabajo coinciden con los encontrados por Sergerie, detectando que los pacientes que fuman tienen fragmentaciones basales inferiores en relación a las que se aprecian en los no fumadores, no siendo estas diferencias estadísticamente significativas. A pesar de que determinar cómo afecta el tabaco a la calidad seminal, en general, y conocer los mecanismos exactos implicados, está todavía en vías de investigación, todos los datos sugieren que los componentes tóxicos del tabaco son perjudiciales y se traducen en una reducción de los niveles hormonales y de los parámetros seminales, más o menos importantes y acusadas. Se desconoce igualmente si al dejar de fumar se recupera o no la calidad seminal, ni cuánto tiempo es necesario para recuperarla, ni tampoco el efecto que tiene el humo sobre la calidad seminal en el caso de los fumadores pasivos. Aunque las sucesivas campañas han disminuido la incidencia del consumo, sigue siendo necesario asesorar a todos los pacientes que acuden a las unidades de 145 DISCUSIÓN reproducción asistida sobre la necesidad de evitar la exposición al tabaco antes de que se vayan a someter a un tratamiento de fertilidad, lo que indudablemente mejorará su estado de salud general, probablemente se traducirá en una mejoría de su calidad seminal y contribuirá aumentar sus posibilidades de tener descendencia (Al‑Turki, 2015). 3. FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICOTRAS EL PROCESAMIENTO MEDIANTE SWIM-UP Las técnicas de procesamiento son imprescindibles para poder utilizar las muestras seminales en las TRA. Estas técnicas eliminan el plasma seminal, los espermatozoides inmóviles y otras células presentes en la muestra, como los leucocitos, permitiendo aislar la fracción que contiene los espermatozoides con mejor movilidad y morfología. En los TRA, en general, habría varias causas por lasque el nivel de fragmentación en el momento de la fecundación debería ser, por lo general, mucho más alto que el detectado en el momento de la eyaculación. Las manipulaciones que implica el procesamiento de las muestras podrían afectar negativamente a la calidad de las mismas. Se ha descrito un deterioro de la integridad de la cromatina nuclear como consecuencia de los procesos de centrifugación que, por otra parte, son indispensables para realizar cualquiera de las técnicas de procesamiento. La centrifugación, unido a la coexistencia, durante su procesamiento, de espermatozoides con el ADN intacto con espermatozoides inmaduros provocaría un aumento en los niveles de ROS producidos por estos últimos que afectarían negativamente al resto alterando la integridad de la cromatina e induciendo fragmentación en el ADN espermático (Ollero et al., 2001). Se ha observado también una dinámica de fragmentación asociada al tiempo además de un incremento progresivo en la intensidad del daño que sufre el espermatozoide cuando se incuba a 37°C durante un período prolongado (Nabi et al., 2014). Puesto que la preparación y manipulación de la muestra es imprescindible para su posterior utilización en cualquiera de las TRA, es fundamental reducir al máximo el 146 DISCUSIÓN tiempo de procesamiento de las muestras de semen para minimizar la interacción entre los espermatozoides con ADN dañado y no dañado y dado que el tiempo repercute negativamente en la fragmentación (Caballero et al., 2008). En concreto, el tiempo de incubación a 37°C debe mantenerse por debajo de las 2 horas (Nabi et al., 2014). Teniendo en cuenta que los niveles de fragmentación de una muestra pueden variar desde el momento de su evaluación hasta el momento de su utilización en la técnica de TRA, coincidimos con otros autores que proponen el estudio del daño en el ADN espermático justo en el momento en el que se vaya a realizar la TRA, no antes, para así conocer los valores reales del daño que tiene la muestra en el momento más cercano posible a la fecundación. Si se realizase siempre en ese momento, se conseguiría unificar los resultados entre diferentes laboratorios a la vez que aportar datos más precisos para analizar el impacto negativo de la fragmentación del ADN espermático (Núñez-Calonge et al., 2012). Todas las muestras de este estudio han sido utilizadas en un plazo inferior a 60 minutos desde su procesamiento, intervalo en el cual se realizó el nuevo test de fragmentación, determinándose el porcentaje de espermatozoides con el ADN fragmentado, que es el parámetro que hemos denominado fragmentación post swimup. Todas las muestras analizadas en este estudio fueron sometidas a la técnica swim-up de procesamiento espermático.Según los resultados de este estudio, la técnica de swim-up provoca, además de lo indicado al comienzo de este apartado, una reducción en los porcentajes de fragmentación de las muestras comparándolos con los que encontramos en las mismas muestras antes de su preparación (fragmentación basal). Esto indicaría que la técnica de procesamiento produce un aumento de la calidad de la muestra en cuanto a la fragmentación del ADN, aun cuando la técnica se estableció en su origen para aumentar la calidad de las muestras en parámetros relativos a la movilidad y la morfología espermática, está concebida para seleccionar una muestra enriquecida en espermatozoides con movilidad progresiva mayor y mejores porcentajes de morfología normal (Mortimer, 1994). 147 DISCUSIÓN Numerosos autores coinciden en que es el procesamiento de la muestra en sí lo que disminuye la fragmentación y no depende de la técnica elegida para realizarlo. Hay autores que han comparado las dos técnicas más utilizadas, el swim-up y los gradientes de densidad. Algunos de ellos se decantan por una de las dos técnicas encontrando un porcentaje significativamente mayor de espermatozoides con la cromatina intacta tras procesar la muestra mediante swim-up con respecto a hacerlo utilizando gradientes de densidad (Zini et al., 2000). Otros autores no encuentran diferencias en los resultados que obtienen y observan que ambas técnicas producen una reducción significativa en los niveles de fragmentación (Jackson et al., 2010;Jayaraman et al., 2012). Este último grupo incluso analiza una combinación de las dos técnicas y, comparando los tres métodos, comprueban que cualquiera de ellos consigue un enriquecimiento de espermatozoides con la cromatina intacta (Jayaraman et al., 2012). A pesar de ciertas publicaciones discrepantes, la mayoría de los autores coinciden en la mejoría observada en cuanto al porcentaje de fragmentación tras el procesamiento de la muestra, tal como ocurre en nuestro caso. No se ha encontrado bibliografía relevante referente a la magnitud de la variación de la fragmentación tras el procesamiento de la muestra. 3.1. FRAGMENTACIÓN POST SWIM-UP Y FRAGMENTACIÓN BASAL La disminución observada, en nuestros pacientes, en el daño de la cromatina de los espermatozoides post swim-up se produce tanto en las muestras de varones que tienen un porcentaje de fragmentación no patológico (<30%) (reducción de 11 puntos porcentuales) como en aquellas en las que es patológico (≥30%) (reducciónde 47 puntos porcentuales). Estos resultados muestran queel swim-up mejora el porcentaje de espermatozoides con el ADN intacto, en general, para cualquier valor de fragmentación inicial de la muestra (Fig. 25). La mayor parte de las publicaciones coinciden con nuestros datos y relatan una disminución en la fragmentación más o menos elevada como consecuencia del procesamiento de la muestra (Tomlinson et al., 2001; Bungum et al., 2008; Wang et al., 2014). Los resultados obtenidos forman parte de lo esperado ya que las técnicas de preparación espermática tienen como objetivo 148 DISCUSIÓN eliminar, además del plasma seminal, otros tipos celulares y componentes presentes en la muestra en fresco así como los espermatozoides que tienen peor motilidad y los inmóviles. Este tipo de espermatozoides suele presentar el ADN más fragmentado (de Lamirande and Gagnon, 1995) con lo cual es lógico que al eliminarlos se obtenga una muestra con mayor concentración de espermatozoides con el ADN intacto que es la que se va a utilizar para la TRA elegida. El valor medio de fragmentación post swim-upde nuestra poblaciónfue 10,03 ± 1,83 [0,10 - 8,90] % de espermatozoides fragmentados, es decir, 22 puntos porcentuales menor que el valor medio de la fragmentación basal(31,83 ± 2,97 [5,50 95,20] % de espermatozoides fragmentados), unas diferencias muy significativas (P= 0,00)que suponen una reducción de más de 2/3, de manera que el 90% de los pacientes tuvieronvalores de fragmentación post swim-up inferiores al 30%, mientras que en el caso de la fragmentación basal, sólo el 50% se encontraba por debajo de dicho umbral (Fig. 24). Nuestros resultados demuestran que el procesamiento de las muestras mejora la calidad espermática de las mismas no sólo a nivel de la movilidad y morfología, que era el resultado esperado, sino también a nivel de la fragmentación del ADN espermático(Tabla 25). El porcentaje medio de fragmentación post swim-up (6,41 ± 0,50) fue significativamente inferior en las muestras que partían de una fragmentación basal inferior al 30% que en aquellas que la tenían igual o superior (13,83 ± 0,51), circunstancia que cabría esperar al partirse de muestras menos y más fragmentadas respectivamente (P= 0,04) (Tabla 26). Los análisis de correlación entre ambos tipos de fragmentaciones del ADN espermático estableció fuerte correlación positiva entre ambos parámetros (r= 0,463, P= 0,02) (Tabla 27).Analizando lavariación de la fragmentación respecto a la basal se encontró quela magnitud de la variación que experimenta la fragmentación en los varones cuya fragmentación basal era menor de 30% (11,4 p.p.), es significativamente inferior a la de aquellos cuya fragmentación basal era mayor o igual a 30% (32,8 p.p.) (P= 0,00)(Tabla 33). Esto significaría que el nivel de fragmentación descendió significativamente más en el grupo de muestras más fragmentadas basalmente.El análisis de correlación estableció una correlación positiva 149 DISCUSIÓN altamente significativa entre los valores de variación de fragmentación y sus resrespectivos porcentajes de fragmentación basal para cada paciente (P= 0,000) (Tabla 34 y Fig. 29). Sin embargo, se observa en la Tabla 34, que no se estableció correlación significativa de la variación, en disminución de la fragmentación, con su resultado final, es decir con la fragmentación post swim-up. Tomando en su conjunto todos estos hechos, puede decirse que el procesamiento de la muestra seminal es más efectivo en mejorar la calidad espermática, no sólo para seleccionar motilidad y morfología, sino también disminuir el porcentaje de espermatozoides con fragmentación de su ADN. Esta disminución es más acusada en aquellos pacientes que presentaron mayores porcentajes de fragmentación basal, de manera que, finalmente, el procesamiento acerca en sus niveles de fragmentación a ambos tipos de pacientes, aquellos que partían de porcentajes de fragmentación basal no patológicos (< 30%) y aquellos pacientes que eran patológicos para ese parámetro (≥ 30%). Esto podría ser debido a que, cuantos más espermatozoides con el ADN dañado tenga la muestra, más posibilidades hay de que la técnica los elimine. Al mismo tiempo, revisando los datosemanados de laFigura 27, se observandescensos en la fragmentación de hasta 66 puntos porcentuales en el mejor de los casos (muestra 23, Fig. 27). Únicamente en dos individuos la fragmentación aumentó, siendo en ambos un incremento poco importante (muestras 6 y 20, Fig. 27), y existe un tercer caso en el que la mejora es mínima (muestra 9, Fig. 27). En la muestra para la que el swim-up tiene peor impacto(muestra 20, Fig. 27), se produce un aumento de 6,5 p.p., pasando de tener un valor de fragmentación considerado no patológico (21% > 30%) antes del procesamiento a encontrarse entre las muestras de peor valor tras el procesamiento (27%). En el otro caso, el aumento no llega a un 1 p.p. pero a pesar de que presentaba un valor basal bastante favorable (16%), y el cambio es mínimo, el valor post swim-up (17%) se encuentra por encima de la media. La muestra en la que la disminución es menor, tan sólo 0,2 p.p. pasa de un valor de fragmentación basal muy favorable (10,3%) a un valor de fragmentación post swim-up ligeramente por encima de la media (10,1%). Esos tres casos pertenecían al 150 DISCUSIÓN subgrupo de fragmentaciones basales menores del 30%, mientras en el otro grupo había numerosos pacientes que, partiendo de valores muy elevados de fragmentación basal (>30%), estos se reducen, tras el procesamiento, hasta niveles que se encuentran por debajo del valor medio de fragmentación postswim-up. Todos estos datos también corroborarían lo referido acerca de que el procesamiento afecta más acusadamente, disminuyendo los niveles de fragmentación, a las muestras más fragmentadas basalmente. 3.2. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN, EDAD Y TABACO Una vez comprobada la relación entre la fragmentación post swim-up y la fragmentación basal y analizado también el efecto positivo que la variación de la fragmentación, producida por el procesamiento, tiene sobre la fragmentación basal de la muestra (Fig. 25),se ha analizado el alcance de estos parámetros en relación con otras características de los varones de la serie. Se encontraron ligeras diferencias en los porcentajes medios de fragmentación del ADN espermático post swim-up en los varones menores de 40 años respecto a los que tienen 40 años o más, siendo la fragmentación más alta en estos, pero sin significación estadística (Tabla20). Al analizar globalmente los porcentajes de fragmentación post swim-up de cada paciente, en relación con su edad, no existió correlación lineal estadísticamente significativa entre ambos parámetros (r = -0,045, P = 0,781). Sin embargo, en relación con la variación de la fragmentación, en el subgrupo de varones con edad < 40 años, la variación en el porcentaje de fragmentación del ADN espermático producida por el swim-up, es muy inferior a la observada en el subgrupo de edad ≥ 40 años (casi 10 puntos menos). Los valores de partida de porcentajes de fragmentación de los varones jóvenes eran significativamente mejores (28,28 ± 0,45 frente a 38,69 ± 0,60 en los mayores de 40 años; P=0,01) (Tabla 28)). Analizando la variación de la fragmentación en relación con la condición de fumador, apesar de ser más efectivo el swim-up para descartar espermatozoides con el 151 DISCUSIÓN ADN fragmentado en los no fumadores las diferencias no son estadísticamente significativas con respecto al otro grupo (Tabla 29. 3.3. VARIACIÓN DE LA FRAGMENTACIÓN Y CARACTERÍSTICAS SEMINALES En relación a la condición de normozoospermia, se establece un descenso en los porcentajes de fragmentación que parecerían indicar que la técnica de swim-up es ligeramente menos efectiva en la eliminación de espermatozoides con el ADN fragmentado en el caso de que las muestras sean normales respecto a las que no lo son. Pero hay que tener en cuenta que en las muestras normales, se partía de una fragmentación basal ligeramente menor, aunque no puede descartarse un efecto correlacionado a lo que ocurre con respecto a la fragmentación basal (Tabla 30). Del mismo modo, las variaciones en los porcentajes medios de fragmentación espermática en varones con las diferentes alteraciones en los parámetros seminales en comparación con las muestras normales, no arrojaron diferencias significativas para ninguna de las alteraciones seminales (Tabla 31). De esto se puede concluir que el procedimiento del swim-up es igualmente efectivo, a la hora de eliminar fragmentación del ADN, en el caso de utilizarlo para procesar muestras alteradas que las que no lo son. En referencia al REM, la variación de la fragmentación fue más acusada para los los dos grupos con menor recuento de espermatozoide móviles, mientras que disminuyó para el grupo de REM>5, no alcanzando las diferencias entre grupos significación estadística(Tabla 32). Hay que tener en cuenta que para el grupo con mayor REM se partía de una media de fragmentación basal por debajo del 30%, y no era el caso para los otros dos grupos de pacientes, con niveles menores de REM, en los que se partía de porcentajes medios de fragmentación basal por encima del 30%. Esta tendencia a encontrar mayor recuperación de semen normal cuanto peor era la calidad de partida, concuerda con lo encontrado entre los subgrupos de fragmentación basal y post swim-up. 152 DISCUSIÓN 4. FACTOR MASCULINO EN LOS RESULTADOS DE LOS CICLOS DE ICSI Los parámetros utilizados en nuestro estudio para valorar el resultado de los ciclos, son: tasa de fecundación, calidad embrionaria, tasa de implantación y gestación. Según los resultados de la bibliografía, la relación entre fragmentación y éxito en TRA va a depender de la técnica reproductiva utilizada. Se estableceuna relación negativa entre el elevado porcentaje de fragmentación y el embarazo natural o en elconseguido mediante inseminación artificial (IA) (Duran et al., 2002) que no se mantiene cuando se trata de pacientes sometidas a fecundación in vitro (FIV)o a ICSI (Larson-Cook et al., 2003).De manera que cuanto más selectiva para el factor masculino es la técnica, menor es el efecto perjudicial de una elevada fragmentación. En nuestra serie, todas las pacientes fueron sometidas a la técnica de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), procedimiento en que cada espermatozoide es seleccionado individualmente. 4.1. RESULTADOS DEL CICLO ICSI Y EDAD DEL VARÓN Varios estudios determinan que la implantación, la calidad de los embriones y el éxito de la gestación son independientes de la edad del varón (Bellver et al., 2008) o que no existen diferencias en cuanto a los resultados del ciclo en función de la edad (Gallardo et al., 1996). Nuestros resultados están en consonancia con estos autores, en cuanto a la independencia estadística de la implantación, la calidad embrionaria y la gestación respecto a la edad de los varones, aunque sí detectamos diferencias, no estadísticamente significativas, para los tres parámetros entre ambos grupos de edad, a favor del grupo de varones más jóvenes. La tasa media de fecundación, sin embargo, sí es significativamente mayor para varones menores de 40 años, con diferencias de 15 puntos entre ambos grupos de edad (P= 0,049) (Tabla 35). Se observó una tendencia similarpara la tasa de implantación, con casi 14 puntos de diferencia entre los varones de mayor y menor edad, aunque sin significaciónestadística (Tabla 35).Tampoco se encontraron diferencias estadísticamente significativas en cuanto a calidad embrionaria y gestación en relación con los dos grupos de edad del varón, pero los 153 DISCUSIÓN datos también evidencian tendencias en el mismo sentido. El porcentaje de ciclos en los que se obtienen embriones G1 y G2 es casi 10 puntos mayor en el grupo de varones de menor edad (74,1% frente a 64,3%) y el porcentaje de gestaciones obtenidas es mucho mayor, 49 puntos, en el grupo de los varones más jóvenes (Tabla 36 y Fig. 30). 4.2. RESULTADOS DEL CICLO ICSI Y CARACTERÍSTICAS SEMINALES No se encontró correlación estadísticamente significativa entre la tasa de fecundación y las variables de la muestra seminal analizadas, volumen, concentración, motilidad, morfología y el REM (Tabla 41). Los resultados de nuestro estudio indican que la calidad embrionaria es independiente de la existencia de cualquier alteración en el seminograma y del REM (Tabla 39). La tasa de implantación presenta correlación lineal positiva estadísticamente significativa con el porcentaje de formas normales (P= 0,014), no existe significación estadística en la correlación con las otras variables, volumen, concentración, motilidad y REM (Tabla 41). La tasa de gestación y la condición de normozoospermia, se comportan como variables positivamente dependientes (P= 0,03). El 16% de las parejas con muestras teratozoospérmicas, se embarazan, frente al 53% en aquellas con muestras consideradas morfológicamente normales, siendo esta diferencia estadísticamente significativa. Las diferencias encontradas entre la existencia o no de oligozoospermia y astenozoospermia, en cuanto a gestación, no son estadísticamente significativas, lo mismo sucede con las diferencias entre los tres grupos de REM. La alteración en la morfología es la única que afecta negativamente, de forma significativa, tanto a la tasa de implantación como a la de gestación (P= 0,04) (Tabla 40). Estas deducciones van en la misma línea que otras investigaciones que indican que los varones con menor porcentaje de gametos morfológicamenteanormales tienen menor probabilidad de producir embarazo natural (Menkveldet al., 2001) o cuando sus parejas son tratadas con inseminación (Van Waartet al., 2001) o fecundación in vitro (Krugeret al., 1988). Algunos investigaciones, por el contrario, concluyen que los resultados del embarazo son independientes de los parámetros seminales (Larson-Cook et al., 2003). 154 DISCUSIÓN 4.3. RESULTADOS DEL CICLO ICSI Y FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO Se analizó si la fragmentación basal de las muestras seminales afectaba a los resultados del ciclo. Según los resultados obtenidos, no encontramos ninguna relación entre los valores de fragmentación basal y ninguno de los parámetros con los que evaluamos el resultado del ciclo de ICSI. Muestras con valores de fragmentación basal superiores al 30% son capaces de conseguir tasas de fertilización (Tabla 42), calidades embrionarias (Tabla 43), tasas de embarazo clínico (Tabla 45) y de implantación (Tabla 44) semejantes a las muestras que con niveles de fragmentación inferiores. Este fenómeno ya había sido descrito en la literatura, donde se describe que la fragmentación de ADN basal no se correlaciona con los resultados del ciclo de ICSI (Anifandis et al., 2014; Palermo et al., 2014; Wang et al., 2014; Zhang et al., 2014; Zhao et al., 2014; Sánchez Toledo et al., 2013; Yilmaz, et al., 2010; Vélez de la Calle et al., 2008; Zini et al., 2005). Sin embargo, en determinados casos, sí que se ha establecido una correlación negativa entre la fragmentación basal, la tasa de fecundación, la calidad del embrión y la tasa de gestación también en ciclos de ICSI (Simon et al., 2011). Las tasas de fragmentación superiores al 30% han sido relacionadas incluso con el riesgo de aborto, indicando que un porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado superior al 30 % reduce o en algunos casos elimina la posibilidad de conseguir en embarazo a término (Evenson and Wixon, 2008). En nuestro estudio, no es posible extraer conclusiones relativas al aborto puesto que sólo uno de los embarazos no llegó a término. Una vez comprobado el efecto positivo que tiene el procesamiento espermático mediante la técnica de swim-up sobre los niveles de fragmentación de las muestras, se analizó la posible relación entre los nuevos valores de fragmentación post swim-up y los resultados del ciclo. Nuestros resultados muestran que el porcentaje de fragmentación post swim-up es independiente de los resultados que obtenemos en el ciclo de ICSI. Valores más bajos de fragmentación post swim-up no se traducen en mejores tasas de fecundación (r= 0,180, P= 0,26), mejor calidad embrionaria (Tabla 47), mejores tasas de implantación (r= 0,035, P= 0,84) o en relación con la consecución 155 DISCUSIÓN de embarazo (Tabla 48). Esta ausencia de relación coincide con lo que encuentran otros autores (Larson et al., 2000; Bungum et al., 2007). Otras investigaciones, por el contrario, concluyen que sí es posible predecir resultados, como la calidad del embrión y la tasa de embarazo a partir de los valores de fragmentación post swim-up (Gosálvez et al., 2013; Avendaño et al., 2010; Zhang et al., 2008). Una primera justificación a la independencia encontrada entre la fragmentación basal y los resultados del ciclo, podría serla elevada disminución (hasta 66 p.p., con una media de 22 p.p) en el porcentaje de fragmentacióntras el procesamiento de las muestrasque se ha expuesto previamente, provoca que los valores finales sean similares entre sí, lo que anula la importancia de los valores basales.A estas dos explicaciones, habría que añadir que, la mayoría de las muestras, a pesar de tener valores más o menos elevados de fragmentación basal ven reducidos los niveles de daño a niveles mucho más bajos al analizar la muestra una vez procesada, lo que explicaría que no se encuentre relación entre el porcentaje de fragmentación basal y los resultados de ICSI. En resumen, la similitud de los valores finales entre sí y el bajo valor de estos, constituyen las posibles causas que justificarían que el nivel de fragmentación basaltenga poco valor pronóstico en términos de fecundación, calidad embrionaria, implantación y embarazo. La fragmentación post swim-up indica el porcentaje real de espermatozoides con el ADN fragmentado presente en la muestra que se va a utilizar para la TRA. Parece más sensato utilizar este valor para predecir el éxito en las técnicas de reproducción asistida. Sin embargo, al analizar el parámetro fragmentación post swimup tampoco encontramos relación ni con la tasa de fecundación, ni con la calidad embrionaria, ni con las tasas implantación y gestación. El procesamiento elimina un porcentaje elevado de los espermatozoides con el ADN fragmentado, no la totalidad de ellos. El tipo y la magnitud de deterioro que presenta el ADN espermático, además de variar entre individuos, también lo hace entre espermatozoides de una misma muestra.En la técnica ICSI, se selecciona el mejor espermatozoide en términos de morfología y motilidad pero se desconoce el estado de su ADN. Será más probable haber escogido un espermatozoide con el ADN íntegro en 156 DISCUSIÓN una muestra que contenga un porcentaje más elevado de ellos. El estudio de la fragmentación post swim-up, determinó que los valores no varían mucho entre las diferentes muestras, con lo que tendríamosprobabilidades similares en todas ellas de escoger un espermatozoide con el ADN dañado/integro. De ahí que no se encuentre relación entre los valores de fragmentación post swim-up y los parámetros indicadores de éxito del ciclo. El genoma nuclear humano está compuesto por ADN no codificante y ADN codificante. La parte codificante la constituyen los exones y corresponde tan sólo al 1,5% del total.Esta gran diferencia entre la cantidad de ADN codificante y no codificante provoca, por sí sola, que la mayor parte de la roturas sucedan en las secuencias no codificantes, lo que podría ser mejor tolerado y reparado(Gosálvez Berenguer et al., 2008). Aunque tanto en nuestro estudio como en otras investigaciones, no se infiere relación entre la fragmentación del ADN espermático y el éxito de las TRA, existen diferentes métodos que permiten mejorarla. Algunas causas inductoras de fragmentación basal en el ADN espermático, como el daño producido por los radicales libres, puede disminuirse contratamientos y dietas ricas en nutrientes con propiedades antioxidantes (Wright et al., 2014). La reducción del periodo de abstinencia puede mejorar también los valores de fragmentación basal (Gosálvez et al., 2011). Se han desarrollado también procedimientos de laboratorio, como las columnas MACS (magnetic activated cell sorting), capaces de eliminar de la muestra procesada espermatozoides apoptóticos (Gil et al., 2013). Otra posible alternativa, en casos de varones con porcentajes de fragmentación basal elevada, es la utilización de espermatozoides de testículo, que tienen un grado de fragmentación menor debido a que parte del daño se origina por oxidación una vez que han salido del testículo (González-Marín et al., 2012). Además del estudio de la fragmentación, otras técnicas han suscitado,en las últimas décadas, gran interés para estudiar la calidad espermática entre los profesionales de la reproducción asistida. Por ejemplo, estudio de meiosis que permite descartar anomalías en la meiosis espermática, estudio de aneuploidías (FISH y CGH157 DISCUSIÓN array), microscopía electrónica de barrido para identificar anomalías morfológicas indetectables con microscopía óptica convencional. Hasta la fecha ningún método ha resultado mejor que otro para el estudio del factor masculino. Finalmente, para valorar en su conjunto el factor masculino en relación con la obtención de embarazo, se realizó un test de regresión logística multivariante con edad, tipos de anomalías seminales, porcentajes de fragmentación basal y post swimup. Los resultados de este análisis evidenciaron que el fracaso en la consecución de embarazo se asoció significativamente a varones oligozoospérmicos (P= 0,005), lo que confirma los resultados obtenidos de χ². También se asoció significativamente el embarazo a varones teratozoospérmicos (P= 0,012), de forma contraria a lo que ocurría en el análisis univariado. 5. FACTOR FEMENINO EN LOS RESULTADOS DE CICLOS DE ICSI Aunque en este estudio no se encontró una diferencia estadísticamente significativa de las tasa de fecundación e implantación entre los dos grupos de edad de las mujeres establecidos, la tasa de fecundación disminuye a la mitad en el grupo de mayor edad y las tres mujeres con fallo de fecundación pertenecen también a este grupo de mujeres > 35 años (Tabla 37).Lo mismo sucedió con respecto a la existencia de embriones de buena calidad y el embarazo (Tabla 38). Tal como ocurre con las edades de los varones, en ambas variables se observó la misma tendencia de valores negativos de coeficientes de correlación, de forma que tanto el porcentaje de mujeres con embriones de buena calidad como el de mujeres gestantes, se encontraron en las pacientes más jóvenes. En el análisis de regresión logística multivariante realizado (entre la consecución de embarazo y el número de ovocitos, el número de embriones G1+G2, el número de embriones transferidos y la edad de la mujer), sí encontramos asociación significativa entre la edad de la mujer y tanto el éxito de embarazo comoel número de embriones G1+G2. Del mismo modo, varios autores encuentran mejores valores de calidad embrionaria y tasa de embarazo en mujeres más jóvenes sometidas a ciclos de ICSI respecto a las de mayor edad (Ménézo and Barak, 2000; Brucker et al., 2014). En contra de la creencia general, está comprobado que las TRA, en general, no 158 DISCUSIÓN compensan totalmente el efecto negativo de la edad de la mujer sobre la fertilidad (Leridon, 2004).El factor ovocitario ha de ser tenido en cuenta a la hora de valorar estos resultados del ciclo de FIV. No sólo porque, como veremos, tiene la capacidad de reparar el DNA espermático, sino porque los primeros días de vida embrionaria dependen fundamentalmente del ovocito que aportará todos los orgánulos necesarios para su supervivencia y desarrollo. Hasta el 4º o 5º día no se activa el material genético paterno y empieza a tener mayor relevancia el factor masculino. El ovocito presenta una capacidad de reparación del daño en el ADN del espermatozoide,una vez que este ha entrado en su citoplasma, que influye en la fertilidad de la pareja y que depende de tres factores: la cuantía de daño, el tipo de daño y la calidad del ovocito.Hay autores que aseguran que la tasa de fecundación va a depender más de la calidad del ovocito que de la calidad del espermatozoide (Meseguer et al., 2011). Parece que los ovocitos de buena calidad conseguirían neutralizar el impacto negativo de la fragmentación del ADN sobre la probabilidad de obtener un embarazo.Uno de los factores decisivosa la hora de relacionar la fragmentación del ADN espermático con los resultados del ciclo de reproducción asistida, es la diferencia que puede existir entre la población de mujeres en cuanto a su capacidad para reparar estas roturas del ADN. Para intentar minimizar el error o la confusión que puede introducir en este estudio las diferencias que existen entre las condiciones de las pacientes hemos dividido la población en dos grupos, mujeres de buen o de mal pronóstico. El grupo de mujeres de buen pronóstico está formado por aquellas pacientes que tenían una edad menor de 38 años, un recuento de folículos antrales de más de 7, una FSH basa < 10 mUI/ml. o que habían tenido resultados desfavorables en ciclos previos. El grupo de mujeres de mal pronóstico lo constituyen aquellas que no cumplían dichos criterios.No se siguieron de forma estricta los criterios de Bolonia (Ferraretti et al., 2011)puesto que el estudio se hizo antes de la aparición de dicho consenso y porque se incluyen también pacientes potencialmente bajas respondedoras. Este segundo grupo fue estimulado con dosis altas de gonadotropinas (FSH y acción LH ) en protocolo con 159 DISCUSIÓN antagonistas GnRH. De nuestra muestra, 23 (56%) fueron incluidas en esta categoría de peor pronóstico. Los resultados obtenidos determinan que tanto la tasa de fecundación, como la calidad embrionaria, la tasa de implantación o el embarazo, son más elevadas en el grupo de mujeres con buen pronóstico, no siendo las diferencias entre ambos grupos estadísticamente significativas para ninguna de las cuatro variables (Tablas 51-54). Estas diferencias son más acusadas en la tasa de implantación, donde las mujeres de buen pronóstico, tuvieron casi 12 p.p. más de tasa de implantación que las de mal pronóstico. El tamaño muestral de nuestro estudio no permite hacer un análisis estratificado en función de la fragmentación de los resultados del ciclo en los dos grupos de mujeres. Dado que el factor más determinante de la calidad ovocitaria es la edad, es posibles que la capacidad de reparación de los ovocitos disminuya de forma significativa con la edad materna. Se han obtenido resultados mejores en pacientes que han utilizado ovocitos de donantes, que son mujeres jóvenes con ovocitos de mejor calidad que teóricamente repararían mejor (Meseguer et al., 2011). 160 CONCLUSIONES CONCLUSIONES 1.La evaluación de los parámetros clásicos del seminograma no permite predecir el grado de integridad del ADN espermático, siendo este un factor importanteparadeterminar la calidad del material genético masculino. Por lo tanto, es recomendable incluir el estudio de fragmentación del ADN espermático, como complemento al seminograma, en el diagnóstico de la infertilidad del varón. 2. La técnica swim-up de procesamiento de muestras seminales, además de recuperar los espermatozoides con mejor movilidad y morfología, enriquece la muestra en espermatozoides con el ADN íntegro, disminuyendo drásticamente los porcentajes de fragmentación del ADN espermático. La evaluación de la fragmentación, por tanto, debería realizarse después del procesamiento de las muestras. 3. La disminución de los niveles de fragmentación del ADN espermático tras el swim-up, es proporcionalmente mayor cuanto mayor sea el porcentaje de fragmentación basal del individuo, unificando en gran medida los valores finales de fragmentación entre las diferentes muestras. 4. En la valoración de los ciclos de ICSI en relación con las características del varón y los parámetros seminales, se ha encontrado que la edad y la condición de normozoospermia se relacionan con los resultados de este tratamiento. 5. Los bajos niveles de fragmentación del ADN espermático tras el procesamiento mediante swim-up, junto con la gran capacidad de reparación del ADN que posee el ovocito, hacen que la fragmentación del ADN espermático sea un factor independiente del éxito de los tratamientos de reproducción asistida mediante ICSI. 163 BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA - Adham I.M., Nayernia K., Burkhardt-Göttges E., Topaloglu O., Dixkens C. and Holstein A.F., Engel W. Teratozoospermia in mice lacking the transition protein 2 (Tnp2). Mol Hum Reprod (2001) 7(6): 513-20. - Aitken J., Krausz C. and Buckingham D. 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ICSI: Inyección intracitoplasmática de espermatozoides, intracytoplasmic sperm injection (microinyección espermática) INE: Instituto Nacional de Estadística ISNT: marcaje por traslado de mella; in situ nick translation IUI: inseminación intrauterina; intrauterine insemination kb: Kilobase LH: Hormona luteinizante, luteinizing hormone m: Metro MAR: Región de anclaje a la matriz, matrix attachment region MI: Metafase I de la primera división meiótica MII: Metafase II de la primera división meiótica mg: Miligramo min: Minuto ml: Mililitro mm: Milímetro ng: Nanogramo N2: Nitógeno °C: Grado centígrado -OH: Radical hidroxilo OMS: Organización mundial de la salud, world health organization (WHO) P: p-valor estadístico pb: Pares de bases PBS: Tampón fosfato salino, phosphate buffered saline 188 ABREVIATURAS PI: Profase de la primera división meiótica, profase I PN: Pronúcleo p.p.: Punto porcentual PVP: Polivinilpirrolidona, polyvinylpyrrolidone REM: Recuento de espermatozoides móviles ROC: Característica operativa del receptor; receiver operating characteristic ROS: Especies reactivas de oxígeno, reactive oxygen species SCD: Dispersión de la cromatina espermática; sperm chromatin dispersion test (SCDt) SCGE: Single Cell Gel Electrophoresis SCSA: Ensayo de la estructura de la cromatina espermática; sperm chromatin structure assay SDF: Fragmentación del ADN espermático, sperm DNA fragmentation SEF: Sociedad Española de Fertilidad SPSS: Programa estadístico, Statistical package for the social sciences TdT: Desoxinucleotidil transferasa terminal; terminal deoxynucleotidyl transferase TNP: Proteína de transición, transition protein TOP2B: Topoisomerasa IIβ TRA: Técnicas de reproducción asistida TUNEL: Marcaje del extremo libre por dUTP mediado por la desoxinucleotidil transferasa terminal, terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick-end labeling UI: Unidades internacionales VG: Vesícula germinal ZP: Zona pelúcida β-hCG: Subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana μg: Microgramo μl: Microlitro 189