El laboratorio en endocrinología pediátrica

Luis Fernando Gómez Uribe
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endocrinología pediátrica
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María Victoria Urueña Zuccardi
Endocrinóloga pediatra
Asociación Colombiana de Endocrinología Pediátrica (ACEP)
Gladys Laverde de Arbeláez
Bacterióloga
Directora Científica Laboratorio de Investigación Hormonal (LIH)
Nayive Gil Ochoa
Bacterióloga Coordinadora Sección Endocrinología LIH
Introducción
Basados en que las pruebas bioquímicas constituyen el pilar fundamental para el diagnóstico y
seguimiento de las enfermedades endocrinas, los
adelantos científicos y tecnológicos de los últimos
años han capacitado mucho más al laboratorio
para ser un efectivo colaborador en la labor del
médico tratante en la prevención, diagnóstico,
tratamiento, seguimiento y vigilancia de estas
patologías.
Tradicionalmente las herramientas del laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades
endocrinas se basan en la reacción antígenoanticuerpo, utilizando diversos marcadores y
métodos de detección.
Es necesario el respaldo de un laboratorio de
alta calidad, oportunidad y racionalidad lógicocientífica, para lograr un diagnóstico preciso,
un manejo efectivo y un costo razonable de las
patologías endocrinas.
Desde el descubrimiento de los anticuerpos
contra la insulina en el suero de los diabéticos
y la consiguiente aplicación de dichos anticuerpos como reactivos analítico-específicos, nacen
los inmunoensayos (IE), que se definen como
un conjunto de técnicas analíticas que usan
anticuerpos para la determinación selectiva de
ciertos componentes de interés presentes en
muestras biológicas. Estos ensayos son altamente selectivos, de bajos límites de detección,
y pueden ser adaptados para la determinación
de muchos compuestos de interés clínico, hormonas, enzimas, proteínas, drogas y agentes
infecciosos.
Por su alta selectividad los IE pueden ser
usados en muestras de orina o sangre y constituyen los métodos de elección para múltiples
aplicaciones endocrinológicas.
Actualmente, la mayoría de los ensayos hormonales se realizan por métodos automáticos o
manuales que utilizan anticuerpos monoclonales
específicos.
La metodología continúa evolucionando a
medida que se establecen normas de calidad y se
desarrollan nuevas tecnologías e instrumentos.
Muchos de los utilizados por el laboratorio actual
pueden ser considerados “dispositivos inteligentes”,
puesto que poseen la capacidad de comunicarse
y “hablar” con otros computadores.
CCAP  Volumen 7 Número 2 
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Adicionalmente, permiten establecer servicios como el manejo del control de calidad en
línea, en tiempo real, desarrollando un enorme
potencial de la eficiencia del laboratorio. La
automatización ha logrado que los métodos
sean más sensibles, específicos, precisos y
reproducibles.
Los avances en el campo de la biología
molecular han permitido el conocimiento
etiológico y, por lo tanto, la fisiopatología de
muchas enfermedades hasta ahora calificadas
como idiopáticas. Como ejemplos de defectos
moleculares en patologías endocrinas se han
descrito: la demostración de una deleción del
gen codificador para la GH, posteriormente la
descripción de los déficits múltiples hipofisarios
debidos a anomalías de los genes Pit-1, PROP-1,
cuadros de resistencia parcial a la GH y el papel
del gen SHOX en la baja talla del síndrome de
Turner.
La generalización del uso de microarrays
(biochips) que permiten analizar rápidamente la
composición de secuencias de ADN o ARN va a
facilitar enormemente, no solo el conocimiento
de la composición génica y sus alteraciones, sino
la expresión del mensaje genético, la interacción
génica, la significación de los polimorfismos,
la relación genotipo-fenotipo, la tolerancia
individual y efectividad de los tratamientos (farmacogenómica). Avances que van a ampliar los
conocimientos diagnósticos y las posibilidades
preventivas y terapéuticas.
La exploración y la valoración del estado de
las diferentes hormonas en los individuos, desde
el nacimiento hasta la edad adulta, requieren
la comparación de los resultados con rangos de
referencia que correspondan con la edad, sexo
y estadio puberal, cuando la hormona varía en
función de ellos. Por ejemplo, los neonatos y
niños prematuros presentan función inmadura
en los sistemas pulmonar, hepático y renal, y
los rangos de referencia son específicos, por
consiguiente los niños no se deben considerar
como adultos en miniatura.
 Precop SCP
Factores que influyen en los
análisis hormonales
Factores preanalíticos:
Los efectos fisiológicos y los métodos de
recolección y manipulación de las muestras
pueden influenciar la medición de los niveles
hormonales.
Los factores fisiológicos más importantes
que se deben considerar son:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Edad.
Estrés emocional y físico.
Ejercicio y cambios posturales.
Ritmo circadiano.
Variabilidad intraindividual en la secreción
hormonal.
Secreción hormonal episódica.
Medicamentos.
Enfermedades de base.
Recolección de las muestras:
Recolección en los tubos apropiados y bajo
condiciones adecuadas (por ejemplo: ACTH
en tubo con EDTA y a temperatura de refri-
•
•
•
•
•
geración).
Identificación correcta.
Separación.
Verificación de la calidad de la muestra (hemólisis, lipemia, ictericia).
Almacenamiento y estabilidad.
Evitar procesos de congelación y descongelación que puedan alterar la calidad.
Factores analíticos:
•
•
•
•
•
Métodos (sensibilidad, especificidad, precisión, reproducibilidad).
Procedimientos (estandarización, seguimiento, verificación de controles de calidad
internos y externos).
Errores aleatorios y sistemáticos.
Variabilidad intraensayo e interensayo.
Interferentes presentes en la muestra (anticuerpos heterófilos, anticuerpos tipo factor
reumatoideo).
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Gil Ochoa
Uribe
Factores posanalíticos:
•
••
•
Transcripción errada de resultados (resultado,
unidades de medida, método).
Validación analítica inadecuada de resultados.
Equivocación en la entrega del resultado.
Interpretación inadecuada de los resultados por
parte del médico tratante.
En muchas de las determinaciones hormonales, los niveles en sangre o urinarios de
hormonas basales son limítrofes, por lo tanto,
es necesario usar las pruebas de estímulo o
supresión para confirmar si existe o no trastorno endocrino.
Las pruebas dinámicas valoran el eje global
entre hipotálamo, hipófisis y el órgano blanco,
y se basan en el principio de retroalimentación
(positiva o negativa). Cuando hay exceso de
hormona (hiperfunción), se intenta supresión,
y en deficiencia de la hormona (hipofunción) se
intenta estimulación, determinando la hormona
respectiva.
Con relación a las condiciones del
paciente:
•
••
••
•
El paciente debe estar clínicamente bien (no
procesos infecciosos, virales, fiebre, etc.).
Pesar y medir al paciente el día de la prueba.
Nombre - edad - sexo - hora - día.
Datos sobre diagnóstico clínico.
Anotar medicamentos y alimentos que puedan interferir con la prueba o los métodos utilizados.
Cuando sea indispensable el ayuno, la recomendación es: en niños pequeños de 4 a 6 horas; en
niños mayores y adultos de 8 a 12 horas.
Evaluación de la función de
crecimiento
La hormona de crecimiento (GH, por su sigla
en inglés) se secreta en forma pulsátil y predominantemente durante la fase profunda de
sueño, por lo que su determinación basal no
es de mucha utilidad, haciéndose necesario
recurrir a las pruebas dinámicas. Las pruebas
se clasifican en: fisiológicas: ejercicio, sueño; y
farmacológicas: clonidina, insulina, glucagón,
arginina, L-dopa y mediciones de IGF-1, IGFBP3. Los niveles de IGF-1 y IGFBP-3 varían con la
edad y el sexo, aumentan durante la pubertad
y luego disminuyen.
Todas las pruebas deben realizarse en ayunas,
debido a que la mayoría de los estímulos pueden
ser bloqueados en presencia de hiperglicemia
o de ácidos grasos libres, y se deberá colocar
un catéter endovenoso para poder tomar las
muestras múltiples.
Las pruebas de estímulo más usadas
en nuestro medio son:
Estímulo
Dosificación
Muestras
Ejercicio
Durante 20
minutos
0-20 y 40
minutos
Clonidina
5 µg/kg o 0,15 mg
por m2 V.O.
0-60-90 minutos
Insulina regular
(acción rápida)
0,05-0,1 UI/kg V.I.
0-15-30-45-6090-120 minutos
Glucagón
0,1 mg/kg IM
o SC
0-30-60-90-120
minutos
Ejercicio
El ejercicio libera hormona de crecimiento en
forma aguda. Es un método fisiológico aceptable
para analizar la secreción de GH. Los mecanismos adrenérgicos juegan papel importante en la
liberación de GH por este estímulo. El período de
latencia entre la iniciación del ejercicio y el pico
máximo de GH observado varía con el nivel de
ejercicio del paciente, debe ser continuo, intenso
y estandarizado (correr, montar bicicleta) por 20
minutos. El pico máximo se observa entre los 1520 minutos después de iniciada la prueba.
Clonidina
El clorhidrato de clonidina (catapresán) es
un antihipertensor, agonista de los receptores
alfa 2 adrenérgicos, produce liberación de GH
mediante secreción de GHRH e inhibición
de la somatostatina. La respuesta de GH es
CCAP  Volumen 7 Número 2 
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dosisdependiente, es considerablemente más alta
que para otros estímulos. La clonidina produce
efectos secundarios como somnolencia, debilidad
y disminución de la tensión arterial.
Insulina
La hipoglicemia inducida por la insulina libera
GH como respuesta de hormona contrarreguladora y por bloqueo de los receptores alfa
adrenérgicos. Se requiere una disminución de
por lo menos el 50% de los niveles de glucosa
basal para un apropiado estímulo de secreción
de GH, usualmente por debajo de 40 mg/dl.
Aunque el nadir de la glucosa se observa
después de 15 a 30 minutos de iniciada la
prueba, los niveles máximos de GH se observan
después de 60.
Pueden presentarse síntomas de hipoglicemia
como nerviosismo, sudoración, taquicardia,
etc., por lo que se debe practicar bajo estricta
vigilancia médica y tener a la mano dextrosa
entre el 10 y 50% y un corticoide, en caso de
hipoglicemia severa.
Esta prueba también sirve para medir la
integridad del eje hipofiso adrenal. El fundamento consiste en que el estrés resultante de
la hipoglicemia conlleva a una descarga hipotalámica y, por consiguiente, a la liberación de
las hormonas contrarreguladoras como la GH,
ACTH/cortisol y PRL. Se espera que se doblen
los niveles basales de cortisol, o un pico máximo
hasta 20 µg/dl (552 nmol/L).
Glucagón
El glucagón ejerce un efecto de estimulación
por la vía de los receptores alfa adrenérgicos,
estimula la liberación de GH a través de la
secreción endógena de insulina que responde
a los niveles de glucosa sérica elevados. Esta
prueba es la mejor elección para lactantes y
niños pequeños, presenta menos riesgos que la
realizada con insulina. Se detecta hiperglicemia
 Precop SCP
entre los 15 y 60 minutos y una hipoglicemia
posterior entre los 90 y 120. Como efectos
secundarios a la administración de glucagón
se pueden presentar náuseas, vómito y dolor
abdominal.
Interpretación
En cualquiera de las pruebas de estímulo para
la hormona de crecimiento, se considera una
respuesta normal cuando se encuentra un
valor superior a 10 ng/ml en cualquiera de los
tiempos incluido el valor basal. Deficiencia
parcial, cuando los valores están entre 7-10
ng/ml. Respuesta anormal, valores menores
a 5 ng/ml; es importante tener en cuenta que
una sola prueba de estimulación con respuesta
negativa no puede ser considerada diagnóstico
de deficiencia de GH. La respuesta menor de 10
ng/ml en dos pruebas de secreción puede ser la
base del diagnóstico de insuficiencia o déficit
de GH. Se habla de déficit total si la respuesta
es inferior a 5 ng/ml.
Evaluación de la función
pancreática
Las mediciones más útiles son la concentración
plasmática de glucosa y la prueba de tolerancia
oral a la glucosa.
Un nuevo punto de corte de 100 mg/dl en
glucosa en ayunas es considerado como normal,
entre 100 y 126 mg/dl es glicemia de ayuno
inadecuada. La glicemia en ayuno ≥ a 126 mg/dl
y una glicemia posprandial ≥ 200 mg/dl hacen
un diagnóstico provisional de diabetes mellitus,
y debe ser confirmado con una muestra en un
día diferente. Si la segunda muestra en ayunas
se encuentra por debajo de 126 mg/dl, pero
existe una alta sospecha de diabetes, se debe
proceder a practicar una prueba de tolerancia
oral a la glucosa.
Para la prueba se requiere un ayuno de 10-16
horas, se administra 1,75 g de glucosa/kg, con
una dosis máxima de 75 g. Tomar muestras a
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los 30, 60 y 120 minutos. Se pueden medir los
niveles de insulina simultáneamente.
Niveles de glucosa en el test de
tolerancia oral
mg/dl
Ayuno
60-100
30-60 minutos
110-170
90 minutos
100-140
120 minutos
70-120
Evaluación de la función
suprarrenal
La función de la suprarrenal se realiza midiendo
ACTH, glucocorticoides, mineralocorticoides
y andrógenos suprarrenales, tanto en sangre
como en orina.
El cortisol matutino o AM es la determinación básica para la medición de los glucocorticoides, también el cortisol libre urinario es
de gran utilidad.
La prueba de estimulación con ACTH es la
más utilizada. El propósito de esta es evaluar
la capacidad de la suprarrenal para secretar
cantidades normales de hormonas esteroideas,
principalmente cortisol, y estudiar la insuficiencia adrenal primaria o secundaria. La
otra indicación es el análisis de la hiperplasia
suprarrenal congénita, midiendo la 17 hidroxiprogesterona (17OHP), que identifica defectos
en la biosíntesis enzimática por aumento del
esteroide precursor: androstenediona-T-DHEAS
y 11 deoxicortisol.
En la prueba de ACTH corta se deben tomar
muestras basales y aplicar dosis V.I. de tetracosactrin, synacthen o cortrosyn, que son análogos del
ACTH, a razón de 250 µg por m2 de superficie
corporal o 36 µg/kg (0,25 mg V.I.) y posteriormente
tomar muestra a los 60 minutos.
No se observan efectos secundarios; se debe
tomar en horas de la mañana debido a la variación por el ritmo circadiano con que se producen
algunos de los esteroides adrenales.
Se considera respuesta normal una elevación
del cortisol de por lo menos 7-10 µg/dl (193-276
nmol/L) por encima del valor basal, o un valor
de cortisol en la prueba mayor de 18-20 µg/dl,
(495-550 nmol/L) con un máximo nivel a los
60 minutos. Una respuesta normal excluye una
insuficiencia suprarrenal.
En general, las concentraciones de 17 hidroxiprogesterona se elevan cuatro veces después de
la inyección de ACTH, pero menores de 7 ng/ml.
Niveles por encima de 40 ng/ml indican una
deficiencia de 21 hidroxilasa. Respuestas de 17
hidroxiprogesterona por encima de 10 ng/ml
se consideran sugerentes de una hiperplasia
suprarrenal tardía o de formas heterocigotos de
la enfermedad. En respuestas entre 10-15 ng/ml
sin mayores hallazgos clínicos se recomienda
confirmar con biología molecular.
Evaluación de la función
gonadal
La función endocrina testicular se evalúa
midiendo las concentraciones basales de testosterona, dihidrotestosterona, androstenediona,
LH y FSH.
La función endocrina ovárica se evalúa con la
medición de la progesterona y estrógenos como
la estrona y el 17-β estradiol, LH y FSH.
La prueba con estímulo de LHRH evalúa
el eje hipotálamo-hipófisis-gónada, mide la
reserva hipofisiaria de LH y FSH. Existe gran
variedad de análogos sintéticos de la GnRH
actualmente como son: deslorelin, buserelin,
nafarelin, histrelin, luteoliberina, acetato de
leuprolide y gonadorelina.
Procedimiento
No requiere ayuno. Tomar muestra de sangre
basal para LH, FSH, estradiol y testosterona
(según sexo), tiempo 0 minutos. Aplicar 100 µg
de LHRH o 2,5 µg/kg en bolo V.I. hasta máximo
100 µg. Posteriormente tomar muestras de sangre
CCAP  Volumen 7 Número 2 
El laboratorio en endocrinología pediátrica
a los 30 y 60 minutos, en estos tiempos la estimulación es máxima; actualmente es más sensible
la prueba de estimulación con un análogo de la
GnRH más potente, como el acetato de leuprolide,
que permite la dosificación de estradiol en niñas
y testosterona en niños a las 8 y 24 horas.
Es útil en la evaluación de niños con pubertad precoz central o con pubertad retardada.
La respuesta varía con la edad, sexo y estadio
puberal. En niños prepúberes los niveles de LH
y FSH son generalmente menores de 2 mUI/ml.
El aumento de las dos gonadotrofinas suele ser
similar. Respuestas por debajo de 5 mUI/ml
generalmente se asocian a hipogonadismo o a
ausencia de inicio de pubertad. Respuestas por
encima de 50 mUI/ml generalmente se asocian
a hipergonadismo.
Otra utilidad de la prueba de LHRH es el
monitoreo del tratamiento con análogos de
GNRH en pubertad precoz. Durante el tratamiento se repite la prueba a los tres primeros
meses y luego cada año para evaluar la supresión
del eje hipotálamo-hipófisis-gónada.
Evaluación de la función
tiroidea
La función tiroidea se evalúa con la determinación de TSH, T4 libre y T3 libre. En el recién
nacido las concentraciones son altas y van
disminuyendo hacia el primer año de vida. La
sensibilidad de los ensayos de TSH han permitido medir concentraciones menores de 0,1
uUI/ml y, por lo tanto, la utilidad de la prueba
de TRH ha quedado restringida en el estudio
de la enfermedad tiroidea.
Esta prueba permite establecer el nivel de
alteración del eje hipotálamo-hipófisis-tiroides.
Su principal uso es en el diagnóstico diferencial
de los tumores de la pituitaria productores de
TSH y en la resistencia a la hormona tiroidea;
igualmente permite diferenciar entre el hipotiroidismo secundario o hipofisiario del terciario o hipotalámico. Algunos autores lo han
10  Precop SCP
considerado importante cuando los valores de
TSH se encuentran en el límite superior de la
normalidad o ligeramente altos.
La hormona liberadora de tirotropina (TRH,
por su sigla en inglés) es un tripéptido (protirelina), secretado por el hipotálamo que estimula
la secreción de TSH por la pituitaria anterior; la
TRH también puede estimular la liberación de
prolactina. Presentación disponible en ampollas
de 200 µg/ml.
No es necesario el ayuno. Tomar muestra
de sangre basal, T: 0 minutos, inyectar TRH
200 µg o 5-7 µg/kg máximo 200 µg, y en niños
menores de dos años, 100 µg V.I. en un período
de 15 a 30 segundos; tomar muestras para TSH
a los 30 y 60 minutos.
La TSH se libera posaplicación de la TRH,
alcanzando niveles 5 a 10 veces por encima de
los niveles basales. La prolactina debe aumentar
de 3 a 5 veces los niveles basales, con un pico
entre los 15 a 30 minutos. En el hipotiroidismo
secundario los niveles de TSH no se elevan
normalmente. La TRH puede producir elevación en la tensión arterial, por lo tanto, está
contraindicada en pacientes hipertensos y con
enfermedades cardiovasculares.
Los efectos colaterales incluyen náuseas, vómito
ocasional, rubor facial, urgencia urinaria, en especial cuando la TRH se inyecta rápidamente.
Para la interpretación de las pruebas, es
importante que el médico conozca la sensibilidad
clínica, es decir, que puede existir patología y
la prueba ser negativa (falsos negativos), y la
ausencia de patología y positividad de la prueba
(falsos positivos), para saber sus limitaciones.
Estos hechos son muy importantes, ya que, para
un diagnóstico final, debe considerarse una
serie de datos (clínicos, analíticos, radiológicos,
etc.), y resulta fundamental la interrelación
médico-laboratorio con el fin de que se pueda
llegar a decisiones más rápidas y eficaces que
beneficien al paciente.
María Victoria Urueña Zuccardi - Gladys Laverde de Arbeláez
Luis Fernando
- Nayive
Gómez
Gil Ochoa
Uribe
Lecturas recomendadas
1. Audí L, Granada ML. Tratado de endocrinología pediátrica.
Valores de referencia en endocrinología pediátrica. 3ª ed.
España; 2002. p. 1381-410.
7. Ropelato MG. Métodos de exploración de la función
suprarrenal. En: Tratado de endocrinología pediátrica. 3ª ed.
España; 2002. p. 929-42.
2. Beas F.Endocrinología del niño y el adolescente. 2ª ed.
Santiago de Chile: Editorial Mediterráneo Ltda.; 2002.
8. Rosenfeld RG, Cohen P. Disorders of growth hormone/
insulin-like growth factor secretion and action. En: Pediatric
endocrinology. 2ª ed. Pittsburgh, Pennsylvania; 2002. p. 22127 y 254-60.
3. Ibáñez L, Ferrer Á, Rodríguez-Hierro F. Aparición precoz de
signos puberales en la niña. En: Endocrinología del niño y el
adolescente. 2ª ed. Santiago de Chile; 2002. p. 160-70.
4. Iñiguez G, Boric MA. Endocrinología del niño y el adolescente.
El laboratorio de endocrinología pediátrica. 2ª ed. Santiago de
Chile; 2002. p. 437-60.
5. Mauras N, Walton P, Nicar M, Welch S, Rogol AD. Growth
hormone stimulation testing in both short and normal
statured children: use of an inmunofunctional assay. Pediatr
Res 2000;48(5):614-8.
9. Saenger P, Stene M, Mantilla P. Principles of endocrine
laboratory examination. En: Pediatric endocrinology. 2ª ed.
Pittsburgh, Pennsylvania; 2002. p. 757-70.
10. Sperling MA. Pediatric endocrinology. 2a ed. Pittsburgh,
Pennsylvania: Saunders; 2002.
11. Vicens Calvet E. Tratado de métodos de exploración de la
secreción hormonal adenohipofisiaria. En: Endocrinología
pediátrica. 3ª ed. España; 2002. p. 403-09.
6. Pombo M y cols. Tratado de endocrinología pediátrica. 3a ed.
España: McGraw-Hill Interamericana; 2002.
CCAP  Volumen 7 Número 2 
11
examen consultado
El laboratorio en endocrinología pediátrica
1. ¿Cuáles son las herramientas
del laboratorio para
el diagnóstico de las
enfermedades endocrinas?:
A. antígenos y anticuerpos
B. reacción antígeno-anticuerpo, utilización
de diversos marcadores y métodos de
detección
C. reacción antígeno-anticuerpo y métodos
de detección
D. implementación de nuevas tecnologías
E. reacción antígeno-anticuerpo y utilización
de diversos marcadores
2. La valoración de las diferentes
hormonas en los individuos
requiere la comparación de
los resultados con rangos de
referencia que se basen en:
A. ritmo circadiano
B. madurez de los sistemas
C. edad, sexo y estadio puberal
D. edad, ritmo circadiano, estrés físico
E. raza, edad, ritmo circadiano
3. Son factores preanalíticos que
afectan las determinaciones
hormonales:
A. variabilidad intra e interensayo
B. error en la transcripción de resultados
C. errores aleatorios y sistemáticos
D. edad, medicamentos, ejercicio,
enfermedades de base
E. solo la congelación y descongelación
repetitiva de muestras
4. Se hace necesario realizar
pruebas dinámicas
hormonales porque:
A. el paciente quiere que se le practiquen
B. el médico las ordena
C. los valores basales son limítrofes y por
sí solos no ayudan al médico a definir si
existe o no un trastorno endocrino
D. son de ayuda diagnóstica
E. para saber si los medicamentos que el
paciente toma interfieren en los análisis
hormonales
12  Precop SCP
examen consultado
María Victoria Urueña Zuccardi - Gladys Laverde de Arbeláez
Luis Fernando
- Nayive
Gómez
Gil Ochoa
Uribe
5. Para realizar las pruebas
dinámicas se deben
llenar los siguientes datos
excepto:
A. edad
B. medicamentos
C. posible diagnóstico
D. ayuno para pruebas de estímulo para GH
E. curva de crecimiento
6. ¿Cuál de los siguientes
tests de estímulo para la
hormona de crecimiento es
el más indicado en niños
pequeños?:
A. ejercicio
B. G
C. glucagón
D. insulina
E. clonidina
F. L-dopa
7. ¿Cuál es la medición
hormonal básica de los
glucocorticoides?:
A. cortisol libre urinario
B. cortisol AM-PM
C. cortisol AM
D. aldosterona
E. androstediona
8. El test de LHRH mide la
reserva hipofisiaria de:
A. TSH
B. LH
C. FSH
D. a y b
E. b y c
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13