Fecha emisión - Instituto de Salud Pública de Chile

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1.
PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE
TETRACICLINA, OXITETRACICLINA Y
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POR LC –MS-MS
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OBJETIVO
Determinar residuos de tetraciclina, oxitetraciclina y clortetraciclina en tejido animal por LCMS-MS.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
El alcance de este procedimiento es para las muestras de tejido animal ingresadas al laboratorio
de residuos de medicamentos veterinarios.
3.
FUNDAMENTO
La determinación de tetraciclina, oxitetraciclina y clortetraciclina, se basa en la extracción de los
analitos con una mezcla acuosa de buffer citrato y EDTA desde el tejido, una partición líquidolíquido con hexano y posterior clean-up mediante columnas de extracción de fase sólida plus PS2. La detección se realiza por cromatografía líquida acoplada a detección por espectrometría de
masa (LC/MS/MS).
4.
REFERENCIAS
4.1. Entrenamiento realizado por JICA en Instituto de salud Pública de Chile.
5.
TERMINOLOGÍA
5.1. LC-MS-MS = Cromatografía líquida acoplada a detección por masas-masas
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
MATERIALES
6.1.1
6.1.2
6.1.3
6.1.4
6.1.5
6.1.6
6.1.7
6.1.8
6.1.9
6.1.10
Matraz de aforo de 10 mL +/- 0.02 mL (20°C), clase A
Matraz de aforo de 50 mL +/- 0.06 mL (20°C), clase A
Matraz de aforo de 1000 mL +/- 0.6 mL (20°C), clase A
Embudos de decantación con tapa de 125 y 250 mL
Probeta de 1000 mL+/- 7.5 mL (20°C) , clase A
Probeta de 100 mL+/- 0.75 mL (20°C) , clase A
Pipetas Pasteur de 3 mL
Tubos de centrifuga Falcon con tapa de 50 mL
Tubos de vidrio con tapa de 15 mL
Viales de 2 mL para autosampler
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6.1.11 Jeringas desechables de 1 o 3 mL
6.2 INSUMOS
6.2.1
6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.2.5
6.2.6
6.2.7
6.2.8
6.2.9
6.2.10
6.2.11
6.2.12
6.2.13
6.2.14
6.2.15
Columna cromatográfica Eclipse XDB- C-18 de 2.1 mm x 150 mm (5 µm).
Micropipeta intervalo de 100-1000 µL.
Micropipeta intervalo 10-100 µL.
Filtros Millipore de 0.22 µm de tamaño de poro o similar
Columna de extracción en fase sólida Sep- pak plus PS-2. JJAN2013 .
Agua grado HPLC
Estándar tetraciclina Riedel de Hảen 46935
Estándar clortetraciclina Riedel de Hảen 46133
Estándar oxitetraciclina Riedel de Hảen 46598
Metanol grado HPLC
Acetonitrilo grado HPLC
Acido cítrico anhidro SIGMA C0759.
Fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na2HPO4 x 7H2O).
Agua desionizada.
EDTA sal disodica p. a ( C10H14N2O8Na2 x 2H2O)
6.3 EQUIPOS
6.3.1 Cromatógrafo líquido Apllied Bio system MDS SCIEX., equipado con bomba cuaternaria
Agilent 1200 series, desgasificador por vacío Agilent 1200, muestreador automático con control
de temperatura Agilent Hip-Als, termostatizador de columna Agilent 1200 y detector 3200 Q
trap LC MS/MS System
6.3.2 Refrigerador para almacenar estándares intervalo entre 2 y 8°C
6.3.3 Refrigerador para almacenar muestras entre 2 y 8 °C
6.3.4 Campana con extractor de gases corrosivos
6.3.5 Balanza de analítica
6.3.6 Centrifuga de 2000 rpm
6.3.7 Homogenizador Blender o similar
6.3.8 Baño de ultrasonido
6.3.9 Evaporador con corriente de nitrógeno
6.3.10 Manifold de extracción
6.3.11 Bomba de vacío
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7.
DESARROLLO
7.1
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
7.1.1 Preparación de soluciones
a) Solución de Hexano saturado con H2O : Agregar 500 mL de n-hexano en un embudo de
decantación de 1 L, adicionar 50 mL de H2O, agitar por un minuto y esperar hasta separación
de fases, descartar inferior, repetir dos veces esta operación. Esta solución tiene una duración
de tres meses y debe conservarse a temperatura ambiente.
b) Solución de HCO2NH4 1 M: Pesar por 6.3 g HCO2NH4 en una balanza analítica (precisión
0.0001 g) en un vaso de precipitado, aforar con agua grado HPLC. Esta solución tiene una
duración de tres meses y debe conservarse a una temperatura de entre 2-8 ºC.
c) Buffer citrato-EDTA: Disolver 12.9 g de acido cítrico, 52 g de fosfato de sodio dibásico y
3.72 g de EDTA disódico con agua desionizada y enrasar a 1 L en matraz aforado. Duración
mínima 1 mes y debe conservarse a temperatura ambiente.
d) Solución de CH3CN: H2O (1:1) 0.1 % HCO2H: Medir con una probeta separadamente 50 mL
de CH3CN y 50 mL agua grado HPLC, mezclar y homogeneizar. Agregar una alícuota de 100
µL de HCO2H, homogenizar. Esta solución tiene una duración de un mes y debe conservarse
a temperatura ambiente.
e) Solución fase móvil A: Tomar 1.25 mL de Solución de HCO2NH4 1 M, 250 µL de HCO2H
y 25 mL de CH3CN, aforar con agua grado HPLC, homogenizar y filtrar sobre membrana de
0.22 µm. Esta solución tiene una duración de un mes y debe conservarse a temperatura
ambiente.
f) Solución fase móvil B: Tomar 1.25 mL de Solución de HCO2NH4 1 M, 250 µL de HCO2H
y 23.75 mL de agua grado HPLC, aforar con CH3CN, homogenizar y filtrar sobre membrana
de 0.22 µm. Esta solución tiene una duración de un mes y debe conservarse a temperatura
ambiente.
g) Solución de EDTA saturado: disolver 12 g de EDTA disodico por cada 100 mL de agua
desionizada, homogenizar y agregar punta de spatula hasta lograr la saturación. Esta solución
tiene una duración de un mes y debe conservarse a temperatura ambiente
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7.1.2 Preparación de Estándares
a) Solución stock tetraciclina (1000 ppm): pesar aproximadamente 25 mg del estándar de
tetraciclina, en una balanza analítica (precisión 0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño
volumen de CH3OH a un matraz de aforo de 25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta
solución debe ser refrigerada a una temperatura menor o igual a 0 °C.
b) Solución stock clortetraciclina (1000 ppm): aproximadamente 25 mg del estándar de
clortetraciclina, en una balanza analítica (precisión 0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño
volumen de CH3OH a un matraz de aforo de 25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta
solución debe ser refrigerada a una temperatura menor o igual a 0 °C.
c) Solución stock oxitetraciclina (1000 ppm): aproximadamente 25 mg del estándar de
oxitetraciclina, en una balanza analítica (precisión 0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño
volumen de CH3OH a un matraz de aforo de 25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta
solución debe ser refrigerada a una temperatura menor o igual a 0 °C.
d) Solución intermedia tetraciclina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar de
1000 ppm de tetraciclina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar volumen con CH3OH. Esta solución debe ser refrigerada a una temperatura menor
o igual a 0 °C.
e) Solución intermedia clortetraciclina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de clortetraciclina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar volumen con CH3OH. Esta solución debe ser refrigerada a una temperatura menor
o igual a 0 °C.
f) Solución intermedia oxitetraciclina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de oxitetraciclina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar volumen con CH3OH. Esta solución debe ser refrigerada a una temperatura menor
o igual a 0 °C.
g) Solución multiestándar (2000 ppb): Tomar una alícuota de 500 µL de cada uno de los
estándares de 100 ppm de tetraciclina, clortetraciclina y oxitetraciclina, agregar cada alícuota
sobre un matraz de aforo de 25 mL con CH3CN. Esta solución debe ser refrigerada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
NOTA: La caducidad de cada una de estas soluciones esta indicada en el registro: RGG-700.00034 “Registro preparación de soluciones de estándares puros”y RGG-700.00-035 “Registro
preparación de mezclas de soluciones de estándares”
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7.1.3. Preparación de curva de calibración y fortificados
a) Curva de calibración (10-100 ng*mL-1): Se preparan cinco niveles para a curva de calibración
a partir de la solución multiestándar intermedia de 500 ppb. Se toma la alícuota
correspondiente de la solución multiestándar, se trasvasa a un vial de 2 mL y se completa el
volumen con la solución de CH3CN: H2O (1:1) 0.1 % HCO2H, siguiendo el esquema de
dilución:
Solución
multiestándar
(ng*mL-1)
2000
2000
2000
2000
2000
Alícuota a
tomar
µL
25
50
75
100
200
CH3CN: H2O (1:1) 0.1 %
HCO2H (µL)
980
950
925
900
800
Concentración
(ng*mL-1)
100
200
300
400
800
b) Fortificados (50-150 ng*g-1): Para obtener distintas concentraciones de los analitos en estudio
en la matriz, se procede a agregar una alícuota del multiestándar sobre esta, luego se deja
reposar por 30 minutos y se procede a la extracción, los fortificados se obtienen siguiendo el
esquema:
Solución multiestándar
(ng*mL-1)
Alícuota a tomar
µL
Cantidad de matriz (g)
2000
2000
2000
125
250
500
5
5
5
7.2.
Concentración en
matriz
(ng*g-1)
50
100
150
Preparación de la Muestra
7.2.1. Extracción
Desde su recepción, las muestras se mantendrán en estado congelado, hasta la preparación previa
al análisis. Se elimina de la pieza semicongelada la parte visible de grasa con un cuchillo y se
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homogeniza en la picadora una porción representativa y suficiente para realizar una serie de
trabajo. El resto de la muestra homogeneizada, se congelará de nuevo debidamente identificada.
a) Pesar 5 g de la muestra previamente molida en tubo Falcon (tubo A). En este punto debe
agregarse la alícuota de los analitos en el caso de muestras fortificadas y esperar 30 minutos
previa a la extracción.
b) Adicionar 30 mL de Buffer citrato sódico-EDTA y agitar 5 minutos en agitador orbital.
c) Homogenizar por 5 minutos en ultraturrax a una velocidad intermedia (13000 rpm). Lavar el
vástago del equipo con 20 mL de Buffer citrato sódico-EDTA (tubo B).
d) Centrifugar la muestra por 10 minutos a 3000 rpm.
e) Vaciar el sobrenadante al embudo de decantación de 125 mL. El contenido del tubo de lavado
(tubo B) se traspasa al tubo de la muestra (tubo A).
f) Se despega el sólido desde el fondo de tubo, y se agita 5 minutos en el agitador orbital.
Centrifugar por 5 minutos a 2500 rpm.
g) Vaciar el sobrenadante al embudo de decantación de 125 mL.
h) Agregar 20 mL de hexano saturado con H2O y agitar 55 veces en forma manual.
i) Separar equitativamente la emulsión obtenida en dos tubos falcon. Centrifugar por 10
minutos a 3000 rpm.
j) Desechar la parte superior de cada tubo. Combinar los extractos inferiores en un nuevo tubo
falcón y centrifugar 10 minutos a 3000 rpm.
7.2.2. Purificación
a) Instalar en el manifold las columnas plus PS-2.
b) Acondicionar las columnas con 10 mL metanol, 10 mL de agua desionizada y 5 ml de EDTA
saturado, se debe impedir que las columnas se sequen.
c) Pasar la muestra a través de la columna, sin cambiar el flujo.
d) Lavar con 10 mL agua desionizada.
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e) Secar 15 minutos las columnas con vacío.
f) Eluír con 10 mL de CH3OH y recibir en tubo de ensayo.
g) Concentrar bajo corriente de N2 a una temperatura de 40 ºC.
h) Reconstituir la muestra con 1 mL CH3CN: H2O (1:1) 0.1 % HCO2H, agitar en un vortex por 1
minuto, sonicar por 5 minutos y volver agitar 1 minuto en el vortex.
i) Filtrar la muestra en membrana de 0.22 micrones y colectar la muestra en un vial para su
análisis cromatográfico.
7.3.
Análisis Instrumental
La determinación de los analitos se realiza a través de LC-MS-MS. Para comprobar el correcto
funcionamiento del sistema cromatográfico se debe verificar la respuesta de un patrón directo del
nivel mas bajo de la curva de calibración.
Los tiempos de retención de los distintos compuestos se tienen que encontrar dentro del segmento
de la función correspondiente descrita en el método de masas. Acondicionar el sistema
cromatográfico con la fase móvil durante al menos 15 minutos.
7.3.1. Cromatógrafo Líquido:
-Temperatura del horno de columna: 35 ºC.
-Temperatura de la muestra: 10 ºC.
- Flujo: 0.2 mL/min.
-Volumen de inyección: 5 µL.
-Tiempo de análisis: 15 min.
- Fase móvil: A: 0.1% HCO2H, 5 mM HCO2NH4, 10 % CH3CN, 90 % agua HPLC
B: 0.1% HCO2H, 5 mM HCO2NH4, 10 % agua HPLC, 90 % CH3CN
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-Gradiente:
Tiempo
(min)
A%
B%
0
100
0
0.2
100
70
3.5
0
100
9
0
100
10
15
100
100
0
0
7.3.2. Espectrómetro de masas
El método tiene los siguientes Parámetros fuente de iones:
Tipo de scan:
ESI+
CUR:
CAD:
IS (Volt):
GS1:
GS2:
Temp. (ºC):
Interface:
MRM
tetraciclina, oxitetraciclina y clortetraciclina.
15
High
5000
45
30
500
ON
7.3.3. Método de Masas
Se monitorizan 2 canales o transiciones para cada compuesto. En la siguiente tabla se incluyen el
dwell (dwell time en segundos), DP, EP, CEP, CE y CXP. Así como los compuestos y los
tiempos de retención (RT) aproximados, obtenidos para cada una de ellas.
En la cuantificación se utilizan las transiciones señaladas (*) en la tabla para cada compuesto y
en la confirmación las 2 transiciones monitorizadas.
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Método de masas
Transición
Dwell
DP
EP
CEP
CE
CXP
445>410 (*)
0.15
70
10
24
26
3
445>410
0.15
41
10
24
23
3
479>444 (*)
0.15
38
10
25
27
5
479>154
0.15
38
10
25
24
3
461>426 (*)
0.15
38
10
25
24
3
461>201
0.15
38
10
25
24
3
7.4.
Tipo de
transición
Ion
cuantificador
Ion
cualificador
Ion
cuantificador
Ion
cualificador
Ion
cualificador
Ion
cualificador
Compuesto
tetraciclina
tetraciclina
clortetraciclina
clortetraciclina
oxitetraciclina
oxitetraciclina
Tratamiento de Resultados
7.4.1. Cuantificación
Se realiza una curva de calibrado correspondiente a 100, 200, 300, 400 y 800 ppb según se
describe en el punto 7.1.3. La ecuación de la curva es:
y=ax+b
Siendo:
X= Concentración (ppb) tetraciclina, oxitetraciclina y clortetraciclina según corresponda.
Y= área del pico de tetraciclina, oxitetraciclina y clortetraciclina según corresponda, para la
transición mas abundante o ion cuantificador.
La concentración en la muestra queda definida por la siguiente ecuación:
Conc (ng/g) = y x F_
p
Siendo:
y = concentración entregada por el equipo para una muestra.
F = factor de dilución de muestra, en este caso es 1.
P= masa de la muestra en gramos.
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Un resultado emitido por encima del límite de decisión deberá proceder de al menos dos
determinaciones.
7.4.2. Confirmación
Siguiendo los criterios de confirmación definidos en la Decisión 2002/657/CE, la identidad del
compuesto se considera confirmada cuando:
Se observen picos correspondientes a las transiciones características de tetraciclina,
oxitetraciclina y clortetraciclina y con una relación señal/ruido igual o superior a 3.
El tiempo de retención debe ser igual al que presenta el analito en la muestra adicionada con un
margen ± 2.5%.
El ratio resultante de dividir el área del pico correspondiente a la transición menos abundante
(ion cualificador) entre el área del pico correspondiente a la transición más abundante (ion
cuantificador) sea igual al obtenido para las muestras adicionadas teniendo en cuenta las
tolerancias recogidas en la decisión 2002/657/CE:
Intensidad relativa
(% del pico base)
Tolerancia permitida
≥ 50 %
± 20 %
> 20 –50 %
± 25 %
> 10 - 20 %
± 30 %
≤10 %
± 50 %
Los ratios para cada uno de los analitos son fijados durante el proceso de validación sobre las
muestras fortificadas.
7.4.3 Aseguramiento de la calidad del ensayo
Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos
realizados con el método analítico recogido en este procedimiento. Los controles de calidad
quedan agrupados en tres niveles de control:
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a) Nivel I: Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia certificados y
patrones de referencia certificados, según disponibilidad.
b) Nivel II: Materiales de referencia sin certificación externa y muestras fortificadas por el
analista.
c) Nivel III. Este nivel se refiere a los controles a efectuar durante el desarrollo de toda serie de
trabajo, por ello será descrito con más detalle. Incluye:
-
Control de blanco (una muestra por cada diez muestras por matriz).
Control muestras adicionadas (una muestra por cada diez muestras por matriz).
Control de respuesta instrumental con un patrón mas bajo de la curva de calibración.
7.4.4
Expresión de los Resultados
Para compuestos con LMR. La expresión de resultados es la siguiente:
a) Cuando la concentración obtenida sea inferior al Límite de Cuantificación:
“Inferior al Límite de Cuantificación”
(Límite de Decisión (CCα):...... ppb, Límite de Cuantificación: .......ppb,)
b) Cuando la concentración obtenida este comprendida entre el Límite de Cuantificación y el
valor superior del rango validado, ambos incluidos, y la identidad ha sido confirmada:
“Valor numérico en ppb”.
(Límite de Decisión (CCα):...... ppb, Límite de Cuantificación: .......ppb
Incertidumbre:.....%)
c) Cuando la concentración obtenida esté por encima del valor superior del rango validado y la
identidad ha sido confirmada:
“Superior a...... ppb (valor más alto del rango validado)”.
(Límite de Decisión (CCα):...... ppb, Límite de Cuantificación: .......ppb)
Los valores de CCα y CCβ son obtenidos del análisis de resultados de proceso de validación.
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7.4.4. Estimación Incertidumbre
La incertidumbre del resultado es 2 veces el coeficiente de variación correspondiente a la
reproducibilidad (CV) obtenido en la validación según el nivel de concentración (con un factor
de cobertura k=2). Cuando la concentración obtenida se encuentre entre dos niveles, siempre se
aplicará el CV menos favorable.
I = 2xCV
NOTA: Los valores de la Incertidumbre figuran en el Informe de Validación del Método.