UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN Identificación varietal y búsqueda de genes (segmentos de ADN) asociados y/o involucrados en la resistencia a Colletotrichum fragariae en frutilla. Tesis Doctoral ING. AGR. MARÍA GABRIELA GARCÍA -2013- AUTORIDADES RECTOR CPN Juan Alberto Cerisola VICERRECTORA Dra. Alicia Bardón SECRETARIA ACADÉMICA Dra. Susana Maidana DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Acreditado y Categorizado A ante la Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU) Resolución nº: 615/07 Directora: Dra. Mercedes Lizarralde de Grosso Comité Académico: Dra. Marta Inés Bühler Dr. Atilio Pedro Castagnaro Dr. Raúl Ricardo Raya Dr. Alfredo Grau UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN Facultad de Agronomia y Zootecnia. Autoridades Decano Ing. Agr. José Ramón García Vice Decano Ing. Zoot. Mag. Héctor Rolando Navarro Secretario Académico Ing. Agr. Carlos Arnaldo Latina Secretario de Posgrado e Investigación Ing. Zoot. Oscar Rafael Wilde Secretario Administrativo Lic. Eduardo Guardia Trabajo de Postgrado para la obtención del grado académico superior de Doctora en Ciencias Biológicas Ing. Agr. María Gabriela García Tesista Dr. Atilio P. Castagnaro Director de tesis Dr. Raúl Osvaldo Pedraza Dr. Daniel Kirschbaum Comisión de supervisión de Tesis Este trabajo se realizó, en las primeras etapas, en las instalaciones del Departamento de Bioquímica de la Nutrición del Instituto Superior de Investigaciones Biológicas (INSIBIO) e Instituto de Química Biológica ―D r. Bernabé Bloj‖ de la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia de la Universidad Nacional de Tucumán (UNT). Y en la ultima parte, en las instalaciones de la Sección Biotecnología de la Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC)- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Instituto de Tecnología Agroindustrial del Noroeste Argentino (ITANOA). En memoria a mis Padres A mi papá por el ejemplo de vida que me enseño. A mi mamá por enseñarme a no dejarme vencer nunca. Dedicada a José Ignacio AGRADECIMIENTOS Con estas líneas quiero expresar mi más profundo agradecimiento a todas aquellas personas que me han ayudado y acompañado en la realización de este trabajo y que han compartido conmigo todos estos años y por la ayuda incondicional que me han prestado: A mi director Dr. Atilio Castagnaro por su apoyo y enorme preocupación durante todo este tiempo y por su valioso asesoramiento. Al Dr. Juan Carlos Díaz Ricci, por su capacidad y experiencia para guiarme en ciertos momentos. A los integrantes de la Comisión de seguimiento el Dr. Daniel Kirschbaum y el Dr. Raúl Pedraza que con paciencia y dedicación me guiaron, y por sus valiosos aportes realizados durante este trabajo de Tesis. A la Bioq. Marta Ontivero por ayudarme a dar los primeros pasos en el ― mundo de las técnicas moleculares‖, por su generosidad, por brindarme sus conocimientos y por su gran colaboración en la corrección de la tesis. Al Dr. Sergio Salazar por su amistad, su dedicación ilimitada y su gran ayuda en los ensayos de aislamiento e infección. Un gran compañero! A la Dra. Paula Filippone por brindarme desde un principio su amistad, por hacerme pasar momentos felices en el laboratorio, y por su interés y su apoyo incondicional en mis momentos difíciles. Y a la Lic. Mariela Salgado por su amistad, su paciencia y su buen humor siempre. Al Dr. Gustavo Martinez Zamora por enseñarme e instruirme, por su enorme colaboración en los últimos experimentos especialmente en la técnica de RACE, por sus enseñanzas en bioinformática y por su amistad. A la Dra. Marta Arias, Botánica de la Facultad de Ciencias Naturales e Instituto Miguel Lillo que me enseño y me ayudo con el análisis y evaluación de los descriptores de las variedades de frutilla. Al Dr. Bjorn Wellin por sus palabras y sugerencias, y por su importante compañía en la sección. A mis compañeros del grupo soja por ayudarme en todo momento. Al Dr. Gabriel Velicce por su asesoramiento, su colaboración en la corrección de esta tesis y principalmente por todos los consejos que me dio en este largo camino. Al Lic. Mariano Pardo por su valiosa ayuda en la edición de todas las figuras y cuadros, y por la compaginación de la tesis. Y a la Lic. Carla Rocha por su colaboración en la organización de la bibliografía. A todos mis compañeros y amigos de la EEAOC Francisca Perera, Josefina Racedo, Georgina Orce, Lorena Sendin, Lorena Romero, Carla Rocha, Aldo Noguera, Mariano Pardo, Karina Dantur, Elena Díaz, Nora Paz, Alejandro Perea, Nancy Ruiz, Ivana Perez, Lucas Contreras, María José Soria, Caro Caram, Giuliana Rojas, Sergio Diaz, Carlitos Grellet, Nadia Chalfoun, Pia Di Peto, Ramón Enrique, Emilia Soria, Paulita Insaurralde, Ana Cerviño, por su amistad y afecto que hizo que cada día sea mejor. A los que fueron mis compañeros del laboratorio del INSIBIO: Gabriel Vellicce, Gustavo Martínez, Mony Mamaní, Marta Arias, Mercedes Zavaleta, Luisa Rodríguez, Omar Scaravaglio, Ursula Tonello, Cecilia Lemme, Augusto Bellomío, Carlos Minhak, Mónica Delgado, Viviana Rapisarda, Ana Zenof, Paula Vincent, y Daniela Juárez, entre otros, los cuales me acompañaron en mis inicios a introducirme en el mundo de la ciencia. A mi esposo José Ignacio, porque siempre me dió fuerzas para seguir adelante y no vencerme frente a las complicaciones. Por acompañarme al laboratorio los fines de semana y feriados a terminar algunos experimentos. Por su paciencia y cariño, principalmente en mis decepciones. Por su amor… A mi familia, mis hermanas Elena y Cristina y a mis hermanos Pablo, Miguel, Juan, Germán y Fredy, y a mis cuñados y cuñadas, que comprendieron mis ausencias especialmente durante los años que duró la realización de este trabajo. Y especialmente a mis sobrinos y sobrinas por brindarme su cariño y alegría. A todas las personas que pasaron por el INSIBIO y por la EEAOC con las cuales compartí algún momento durante el tiempo que trabajé en esta tesis. A mis amigas del alma, gracias por justificar mis ausencias, alegrarse con mis logros, y enseñarme el verdadero valor de la amistad. Al departamento de Bioquímica de la Nutrición del Instituto Superior de Investigaciones Biológicas (INSIBIO), por facilitarme el lugar de trabajo y los instrumentos para realizar las primeras etapas de esta tesis. A la Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC) por facilitarme las instalaciones y los medios para concretar esta tesis. A la Universidad Nacional de Tucumán (UNT), la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) y al Consejo Nacional de Investigación Científicas y Tecnológicas (CONICET) quienes me brindaron el apoyo económico. Y a todos a los que ya no me fue posible mencionar, pero que tienen un lugar en mi vida. Muchas Gracias!! Publicaciones y presentaciones a eventos científicos con relación al tema de tesis. Trabajos publicados García M G, Ontivero M, Díaz Ricci JC y Castagnaro A. (2002). Morphological traits and high resolution RAPD markers for the identification of the main strawberry varieties cultivated in Argentina. Plant Breeding 121: 76-80. Resúmenes y artículos cortos publicados en revistas o libros - Castagnaro, A.; Ontivero, M.; Arias, M.; Vellicce, G.; Salazar, S.; Tonello, U.; Martínez Zamora, G.; García, G.; Terada G.; Aprea A.; Camadro E. y Dìaz Ricci, J. ― Conservación, caracterización y utilización del germoplasma silvestre y cultivado de frutilla.‖ J .of Basic & Applied Genetics (suppl.) XIV(2): 35. Abstract. (ISSN: BAG 1666-0390). 2001. - García, María Gabriela; Ontivero, Marta; Díaz Ricci, Juan Carlos y Castagnaro, Atilio. ―M arcadores RAPD de alta resolución para la identificación de las principales variedades de frutilla (Fragaria ananassa) cultivadas en Argentina.‖ J. of Basic & Applied Genetics (suppl) XIV (2): 121(abstract) (ISSN: BAG 1666-0390). 2001. Trabajos presentados a Congresos - García M. G., Ontivero M., Díaz Ricci J. C. y A. Castagnaro. ―M arcadores RAPD de alta resolución para la identificación de las principales variedades de frutilla (Fragaria ananassa) cultivadas en Argentina‖. XXX° Congreso Argentino de Genética. IV Jornadas Argentino Uruguayas de Genética‖. Mar del Plata, Argentina. (Septiembre 2001). - Castagnaro, A., Ontivero, M., Arias, M., Vellicce, G., Salazar, S., Tonello, U., Martínez Zamora, G., García, G., Terada G., Aprea A., Camadro E. y J.C. Díaz Ricci. ―Sim posio: Conservación y Utilización de Recursos Genéticos‖. XXX Congreso Argentino de Genética. IV Jornadas Argentino Uruguayas de Genética. Mar del Plata, Argentina. (16-19 Septiembre de 2001). - Castagnaro A., Ontivero M., García M.G., Salazar S. y J.C. Díaz Ricci. ―U tilización de marcadores moleculares en el mejoramiento e identificación de cultivares de frutilla‖. XXV Congreso Argentino de Horticultura. I Encuentro Virtual de las Ciencias Hortícolas. (3 - 6 de Diciembre de 2002). - Díaz Ricci, J.C., Salazar, S.M., Arias, M.E., Ontivero, M., García, M.G., Tonello, U., Agüero, T, Camadro, E., Zembo, J.C. y Castagnaro, A.P. ―Ap roximación Biotecnológica integrada para la caracterización y uso de genes de defensa contra agentes patógenos en enfermedades de la frutilla‖. IV Simposio de recursos genéticos para América latina y el Caribe‖. (INTA UBA) Mar del Plata, Argentina. (10 – 14 de noviembre de 2003). INDICE PUBLICACIONES Y PRESENTACIONES A EVENTOS CIENTIFICOS RESUMEN HIPÓTESIS Y OBJETIVOS INTRODUCCIÓN GENERAL 1 1 La Frutilla: Características biológicas de la planta 1 1.1 Clasificación taxonómica y condiciones de crecimiento 1 1.2 Morfología de la planta de frutilla 2 2 La Frutilla: Aspectos generales de producción 4 2.1 Importancia del cultivo de frutilla en el mundo 4 2.2 Cultivo y comercialización de frutilla en Argentina 4 2.3 Tucumán como productor de frutilla 6 3 La Frutilla: principales variedades en Argentina. 8 3.1 Características de cada variedad 8 CAPÍTULO l: Caracterización molecular de cultivares de F. ananassa. 10 Introducción 10 ADN, marcadores moleculares y biología molecular 11 Marcadores moleculares de ADN en la mejora genética 12 Marcadores moleculares de ADN en Frutilla 14 Marcadores RAPD 15 Materiales y métodos 17 Material vegetal 17 Características morfológicas 17 Análisis molecular 17 Extraccion de ADN genómico 17 Caracterizacion por RAPD 18 Análisis de los datos 20 Resultados 22 Discusión 33 Conclusiones 34 CAPÍTULO ll: Caracterización fenotípica de cultivares de F. ananassa. 35 Introducción 35 La antracnosis 35 Ciclo de la enfermedad y epidemiologia 40 Materiales y métodos 42 Material vegetal 42 Condiciones de crecimiento 42 Material fúngico 42 Inoculación 43 Evaluación del grado de severidad de la enfermedad 44 Análisis de los datos 44 Resultados 46 Características morfológicas del aislado F7 46 Discusión 49 Conclusiones 49 CAPÍTULO lll: Búsqueda de marcadores moleculares asociados con genes que aumenten la resistencia a C. fragariae en frutilla. 50 Introducción 50 Manejo integrado 50 Interacción planta–patógeno 51 Resistencia mediada por genes R 53 Estructura y función de los genes R 54 Utilización de los genes R 55 Genómica funcional 56 Análisis transcriptomico mediante cDNA-AFLP 58 Caracterización genómica por AFLP 59 Genes de defensa en F. ananassa. 60 Materiales y métodos 63 Material vegetal 63 Inoculación con el aislado F7 63 Extracción de ARN total 63 Técnica cDNA-AFLP 65 Amplificación por AFLP 67 Electroforesis en geles de poliacrilamida 69 Análisis de los datos 70 Aislamiento y reamplificación de TDF 70 Clonado de los TDF 70 Transformación de E. coli mediante electroporación 71 Purificación de plásmidos y verificación de insertos 72 Secuenciación 73 Análisis bioinformático de secuencias obtenidas 73 Análisis de expresión 74 Técnica RLM-RACE 74 Resultados 78 Técnica de cDNA-AFLP 78 Análisis de las secuencias 83 Discusión 96 Conclusiones 100 CAPÍTULO lV: Construcción de una población segregante para el carácter resistencia/ susceptibilidad al aislado F7 de C. fragariae. 101 Introducción 101 Marcadores moleculares en el mapeo genético 102 Tipos de mapas 103 Uso de los mapas genéticos 103 Mapeo de genes de resistencia 104 Materiales y métodos 107 Resultados 108 Discusión 109 Conclusión 109 CONCLUSIONES FINALES 110 PROYECCIONES 110 BIBLIOGRAFIA 111 ABREVIATURAS µl: microlitros AFLP: polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados. APS: Persulfato de amonio ARNm: ARN mensajero. Avr/Avr: gen/proteína de avirulencia. BGA: Banco de Germoplasma Activo CC: dominio ―coiled -coil‖. cDNA: ADN complementario CTAB: bromuro de hexadecil trimetil amonio DEPC: Dietilpirocarbonato dNTP: desoxiribonucleótidos trifosfato. DSR: índice de severidad de enfermedad EDTA: ácido etilen diamino tetra acético. EEAOC: Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres EST: etiquetas de secuencias expresadas ET: etileno. ha: hectarea HR: respuesta de hipersensibilidad. INDEC: Instituto Nacional de Estadisticas y Censo INTA: Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria. ISR: resistencia sistémica inducida. ISSR: secuencias simples repetidas internas JA: ácido jasmónico. LAR: resistencia local adquirida. LRR: repeticiones ricas en leucina. MAMP: patrón molecular asociado a microbios. MAPK: MAP quinasa. MAS: selección asistida por marcadores. NBS: del Ingles ―N ucleotide Binding Site‖ ng: nano gramos nm: nanómetros pb: pares de bases. PCR: reacción en cadena de la polimerasa. pmol: picomol PR: proteínas relacionadas con la patogénesis. PVP: polivinilpirrolidona QTL: loci de características cuantitativas. R/R: gen/proteína de resistencia. RACE: amplificación rápida de los extremos del cDNA. RAPD: polimorfismo de ADN amplificado al azar RNAsa: ribonucleasa. SA: ácido salicílico. SAR: resistencia sistémica adquirida. SENASA: Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria SSR: secuencias simples repetidas TAE: Tris - Ácido acético – EDTA TBE: Tris – Ácido bórico – EDTA TEMED: N,N,N‘,N‘- Tetramethylenediamina TIR: homólogo de Toll (Drosophila) e Interleuquina-1 (mamíferos). TNL: proteínas de resistencia NBS-LRR con dominio TIR N-terminal. Tris: trihidroximetilaminometano UPOV: Union Internacional para la Proteccion de las Obtenciones Vegetales WRKY: superfamilia de factores de trascripción que presentan la secuencia WRKYGQK. X-GAL: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido Identificación varietal y búsqueda de genes (segmentos de ADN) asociados y/o involucrados en la resistencia a Colletotrichum fragariae en frutilla. RESUMEN El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue caracterizar los genotipos más usados en el Programa Nacional de Mejoramiento Genético de la Frutilla (Pro-Frutilla), estimar la diversidad genética disponible e identificar regiones del genoma (genes y/ o segmentos de ADN) de la frutilla que pudieran estar asociadas con la resistencia a Colletotrichum fragariae, uno de los causantes de la antracnosis. Utilizando la técnica RAPD se estimó la diversidad genética del Banco de Germoplasma Activo del Pro-Frutilla, se genotiparon progenitores y se detectaron variaciones genéticas entre accesiones de un mismo cultivar, lo que puede deberse a la acumulación de mutaciones por multiplicación agámica independiente. También se observaron entre estas accesiones diferencias fenotípicas respecto de su comportamiento frente al aislado F7 de C. fragariae. Un genotipo susceptible (Mendoza) y otro resistente (Salta) a C. fragariae, se utilizaron para obtener una población de mapeo y para analizar su expresión génica diferencial mediante la técnica cDNA-AFLP. Esto permitió identificar al menos 60 genes que se expresaron específicamente en el genotipo (accesión) resistente. El producto de expresión de uno de estos genes presentó homología con proteínas putativas de la clase NBS-LRR, correspondientes a dos subclases (TIR y CC), que son proteínas de resistencia del tipo R. El estudio de la expresión de este transcripto reveló una represión del mismo en el genotipo suceptible luego de la infección con el aislado F7, mientras que no hubo cambios significativos en la expresión relativa en el genotipo resistente. Este patrón de expresión fue previamente informado para varios miembros de los genes R. Por la importancia de estos genes R en la defensa vegetal, es necesario completar un estudio más exhaustivo para entender los mecanismos que puedan estar involucrados en la defensa de la frutilla contra C. fragariae. El análisis bioinformático de los genes restantes arrojó los siguientes resultados: (i) un grupo mostró homología con genes de plantas, fundamentalmente de Fragaria vesca, que se expresaron ante estrés biótico y abiótico; (ii) tres genes presentaron similitud con factores de transcripción y otro con un mensajero que aparece en Fragaria ananassa en respuesta a ácido salicílico; y (iii) una pequeña fracción presentó homología con genes de otros eucariotas a los cuales se le asignaron funciones diversas o no tienen función putativa conocida. Esta tesis puso en evidencia que la propagación agámica de frutilla, no controlada, puede acumular mutaciones que modifiquen su genotipo y fenotipo agronómico. Además, permitió profundizar en el conocimiento de la genética de la resistencia a patógenos, entre lo que se destaca haber caracterizado un nuevo gen putativo de resistencia, lo que a su vez abre interrogantes respecto de si la expresión diferencial de este gen puede ser la responsable de que un genotipo sea o no resistente. HIPOTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis de trabajo 1. Usando las aproximaciones biotecnológicas moleculares adecuadas, no sólo es posible estimar y analizar la diversidad genética en el Pro-Frutilla, sino que pueden permitir detectar variaciones genéticas entre individuos propagados agámicamente (clones), debidas estas últimas a la acumulación de mutaciones espontáneas que se producen durante largos procesos de multiplicación clonal (agámica o asexual). 2. Estas variantes genéticas leves pueden o no verificarse a través de caracteres fenotípicos, morfológicos y/ o agronómicos (como los descriptores de la UPOV), lo que implica que pueden inclusive afectar el comportamiento frente a agentes patógenos como los causantes de la enfermedad de la antracnosis. 3. En el caso de que las diferencias genéticas tengan una correspondencia con cambios fenotípicos respecto de la resistencia/ susceptibilidad a un determinado patógeno (como por ejemplo C. fragariae), utilizando estrategias genéticas y/ o métodos moleculares apropiados, se pueden buscar marcadores moleculares asociados con la resistencia y también genes que puedan de algún modo estar implicados en la misma. Objetivos El objetivo general de esta tesis doctoral fué llevar a cabo una profunda caracterización de los progenitores (genotipos) mas usados en el Pro-Frutilla, estimar la diversidad genética disponible e identificar regiones del genoma (genes y/ o segmentos de DNA) de la frutilla que estén asociadas o involucradas en la resistencia a uno de los agentes etiológicos de la enfermedad de la antracnosis: C. fragariae. En cumplimiento de lo anterior nos hemos planteado los siguientes objetivos parciales: 1. Caracterización genotípica de cultivares y de accesiones del Banco de Germoplasma Activo (BGA) del Pro-Frutilla, estimación y análisis de la diversidad genética y su relación con la utilización de los descriptores o caracteres fenotípicos de la UPOV. 2. Caracterización fenotípica de accesiones elegidas del BGA con respecto a su nivel de resistencia/ susceptibilidad frente al aislado F7 de C. fragariae. 3. Construcción de una población lo más consanguínea posible donde esté segregando el carácter de resistencia/ susceptibilidad al aislado F7, de tal forma de poder a futuro mapear marcadores moleculares asociados con la resistencia. 4. Identificar transcriptos que se expresen diferencialmente en genotipos de frutilla emparentados y con resistencia/ susceptibilidad contrastante frente al asilado F7 de C. fragariae. 5. Estudio Bioinformático. 6. Validación de transcriptos y/ o marcadores. INTRODUCCION GENERAL 1. La Frutilla: Características biológicas de la planta 1.1. Clasificación taxonómica y condiciones de Crecimiento. La frutilla pertenece a la Familia Rosaceae, Subfamilia Rosoidea, Tribu Potentillea y género Fragaria. Su nombre deriva del latín Fragans, relacionado con el aroma característico que presentan sus frutos. El género Fragaria incluye 23 especies (Shualev y col., 2008). La especie silvestre más común, Fragaria vesca, es un organismo diploide con 14 cromosomas (2n=2x=14). Otras especies importantes son F. viridis Duchesne también diploide, F. moschata Duch. hexaploide (2n=6x=42), F. chiloensis Duch. Octoploide, F. ovalis Rhydb Octoploide y F. virginiana Duch. Octoploide. Sin embargo, la especie más cultivada es Fragaria ananassa Duch., organismo octoploide que cuenta con 56 cromosomas (2n=8x=56). Esta especie híbrida proviene del cruzamiento entre F. virginiana Duch. de Estados Unidos destacada por su sabor, y F. chiloensis (L.) Mill de Chile, destacada por su gran tamaño (Hancock, 1999). Se trata de una especie herbácea perenne y estolonífera de bajo porte considerada un cultivo hortícola, a pesar de que su producto comercial es una fruta. Otros autores la incluyen en el grupo de las frutas finas o berries junto a especies como el arándano, la frambuesa y la zarzamora (Kirschbaum y Hancock, 2000). El cultivo de frutilla se ha extendido por casi todo el mundo debido a la disponibilidad de variedades adaptadas a las distintas condiciones agroecológicas y a los modernos sistemas agrícolas, promoviendo la producción de frutilla desde las regiones frías hasta las regiones tropicales, pasando por las templadas y las subtropicales (Hancock y Retamale, 1999). La frutilla se adapta bien a climas húmedos con temperatura media anual entre 15 y 20ºC y con una mínima no inferior a los -6ºC y una máxima no mayor de 35ºC. Se cultiva en diferentes tipos de suelo, desde arcillosos a arenosos, y los más aptos son los francos a franco-arenosos, de buena fertilidad y buen drenaje con pendiente para evacuar el exceso de agua durante de altas precipitaciones. El rango óptimo de pH es de 5,5 a 7,0. La frutilla es sensible a la salinidad del suelo, por lo que la conductividad eléctrica del extracto de saturación no debe superar 1 mmhos/cm. El requerimiento hídrico mínimo es de 600 mm anuales. El agua de riego debe ser libre de sodio, cloro, boro y el contenido total de sales no mayor de 400-600 ppm (Pritts y Handley, 1999). 1 1.2. Morfología de la planta de frutilla Raíces: Son de aspecto fibroso, las que se originan de la corona (Figura 1) se denominan primarias y responsables del soporte, las secundarias que se originan a partir de las primarias son más delgadas y su función principal es la absorción de los nutrientes (Strand, 1994). Las raíces pueden penetrar en el suelo hasta 0,80 m, pero generalmente se encuentran en los primeros 0,40 m. Tallo: La frutilla presenta un tallo de tamaño reducido pero engrosado denominado ―coron a‖ (Figura 1). Entre cada hoja y la corona se forman las yemas auxiliares que dan origen a estolones o ramas de la corona de acuerdo a las horas de luz y a la temperatura del medioambiente. Inflorescencias pueden formarse solo a partir del meristema de cada corona. Las ramas de la corona pueden a su vez producir raíces adventicias y aumentar el número de frutos por planta (Strand, 1994; Hancock, 1999). Hojas: Tienen pecíolos de longitud variable, son pinadas o palmeadas, generalmente constituidas por tres folíolos de color verde intenso (Figura 1). Tienen estípulas en la base de su pecíolo. Emergen de la corona ubicándose las hojas jóvenes cerca del centro y las senescentes alrededor de la misma, en forma espiralada. Cuentan con un alto número de estomas sobre el envés de cada folíolo, lo que aumenta su tasa de transpiración y por lo tanto su sensibilidad a la falta de humedad (Strand, 1994; Hancock, 1999). Estolón: Es un brote delgado, largo, rastrero, que se forma a partir de las yemas axilares de las hojas situadas en la base de la corona (Figura 1). Su aparición es frecuentemente promovida por altas temperaturas y foto-períodos prolongados. En el extremo del estolón se forma una roseta de hojas con su propia corona que en contacto con el suelo emite raíces, lo que origina una nueva planta con idénticos caracteres a los de la planta madre, proceso conocido como propagación agámica. Hasta que la planta hija desarrolla su sistema radicular, recibe agua y nutrientes de la planta madre por medio del sistema vascular del estolón. Después de 2 a 3 semanas de emitir raíces, la planta hija es capaz de sobrevivir por si mísma (Strand, 1994; Hancock, 1999). 2 e f b c g d a Figura 1: Morfología de Fragaria x ananassa Duch. (a) Raíz, (b) Corona, (c) Hoja, (d) Estolón, (e) Flor, (f) Fruto, (g) Planta hija. Flor: La flor de la frutilla es de simetría actinomorfa (radial), pedunculada, con un grueso receptáculo que se hipertrofia después de la fecundación junto con el ovario para convertirse en fruto (en realidad, el fruto botánico es el aquenio, que tiene la apariencia de una semilla). La flor perfecta está constituida por un cáliz, compuesto normalmente por cinco sépalos, una corola compuesta por cinco pétalos generalmente blancos y numerosos estambres insertos en el receptáculo que contiene además los pistilos dispuestos en espiral sobre él. Las flores se originan a partir de inflorescencias de la corona, inicial como una flor primaria bajo la cual se forman 2 flores secundarias y así sucesivamente hasta incluso cuaternarias (Strand, 1994; Hancock, 1999). Fruto: Los frutos son del tipo múltiple, cuyo receptáculo constituye la parte comestible. Los aquenios son los frutos verdaderos, son secos indehiscentes, uniseminados, de 1 mm de largo, que se encuentran en la superficie del receptáculo. Un fruto mediano suele tener de 150 a 200 aquenios pudiendo llegar hasta 400 en los de gran tamaño. Después de la fecundación, los óvulos al convertirse en aquenios regulan el engrosamiento del receptáculo que finalmente constituirá la parte comestible del llamado fruto. El receptáculo alcanza su madurez entre los 25 y 60 días luego de la polinización adquiriendo hasta 5 cm de diámetro y distintas formas (Strand, 1994; Hancock, 1999). Su color puede ser rosado, carmín, rojo o púrpura. El receptáculo presenta una gran variedad de sabores, aromas y texturas que caracterizan a cada variedad. 3 2. La Frutilla: Aspectos generales de producción 2.1. Importancia del cultivo de frutilla en el mundo El cultivo de la frutilla adquirió un elevado interés mundial debido a las propiedades organolépticas tan especiales de su fruto y los diferentes beneficios que aporta a la salud humana. Se consume directamente en forma fresca, pero es ampliamente utilizado en la industria en la elaboración de jaleas, salsas, conservas, congelados, yogures, bebidas y helados (Branzanti, 1989). El consumo fresco ha demostrado tener efectos benéficos sobre enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y otras enfermedades en humanos como obesidad y cáncer (Maas y col., 1991; Zhang y col., 2008; da Silva Pinto y col., 2010). La producción de frutilla adquiere un creciente valor agregado debido a que la demanda mundial ha impulsado su industrialización y exportación, empleando cada vez más tecnología e insumos. Incluso el cultivo de frutilla demanda importante mano de obra tanto para la producción y cosecha en el campo, como para el empaque de fruta fresca y para la industria del congelado. Actualmente la producción de plantines de frutilla en viveros constituye una actividad con creciente importancia económica. La producción mundial de frutilla ha experimentado un aumento significativo en las dos últimas décadas, alcanzando 5 millones de toneladas en el año 2012 (Zhang, 2012; FAO, 2012). El mayor productor mundial es China (2.000.000 t), siguiéndole EE.UU. (1.500.000 t) y luego España, Corea del Sur, Japón, Polonia, Turquía, Italia, Alemania y México con producciones menores (Zhang, 2012: FAO 2012). 2.2. Cultivo y comercialización de frutilla en Argentina Argentina es uno de los cuatro principales países productores de frutilla en América del Sur, con una producción continua durante los doce meses del año. En la actualidad se cultivan anualmente ~1.500 ha de frutilla y ~200 ha de viveros de frutilla. El rendimiento promedio está en 30 t/ha, en un rango variable que va de 10 a 50 t/ha. La frutilla producida se exporta como fruta congelada principalmente, y también como fruta fresca. La exportación de fruta congelada alcanzó un máximo en el año 2006 de 16.727 toneladas, a partir del cual mostró una disminución anual llegando a llegando a 9.200 toneladas en el 2011 de acuerdo a datos de la EEAOC y el Instituto Nacional de Estadísticas y Censo (INDEC, Rodriguez y col., 2012). Los principales destinos de la fruta congelada exportada desde Argentina son Estados Unidos, China, Brasil y Canadá. 4 Figura 2: Principales destinos de la exportación argentina de frutilla congelada expresados en volumen porcentual, Año 2011. Fuente: EEAOC con datos del INDEC, 2012. En cuanto a la exportación de fruta fresca los volúmenes son bastante menores, solo se realizan durante primavera y verano, y mostraron un aumento del 37% entre 2010 y 2011. Durante el 2011 se exportaron 47 toneladas de frutilla como fruta fresca, principalmente hacia Francia (Rodriguez y col., 2012). Argentina por tener territorios en altas latitudes y contar con valles de altura frescos, se destaca junto a Chile por sus ventajas competitivas para producir plantines de frutilla. Según fuentes del sector privado, Argentina produce 40 millones de plantas. Típicamente para la producción de fruta se utiliza una densidad de 50.000 a 80.000 plantas/ha. La demanda estimada de plantines de frutilla anual para el país es aproximadamente de 50 millones. Viveros especializados nacionales suministran el 85% de esta cantidad, mientras que el 15% restante es importado de Estados Unidos principalmente (Kirschbaum y Hancock, 2000). Las zonas productoras de plantas están distribuidas en las provincias de Santa Cruz, Chubut, Neuquén, Mendoza y Tucumán. Las plantas de frutilla son comercialmente obtenidas por propagación vegetativa de plantas madres, lo que requiere partir de material sano y realizar las labores de multiplicación con máximo cuidado. Se utiliza la micropropagación in vitro, a partir de meristema de estolón, realizando un número limitado de subcultivos para evitar la introducción de variaciones somaclonales (Martínez Zamora y col., 2001). A partir de estas plantas madres se realizan sucesivas multiplicaciones agámicas a campo por enraizamiento de estolones, hasta obtener la primera generación clonal que es la que se comercializa. Si bien el cultivo de frutilla se lleva a cabo en 9 provincias, actualmente la producción se concentra principalmente en las provincias de Santa Fé, Tucumán, Corrientes y Buenos Aires. Esta 5 amplia distribución en la producción hace que exista fruta fresca disponible durante todo el año (Cuadro 1). Cuadro 1: Calendario de cosecha de frutilla en Argentina. (Fuente: Kirschbaum y Hancock 2000). Región Provincia Norte Tucumán En Fe Mz Ab My Jn Jl Ag Se Oc No Di Salta-Jujuy Corrientes – Misiones Centro Sta Fe (Coronda) Bs As (Norte) Sur Bs As (Sur) Río Negro – Neuquén 2.3. Tucumán como productor de frutilla La provincia de Tucumán presenta zonas con excelentes condiciones agroecológicas para el cultivo de la frutilla, destacándose tanto en la producción de fruta y de plantines (Pérez y Mazzone, 2004). Aunque la producción de frutilla tiene un costo elevado, este sector productivo ha experimentado un importante crecimiento desde la década de los 90 en Tucumán. Inclusive se ha posicionado como la principal provincia productora de frutilla congelada en la Argentina. De acuerdo a datos presentados por Kirschbaum y col., (2012), Tucumán produce alrededor de 14.000 toneladas de frutilla anuales con un rendimiento promedio de 31 t/ha para el año 2011, aunque en algunos casos ha superado las 50 t/ha, destacándose como un polo productor e industrializador de frutilla en Argentina. La producción, el comercio interno y las exportaciones de frutilla se incrementaron en los últimos años impulsados además por la incorporación de tecnología y el cumplimiento de normas (BPA, BPM, HACCP, GlobalGap, trazabilidad) que aseguran la calidad y sanidad del producto. Una importante parte de la producción de frutilla de Tucumán se destina al mercado externo. Durante el año 2011 el volumen exportado por nuestra provincia ascendió a 5.781 t y representó el 63% de la frutilla comercializada por el país en el exterior. Comparada con el año 2010, la cantidad exportada representó un aumento del 2% (Rodriguez y col., 2012). Como se muestra en el Cuadro 1, en Tucumán se produce fruta prácticamente todo el año en forma intensiva con las siguientes modalidades: la producción primicia que comprende 6 el período abril-agosto, la frutilla de estación que es cosechada de septiembre a noviembre y la producción de verano que se realiza de diciembre a marzo. La superficie de frutilla plantada en Tucumán comprende alrededor de 450 ha (Kirschbaum y col., 2012) ubicadas principalmente en Lules, Famaillá, Monteros, Chicligasta y Alberdi (Kirschbaum, 2009). La producción durante el verano proviene principalmente de Tafí del Valle que cuenta con 25 ha plantadas, parte de esta superficie se destina a la venta de plantines (Rodriguez y col., 2009). De la frutilla producida en Tucumán un 50% se exporta como fruta congelada, el resto se comercializa como fruta fresca en Tucumán y el resto del país. El mercado central de Buenos Aires (MCBA) recibe la producción de frutilla proveniente principalmente de Santa Fé, Tucumán y Corrientes siendo el período de septiembre y octubre el de mayor volumen de fruta ingresada. Sin embargo Tucumán comienza a comercializar en forma importante su producción desde junio y julio período en el cual adquiere alto valor económico por ser fruta primicia. Cuadro 2: Ingresos provinciales de frutilla al MCBA, expresados en toneladas. Años 2010 y 2011. Fuente: Rodriguez y col., 2012. Figura 3: se observan los ingresos de frutilla al MCBA en t (toneladas), según su origen, durante el año 2011. Fuente: Rodriguez y col., 2012. 7 Tucumán es la principal provincia exportadora de frutillas congeladas argentinas, aportando entre un 70 y 90% del total exportado por el país por este concepto. En el año 2008 el 80% de la frutilla exportada en Argentina fue producida en Tucumán, según datos del SENASA. Las exportaciones de frutilla producida en nuestra provincia fueron destinadas principalmente a Estados Unidos, y en menor proporción a China, Chile, Canadá y Brasil. 3. La Frutilla: principales variedades en Argentina. 3.1. Características de cada variedad Los cultivares de frutilla tienen diferente requerimiento de fotoperíodo y se los clasifica de acuerdo a su respuesta a las horas de luz del día. El tipo de planta que responde al fotoperíodo para florecer se la llama planta de día corto y las indiferentes a la longitud del día son llamadas plantas neutras o reflorescientes (Brandán, 2009). A continuación se mencionan algunas de las variedades más utilizadas en los últimos años en nuestro país, las cuales forman parte del Banco de Germoplasma Activo (BGA; Arias y col., 2006) y constituyen los principales progenitores del Pro-Frutilla (Castagnaro y col., 2004). „Pájaro‟: El fruto se destaca por su calidad: de buen sabor, de forma tronco cónica regular, ligeramente alargado, color superficial rojo brillante e interior también coloreado. Es una de las variedades de mayor aceptación en el mercado internacional. Escasa resistencia al transporte. Susceptibilidad a la enfermedad de la antracnosis. „Chandler‟: Tiene buen tamaño, es firme, cuneiforme, buen sabor y color rojo por dentro, no tan regular como ‗Pájaro‘. En determinadas condiciones climáticas presenta una maduración incompleta, quedando el ápice de la fruta de color verde o blanco. „Camarosa‟: Variedad de día corto similar a ‗Chandler‘ pero con mayor productividad total, y de frutos más grandes y más firmes. Presenta un fruto grande a veces deforme, muy precoz, de color rojo brillante externamente, coloreado interiormente y de sabor de calidad inferior al de ‗Pájaro‘, aunque de mayor firmeza. „Milsei Tudla‟: Frutos grandes, cilíndricos, alargados, aquenios semi-hundidos, color rojo brillante, aromáticos, buena aptitud para el transporte, dureza similar a ‗Chandler‘. „Oso Grande‟: Su inconveniente es la tendencia del fruto al rajado. No obstante presenta buena resistencia al transporte. De color rojo anaranjado, forma de cuña achatada, calibre grueso y buen sabor. 8 „Rosa Linda‟: Frutas cónicas tamaño medio. Color rojo brillante por fuera e interior rojo intenso, más firme que ‗Sweet Charlie‘, de buen sabor y aroma. „Seascape‟: introducida en 1991 por la Universidad de California como una variedad de día neutro superior a ‗Selva‘. Se destacan su sabor, alto rendimiento, gran tamaño de frutos, firmeza, apariencia atractiva. „Selva‟: Variedad de día neutro introducida en 1983 por la Universidad de California. Cuneiforme, color rojo anaranjado que no se oscurece con el tiempo. Buen tamaño y muy firme, no tiene muy buen sabor, es poco jugosa y de mucha dureza al final de la temporada. „Sweet Charlie‟: Variedad de día corto, fruta de tamaño medio, roja y de excelente sabor. De menor potencial de rendimiento, pero altamente precoz y con la ventaja añadida de presentar altos niveles de resistencia a la antracnosis. Las variedades más comercializadas en la región norte y central de nuestro país son ‗Camarosa‘, ‗Chandler‘, ‗Sweet Charlie‘, ‗Pájaro‘ y Milsei Tudla‘. ‗Selva‘ y ‗Seascape‘ son las más frecuentes en la región del sur del país. Mientras que los otros cultivares ‗Oso Grande‘ y ‗RosaLinda‘ también son de importancia (Kirschbaum y Hancock, 2000). 9 CAPITULO l Caracterización molecular de cultivares de F. ananassa. INTRODUCCION El cruzamiento de las especies Fragaria chiloensis L. con Fragaria virginiana Duch. originó plantas de mejor rendimiento y grandes frutos de muy buena calidad. Estas han sido clasificadas como Fragaria ananassa Duch, especie híbrida a partir de la cual se han desarrollado las variedades de frutilla actualmente cultivadas. Thomas Knight en 1795 inició sus trabajos de mejoramiento a través de cruzamientos e hibridaciones utilizando materiales de Estados Unidos de Norteamérica y obtuvo dos variedades conocidas como ‗Dowton‘ y ‗Eton‘. Estas investigaciones fueron el punto de partida para que, posteriormente en Inglaterra en 1811 y 1814, se desarrolle el mejoramiento de la frutilla bajo los auspicios de la "England´s Royal Horticultural Society", de la cual Thomas Knight fue fundador y presidente durante un largo período. En 1834, en Estados Unidos de Norteamérica se obtuvo la variedad comercial conocida como ‗Hooey‘, más resistente al frío que las importadas de Inglaterra. Posteriormente Wilson en 1851 mediante sus trabajos de fitomejoramiento transforma la producción de frutilla como cultivo de importancia económica en todo el territorio de Estados Unidos de Norteamérica. A partir del año 1900, la Universidad de California intensificó notablemente sus trabajos de mejoramiento genético. En igual forma lo hicieron los países europeos y posteriormente países de otros continentes. En las últimas cinco décadas se ha hecho un progreso considerable en los programas de mejoramiento genético de la frutilla. En la actualidad se estima que existen más de 500 variedades de frutillas cultivadas comercialmente en todo el mundo (Galletta y Maas, 1990). Dentro de un programa de mejoramiento es necesario conocer la variabilidad genética del germoplasma que se posee. La información de la diversidad genética es importante para la comprensión de las fuentes de variación genética, la determinación de la forma en que se mantiene la variación genética, cual es la tasa de cambio, etc. Esta información es necesaria para predecir por ejemplo, cuánto tiempo puede durar una fuente de resistencia y formular las estrategias de manejo y sobre todo para dirigir cruzamientos que maximicen la diversidad y el potencial productivo. Actualmente existe un gran número de colecciones de germoplasma que contienen genotipos con un alto valor agronómico, susceptibles de ser usados en los programas de 10 mejoramiento genético. Sin embargo, en muchas ocasiones se cuenta con escasa información de la diversidad genética de los progenitores de los programas de mejoramiento, lo que impide su óptima utilización (Becerra y Paredes, 2000). Dentro de las colecciones existen materiales ingresados como accesiones diferentes que en muchos casos resultan ser un mismo genotipo pero recolectado de distinto lugar geográfico. En ciertas ocasiones algunas accesiones pueden incluir distintos genotipos y esto puede llevar a confusiones si se los considera como un único genotipo. La caracterización de cultivares y accesiones es esencial en programas de mejoramiento. Como se dijo, la valoración correcta de las relaciones genéticas entre los genotipos de un banco de germoplasma puede ser una herramienta muy útil para dirigir los cruzamientos. Antiguamente se evaluaba la diversidad en base a características fenotípicas que generalmente estaban influenciados por el ambiente. Actualmente, la forma más certera, rápida y economica de determinar los niveles de diversidad y estructura genética intraespecífica es a través del uso de marcadores moleculares. ADN, marcadores moleculares y biología molecular A mediados del siglo XX Watson y Crick (1953) descubrieron la estructura del ADN, lo que les permitió sentar las bases para descifrar el código genético y los mecanismos mediante los cuales estos genes intervienen en la determinación de la totalidad de las características visibles y no-visibles de un organismo y cómo éstos son transmitidas de generación en generación. Alrededor del estudio del ADN se desencadenó, entonces, una serie de nuevas áreas de investigación que en las últimas dos décadas se han fusionado bajo la común denominación de biología molecular. Son innumerables las consecuencias de este descubrimiento para el entendimiento de la evolución, la biología y la genética aplicada al mejoramiento de cultivos. Como resultado de esto surgió el concepto de marcadores moleculares cuyo uso cada día es mayor para caracterizar la variabilidad del germoplasma de una especie. La variabilidad o polimorfismo de los marcadores puede ser usada en diferentes estudios de diversidad genética en especies vegetales y su herencia puede ser monitoreada. Los marcadores moleculares incluyen: 1) los marcadores bioquímicos: detectan variaciones en las proteínas que pueden ser de reserva o almacenamiento, y en las isoenzimas o aloenzimas que son formas diferentes de una enzima que comparten una misma actividad catalítica y 2) marcadores de ADN: analizan diferencias en las secuencias, que pueden ser inserciones, deleciones, sustituciones, etc. y se manifiestan como polimorfismos. La mayoría de estos marcadores son heredados genéticamente según las leyes de Mendel y al no estar influenciados por el ambiente, son de mucha utilidad en el mejoramiento genético. 11 Las isoenzimas se definen como diferentes formas moleculares de una enzima que poseen una actividad catalítica común, es decir actúan sobre el mismo sustrato y forman los mismos productos. Ciertos cambios en la secuencia de ADN (mutaciones) que codifica para estas enzimas pueden resultar en cambios de la composición de aminoácidos, originando proteínas con la misma actividad biológica pero con diferente carga neta y por lo tanto con diferentes velocidades de migración en un campo eléctrico. Estas diferencias, visualizadas en geles de poliacrilamida, determinan patrones característicos de migración electroforética de las formas iso-enzimáticas. Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y estructura genética, sistemática y biología evolutiva así, como en la descripción de germoplasma e identificación de variedades. Su aplicación en la construcción de mapas se ha visto limitada por el número de marcadores isoenzimáticos disponibles, en general menor a 50, y por su reducido polimorfismo (2-4 alelos). Por otro lado, las formas isoenzimáticas extraídas de hoja o raíz (no así las de semilla) presentan variaciones en relación a las condiciones ambientales de crecimiento y a la edad del tejido, lo cual afecta la reproducibilidad de los zimogramas (Picca y col., 2004). En cuanto a los marcadores de ADN, también denominados marcadores moleculares, se definen como un segmento particular de ADN que es representativo de diferencias a nivel genómico. Los marcadores moleculares pueden o no correlacionarse con la expresión fenotípica de un carácter, pero ofrecen numerosas ventajas sobre aquellos basados en el fenotipo, ya que son detectables en todos los tejidos, independientemente del estadio de diferenciación, desarrollo o defensa de la planta y no son alterados por efectos ambientales, pleiotrópicos o epistáticos. Marcadores moleculares de ADN en la mejora genética. El desarrollo de nuevas herramientas como los marcadores moleculares basados en el ADN, ha potenciado los avances en la mejora genética. Los marcadores de ADN identifican diferencias en la secuencia de los genes que determinan un carácter de interés, o bien, diferencias entre segmentos de ADN que estan ligados a dichos genes. A lo largo de los años, la selección fenotípica ha sido el método aplicado en los distintos programas de mejoramiento. Esta metodología ha empleado la expresión fenotípica de caracteres externos como fuente de información de la variabilidad existente como objetivo y criterio de selección. Pero en general, una de las principales limitantes de la caracterización fenotípica o morfológica tanto para la identificación varietal como para la estimación de la diversidad genética, son por una parte, la influencia ambiental del carácter a medir lo que conlleva a variaciones en la expresión que no son genéticas sino 12 causadas por diferencias ambientales y por otro lado, el relativamente reducido número de caracteres morfológicos disponibles para medir, que no sean o lo sean en baja magnitud, influenciados por el ambiente. Estos caracteres, que cambian poco con los cambios ambientales, se llaman diagnosticos. Con la identificación de marcadores de ADN asociados a loci que codifican tanto para características cualitativas como para características cuantitativas, se plantea la posibilidad de realizar una selección asistida por estos marcadores (― Marker Asisted Selection‖). Esta se basa en conjugar la variabilidad fenotípica y genotípica como fuente de información de la variabilidad existente y en utilizar como criterio de selección la variabilidad genética (marcadores moleculares de ADN) asociada a la característica de estudio. Algunos marcadores moleculares de ADN al tener su origen en variaciones individuales en la secuencia común de ADN, teóricamente cubren todo el genoma y posibilitan su evaluación en estadios muy tempranos y a partir de muestras mínimas que no destruyen el individuo. Los atributos ideales de un marcador molecular son: Polimorfismo. Amplia cobertura genomica. Herencia mendeliana. Insensibilidad a la influencia ambiental. Ausencia de efectos en el desarrollo de la planta. Simplicidad en la identificación y análisis. Codominancia. Posibilidad de detección en los primeros estadios del desarrollo de la planta. Los marcadores moleculares se han utilizado en la mejora genética de plantas con el fin de estimar las distancias genéticas entre poblaciones, variedades, líneas puras e híbridos y para identificar y distinguir variedades, líneas puras e híbridos y proteger así los derechos del obtentor vegetal en el registro de variedades protegidas. Los marcadores moleculares de ADN permiten una distinción más precisa de genotipos que los descriptores morfológicos requeridos hoy en día; sin embargo estos marcadores no han sido todavía adoptados por los organismos oficiales encargados de la regulación de la protección de variedades porque pueden ser alterados, pero son muy utiles para la investigación y el desarrollo tecnológico, ya que permiten: establecer relaciones de parentesco y localizar e identificar genes de efecto cualitativo y genes que afecten a caracteres cuantitativos, investigar y entender las bases fisiológicas y genéticas de la 13 heterosis y la predicción del rendimiento de los híbridos, identificar factores genéticos útiles en poblaciones o líneas divergentes, evaluar la introgresion de factores genéticos deseados en líneas y poblaciones de mejora, potenciar los programas de selección recurrentes que se basan en las respuestas fenotípicas, analizar las interacciones genotipo – ambiente y monitorear la diversidad de los fondos genéticos (Stuber y col., 1999; Sorrells, 1998). Marcadores moleculares de ADN en Frutilla En la frutilla cultivada se han utilizado principalmente cuatro tipos de marcadores moleculares para estudiar la diversidad genética: AFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados o “Amplified Fragment Length Polymorphisms”), SSR (secuencias simples repetidas o ―Si mple Sequence Repeats‖), ISSR (secuencias simples repetidas internas o ― Inter Simple Sequence Repeats‖) y RAPD (polimorfismo de ADN amplificado al azar o ― Random Amplifield Polymorphic DNA‖). Los AFLP (Vos y col, 1995) fueron usados tanto para estudiar las relaciones genéticas entre cultivares (Degani y col, 2001) como para la identificación de variedades y líneas avanzadas de frutilla (Tyrka y col, 2002). En el caso de los SSR (Smith y col., 1997) el primer informe sobre el desarrollo de SSR en Fragaria spp fue de James y col., (2003) que diseñaron diez SSR a partir de secuencias genómicas de F. vesca. Debido a las ventajas asociadas con SSR incluyendo codominancia, multialelismo y las altas tasas de polimorfismo y reproducibilidad (Powell y col, 1996; Zhu y col, 2000), el número de publicaciones de SSR en Fragaria spp fue aumentando. Aproximadamente 250 pares de cebadores SSR derivados de Fragaria spp están actualmente disponibles para estudios moleculares. Actualmente la mayoría de estos cebadores SSR fueron desarrollados a partir de la frutilla cultivada, F. ananassa (114) seguido de F. vesca (97), F. viridis (22) y F. viriginiana (4). Cada uno de los estudios excepto dos, James y col., 2003 y Keniry y col., 2006, probaron la transferibilidad de los SSR desarrollados para las otras especies y han demostrado altos niveles de transferencia entre especies dentro de Fragaria spp. Los mayores niveles de amplificación se observaron en la especie cultivada, F. ananassa (Bassil y col., 2006a; Bassil y col., 2006b; Cipriani y Testolin, 2004; Hadonou y col., 2004; Lewers y col., 2005). Los ISSR (Wolfe y col., 1998) fueron usados para la identificación de 30 variedades de frutilla de distintos orígenes geográficos y genéticos (Arnau y col., 2003). También se usaron los ISSR para compararlos con los RAPD y determinar las relaciones genéticas de 24 cultivares de un programa de mejoramiento del Instituto de Investigaciones de 14 fruticultura y floricultura de Polonia (Kuras y col., 2004), concluyendo que las relaciones genéticas determinadas sobre la base del análisis de los productos polimórficos fue generalmente similar para ambas técnicas. La técnica de RAPD fue una de las más utilizadas para la caracterización de cultivares de frutilla (Gidoni y col., 1994; Hancock y Callow, 1994; Levi y col., 1994; Parent y Pagé, 1995; Graham y col., 1996; Degani y col., 1998; Congiu y col., 2000), obteniendose la amplificación de varios fragmentos de ADN para cada cultivar, lo que permitió disponer con éxito de perfiles moleculares específicos a pesar de tratarse de un cultivo octoploide (Graham y col., 1996). Los polimorfismos RAPD, por lo tanto, pueden considerarse caracteres útiles para establecer las relaciones genéticas entre los cultivares. Todos estos tipos de marcadores han sido efectivos para determinar diferencias genéticas entre variedades, pero en forma complementaria y con un poder de discriminación diferente entre ellos. En Argentina, prácticamente y con anterioridad a esta tesis, la frutilla cultivada (Fragaria ananassa) no ha sido estudiada utilizando marcadores moleculares. Marcadores RAPD El análisis genómico y genotípico a partir de marcadores RAPD fue descrito por primera vez en 1990 por dos grupos independientes de investigadores (Welsh y McMilland, 1990, Williams y col., 1990). Esta técnica se basa en la metodología de la reacción en cadena de la polimerasa ― PCR‖ (Williams y col., 1990) y tiene la capacidad para el reconocimiento de muchos loci diferentes (Wolfe, 1985). El análisis RAPD utiliza un único cebador, generalmente de 10 nucleótidos, para amplificar secuencias al azar de un ADN genomico. Los polimorfismos detectados con la técnica RAPD pueden originarse de cualquier cambio en la secuencia o sitio de unión del cebador, mutación puntual, translocaciones, inversiones, deleciones etc., que impiden que el cebador se una a la cadena e impida la amplificación del ADN molde en ese sitio. Esta técnica que genera un gran número de marcadores no requiere del desarrollo de sondas específicas para cada especie, ni tampoco del uso de sustancias radioactivas. Por esta razón puede ser implementada en forma más rápida y con menos requerimientos de equipamiento de laboratorio. Además, las cantidades necesarias de ADN molde son 100 veces inferiores a las usadas en otros marcadores moleculares como los AFLP. Al igual que para el PCR, durante el análisis RAPD se producen una serie de reacciones químicas en forma cíclica, cuya contribución relativa al proceso global varía entre los 15 ciclos iniciales, medios y finales (Ruano y col., 1991). Cada ciclo está compuesto por tres fases que son definidas por cambios en la temperatura: a) La desnaturalización del ADN o de los productos previamente sintetizados mediante la incubación a altas temperaturas, lo que provoca la ruptura de los puentes de hidrogeno y la separación de las dos cadenas, las cuales permanecen separadas en solución hasta que la temperatura se reduce. b) La unión del cebador a sitios de secuencia complementaria en las cadenas disociadas, lo que se produce cuando la temperatura disminuye. c) La síntesis de la doble cadena en una dirección específica (de 5‘ a 3‘) y a partir del sitio de unión del cebador mediante la acción de una polimerasa y la presencia en la solución de desoxinucleótidos libres y algunos elementos que actúan como cofactores enzimaticos esenciales como el Magnesio y el Potasio. Esta fase se produce a una temperatura de 72ºC, óptima para la Polimerasa de ADN llamada Taq, porque fue purificada del micoorganismo Thermophilus aquaticus. El RAPD se basa en la existencia de secuencias de ADN complementarias al cebador en cadenas opuestas del ADN y en orientación opuesta dentro de una distancia de entre 200 y 2000pb que permita su amplificación. Cuando los tres pasos se repiten sucesivamente (usualmente de 30 a 40 veces), en solo unas pocas horas se pueden obtener fragmentos amplificados del orden de microgramos, luego de haber iniciado el proceso con cantidades tan reducidas como 5ng de ADN de plantas (Becerra y col., 2007). En el Banco de Germoplasma Activo del Programa Nacional de Mejoramiento Genético de la Frutilla (Pro-Frutilla), se caracteriza el material disponible mediante caracteres morfológicos pero consideramos necesaria una caracterizacion que permita identificar variaciones en el ADN genómico y de ese modo poder estimar las relaciones y las distancias genéticas entre distintos genotipos y accesiones. Asimismo consideramos que la identificación de los cultivares de frutilla es esencial para evitar mezclas o errores y proteger tanto los derechos de obtentor de los mejoradores, como brindar al agricultor garantías en la pureza genética del germoplasma que compra en los viveros autorizados. Teniendo en cuenta todos estos antecedentes y las ventajas que poseen los marcadores RAPD, consideramos que estos serían los apropiados para llevar a cabo nuestro estudio con las principales variedades de frutillas utilizadas en el país. 16 MATERIALES Y METODOS Material vegetal Se eligieron 6 cultivares de Fragaria ananassa Duch. (Cuadro 3) entre los más cultivados en nuestro país: ‗Camarosa‘, ‗Chandler‘, ‗Sweet Charlie‘, ‗Selva‘, ‗Milsei Tudla‘ y tres accesiones del cv Pájaro: ‗Pájaro Mendoza‘, ‗Pájaro Salta‘ y ‗Pájaro Corrientes‘, de acuerdo a la provincia donde fueron multiplicados. Cuadro 3: lista de los cultivares estudiados y sus progenitores correspondientes. Nombre del cultivar Chandler Camarosa Pájaro Selva Sweet Charlie Milsei Tudla Abreviación Ch CAM PAJ S SCh MT Progenitores ‗Douglas‘ X ‗Cal 72.361-105‘ ‗Douglas‘ X ‗Cal 85.218-605‘ ‗Sequoia‘ X ‗Cal 63.7-101‘ ‗Cal 70.3-177‘ X ‗Cal 71.98-605‘ ‗FL 80-456‘ X ‗Pajaro‘ ‗Parker‘ X ‗Chandler‘ Las plantas se obtuvieron en estadío de dormición de distintos viveros y fueron cultivadas y multiplicadas en fitotron, bajo condiciones controladas, en las instalaciones del Programa Nacional de Mejoramiento Genético de la Frutilla (Pro-Frutilla). Las plantas se cultivaron en macetas con un sustrato compuesto por una mezcla de turba:perlita en relación 3:1, esterilizado por tindalización. Se mantuvieron con un fotoperíodo de 16 hs de luz, 70% HR y de 20ºC a 24ºC de temperatura y se regaron con agua destilada. Características morfológicas La evaluación morfológica (caracteres fenotípicos) del material vegetal se realizó considerando los 41 descriptores establecidos para la frutilla cultivada (Cuadro 5 en Resultados) por la UPOV (Unión Internacional para la Protección de las Obtenciones Vegetales, 1995) y el Registro Nacional de la Propiedad de Cultivares y Registro Nacional de Cultivares de Argentina. Estos descriptores son muy estables y varían poco con las condiciones ambientales. Se evaluaron 10 plantas de 10 a 12 meses de edad para cada genotipo. Todas las determinaciones fueron realizadas con la colaboración de Investigadores de la Facultad de Ciencias Naturales e Instituto Miguel Lillo. Análisis Molecular Extracción de ADN genómico El ADN genómico se aisló a partir de las hojas jóvenes de todos los genotipos analizados y según el protocolo publicado por Rogers y Bendich (1988). Se molieron 100 mg de hojas 17 jóvenes con nitrógeno liquido hasta obtener un polvo fino al cual se le agregó 1ml de buffer de extracción: Tris-HCl 100 mM (pH 8), EDTA 50 mM pH 8, NaCl 500 mM, CTAB 10 mg/ml, PVP 20 mg/ml y β- mercaptoetanol 1%. La mezcla se homogenizó con ayuda de vortex y se incubó a 65°C con agitación ocasional por 90 min. Cumplido el tiempo de incubación, se retiraron los tubos y se dejaron enfriar a temperatura ambiente por 5 min, se agregaron 500 μl de cloroformo-octanol (24:1) y se mezcló suavemente hasta obtener una emulsión. Los tubos se centrifugaron durante 10 min a 7000 x g a temperatura ambiente y al sobrenadante se le agregó igual volumen de alcohol isopropílico frío con el objeto de precipitar el ADN. Se centrifugó a 5000 x g durante 5 min y se lavaron los precipitados dos veces con etanol 70% para eliminar los restos de sales; se secaron y resuspendieron en 50 μl de buffer TE (TrisHCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). Con las mismas muestras de tejido vegetal se repitieron las extracciones de ADN pero en este caso con un Kit ― Nucleon Phytopure‖ (Amersham Pharmacia Biotech, UK) según las indicaciones del fabricante y se compararon los resultados obtenidos con ambas metodologías. La concentración y calidad del ADN se evaluó mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 0,7% con buffer TBE 0,5X (Tris Borato 45 mM, EDTA 1 mM). Se sembró en el gel una mezcla de cada muestra que contenía: 1 µl de ADN, 2 µl de buffer de carga 6X para agarosa [azul de bromofenol 0,25% (p/v), xilencianol 0,25% (p/v) y glicerol en agua 30% (v/v)] y 9 μl de agua bidestilada estéril. Se realizó la electroforesis a Voltaje constante (5 V/cm) durante 40 minutos y posteriormente se sumergió el gel en una solución con 0,5 μg/ml de bromuro de etidio durante 20-25 min, luego se fotografió el gel bajo luz UV (260nm) en un transiluminador (Sambrook y col., 1989). El ADN de buena calidad se observó como una banda compacta de alto peso molecular sin signos de degradación. Las concentraciones de ADN fueron establecidas por comparación con muestras de ADN estándar de concentración conocida. Se realizó la dilución a una concentración de 10 ng/µl que fue utilizada como solución de trabajo para las posteriores amplificaciones. Las muestras fueron conservadas a 4ºC hasta su utilización. Caracterización por RAPD Se utilizó la metodología publicada por Williams y col. (1990). Las reacciones de PCRRAPD se realizaron en un volumen final de 20 μl que contenían: 20 ng de ADN molde, 2 mM de MgCl2, 0,1mM de cada nucleótido, 0,2 μM de cebador, 1,5 U de Taq polimerasa (Promega Corporation, Madison, WI, USA) y 2 μl de buffer Taq 10X (PROMEGA, WI, USA). Se utilizaron 20 cebadores de 10 nucleótidos cada uno con una secuencia 18 conocida pero arbitraria, correspondientes a la Serie OPJ de la empresa ―Ope ron Tecnology‖, Inc., Alameda, California, USA (Cuadro 4). Cuadro 4: secuencia de cebadores utilizados en la reacción de RAPD. Serie KIT J Nombre OPJ-01 OPJ-02 OPJ-03 OPJ-04 OPJ-05 OPJ-06 OPJ-07 OPJ-08 OPJ-09 OPJ-10 OPJ-11 OPJ-12 OPJ-13 OPJ-14 OPJ-15 OPJ-16 OPJ-17 OPJ-18 OPJ-19 OPJ-20 Secuencia CCCGGCATAA CCCGTTGGGA TCTCCGCTTG CCGAACACGG CTCCATGGGG TCGTTCCGCA CCTCTCGACA CATACCGTGG TGAGCCTCAC AAGCCCGAGG ACTCCTGCGA GTCCCGTGGT CCACACTACC CACCCGGATG TGTAGCAGGG CTGCTTAGGG ACGCCAGTTC TGGTCGCAGA GGACACCACT AAGCGGCCTC La mezcla de reacción se amplificó en un termociclador MJ-Research PTC-100 con el siguiente programa: una etapa inicial de desnaturalización del ADN a 94ºC durante 3 minutos, seguida de 45 ciclos de: 30 seg a 92ºC, 1 min a 35ºC y 2 min a 72ºC, para finalizar con una incubación a 72ºC durante 5 min. Los experimentos de RAPD fueron repetidos 4 veces para evitar falsos resultados y asegurar la reproducibilidad. En cada experimento se incluyeron controles negativos (sin ADN). Al finalizar la reacción, se separaron 15 μl del producto de amplificación para visualizarlos mediante electroforesis horizontal, en geles de agarosa y los 5 μl restantes por medio de electroforesis vertical, en geles de poliacrilamida. Electroforesis en geles de agarosa: la electroforesis se realizó en geles de agarosa al 1,5% con buffer de corrida TBE 0,5X a 5 V/cm durante 1 hora. Se sembraron en el gel 18 µl de una mezcla que contenía: 15 µl del producto de la amplificación y 3 µl de buffer de carga 6X. A continuación el gel de agarosa se tiñó con bromuro de etidio 0,5μg/ml durante 20 min y luego se observó bajo luz UV (260nm) en un transiluminador. El peso molecular fue estimado por comparación con el marcador de peso molecular 100 Markers (PROMEGA, WI, USA). 19 Electroforesis en geles de Poliacrilamida: las muestras se analizaron también en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes preparados en buffer TBE estándar 0,5X, con acrilamida:bis-acrilamida al 6% (19:1 acrilamida/bisacrilamida), urea 7M, TEMED (N,N,N‘,N‘- tetramethylenediamina) 0,07% (v/v) y APS (persulfato de amonio) 0,07% (p/v). Para esto se utilizó un equipo de electroforesis vertical ―Se qui-Gen GT System‖ de BIORAD. Uno de los vidrios se trató con Repel Silane EC (Amersham Pharmacia Biotech) para facilitar la separación del gel del vidrio después de la electroforesis. Paralelamente, el otro vidrio fue tratado con Bind Silane (PROMEGA, WI, USA) para favorecer la unión del gel al vidrio y permite realizar la tinción de plata del mismo. A 5 μl de cada reacción se le agregaron 2 μl de buffer de carga (95% de formamida desionizada, 10 mM de EDTA pH 8, 1mg/ml de azul de bromofenol y 1mg/ml de xilencianol). Se desnaturalizaron durante 5 min a 95ºC y transfirieron rápidamente a hielo hasta sembrarlos. La electroforesis se llevó a cabo en un buffer de corrida TBE 0,5X a temperatura constante de 48ºC y a 70W por 120min. La visualización de los fragmentos se realizó mediante tinción con nitrato de plata usando el Kit ―Sil ver Staining System‖ (PROMEGA Biotech USA) de acuerdo a las indicaciones del fabricante que a continuación se detalla: fijación durante 20 minutos en ácido acético 10%, tres lavados de 2 minutos cada uno con H2O bidestilada, tinción durante 30 minutos en una solución conteniendo 0,1% de nitrato de plata y 0,06% de formaldehído, lavado de 10 segundos con H2O bidestilada, revelado con una solución compuesta por 0,03% de formaldehído, 0,4% de tiosulfato de sodio y 3% de carbonato de sodio anhidro hasta visualización de las bandas (2 a 5 minutos), fijación final de 5 minutos con acido acético 10%, seguida de un lavado con H2O bidestilada. El tamaño de las bandas se estimó por comparación con un marcador de peso molecular estándar (100bp DNA Ladder, PROMEGA). Análisis de los datos Se realizó un análisis de los datos obtenidos con los caracteres morfológicos y los moleculares por separado y luego un análisis comparativo entre ambos tipos de datos. El análisis estadístico de los datos se realizó con el programa informático NTSYS (Rohlf, 1993). Para el análisis de los caracteres morfológicos se consideraron 6 cultivares, ya que las tres accesiones del cultivar ‗Pájaro‘ poseen los mismos caracteres (descriptores). Se asignó el número 1 al carácter presente y el numero 0 (cero) al ausente en cada uno de los cultivares. 20 Con respecto a los caracteres moleculares (bandas RAPD), se consideraron 8 genotipos, asumiendo que las 3 accesiones del cultivar ‗Pájaro‘ son diferentes. También se asignó el número 1 a las bandas presentes y el 0 (cero) a las ausentes. Solo se registraron como presentes a las bandas detectadas en al menos 3 de las 4 réplicas de cada genotipo. Para el tratamiento de los datos se empleó la siguiente nomenclatura: NA, número de caracteres (bandas) presentes en las muestras A y B; NB, número de caracteres presentes en la muestra A y ausentes en la B; NC, número de caracteres presentes en la muestra B y ausentes en la A. La similitud se calculó usando el coeficiente de Dice (S D) (Crisci y López- Armengol, 1983), cuya fórmula es: SD= 2NA/ (2NA+NB+NC). El Coeficiente de Dice (equivalente al de Nei y Li, 1979), otorga más peso a los caracteres compartidos que a los no compartidos, y excluye como criterio de similitud la ausencia compartida de bandas entre dos muestras. Este coeficiente ha sido recomendado para evaluar similitudes genéticas cuando se usan marcadores RAPD. (Lamboy 1994). En nuestro caso, hemos comprobado previamente que cuando se incluyen más de 50 caracteres en el análisis, se obtienen similares resultados empleando cualquier coeficiente, como el de apareamiento simple o el de Jaccard. El análisis de agrupamiento se realizó utilizando el método UPGMA (― unweighted pair group method with arithmetic mean‖), que es el más usado en ecología y sistemática. (Crisci y López-Armengol, 1983) 21 RESULTADOS Los datos morfológicos analizados en los 6 genotipos coincidieron con los datos de referencia (descriptores) y se muestran en el cuadro 5. Cuadro 5: Descriptores de Fragaria ananassa, se indica con signo (+) la presencia del carácter; y signo (-) ausencia del carácter. CARACTERES o DESCRIPTORES 001 Planta: Forma 1: Globoso {Benton, Gorella} 2: Globosa Aplanada {Senga Sengana} 3: Aplanada {Pantagruella} 002 Planta: Densidad 1: 2: 3: Abierta {Elista} 4: 5: Media {Gorella} 6: 7: Densa {Talisman} 8: 9: 003 Planta: Vigor 1: 2: 3: Débil {Senga Precosa} 4: 5: Medio {Gorella} 6: 7: Fuerte {Elsanta, Grande} 8: 9: 004 Hoja: Color de la cara superior 1: Verde-Amarillo {Tristar} 2: Verde-Claro {Aliso, Georg SoltwedeL} 3: Verde-Medio {Gorella} 4: Verde-Oscuro {Direktor Paul Wallbaum} 5: Verde-Azul {Mrak} 005 Hoja: Forma en seccion transversal 1: Fuertemente Concava {Senga Precosana} 2: Fuertemente Concava a ligeramente Concava 3: Ligeramente Concava {Hapil} 4: Ligeramente Concava a Plana 5: Plana {Georg SoltwedeL} 6: Plana a Ligeramente Convexa 7: Ligeramente Convexa {Domanil} 8: Ligeramente Convexa a Fuertemente Convexa 9: Fuertemente Convexa {Cambridge Favourite} 006 Hoja: Abolladuras 1: Ausentes o Muy Debil {Bemanil} 2: 3: Debil {Marmion} 4: 5: Medio {Precosa} Variedades Camarosa Chandler Milsei Tudla Sweet Charlie Pajaro Selva + - + - + - + + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + - + + - + - + - 22 6: 7: Fuerte {Marie France} 8: 9: Muy Fuerte {Jamil} 007 Hoja: Brillo 1: + 2: 3: Debil {Aptos,Bogota,Mrak} 4: 5: Medio {Darestivale,Irvine} 6: 7: Fuerte {Sweet Delight, Tioga} 8: 9: 008 Foliolo Terminal: Relación Largo/Ancho 1: Mas Ancha que Larga 2: Tan Larga como Ancha {Crusader} 3: Más Larga que Ancha {Montrose,Red Gauntlet} + 4: Mucho más Larga que Ancha {Macherauchs Frühernte} 009 Foliolo Terminal: Forma de la Base 1: 2: 3: Aguda {Gorella,Regina} + 4: 5: Obtusa {Senga Sengana} 6: 7: Redondeada {Crusader,Marie France} 8: 9: 010 Foliolo Terminal: Forma de las Incisiones del Margen 1: Aserrado {Garriguette,Tenira} 2: Crenado {Cambridge Favourite,Irvine} + 011 Peciolo: Implantación de los Pelos 1: Para Arriba {Elista,Georg Soltwedel} 2: Levemente para Arriba {Elsanta} + 3: Perpendiculares {Cambridge Favourite} 012 Estipulas: Pigmentación Antocianica 0: + 1: Ausente o Muy Debil {Elista} 2: 3: Débil {Crusader} 4: 5: Medio {Gorella} 6: 7: Fuerte {Talisman} 8: 9: Muy Fuerte {Royal Sovereign} 013 Estolones: Numero 1: 2: 3: Pocos {Sans Rivale} 4: 5: Medio {Gorella} 6: 7: Muchos {Cambridge Favourite} + - - - - - + - + - + - + - + - + - + - + - + + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + - + - + + - + - + - + - + - + + - + - + - + - 23 8: 9: 014 Estolones: Pigmentación Antocianica 1: Ausente o Muy Debil {Tioga} 2: 3: Débil {Tenira} 4: 5: Medio {Gorella} + 6: 7: Fuerte {Royal Sovereign} 8: 9: Muy Fuerte {Arking} 015 Estolones: Pubescencia 1: 2: 3: Debil {Elista,Vigerla} 4: 5: Medio {Cambridge Favourite} 6: 7: Fuerte {Grande} + 8: 9: 016 Inflorescencia: Posición en Relación al Follaje 1: Debajo {Crusader} + 2: A Nivel {Astino,Cambridge Favourite} 3: Arriba {Direktor Paul Wallbaum} 017 Flor: Tamaño 1: 2: 3: Pequeño {Redgauntlet} 4: + 5: Medio {Gorella} 6: 7: Grande {Domanil} 8: 9: 018 Flor: Tamaño del Cáliz en Relación a la Corola 0: 1: Mas Pequeño {Grande,Nordika} 2: Mismo Tamaño {Korona} + 3: Mas Grande {Regina} 019 Flor: Separación de Pétalos(Solo Flores con 5 ó 6 Pétalos) 0: 1: Libres {Talisman} 2: Se Tocan {Regina} + 3: Superpuestos {Senga Gigana} 020 Pétalo: Relación Largo / Ancho 0: 1: Mucho más Ancha que larga {Senga Gigana} 2: Mas Ancha que Larga {Tioga} + 3: Tan Ancha como Larga {Red Gauntlet} 4: Más Larga que Ancha {Gorella} 5: Mucho más Larga que Ancha {Talisman} 021 Fruto: Relación Largo / Ancho 0: 1: Mucho más Ancho que Largo {Early Dawn} - - - - - - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + - + - + - + - + - + - + - + + - + - + - + - + + - + - + - + - + - + - + - + - - - - + - - 24 2: Ligeramente más Ancho que Largo {Elista} 3: Tan Largo como Ancho {Gorella,Merton Dawn} 4: Ligeramente más Largo que Ancho {Talisman} + + 5: Mucho más Largo que Ancho {Marie France} 022 Fruto: Tamaño 1: Muy Pequeño {Astino} 2: 3: Pequeño {Senga Precosana} 4: 5: Medio {Senga Tigaiga} 6: + 7: Grande {Domanil} + 8: 9: Muy Grande {Maxim} 023 Fruto: Forma más Frecuente o Predominante 1: Reniforme {Early Dawn} 2: Aplanada {Elista} 3: Redonda {Grande} 4: Conica {Gorella} + 5: Bi-Conica {Pantagruella} + 6: Ovoide {Macherauchs Frühernte} 7: Casi Cilindrica {Marie France} 8: Cuneiforme {Georg Soltwedel} 9: Cordiforme {Direktor Paul Wallbaum} 024 Fruto: Diferencia en Forma entre Frutos Primarios y Secundarios 0: 1: Nula o muy Poca {Cambridge Favourite,Vigerla} + 2: 3: Poca {Sengana} 4: 5: Moderada {Gorella} + 6: 7: Marcada {Georg Soltwedel,Talisman} 8: 9: Muy Marcada {Maxim} 025 Fruto: Zona sin Aquenios 0: 1: Ausente o Muy Angosta {Senga Sengana} 2: 3: Angosta {Pandora} 4: 5: Medio {Garriguette} + 6: + 7: Ancha {Pantagruella} 8: 9: Muy Ancha {Earliglo} 026 Fruto: Irregularidad de la Superficie 1: Ausente o Muy Debil {Valeta} 2: Debil {Precosana} + + 3: Fuerte {Red Gauntlet} 027 Fruto: Color 1: Amarillo Blanquecino {Weisse Ananas} 2: Naranja Claro {Merton Dawn} 3: Naranja {Cambridge Favourite} 4: Rojo Naranja {Gorella} + 5: Rojo {Royal Sovereign} - + + - - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + - - + 25 6: Rojo Oscuro {Senga Sengana} 7: Rojo Negro {Honey Oya,Rubina} 028 Fruto: Uniformidad del Color 1: Desuniforme {Marie France} 2: Algo Uniforme {Tamella} 3: Uniforme {Valeta} + 029 Fruto: Brillo 1: 2: 3: Débil {Bemanil} 4: 5: Medio {Macherauchs Frühernte} 6: 7: Fuerte {Red Gauntlet} + 8: 9: 030 Fruto: Implantación de Aquenios 1: Hundidos {Elista} + 2: A Nivel {Regina} 3: Salientes {Rigensa} 031 Fruto: Inserción del Cáliz 0: 1: En Cubeta {Aliso} + 2: A Nivel {Cambridge Favourite,Talisman} 3: Saliente {Regina} 032 Fruto: Disposición de los Sépalos 1: Abrazados o Entrelazados {Elvira} 2: Desplegados {Framura} 3: Replegados o Apoyados {Bounty} + 033 Fruto: Tamaño del Cáliz en Relación al Diámetro del Fruto 0: 1: Mucho más Pequeño {Lumina} 2: Ligeramente más Pequeño {Senga Sengana} 3: Mismo Tamaño {Tenira} 4: Ligeramente más Grande {Senga Precosa} + 5: Mucho mas Grande {Cambridge Favourite} 034 Fruto: Adherencia del Cáliz 0: 1: Muy Débil {Confitura} 2: 3: Debil {Precosa} 4: 5: Medio {Sengana} 6: 7: Fuerte {Red Gauntlet} 8: + 9: Muy Fuerte {Rainier} 035 Fruto: Firmeza 1: Muy Blanda {Marie France} 2: 3: Blanda {Grande} 4: + 5: Medio {Gorella} 6: 7: Firme {Tigaiga} 8: - + - - - + - - + + + + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + - + + - + - + + + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - 26 9: Muy Firme {Holiday} 036 Fruto: Color de la Pulpa 1: Blanquecina {Regina} 2: Rosa Palido {Direktor Paul Wallbaum,Precosa} 3: Rojo Naranja {Talisman} 4: Rojo Claro {Cambridge Favourite} 5: Rojo Medio {Elista} + + 6: Rojo Oscuro {Senga Tigaiga} 037 Fruto: Hueco Central 0: + 1:Ausente o muy Débilmente Expresado + {Onebo,Geride} 2: Debilmente Expresado {Agana,Douglas} 3: Fuertemente Expresado {Costina,Fiesta} 038 Fruto: Distribución de la Coloración Roja de la Pulpa 1: Solo Marginal 2: Solo Central 3: Marginal y Central + + 039 Época de Floración (50%de las Plantas con por lo menos 1 Flor) 1: Muy Temprana {Karina} 2: 3: Temprana {Pantagruella} + 4: + 5: Medio {Cambridge Favourite} 6: 7: Tardia {Tago} 8: 9: Muy Tardia {Pandora} 040 Época de Maduración (50%de las Plantas con Frutos Maduros) 1: Muy Temprana {Karina} 2: 3: Temprana {Pantagruella} + 4: + 5: Medio {Cambridge Favourite} 6: 7: Tardia {Tago} 8: 9: Muy Tardia {Pandora} 041 Reflorescencia 1: No Refloresciente {Cambridge Favourite} + + 2: Parcialmente Refloresciente {Red Gauntlet} 3: Refloresciente {Brighton} 4: Dia Neutro {Florika} - - - - - + - + - + - + - + - + - + - - - - - + - + + - + - + + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - La calidad y cantidad de ADN obtenidos de la purificación con los dos métodos utilizados fue similar. Se realizaron reacciones de RAPD, con las muestras obtenidas con los distintos métodos de extracción, y se obtuvieron perfiles de amplificación similares para ambos métodos en todas las muestras. En este estudio se obtuvieron productos de amplificación con 16 de los 20 cebadores utilizados. Los cuatro cebadores que no produjeron amplificación fueron: OPJ02, OPJ03, OPJ08 y OPJ13. Con los cebadores OPJ15 y OPJ20 no se detectaron bandas 27 polimórficas entre los genotipos estudiados, mientras que el OPJ19 solo produjo polimorfismos entre las tres accesiones del cultivar ‗Pájaro‘. El análisis de los geles de agarosa mostró que únicamente el cebador OPJ14 permitió amplificar una banda polimórfica para el cultivar ‗Selva‘ (Figura 4). Con el mismo cebador se observó en el cultivar `Pájaro Corrientes‘ la ausencia de una banda que está presente en las otras dos accesiones de ‗Pájaro‘ (Figura 4). En los perfiles de amplificación obtenidos con los restantes cebadores no se observaron bandas polimórficas reproducibles útiles para la identificación de las accesiones analizadas. Figura 4: electroforesis en gel de agarosa mostrando perfiles de amplificación RAPD de los cultivares analizados, obtenidos con el cebador OPJ14. M, marcador de PM para PCR 100bp ladder; 1, ‗Camarosa‘; 2, ‗Milsei Tudla‘; 3, ‗Pájaro Corrientes‘; 4, ‗Pájaro Mendoza‘; 5,‘Pájaro Salta‘; 6, ‗Selva‘; 7,‘Chandler‘; 8, ‗Sweet Charlie‘. Las flechas señalan los marcadores diferenciales. Teniendo en cuenta los resultados anteriores, los mismos productos de amplificación fueron separados por electroforesis en geles de poliacrilamida, con lo que se logró un significativo incremento de la resolución (Figura 5). 28 Figura 5: Electroforesis en geles de poliacrilamida mostrando los perfiles de amplificación RAPD de los cultivares analizados con los cebadores OPJ14 (a) y OPJ04 (b). M, marcador de peso molecular para PCR 100pb ladder. Gel (a).1, ‗Camarosa‘; 2, ‗Milsei Tudla‘; 3,‘Chandler‘; 4, ‗Pájaro Corrientes‘; 5, ‗Pájaro Mendoza‘; 6, ‗Pájaro Salta‘; 7, ‗Selva‘; 8, ‗Sweet Charlie‘. Gel (b) 1, ‗Camarosa‘; 2,‘Chandler‘; 3, ‗Milsei Tudla‘; 4,‘Sweet Charlie‘; 5, ‗Pájaro Corrientes‘; 6 ‗Pájaro Mendoza‘; 7 ‗Pájaro Salta‘; 8, ‗Selva‘. Las flechas indican los marcadores diferenciales. Se obtuvieron en promedio de 20 a 45 bandas por cebador. En total, con 16 cebadores se amplificaron 550 bandas, de las cuales 120 fueron polimórficas. Entre estas últimas, 37 bandas obtenidas con 13 cebadores pueden considerarse marcadores específicos de genotipo, fueron reproducibles y diferentes en tamaño con respecto a las bandas vecinas (Figura 5 y Cuadro 6). Estos resultados demostraron que la técnica de RAPD combinada con la electroforesis de alta resolución en geles de poliacrilamida, permitió identificar marcadores específicos de cultivar y, como se observa en el cuadro 6, con solamente 3 cebadores pueden diferenciarse los 8 genotipos estudiados. 29 Cuadro 6: Bandas RAPD polimórficas que distinguen cada uno de los 8 genotipos analizados. (1) +, presencia de banda; - , ausencia de banda. CAM, ‗Camarosa‘; Ch, ‗Chandler‘; MT, ‗Milsei Tudla‘; SCh, ‗Sweet Charlie‘; PC, ‗Pájaro Corrientes‘; PM, ‗Pájaro Mendoza‘; PS ‗Pájaro Salta‘; S, ‗Selva‘, (2) Cebadores que discriminan cada uno de los 8 genotipos Cebadores Tamaño de banda (pb) La electroforesis en poliacrilamida permitió, además, comprobar diferencias entre las tres accesiones del cultivar ‗Pájaro‘. Los polimorfismos fueron detectados con los cebadores OPJ18, OPJ06, OPJ07, OPJ09, OPJ19 (Figura 6), y con OPJ10, OPJ14, OPJ17 y OPJ05. Estos resultados demuestran que considerar solamente los caracteres morfológicos son insuficientes para una correcta identificación de los cultivares. 30 Figura 6: Geles de poliacrilamida mostrando los perfiles de amplificación RAPD de las tres accesiones del cultivar ‗Pájaro‘, obtenidas con los cebadores OPJ18 (a), OPJ06 (b), OPJ07 (c), OPJ09 (d) y OPJ19 (e). Las muestras: 1, ‗Pájaro Corrientes‘; 2, ‗Pájaro Mendoza‘; 3, ‗Pájaro Salta‘. Las flechas señalan los marcadores diferenciales. El análisis de las similitudes genéticas mediante UPGMA, considerando todos los caracteres genómicos detectados, es decir las bandas comunes y no comunes, se utilizó para construir un fenograma que se muestra en la Figura 7. Se consideraron caracteres comunes a las bandas presentes en todos los genotipos analizados. Índice de DICE Figura 7: Fenograma de similitudes genéticas generado con 550 caracteres RAPD. CAM: ‗Camarosa‘, PM: ‗Pájaro Mendoza‘, PS: ‗Pájaro Salta‘, PC: ‗Pájaro Corrientes‘, SCh: ‗Sweet Charlie‘, CH: ‗Chandler‘, S: ‗Selva‘, MT: ‗Milsei Tudla‘. 31 Los valores de distancia genética, calculados con el índice de Dice, variaron entre un mínimo de 0.65 y un máximo de 0.78, indicando que estos cultivares están estrechamente relacionados. De acuerdo con el fenograma, las accesiones Mendoza y Salta del cultivar Pájaro son cercanas genéticamente. Sin embargo, la accesión Corrientes se mostró más cercana al cultivar Camarosa que a las otras accesiones de Pájaro, que sería lo esperado. A fin de evaluar si las relaciones genéticas basadas en los caracteres moleculares son semejantes a las basadas en los caracteres morfológicos diferenciales (descriptores) que se emplean para identificar los cultivares, se generaron dos fenogramas, uno con los caracteres morfológicos y el otro con las bandas RAPD no comunes, o sea solo las polimórficas entre los genotipos en estudio. Como puede observarse en la Figura 8, entre ambos fenogramas hay diferencias significativas en el agrupamiento, indicando que los datos morfológicos no se corresponden con los datos moleculares. Índice de DICE Índice de DICE Figura 8: Fenogramas generados con caracteres morfológicos (a), y con los caracteres RAPD no comunes (b). CAM, ‗Camarosa‘; Ch, ‗Chandler‘; MT, ‗Milsei Tudla‘; SCh, ‗Sweet Charlie‘; PC, ‗Pájaro Corrientes‘; PM, ‗Pájaro Mendoza‘; PS, ‗Pájaro Salta‘; S, ‗Selva‘. Es interesante señalar que la topología del fenograma generado con los caracteres moleculares polimórficos (no comunes) es diferente a la del fenograma obtenido con todos los caracteres, comunes y no comunes. (Figura 7 y 8b) Los resultados obtenidos en el análisis molecular permitieron, además de identificar los cultivares correctamente, establecer sus relaciones genéticas y elegir los progenitores para construir una población segregante que sera utilizada con posterioridad. 32 DISCUSION En este estudio, la fidelidad de los marcadores RAPD se comprobó al no encontrar diferencias en los loci amplificados en las mismas muestras provenientes de extracciones de ADN independientes obtenidas, inclusive, con diferentes métodos. El uso de estos marcadores moleculares ha sido fácil de implementar por su simplicidad, reproducibilidad, ausencia de elementos radiactivos para el análisis y la gran cantidad de polimorfismos que se obtuvieron al combinarlos con la alta resolución de los geles de poliacrilamida. Aprovechando la versatilidad de la técnica de RAPD, en nuestro laboratorio ya se habían desarrollado los primeros marcadores moleculares específicos de especies silvestres y cultivadas de frutilla (Ontivero y col., 2000). Del mismo modo, pero usando electroforesis de alta resolución, en el presente trabajo se generaron 37 marcadores genotípicos para la identificación inequívoca de las 6 variedades de frutilla mas cultivadas en la Argentina. Utilizando esta aproximación pudieron diferenciarse tres accesiones distintas del cultivar Pájaro, que habían sido multiplicadas en forma independiente. Las diferencias observadas a nivel genómico podrían explicarse en el hecho de que en Argentina este cultivar es de uso libre y fue multiplicado clonalmente, mediante estolones o micropropagación, sin necesidad de usar los clones originales. Los eventos repetidos de micropropagación podrían haber generado las diferencias genómicas detectadas en el análisis molecular. Estas mutaciones se conocen como variación somaclonal y se deben a cambios espontaneos en la secuencia del ADN genómico que se fueron acumulando con los sucesivos eventos de multiplicación. La comparación de fenogramas, basados uno en caracteres morfológicos y el otro en datos moleculares, mostró diferencias significativas en el agrupamiento de los cultivares. Estas diferencias indicarían que las regiones del ADN examinadas con RAPD corresponden a regiones que no se expresan en los caracteres fenotípicos considerados por la UPOV como caracteres a evaluar para distinguir las variedades. Estos resultados evidencian que los caracteres considerados por la UPOV no serían adecuados para evaluar las relaciones genéticas entre los cultivares. Apoyándonos en la genealogía de las variedades (Cuadro 3) podemos ver que mientras Sweet Charlie es hija de Pajaro, en el fenograma de los caracteres RAPD aparecen muy cercanos genéticamente y no así en el fenograma generado con los descriptores. Algo semejante ocurre con Milsei Tudla, hija de Chandler las que aparecen cercanas genéticamente cuando analizamos el agrupamiento con los caracteres RAPD y no en el de los descriptores. 33 CONCLUSIONES La técnica de RAPD convencional, utilizando geles de agarosa, no permitió detectar bandas polimórficas útiles para la identificación de los cultivares de F. ananassa analizados en el presente trabajo. En cambio, una modificación original implementada en esta tesis condujo a aumentar la resolución en geles de poliacrilamida y de ese modo se consiguió la identificación inequívoca de los cultivares y de las diferentes accesiones de un mismo cultivar, empleando solamente tres cebadores. Se demostró que los caracteres distintivos fenotípicos (descriptores) recomendados por la UPOV para la identificación varietal no reflejan el parecido genético el cual se pone de manifiesto a través del análisis de los marcadores moleculares obtenidos. Se demostró que un mismo cultivar caracterizado a través de los descriptores de la UPOV, puede presentar diferencias genéticas si el mismo se multiplica en forma independiente sin recurrir siempre a plantas madres de pureza genética determinada. En esta tesis se demostró la utilidad de los marcadores RAPD en el mejoramiento genético de la frutilla, a través del establecimiento de distancias genéticas, de la identificación varietal inequívoca, y de la posibilidad de asociar este tipo de marcadores con caracteres de interés agronómico. 34 CAPITULO ll Caracterización fenotípica de cultivares de F. ananassa. INTRODUCCION Las variedades de frutilla son comúnmente susceptibles a diversos factores abióticos y bióticos que causan estrés al cultivo y reducen notablemente su producción y rendimiento. Los principales causantes de estrés biótico en frutilla son un gran número de enfermedades provocadas por hongos, bacterias, virus y micoplasmas, así como por fitófagos diversos. Producen reducción del tamaño de la planta, mortalidad y por consiguiente limitan la producción y calidad de la fruta (Howard y Albregts, 1984). Al igual que otros cultivos, la frutilla es afectada por hongos de suelo desde sus primeras fases de crecimiento. Existen numerosas enfermedades y plagas citadas para la región del Noroeste argentino. De acuerdo a los datos del INTA (http://www.inta.gov.ar/famailla/ frutilla/info/prob_fitosanitarios.htm) las enfermedades más frecuentes en los cultivos de frutilla en la provincia de Tucumán son: a) Podredumbre de raíz y coronas: causadas por hongos de los géneros Phytophthora (podredumbre de corona y corazón rojo), Rhizoctonia (podredumbre negra de raíz) y Colletotrichum (antracnosis). b) Enfermedades de hojas: mancha angular de la hoja (Xanthomonas fragariae), mancha foliar (Gnomonia comari), viruela (Mycosphaerella fragariae o Ramularia), quemadura o mancha (Dendrophoma/Phomopsis de la hoja obscurans), (Diplocarpon oidio earliana), (Sphaerotheca tizón macularis), antracnosis (Colletotrichum spp.). c) Enfermedades de flores y frutos: podredumbre por moho gris (Botrytis cinerea), oidio (Sphaerotheca macularis), antracnosis (Colletotrichum spp.) y podredumbre poscosecha (Rhizopus spp., Mucor spp., Penicillum spp., Aspergillus spp.). La antracnosis La antracnosis de la frutilla causada por un complejo de hongos del género Colletotrichum, es sin duda la enfermedad que afecta en mayor medida al cultivo (Howard y col., 1992). Ataca prácticamente todos los órganos de la planta y provoca grandes 35 pérdidas tanto en la producción de fruta como de plantines, principalmente en regiones agroclimáticas tropicales y subtropicales (Freeman y Katan, 1997). Una epifitia de antracnosis en campos de producción de frutilla causó la pérdida de toda la producción de fruta en Florida, EEUU (Howard y col., 1992), y provocó una reducción del 30% al 68% del rendimiento en el centro de Brasil (Henz y col., 1992). En Argentina se consideraba una enfermedad secundaria hasta 1993, año en el que alcanzó proporciones epidémicas en la provincia de Tucumán, siendo responsable de la llamada ―m uerte de plantas‖ que determinó la reducción del 50% de la superficie cultivada (Kirschbaum, 2000). Otro ejemplo, en la campaña 2005/2006 la producción de fruta de verano en Tafí del Valle (Tucumán), debió abandonarse en amplias superficies, debido a la fuerte incidencia de la antracnosis. Esto determinó que en esa localidad actualmente sólo se esté cultivando un 25% de la superficie que se había destinado a la frutilla de verano (Dr. Ing. Agr. Salazar, Com. Pers. 2007). Esta enfermedad fue descripta por primera vez en 1931 por Brooks, quien utilizó el término ―an tracnosis‖ para describir los síntomas causados por la infección de Colletotrichum fragariae en la frutilla considerando que éste era el único agente etiológico responsable de la antracnosis de frutilla. Posteriormente este término fue ampliado para incluir a todos los síntomas causados por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Colletotrichum que afectan distintos cultivos (Delp y Milholland, 1980; Smith y Black, 1990). Actualmente, tres especies de Colletotrichum han sido descriptas como agentes etiológicos de la antracnosis: C. acutatum J.H. Simmonds (Teleomorfo Glomerella acutata), C. fragariae Brooks y C. gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc. in Penz. (teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk) (Smith y Black, 1986; Smith y Black, 1990; Howard y col., 1992; Adaskaveg y Hartin, 1997; Ramallo y col., 2000; Mónaco y col., 2000). La presencia de C. fragariae en nuestro país fue observada por primera vez en el año 1974 en la provincia de Tucumán (Mena y col., 1974), mientras que la existencia de las especies C. acutatum y C. gloeosporioides en la región Noroeste de la Argentina fue informada por primera vez recien en el año 2000 (Ramallo y col., 2000; Mónaco y col., 2000). Estos hongos presentan dos estados: el imperfecto pertenece a la clase de los Deuteromycetes y el perfecto a los Ascomycetes. La clasificación taxonómica sistemática del patógeno en su estado imperfecto es la siguiente: Subdivisión: Deuteromycotina 36 Clase: Deuteromycetes Subclase: Coelomycetidae Orden: Melanconiales Familia: Melanconiaceae Género: Colletotrichum El estado perfecto pertenece a: Clase: Ascomycetes Subclase: Euascomycetidae Serie: Pirenomycetes Orden: Diaporthales Familia: Diaporthaceae Género: Glomerella La Clase Deuteromycetes recibe este nombre por la falta aparente de una fase sexual. La Subclase presenta conidios que se forman en picnidios o acérvulas. El estado perfecto muestra mayor complejidad de estructuras y fases reproductivas. La Clase Ascomycetes tiene amplia distribución, encontrándose en una gran diversidad de hábitats. Los distingue la producción de una estructura en forma de saco o bolsa, llamada asco que contiene un número variable de esporas. C. gloeosporioides es un hongo perfecto cuyo teleomorfo se conoce con el nombre de Glomerella cingulata. Sin embargo, la diferencia (presencia o ausencia) en la fase sexual no constituye por sí sola un criterio adecuado para la separación de estas especies, es por esto que erróneamente se consideró durante muchos años que C. fragariae era sinónimo de C. gloeosporioides (von Arx, 1970). Colletotrichum acutatum fue descripto por primera vez en Australia y se distingue de C. gloeosporioides por la morfología de sus conidios, ya que C. acutatum también presenta un estado teleomórfico, conocido como Glomerella acutata (Guerber y Correll, 1997). A partir de 1983 se demostró que Colletotrichum acutatum era responsable también de causar antracnosis en la frutilla (Smith y Black, 1986). Durante 1980 y 1990 muchos fitopatólogos estadounidenses reconocieron un importante aumento de C. acutatum en los campos de frutilla, pero no quedó claro si el cambio se debió a una introducción reciente o si el patógeno ya estaba presente antes y no había sido reconocido. Las especies de Colletottricum pueden distinguirse por características morfológicas, culturales y moleculares (Freeman y Katan, 1997; Simmonds, 1965; Smith y Black, 1990). 37 Smith y Black (1990) informaron que C. fragariae podría ser identificado por tener conidios cilíndricos y colonias de color beige, oliva a grises oscuras. Los aislamientos de C. gloeosporioides pueden ser diferenciados de otras especies por tener colonias de color gris o gris-oliva, gris oscuro a verde oliva oscuro y conidios cilíndricos. Los aislamientos de C. acutatum pueden ser identificados por color rosa, naranja, o colonias beige, cremarosa, o rosa y conidios fusiformes. La presencia o ausencia de setas se ha utilizado también para ayudar en la identificación de especies de Colletotrichum (Gubler y Gunnell, 1991). Esta diversidad fenotípica responde a una diversidad genotípica dentro de cada especie de hongo. Sintomatología: La antracnosis es una enfermedad holonecrótica que ataca distintos tejidos de la planta tales como coronas, hojas (pecíolos y foliolos), estolones, pedúnculos, pedicelos, flores, frutos y raíces (Smith y Black, 1990; Howard y col., 1992; Freeman y Katan, 1997), independientemente de la especie del hongo patógeno. En estolones se describen manchas hundidas, firmes, oscuras y secas, bien delimitadas que progresan rodeando al estolón (Figura 9 D), produciendo la marchitez y muerte de las plantas hijas por colapso de los sistemas de conducción. Asimismo, el pecíolo estrangulado por la lesión es capaz de provocar la muerte de la hoja (Figura 9 F). El hongo puede invadir la corona desde el estolón o el pecíolo produciendo la podredumbre de corona. Al realizar un corte longitudinal de las coronas de plantas infectadas, se observa una podredumbre firme de color marrón rojiza, considerada uno de los signos distintivos de la enfermedad (Figura 9 C). Las plantas con las coronas infectadas exteriorizan importante reducción del crecimiento, incrementan el número de brotes afectados y hojas secas de color castaño, finalmente se marchitan y mueren (Colombo, 2006). La sintomatología en hojas puede considerarse la primera evidencia del hongo en viveros y se visualiza como manchas de color negro (Howard y Albregts, 1984; Tanaka y col., 1996), de aspecto oleoso y de un diámetro de 0,5 a 1,5 mm, generalmente en la cara adaxial del foliolo (Figura 9 E). El síntoma en flores se denomina tizón. Sobre el pedicelo se forma una lesión marrón oscura que alcanza al cáliz (Figura 9 B) y se pueden observar masas de conidios densas y gelatinosas de color naranja llamadas cirrus formadas por exudados del patógeno en los pedicelos y flores infectadas (Ramallo, 2000). La podredumbre de frutos causada por Colletotrichum spp., se da principalmente en frutos maduros, donde se desarrollan manchas redondeadas, firmes y hundidas, de color 38 marrón o negro, las cuales pueden aumentar de tamaño hasta abarcar todo el fruto, causando su momificación (Figura 9 A). En la planta estos hongos pueden infectar muchos tejidos, pero sin duda las dos fases económicamente devastadoras son pudrición de la corona y la pudrición de la fruta. La podredumbre de la corona se suele asociar con C. fragariae y algunas veces con C. gloeosporioides. La pudrición de la fruta por lo general es asociada con C. acutatum. En función del genotipo de la planta y del patógeno, cuando se produce la infección, si esta es severa puede llegar a matar la planta en pocos días. En general, si el inóculo está presente, la enfermedad en los cultivares susceptibles se presenta en períodos cálidos y lluviosos. Figura 9: Sintomatología en diferentes órganos de la planta de frutilla. A) Podredumbre en frutos. B) Tizón en flores. C) Podredumbre de corona. D) Lesiones provocando el estrangulamiento del estolón. E) Manchas negras en hojas. F) Estrangulamiento en pecíolos. Fuente: Sergio M. Salazar (Universidad Nacional de Tucumán) y Jack Kelly Clark (Universidad de California). Dada la gran diversidad de patógenos tanto entre como dentro de especies hay una coevolucion patógeno/planta en la que interfiere el hombre con el mejoramiento genético, lo que resulta en que casi todas las variedades de frutilla son sensibles a la enfermedad 39 de la antracnosis. Así C. fragariae ataca generalmente estolones y otros órganos vegetativos, mientras C. acutatum lo hace preferentemente en fruto y C. gloeosporioides puede infectar cualquier tejido de la planta. Todo ello adiciona complejidad al patosistema (Ramallo, 2000). Ciclo de la enfermedad y epidemiología Como pudo comprobarse que Colletotrichum puede permanecer viable en el suelo y en hospederos alternativos de una estación a otra, se supone que este seria el origen del inóculo que inicia la infección convirtiéndose en la fuente primaria de inóculo (Figura 10; Freeman y col., 2001). Independientemente de la fuente de inóculo, la infección primaria comienza cuando la parte aérea de la planta se pone en contacto con el patógeno. A partir de allí, se produce un gran número de esporas sobre las lesiones, las cuales son diseminadas por el viento y el agua constituyendo la fuente secundaria de infección (Ntahimpera y col., 1997) (Figura 10). Períodos de 3 a 4 días de lluvia seguidos por alta humedad ambiente son favorables para desencadenar la enfermedad (Madden y Boudreau, 1997; Ntahimpera y col., 1997), a la vez que la máxima esporulación del patógeno se consigue a una temperatura de 25ºC. Los períodos de mayor susceptibilidad de las plantas de frutilla se corresponden con la producción de estolones en la etapa vegetativa y con el incremento de la madurez de los frutos en la etapa reproductiva del cultivo. De esta forma, los estolones jóvenes y el pecíolo de la hoja más joven, constituyen las partes más susceptibles de la planta. Además, las flores abiertas y los frutos maduros son más susceptibles que las yemas cerradas y los frutos verdes. 40 Figura 10: Ciclo hipotético de la enfermedad de la antracnosis en frutilla causada por Colletotrichum sp. A la derecha se muestran los estados del ciclo de vida del patógeno. C: conidios. A: apresorio. IH: hifa infectiva. En el marco del Programa Nacional de Mejoramiento Genético de la Frutilla (Pro-Frutilla) en el laboratorio de Biotecnología Vegetal del INSIBIO (CONICET-UNT) se obtuvieron aislados de las diferentes especies de Colletotrichum responsables de la antracnosis de la frutilla en el Noroeste argentino. Los cultivares de frutilla mas utilizados en argentina, los que a su vez son los principales progenitores del Pro-Frutilla, fueron desafiados con estos genotipos (aislados) de Colletotrichum correspondientes a las tres especies mencionadas. Para el trabajo experimental de la presente tesis doctoral y con el objetivo de discriminar respuestas especificas, fue elegido uno de estos aislados, denominado F7, que corresponde a la especie Colletotrichum fragariae; para investigar la interacción genotipo de la planta con genotipo del patógeno, tendiente a la búsqueda de genes que puedan en definitiva contribuir a implementar estrategias de manejo sostenible de la enfermedad. 41 MATERIALES Y METODOS Material vegetal Se utilizaron los mismos genotipos mencionados en el capítulo l: ‗Camarosa‘, ‗Chandler‘, ‗Sweet Charlie‘, ‗Selva‘, ‗Milsei Tudla‘ y ‗Pájaro‘. Este último cultivar representado por las 3 diferentes accesiones, ‗Pájaro Mendoza‘, ‗Pájaro Salta‘ y ‗Pájaro Corrientes‘ de acuerdo a la provincia donde fue colectada. Condiciones de crecimiento Las plantas de frutilla (Fragaria ananassa Duch.), fueron colectadas en estadío de dormición en Tafí del Valle de las instalaciones del vivero del Programa Nacional de Mejoramiento Genético de la Frutilla (Pro-Frutilla) y mantenidas en invernadero. Posteriormente este material fue propagado asexualmente por enraizamiento de estolones en cámaras de cría. En todos los casos se utilizó sustrato esterilizado por tindalización, mediante autoclavado, para asegurar la calidad fitosanitaria de las plantas. De esta manera el material vegetal se mantuvo libre de contaminación fitopatógena y en condiciones adecuadas para un buen crecimiento vegetativo. Las plantas se regaron con agua destilada y todas las hojas senescentes fueron removidas periódicamente hasta 10 días antes de los experimentos de inoculación. Se seleccionaron 8 plantas de cada genotipo por su tamaño: al menos 5 hojas totalmente expandidas, lo que bajo nuestras condiciones se logra entre 14 y 16 semanas de cultivo. Material fúngico Se utilizó el aislado F7 de Colletotrichum fragariae, del cepario obtenido por nuestro grupo. Este cepario contiene numerosos aislados de Colletotrichum sp. y fue construido a partir de la colección de tejido enfermo de plantas de frutilla cultivadas en distintas regiones productoras del Noroeste argentino (Salazar, 2009. Tesis Doctoral). El aislado F7 fue obtenido a partir de una planta de la variedad Chandler, con frutos que mostraban los síntomas característicos de antracnosis. Los frutos fueron recolectados directamente del campo de una plantación de frutillas de la localidad de Famaillá, en la provincia de Tucumán. A partir de esta muestra se obtuvo un cultivo monospórico del hongo, el que se denominó F7. Para ello, en condiciones de esterilidad, en cámara de flujo laminar (Casiba HL1, Argentina), se raspó suavemente el micelio de la superficie de una colonia con una espátula y el material así obtenido se resuspendió en 15 ml de agua destilada estéril. La suspensión se filtró a través de gasa con la ayuda de una jeringa estéril para remover los restos de micelio y se realizó el recuento de conidios en cámara de Newbawer. Se llevó a 42 una concentración de 1,5 x 106 conidios/ml con agua destilada estéril y se realizaron diluciones sucesivas: 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16. Se esparcieron 0,1 ml de cada dilución en placas de Petri conteniendo 20 ml de medio Agar Papa Glucosado (APG) al 1,5% pH 6,6 6,8 (Hansen, 1926). Las placas se incubaron a 28ºC bajo luz blanca continua (2.000 lux) para inducir la formación de conidios (Smith y Black, 1990). Cada 24hs se evaluó el crecimiento en cada placa y al 5º día con la dilución 1:4 se detectó crecimiento de una espora/conidio del hongo. A este punto de crecimiento del hongo se lo retiró, en condiciones asépticas, y se lo transfirió a una nueva placa con medio APG que se incubó en las condiciones mencionadas. La colonia desarrollada a partir de esta espora es la que se multiplicó para realizar todos los experimentos de infección bajo condiciones controladas. Los cultivos se mantuvieron frescos realizando repiques de la colonia del hongo. Pequeños trozos de micelio de la zona de avance del patógeno fueron transferidos a medio APG fresco donde se incubaron por 15 días en iguales condiciones y posteriormente fueron mantenidos a 4ºC. Antes de realizar las inoculaciones a las plantas previamente seleccionadas, se confirmaron las características culturales del aislado F7 mediante estudios de morfología del hongo (medición del tamaño de los conidios, determinación de la forma de los conidios) y se analizaron las características de crecimiento de las colonias. Inoculación Para la inoculación de cada genotipo se utilizaron cultivos frescos del aislado F7 a partir del aislado monospórico de C. fragariae. La suspensión de conidios se realizó en agua destilada estéril raspando el micelio de la superficie de la colonia y filtrando a través de una gasa en una jeringa estéril. Se realizó el recuento de los conidios con cámara de Newbawer y se llevó a una concentración de la suspensión a 1,5 x 10 6 conidios/ml con agua destilada estéril conteniendo Tween 20 al 0,1% v/v (tensioactivo que mejora la adhesión, disminuyendo la tensión superficial) lo que permite un mejor contacto de la suspensión conidial con la superficie de la planta. La metodología de inoculación utilizada fue optimizada por nuestro grupo de trabajo. La pulverización se realizó sobre hojas y pecíolos hasta punto de goteo (Smith y Black, 1990), sin provocar heridas. Las plantas controles fueron pulverizadas con agua destilada estéril y tensioactivo. Luego todas las plantas, pero en cámaras separadas para el caso de los controles, se colocaron en cámaras húmedas (100% HR) en oscuridad a 30-32ºC durante 48 horas para facilitar la germinación del hongo. Posteriormente, fueron 43 transferidas a cámaras de seguimiento con un fotoperíodo de 16 horas de luz, una HR del 70% y a una temperatura de 28-30ºC, donde permanecieron bajo observación durante 50 días para evaluar el desarrollo de los síntomas y el grado de severidad de la enfermedad. Evaluación del grado de severidad de la enfermedad Las plantas fueron evaluadas a los 9, 21, 30, 40 y 50 días posteriores a la inoculación. Los síntomas fueron observados en los pecíolos de las tres hojas más jóvenes, totalmente expandidas. La tasa de severidad de la enfermedad o Índice de Severidad de la Enfermedad (ISE) (DSR del inglés, ― Disease Severity Rating‖) fue establecida en una escala de 1 a 5, basado en la evaluación de los síntomas según la escala de Delp y Milholland, (1980) como a continuación se detallan: Grado 1: pecíolos sanos, no se observan lesiones; Grado 2: lesiones menores a 3 mm y superficiales a lo largo del pecíolo; Grado 3: lesiones de 3 a 10 mm de coloración rojiza; Grado 4: lesiones severas, con estrangulamiento del pecíolo o bien abarcando hasta un 50% de la longitud del mismo; Grado 5: lesión muy severa, que abarca más del 50% del pecíolo y/o planta muerta. En caso de encontrar diferentes grados de lesión en la misma planta, se consideró el valor máximo al momento de la observación. Las plantas con un grado de severidad de la enfermedad mayor a 2 fueron consideradas susceptibles. Figura 11: Índice de Severidad de la Enfermedad (ISE) observados en pecíolos infectados por Colletotrichum spp. Fuente: Delp y Millohand, 1980. Análisis de los datos El diseño experimental fue aleatorizado, con 4 repeticiones independientes para cada genotipo y cada ensayo fue realizado tres veces en forma independiente. Los resultados se analizaron mediante el programa Statistix versión 9 (Analytical Software, 1996). Para el 44 estudio de la medida de posición (media aritmética) utilizada para describir este lote de datos, se usó la Prueba de las Mínimas Diferencias Significativas (LSD del inglés ―L east Significant Differences‖). Para estudiar la dispersión de los datos respecto a la media se realizó el Análisis de la Varianza (ANOVA, Sokal y Rohlf 1995). 45 RESULTADOS En una primera etapa y antes de realizar inoculaciones sobre los genotipos de frutilla en estudio, se analizaron las caracteristicas culturales del hongo para compararlos con los genotipos pertenecientes a las tres especies del cepario de nuestro grupo de trabajo. Características morfológicas del aislado F7 Se midió el tamaño de los conidios, se determinó la forma de los conidios, y se caracterizaron las colonias en cuanto a forma, aspecto, color y velocidad de crecimiento. Se utilizó como referencia los datos publicados por Salazar (2009, tesis Doctoral). A continuación se detallan los resultados obtenidos, los cuales coinciden con los de referencia para la especie Colletotrichum fragariae: Forma del Conidio: cilíndrico. Tamaño del conidio: 11,0 x 4,1 µm (± 2,8 x 0,5 µm). Forma de la colonia: regular. Aspecto de la colonia: algodonosa. Velocidad de crecimiento: 0,7 cm/día en medio de cultivo, con luz blanca continua y 28 ºC de temperatura. Ausencia de fase sexual. Figura 12: micro fotografía de microscopio electrónico de conidios del aislado F7. Nótese la forma cilíndrica con ambos extremos redondeados típicos del aislado F7. Los aislados cultivados en medio APG sirvieron para describir la forma de las colonias y aspecto de las mismas. En general el color del cirrus (masas de conidios) fue gris. 46 Figura 13: Aspecto y color de la colonia en el anverso y reverso de la placa, del aislado F7 de Colletotrichum fragariae. Para realizar las pruebas de patogenicidad de este hongo sobre diferentes genotipos de frutilla, se siguió una metodología de inoculación bajo condiciones controladas optimizada en nuestro laboratorio, que posibilita la valoración fenotípica certera del grado de resistencia/susceptibilidad de las variedades de frutilla. La pulverización con la suspensión de conidios fue efectiva para desencadenar la enfermedad sobre los genotipos susceptibles de frutilla. Las lesiones pudieron visualizarse a partir de las 72 horas posteriores a la inoculación. En ningún caso se observaron síntomas en las plantas utilizadas como controles. Se estimó el grado de resistencia/susceptibilidad de los distintos genotipos estudiados de acuerdo a la sintomatología producida por el aislado F7 siguiendo la escala de DSR. Se observó un amplio rango de variabilidad en la respuesta al patógeno, hubo una distribución continua entre la máxima resistencia (DSR= 1,2) y la máxima susceptibilidad (DSR= 5). Los genotipos Pájaro Mendoza, Chandler y Pájaro Corrientes se comportaron como altamente susceptibles, mientras que los genotipos Pájaro Salta, Camarosa y Selva presentaron altos niveles de resistencia (Cuadro 7). Cuadro 7: valores promedio de DSR obtenidos al desafiar genotipos de frutilla con el aisaldo F7, a 50 días posteriores a la inoculación. Cultivar Camarosa Chandler Milsei Tudla Sweet Charlie Selva Pájaro Corrientes Pájaro Salta Pájaro Mendoza DSR 1,2 5 4,2 3,5 1,4 5 1,2 5 Los valores promedio de DSR obtenidos a los 50 días pos-inoculación demostraron que existe una interacción específica genotipo/patógeno: cada cultivar presentó diferentes 47 grados de resistencia/susceptibilidad frente al aislado F7. En el caso de las accesiones del cultivar Pajaro, se debe resaltar que mientras dos accesiones se comportaron como susceptibles (Pájaro Mendoza y Corrientes), la tercera tuvo una respuesta totalmente opuesta (Pájaro Salta). a) Pajaro Salta b) Pajaro Mendoza 96hs post inoculación c) Pajaro Salta d) Pajaro Mendoza 21 días post inoculación Figura 14: manifestación contrastante de los síntomas de dos accesiones del cultivar Pájaro a) P. Salta, la flecha indica la falta de sintoma y b) P. Mendoza, la flecha indica el sintoma; ambas a 96 horas posteriores a la inoculación con el aislado F7. Y c) P. Salta y d) P. Mendoza, ambas a 21 dias posteriores a la inoculación con el aislado F7. 48 DISCUSIÓN A través de inoculaciones bajo condiciones controladas pudo confirmarse que los diferentes genotipos de frutilla respondieron en forma diferencial cuando se desafiaron con el mismo genotipo patógeno (aislado F7), lo que pone de manifiesto que hay una interaccion específica genotipo del hongo con genotipo de frutilla. La respuesta defensiva diferencial de las tres accesiones del cultivar ‗Pajaro‘ en relación al aislado F7 utilizado, muestra como cada genotipo identificado por métodos moleculares (ver Capitulo l), presenta o puede presentar un fenotipo distinto y por tanto constituyen o pueden constituir tres fuentes de resistencia distinta. La manifestación de una respuesta contrastante en cuanto a resistencia en genotipos que provienen de un mismo cultivar y que por lo tanto tienen un mayor parecido genético relativo (ver figura 7 del Capitulo l), brinda una herramienta para identificar las regiones genéticas que han cambiado respecto del cultivar o variedad original, bajo la hipotesis de que esas zonas genómicas podrian estar involucradas en la interacción con hongos del género Colletotrichum. Esto siempre a la luz de los resultados obtenidos, los cuales indican que al menos uno de los genotipos de Pájaro presenta un comportamiento de resistencia frente a la cepa F7 de Colletotrichum fragariae, lo que conduce a una interacción claramente incompatible. Lo expresado abre la posibilidad de dilucidar los mecanismos implicados en la respuesta de defensa, que tendrían gran interés académico y biotecnológico. CONCLUSIONES Los ensayos de patogenicidad demostraron que los diferentes genotipos de frutilla cultivada analizados, inclusive diferentes accesiones de un mismo cultivar que fue multiplicado de manera independiente en tres lugares del país (Mendoza, Corrientes y Salta), respondieron en forma diferencial al ser desafiados con un mismo aislado patogénico. Como los tres genotipos de Pájaro están emparentados entre sí y manifiestan un comportamiento distinto frente a un mismo aislado patogénico (F7), se puede plantear la hipótesis de que la mayor resistencia de la accesión Pajaro Salta puede deberse a cambios en las zonas genómicas relacionadas con la respuesta a C. fragariae. 49 CAPITULO lll Búsqueda de marcadores moleculares asociados con genes que aumenten la resistencia a C. fragariae en frutilla. INTRODUCCIÓN Los cultivos de frutilla continuamente son afectados por el complejo de hongos que causan la antracnosis. Estos patógenos son capaces de colonizar y provocar daños importantes en el cultivo, por lo que se destinan anualmente grandes cantidades de dinero para su manejo, siendo la aplicación de fungicidas convencionales el método más empleado. No obstante, los agroquímicos favorecen la selección de resistencia en las poblaciones de los distintos patógenos en las áreas de cultivo y causan graves alteraciones en el ambiente y en la calidad de vida de los aplicadores y consumidores. También hay métodos alternativos para el manejo de la antracnosis y otras enfermedades, los cuales están siendo incluidos en protocolos para el manejo integrado de plagas y enfermedades, pero sin duda la mejor forma de manejar ésta y otras enfermedades en cualquier cultivo, es la via genética usando genes que incrementen la resistencia. Como reacción extrema a la agronomía convencional también surgió la agricultura orgánica con una postura estricta hacia la eliminación de los plaguicidas, fungicidas y fertilizantes sintéticos, sin proponer métodos alternativos que puedan mantener una eficiencia productiva que no haga retroceder los rendimientos. Para desarrollar tecnologías alternativas resulta muy importante aumentar el conocimiento científico de la interacción planta-patógeno para poder exaservar, tecnológicamente, los mecanismos de defensa naturales de las plantas. Manejo integrado En la actualidad existe un importante consenso mundial para promover, en general, la agricultura sostenible o sustentable mediante el desarrollo de sistemas productivos integradores de procedimientos agronómicos de bajo impacto ambiental (producción integrada). En este marco, el control eficiente de las enfermedades de un cultivo requiere combinar todas las estrategias de lucha disponibles, lo que se conoce como ― manejo integrado de plagas y enfermedades‖. Esta producción integrada es la obtención económicamente viable de frutas de alta calidad, y en la cual se da prioridad al empleo de los métodos ecológicamente más seguros para el control de enfermedades, minimizando la utilización de agroquímicos de síntesis y sus efectos secundarios negativos. Propone estrategias biológicas o de biocontrol para combatir las enfermedades de los cultivos. 50 Entre las diversas aproximaciones biológicas englobadas en el término biotecnología, se incluye la utilización de variedades con resistencia incrementada (resultantes de mejora genética convencional o asistida por marcadores moleculares), así como el empleo de Agentes de Control Biológico (ACB). Estos ACB pueden actuar directamente sobre el patógeno a través de parasitismo, predación, antibiosis o competición como es el caso de los microorganismos antagonistas. También pueden ejercer una acción indirecta al interactuar con la planta hospedera confiriéndole protección frente a la enfermedad mediante la activación de mecanismos de defensa. Como se dijo, el desarrollo de cultivares mas resistentes es otra opción para prevenir el uso desmedido de agentes químicos y surge como la estrategia más rentable y a largo plazo. En ambos casos para lograr una u otra opción, es muy importante tener una mejor comprensión de los mecanismos de defensa de las plantas contra la infección de un patógeno. Por lo que es necesario avanzar en los conocimientos sobre los mecanismos moleculares que intervienen en las interacciones planta-microorganismo. Interacción planta–patógeno Las plantas están continuamente en contacto con microorganismos patógenos, pero sólo una pequeña proporción de ellos tienen la capacidad de invadir exitosamente la planta causando enfermedad. Esto se debe principalmente a varias razones: i) la especie vegetal involucrada en la interacción no presenta los requerimientos que necesita el patógeno y la planta se considera no-hospedera (resistencia a nivel de especie o ―no n-host resistance‖); ii) existen barreras preformadas, estructuras o componentes tóxicos en diferentes tejidos de la planta que impiden la entrada y el crecimiento del patógeno (Van Etten y col., 1994); iii) mecanismos de defensa activos inducidos por el contacto con el patógeno tras el reconocimiento planta–patógeno. En todos estos casos decimos que la interacción es incompatible (hay resistencia) pero solo en el tercer caso el mecanismo de defensa depende exclusivamente de respuestas inducidas para limitar el ataque del patógeno. La enfermedad (interacción compatible) ocurrirá solo cuando las defensas preformadas de la planta sean inadecuadas, las condiciones ambientales sean favorables para el patógeno y/o si las respuestas activas de defensa no sean efectivas. Entre los mecanismos o barreras generales encontramos las defensas estructurales como cutículas cerosas y gruesas, tricomas, etc., compuestos antimicrobianos preformados y producción de compuestos fenólicos (Dangl y Jones 2001, Nicholson y Hammerschmidt 1992) y/o de enzimas de defensa como las quitinasas y glucanasas (Bowles 1990). 51 En cuanto a los mecanismos de defensa inducibles las plantas tienen un sistema de reconocimiento molecular del patógeno diferenciado en dos niveles (Jones y Dangl, 2006). En el primero, la planta reconoce moléculas comunes de diversas clases de microorganismos, los MAMP (del inglés, ― Microbe-Associated Molecular Patterns”) los cuales son percibidos por receptores PRR (del inglés, ― Pattern Recognition Receptors”). Este tipo de resistencia se ha denominado defensa basal (Chisholm y col., 2006). Los patógenos han desarrollado mecanismos para bloquear este primer nivel de defensa a través de la introducción de factores proteicos denominados efectores. Las plantas a su vez, han desarrollado un segundo nivel de defensa conocido como resistencia razaespecifica, en la cual las proteínas de resistencia (R) permiten el reconocimiento de los efectores del patógeno. Cuando los efectores son reconocidos reciben el nombre de proteínas de avirulencia (Avr) (Jones y Dangl, 2006). Las variedades de plantas que posean la proteína R que reconozca la proteína Avr correspondiente de una raza de un patógeno determinado presentarán este tipo de resistencia (resistencia monogénica o cualitativa). El carácter monogénico de la resistencia raza-específica ha hecho que esta sea la más estudiada, quizás también la más utilizada en el mejoramiento, pero al ser la menos duradera, en la actualidad se busca otros tipos de resistencia. Por otra parte, el ataque localizado de patógenos virulentos y avirulentos capaces de producir lesiones necróticas puede resultar en la inducción de resistencia local (LAR: Localized Acquired Resistance) o sistémica (SAR: Systemic Acquired Resistance) a un ataque subsecuente del patógeno (Hammerschmidt y Becker 1997). La resistencia sistémica adquirida, que es efectiva en sitios distantes del punto de infección, es una respuesta de defensa activa y de amplio espectro asociada a una alta expresión de genes que codifican proteínas de defensa, denominadas proteínas PR (Pathogen-Related) (Alvarez y col. 1998, Hammerschmidt 1999b). En la mayoría de los casos, SAR es igualmente efectiva contra hongos, bacterias, virus o nematodos, es decir es independiente del organismo inductor (Ryals y col. 1996). Se ha demostrado que la resistencia sistémica involucra diferentes vías de transducción de señales. Algunas fitohormonas o reguladores de crecimiento regulan, además de numerosos aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal, la respuesta a diferentes tipos de estrés. La resistencia sistémica inducida por patógenos está mediada por una ruta asociada y dependiente de ácido salicílico (SA), y por una ruta independiente de SA, ligada al ácido jasmónico (JA) y al etileno (Reymond y Farmer 1998; Thomma y col. 1999). Mientras la ruta dependiente de SA permite el desarrollo de la SAR y la expresión de genes que codifican proteínas PR, la ruta ligada al JA y etileno conduce a la expresión 52 de genes que codifican proteínas denominadas defensinas, tioninas o proteínas antimicrobianas (AMP), inhibidores de proteasas y otras proteínas PR no inducidas por SA. Frecuentemente ambas rutas se entrecruzan y pueden inducir compuestos o proteínas de defensa comunes. Dependiendo del patógeno que infecta, los tipos de compuestos de defensa inducidos por la planta pueden variar predominando los inducidos por la vía de SA o por la de JA y etileno. Resistencia mediada por genes R La resistencia a enfermedades en plantas depende a menudo de la capacidad de estas de reconocer al patógeno y de provocar una activación rápida de los mecanismos de defensa de la misma. La existencia de este proceso de reconocimiento específico ha sido revelada por el análisis de interacciones planta-patógeno. La definición genética de esta interacción se explica mediante la hipótesis de Flor obtenida tras su trabajo realizado de la interacción entre el lino cultivado (Linum usitatissimum) y el hongo biotrófico Melampsora lini (Flor, 1947). Flor demostró que la expresión o no de la resistencia de la planta, en un reconocimiento específico planta-patógeno, está gobernada por la presencia de un gen de resistencia dominante (R) en la planta, el producto del cual reconoce al producto de un gen especifico de avirulencia dominante (Avr) del patógeno. Una pérdida o alteración de algunos de los dos genes conducirá a la manifestación de la enfermedad. Este es el denominado sistema gen a gen (Flor, 1971). El modelo fue desarrollado en una interacción planta-hongo, sin embargo, también proporciona la base genética para la mayoría de las resistencias activas en plantas contra patógenos tan diversos como bacterias, hongos, virus, nematodos e insectos (Keen, 1990; Dangl, 1992). Figura 15: Esquema que explica la hipótesis de la interacción gen a gen. Se muestran dos tipos de respuesta: respuesta incompatible (I) o resistencia y respuesta compatible (C) o susceptibilidad, como resultado de la interacción de los productos de un gen Avr y R en el patógeno y en el hospedero, respectivamente. 53 El reconocimiento de la proteína Avr del patógeno por parte de la proteína R desencadena una serie de eventos de transducción de señales que puede muchas veces provocar una respuesta de hipersensibilidad (HR) seguida de muerte celular, lo que impide la dispersión de la infección (Cullis 2004). Un evento que antecede a la HR es un estallido oxidativo mediado por especies reactivas del oxígeno; también ocurre la activación de varias proteínas quinasas, el flujo de iones y la expresión de genes que codifican proteínas con actividad antimicrobiana (Martin y col., 2003). La resistencia específica monogénica contra la mayoría de los patógenos biotróficos sigue este modelo gen-a-gen. Estructura y función de los genes R Desde que en 1993 se identificó el primer gen de resistencia en tomate, el Pto, mediante una aproximación de clonaje posicional (Martin y col., 1993), se han identificado y clonado un gran número de genes R que confieren resistencia frente a distintos patógenos. A pesar del amplio rango taxonómico de hospederos vegetales y patógenos, los genes R pueden agruparse principalmente en cinco clases según la presencia de dominios estructurales conservados en las proteínas que codifican: i) proteínas intracelulares con un sitio de unión a nucleótidos (NBS: ― Nucleotide Binding Site‖) y un dominio de repeticiones ricas en leucinas (LRR: ―Le ucine Rich Repeats‖); ii) proteínas con LRR extracelular, un único dominio transmembrana (TM) y un dominio citoplasmático; iii) serina/treonina quinasas (STK) intracelulares; iv) proteínas LRR con un único TM y un dominio de quinasa intracelular y finalmente, v) la clase RPW8 con un dominio TM aminoterminal y un dominio ―coiled -coil‖ (CC) intracelular. En la Figura 16 se muestra una representación esquemática de las clases más importantes de proteínas R. La clase NBS-LRR incluye a la gran mayoría de los genes R. Son muy abundantes en las especies vegetales y constituyen grupos que incluyen varios genes R diferentes. 54 Figura 16: Diferentes clases de proteínas de resistencia vegetales representadas por las proteínas: BS2 de pimiento (resistencia a Xanthomonas campestris pv vesicatoria); Cf-2, 4, 5 y 9 de tomate (resistencia a Cladosporium fulvum); L6 de lino (resistencia a roya, Melampsora lini); PBS1 de A. thaliana y Pto de tomate (resistencia a Pseudomonas syringae); RPG1 de avena (resistencia a numerosas razas de Puccinia graminis), RPM1 de A. thaliana (resistencia a Pseudomonas syringae pv maculicola); RPW8 de A. thaliana (resistencia a los agentes causales de mildiu Erysiphe orontii, E. cichoracearum y Oidium lycopersisi); RRS1-R de A. thaliana (resistencia a Ralstonia solanacearum); Ve1 y Ve2 de tomate (resistencia a Verticillium dahliae y V.alboatrum); Pi-d2 de arroz (resistencia a Magnaporthe grisea); Xa21 de arroz (resistencia a Xanthomonas oryzae pv oryzae) y la proteína de resistencia basal FLS2 de A. thaliana (receptor de flagelina bacteriana). Dominios y motivos: TIR: homólogo a los receptores Toll e Interleuquina-1, NBS o NBARC: dominio de unión a nucleótidos, LRR: repeticiones ricas en leucina, CC: estructura de coiled coil, NLS: señal de localización nuclear, WRKY: dominio ― dedos de zinc‖ (unión a DNA), ESC: señal de endocitosis, PEST: secuencia tipo Pro-Glu-Ser-Thr, LEC: dominio tipo lectina (unión a carbohidratos). Dominios 1-3: sin homología con otras proteínas. Adaptado de Hammond-Kosack y Parker (2003). Utilización de los genes R La evolución de la interacción gen a gen tiene como consecuencia una diversidad de genes R en diferentes individuos de una especie hospedante y una correspondiente diversidad de genes de avirulencia en diferentes razas de patógenos (Staskawicz y col., 1995). El estudio de la diversidad de genes R, y la organización genómica de los mismos, han despertado el interés de diferentes investigadores, porque abre nuevas perspectivas para el entendimiento de la evolución de los genes R y el desarrollo de estrategias eficaces para el mejoramiento de la resistencia a las enfermedades. 55 Asimismo, los fito-mejoradores han estudiado durante más de un siglo la herencia de la resistencia a enfermedades aplicando técnicas de mejoramiento clásico por introgresion de genes R de individuos de especies silvestres en cultivares elite (Biffen, 1912). Estos métodos utilizan la expresión fenotípica como manifestación de la variabilidad existente, como objetivo y criterio de selección e implica largos períodos de tiempo: el desarrollo de cultivares resistentes puede insumir hasta 15 o 20 años. Pero incluso luego de este proceso laborioso y de largo plazo, los mejoradores han tenido que enfrentar numerosos problemas como la escasa durabilidad y la ligación genética con caracteres indeseables (Rommens y Kishore, 2000). Las estrategias de mejoramiento para encontrar resistencia a las enfermedades fúngicas se han basado en métodos convencionales y existen limitaciones en la celeridad y precisión con que estas características útiles pueden ser identificadas, seleccionadas y utilizadas en los programas de mejoramiento. Con el advenimiento de la biología molecular y la capacidad para identificar, aislar y clonar genes, se estan desarrollando nuevas tecnologías que contribuyan a hacer mas eficiente la mejora genetica. La biotecnología abre muchas posibilidades en este campo, permitiendo que los procesos sean más rápidos y confiables. Genómica funcional Desde principios de los años noventa se han empezado a implementar novedosas tecnologías que posibilitan el análisis de los cambios en la expresión de varios genes a la vez. Antes del uso de estas herramientas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), solo se podía evaluar los cambios de expresión de uno o pocos genes a la vez mediante ensayos de ―N orthern blot‖ hibridando, por complementariedad de nucleótidos, con sondas especificas para cada gen. Lamentablemente la gran cantidad y complejidad de problemas superaba por lejos la capacidad de estas técnicas para resolver las preguntas que surgían. El desarrollo de tecnologías para el estudio de la expresión génica de una manera mas generalizada surgió con la capacidad de amplificar in vitro segmentos de ADN, es decir con la técnica de PCR mencionada con anterioridad. Una aproximación muy utilizada, es la tecnología de microarreglos de ADN (― DNA microarrays”), basada en la impresión de sondas (cientos o miles de ellas) en una placa para que éstas detecten las moléculas de ADN o ARN complementarias y en función de su numero relativo se puede estimar el nivel de expresión de varios genes a la vez. Sin embargo esta técnologia necesita conocimiento previo de parte o la totalidad de la secuencia del genoma del organismo a estudiar y ademas, es muy costosa. Por estas razones se ha transformado en la opción elegida cuando se trata de estudiar cambios en 56 la expresión génica en organismos modelos clásicos (Banerjee y Zhang 2002, Reijans y col., 2003). Para investigar la expresión génica en organismos no modelos cuyos genomas no están secuenciados, se han implementado aproximaciones menos costosas. Las más usadas son: DDRT-PCR (― Differential Display Reverse Transcription- PCR”), SAGE (― Serial Analysis of Gene Expression”) y cDNA-AFLP (cDNA- Amplified Fragment Length Polymorphism). Diversas publicaciones comparan algunas de estas técnicas considerando los distintos factores que afectan a cada uno de los sistemas, tales como reproducibilidad, sensibilidad, cantidad de muestra (ARN) a utilizar, equipamiento necesario y costos. Por combinar robustez con la posibilidad de llevarla a cabo en un laboratorio relativamente modesto, una de las mejores se considera al cDNA-AFLP, técnica basada en la obtención, de fragmentos de restricción de ADN copia de transcriptos, los cuales son posteriormente amplificados por PCR (Bachem y col., 1996, 1998). El SAGE, método que proporciona datos cuantitativos concernientes a la expresión génica, es costoso y muy laborioso cuando se deben comparar muchas muestras en distintas condiciones, aunque no es necesario un conocimiento acabado del genoma del organismo a estudiar (Kuhn, 2001). El cDNA-AFLP es mucho menos costoso y mediante electroforesis en geles de secuenciación de los perfiles de expresión génica generados mediante PCR, también permite un análisis cuantitativo con una lectura densitométrica de las bandas. El DDRT-PCR es un método que tampoco necesita una gran cantidad de información previa, sin embargo tiene importantes limitaciones, tales como problemas de reproducibilidad, dificultad para la detección de mensajeros muy escasos y generación de falsos positivos (Bauer y col., 1994; Bachem y col., 1998). Estas debilidades del DDRTPCR han sido resueltas por el cDNA-AFLP utilizando cebadores específicos y condiciones de alta restrictividad, haciendo asimismo posible la verificación de la identidad de una banda de una manera simple y rápida. Además, el uso de oligonucleótidos oligo-dT para la síntesis del cDNA permite la detección de casi todos los transcriptos en un sistema biológico determinado, utilizando pequeñas cantidades de material de partida (Bachem y col., 1998, Kuhn, 2001). Comparándola con la tecnología de microarreglos, el cDNA-AFLP es una técnica muy útil por ser más reproducible, con las ventajas de tener un menor costo y que no sea necesario tener un genoma previamente secuenciado, a pesar de que tiene la desventaja de generar menos información (Donson y col., 2002, Reijans y col., 2003). 57 Hay otros procedimientos que al momento de llevar a cabo la tarea experimental de esta tesis eran más caros como las genotecas sustractivas o directamente no estaban disponibles o al alcance de nuestro laboratorio, como la secuenciación masiva del transcriptoma. Por las razones expuestas, el cDNA-AFLP representa una buena opción para analizar en forma global los transcriptos que se expresen diferencialmente en genotipos emparentados de Fragaria ananassa y que tienen resistencia/susceptibilidad contrastante frente al aislado F7 de Colletotrichum fragariae. Análisis transcriptomico mediante cDNA-AFLP La técnica está basada en la síntesis de un ADN complementario (cDNA), utilizando una transcriptasa inversa, de cada ARN mensajero (mRNA) que se expresa en un momento dado en un tejido determinado bajo un tratamiento específico. La identificación de los cDNA se obtiene por secuenciación de los mismos. Así, estas secuencias de transcriptos que se expresan (EST) nos permite conocer qué genes pueden estar involucrados en la respuesta a un tratamiento específico y de este modo, identificar genes candidatos para el mejoramiento genético, ya sea por transgénesis o por el uso de marcadores moleculares asociados o ligados a genes de interés. Esta técnica fue desarrollada y utilizada primero por Bachem y col. (1996) para estudiar la expresión diferencial de los genes durante la formación del tubérculo en papa y desde entonces fue usada para investigar la expresión de genes en diferentes sistemas incluyendo humanos (Egert y col., 2006), animales (Fukuda y col., 1999; Vandeput y col., 2005), plantas (Carmona y col., 2004; Durrant y col., 2000; Kemp y col., 2005; Diegoa y col., 2006; Money y col., 1996; Simoes-Araujo y col., 2002; Yang y col., 2003) y microorganismos (Decorosi y col., 2005; Dellagi y col., 2000; Qin y col., 2000). Breyne y col. (2003) han mejorado y adaptado el procedimiento original de Bachem y col. (1996) para realizar un análisis global de la expresión génica cuantitativa de todo un genoma y discutieron sus ventajas sobre los microarreglos. La sensibilidad y especificidad del método les permitió detectar genes débilmente expresados y distinguir entre secuencias homólogas de genes en tabaco. Esta aproximación también fue usada en plantas para estudiar genes involucrados en el control de diversos procesos biológicos que van desde el desarrollo de la planta hasta la respuesta a condiciones ambientales. Pero especialmente ha sido utilizada para la identificación de secuencias inducidas durante un proceso infeccioso. Por ejemplo, en plantas de yuca infectadas con Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) se ha 58 usado esta estrategia para identificar genes expresados diferencialmente (Santaella y col., 2004), tambien fue aplicada para identificar y aislar genes específicamente expresados después de la infección de Peronospora en Arabidopsis (Van der Biezen y col., 2000) y después de la inoculación con Cladosporium en tabaco (Durrant y col., 2000). El método también ha sido usado por Qin y col., (2000) para identificar factores de patogenicidad en el nematodo de la papa Globodera rostochiensis. En el caso de la frutilla esta técnica fue utilizada para estudiar los genes involucrados en el desarrollo del fruto y su maduración (Balogh y col., 2004). Caracterización genómica por AFLP La metodología de cDNA-AFLP aprovecha el potencial de los AFLP (Vos y col., 1995) para hacer marcas y caracterizar genomas, identificando poblaciones de mensajeros que fueron convertidos en cDNA y pueden ser considerados como el genoma (transcriptoma) especifico que se genera ante un estímulo o tratamiento. Los marcadores AFLP “Amplified Fragment Length Polymorphisms” se desarrollaron a mediados de la década de los noventa y se basan en la combinación de dos técnicas usadas para la generación de marcadores moleculares: la digestión con enzimas de restricción y la amplificación por PCR. Los marcadores AFLP son fragmentos de ADN que proceden de la amplificación, usando cebadores de secuencias especificas, de ADN genómico digerido con enzimas de restricción (Vos y col., 1995, Karp y col., 1997, Matthes y col., 1998). Se considera que es una técnica rápida y de costo medio. Consta básicamente de 4 pasos: 1) Digestión o corte del ADN genómico con 2 enzimas de restricción, una de corte frecuente y otra de corte poco frecuente. 2) Ligación de adaptadores de doble cadena, que se unen al extremo final de los fragmentos de ADN generados, con el objetivo de obtener un ADN molde para la amplificación. 3) Pre-amplificación con 2 cebadores complementarios a la secuencia de los adaptadores, que permiten una amplificación consistente sin necesidad de un conocimiento previo de las secuencias del genoma. 4) Amplificación de una parte de estos fragmentos pre-amplificados, utilizando cebadores con nucleótidos selectivos que reducen el número de fragmentos amplificados de manera de poder visualizarlos en una electroforesis sencilla. Los AFLP son marcadores dominantes lo cual significa que no se puede identificar al individuo heterocigota en el caso de estudios de genética poblacional. Estos marcadores AFLP pueden producir perfiles de complejidad variable de acuerdo al tipo de enzimas de restricción y la longitud de los cebadores utilizados en el PCR. Son marcadores que 59 segregan de forma mendeliana y proporcionan un elevado número de polimorfismos reproducibles en relativamente poco tiempo debido a la cantidad de loci detectados por cada combinación de cebadores utilizados (Blanco M. y Valverde R., 2005). Genes de defensa en F. ananassa. En frutilla se conoce poco sobre los mecanismos moleculares involucrados en la regulación de la expresión génica en las plantas resistentes a hongos patógenos. Específicamente en el caso de la enfermedad de la antracnosis de la frutilla, hay algunos estudios a nivel de transcriptoma, proteoma y vías de señalización de la defensa que nos permiten tener algún entendimiento sobre los mecanismos de defensa de F. ananassa frente a esta enfermedad. A continuacion se comentan algunos estudios moleculares en relación a la antracnosis: Guidarelli y col. (2011) obtuvieron perfiles comparativos de transcriptomas de frutos de frutilla después de la infección con C. acutatum donde identificaron 44 transcriptos modulados por C. acutatum, incluyendo los genes que codifican las proteínas necesarias para las respuestas inducidas por patógenos específicos y metabolitos secundarios. Martínez-Zamora y col., (2004) informaron por primera vez análogos a genes de resistencia en frutilla. Identificaron distintos genes de resistencia del tipo NBS-LRR en F. ananassa y en dos especies del mismo género relacionadas con la frutilla cultivada: F. vesca y F. chiloensis. Casado-Díaz y col., (2006) encontraron un gran número de genes de frutilla implicados en la señalización, el control transcripcional y los mecanismos de defensa, así como muchos genes de función desconocida que tienen una expresión alterada en respuesta a la infección por C. acutatum. Informaron qué genes de resistencia del tipo LRR se expresaban diferencialmente en las plantas de frutilla inoculadas con C. acutatum, con distintos perfiles según el cultivar y el tejido vegetal estudiado. Por otro lado, Yanlin y col. (2006) encontraron en plantas de frutillas infectadas con C. fragariae altos niveles de expresión de dos genes de frutilla de β-1, 3 – glucanasa: FaBG2-2 y FaBG2-3. Recientemente se han realizado algunos estudios sobre cambios en la expresión de proteínas en respuesta a este patógeno. Fang y col., (2012) identificaron 49 proteínas expresadas diferencialmente en hojas infectadas con C. fragariae. También vieron que aumentó la expresión de proteínas ya conocidas y otras nuevas sensibles a patógenos cuyos patrones de expresión tienden a correlacionarse con cambios fisiológicos en las 60 hojas. Ellos examinaron los perfiles de transcripción de hojas de frutilla infectadas y no infectadas, y confirmaron la inducción de β-1, 3 - glucanasas y proteínas del tipo de las del choque térmico, de bajo peso molecular en respuesta a la infección por C. fragariae. Se han encontrado diversos genes que codifican para proteínas PR en frutilla, aunque su función exacta en las respuestas de defensa no ha sido demostrada. Genes tipo PR-1 no se han descripto en frutilla, aunque hay un EST para PR-1 publicado en bases de datos de secuencias nucleotídicas (GenBank ID: AB462752). Tres β-1,3-glucanasas, FaBG2-1, FaBG2-2 y FaBG2-3, pertenecientes al grupo PR-2 han sido caracterizadas parcialmente a partir de plantas de frutilla inoculadas con C. acutatum y C. fragariae (Shi y col., 2006). Quitinasas del tipo II, pertenecientes al grupo PR-3 (FaChi2-1, FaChi2-2), fueron identificadas y caracterizadas luego de la inoculación con dichos aislados fúngicos (Khan y Shih, 2004). También se publicó la secuencia genómica de una quitinasa del tipo III perteneciente al grupo PR-8 (Khan y col., 1999). Dos genes que codifican para proteínas tipo osmotina, pertenecientes el grupo PR-5, fueron identificadas en frutilla (Wu y col., 2001; Zhang y Shih, 2007). La expresión de FaOLP1 fue inducida en plantas inoculadas con C. fragariae y C. acutatum (Zhang, 2006), mientras que FaOLP2 parece solo responder a estreses abióticos (Zhang y Shih, 2007). Genes codificantes para proteínas tipo taumatina, pertenecientes también a este grupo, fueron clonados y estudiados por Casado-Díaz y col. (2006). Una proteína con actividad inhibidora de proteasas llamada fitocistatina, ha sido identificada en frutilla (FaCPI-1). Esta proteína pertenece al grupo PR-6 y participaría en la defensa contra insectos y microorganismos patógenos (Martínez y col., 2005). Genes homólogos a proteínas del grupo PR-10 fueron informados en frutilla porque se vieron inducidos en plantas de frutilla desafiadas con patógenos (Guidarelli y col., 2011). Un gen tipo ribonucleasa perteneciente del grupo PR-10 fue identificado y estudiado por Casado-Díaz y col., (2006). También se han clonado genes que codifican para proteínas transportadoras de lípidos (Fxaltp1, FaLTP-1 a -5) pertenecientes al grupo PR-14, que responden a estreses bióticos y abióticos (García-Olmedo y col., 1995; Yubero-Serrano y col., 2003). Mehli y col. (2004) clonaron genes de proteínas inhibidoras de poligalacturonasas en frutilla, que hidrolizan la pectina de la pared celular vegetal, las cuales tendrían un rol fundamental en la defensa contra patógenos fúngicos como Botrytis cinerea. Un factor de transcripción tipo WRKY identificado en frutilla (FaWRKY1) fue inducido luego de la infección con C. acutatum, del tratamiento con elicitores de la defensa y por daño mecánico (Encinas-Villarejo y col., 2009) sugiriendo su participación en los mecanismos de defensa de frutilla. 61 Los recientes progresos realizados en el área de la genómica (secuenciación de genomas enteros, desarrollo de colecciones de ESTs o ― Expressed Sequence Tags”, análisis de transcriptoma) hacen posible la identificación de un amplio ― repertorio‖ de genes con funciones muy diversas en plantas, especialmente en especies vegetales poco estudiadas como es la frutilla. Hace tres años comenzó un proyecto de investigación genómica en frutilla el cual incluye el desarrollo de una colección de ESTs. Como se dijo estos ESTs son fragmentos cortos de ADN generados a partir de la secuenciación de uno o ambos extremos de los clones de una genoteca de cDNA. Representan fragmentos de un gen expresado bajo ciertas condiciones particulares (Rudd, 2003). Las secuencias generadas son depositadas en bases de datos de genes de disposición pública (por ejemplo GenBank) y representan el 90% de las secuencias disponibles en Fragaria. Los datos fueron aportados a partir de la secuenciación del genoma de Fragaria vesca (una especie relacionada a la frutilla cultivada). Se seleccionó a F. vesca (2n = 2x = 14) como una referencia para el género, por tener un genoma pequeño y representar una puerta de entrada a los estudios funcionales de genes dentro de la familia de las Rosáceas. La secuenciación del genoma de F. vesca ssp. vesca accesion Hawaii 4 fue realizada con una cobertura altísima, utilizando tecnología de segunda generación, ensamblado de novo y luego anclado en el mapa de ligamiento genético en siete pseudocromosomas (Shulaev y col., 2011). Por otra parte, Folta y col. (2010) generaron numerosos ESTs a través de la secuenciación masiva (pirosecuenciación) de muchos genes en una variedad de F. ananassa, bajo diversos tratamientos. Los materiales vegetales se agruparon por tipo de tejido y se secuenciaron grupos de cDNA. Se ensamblaron en más de 32.000 ― contigs‖. Los marcadores de pooles de tejido proporcionan un medio para evaluar el patrón de expresión global para cualquier transcripto dado. Dentro de los ESTs que publicaron Folta y col., (2010) encontraron similitudes con genes previamente implicados en la respuesta de defensa tales como genes de resistencia, factores de transcripción de tipo WRKY, quitinasas, peroxidasas y quinasas entre otros (López y col., 2004). Estos análisis demuestran la importancia de la colección de ESTs como medio para identificar genes candidatos implicados en resistencia a enfermedades, así como también en otras características biológicas de interés agronómico o industrial. Por lo expuesto y debido al comportamiento contrastante de dos accesiones del cv. Pájaro en respuesta a inoculaciones con el aislado F7 causante de la enfermedad de la antracnosis, se decidió investigar los genes que se expresan diferencialmente utilizando la aproximación biotecnológica de cDNA-AFLP. 62 MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal Se utilizaron las 2 accesiones de la variedad Pájaro: ‗Salta‘ y ‗Mendoza‘, resistente y susceptible respectivamente, para realizar inoculaciones con el aislado F7 de Colletotrichum fragariae. Las plantas se obtuvieron, propagaron y cultivaron bajo las condiciones descriptas en la sección Materiales y Métodos del capítulo ll. Inoculación con el aislado F7 Para las inoculaciones se siguió el mismo procedimiento descripto en la sección Materiales y Métodos del capítulo ll. Extracción de ARN total Se cosecharon foliolos y peciolos de 4 plantas de cada una de las accesiones tanto inoculadas como controles, a diferentes tiempos post-inoculación, obteniéndose 12 muestras de acuerdo al detalle del Cuadro 8. El material vegetal se congeló inmediatamente con nitrógeno líquido, para luego realizar la extracción del ARN total. Como controles se usaron plantas de ambas accesiones pulverizadas con agua destilada estéril. Cuadro 8: Denominación asignada a las muestras según el tiempo de tratamiento. Momento de muestreo Pájaro Salta Pájaro Salta Pájaro Mza Pájaro Mza Tratamiento Control Tratamiento Control 24hs Post 1 2 3 4 48hs Post 5 6 7 8 96hs Post 9 10 11 12 inoculación inoculación inoculación Todo el material que se utilizó en las extracciones (tubos de polipropileno de 50ml, pipetas de vidrio, etc) fue esterilizado 2 veces en autoclave, a una presión de 1 atmósfera y 121ºC durante 20 minutos. Todas las soluciones fueron preparadas con agua bidestilada y tratadas con DEPC al 0,1%, incubadas a 37ºC toda la noche y al día siguiente fueron autoclavadas para inactivar este producto. El ARN total se extrajo a partir de 2 g de tejido siguiendo el protocolo adaptado de Iandolino y col., (2004) como a continuación se detalla: 63 El buffer de extracción [Tris-HCl 100mM (pH 8), EDTA 25mM (pH 8), CTAB 2% (p/v), NaCl 2,5 M, PVP soluble 2% (p/v) y Spermidina 0,5gr/l] se precalentó a 65º C durante al menos 30 minutos. Antes de usar el buffer de extracción se agregó β-mercaptoetanol a una concentración final del 2% y se mantuvo caliente hasta su uso. Se trituró el tejido vegetal con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino y se transfirió a un tubo de polipropileno de 50ml previamente enfriado. Se agregaron 8 ml de buffer de extracción previamente calentado por cada gramo de tejido y se agitó vigorosamente. Se incubó por 30 minutos a 65ºC, agitando en vortex cada 5 minutos. Se centrifugó la muestra a 5000 x g por 10 minutos a 4ºC en rotor basculante. Se trasfirió el sobrenadante a un tubo estéril de 50 ml, mantenido en hielo. Se centrifugó a 5000 x g durante 10 minutos a 4ºC para remover restos del material vegetal en suspensión. Se colocaron volúmenes iguales al de los sobrenadantes de una solución cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Se mezcló suavemente por inversión durante 1 minuto. Se centrifugó a 5000 x g por 5 min a 4ºC. Se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo estéril de 50ml. Se agregó un volumen igual de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), se mezcló suavemente y se centrifugó a 5000 x g por 5 min a 4ºC. Se transfirió el sobrenadante a otro tubo y se agregó ¼ de volumen de Cloruro de Litio 10M. Se mezcló suavemente y se dejó precipitando toda la noche a 4ºC. Se centrifugó a 5000 x g por 30 min a 4ºC. Se descartó el sobrenadante. Se lavó el precipitado una vez con 1 ml de de etanol 70% y se centrifugó de nuevo a 5000 x g por 5 min a 4ºC. Se descartó el resto de etanol. El precipitado fue inmediatamente resuspendido en 50μl de agua bidestilada tratada con DEPC al 0,1%. Una vez que se resuspendió completamente se tomaron 2 alícuotas para análisis y el resto se guardó a -70ºC hasta su utilización. 64 Una alícuota de 4μl se usó para la cuantificación en espectrofotómetro; y la otra de 2μl se usó para una electroforesis en agarosa. La cuantificación espectrofotométrica se realizó en cubetas de cuarzo, midiendo la absorbancia a 230 nm, 260 nm y 280 nm. Con la alícuota de 4 μl de cada muestra se diluyó hasta un volumen final de 500 μl con agua bidestilada estéril y la concentración se calculó con la siguiente fórmula: ARN [ng/μl] = A260 x Factor de Dilución x FC* *FC es el factor de conversión (ng/μl) = 1 unidad de absorbancia es aproximadamente 40 ng/μl de ARN. (Sambrook y col. 1989). Asimismo, para medir la contaminación con carbohidratos y sales se calculó la relación entre las absorbancias obtenidas a 260 nm y 230 nm, debiendo ser ésta superior a 2. Para medir la contaminación con proteínas se hizo una relación entre las absorbancias a 260 nm y 280 nm, valores superiores a 1,8 se consideraron de apropiada pureza. Para determinar la calidad del ARN total y la integridad de las bandas del ARN ribosomal, se analizaron mediante electroforesis nativa en gel de agarosa al 1,2% con buffer TAE (Tris–acetato 40mM y EDTA 1mM). La electroforesis se realizó a 100V en buffer TAE al 0,5X, colocando 2 μl de cada muestra de ARN adicionada con buffer de carga 1X [Azul de bromofenol 0,25% (p/v), xilencianol 0,25% (p/v) y glicerol en agua 30% (v/v)] en un volumen final de 10 μl. Todas las soluciones y el buffer de carga fueron previamente tratados con DEPC. La visualización del ARN total en el gel se realizó mediante tinción con 0,5 μg/ml de bromuro de etidio y luego se fotografió el gel expuesto a la luz UV (260nm). Para evitar una posible contaminación con ADN, se realizó un tratamiento con DNAsa I (Invitrogen). De cada una de las muestras de ARN total extraídas, se colocaron 100 μg de ARN total en un volumen de 85 μl de agua bidestilada estéril tratada con DEPC al 0,1%, y se agregaron 10μl de buffer 10X ―D NAse I reaction‖ y 5 μl (5 U) de la enzima DNAsa I. Se incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente (25ºC aproximadamente) y luego se inactivó la enzima DNAsa I por adición de 10 μl de EDTA 25 mM e incubación a 65ºC por 10 minutos. Posteriormente se colocó en hielo o se guardó a -20ºC hasta el momento de realizar la purificación de ARNm. Técnica cDNA-AFLP Se utilizó el protocolo de Bachem y col., (1996 y 1998) con modificaciones específicas y de acuerdo a Vos y col. (1995), que produjeron óptimos resultados para las muestras de frutilla. 65 La purificación a gran escala de ARN mensajeros o ARN poliA a partir del ARN total (15mg de ARN total) se realizó con el Kit PolyATtract®mRNA Isolation Systems IV (Promega), siguiendo las indicaciones del fabricante. Este sistema utiliza la tecnología de las partículas magnéticas ―Prom ega MagneSphere‖ que permite una purificación de los ARN mensajeros (ARNm) sin contaminaciones con otros ácidos nucleicos. El sistema utiliza un cebador oligo (dT) biotinilado para hibridar, con mucha eficacia en una solución, con la región 3‘ poli(A), presente en la mayoría de los ARNm eucarióticos maduros. Los híbridos son capturados y lavados con mucha astringencia usando estreptavidina acoplada a partículas paramagnéticas, que permiten la separación magnética de los ARNm. El ARNm, estando aun unido a la estreptavidina acoplada a las partículas paramagnéticas, se lo resuspendió añadiendo 100μl de agua bidestilada estéril tratada con DEPC al 0,1% (libre de ribonucleasas). Síntesis de la primera cadena de cDNA: se siguieron los pasos indicados por Bachem y col. (1996). Se partió de 20 μl de la solución que contenía los ARNm unidos a las estreptavidinas. A esto se le añadió 1μl del cebador oligo (dT)25 (100 ng/μl) y se incubó a 70ºC durante 5 minutos. Transcurrido ese tiempo, se colocó en hielo y se le agregaron 10 μl de una mezcla que contiene: 200 U de enzima transcriptasa reversa ―Su perScript™ II‖ de Invitrogen, 6 μl de buffer 5X cDNA l de Invitrogen, 1 μl de dNTPs 25mM y 2 μl de ditriotreitol (DTT) 100mM. Se incubó a 37ºC durante 1 hora y luego se colocó en hielo para realizar los pasos siguientes. Síntesis de la segunda cadena de cDNA: los 31μl de la reacción anterior se utilizaron para la siguiente reacción. Primero se calentó a 95ºC e inmediatamente sobre hielo se añadió 119μl de la siguiente mezcla: 35 U de DNA Polimerasa I de Invitrogen, 3 U de RNAsa H de Invitrogen, 25 μmoles de nucleótidos, 15μl de buffer 10X cDNAII (Tris-HCl 200 mM; KCl 750 mM; (NH4)2SO4 100 mM; MgCl2 50 mM y DTT 10 mM) y se llevó a 150 μl finales con agua bidestilada estéril. Esta reacción se incubó a 16ºC por 2 horas. El cDNA fue cuantificado en espectrofotómetro tomando 10 μl de cada muestra sin estreptavidinas como se describió anteriormente y la concentración se calculó con la siguiente fórmula: ADN [ng/μl] = A260 x Factor de Dilución x FC* *FC es el factor de conversión (ng/μl) = 1 unidad de absorbancia es aproximadamente 50 ng/ μl de ADN de doble cadena (Sambrook y col. 1989). 66 Amplificación por AFLP (“Amplified Fragment Length Polymorphisms”) Se realizó la técnica de AFLP utilizando cDNA como molde. Se siguió el protocolo de cDNA-AFLP publicado por Bachem y col. (1996 y 1998), con algunas modificaciones y combinado con el protocolo de Vos y col. (1995) previamente optimizado en nuestro laboratorio. También se modificaron las técnicas de revelado descriptas por Bachem y col. (1998) y Vos y col. (1995), utilizándose nitrato de plata para visualizar los productos de amplificación. Digestión: se digirieron 3μg de cDNA, unido a las estreptavidinas acopladas a las partículas paramagnéticas de cada una de las muestras con 2 enzimas de restricción: MseI (diana de restricción: T↓TAA) y EcoRI (diana de restricción: G↓AATTC). El volumen final de la digestión fue de 30 μl y contenía: 2,5 U de MseI, 2,5 U de EcoRI y buffer 1X RL (Tris-HCl 50mM pH 7,5, acetato de magnesio 50 mM, acetato de potasio 250 mM, DTT 25 mM y Albúmina Bovina 250 ng/μl). Se incubó por 2 horas a 37ºC y a continuación se inactivó las enzimas por incubación a 70ºC durante 15 minutos. Ligación de adaptadores específicos: una vez digerido el cDNA se hizo la separación magnética de los extremos que contienen las estreptavidinas acopladas a las partículas paramagnéticas. Se colocó el tubo de reacción en el soporte magnético (― Magnetic Stand‖) que captura con un imán las partículas paramagnéticas y se saca la parte acuosa que contiene los fragmentos de cDNA digeridos. Este paso mejora la calidad de la amplificación final y evita la aparición de residuos de alto peso molecular en la electroforesis (Bachem y col., 1996). Los fragmentos de restricción se ligaron a los adaptadores específicos (Vos y col., 1995) en los sitios creados por las enzimas de restricción. A 15 μl de la digestión se le añadió 15 μl de una solución que contenía: 5 pmol del adaptador EcoRI, 50 pmol del adaptador MseI, 0,6 U de T4 ADN ligasa y buffer 1X ADN ligasa. Se incubó 2 horas a 20ºC y una vez finalizada la ligación se guardó a -20ºC hasta su posterior utilización para la amplificación. Amplificación pre-selectiva: se utilizaron cebadores con un nucleótido selectivo en la posición 3‘ denominados cebadores +1 (Cuadro 9). Cuadro 9: Secuencias de los cebadores MseI (+1) y EcoRI (+1). En negrita se indican los nucleótidos preselectivos: 67 El volumen final de la reacción fue de 20 μl con: 30 ng de cada cebador, 0,2 mM de cada uno de los nucleótidos, 1,5 mM de MgCl2, 0.5 U de Taq polimerasa, 1X de buffer Taq Polimerasa y 5 μl de la reacción de ligación. La amplificación se realizó en un termociclador MJ Research modelo PTC-100 (MJ Research, Inc., Watertown, MA, USA) y el programa utilizado fue el siguiente: 20 ciclos de 30 segundos de desnaturalización a 94ºC, seguido de 1 min de hibridación a 56ºC y finalmente 1 min de extensión a 72ºC. Se preparó una dilución 1/10 del producto de reacción y se guardó a 4ºC para usarla en la siguiente amplificación. Amplificación selectiva: para esta amplificación se utilizaron cebadores con tres nucleótidos selectivos en el extremo 3‘ denominados cebadores +3 (Cuadro 10). Cuadro 10: Secuencias de los cebadores EcoRI (+3) y MseI (+3) utilizados en la reacción de los AFLPs. En negrita se indican los nucleótidos selectivos. Con estos cebadores se organizaron 64 combinaciones posibles EcoRl +3/ Msel +3 designando a cada combinación con números corridos del 1 al 64, como se muestra en el Cuadro 11. 68 Cuadro 11: combinaciones de cebadores utilizadas para la amplificación selectiva. Arriba corresponde a los cebadores de Msel y al costado corresponde a los cebadores de EcoRl. Msel EcoRl AGG ACT AGC ACC AAG ACA AAC ACG CTT CAT CAC CAA CTC CTA CAG CTG 1 9 17 25 33 41 49 57 2 10 18 26 34 42 50 58 3 11 19 27 35 43 51 59 4 12 20 28 36 44 52 60 5 13 21 29 37 45 53 61 6 14 22 30 38 46 54 62 7 15 23 31 39 47 55 63 8 16 24 32 40 48 56 64 Se utilizaron distintas diluciones de la reacción de pre-amplificación como molde para la amplificación: 1/10, 1/20, 1/30, 1/50 y 1/60. La amplificación se llevó a cabo con 2,5 µl de la dilución del producto de pre-amplificación y se le agregó 7,5 µl de una solución que contenía: 1,5 mM de MgCl 2; 0,2 mM de cada uno de los nucleótidos; 30 ng de cada cebador; 0,5 U de Taq polimerasa y 1X de buffer Taq Polimerasa. El programa empleado para la amplificación fue: 1 ciclo de desnaturalización a 94ºC, 30s; hibridación a 65ºC, 30s y extensión a 72ºC, 60s; seguido por 12 ciclos en los que la temperatura de hibridación fue descendiendo desde 65ºC hasta 56ºC (0,7ºC por ciclo), temperatura que se mantuvo en los siguientes 22 ciclos. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en el mismo termociclador ya citado. A fin de comprobar que las muestras estaban libres de contaminación con ADN se amplificó una muestra sin el tratamiento de DNAsa, otra muestra con tratamiento de DNAsa, y ambas muestras sin los pasos de síntesis de primera y segunda hebra, es decir sin retrotranscribir, de manera que una amplificación final en cualquier muestra sería el resultado de la presencia de ADN contaminante. Electroforesis en geles de Poliacrilamida Una vez finalizada la reacción de amplificación, los fragmentos obtenidos fueron separados mediante electroforesis vertical en geles desnaturalizantes de poliacrilamida, igual como se explicó en el Capitulo l. A los productos de la amplificación se les añadió 2,5 µl de buffer de carga y se desnaturalizaron durante 5 min a 95ºC. Inmediatamente se colocaron en hielo y posteriormente se sembraron en el gel. Anexo: Buffer de carga para acrilamida: 95% de formamida desionizada, 10mM de EDTA pH 8, 0,01% de azul de bromofenol y 0,01% de xilencianol. 69 Los geles fueron revelados según el sistema descripto en el ― Silver Staining System‖ (Promega, Biotech, EUA) ya explicado en el Capítulo l. Análisis de los datos Los perfiles de amplificación se analizaron visualmente. Se seleccionaron las bandas presentes únicamente en las muestras codificadas como 1, 5 y 9 que corresponden a la accesión resistente, inoculada con C. fragariae. Para validar los resultados, se repitieron las amplificaciones con las combinaciones de cebadores que produjeron bandas de interés, utilizando duplicados de extracciones independientes de ARN. Una vez confirmada la banda diferencial o TDF (fragmento derivado de transcripto) como lo sugiere Bachem y col. (1996), se lo codificó con números y letras a cada uno. Aislamiento y reamplificación de TDF Las bandas seleccionadas se cortaron directamente del gel utilizando un bisturí estéril, se colocaron en tubos eppendorf con 50 µl de buffer de elución (0,5 M de acetato de amonio y 1mM de EDTA pH 8) y se incubaron a 37ºC durante toda la noche. Al día siguiente se centrifugó a máxima velocidad durante 20 min, se tomó el sobrenadante que se transfirió a un tubo estéril. Se le agregó 5% de su volumen de NaCl 5M y 2,5 volúmenes de etanol absoluto frio. Se incubó a -20ºC durante 2 horas y posteriormente se centrifugó a máxima velocidad durante 20 min a 4ºC. Se descartó el sobrenadante y el precipitado se lavó con etanol 70%, se secó a 37ºC para eliminar restos de alcohol y se resuspendió en 20 µl de agua bidestilada estéril. La reacción de reamplificación se realizó con 2,5 μL del ADN eluído utilizando los cebadores específicos según la combinación correspondiente. Las condiciones de PCR fueron: 30 ciclos de 94°C, 30 s; 56°C, 1 min y 72°C 1 min. Para la purificación de los amplicones se utilizó el sistema comercial ―Ill ustra TM GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification kit‖. El producto obtenido luego fue analizado mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% teñidos con 0,5 ug/ml de bromuro de etidio. Clonado de los TDF Los productos amplificados se clonaron en dos tipos de vectores: i) pGEM-T Easy Vector System de Promega (Madison, WI, EEUU) y ii) TOPO TA-pCR2.1 de Invitrogen (Carlsbad, CA, EEUU) según disponibilidad. Para la ligación del fragmento amplificado por PCR al vector seleccionado se siguieron las instrucciones del fabricante utilizando en cualquier caso 3 μl del producto de PCR purificado. 70 El plásmido pCR2.1 TOPO (Invitrogen) utiliza el método denominado ―T A cloning‖ que permite la ligación directa entre el plásmido, que contiene extremos cohesivos los cuales constan de una Desoxitimidina libre (3´-T), y los productos de la amplificación, a los cuales la Taq polimerasa les ha adicionado una Desoxiadenosina formando también extremos cohesivos (3´-A). La ligación se lleva a cabo por una topoisomerasa que se encuentra unida al vector que liga a este último con los productos de amplificación. Este plásmido confiere resistencia a ampicilina. En el caso del plásmido pGEM-T Easy los vectores son linealizados con una única timidina terminal (3´-T) en ambos extremos. Así quedan formados extremos cohesivos con T sobresaliente en el sitio de inserción, lo que mejora en gran medida la eficiencia de la ligación de los productos de PCR mediante la prevención de la recircularización del vector y proporciona un extremo compatible para los productos de PCR generados por la mayoría de las polimerasas termoestables. Los productos de PCR a su vez resultan con una cola de adenina típica de la actividad transferasa terminal de la Taq polimerasa sin actividad correctora de prueba. El sitio de clonación se encuentra en el marco del gen lacZ, lo que permite la selección de plásmidos portadores del inserto mediante el análisis del color de las colonias: blancas o azules cuando se cultivan en presencia de X-Gal. La selección se realiza por la resistencia al antibiótico ampicilina que confiere este plásmido. Para la transformación se utilizó la cepa de E. coli DH5α, cultivada en medio LB (Luria Bertani: 10 g/l de peptona de carne, 5 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de NaCl) que es el medio utilizado por excelencia para el mantenimiento de E. coli recombinante en procesos de microbiología molecular. Cuando se utilizan medios sólidos se usó como agente solidificante agar-agar en una proporción de 15 g/l. Todos los medios fueron esterilizados en autoclave a 121ºC durante 20 min. Se adicionaron 100 ug/ml del antibiótico ampicilina Sigma Chemicals Co (St. Louis, MO, EEUU). Se utilizó X-Gal a concentraciones finales de 40 μg/ml como agente de selección. El agar-agar y el extracto de levadura fueron de Britania S.A. (Argentina), y el X-Gal, la peptona y las sales provienen de Merck (Darmstadt, Alemania). Transformación de E. coli mediante electroporación. A partir de una placa con cultivo fresco con la cepa de E. coli DH5α, se tomó una colonia aislada y se cultivó en 5 ml de medio LB líquido suplementado con ácido nalidíxico 25 mg/l, con agitación (135 rpm), durante toda la noche a 37°C. Al día siguiente se inocularon 300 ml de medio LB con 3 ml del cultivo activo y se incubaron bajo las mismas condiciones hasta alcanzar una densidad óptica de 0,5 a 600 nm (D.O. 600= 0,5). El cultivo se incubó en hielo durante 30 minutos y después se centrifugó a 6.000 x g durante 15 71 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se agregaron 300 ml de agua bidestilada fría y estéril. Este procedimiento se repitió 1 vez mas y luego se realizó nuevamente pero con un volumen de agua de 150 ml. Finalmente el precipitado se resuspendió en 600μl de glicerol 10% frío y estéril, para posteriormente almacenar las células a -70ºC en alícuotas de 40μl. La transformación se realizó por electroporación, usando el equipo BIO RAD ―M icroPulser Electroporator‖, en cubetas de 0,2 cm (― Gene Pulser ®/Micropulser cubetas de electroporación‖) enfriadas en hielo. Se añadieron entre 0,5 a 4µl de la reacción de ligación a 40µl de las células electrocompetentes (Dower y col., 1988). Se dio un pulso de 2,2kV durante 5 milisegundos (ms). Después de la electroporación las células se transfirieron a 1ml de medio LB líquido y se incubaron a 37ºC durante 1 hora con suave agitación. La selección de recombinantes se realizó sembrando 100 a 200μl del cultivo bacteriano en placas de Petri con medio sólido LB (LB con 1,5% agar) suplementado con el antibiótico de selección (ampicilina 100 μg/ml) y 1 μg del sustrato cromógeno X-Gal para la selección por α complementación (el X-Gal es un sustrato cromogénico para la βgalactosidasa de modo que al ser hidrolizado forma precipitados azules). Las placas fueron incubadas a 37ºC durante 12 horas, seleccionándose las colonias blancas. El X-gal se diluyó en dimetilformamida a una concentración de 50 mg/ml y se mantuvo protegido de la luz debido a su fotosensibilidad. Purificación de plásmidos, y verificación de insertos Dado que existe la posibilidad de obtener distintas secuencias en una misma banda amplificada por PCR, de cada evento de ligación se seleccionaron entre 3 a 5 colonias blancas por banda para su posterior análisis. Las colonias seleccionadas fueron reaisladas en placas de cultivo con ampicilina 100 μg/ml e incubadas durante 24 hs a 37ºC. A partir de estas colonias se iniciaron cultivos en 5 a 10 ml de medio LB adicionados con ampicilina (100 μg/ml) para luego purificar y analizar los plásmidos recombinantes. La extracción del plásmido recombinante se realizo a partir de un cultivo que provenía de una única colonia bacteriana cultivada durante toda la noche a 37ºC con agitación, en 5ml o 10ml de medio LB y con el antibiótico correspondiente. Se utilizó el sistema ―M iniprep Kit‖ de Promega (― Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System‖) o de Invitrogen (― Pure Link TM Quick Plasmid Miniprep Kit‖) según disponibilidad. Los plásmidos recombinantes se eluyeron en 100μl de agua bidestilada estéril y se verificó la integridad y cantidad del ADN mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% y se cuantificaron con espectrofotómetro. 72 La identificación de clones positivos (que tengan los insertos) se llevó a cabo por medio de la técnica de PCR usando los cebadores universales T3 (5´- ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3´) y T7 (5´-TAATACGACTCACTATAGGG-3´) para el caso de los plásmidos de TOPO TA pCR2.1, y los cebadores SP6 (5´- ATTTAGGTGACACTATAGAA-3`) y T7 para los plásmidos de pGEM-T Easy. La reacción se realizó en un volumen final de 20 μl conteniendo 1X buffer de Taq polimerasa; 2 mM MgCl2; 0,5 μM de cada cebador; 0,2 mM de cada dNTP; 1 U de Taq ADN polimerasa (Fermentas) y aproximadamente 50 ng de ADN. Las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización inicial de 2 min a 95ºC, 30 ciclos de 30 s a 95ºC, 30 s a 52ºC y 1 min a 72ºC, seguidos por una extensión final de 5 min a 72ºC. Los productos de PCR fueron separados por electroforesis en geles de agarosa 1,5% en buffer TAE 0,5X, teñidos con bromuro de etidio y visualizados a través de luz UV. Los mismos cebadores usados para la verificación de insertos fueron usados para secuenciar cada plásmido recombinantes en ambas direcciones. Secuenciación Una vez verificada la presencia del inserto, los plásmidos recombinantes fueron enviados a secuenciar en ambas direcciones con los cebadores: T3, T7 y SP6 . La secuenciación de los fragmentos de ADN se realizó en el Servicio Interno de Genotipificación y Secuenciación de ADN (SIGYSA) de INTA Castelar y se llevó a cabo según el protocolo de Sanger y col., (1977) en un secuenciador ABI PRISM 377 (Perkin Elmer). Análisis bioinformático de secuencias obtenidas El análisis de cada secuencia se realizó siguiendo el procedimiento descrito a continuación: i) Identificación y eliminación de la secuencia correspondiente al vector, empleando el programa VecScreen (―N ational Center for Biotechnology Information‖, NCBI). ii) Identificación y eliminación de la secuencia correspondiente a los cebadores. iii) Análisis de las secuencias de los clones de cada TDF para determinar su similitud utilizando el software DNAman versión 5.2.2 (Lynnon Biosoft, Québec, Canadá). iv) Comparación de las secuencias obtenidas con bases de datos del NCBI para identificar homologías a nivel de aminoácidos utilizando el algoritmo Blast X, y a nivel de secuencia nucleotídica con Blast N (Altschul y col, 1990). 73 v) Búsqueda de dominios conservados, en las proteínas de interés de función conocida, utilizando el programa SMART 5 del servidor ―Eu ropean Molecular Biology Laboratory‖, EMBL (Letunic y col., 2006). Análisis de Expresión Para estudiar los niveles de expresión relativa de de los TDFs seleccionados o promisorios, se realizó PCR en tiempo real (―R eal Time PCR‖). Se utilizo un equipo Real Time PCR System 7500 (Applied Biosystems) con iQ SYBR Green Supermix (BIORAD). Los cDNAs molde fueron los mismos que se utilizaron para la técnica de cDNA-AFLP y corresponden al primer tiempo de muestreo (24hs post inoculación). Se utilizaron los siguientes cebadores específicos: GAPDH Fw: 5‘-GCCGAGGAGCTGCTCAGA-3‘ GAPDH Rv: 5‘-GAACTTTTCCAACAGCCTTTGC-3‘ Actina Fw: 5‘CCCAGAAGAGCACCCAGTTC-3‘ Actina Rv: 5‘-CACGATTAGCCTTGGGATTCA-3‘ 11C Fw: 5‘- AGGCGGTGCCGTAAGCT-3‘ 11C Rv: 5‘-CATCCTTCTATCCGCAAGGT-3‘ FaPR1 Fw: 5‘- TGCTAATTCACATTATGGCG -3‘ FaPR1 Rv: 5‘-GTTAGAGTTGTAATTATAGTAGG-3‘ Se realizaron curvas standard con cada par de cebadores para determinar la eficiencia de cada reacción, utilizando diferentes diluciones del cDNA correspondiente a Pájaro Salta tratado (infectado con F7). Las reacciones se llevaron a cabo en 20 µl de volumen final, utilizando 10ul de la master mix (iQ Sybr Green Supermix) y 0,25 µM de cada uno de los cebadores y 50 ng de molde. El programa de amplificación fue el siguiente: 94ºC, 30 segundos; 58ºC, 30 segundos y 72ºC, 30 segundos repetido por 34 ciclos. La temperatura de annealing de 58ºC se uso para todos los cebadores Técnica RLM-RACE. Para obtener en el futuro la secuencia completa del ADN complementario (cDNA) correspondiente a un TDF con homología a un gen de resistencia se realizaron las primeras etapas de la técnica RLM-RACE (del inglés ―R NA Ligase-Mediated Rapid Amplification of cDNA Ends‖) (Frohman y col. 1988). Se realizó una nueva extracción de ARN total de la variedad Pájaro accesión Salta, inoculada con el aislado F7 bajo las condiciones de inoculación anteriormente descriptas (M y M Capitulo ll). La muestra se 74 tomó 24hs post inoculación, momento en el que se encontró el TDF en estudio y este ARN se utilizó como material de partida para realizar una genoteca de RACE. La técnica RACE es un procedimiento usual para la clonación de la secuencia completa de un cDNA a partir de una secuencia parcial del mensajero conocida previamente, utilizando la reacción de PCR. El RACE puede emplearse para la clonación de la región 5‘ y/o 3‘ del cDNA completo. La estrategia consiste en añadir una secuencia molde extra (secuencia específica) a los extremos de los cDNA que se desean clonar, para luego amplificar esos extremos del cDNA empleando dos cebadores: uno específico de la secuencia extra y otro dirigido a una secuencia determinada del cDNA que se desea aislar. Existen protocolos que usan varias secuencias contenidas en los TDF para realizar amplificaciones sucesivas con cebadores internos (cebadores anidados o ―n ested primers‖) y aumentar así la especificidad. En base a la secuencia del TDF seleccionado se diseñaron los siguientes cebadores específicos para RACE: NBARC-3': 5'-AATCCCACTGCCGCGCACATCTTC-3' NBARC-3'NESTED: 5'-GCGGTGCCGTAAGCTGAGGTGTT-3' NBARC-5': 5'-GGAGGCCTTGTGATGGAATTGGGAT-3' NBARC-5'NESTED: 5'-GGGAAGTCCGCCTGAAAGCCGCAT-3' El diseño de estos cebadores específicos (GSP, del ingles ― Gene-Specific Primers‖), que ceban hacia el extremo 5‘ y 3‘ del fragmento del gen de interés, se llevó a cabo mediante el programa DNAMAN versión 5.2.2 (Lynnon Biosoft, Québec, Canadá) siguiendo los siguientes criterios: -Alta temperatura de hibridación (>72ºC) lo que se consiguió mediante la longitud de los cebadores (entre 23 a 25 nucleótidos) y el alto contenido en GC (50-70%). Estas altas temperaturas aumentan la especificidad y permiten el uso de la técnica de ―t ouch down‖ (Don y col. 1991) que implica temperaturas de hibridación decrecientes para asegurar máxima complementaridad de los cebadores. -Bajo contenido de GC hacia el extremo 3‘ (no más de 2 residuos de G o C en las últimas 4 bases) para minimizar extensión de regiones inespecíficas por la ADN polimerasa. -Ausencia de auto-complementariedad dentro del cebador y ausencia de complementariedad con los cebadores GeneRacer usados. En el presente trabajo se utilizó el sistema GeneRacer de Invitrogen, basado en una técnica que emplea la ARN ligasa, siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, 75 la tecnología del sistema GeneRacer se basa en el tratamiento del ARNm de partida con una fosfatasa (CIP) que elimina los grupos fosfato presentes en el extremo 5‘ de los mensajeros que estarían parcialmente degradados, de modo que sólo aquellos con secuencia completa y protegidos por el casquete o estructura ―CAP ‖ puedan continuar con el protocolo de clonado. Después, el ARNm se trata con una pirofosfatasa (TAP) que elimina este ―C AP‖ del ARNm íntegro dejando un grupo fosfato en posición 5‘ al cual se le puede ligar (usando una T4 ARN ligasa) un oligonucleótido de ARN con una secuencia específica que servirá para el proceso de amplificación propio de la técnica RACE. Para la síntesis de la primera hebra de cDNA se usan como molde 4 μg del ARNm así tratado, usando un oligo poli-dT con una secuencia específica en su extremo 5‘ (GeneRacer Oligo dT, 5′- GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)243′), que servirá para generar el 3‘-RACE. La retrotranscripción se realizó con la enzima SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. 76 De esta manera se obtiene una genoteca constituida por las primeras hebras de los cDNA con sitios de hibridación de los cebadores GeneRacer para el extremo 5‘ y 3‘. Posteriormente se continúa con reacciones de amplificación por PCR para cada extremo, como se muestra en el esquema: Esquema de amplificación de los extremos 5‘ y 3‘: Extremo 5‘: Extremo 3‘: Finalmente las bandas amplificadas son clonadas y enviadas a secuenciar. Las secuencias obtenidas deben ser ensambladas de manera que la secuencia de los cebadores coincida tal como estaba posicionado en el fragmento de partida. 77 RESULTADOS Con el fin de identificar genes involucrados en la resistencia a Colletotrichum fragariae en frutilla, se utilizó la técnica del cDNA-AFLP sobre material resistente y susceptible inoculado con el hongo. Las bandas polimórficas, generadas del cDNA como material de inicio, se denominaron TDF (fragmentos derivados de transcriptos) como sugirió Bachem y col (1996). Técnica de cDNA-AFLP En primer lugar se llevó a cabo una optimización de la técnica de cDNA-AFLP. Se ajustaron las condiciones en base a los perfiles amplificados con las siguientes combinaciones de cebadores elegidas al azar: combinación 6, 23, 27, 45, y 50 (Cuadro 11 en Mat y Met). Se eligieron las condiciones que produjeron mayor número de bandas y con menor cantidad de bandas monomórficas (correspondientes a genes expresados constitutivamente). Una vez ajustadas las condiciones de amplificación, se utilizaron las 64 combinaciones de cebadores disponibles en nuestro laboratorio para el análisis y comparación de los perfiles resultantes para cada tiempo de muestreo que estuvo representado por 4 muestras correspondientes a los siguientes individuos: i) resistentes inoculados, ii) resistentes controles, iii) susceptibles inoculados y iv) susceptibles controles. Los 4 tipos de muestras analizadas nos permitieron discriminar los transcriptos provenientes del patógeno. Los fragmentos amplificados presentaron un tamaño estimado comprendido entre 100 y 600 pares de bases aproximadamente y la cantidad de éstos fue relativamente equivalente en la totalidad de las combinaciones de cebadores utilizadas (Figura 17). Las muestras controles de contaminación de ADN no amplificaron en ningún caso. 78 600bp 100bp (A) (B) Figura 17: perfiles de amplificación obtenidos con la técnica de cDNA-AFLP en muestras de frutilla inoculadas con C. fragariae. (A) Combinación Nº2 y (B) Combinación Nº9. Los números de cada calle corresponden a las diferentes muestras de los tratamientos descriptos en M y M de este capítulo (ver Cuadro 8) y (-) es el control negativo. En cada una de las amplificaciones de cada combinación de cebadores se identificaron bandas diferenciales presentes únicamente en las muestras de individuos resistentes inoculados y ausentes en las restantes muestras, considerando un mismo tiempo de muestreo. Se identificaron 67 bandas diferenciales, denominadas TDF, con 20 combinaciones de cebadores. Para validar los resultados, se repitieron las amplificaciones con las 20 combinaciones de cebadores utilizando duplicados de extracciones de ARN. En la mayoría de los casos se confirmaron los resultados obtenidos previamente con excepción en las combinaciones nº 16, 39 y 48, que no produjeron los TDF esperados. Las 7 bandas que no fueron amplificadas en la réplica experimental, se cortaron del gel y se guardaron a -20ºC para posteriores análisis. Así, finalmente quedaron 60 TDFs amplificados con 17 combinaciones como se muestra en el Cuadro 12. 79 Figura 18: perfiles de amplificación obtenidos con la técnica del cDNA-AFLP en muestras de frutilla (con duplicados) inoculadas con C. fragariae. Combinación Nº4. Los números corresponden a las diferentes muestras de los tratamientos descriptos en M y M de este Capítulo (ver Cuadro 8). Cuadro 12: Distribución de los 60 TDF finalmente obtenidos según el momento de muestreo. 80 Los 60 TDFs fueron cuidadosamente cortados del gel de poliacrilamida y posteriormente purificados (Figura 19). Figura 19: geles de poliacrilamida mostrando antes (flecha azul) y después (flecha rosa) de extraer las bandas del gel. A: Combinación Nº24 y B: Combinación Nº46. Los números corresponden a las diferentes muestras de los tratamientos descriptos en M y M de este Capítulo (ver Cuadro 8). El ADN purificado se utilizó como molde para la re-amplificación por PCR con el objetivo de incrementar la cantidad del producto amplificado y facilitar el clonado del fragmento en estudio. Figura 20: gel de agarosa con las re-amplificaciones de algunos TDFs. En cada carril se observa el código con el que se denominaron a cada TDF. M: marcador de peso molecular ‗100 Marker‘ (Fermentas). 81 En algunos casos la re-amplificación fue débil o no se obtuvo una banda nítida y en esos casos no se pudo continuar con el clonado y secuenciación del TDF, por lo que 8 bandas fueron descartadas del análisis subsiguiente (se muestran resaltados en color rosa en el Cuadro 13). Cuadro 13: Denominación de los TDF extraídos del gel, según la combinación de cebadores y resultado de la re-amplificación con el tamaño aproximado en pares de bases. Los TDF resaltados en color rosa no reamplificaron y los resaltados en azul no pudieron clonarse. Nº Combinacion 1 2 4 11 14 17 22 Nombre del TDF Tamaño aprox (pb) 11 A 11 B 11 C 51 A 51 B 51 C 91 A 12 A 54 A 54 B 94 A 94 B 14 511 A 511 B 511 B´ 511 C 511 D 511 E 511 F 114 514A1 514A2 117 517 A 517 A1 517 B 517 C 517 E 917 A 917 B 122B1 122B2 122C 690 590 430 200 150 -- 230 -- 110 100 120 80 80 270 220 220 200 150 130 110 200 200 200 -- 250 200 180 150 120 200 100 150 130 120 Nº Combinacion 24 38 40 42 44 45 46 47 52 53 Nombre del TDF Tamaño aprox (pb) 524 938 A 938 B 938 C 140 A 140 A´ 140 B 142 A 142 B 144 A 144 B 144 C 544 A 544 B 944 545 C1 545 C2 545 D 545 E1 545 E2 146 A 146 B 546 A 546 B 946 147 B 147 B1 152 A 152 B 152 C 553 A 553 B 280 -- 100 200 200 --- 170 150 280 280 160 280 300 150 150 100 80 80 80 160 --- 280 150 150 210 150 200 280 170 180 En una primera instancia se intentó secuenciar directamente los fragmentos reamplificados, pero debido al tamaño reducido de los fragmentos y a la heterogeneidad de secuencias, los resultados obtenidos no se pudieron analizar. Los fragmentos reamplificados fueron entonces clonados con el kit Topo TA (Invitrogen) o pGEM-T Easy (Promega) y utilizados para transformar E. coli. Por cada fragmento clonado se eligieron entre 3 y 5 clones positivos (colonias blancas) para la purificación de ADN plasmidico y 82 posterior secuenciación. Del total de TDFs re-amplificados hubo 4 (resaltados en color azul Cuadro 13) que no pudieron clonarse. Análisis de las secuencias Los resultados de la secuenciación y de las comparaciones con las bases de datos se resumen en los Cuadros 14, 15 y 16. A los TDFs se les asignaron funciones putativas en base a las homologías encontradas en las comparaciones con bases de datos de genes y proteínas realizadas por Blast N y Blast X, respectivamente. Los datos obtenidos que presentaron un valor de E (― E-value‖) menor a 10-5 se encuentran resumidos en los Cuadros 14, 15 y 16. El valor de E refleja el valor esperado que representa el número de diferentes alineamientos con resultados equivalentes que se espera que ocurra en una búsqueda de base de datos por casualidad. Cuanto más bajo sea el valor E, la puntuación y el alineamiento es más significativo y por tanto, más posibilidades tiene de representar una homología real (menos probable es que el alineamiento se deba únicamente al azar). Un valor de E menor a 10-5 se considera un umbral estadísticamente apropiado de elección de homólogos. 83 Cuadro 14: resultado de los análisis bio-informáticos de los TDFs, encontrados 24hs post inoculación, clonados y secuenciados. Se indica la ID del clon, tamaño esperado, análisis de los clones del mismo TDF y homología obtenida. TDF 24hs postinoc 11A Tamaño esperado 690bp Clon Comparación de los clones G10 Secuencias idénticas de 64pb integradas solo por cebadores en tándem. Sin datos Secuencia de 64pb integrada solo por cebadores en tándem. ------------------ ------------------ ------------------ Sin similitud Disease resistance protein RPP1-like protein R8. gb|ACJ64862. Secuencias idénticas de 587pb. Sin similitud Proteínas de la super-familia de las DUF547, de función desconocida. Posiblemente transportadores de electrones. G18 Secuencia de 277pb integrada solo por cebadores en tándem. ----------------- ----------------- G40 G41 G42 G43 G44 Secuencias idénticas de 190pb. Sin similitud Retrotransposon protein, putative, unclassified. gb|ABA91244 Secuencia de 173pb integrada solo por cebadores en tándem. Secuencias idénticas de 307pb integrada solo por cebadores en tándem. ------------------ ------------------- Secuencias idénticas de 134pb. ESTs relacionados a la vernalización. B3 domain-containing transcription factor VRN1 (Vernalization1)-like. Secuencias idénticas de 121pb. ESTs muy variados algunos de plantas por sequia y Sin similitud G14 Secuencias idénticas de 436pb. G16 114 590bp 200bp G17 G59 122B1 150pb 122B2 130pb 122C 120pb Homologia ------------------ G15 11B Especie ------------------- G13 430bp Homologia Blast X ------------------- G11 G12 11C Blast N G60 G61 G62 G63 G64 G65 G66 Especie Arabidopsis thaliana. Oryza sativa Japonica Group 84 TDF 24hs postinoc 144A 144B Tamaño esperado 280pb 280pb Clon 160pb 147B 150pb 210pb A1R Sin similitud A3R A5R B22 B24 C21 C22 C23 B3 B10 B6 B16 B20 146A Homologia patógenos, también de ratón, humano, etc: B15 147B1 Blast N G67 B25 144C Comparación de los clones 160pb X22 152A 150pb A12 A5N A9 A5 152B 200pb B6 Tienen secuencias distintas Sin datos Tienen secuencias distintas Secuencias idénticas de 138pb. Secuencia de 163pb integrada solo por cebadores en tándem. Sin datos Secuencia de 185pb y cebadores en tándem. Secuencia de 274pb integrada solo por cebadores en tándem. Secuencia de 297pb integrada solo por cebadores en tándem. Secuencia de 142pb y cebadores en tándem. Blast X Especie Homologia Identidad con proteínas de bacterias Factores de transcripción (BRCA1 associated protein and ERF034). Sin similitud ------------Sin similitud Factores de transcripción (BRCA1 associated protein and ERF034). Sin similitud Sin similitud ---------------Sin similitud Sin similitud Sin similitud Sin similitud ---------------- ---------------- ---------------C3HC4 type RING zinc finger protein genes EST: Draught stressed -gb|EX676385.1 ---------------Fragaria vesca Especie Ricinus communis y Glycine max Ricinus communis y Glycine max C3HC4 type RING zinc finger proteins. ------------------- ------------------- ------------------- ------------------- EST: Salt stressed Fragaria vesca Sin similitud Secuencias idénticas de 205pb. EST: Salt and heat stressed -gb|EX685240.1 Fragaria vesca Sin similitud Secuencias idénticas de 178pb. Gamma-tubulin complex component 4-like gene. Malus domestica Gamma-tubulin complex component 4-like protein. 85 TDF 24hs postinoc Tamaño esperado Clon Comparación de los clones B8 B16 C25 C28 152C 280pb C30 Sin datos Sin datos Secuencia de 241pb A24 140A 200pb Tienen secuencias distintas A1 A22 142A 170pb A9 150pb B16 B25 Homologia -EST: Gamma-tubulin complex component 4 homolog emb|CAB62542.1| Mdfrs3139E20.g1 ------------------------------------Protease Do-like 9-like gene. ESTs: i)Infestans-challenged potato leaf, compatible reaction gb|BI433912.1 ii)Royal Gala partially senescing leaf gb|CN874900.1 ESTs: i) Royal Gala partially senescing leaf -gb|CN873975.1 ii) Phakopsora pachyrhizi infected soybean leaf tissue 13-15 days post inoculation. -gb|EH219416.1 Glycyl-tRNA synthetase gene. EST: Salt and heat stressed -gb|EX685643.1 Blast X Especie Secuencias idénticas de 142pb. Secuencia de 128pb. Sin datos Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase-like 2-protein ESTs relacionados con estrés abiótico gb|FC065080.1 Sin similitud ------------------- Homologia Especie ------------------------------------i) Solanum tuberosum. Protease Do-like 9-like. ii) Malus x domestica i) Malus x domestica ii) Glycine max Fragaria vesca. Sin similitud A10 142B Blast N Sin similitud Glycyl-tRNA synthetase. Sin similitud Vitis vinifera Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase-like protein Sin similitud ------------------- 86 Cuadro 15: resultado de los análisis bio informáticos de los TDFs, encontrados 48hs post esperado, análisis de los clones del mismo TDF y homología obtenida. TDF Blast N 48hs Tamaño Clon Comparación de los clones postesperado Homologia inoc G4 EST: Salt and heat Secuencias idénticas de G5 51A 200pb stressed. 205pb. -gb|EX687312.1 G6 G7 Secuencias idénticas de EST: Drought, cold and G8 51B 150pb 128pb y cebadores en high light stress. tándem. G9 -gb|GT313452.1 1 Secuencias idénticas de EST: knotted-like 524 280pb 2 236pb y cebadores en homeobox KNOX5 mRNA. tándem. 10 54B 100pb 511A 270pb 511B 220pb 511B´ 220pb 511C 200pb 22 27 3 8 9 2 4 10 12 13 14 511E 130pb Especie Fragaria vesca Homologia Especie Sin similitud Ipomopsis aggregata Sin similitud Fragaria vesca Sin similitud Sin similitud Sin similitud Secuencias idénticas de 261pb. Sin similitud Hypothetical protein P20439 1494 ZP_09235171.1 Pseudoalteromonas sp. Secuencias idénticas de 188pb. Sin similitud NADH dehydrogenase subunit 5 gb|ADZ24966.1 Spirometra erinaceieuropaei Secuencias idénticas de 191pb. Sin similitud Sin similitud Secuencias idénticas de 148pb y cebadores en tándem. Sin similitud Putative aminopeptidase APM1. Secuencias idénticas de 135pb y cebadores en tándem. Sin similitud Sin similitud 14 Secuencia de 191pb integrada solo por cebadores en tándem. ------------- ---------------- 3 Secuencias idénticas de ESTs 13 14 4 150pb Blast X Secuencias idénticas de 118pb. 22 511D inoculación, clonados y secuenciados. Se indica la ID del clon, tamaño 18 i) Sin similitud 87 TDF 48hs postinoc Tamaño esperado Clon Comparación de los clones 6 117pb y cebadores en tándem. 7 4 511F 110pb 545C1 150pb 545C2 100pb 545D 80pb 545E1 80pb 545E2 80pb 5 12 22 6 1 2 4 G68 G69 G70 G23 G24 10 11 12 16 G28 G27 15 G29 26 G30 517A Homologia i) Sugarcane red rot infected mature stem -gb|EC324540.1 ii) Pathogen-infected compatible 1 (PIC1) -gb|BM322632.1 Blast X Especie Homologia Especie Sorghum bicolor Saccharum hybrid cultivar Co 1148 ii) Sorghum bicolor Secuencias idénticas de 99pb. Sin similitud Hypothetical protein SORBIDRAFT_06g002025 -gb|EES10450.1 Secuencias idénticas de 133pb. Sin similitud Sin similitud Sin similitud Sin similitud -----------------ESTs 'Yellow Wonder' obtenidos de yemas florales -gb|DV438457.1 ------------------ Secuencias idénticas de 87pb. Sin datos Secuencias idénticas de 70pb. Fragaria vesca Sin similitud Secuencias idénticas de 61pb. Sin similitud Sin similitud Secuencias idénticas de 61pb. Sin similitud Sin similitud Secuencias idénticas de 255pb. EST: Cold-stressed - gb|DY670790.1 Fragaria vesca i) Fragaria vesca Secuencia distinta de 110pb ESTs: i) Salt and heat stressed -gb|EX683333.1 ii) Drought stressed -gb|EX675373.1 iii) Cold-stressed 250pb 27 Blast N ii) Fragaria vesca Interferon-related developmental regulator 1like GENE ID: 100266897LOC100266897 Vitis vinifera Putative quinoneoxidoreductase homolog, chloroplastic-like. GENE ID: 100263927 LOC100263927 Vitis vinifera 88 TDF 48hs postinoc Tamaño esperado Clon G49 517A1 200pb G50 G51 G31 517B 180pb G32 34 G52 517C 150pb G53 G54 Comparación de los clones Secuencias idénticas de 203pb integrada solo por cebadores en tándem. Secuencia de 31pb y cebadores en tándem. Secuencia de 121pb integrada solo por cebadores en tándem. Secuencias idénticas de 160pb y cebadores en tándem. Blast N Homologia Especie - gb|DY668868.1 iv) Gene putative quinoneoxidoreductase homolog, chloroplastic-like XM_003634792 iii) Fragaria vesca EST: KHO15 KHO-Wheatseptoria tritici. -gb|JK818514.2 Sin similitud Secuencias idénticas de 138pb integrada solo por cebadores en tándem. ------------------ ------------- Secuencia de 161pb y cebadores en tándem. Sin similitud Sin datos ----------------------- Retrotransposon protein, putative, Ty1-copia subclass ---------------- Secuencias idénticas de 115pb y cebadores en tándem. Sin similitud Sin similitud Sin similitud 200pb G55 Secuencia de 62pb y cebadores en tándem. Sin similitud G56 Secuencia de 68pb y cebadores en tándem. EST: Strawberry Flowers; early buds to senescent -gb|GO578060.1 Secuencias idénticas de 232pb integrada solo por cebadores en tándem. ------------------- G58 Sin similitud Sin similitud 514A1 G57 Triticum aestivum ------------------ 120pb Especie --------------- --------------- 517E 200pb Homologia iv)Vitis vinifera --------------- G46 G45 G47 G48 514A2 Blast X Fragaria x ananassa Sin similitud ----------------- 89 TDF 48hs postinoc Tamaño esperado Clon Comparación de los clones 544A 280pb A13R A14R A20R Secuencias idénticas de 255pb. B14 Secuencia distinta de 198pb 544B 300pb B44 Sin similitud Secuencias idénticas de 293pb. S-adenosylmethioninedependent methyltransferase genes. EST: Cold-stressed seedlings -gb|DY675141.1 Fragaria vesca S-adenosylmethioninedependent methyltransferase Secuencias idénticas de 270pb. EST: i) Heat stressed -gb|EX671327.1 ii) Cold-stressed -gb|DY675688.1 iii) Heat stressed -gb|EX672445.1 Fragaria vesca Glycine rich protein. -gb|AFH57278.1 Secuencias idénticas de 165pb. 60S ribosomal protein L11. 60S ribosomal protein L11. Sin datos --------------------- ---------------- B66 553A 170 553B 180 A14 A15 B1 B5 Homologia Fragaria x ananassa B15‘ 280 EST: Salt and heat stressed -gb|EX685663.1 EST: Strawberry 24h after treatment with salicylic acid FA_SEa0016A12r Especie Sin similitud B20 546B Homologia Blast X Fragaria vesca B15 B16 Blast N Especie Gossypium hirsutum 90 Cuadro 16: resultado de los análisis bio informáticos de los TDFs, encontrados 96hs post inoculación, clonados y secuenciados. Se indica la ID del clon, tamaño esperado, análisis de los clones del mismo TDF y homología obtenida. TDF Blast N Blast X 96hs Tamaño Clon Comparación de los clones postesperado Homologia Especie Homologia Especie inoc G1 91A 230pb G2 G3 G33 917A 200pb Secuencia distinta de 196pb Sin similitud Secuencias idénticas formadas por 2 regiones: sec 1 de 43pb y sec 2 de 46pb. Y cebadores en tándem. sec 1 EST: Drought stressed. -gb|EX678773.1 sec 2 Sin similitud. Secuencia de 76pb y cebadores en tándem. Sin similitud 100pb 150pb 946 150pb Sin similitud Sin similitud -Calcium-dependent phospholipid-binding copine-like protein NP_568944.1 -Copine-like protein gb|AAM62570.1 -Calcium-dependent phospholipid-binding copine-like gb|AED97535.1 ---------------------Calcium-dependent phospholipid-binding copine-like protein -NP_568944 Copine-like protein -gb|AAM62570 Calcium-dependent phospholipid-binding copine-like -gb|AED97535 20 Secuencia distinta de 196pb G34 Sin datos ------------------- Secuencias idénticas de 106pb. Sin similitud Secuencias idénticas de 154pb. Sin similitud Sin similitud Secuencias idénticas de 151pb. Sin similitud Sin similitud 21 G36 944 Fragaria vesca Gene protein BON 3·(BONZAI 3)like (GENE ID: 100250185 LOC100250185) XM_003633302.1 G35 917B Sin similitud M3 M4 M8 G1 G3 Vitis vinifera Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana 91 TDF 96hs postinoc Tamaño esperado Clon Comparación de los clones Blast N Homologia Blast X Especie Homologia Especie G4 C5 938C 200pb C21 938B 100pb B24 B55 Secuencias idénticas de 44pb integrada solo por cebadores en tándem. ---------------------- Secuencias idénticas de 73pb. EST: Salt and heat stressed. -gb|EX687423.1 ------------------ Fragaria vesca Sin similitud 92 Como se observa en el Cuadro 14 uno de los TDF, el denominado 11C, presentó homología con una proteína de resistencia del tipo R de Arabidopsis thaliana. Esta información sugiere que el fragmento 11C correspondería a un gen que codifica para una proteína implicada en la respuesta de defensa. De hecho, al analizar la secuencia de aminoácidos deducida de este fragmento con el programa SMART se identificaron 4 sitios que responden a repeticiones LRR (Leucine Rich Repeats) en los residuos 12, 33, 76 y 100. Las proteínas que pertenecen a la clase NBS-LRR se dividen en dos subclases: i) TIR (― Toll Interleukin‖) y ii) CC (― coiled coil‖). No se pudo determinar a qué subclase pertenece el TDF11C ya que la secuencia obtenida no abarcó esas regiones del gen. Por otro lado, no se encontró similitud a nivel de ADN con secuencias de las bases de datos, probablemente debido a que la región secuenciada corresponde a la zona LRR, que es muy poco conservada y no permite alcanzar un valor de E significativo. Con el fin de analizar la presencia de la secuencia genómica del TDF y evaluar su expresión en los genotipos resistente y susceptible, se diseñaron 2 pares de cebadores específicos a partir de distintas regiones del fragmento. 1º par de cebadores: FNL-1F: 5‘ CTGCGAAAGCACCAGTCTAA 3‘ FNL-1R: 5‘ TTATTATGGGCTCTCTCTCCG 3‘ 2º par de cebadores: FNL-2F: 5‘GTGATGGAATTGGGATGGAC 3‘ FNL-2R: 5‘CATCGACGCGACGTTATATG 3‘ Figura 21: Secuencia del TDF 11C y ubicación de los cebadores sobre la secuencia de dicho gen. 93 Con estos cebadores se realizó una amplificación por PCR usando como molde tanto ADN genómico como cDNA de los genotipos resistente y susceptible. En ambos casos se amplificó un fragmento de unos 313 pb con los cebadores FNL-1 (Figura 22) y 177 pb con los cebadores FNL-2 (no mostrado). Esto demuestra que el gen correspondiente al TDF 11C estaría en ambos genotipos, que no habría intrones entre estos cebadores y que la diferencia, si la hubiera, debería buscarse en el nivel de expresión entre ambos genotipos de frutilla. P. Salta M ADN cDNA P. Mza. ADN cDNA Figura 22: Presencia del gen correspondiente al TDF 11C en ADN genómico y cDNA de los genotipos Pájaro Salta y Pájaro Mendoza, verificada mediante amplificación por PCR con los cebadores FNL-1. M: marcador de peso molecular 100 pb (Genbiotech). Con el objeto de comparar los niveles de expresión del TDF 11C en el genotipo resistente y susceptible, se utilizó la técnica de PCR en tiempo real. Se cuantificó, además, la expresión del gen FaPR1, marcador de la ruta del ácido salicílico (Kawano y col., 2004; An y Mou, 2011) y por lo tanto de Resistencia Sistémica Adquirida (SAR). Para normalizar los niveles de ARNm, se refirieron a los niveles de expresión de dos genes constitutivos ("housekeeping") de la GAPDH (GenBank acc.: AB363963) y de la Actina (GenBank acc.: AB116565). Los resultados obtenidos se observan en la Figura 23: la expresión basal, sin infección, del gen correspondiente al TDF 11C fue menor en Pájaro Salta (resistente) que en Pájaro Mendoza (susceptible), Figura 23 A. Sin embargo, se observó que la inoculación con el hongo provocó una represión significativa de la expresion relativa del gen TDF 11C en el genotipo susceptible (Pájaro Mendoza) mientras que en Pájaro Salta no provocó cambios significativos. Por otro lado, la inoculación con el hongo provocó la sobre-expresión del gen FaPR1 en la accesión resistente y la represión en la accesión Pajaro Mendoza susceptible (Figura 23 C y B). 94 Figura 23: expresión relativa de los genes 11C y FaPR1. A: expresión constitutiva del gen correspondiente al TDF 11C en los genotipos susceptible (Pájaro Mendoza) y resistente (Pájaro Salta) al patógeno Colletotrichum fragariae F7. B: expresión relativa de los genes 11C y FaPR1 en condiciones sin infección (control) y con infección con F7 en la accesión Pájaro Medoza. C: expresión relativa de los genes 11C y FaPR1 en condiciones sin infección (control) y con infección con F7 en la accesión Pájaro Salta. Los valores de expresión fueron normalizados en relación con la del gen de referencia GAPDH. Los valores de expresión normalizados en relación a la del gen de la Actina tuvieron niveles similares (no mostrados). Estos resultados demuestran expresión diferencial entre los genotipos resistente y susceptible, lo que nos llevó a iniciar la caracterización de la secuencia completa del transcripto (cDNA) y estudiar la secuencia de este gen en ambos genotipos de frutilla. Por estos motivos, se realizó una genoteca de cDNA de la accesión resistente 24 hs post inoculación y se la conserva a -70ºc para su posterior análisis con la técnica RLM-RACE (― RNA Ligase-Mediated Rapid Amplification of cDNA Ends‖) de manera que en un futuro se pueda conocer la secuencia completa del transcripto correspondiente al TDF 11C. 95 DISCUSIÓN Con el objetivo de profundizar el conocimiento de la interacción entre dos genotipos de frutilla, altamente emparentados, con respuesta diferencial frente a un aislado (genotipo) de uno de los hongos causantes de la antracnosis, se usó la técnica de cDNA-AFLP para identificar y clonar genes que se expresaron diferencialmente en esa interaccion plantapatógeno. Con este propósito se analizaron cuatro muestras de hojas provenientes de dos genotipos: i) resistente sin inocular, ii) resistente inoculado, iii) susceptible sin inocular y iv) susceptible inoculado. Esto permitió identificar transcriptos expresados sólo en la muestra de los individuos resistente inoculados y evitar falsos positivos derivados de los transcriptos del patógeno. Se identificaron 60 seceuncias de genes que se expresaron específicamente en el genotipo resistente inoculado con el hongo. Estos resultados demostraron que la aproximación utilizada permitió capturar genes de interés en un cultivo altamente poliploide y del que su genoma aún no esta secuenciado. Los primeros transcriptos interesantes de analizar fueron dos TDFs (917A y 917B) que presentaron homología con proteínas similares a copina. Esta familia de proteínas, recientemente identificada, posee dominios de unión a fosfolípidos, dependientes de calcio, evolutivamente conservada, presente en una amplia gama de organismos como protozoos, plantas, nematodos, y mamíferos. Sin embargo, su función biológica y bioquímica no se esclareció aún. El TDF 917A presentó similitud con el gen BON3 (BONZAI 3) de Arabidopsis, que codifica una proteína copina. El gen BON3 tiene dos homólogos en Arabidopsis: BON1 y BON2 (Yang y col. 2006b). Los trabajos de Li y col., (2009) demostraron que los genes BON1 y BON3 en Arabidopsis actúan como reguladores negativos de varios genes R que intervienen en las respuestas de defensa y muerte celular. Otros dos TDF (144A y 144B) mostraron identidad con factores de transcripción como BRCA1 de Ricinus communis y ERF 034 de Glycine max; que se caracterizan por poseer un dominio dedos de zinc (― zinc finger‖) de unión a ADN para regular la transcripción génica. La proteína BRCA1, forma parte del sistema de detección y reparación de los daños del ADN. El dominio dedos de zinc RING es un tipo de dedo de zinc que contiene un motivo caracterizado por la secuencia de aminoácidos Cys3HisCys4 (C3HC4) capaz de unir cationes de zinc. Este dominio proteico es un dominio rico en cisteína que contiene entre 40 y 60 aminoácidos y coordina dos iones de zinc (Haas y col. 2002; Sasaki y col. 2002; Alexandrov y col. 2006). El acrónimo "RING" proviene de sus siglas en inglés "Really Interesting New Gene" y fue definido como un nuevo dominio por Freemont y col. (1991). Estos dominios han sido encontrados en proteínas implicadas en diversas 96 vías de transducción de señales y vías reguladoras de respuestas (Saurin y col. 1996; Joazeiro y col. 1999; Freemont 2000; Vij y Tyagi 2006). En plantas, se identificaron y caracterizaron diversas proteínas del tipo RING, entre las que podemos destacar: CaKR1, en Capsicum annuum involucradas en las respuestas al frío y la salinidad (Seong y col. 2007) y XERICO en Arabidopsis thaliana que confiere tolerancia a sequía (Ko y col. 2006) y otras que están involucradas en el desarrollo de semillas, fotorespiración, etc. El TDF 147B1 arrojó homología con genes y proteínas del tipo C3HC4 dedos zinc RING. Las estructuras de dedos de zinc RING unen simultáneamente enzimas de ubiquitinación y sus correspondientes sustratos, actuando así como ubiquitin-ligasas. La ubiquitinación marca la proteína sustrato para su degradación. Se ha descrito que proteínas que contienen dedos de zinc están involucradas en transcripción, traducción, tráfico de ARN mensajeros, organización del citoesqueleto, en el desarrollo epitelial, la adhesión celular, en el plegamiento de proteínas, en el reordenamiento de la cromatina y con bio-sensores de zinc (García, 2006; Laity y col., 2001). Un grupo de 14 TDFs mostró similitud con distintos ESTs de Fragaria vesca. Esta especie constituye el pariente más cercano con genoma diploide, pequeño y que ha sido secuenciado, representando una puerta de entrada a los estudios funcionales de genes dentro de las Rosáceas (Shulaev y col., 2011). La mayoría de los EST anotados se expresaron en situaciones de estrés biótico y/o abiótico. Dos TDFs mostraron homología con ESTs obtenidos de Fragaria ananassa, el TDF 544B con un EST inducido en respuesta al tratamiento con el ácido salicílico y el TDF 514A2 con un EST relacionado con la senescencia o muerte temprana de yemas florales. El TDF 524 tuvo homología con genes Knotted y homeobox (Knox), estos conforman una familia de genes de plantas que se dividen en: i) Clase I, Knox que se expresan en meristemas de brotes, y en algunos casos (con notables excepciones) en primordios laterales y ii) Clase II, tienen patrones de expresión más diversos. La pérdida y ganancia de mutaciones funcionales en su secuencia demostraron que los genes Knox son importantes reguladores de la función meristemática. Todavía no se les designó una función relacionada con la respuesta defensiva en plantas. El TDF 122B2 mostró homología con genes relacionados a la vernalización, como el gen Vernalization1 (VRN1) de cereales de clima templado, que se activa transcripcionalmente por frío prolongado durante el invierno (vernalización) para promover la floración. Al igual que para otros TDF, aún se desconoce que rol cumpliría en la respuesta defensiva contra patógenos. 97 En esta Tesis se identificaron además, un grupo de transcriptos que no mostraron similitud con secuencias publicadas y que posiblemente estarían involucrados en la respuesta de defensa a C. fragariae. La información obtenida en este trabajo se suma a la de varios estudios que se han realizado para aumentar la cobertura del transcriptoma en Fragaria spp, que incluyeron la evaluación de transcriptos relacionados al estrés en plántulas de F. vesca en desarrollo (Shulaev y col., 2011) y la pirosecuenciación con diversos tratamientos de distintos tejidos de F. ananassa (Folta y col., 2010). Los mensajeros identificados en este trabajo podrían contribuir al conocimiento del transcriptoma de Fragaria spp y favorecer el desarrollo de herramientas genómicas útiles en escenarios del mejoramiento de esta especie, ya que permitirán identificar marcadores funcionales para selección asistida por marcadores. Por otra parte, aportan datos al banco de ESTs de frutilla, que pueden ser útiles para la transcriptómica comparativa entre frutillas cultivadas, sus ancestros diploides, y la familia Rosaceae en general. Finalmente, otro de los fragmentos identificados y que fue elegido para profundizar su caracterización, fue el TDF 11C, debido a que su secuencia traducida mostró homología con proteínas putativas de resistencia de la clase NBS-LRR, del tipo R y podría jugar un rol importante en la respuesta de defensa. Se estudio la presencia de su secuencia en el genoma y sus niveles de expresión en los genotipos resistente y susceptible. Se detectó la presencia del gen en ambos genotipos y se observó una expresión relativa basal o constitutiva diferencial entre el genotipo susceptible y el genotipo resistente (Figura 23 A). En cuanto a la expresión después de la inoculación con el hongo, en el genotipo susceptible se observó una disminución significativa de la expresión (represión). Por el contrario, en el genotipo resistente no hubo cambios significativos en los niveles de expresión del transcripto 11C (Figura 23 C). Estos resultados ratifican la naturaleza diferencial del transcripto 11C detectado inicialmente por cDNA-AFLP como banda presente en el genotipo resistente y ausente en el susceptible después de la inoculación con el hongo F7. Estos resultados apoyan la hipótesis de que el TDF 11C correspondería a un gen de resistencia ―R ‖. Está ampliamente reportado en la bibliografía que los genes de resistencia tipo ―R‖ poseen expresión constitutiva muy baja debido a que codifican para proteínas de gran tamaño lo que implica importantes gastos metabólicos para la planta, de manera que mantiene una mínima expresión del gen, pero suficiente para defenderse del ataque del hongo (Meyer y col. 2009). La represión de la expresión de TDF11C en el genotipo susceptible inducida por la infección con el aislado F7 de C. fragariae podría atribuirse a algún efector fúngico que bloquee, secuencia arriba ("upstream"), la cadena de transducción de señales que regula la expresión del gen de resistencia y como consecuencia de este bloqueo la planta desarrolló una interacción compatible. Por su 98 parte, el genotipo resistente no mostró tal represión en la expresión de TDF 11C, lo que mantendría la funcionalidad del gen para evitar la enfermedad y desencadenar una respuesta de tipo incompatible. Estos resultados nos llevan a pensar en el TDF 11C como gen candidato de la resistencia a este aislado fúngico. Información respecto de las diferencias en la secuencia nucleotídica del gen y/o sus regiones promotoras entre los genotipos resistente y susceptible permitirá valorar la región responsable de la expresión diferencial y en consecuencia de la regulación de la expresión. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de que otras regiones en trans puedan ser las responsables de la expresión diferencial y por lo tanto de la resistencia a F7. Se destaca la importancia de estos resultados, los cuales pueden contribuir a esclarecer los mecanismos de defensa de F. ananassa frente a C. fragariae y quizás también a implementar biotecnologías para el manejo de la enfermedad de la antracnosis. Un hecho interesante es que las accesiones en estudio corresponden al mismo cultivar y por lo tanto se considera que las diferencias a nivel de secuencia serían muy bajas. Sin embargo, no podemos obviar que fueron sujetas a multiplicación in-vitro durante muchos años siguiendo los protocolos recomendados por Boxus (1974), sin evaluar la estabilidad genética. Probablemente el uso de medios de cultivos con altos contenidos de hormonas del tipo citoquininas, auxinas y giberelinas, junto a un extenso número de multiplicaciones, provocaron la proliferación de brotes adventicios (derivados de callos). Las células en esta situación se ven sometidas a un gran estrés que desencadena la aparición de mutaciones conocidas con el nombre de variaciones somaclonales que pueden ser las responsables del fenotipo alterado que se ha observado en estas plantas. Años después se ajustaron procedimientos para multiplicar la frutilla a través de yemas axilares (Boxus 1987, Boxus 1992, López Aranda y col. 1994) que poseen un origen multicelular sin pasar por la etapa de callo, por lo que poseen mayor estabilidad genética. En nuestro caso, podriamos especular que como consecuencia de variaciones somaclonales se projujeron cambios beneficiosos en este cultivar, que derivaron en un genotipo con alto interés agronómico (Pajaro accesión Salta) resistente al aislado F7 de C. fragariae. Estos resultados apoyan la hipótesis de que las mutaciones espontaneas afectaron la susceptibilidad de la planta de frutilla frente a C. fragariae a través de modificaciones de una característica íntimamente ligada al locus del transcripto 11C o en la cadena de transducción de señales en la que interviene este factor. 99 CONCLUSIONES Se utilizó con éxito la técnica de cDNA-AFLP para identificar y aislar transcritos que se expresan diferencialmente en genotipos de frutilla con distintos niveles de resistencia a C. fragariae. Con las secuencias obtenidas, el análisis bioinformático de homologías en banco de genes arrojó los siguientes resultados: (i) un grupo de TDF mostraron homología con genes de plantas, fundamentalmente de Fragaria vesca, que se expresan frente a estrés biótico y abiótico. (ii) Tres genes mostraron similitud con factores de transcripción, mientras que otro presentó similitud con un mensajero de Fragaria ananassa inducido por ácido salicílico. (iii) Una pequeña fracción presentó homología con genes de otros eucariotas a los cuales se le asignaron funciones diversas o no tienen función putativa conocida. La expresión de uno de los transcriptos (TDF 11C), que por su homología con genes de resistencia tipo R fue elegido para profundizar su caracterización, es reprimida por el patógeno en el genotipo de frutilla susceptible, lo que implicaría que el gen que lo codifica tiene un rol en la defensa de la frutilla. 100 CAPITULO lV Construcción de una población segregante para el carácter resistencia/ susceptibilidad al aislado F7 de C. fragariae. INTRODUCCIÓN Una de las formas de buscar genes útiles para el mejoramiento, es el análisis de expresión visto en el capitulo anterior. Otra posibilidad es a través del mapeo genómico y es lo que nos propusimos hacer en este capítulo. La incidencia de la enfermedad de la antracnosis sobre la frutilla se puede disminuir con un adecuado manejo del cultivo, utilizando prácticas culturales en conjunto con los tratamientos químicos (Freeman y col., 1997). Pero el uso desmedido de agroquímicos tiene un alto impacto en el ecosistema, en la salud del trabajador rural, contamina las aguas y genera residuos tóxicos en los alimentos. Además, promueve la aparición de cepas de hongos resistentes a los fungicidas y produce la eliminación de los enemigos naturales de las plagas de insectos y microbios. El exceso de residuos de fungicidas en la fruta puede causar serios inconvenientes a la hora de comercializarla porque no cumple con los estándares de calidad exigidos por los mercados importadores. Por lo tanto, el desarrollo de cultivares resistentes o tolerantes es la medida más efectiva para el control de esta enfermedad. La obtención de resistencia se logra mediante la combinación del mejoramiento genético clásico y selección asistida por marcadores moleculares (MAS), esto implica la identificación y mapeo de genes de resistencia y loci de caracteres de interés. En la mayoría de los programas de mejoramiento, las especies silvestres son usadas para transferir caracteres específicos deseables a las especies cultivadas y para acrecentar la diversidad genética de estas últimas (Rajendran, 1990). En ciertos casos los genotipos salvajes están física y genéticamente lejanos de los cultivados, dificultando el proceso de mejora ya que se necesitan de un gran número de generaciones de retrocruzamiento para incorporar la resistencia. Además en el caso de la frutilla las diferencias en la ploidia con las especies silvestres relacionadas resulta una barrera para obtener una numerosa progenie interespecifica. De todos modos, con los programas de mejoramiento genético tradicional se pueden obtener cultivares con resistencia incrementada. Y en este caso, los marcadores moleculares ligados a genes de resistencia pueden ser muy útiles para ayudar a 101 seleccionar los cultivares más resistentes (selección asistida por marcadores), reduciendo el tiempo que insumen las diferentes etapas de la selección clonal, reemplazando los tradicionales marcadores morfológicos o fenotípicos, en especial cuando la expresión de esta característica es ambiental, inestable o difícil de observar. Marcadores moleculares en el mapeo genético Los marcadores genéticos representan las diferencias que existen entre individuos o especies. Generalmente no representan a genes blanco y la mayoría no afecta el fenotipo de la característica de interés, pero actúan como señales o marcas ya que se encuentran cerca o ligados a los genes que controlan la característica (Collard y col., 2005). Los marcadores inicialmente se utilizaron en el mapeo genético para determinar el orden de los genes a lo largo de los cromosomas. Sturtevant (1913) desarrolló el primer mapa genético con caracteres morfológicos ligados al sexo en Drosophila melanogaster Meigen. Posteriormente, Sax (1923) determinó el ligamiento genético entre caracteres cualitativos (color y tamaño de la semilla) en poroto. Los beneficios potenciales de la utilización de marcadores vinculada a los genes en programas de mejoramiento han sido evidentes durante muchos años. Con el advenimiento de los marcadores genéticos basados en ADN en la década de los setenta la situación cambió para investigadores y mejoradores, ya que a partir de esa época se identificaron gran número de marcadores dispersos en el genoma de varias especies como el tomate (Paterson y col., 1988), arroz (Kurata y col., 1994, Van Deynze y col., 1995; Devos y Gale, 1997), maíz (Dufour y col., 1996), trigo (Blanco y col., 1998), soja (Yu y col., 1994), alfalfa (Kiss y col., 1993), manzana (Hemmat y col., 1994) y en muchas otras plantas cultivadas. Un requisito básico para cualquier programa de mejoramiento basado en la selección asistida por marcadores (MAS) es contar con un adecuado número de marcadores polimórficos. Actualmente existe una gran variedad de marcadores moleculares disponibles, que se pueden utilizar en diversas aplicaciones como: en investigación vegetal básica, en mejoramiento, caracterización y conservación de germoplasma; identificacion de genes; introgresión asistida de alelos favorables y protección de variedades comerciales (Henry, 2001). Los marcadores moleculares más usados para mapeo son: RFLP: ―R estriction Fragment Length Polymorphism‖ (Botstein y col., 1980). RAPD: ―R andom Amplified Polymorphic DNA‖ (Williams y col., 1990). SCAR: ―Se quence-Characterized Amplified Region‖ (Williams y col., 1991). 102 SSR: ―Sim ple Sequence Repeat‖ o microsatélites (Hearne y col., 1992). CAPS: ―C leaved Amplified Polymorphic Sequences‖ (Lyamichev y col., 1993). STS: ―Se quence-Tagged Sites‖ (Fukuoka y col., 1994). AFLP: ―A mplified Fragment Length Polymorphism‖ (Vos y col., 1995). ALP: ―A mplicon Length Polymorphisms‖ (Ghareyazie y col., 1995). ter-Simple Sequence Repeats‖ (Wolfe y col., 1998). ISSR: ―In SNP: ―Sin gle Nucleotide Polymorphism‖ (Buetow y col., 1999). El progreso de algunas técnicas en genética molecular ha facilitado la identificación de marcadores ligados a un carácter mediante la utilización de marcadores moleculares que permitan detectar un número elevado de loci con un número limitado de cebadores. Precisamente Michelmore y col. (1991) desarrollaron una estrategia de análisis de mezclas de ADN (― bulked segregant analysis‖: BSA) en lechuga, Lactuca sativa L., para identificar fragmentos de ADN amplificados al azar (RAPD) ligados a genes de resistencia a enfermedades. El BSA permitió la comparación de dos muestras de mezclas de ADN obtenidos de la misma población, pero de fenotipos contrastante para el carácter de interés. Los fragmentos polimórficos de ADN fueron detectados como bandas únicas, en geles de agarosa o acrilamida según la técnica utilizada, presentes en una mezcla de ADN y no en la mezcla de ADN del otro fenotipo (Michelmore y col., 1991). Tipos de mapas Una de las herramientas que utilizan los programas de mejoramiento genéticos para la ubicación y disección de genes de interés es el desarrollo de mapas genéticos. Existen 2 tipos de mapas, los mapas de ligamiento molecular que están formados por marcadores de ADN ubicados en posiciones relativas unos de otros, basándose en grupos de ligamientos genéticos; y los mapas físicos, que consisten en fragmentos genómicos clonados y secuenciados, ordenados linealmente como se encuentran en el cromosoma del organismo considerado (Blanco M y Valverde R., 2005). Uso de los mapas genéticos Caracterizar la estructura del genoma de una especie: conocer el ordenamiento de los genes en el genoma, identificar sitios de alta y baja tasa de entrecruzamiento, identificar reordenamientos cromosómicos ocurridos al comparar los mapas genéticos de especies relacionadas. 103 Predecir la probabilidad de ocurrencia de determinados gametos y por lo tanto de determinados genotipos. Realizar selección indirecta cuando un gen de interés está completamente ligado a un marcador o gen de fácil evaluación. Agrupar a los individuos según su arreglo genotípico (tipificación genotípica) identificando los individuos recombinantes. Mapeo de genes de resistencia Los mapas genéticos y los marcadores moleculares son herramientas importantes que sirven para identificar genes de interés. Como los marcadores existen en un número elevado, se puede construir mapas genéticos de alta densidad que son la base para llevar a cabo programas de mejora asistida por marcadores (MAS). En los mapas genéticos se pueden localizar genes de interés como: resistencia a enfermedades, tolerancia a estreses abióticos, características agronómicas o del fruto, etc. La resistencia a enfermedades representa un desafío diferente a los caracteres agronómicos, pues la interacción planta-patógeno está en constante co-evolución. Así, el mejorador se topa con diferentes razas de un patógeno o la presencia de varios genes de resistencia en la planta. La selección indirecta de genes específicos de razas ofrece una alternativa viable para asegurar que las combinaciones de genes favorables estén presentes en las nuevas líneas mejoradas (Kelly y Miklas, 1998). Hay marcadores que al estar fuertemente ligados a genes de resistencia específica a razas individuales del patógeno, permiten guiar la selección indirecta eficaz de genes de resistencia. Hay estudios, como los de Faleiro y col, (2003), que encontraron que las plantas poseen muchos genes específicos de raza para hongos patógenos que son mapeados en pocos loci y que estos loci pueden estar constituidos por genes aislados, por genes ligados y organizados en forma secuencial o por genes que contienen diferentes alelos. El número de genes R, así como el mapeo de dichos genes han sido determinados para diferentes patosistemas (Pryor y Ellis, 1993). Por ejemplo en el poroto común (Phaseolus vulgaris L.) con el desarrollo de los marcadores moleculares, los estudios dirigidos al mapeo de diferentes genes R, han aumentado considerablemente en los últimos años (Kelly y Miklas, 1998). Se han desarrollado alrededor de 15 mapas de ligamiento en poblaciones generadas a partir de diferentes cruzas, y han localizado genes mayores ligados o asociados con resistencia a enfermedades, en poroto, tales como el gen ligado a resistencia a virus del mosaico común (BCMV) (Blair y col., 2007a, b), al tizón común (Park y col., 1999), a mancha angular de la hoja (Namayanja y col., 2006), a moho blanco 104 (Kolkman y Kelly, 2003), a la antracnosis (Vallejos y col., 2001), a roya (Park y col., 2003). Estos mapas han permitido que los mejoradores entiendan la herencia de la resistencia de las características en cuestión (McClean y col., 2004). En el caso del melón, se han desarrollado marcadores moleculares ligados al gen de resistencia Fom-2, que confiere resistencia a las razas 0 y1 de Fusarium oxysporum f.sp melonis (Zheng y col., 1999; Wang y col, 2000) con una población de mapeo. Actualmente ya se han utilizado mapas genéticos en numerosas plantas cultivadas y en plantas silvestres relacionadas, para identificar marcadores ligados a genes de resistencia a enfermedades como por ejemplo en tomate (Martin y col., 1991), lechuga (Paran y col., 1991), arroz (Yoshimura y col., 1995), trigo (Botstein y col., 1980), maíz (Simcox y col., 1993), sorgo (Oh y col., 1994), cebada (Kilian y col., 1994; Penner y col., 1995; Borovkova y col., 1995; Graner y col., 1996), soja (Yu y col., 1994), papa (MeKsem y col., 1995). En el caso de las especies de la familia Roseaceae, se publicaron algunos trabajos en frutilla y frambuesa donde se han encontrado marcadores asociados con la resistencia a Colletotrichum (Lerceteau- Köhler y col., 2005, Smith y col., 1987). Se identificaron genes de resistencia en frambuesa y marcadores moleculares asociados con el gen Rca 2 que otorga la resistencia a un grupo de patogenicidad de Colletotrichum acutatum, que causa la antracnosis. Otros trabajos realizados en Fragaria ananassa con poblaciones segregantes como los de Van de Weg y col., (1993), demostraron que la resistencia al patógeno Phytophtora fragariae tiene una herencia monogénica y se comporta de acuerdo a un sistema gen a gen. También Gupton y Smith, (1991) estudiaron genes de defensa en la frutilla cultivada y demostraron que la resistencia a C. acutatum y C. fragariae estaría dada también por la acción de un gen mayor, pero no descartaron efectos epistáticos. En cuanto al mapeo dentro del género Fragaria, podemos citar el trabajo de tesis doctoral del Dr. Bonet Gigante (2010) en la Universidad de Barcelona, que desarrolló un mapa genómico con la especie diploide F. vesca. Con el objetivo de localizar nuevos loci responsables de las principales características agronómicas de la frutilla, desarrollaron nuevos marcadores moleculares que contribuyen a mejorar el mapa genético de referencia del género. También confeccionó un mapa físico del género, pero su máximo esfuerzo fue la localización de posibles genes candidatos para la calidad del fruto. El primer mapa de ligamiento del genoma de la frutilla diploide fue desarrollado por Davis y Yu (1997) con izoenzimas. Al mismo tiempo se publicaba el ligamiento entre marcadores RAPD y un carácter de interés en la frutilla cultivada usando BSA de individuos resistentes y susceptibles a Phytophthora fragariae (Haymes y col., 1997). 105 Estos últimos autores identificaron 7 marcadores RAPD ligados al locus Rpf1, que es una de las fuentes principales de resistencia genética a la pudrición roja de la corona y raíz, causada por el hongo de suelo P. fragariae. En el primer mapa basado en estudios de asociación en Fragaria ananassa (Sugimoto y col., 2005) se identificaron dos marcadores RAPD ligados al locus EV (― everbearing‖) en la frutilla octoploide. La técnica de AFLP fue aplicada por primera vez en Fragaria ananassa por LerceteauKöhler y col. (2003) durante la construcción del primer mapa de ligamiento público de la frutilla cultivada y subsecuentemente en estudios relacionados (Weebadde y col., 2008; Rousseau-Gueutin y col., 2008; Sargent y col., 2009b, Ontivero y col., 2011). Lerceteau-Köhler y col., en 2005 estudiaron la herencia de la resistencia a uno de los agentes causantes de la antracnosis, Colletotrichum acutatum, en 43 cultivares de frutilla. Ellos obtuvieron 2 marcadores SCAR, derivados de AFLP, muy ligados al gen Rca2. A pesar de estos estudios, en este cultivo se han desarrollado pocas poblaciones de mapeo y específicamente en lo que se refiere al mapeo de genes de resistencia a la antracnosis en frutilla hay escasa información. Por lo tanto si se dispone de una población segregante para el carácter de resistencia a este patógeno se podrán desarrollar marcadores que nos permitan determinar la presencia del/los gen/es deseado/s. Y como estos marcadores no están influenciados por el ambiente, permitirán una selección más rápida y confiable que los procesos de selección tradicional en el mejoramiento. Por todo lo explicado se decidió desarrollar una población segregante los más consanguínea posible donde este segregando el carácter resistencia/susceptibilidad a C. fragariae. 106 MATERIALES Y METODOS Para la obtención de progenie segregante para el carácter de resistencia al aislado F7 de C. fragariae se realizaron cruzas recíprocas entre la accesión Mendoza (susceptible) del cultivar Pajaro con la accesión Salta (resistente) del mismo cultivar. Los cruzamientos se realizaron mediante una técnica optimizada en nuestro grupo que garantiza la obtención de progenie híbrida. Para ello se utilizaron flores cerradas de los genotipos que actuaron como progenitores femeninos y flores completamente abiertas para los progenitores masculinos. Se eligieron los pimpollos de mayor tamaño de plantas cultivadas en invernadero pertenecientes al cultivar seleccionado como progenitor femenino y se procedió a la eliminación de las piezas florales externas (sépalos y pétalos) con ayuda de una pinza y una tijera de punta fina, posteriormente se cortaron los estambres (castración) y se taparon con copos de algodón para evitar la polinización con polen extraño. Al tercer día posterior a la castración, se fecundaron las mismas con polen de plantas del cultivar seleccionado como progenitor masculino. Luego de la polinización se cubrieron las flores con algodón. A los siete días se destaparon las mismas y se evaluó el resultado de los cruzamientos. En los casos positivos, se cosecharon los frutos a la madurez aproximadamente 30 días después de la polinización. Los aquenios más turgentes fueron seleccionados para ser escarificados y posteriormente sembrados. La escarificación de los aquenios se realizó por inmersión en ácido sulfúrico concentrado durante 1 min y a continuación se lavaron de 8 a 10 veces con agua destilada estéril. Finalmente los aquenios híbridos se sembraron en tierra estéril en bandejas ‗speedlings‘ y se mantuvieron a 25ºC y 16 horas de luz diarias en un fitotrón. Transcurrido un periodo aproximado de tres meses, las plántulas obtenidas fueron transplantadas a macetas de 1litro, con el mismo sustrato que se detalló en los capítulos anteriores. Se cultivaron en las mismas condiciones controladas durante 30 días y posteriormente se trasladaron a invernadero para un óptimo desarrollo vegetativo e inducción de estolones para su multiplicación. Esta población será utilizada en futuros proyectos, a través de multiplicación vegetativa. 107 RESULTADOS Sobre la base de la información obtenida en los experimentos donde se evaluó la resistencia/susceptibilidad de los genotipos del Banco de Germoplasma del Pro-Frutilla frente al aislado F7 de Colletotrichum fragariae, se diseñaron cruzamientos para obtener poblaciones segregantes que posibilitaran investigar el control genético de la resistencia en frutilla. Para seleccionar dichos progenitores también se tuvieron en cuenta sus relaciones genéticas, lo que fue analizado en el capítulo l de la presente Tesis. Se generaron 2 poblaciones segregantes: Población código Nº196 donde el cultivar Pájaro Mendoza fue el progenitor femenino y el progenitor masculino fue el cultivar Pájaro Salta. Se obtuvieron 130 aquenios. Población código Nº197 es el cruzamiento reciproco al anterior donde Pájaro Salta fue el progenitor femenino. De este cruzamiento se obtuvieron 115 aquenios. Las poblaciones segregantes generadas en este caso equivalen a una F2 debido a la naturaleza altamente heterocigota de la especie. De la población Nº196, se obtuvieron 104 plantas, pero de estas sobrevivieron a las condiciones de invernadero solo 40 genotipos. En el caso de la población Nº197 se obtuvieron 115 aquenios, de los cuales sólo 50 germinaron. Se realizaron nuevos cruzamientos, en ambos sentidos, para obtener poblaciones con mayor número de individuos, cuyos frutos se están por cosechar. 108 DISCUSIÓN El mejoramiento a través de la generación de recombinantes genéticas entre fuentes de resistencia de genotipos muy cercanos podría representar una solución estable a la mejora de cultivares con resistencia incrementada. Antes de desarrollar una población de mapeo para localizar genes o marcadores asociados a la resistencia es necesario realizar un ―sc reening‖ de las variedades o genotipos disponibles para determinar cuáles son resistentes o susceptibles a la enfermedad en estudio, en nuestro caso la antracnosis. Este análisis fenotípico fue realizado dentro de los primeros objetivos de esta tesis concluyendo que dos genotipos muy cercanos genéticamente tuvieron respuestas contrastantes a la infección con el aislado F7 de C. fragariae. Por tal motivo se seleccionaron estos genotipos genéticamente cercanos y con resistencia contrastante al aislado F7 de Colletotrichum fragariae para generar las poblaciones de estudio. Así, analizando la progenie de una cruza entre progenitores resistente y susceptible se podrían encontrar marcadores asociados a la resistencia. Como en frutilla hay pocos estudios de mapeo genético, especialmente relacionados a genes de resistencia a la antracnosis, esta población permitiría el desarrollo de herramientas moleculares que contribuirán al conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en los procesos biológicos de la defensa de este cultivo y esto tendría mayor relevancia en la mejora de las variedades comerciales actuales. CONCLUSIONES Quedaron formadas dos poblaciones segregantes derivadas de los cruzamientos recíprocos de Pájaro Salta con Pájaro Mendoza para futuros estudios de mapeo y selección asistida por marcadores. 109 CONCLUSIONES FINALES I. El genotipado con RAPD permitió caracterizar 3 accesiones del cultivar Pájaro como genotipos distintos. II. Estas diferencias en los perfiles genotípicos, posiblemente por acumulación de mutaciones durante la multiplicación clonal, no se reflejaron en los descriptores recomendados por la UPOV para la identificación varietal. III. Dos de estos genotipos muy parecidos genéticamente presentaron una respuesta diferencial frente a la inoculación con Colletotrichum fragariae. IV. El análisis transcriptómico por cDNA-AFLP permitió identificar 60 transcriptos con secuencias homólogas a proteínas con función putativa conocida. V. Uno de estos genes (TDF 11C) que se corresponde con un gen de resistencia tipo R, es reprimido por el patógeno en el genotipo susceptible, lo que indica que tiene una función en la respuesta de defensa. PROYECCIONES Para profundizar con los estudios básicos sobre cómo las plantas se defienden de sus patógenos y si fuera posible también para mapear genes de resistencia que puedan ser usados en el mejoramiento genético de la frutilla, se obtuvieron dos poblaciones donde esta segregando la resistencia, por cruzamiento entre los progenitores cosanguíneos con comportamiento diferencial frente a C. fragariae. El clonado del TDF 11C en el genotipo resistente y en el susceptible permitiría conocer la región del gen responsable de la expresión diferencial, y también se podría inferir como está regulada su expresión. 110 BIBLIOGRAFÍA A Adaskaveg J E y Hartin R J (1997). Characterization of Colletotrichum acutatum isolates causing anthracnose of almond and peach in California. Phytop 87: 979-987. Alexandrov N N, Troukhan M E, Brover V V, Tatarinova T, Flavell R B y Feldmann K A (2006). Features of Arabidopsis gene and genome discovered using full-length cDNAs. Plant Mol Biol 60:71–87. Altschul S F, Gish W, Miller W, Myers E W y Lipman D J (1990). "Basic local alignment search tool‖ (BLAST). J. Molec. Biol. 215: 403-410. Alvarez M E, Pennell R I, Meijer P J, Ishikawa A, Dixon R A, Lamb C (1998). Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of plant immunity. Cell 92:773-783. Analytical Software (1996). Statistix for Windows. User´s Manual. 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