mitocondria y apoptosis

REVISION (BIOLOGIA CELULAR)
Acta Científica Venezolana, 53: 297–306, 2002
MITOCONDRIA Y APOPTOSIS
Francisco Arvelo
Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores, Instituto de Biología Experimental,
Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela, Apartado 47114, Caracas-Venezuela, 1041
Recibido: 06/05/02; Revisado: 02/07/02; Aceptado: 05/11/02
RESUMEN: Es admitido que las mitocondrias son endosimbiontes originadas de una bacteria aeróbica que habría sido absorbida por
el ancestro de la célula eucariota. Una parte de la maquinaria apoptótica habrá estado presente en los eucariotas unicelulares y parte
de los controles de la apoptosis en las bacterias. Por lo tanto, es posible que el mecanismo de mantenimiento de la simbiosis entre la
bacteria ancestro de la mitocondria y la célula hospedadora que originó a los eucariotas, establecieron las bases para el control de la
supervivencia celular. Los metazoarios habrían aprovechado esta posibilidad, interconectando los efectores mitocondriales de la muerte
celular y las vías de transducción de señales. Una variedad de eventos señala a la mitocondria como el efector principal de la apoptosis.
Esto incluye la liberación de activadores de las caspasas (citocromo c), cambios en el transporte de electrones, pérdida del potencial de
membrana mitocondrial, alteración del mecanismo de oxido-reducción celular y participación de las proteínas pro y antiapoptóticas Bcl-2.
Estas señales diferentes que convergen en la mitocondria para activar o inhibir estos eventos, describen algunas vías en la fisiología de
la muerte celular. Palabras clave: Apoptosis, Muerte celular programada, mitocondria, Proteínas de choque térmico , Bcl-2.
MITOCHONDRIA AND APOPTOSIS
ABSTRACT: It is now accepted that mitochondria are endosymbionts, originated in aerobic bacteria which were integrated by the ancestor
of eukaryotic cells. A part of the apoptotic machinery could exist in unicellular eukaryotic and some controlling apoptosis components might
be present in prokaryotes. It is therefore possible that the mechanism originally involved in the maintenance of the symbiosis between the
bacterial ancestor of the mitochondria and the host cell precursor of eukaryotes, provided the basis for the actual mechanism controlling
cell survival. Metazoans would have improved this possibility by connecting to the mitochondria as principal effector of cellular death to
the pathways of signal transduction. A variety of events appoint to the mitochondria as principal effector of the apoptosis. This including
the release caspase activators (cytochrome c), changes in electron transport, loss of mitochondrial transmembrane potential, altered
cellular oxidation-reduction, and participation of pro and antiapoptotic Bcl-2 proteins. The different signals that converge on mitochondria
for activation or inhibition of these events, delineate several pathways in the physiology of the cellular death. Key Words: Apoptosis,
Programmed cell death, mitochondria, Heat shock proteins (HSP), Bcl-2.
INTRODUCCION
Todos los organismos envejecen de forma natural como paso inexorable hacia la muerte, no existiendo ninguno que pueda eludir ese destino y por consiguiente ser
inmortal. Solamente los seres más sencillos de la escala biológica, los unicelulares, como las bacterias, no sufren este proceso de envejecimiento si consideramos que
cuando una bacteria se divide en dos da paso a una descendencia que perpetúa el correspondiente mensaje genético. En contraposición a este tipo de reproducción, el
envejecimiento acompaña a la reproducción sexual, es decir aquel que ocurre cuando entre los distintos tipos de células que constituyen un organismo pluricelular existe uno
diferenciado: las células germinales.
Los gametos masculinos y femeninos, al unirse en el
proceso de la fecundación, originaran un nuevo individuo
al cual se transmite el mensaje genético de la especie y
las peculiaridades maternas y paternas; el organismo u
organismos generadores de cada uno de los gametos sufrirán las consecuencias del envejecimiento y la muerte.
Así, todo ser vivo, una vez que ha formado y madurado las
células germinales, vive durante el espacio de tiempo necesario que le permite transmitir sus genes, contribuyendo
de esta forma a mantener la especie. Una vez cumplida
esta función se acentúa un declive irreversible y la edad
máxima que puede alcanzar una especie -que difiere de
un organismo a otro-, siempre será limitada y está ligada
a la dotación genética de cada especie. Esto hace pensar que existen genes a los cuales se les ha denominado
“genes de la muerte” que funcionan como relojes que controlan el tiempo de cada individuo y cada especie, desde
la fecundación hasta la muerte.
Por otra parte, para la construcción y funcionamiento
correcto de los organismos, para mantener su equilibrio
homeostático, es importante la desaparición de grupos
determinados de células, lo que caracteriza una muerte
parcial en todos los estadíos iniciales y permanentes de
la vida de cada individuo, proceso regulado por genes
y conocido como apoptosis o muerte celular programada (MCP)(2). Todas las células del organismo están por
tanto proyectadas a morir por apoptosis, bien sea porque
han cumplido con sus funciones, han sufrido un daño en
su material genético o porque no existen señales que las
mantengan en pleno funcionamiento. Las células normales tienen la capacidad de evaluar el nivel de la lesión que
han sufrido; si el nivel de la lesión ocasionada está por
encima de la capacidad reparadora de la célula, entonces
la célula se dirige a su propia destrucción por apoptosis.
Se hace necesario señalar que accidentalmente la célula también puede morir por un proceso diferente de destrucción que se conoce como necrosis, consecuencia de
agresiones físicas, químicas o biológicas.
Las células destinadas a convertirse en ancestros de
todas las células eucariotas establecieron una estrecha
asociación con el ancestro de las bacterias actuales ha-
298
ce aproximadamente 2 billones de años. El resultado
fue una célula protoeucariótica con una bacteria ancestral endosimbiótica -que se transformó evolutivamente en
mitocondria-, asociación que les permitiría beneficiarse de
la energía contenida en el oxígeno atmosférico. Es posible que también en este proceso evolutivo el núcleo de
la célula eucariótica ancestral se creara por endocitosis
al incorporase otros tipos de células procariotas al interior de la célula eucariota anaeróbica45 . Con el tiempo la
mayoría de los genes procariotas (genes protomitocondriales) se integraron en el genoma nuclear, con lo que
el eucariota primitivo anaeróbico ya podía vivir en una atmósfera aeróbica rica en oxígeno. Solo una pequeña fracción del genoma procariótico primigenio permaneció en la
mitocondria56 , siendo el genoma mitocondrial un vestigio
del cromosoma de las arqueobacterias que accedieron al
citoplasma de los eucariotas primitivos para dar lugar a la
evolución de dicha organela.
Algunas hipótesis señalan que el origen endosimbiótico
de la mitocondria y la evolución del metabolismo aeróbico
en las células eucariotas formaron las bases para la evolución de la muerte celular activa que en los metazoarios
se manifiesta como la apoptosis31 . En muchos sistemas
experimentales se ha establecido el papel central de la
mitocondria como efector principal de la apoptosis29;65 . La
MCP constituye un mecanismo fisiológico mediante el cual
son eliminadas las células dañadas, envejecidas, mutadas
o ectópicas, estando también implicada en otros procesos
vitales fundamentales tales como el desarrollo embrionario, el mantenimiento de la homeostasis y la regulación del
sistema inmunitario. Por otra parte, la MCP, por exceso o
defecto, está implicada en una amplia variedad de procesos patológicos80 , como es el caso de las proliferaciones
malignas, donde la alteración de la apoptosis es observada en diferentes etapas, tales como el mantenimiento
de la vitalidad de las células mutadas; la supervivencia
de clones tumorales en condiciones desfavorables y resistencia a los tratamientos anticancerosos64 . La infección
con HIV está también ligada a un desorden en la regulación de la apoptosis con alteraciones en la homeostasis
mitocondrial67 .
Un gran número de genes, tales como bcl-2 y relacionados intervienen en la regulación de la muerte celular.
Aislado por primera vez a partir de un punto de ruptura de
una translocación -encontrada en un 80 a 90 % de linfomas foliculares- entre los cromosomas 14 y 1882 . El gen
bcl-2 codifica para una proteína que bloquea la apoptosis
tanto in vivo como in vitro en numerosos sistemas celulares frente a una amplia variedad de estímulos, perteneciendo a una familia de genes que codifica para proteínas
inhibidoras (Bcl-2, Bcl-x, McL-1, A1, BF11, etc) o activadoras (Bad, Bak, Bik, Bid, etc) de la muerte celular, poseyendo además homología en su secuencia peptídica47 .
Estudios genéticos realizados en el nemátodo Caenorhabditis elegans han permitido identificar genes implicados en la muerte celular programada29 . Un grupo de mutaciones denominadas “ced” o células de la muerte celular,
conducen a anomalías que llevan, durante diferentes eta-
Arvelo
pas del desarrollo del nemátodo, a la pérdida fisiológica
y muerte de 131 de las 1090 células somáticas que posee. Las mutaciones que afectan cada etapa del desarrollo han sido bien estudiadas, permitiendo así la identificación de 14 genes reguladores de la MCP. También ha sido
demostrado que tres de estos genes afectan el conjunto
de células somáticas ced-3, ced-4, ced-9. El gen ced-9 es
homólogo al gen humano bcl-2; ced-3 es homólogo al gen
que codifica para la proteína ICE (Interleuquina-1 enzima convertidora) a una familia de proteasas denominadas
caspasas por cisteína aspártico. Finalmente, ced-4 presenta una fuerte homología con el gen que codifica para
la proteína APAF-1 (Apoptotic Protease Activating Factor1) que interviene en la activación de la caspasa 3 (CPP32)
(cisteina proteasa de 32 kDa)92;13 .
El proceso apoptótico puede ser dividido en tres fases
distintas:
1. Fase inicial, denominada de Inducción, durante la cual
las células reciben estímulos apoptóticos (ligando de
receptores de membrana, privación de factores de
crecimiento o de oxígeno, agentes citotóxicos y radiaciones ionizantes).
2. Eventos bioquímicos que resultan de estímulos letales que conducen a un efector central, donde su activación conduce a la segunda fase común y reguladora de la muerte celular. El tránsito por esta etapa
constituye un punto de no retorno de la señalización
apoptótica.
3. La fase de degradación, en el curso de la cual la célula adquiere la morfología final de apoptosis (degradación del ADN, alteración del citoesqueleto, fragmentación de la célula en cuerpos apoptóticos).
ORIGEN DEL CONTROL MITOCONDRIAL DE LA MUERTE CELULAR
Como hemos visto, se admite mayoritariamente que las
mitocondrias son endosimbiontes que tienen por origen
una bacteria aeróbica que habría sido absorbida por el ancestro de las células eucariotas34 y que en el curso de la
evolución la mayor parte de los genes de esta bacteria
ancestral habrían migrado al núcleo del hospedador. La
existencia de proteínas mitocondriales -difícilmente desplazables del citoplasma hacia la mitocondria, para pensar
en su incorporación desde fuera de la misma- habría obligado a estas entidades a conservar su genoma de forma
semi-autónoma18 .
Ciertos procesos de la muerte celular en bacterias han
sido comparadas con la muerte celular programada observada en las células eucarióticas. En las bacterias, los
plásmidos son estabilizados por diferentes mecanismos,
existiendo tres vías por medio de las cuales se conserva el plásmido a través de la muerte selectiva de células
libres de plásmidos.
Mitocondria y apoptosis
p
p
p
En el primer sistema, genes plasmídicos codifican para una proteína tóxica estable -que corresponde a
un ARNm estable- y un antídoto inestable -pequeño
ARN antisentido inestable- el cual inhibe la traducción
del mensajero. La expresión de letalidad es regulada
postraduccionalmente -sistema ccd (coupled cell división to plasmid proliferation) del plásmido F en E.colio transcripcionalmente -sistema hok (host-killing) del
plásmido R1 en E. coli-.
En el segundo sistema genes plasmídicos - sistema R-M (restriction modification) del plásmido R7 en
Pseudomonas aeruginosa- codifican para una enzima
de restricción tipo II estable y una metilasa inestable
la cual ofrece protección contra el ataque de endonucleasas de restricción.
El tercer sistema está constituido por un operón complejo -sistema MccB17 (microcine B17) en E coli cuyos genes codifican tanto para la síntesis y maduración de proteínas citotóxicas como para un polipéptido que le confiere resistencia o inmunidad a las
células “asesinas” por un mecanismo aún desconocido (las células libres de plásmido son eliminadas por
proteínas citotóxicas excretadas por células que son
portadoras)7 .
A la inversa de las células eucariotas en las cuales el
suicidio celular se encuentra bajo la estricta dependencia
de la activación de sistemas genéticos, la muerte programada en procariotas se encuentra bajo una regulación negativa; es decir, la pérdida de genes contenidos en el plásmido que provoca el mecanismo de suicidio celular. Una
posibilidad ha sido considerada para la sub-unidad 8 de la
actual ATP sintetasa en razón de las similitud que existe
entre este polipéptido y las toxinas respiratorias de la familia hok 7;41 . Otra posibilidad, no exclusiva, sería que el
endosimbionte pudiese tener en su propio citoplasma (futura matriz mitocondrial) moléculas letales para la célula
hospedadora; en este caso, la célula hospedadora estará
obligada a proteger la membrana del endosimbionte contra sus propios ataques y en particular de las proteasas.
Se establecería entonces un equilibrio entre las dos células, cada una volviéndose dependiente de la otra para
poder sobrevivir. A partir de este momento, los dos organismos unicelulares estarán obligados a evolucionar conjuntamente, y por lo tanto se habría iniciado la transferencia del genoma del endosimbionte hacia el núcleo de la
célula hospedadora45 .
Esta hipótesis señala la ausencia de necesidad de proteínas codificadas por el genoma mitocondrial para la
apoptosis y la actividad de Bcl-2. Las proteínas mitocondriales implicadas en la apoptosis: Bcl-2, translocasa de
nucleótidos de adenina, receptores de benzodiazepinas,
porina, citocromo c y AIF(apoptosis inducing factor ), son
todas codificadas por el núcleo y están presentes en las
mitocondrias de las células pÆ (desprovistas de ADN mitocondrial). Sobre la base de esto surge la siguiente interrogante: ¿el control de la supervivencia celular podría de-
299
rivarse de elementos ya presentes en los precursores de
las mitocondrias? Hay que considerar que algunas moléculas que constituirán el poro responsable de transición de
permeabilidad, tales como las ciclofilinas y porinas existen
en los procariotas75 . Dos constituyentes de este poro, la
translocasa de nucleótidos adenílicos y el receptor periférico de las benzodiazepinas tendrían análogos en la bacteria Rhodobaxter capsulatus15;4 . Por otra parte, la proteína
Bcl-x presenta similitudes de estructura con las colicinas
en E coli 61 .
El citocromo c y ciertas proteasas animales, así como
una parte de los componentes mitocondriales implicados
en la apoptosis, estaban presentes en las bacterias aeróbicas. Además en los nemátodos, el ced-9 es transcripto bajo la forma de un ARNm policistrónico conteniendo
también el ARNm cyt-1 específico del citocromo b560, un
componente del complejo II de la cadena respiratoria38 .
Esto sugiere que ced-9 y cyt-1 habrían sido conjuntamente transfectados del genoma de la bacteria ancestral mitocondrial hacia el núcleo, lo que significaría que ced-9 y por
consecuencia los miembros de la familia bcl-2 se habrían
originado a partir del genoma del endosimbionte.
ORIGEN EVOLUTIVO DE LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA
El proceso de muerte nuclear que ocurre en la célula como consecuencia de los mecanismos apoptóticos es una
secuencia de eventos que permiten la sobrevivencia de la
misma, proceso también observado en los protistas26 . La
fragmentación del ADN en fracciones oligonucleosómicas
y la destrucción total del núcleo, son eventos terminales
del proceso apoptótico y son procesos solamente visibles
cuando la célula está comprometida irreversiblemente en
el proceso de la apoptosis. Eventos y mecanismos que
se parecen a la apoptosis han sido descritos en la amiba Dictyostelium21 y en algunos protozoarios como en los
tripanosomas89;1 y en las leishmanias59;22 . Estas observaciones sugieren que al menos una parte de los mecanismos de la MCP existían antes que los organismos multicelulares aparecieran.
¿Cuáles son los elementos de la apoptosis que se encuentran en los organismos unicelulares que no están involucrados en la MCP de los organismos pluricelulares?.
Fenómenos similares a la transición de permeabilidad han
sido descrito en levaduras79 ; sin embargo, análisis del
cuadro de lectura deducidas de la secuencia del genoma
de la levadura Saccharomyces cerevisiae no permite poner en evidencia un gen específico de una presunta proteína conteniendo regiones conservadas de proteínas de
la familia Bcl-2 o de las caspasas, lo que sugiere que no
parece existir en esta levadura un gen homólogo de Bcl2 o de las caspasas. Sin embargo, la expresión del gen
bax de mamífero en la levadura S. cerevisiae es letal a
condición de que esta levadura posea una cadena respiratoria funcional; además, Bcl-2 inhibe la muerte celular
inducida por Bax, cuando la secuencia de Bcl-2 se en-
300
cuentra adosada a la mitocondria35 . Hay que señalar que
Bax y Bak, miembros pro-apoptóticos de la familia Bcl-2,
son capaces de provocar la muerte celular en la levadura S. pombe44;39 , así como la expresión de ced-4 provoca
modificaciones morfológicas de apoptosis en la misma43 .
En conclusión podemos decir que ciertos elementos implicados en el control de la muerte celular en los mamíferos
parecen estar presentes en las levaduras.
MITOCONDRIA: INTEGRADOR DE LAS VÍAS DE LA
MUERTE CELULAR PROGRAMADA
La mitocondria es el blanco común de las numerosas
moléculas transductoras de las señales que provocan la
permeabilización de su membrana, siendo, por ejemplo:
los segundos mensajeros de respuesta al estrés, incluyendo la ceramide y su derivado el gangliósido GD3, el
cual durante el proceso apoptótico se sintetiza activamente localizándose en la membrana mitocondrial, causando apertura con la consiguiente liberación de factores apoptóticos81 ; los ácidos grasos (el palmitato) y sus
productos de oxidación, el 4-hidroxinonenal; las especies
reactivas de oxígeno (el anión superóxido que se forma
en la cadena respiratoria), el óxido nítrico, así como el
calcio17;62;57;48;58;8 . Las elevaciones de calcio citosólico originados vía los receptores IP3 en las proximidades del
retículo endoplásmico- jugarían un papel importante tanto en la regulación transitoria de la permeabilización de la
membrana interna de la mitocondria como en la inducción
de la respuesta apoptótica.
Las concentraciones locales de metabolitos esenciales (ATP, ADP, NADH, NADPH, creatinina, carnitina), así
como iones esenciales (Mg2+ ), modulan la susceptibilidad de la mitocondria a sufrir la permeabilización de sus
membranas46 . En consecuencia, las mitocondrias controlan continuamente tanto el estado bioenergético global de
la célula así como las respuestas no específicas al estrés celular, estimuladas por pequeñas moléculas no proteicas. Podemos afirmar también que numerosas proteínas implicadas en la regulación de la apoptosis están normalmente ubicadas en la mitocondria, antes de la inducción de la apoptosis, incluyendo una serie heterogénea de
proteínas como: la quinasa A, la quinasa A-RAF-1 (90),
Grb10, la cual interactúa con la proteína Raf-1 mitocondrial; la CIDE-B, homólogo de ICAD, que es un inhibidor
de CAD o (caspase-activated DNAse)16 ; la porina o VDAC
(voltaje dependent anion channel), translocador de nucleótidos de adenina (TNA). Por otra parte, los miembros
anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 y Bcl-X, están presentes normalmente en las membranas mitocondriales, donde ellos ejercen un efecto inhibidor sobre la permeabilización de la membrana mitocondrial47 . Ciertos homólogos
pro-apoptóticos de Bcl-2 tales como BNIP3 o Bak se encuentran asociados a la membrana mitocondrial, los cuales, bajo una señal pro-apoptótica, podrían promover la
permeabilización de la membrana mitocondrial83;88 .
Otras proteínas, participantes de la transducción de
Arvelo
señales letales, se encuentran distribuidas en las mitocondrias, provocando la permeabilización de la membrana. Esta redistribución de proteínas del citosol hacia
la mitocondria ha sido observada para las familias proapoptóticas Bcl-2, Bax, Bid, donde la proteína Bax citosólica se adosa en la membrana externa de la mitocondria;
este proceso origina cambios de conformación y oligomerización de la proteína Bax. Por otra parte, la proteína Bid
citosólica es activada por ruptura proteolítica, en este caso por la caspasa 8, transductora de señales que se activa bajo los efectos de la interacción con los receptores de
la muerte de la membrana plasmática Fas/CD95 y TRAIL
(TNF-related apoptosis inducing ligand) o por la granzyma
B, componente citotóxico de los linfocitos T5;6 . El producto de ruptura de esta reacción, la proteína Bid truncada
(tBid) se integra en la membrana mitocondrial e interactúa
con Bax o Bak88 .
La cardiolopina, lípido situado en la membrana interna
de la mitocondria, es responsable de la especificidad y redistribución subcelular de tBid53 . Luego de ocurrir la desfosforilación, bien sea por la calcinuria o la fosfatasa 1a, la
proteína Bad se desplaza hacia la mitocondria, donde ella
inactiva la proteína anti-apoptótica Bcl-x. Por otra parte,
Bim, una proteína pro-apoptótica -de la familia Bcl-2, Bax,
Bid- interactúa en condiciones normales con el complejo
asociado microtúbulos-dineína que además se une a las
mitocondrias bajo los efectos de una perturbación en la
red de microtúbulos. Se ha determinado que las proteínas
Bax, Bak y tBid provocan permeabilización de las membrana mitocondriales cuando son sometidas a la presencia de mitocondrias purificadas in vitro76 y por otra parte,
TR3 -un factor de trascripción de la superfamilia de receptores de las hormonas esteroides/tiroides- que se encuentra localizado en condiciones normales en el núcleo, se
redistribuye hacia las mitocondrias donde puede provocar
la permeabilización de la membrana mitocondrial.
Cuando TR3 forma un heterodímero con otra proteína
de la misma familia, por ejemplo, el receptor del ácido 9cis-retinoico (RXR), interacciona con el elemento de respuesta del ácido retinoico. En las diferentes condiciones
de inducción de la apoptosis, TR3 es sobreexpresado y se
distribuye del núcleo hacia la mitocondria, probablemente por un mecanismo de transporte activo. La presencia
del factor TR3 recombinante sobre mitocondrias purificadas en un sistema acelular provoca la liberación del citocromo c, lo que sugiere que permite la permeabilización
de las membranas mitocondriales sin la presencia de factores adicionales49 . Por otra parte, está la p53, un factor
de transcripción que induce la apoptosis activando genes
pro-apoptóticos (que incluye los de la familia Bcl-2), siendo su mayor potencial el de inducir la permeabilización de
la membrana mitocondrial no estando acoplado a su potencial trans-activador55 . La transfección de p53 salvaje en
células con p53 mutada incrementa la susceptibilidad de
estas a la acción citotóxica del factor alfa de necrosis tumoral con el restablecimiento del proceso apoptótico3 . Por
otra parte, proteínas virales y bacterianas, pueden también controlar la permeabilización de la membrana mito-
Mitocondria y apoptosis
condrial, existiendo un número creciente de homólogos virales de Bcl-2, así como de proteínas sin ninguna similitud
estructural con Bcl-2. Entre las proteínas pro-apoptóticas
que actúan sobre las mitocondrias tenemos la proteína viral R (Vpr) que es codificada por el VIH-1, estando comprobado que el blanco es el TNA42 . También tenemos la
proteína HBx codificada por el virus de la hepatitis B (
HBV) que interactúa con HVDAC3 (70).
Estos resultados revelan la existencia de una serie de
factores heterogéneos tales como los agentes no proteicos, las proteínas homólogas de Bcl-2, quinasas, factores
de transcripción y proteínas virales que actúan sobre las
mitocondrias regulando la permeabilidad de su membrana. Sobre la base de esto la mitocondria representa un
integrador de las diferentes vías de la muerte celular programada.
MITOCONDRIA: UN EJECUTOR DE LA SENTENCIA DE
MUERTE CELULAR PROGRAMADA
Una de las características de la apoptosis es la activación de las caspasas y la liberación del citocromo c fuera
del espacio intermembrana de la mitocondria. Este pasaje
y liberación a través de la membrana externa de las proteínas presentes en dicho espacio mitocondrial conducen
a la activación de las reacciones catabólicas que van a
degradar macromoléculas esenciales con la consiguiente
adquisición de la “morfología apoptótica” (86). Así, una vez
en el espacio citosólico, el citocromo c interactúa con Apaf1 produciendo su oligomerización y la auto activación de la
pro-caspasa 9 (11), la cual va a provocar, a su vez, la activación por ruptura proteolítica de las caspasas ejecutoras,
tal como la caspasa 3. Se ha demostrado que en células
madre embrionarias murinas la inactivación del gen que
codifica para el citocromo c, por recombinación homóloga, le confiere resistencia a la inducción de la apoptosis in
vitro50 .
Otra proteína intermembrana, la Smac/Diablo facilita la
activación indirecta de las caspasas aboliendo su inhibición por IAP (inhibitor of apoptosis proteins)28;84;87 , presentando analogía con tres proteínas caracterizadas en
Drosofila como son Reaper, Hid y Grim, en las cuales la
porción N-terminal interactúa con IAP36 . En experiencias
de transfección llevadas a cabo en células de mamíferos
para sobre-expresar Hid o Grim sugieren que estas proteínas actúan en las mitocondrias19 . La Smac-diablo, como
otras proteínas intermembrana, es sintetizada en forma de
precursor en el citoplasma, con una extremidad amino terminal y una secuencia de localización mitocondrial. Una
vez que el precursor es transportado a la mitocondria, esta
secuencia es procesada dando origen a la forma madura
de la molécula, la cual posee actividad apoptógena, propiedad que no poseen las moléculas Reaper, Grim y Hid,
ya que carecen de secuencia de localización mitocondrial
(28, 84).
Una flavoproteína, la AIF (apoptosis inducing factor ),
con actividad apoptógena, presenta una fuerte homolo-
301
gía con la reductasa de ascorbato en plantas y las oxidasas de NADH en las bacterias91 . Contrariamente al
citocromo c y Smac/Diablo, las cuales son liberadas al
citoplasma durante la apoptosis y no logran llegar al
núcleo28 , la AIF abandona el espacio intermembrana y
atraviesa el citosol para acumularse selectivamente en el
núcleo23 . En condiciones in vitro y en núcleos purificados, AIF provoca la condensación de la cromatina y la
ruptura del ADN en fragmentos de aproximadamente 50
kpb de tamaño87 . La neutralización intracelular de moléculas AIF extra-mitocondriales por microinyección con anticuerpos anti-AIF, ha permitido corroborar la contribución
de este factor en el proceso apoptogénico. En fibroblastos embrionarios murinos la neutralización de AIF inhibe
la apoptosis nuclear, si la vía apoptosoma/caspasa3/CAD
es simultáneamente inhibida por inactivación genética de:
Apaf-1, o de la caspasa-3, o por adición de un inhibidor de
caspasas, el Z-VAD.fmk: (benzyloxycarbonyl-Val-ala-Aspfluoromethyl ketone) o por microinjección de ICAD77 .
Sin embargo, en otro modelo de muerte celular, como es
el caso de las células Rat-1 tratadas con la estauroesporina o de las células Hela (inducidas a morir por la interacción con un complejo de glicoproteínas de la cubierta de
HIV-1), la microinyección de anticuerpos dirigidos contra
AIF impide la liberación de citocromo c y la subsiguiente
liberación de las caspasas; además, la neutralización del
citocromo c y la inhibición de las caspasas no afectan la
redistribución celular de AIF91 .
Sobre la base de estas investigaciones, podemos aseverar que la presencia de AIF recombinante, en presencia
de una mezcla de mitocondrias purificadas y de extractos
citosólicos, provoca la permeabilización de las membranas mitocondriales externas con la consecuente salida del
citocromo c y la activación de las caspasas.
PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO Y APOPTOSIS
El choque térmico es el estrés clásicamente utilizado
en el laboratorio para inducir las proteínas del choque térmico (HSP). Hay que recordar que la respuesta al estrés
físico, provocado por una elevación de la temperatura, depende de la amplitud de esta, lo cual puede determinar
dos vías: una vía por apoptosis si la síntesis de HSP es
moderada, o por vía de la necrosis celular, si el estrés es
intenso73 . La superproducción de HSP permite la termo
tolerancia, es decir, la adaptación de la célula y su resistencia a choques térmicos consecutivos. La inhibición de
la apoptosis está estrechamente relacionada con la inducción de la termo tolerancia y los niveles de síntesis de las
HSP. Esta prevención de la apoptosis por las HSP parece
ser ejercida esencialmente por intermedio de una protección contra los oxidantes, metabolitos reactivos de oxígeno
RLO (radicales libres de oxígeno)30 , incluyendo derivados
no radicales como el peróxido de hidrógeno11;12 .
Las HSP conforman una familia de proteínas conservadas a lo largo de la evolución que ejercen funciones esenciales en la vida celular y que expresan su gran valor ante
302
la presencia de un estrés, bien sea físico, químico o metabólico. Las HSP actúan como “chaperonas moleculares”
al unirse a péptidos o proteínas en el curso de su síntesis -donde existe fuerte riesgo de agregación-, permitiendo un plegamiento correcto y optimizando su traslado en
los compartimientos subcelulares específicos, donde aseguran, en cooperación de los unos con los otros, un control
de calidad y la protección celular24 . Numerosos argumentos están a favor del papel determinante de las HSP, en
particular de HSP70, HSP27, HSP10 y HSP60, en la regulación de la escogencia entre la muerte y la supervivencia
celular, las cuales describiremos a continuación.
LAS HSP70 Y HSP27 EN LA PREVENCION DE LA
APOPTOSIS
Numerosos trabajos han establecido el papel de la
HSP70 en la prevención de la apoptosis, ejercido esencialmente por intermedio de una protección contra los radícales libres de oxígeno (33, 54). Es importante señalar que in
vitro la protección celular contra las lesiones oxidativas o
la citotoxicidad del factor alfa de necrosis tumoral (TNF)
es observada por una sobre expresión de HSP70. Esta
protección contra los oxidantes implica a las mitocondrias
y contra TNF la inhibición de la fosfolipasa A2 (40). Estudios in vivo, empleando el modelo de isquemia-perfusión o
lesiones que resultan de un aumento no compensado de
la producción de oxígeno, han establecido -en el miocardio de rata- un efecto protector con la sobreexpresión de la
HSP70 (78). Por otra parte, la sobreexpresión de las proteínas de estrés de bajo peso molecular y en particular la
HSP27, producen una protección similar a HSP70 contra
RLO, citotoxicidad por TNF o por medicamentos antitumorales generadores de RLO, tal como la adriamicina32
o 5-fluorouracil (29, 9), que además impide la apoptosis
originada por el ligando Fas/APO-1 o la estaurosporina72 .
Este efecto protector está relacionado a la capacidad de
HSP27 de interferir con el metabolismo del glutatión, ya
que existe una correlación significativa entre la concentración de ambos compuestos. El glutatión interviene, por
una parte, en la detoxificación de las proteínas intracelulares oxidadas; por la otra, en la expulsión de los derivados
conjugados al glutation por la bomba específica GS-X dependiente del ATP.
Por otra parte, AIF es neutralizado por HSP70 en reacción independiente de ATP o ATP unido al dominio ABP
de HSP70 (14). La renaturalización de las proteínas oxidadas, la prevención de la activación de NFB (nuclear factor
kappa B) y la inhibición de la lipo-peroxidación de la membrana, serán todos consecutivos a los efectos de HSP27
sobre la concentración del glutatión25 . Por otra parte, tanto
HSP27 como HSP70 pueden también interferir negativamente en su función de protección (10, 68)
Las proteínas de choque térmico HSP10 y HSP60 constituyen un complejo de “chaperones” mitocondriales, donde HSP10 (localizada en el espacio intermembrana de la
mitocondria) y HSP60 (presente en la matriz mitocondrial),
Arvelo
facilitan la activación de la caspasa-3, que a la vez es facilitada por el citocromo c y dATP en extractos citosólicos74 .
La sobreexpresión de HSP60 y HSP10, en conjunto o individualmente, juegan un papel importante en el mantenimiento de la integridad mitocondrial y la capacidad para
generar ATP en la protección del músculo cardíaco sometido a un proceso de isquemia52 . Análisis hechos por hibridización in situ revelan que los patrones de inducción del
ARNm-HSP60 fueron similares al ARNm-HSP10 en cerebro de rata en el curso de un proceso de isquemia63 .
La expresión de HSP60 se encontró aumentado tanto en
estadio temprano como avanzado en cáncer de próstata
comparado con el tejido normal correspondiente20 .
LA MITOCONDRIA: BLANCO DE LOS EFECTOS PROTECTORES DE LAS HSP
Se ha establecido el papel determinante de la HSP70
citosólica en la calidad proteíca dentro de la mitocondria y
en su correcto funcionamiento, pero sin embargo, parece
lógico atribuir la protección de la función mitocondrial en
primer lugar a las chaperonas intramitocondriales51 . Por
otra parte, utilizando la línea celular premielocítica humana U937, se encontró que el choque térmico protege selectivamente a las mitocondrias con una correlación estrecha entre el grado de protección mitocondrial y la concentración de HSP70. Esta protección fue confirmada en
experimentos in vivo empleando ratas expuestas a choque
térmico previo a una perfusión cardiaca por peróxido de hidrógeno, donde ello provocó aumento en la concentración
de HSP70, pero no de las HSP intramitocondriales69 .
Actualmente se han propuesto tres hipótesis para establecer que la mitocondria es el blanco esencial para la protección inducida contra los oxidantes por la HSP70, sin excluir la participación de otras HSP, esencialmente las HSP
intramitocondriales. Ellas son:
1. Mantenimiento constante de la importación intramitocondrial de proteínas esenciales para la función del
organelo60 .
2. Que los poros de transición de permeabilidad de
la membrana mitocondrial (mitochondrial permeability transition pores, MTP), desempeñarían un papel
determinante en la inducción de la apoptosis por los
RLO. Bajo los efectos de estrés oxidativo, las mitocondrias sufren una transición de permeabilidad, liberan calcio, sufren hinchamiento y un desacoplamiento
de la respiración mitocondrial37 . Los MTP son canales localizados en la membrana interna de las mitocondrias, sensibles a la ciclosporina, que se unen a
las ciclofilinas y que tienen la propiedad de cerrar los
MTP (85, 66). También se sugiere que el efecto antiapoptótico de Bcl-2 está relacionado con el cierre de
los MTP27
3. Se propone que HSP70 acompaña, de manera especifica, algunas proteínas mitocondriales, tal como lo
303
Mitocondria y apoptosis
es el factor de muerte mitocondrial (AIF, apoptosis inducing factor ), previniendo su efecto pro-apoptótico;
uno de estos AIF podría ser el citocromo c71 .
En conclusión podemos decir que las proteínas situadas
en la interfase endosimbionte/hospedador han jugado un
papel fundamental estratégico para permitir el desarrollo
y establecimiento de la endosimbiosis como hecho fundamental para originar la mitocondria, así como para proporcionar las bases de un control de la muerte celular. Así,
en los metazoarios, la MCP se habría desarrollado cuando los efectores mitocondriales de la apoptosis se pudieron conectar a las vías de transducción de señales. Por
otra parte, es necesaria la compresión de los mecanismos
efectores de la apoptosis y el conocimiento del conjunto de
vías implicadas en la regulación para integrar los avances
biológicos, tanto en las estrategias terapéuticas como en
la comprensión de la interdependencia con sistemas biológicos complejos, tales como el ciclo celular, función del
telómero, angiogénesis y sistema inmunológico.
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