acrobat

5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
ACTIVIDAD ANTI-LIPOPEROXIDANTE DE DIVERSOS COMPUESTOS
ANTIOXIDANTES. SU PARTICIPACION EN EL DAÑO HEPATICO.
Patricia Yahuaca-Mendoza, Rosalinda Gutiérrez-Hernández y José Luis Alvarado-Acosta.
Doctorado en Farmacología Médica y Molecular, Facultad de Medicina Humana
Universidad Autónoma de Zacatecas.
E-mail: yahuacap@cantera.reduaz.mx
RESUMEN
Tomando en cuenta que la cirrosis hepática es un tipo de daño hepático crónico y que no
puede mejorar espontáneamente, se requiere el estudio de posibles tratamientos para
conocer esta posibilidad. El siguiente trabajo tiene como objetivo fundamental demostrar el
uso de diferentes antioxidantes que ayuden a prevenir y a reducir el grado de cambios
oxidativos, siempre presentes durante daño hepático tanto agudo como crónico (cirrosis), y
conocer comparativamente su eficacia y su potencia relativa, tanto en modelos in vitro como
in vivo. Fueron estudiados compuestos como Romero (Rosmarinus officinalis), tanto en
extracto total como el principio activo, ácido carnósico obtenidos en nuestro laboratorio, así
como vitamina C, vitamina E, y además lipovitasi (medicamento que contiene carnitina,
metionina, y tiamina). Utilizamos ratas Sprague-Dawley, adultas para los experimentos de
lipoperoxidación (LPox) en homogenado hepático in vitro, y de 80-100 g para propiciar
cirrosis experimental con tetracloruro de carbono (CCl4). De los resultados del modelo in vitro
se eligieron los antioxidantes de mayor efectividad para el tratamiento in vivo. En este último
modelo las ratas se dividieron en varios grupos experimentales: 1) control; 2) cirrosis
hepática; 3) cirrosis hepática más tratamiento (Romero, Lipovitasi); y 4) al que solo se le
administró el fármaco (Romero, Lipovitasi). Al término del tratamiento los animales se
sacrificaron para medir diferentes indicadores, y así conocer la magnitud del daño hepático, y
la proporción del mismo que revirtió después de la administración del tratamiento. Los
resultados que obtuvimos sobre LPox en homogenado de hígado, muestran que el Romero
en mayor proporción, así como el lipovitasi tuvieron efecto protector, ya que encontramos
bajas cantidades de malondialdehído (MDA), incluso por debajo del grupo control. Mientras
que las vitaminas C y E, también disminuyeron parcialmente los niveles de MDA, quedando
todavía por arriba del grupo control. En cuanto al modelo de cirrosis experimental in vivo se
midieron varios indicadores, tales como la estabilidad de membranas de eritrocitos, en la cual
nos dimos cuenta que la mayor estabilidad de las membranas se lograba con lipovitasi,
seguida por el Romero. Se midió lipoperoxidación, tanto en homogenado hepático como en
fracción microsomal, en las cuales el Romero en mayor proporción seguido del lipovitasi
revirtieron el daño en cirrosis. En cuanto a glucógeno, al haber daño, disminuye en gran
medida y al administrar los tratamientos, este daño se revierte en gran medida. La prueba del
DNA, cuando hay daño hepático aumenta la producción de ADN en un intento del hígado de
que haya regeneración de hepatocitos. Se encontró que los tratamientos reducen las
actividades de ALAT y LDH, elevadas en el daño. Finalmente llegamos a la conclusión de
que tanto el Romero como el lipovitasi resultaron ser tratamientos efectivos para la
terapéutica de la cirrosis hepática experimental, sugiriendo que el efecto mostrado sobre la
lipoperoxidación por parte de los derivados del Romero correspondió al de atrapador de
radicales libres
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
INTRODUCCIÓN
El hígado es la víscera de mayor tamaño del organismo que ocupa una posición
fisiológica fundamental; su unidad funcional es el hepatocito, por lo tanto cualquier patología
que afecta al hígado está destruyendo o dañando hepatocitos, manifestándose así la
enfermedad hepática. Este órgano tiene una gran capacidad de regeneración, es decir, tiene
gran reserva funcional, lo cual representa ventajas y desventajas, porque cuando se
presentan síntomas o signos es cuando el hígado ya está muy comprometido (más de un
80% de la masa de hepatocitos); mientras tanto, un porcentaje del hígado sigue trabajando y
cuando deja de hacerlo es cuando la enfermedad hepática en general es grave. El hígado
tiene alrededor de 1500 funciones, por lo que si se altera el funcionamiento del hepatocito, a
pesar de la reserva funcional va a llegar un momento en que alterará todo el organismo.
La patología hepática es muy complicada y amplia; sin embargo tiene una
característica, cualquiera que sea la causa que afecte al hígado siempre evolucionará de la
misma manera. Uno de los agentes etiológicos más frecuente y que más daña al hígado es
el etanol, y lo hace en gran proporción. Otra manera que el hígado enferme es por una
hepatitis viral. El desarrollo tecnológico hace cada vez más frecuente el uso de
medicamentos y productos químicos potencialmente hepatotóxicos. Hoy en día una frecuente
causa de daño hepático fulminante es la intoxicación por paracetamol (y por algunos
antibióticos), por agentes químicos (benceno), bacterias, y hongos. Otras causas menos
frecuentes de daño hepático agudo son la ingesta de hongos silvestres (Amanita phalloides),
necrosis isquémica hepatocelular, síndrome de Budd-Chiari agudo, ligadura quirúrgica de la
arteria hepática, esteatosis aguda del embarazo, Síndrome de Reye.
Las consecuencias fisiopatológicas del daño hepático difieren dependiendo de la
magnitud y el tiempo, pudiendo encontrarse daño agudo que propicia necrosis masiva
(muerte masiva de hepatocitos) originada en la mayoría de los casos por hepatitis viral
aguda, y agentes tóxicos. El daño también puede ser crónico induciendo hepatitis crónica
activa y finalmente cirrosis.
La gran mayoría de los compuestos exógenos que ingresan al organismo sufren una
serie de cambios estructurales mediante diversos procesos de biotransformación. Los
sistemas de detoxificación preferentemente hepáticos, están destinados a conferirles a los
xenobióticos mayor polaridad a fin de facilitar su excreción, al aumentar su polaridad y
hacerlos hidrosolubles.
En el daño hepático agudo y crónico se ha descrito la presencia de radicales libres
(RL). Los radicales libres son cualquier molécula independiente que contiene uno o más
electrones sin aparear, que ocupan una órbita atómica o molecular de forma individual. Se
puede considerar a los radicales libres como fragmentos de moléculas muy reactivas, y en
consecuencia de vida media muy corta. Los RL orgánicos fueron descubiertos por Gomberg
en 1900 y, entonces, se postuló que podían tener alguna función biológica. En 1966, Slater
propuso que el efecto tóxico del tetracloruro de carbono sobre las células del hígado se
producía por una reacción de RL; formuló la teoría de que los RL son responsables de
lesiones en los tejidos.
Los RL se producen en la mayor parte de las células como subproducto del
metabolismo; algunas células producen mayores cantidades con propósitos específicos
como por ejemplo, los macrófagos para la fagocitosis. Los RL más importantes de las células
aerobias (como las células humanas), son el oxígeno, el superóxido, los radicales de
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
hidroxilo, el peróxido de hidrógeno y los metales de transición. Los RL que se forman dentro
de las células pueden oxidar las biomoléculas (en especial los lípidos) y por tanto producir la
muerte celular. Una vez que el RL ha conseguido robar el electrón que necesita para
emparejar su electrón libre, la otra molécula se convierte a su vez en un RL, iniciándose así
un ciclo destructivo para nuestras células. Sin embargo, existen diferentes mecanismos
corporales para proteger a las células de los efectos nocivos de los RL; se trata de enzimas
que descomponen los peróxidos y los metales de transición; otros RL son neutralizados por
proteínas y otras moléculas.
Como ya se ha descrito (Campo, 2001), la hepatotoxicidad inducida por tetracloruro de
carbono (CCl4) es un modelo apropiado para el estudio del daño hepático, ya que origina una
condición de producción de radicales libres, lo cual causa peroxidación lipídica de la
membrana y activación de factores de transcripción que regulan los genes del TNFα y de
otros involucrados en regeneración tisular. El proceso lipoperoxidativo podría modificarse por
algunas condiciones como el shock calórico, y aunque algunas proteínas de shock calórico
(HSP72) no son capaces de prevenir la peroxidación lipídica, pueden reducir la
desnaturalización protéica asociada al proceso (Yamamoto, 2000).
La incapacidad de nuestro cuerpo para neutralizar los RL a los que nos exponemos
diariamente nos obliga a recurrir a substancias con la propiedad de neutralizarlos. Estos
compuestos actúan liberando electrones en nuestra sangre que son captados por los
radicales libres convirtiéndose así en moléculas estables. Los compuestos con esta
capacidad reciben el nombre de antioxidantes y recientes estudios han demostrado que
pueden ser la protección mas eficaz contra el envejecimiento celular y las enfermedades
crónicas y degenerativas. Los antioxidantes neutralizan o inactivan a los RL y previenen el
daño que causan en el interior del cuerpo. Algunos de ellos utilizan un mecanismo como
“atrapadores” de RL.
ANTIOXIDANTES
Los seres humanos necesitan oxígeno para sobrevivir. La hemoglobina conduce el oxígeno
por todo el cuerpo. Gracias a la hemoglobina nuestra sangre puede absorber cincuenta
veces más oxígeno que el agua. El cuerpo utiliza oxígeno para obtener energía de los
alimentos y la suministra a los procesos corporales. A este proceso de conversión de
oxígeno en energía se le denomina oxidación y es esencial para la vida. Los procesos de
oxidación producen RL, que pueden interferir en los procesos bioquímicos normales y dañar
las células corporales.
La naturaleza nos ha provisto de una gran variedad de antioxidantes. Así, se
consideran como un grupo de vitaminas, minerales y enzimas que protegen nuestro cuerpo
de la formación de estos radicales: cuatro enzimas los neutralizan en el organismo
naturalmente y son la superóxido dismutasa, metionina reductasa, catalasa y glutatión
peroxidasa. El cuerpo las produce pero, la acción de estas enzimas, puede ser suplementada
por una dieta rica en antioxidantes como las vitaminas A, E y C, el Selenio, el Zinc, entre
otros nutrientes, así como el uso de otros compuestos que pueden actuar como fármacos
antioxidantes.
Los antioxidantes pueden participar por medio de diferentes mecanismos: deteniendo
la reacción en cadena de oxidación de las grasas; eliminando el oxígeno atrapado o disuelto
en el producto; eliminando las trazas de ciertos metales, como el cobre o el hierro, que
facilitan la oxidación. Los que actúan por los dos primeros mecanismos son los antioxidantes
propiamente dichos, mientras que los que actúan de la tercera forma se agrupan en la
denominación legal de "sinérgicos de antioxidantes", o mas propiamente, agentes quelantes.
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
Los antioxidantes frenan la reacción de oxidación, pero a costa de destruirse ellos mismos. El
resultado es que la utilización de antioxidantes retrasa la alteración oxidativa del proceso,
pero no la evita de una forma definitiva.
Se han descrito acciones de diversos compuestos que generan una acción
antioxidante, protegiendo a estructuras biológicas contra el daño oxidativo en modelos
experimentales, como algunos compuestos extraídos del áloe, como la emodina (Arosio,
2000) o de la Artemisia asiática (Ryu, 1998). Uno de los casos estudiados por nuestro grupo
es el de los componentes del Romero (Rosmarinus officinalis), tanto del extracto total, como
de algunos principios activos aislados de la planta (Sotelo, 2001 y Yahuaca, 2001). Se ha
descrito que el extracto acuoso modifica el curso de la cirrosis experimental, revirtiendo y
previniendo las alteraciones en los indicadores bioquímicos medidos. Por otra parte también
se sabe que ciertos preparados comerciales de Romero (vg: Herbalox) ya son utilizados
como conservadores de alimentos, particularmente en carnes para su empacamiento y
conservación a largo plazo.
La colchicina es un fármaco que sin estar clasificado como un antioxidante, ha
mostrado tener efectos benéficos en las alteraciones producidas en el daño hepático
experimental, propiciando cambios a nivel de membranas plasmáticas con la consecuente
recuperación de funcionalidad celular. Algunas vitaminas como la C y la E son probados
agentes antioxidantes que evitan los cambios oxidativos, protegiendo estructuras biológicas,
facilitando procesos bioquímicos y evitando el deterioro y envejecimiento celular. Sin
embargo la vit E, no es capaz de evitar algunos eventos oxidativos, como la hepatotoxicidad
aguda por CCl4 (Campo, 2001). Por otra parte existen otros preparados que pueden también
utilizarse en esquemas terapéuticos con la finalidad de su efecto antioxidante. Uno de estos
preparados es el Lipovitasi, medicamento que contiene los compuestos lipotrópicos:
carnitina, tiamina, metionina y que se ha indicado en casos de esteatosis hepática, hepatitis
tóxica, con o sin ascitis, insuficiencia hepática e hígado graso en diabéticos (reduce
rápidamente el índice ictérico). Se ha descrito que este medicamento favorece la síntesis
proteica (orotato de Carnitina) el trasporte y oxidación de los ácidos grasos (metionina) y
oxidación por los ácidos pirúvicos y alfa- cetoglutámico (tiamina), eliminando la sobrecarga
de grasa hepática. La carnitina en pruebas de laboratorio y en clínica humana ha dado
muestras de desarrollar una intensa acción lipotrópica y hepatoprotectora de células
hepáticas (Chanda, 1994, y )
JUSTIFICACIÓN
Las enfermedades metabólicas del hígado comprenden un grupo heterogéneo de
enfermedades en las que se produce una alteración de la función hepática en relación con un
trastorno bioquímico, generalmente asociado a un proceso oxidativo. En el caso de la
cirrosis, aunque se han utilizado algunos tratamientos, no ha sido posible revertir el daño por
completo, por lo que la investigación debe continuar en busca de alternativas terapéuticas.
En la actualidad existen suficientes datos epidemiológicos, clínicos y experimentales que
permiten afirmar que los antioxidantes al atrapar o inactivar RL tienen capacidad reguladora y
moduladora de reacciones que hasta cierto punto limitan la funcionalidad de las células. Esto
significa que es necesario adquirir mayor conocimiento acerca de los efectos de distintos
antioxidantes en los procesos oxidativos y estudiar comparativamente cuáles de éstos
compuestos son capaces de modificar el curso del daño hepático crónico como lo es la
cirrosis. En esta investigación, se estudiará el efecto de antioxidantes en tejido hepático in
vitro, con la finalidad de conocer el de mayor efectividad. Posteriormente es conveniente
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
estudiar comparativamente el efecto de dichos antioxidantes efectivos, en un modelo de
cirrosis experimental.
HIPÓTESIS
Los antioxidantes que reduzcan la lipoperoxidación por CCl4 en homogenados de hígado
serán capaces de producir mejoría en las alteraciones del proceso de cirrosis hepática
experimental.
OBJETIVOS
v Determinar la actividad anti-lipoperoxidante de varios antioxidantes en homogenados
hepáticos en presencia de CCL4 (in vitro).
v Determinar el grado de reversión del daño hepático en cirrosis experimental, con los
antioxidantes de mejor respuesta en el modelo in vitro.
DISEÑO EXPERIMENTAL
Se realizó en dos fases. En la primera (Fase I) se llevó a cabo un estudio in vitro en
homogenado hepático de ratas normales sobre el cual se propició una alteración oxidativa
con tetracloruro de carbono (CCl4). En este modelo se probaron 5 distintos antioxidantes:
Romero (obtenido por extracto metanólico total, en nuestro laboratorio), ácido carnósico
(aislado de hojas de R. officinalis), vitamina E, vitamina C y el preparado Lipovitasi
(combinación de carnitina 300 mg, tiamina, 25 mg y metionina, 25 mg), donado por
Laboratorios , para conocer su efecto comparativo.
La Fase II del estudio correspondió a probar el efecto del Romero y del lipovitasi en un
modelo de cirrosis hepática experimental. Para esto se utilizaron ratas Sprague-Dawley, con
un peso inicial de alrededor de 80 g, mantenidas en condiciones estándar de bioterio, con
agua y dieta ad libitum. Las ratas fueron divididas en 6 grupos: control; cirróticas (con CCl4
en dosis de 0.4 g/Kg de peso por vía .IP., tres veces a la semana, durante 8 semanas);
cirrótico con tratamiento de lipovitasi (se propició el daño con CCl4 en forma similar al grupo
anterior y además recibieron tratamiento de lipovitasi en dosis proporcional a 30 mg/Kg de
carnitina), diariamente durante 4 semanas; control de lipovitasi; cirrótico con tratamiento de
Romero diariamente durante 4 semanas; y control de Romero
Al término de los tratamientos se anestesian los animales en cámara de éter para ser
sacrificados y obtener muestras de sangre e hígados en donde se midieron los indicadores
de daño hepático.
METODOLOGÍA
Fase I. Grado de lipoperoxidación por la técnica de ácido tiobarbitúrico (Método de
Uchiyama). Se utilizaron ratas Sprague-Dawley adultas (peso aproximado de 200 g), las que
se anestesiaron (en atmósfera de éter), para después de intervenirlas quirúrgicamente, y así
realizar una perfusión hepática, vía la vena porta, con buffer fosfato de potasio 0.2 M, pH 7.4;
el procedimiento se realiza con buffer helado, mediante una bomba de infusión continua a
una velocidad de 4.1 mL/min. Se extrae el hígado, se prepara un homogenado al 10 % en
KCL al 1.15 %, eliminando los restos de tejido conectivo. En vasos de precipitados se
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
colocan 10 mL de homogenado hepático, agitando continuamente durante 1 hora, a
temperatura ambiente y muestreando alícuotas de 0.5 mL cada 10 minutos (se tapa el vaso
con papel parafilm para evitar evaporación). De todos los vasos se tomaron alícuotas a t = 0
para medición de la condición control inicial. Para el esquema experimental se hicieron nueve
grupos de la siguiente forma:
GRUPO 1: Control ( C ). Sin adición de substancias.
GRUPO 2 : Tetracloruro de carbono (CCl4) 100 µL
GRUPO 3: Vitamina E (Vit E) 100 µL + CCl4 100 µL
GRUPO 4: Romero ( R ) 100 µL + CCl4 100 µL
GRUPO 5: Vitamina C (vit C)100 µL + CCl4 100 µL
GRUPO 6: Lipovitasi 100 µL + CCl4 100 µL
GRUPO 8: Ácido Carnósico 100 µL + CCl4 100 µL
Las alícuotas que se tomaron nos sirvieron para determinar el grado de lipoperoxidación en
función del malondialdehído (MDA) producido, el cual reaccionó con el ácido tiobarbitúrico.
Todas las muestras se tomaron a temperatura ambiente de 24ºC. Los resultados se
expresaron en µg de MDA/g de hígado.
Fase II. Al término de los tratamiento y administraciones de tóxico, se anestesiaron las ratas
en atmósfera de éter, para realizar una intervención quirúrgica, y obtener sangre por punción
cardíaca, además de realizar una perfusión hepática vía vena porta con buffer fosfato de
sodio 0.2 M pH 7.4, helado. La salida de la perfusión se llevó a cabo por la vena cava inferior.
La sangre se utilizó para la medición de actividades enzimáticas de alanina aminotransferasa
(ALAT) y deshidrogenasa láctica (LDH) y para evaluar la estabilidad de membranas
plasmáticas de eritrocitos. Del hígado prefundido se tomaron muestras para medir el grado
de lipoperoxidación por el método del ácido tiobarbitúrico, en homogenado total y en fracción
microsomal; contenido de glucógeno hepático, como indicador metabólico, por el método de
la antrona; cuantificación de DNA por método colorimétrico con difenilamina, como un
indicador indirecto de replicación hepática.
Los resultados fueron evaluados por estadísticamente por un método de análisis de
varianza y de diferencia mínima significativa honesta o de Tukey.
RESULTADOS
En los modelos experimentales utilizados fue posible constatar el efecto de las distintas
substancias antioxidantes que potencialmente pueden favorecer la recuperación del hígado
en el caso de un daño crónico. Los resultados obtenidos se muestran en las dos fases
experimentales descritas en el Diseño Experimental.
FASE I. EFECTO ANTIOXIDANTE IN VITRO. En la figura 1 se muestran los resultados
obtenidos al medir el grado de peroxidación lipídica (LPox) en los homogenados de hígado
de rata in vitro. En la gráfica se observa que al adicionar CCl4 la LPox incrementó
importantemente, alrededor de un 114 % con respecto al control (p<0.05), desde los
primeros 10 minutos de experimentación, hasta llegar a aproximadamente un 180 % a los 60
minutos. También se muestra, en general, que la adición de los antioxidantes utilizados
previene la oxidación producida por el tetracloruro de carbono, siendo muy efectivo el
extracto de Romero, que impidió el incremento en el MDA que se produce en presencia de
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
CCl4, obteniéndose valores que desde un principio se mantuvieron incluso por abajo de lo
observado para el control. La misma situación ocurrió para el ácido carnósico que mostró
actividad anti-lipoperoxidante similar a la del extracto total del Romero, lo cual sugiere que
podría ser el ácido carnósico el principio activo responsable del efecto observado. La
vitamina E por su parte, aunque previno el incremento en MDA que produjo el CCl4, a la
dosis empleada, no fue capaz de reducir los niveles de MDA producidos, manteniéndose
siempre por arriba de los valores de control. Estos resultados sugieren una mayor potencia
anti-lipoperoxidante por parte de los derivados del Romero.
[ ] µg MDA / g Hígado
0.45
0.3
0.15
0
0
*
20
40
60
TIEMPO (min)
C O N T R O L
CCl4
C A R N O S I C O
R O M E R O
VIT E
Figura 1. Medición del grado de lipoperoxidación producido por CCl4, en homogenado de
hígado de rata. Los valores representan la cantidad de MDA producida y que reaccionó
con ácido tiobarbitúrico. Cada punto es el promedio de 5 ± 1 experimentos. * p<0.05
Cuando se probó el efecto de la vitamina C y la vitamina E (figura 2), la cantidad
encontrada de MDA fue mayor que la del control, pero menor que la de tetracloruro de
carbono, a los 10 minutos. Para la vitamina C hubo un decremento posterior, para finalmente
quedar en el rango de valores del control. En el caso de vitamina E, a pesar de que los
valores siempre se encontraron por arriba del control, esta diferencia fue solo de
recuperación parcial. También en la figura 2 se observa que en el caso del homogenado con
tratamiento de lipovitasi sobre el daño producido por el CCl4, los valores de MDA aunque al
inicio incrementan en forma discreta (diferencia no significativa), posteriormente disminuyen
notablemente, observándose valores que están incluso por debajo del grupo control. Como
puede apreciarse, el Romero disminuyó notablemente los valores de MDA, lo que
comparativamente muestra que el lipovitasi mantiene una acción anti-lipoperoxidante muy
semejante a la del extracto con una tendencia de reducción de la acción oxidante del
tetracloruro de carbono.
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
MDA µg/g de hígado
0.45
0.3
0.15
0
0
20
CONTROL
CCl4
40
VIT C
VIT E
ROMERO
60
LIPOVITASI
Figura 2. Medición del grado de lipoperoxidación producido por CCl4, en homogenado de
hígado de rata. Los valores representan la cantidad de MDA producida y que reaccionó
con ácido tiobarbitúrico. Cada punto es el promedio de 5 ± 1 experimentos. * p<0.05
Estos resultados nos sugieren, para el lipovitasi, un efecto antioxidante casi tan
potente como el observado con Romero, que ha mostrado ser efectivo en el tratamiento de la
cirrosis experimental. Por lo tanto fue conveniente probar ambos compuestos en el citado
modelo. El probable mecanismo pudiera ser como atrapador de radicales libres.
FASE II. Efecto antioxidante en cirrosis hepática experimental
Estabilización de membranas de eritrocitos
En la figura 3 se muestran los resultados obtenidos al medir el grado de estabilización de
membranas en eritrocitos de la sangre de ratas que participaron en el modelo experimental
de cirrosis hepática, expresado como porcentaje de protección contra su control. En la
gráfica se observa que en eritrocitos de ratas cirróticas, la estabilidad de las membranas
disminuye debido a la ruptura de eritrocitos y la liberación de hemoglobina, dado por la nula
protección de parte de algún fármaco antioxidante. Este deterioro se presenta en alrededor
del 90 %. En la misma gráfica se muestra que en el caso de las ratas cirróticas con
tratamiento de lipovitasi, la estabilidad de membranas aumentó hasta en un 60% en
comparación con el grupo de CCl4, mientras que en los grupos de Lipovitasi y de Romero
solos, la protección se encontró muy cercana a los valores de control. Cuando los animales
cirróticos recibieron Romero, también se observó una protección parcial de alrededor de
50 %, lo cual representa una mejoría con respecto a lo observado en cirrosis. Estos
resultados nos sugieren que los tratamientos con ambos antioxidantes promueven la
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
estabilidad de las membranas plasmáticas contra el deterioro oxidativo presente en el daño
hepático.
100
% de Protección
75
50
25
*
0
CONTROL
CCL4
CCl4+LV
CCl4+R
LV
R
Figura 3. Estabilización de membranas de eritrocitos de rata, medido como % de
protección. Cada barra representa el promedio de valores de 5 experimentos ± desviación
estándar. * p<0.05
Lipoperoxidación en homogenado hepático:
En la figura 4 se muestran los resultados obtenidos al medir el grado de lipoperoxidación en
homogenado de hígados de ratas. En la gráfica se observa que en el hígado de animales
cirróticos, el grado de lipoperoxidación incrementó en un 35% por arriba del control, mientras
que en el caso del grupo de ratas cirróticas con tratamiento se encuentra aproximadamente
un 5% arriba del control y en el caso del grupo de no cirróticas pero con medicamento, es
decir el grupo de lipovitasi esta un poco por debajo del control.
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
MDA µg/g de hígado
PEROXIDACION LIPIDICA EN HOMOGENADO HEPATICO
10
7.5
5
2.5
0
CONTROL
CCl4
CCl4+LV
CCl4+R
LV
R
Grupos de tratamiento
Figura 4. Peroxidación lipídica en homogenado de hígado de ratas del modelo de cirrosis
experimental.
Lipoperoxidación en fracción microsomal:
En la figura 5 se muestran los resultados obtenidos al medir el grado de lipoperoxidación en
fracción microsomal de hígados de ratas. En la gráfica se observa que al adicionar CCl4 el
grado de lipoperoxidación esta por arriba en un 15% por arriba del control, mientras que en el
caso del grupo de ratas cirróticas con tratamiento se encuentra arriba del control, en este
caso no es muy notorio y en el caso del grupo de no cirróticas pero con medicamento, es
decir el grupo de lipovitasi es más notorio que se encuentra por debajo del control.
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
LIPOPEROXIDACION EN FRACCION MICROSOMAL
MDA µg/g de hígado
1
0.75
0.5
0.25
0
CONTROL
CCL4
CCL4+LV
CCL4+LV
LV
R
Figura 5. Peroxidación lipídica en fracción microsomal de hígado de rata en cirrosis
experimental.
Glucógeno hepático
En la figura 6 se muestran los resultados obtenidos al medir el glucógeno hepático de
hígado de rata. En la gráfica se observa que al adicionar CCl4 el glucógeno disminuye a
más de 80%, y en el caso de las ratas cirróticas con tratamiento de Romero el nivel de
glucógeno aumentó, encontrándose por debajo del control, al igual que en el grupo de
Lipovitasi que estuvo en el rango de valores del grupo control.
GLUCOGENO HEPATICO
mg/g de hígado
8
6
4
2
0
CONTROL
CCL4
CCL4+LV
CCL4+R
LV
R
Figura 6. Contenido de glucógeno hepático de las ratas en tratamiento durante la cirrosis.
Cuantificación de AND (DNA)
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
En la figura 7 se observa que el DNA hepático aumentó considerablemente en el grupo
cirrótico esto se debe a que cuando hay algún daño hepático el hígado trata de regenerarse
produciendo mayor cantidad de DNA, pero como el daño es persistente no lo logra sin algún
tratamiento. Por otro lado también vemos que en el caso de los grupos de ratas cirróticas con
tratamiento el DNA también presentó un incremento relativo con respecto al control,
sugiriendo que se mantiene la condición deseable de regeneración, pero en este caso,
aunado al efecto anti-lipoperoxidante que propicia mejoría en el estado de salud de los
animales tratados, según lo muestran los indicadores ya descritos.
DNA EN HIGADO DE RATA
µ g/g de hígado
1750
1400
1050
700
350
0
CONTROL
CCL4
CCL4+LV
CCL4+R
LV
R
Figura 7. Cuantificación del contenido total de DNA en hígado de rata.
Alanina aminotransferasa (ALAT).
En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos al medir la actividad de la enzima alanina
aminotransferasa (transaminasa glutámico pirúvica) en suero de ratas. En la gráfica se
observa que la actividad sérica de esta enzima en animales cirróticos, aumenta en un 40%
por arriba del control, mientras que en el caso del grupo de ratas cirróticas con tratamiento de
lipovitasi se encuentra sobre el control solo en un 20%, lo mismo que el grupo cirrótico
tratado con Romero. Los grupos control de fármaco no mostraron diferencias significativas
contra el control
Tabla 1
ALAT (U/L)
LDH (U/L)
CONTROL
CCL
CCL4+LV
LV
CCl4 + R
R
31.3 ± 3.5
55.6 ± 4.2
48.3 ± 15.0
36 0 ± 7.0
38.0 ± 6.9
30.5 ± 7.0
CONTROL
CCL4
CCL4+LV
LV
CCl4 + R
R
770.12 ± 199.0
1319.51 ± 283.0
957.93 ± 170.4
407.78 ± 70.1
738.00 ± 126.9
730.50 ± 117.0
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
Lactato deshidrogenasa (LDH)
También en la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos al medir la actividad de la enzima
Lactato deshidrogenasa. En la gráfica se observa que en animales cirróticos, la actividad de
esta enzima incrementa hasta en un 40% por arriba del control, mientras que en el caso del
grupo de ratas cirróticas con tratamiento se encuentra muy cercana a los valores de control,
tanto en el grupo de lipovitasi como para el de Romero. Nuevamente los valores de actividad
obtenidos para los controles de fármaco solo no son diferentes estadísticamente de los del
control general.
CONCLUSIONES
Por medio de los estudios que nosotros realizamos además de todos los indicadores que
medimos mencionados anteriormente, pudimos comprobar que tanto el Romero como el
Lipovitasi son compuestos que brindan buen apoyo terapéutico en el caso del modelo
experimental, pues pudo revertir en buen grado la cirrosis hepática.
En nuestro estudio en ratas in vitro, al comparar la eficacia de distintos antioxidantes,
pudimos comprobar que tanto el lipovitasi, que es capaz de contrarrestar la acción oxidante
del tóxico utilizado, como también el Romero, que es un compuesto del cual ya se tienen
estudios previos, son una buena elección para revertir en buena medida el daño producido
por tetracloruro de carbono. El extracto total de la planta del Romero presentó acción
antioxidante en el modelo de lipoperoxidación en homogenado de hígado de rata normal. El
principio activo, ácido carnósico, aislado del Romero, también presentó efecto antioxidante
en el modelo de lipoperoxidación, de igual manera que el extracto total,
También comprobamos que la vitamina E y la vitamina C, tienen efectos sobre el daño
producido por la cirrosis hepática, sin embargo, su eficacia es mucho menor (a la dosis
utilizada) que lo que pudimos comprobar con Romero y lipovitasi.
En cuanto al modelo experimental de cirrosis hepática in vivo, y después de haber medido
una serie de indicadores ya mencionados, y en base a los resultados de estos mismos,
llegamos a la conclusión que en todas estas pruebas tanto el Romero como el lipovitasi
resultaron ser tratamientos efectivos para la terapéutica de la cirrosis hepática experimental.
Por lo observado se sugiere que el efecto mostrado sobre la lipoperoxidación por parte de los
derivados del Romero correspondió al de atrapador de radicales libres
ALUMNOS PARTICIPANTES EN EL PROYECTO
Alfonso S.E. Macías-Castro, Carla S. Padilla-Arellano, Wendolyne DR. Ramos-Garza, María
G. Torres-Mireles y Mario A. Velázquez-Sandoval
REFERENCIAS
1. Aqel MB.: Relaxant effect of the volatile oil of Rosmarinus officinalis on tracheal smooth muscle.
Journal of Ethnopharmacology, 1991, 33 pp 57-62.
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
2. Arosio B, Gagliano N, Fusaro LM, Parmeggiani L, Tagliabue J, Galetti P, De Castri D, Moscheni C,
Annoni G: Aloe-Emodin quinone pretreatment reduces acute liver injury induced by carbon
tetrachloride. Pharmacol Toxicol 2000 Nov;87(5):229-33
3. Blaha V, Simek J: [Development of metabolic parameters in the early phases of liver
regeneration]. Sb Ved Pr Lek Fak Karlovy Univerzity Hradci Kralove Suppl 1995;38(1):37-55
4. Campo GM, Squadrito F, Ceccarelli S, Calo M, Avenoso A, Campo S, Squadrito G, Altavilla D:
Reduction of carbon tetrachloride-induced rat liver injury by IRFI 042, a novel dual vitamin E-like
antioxidant. Free Radic Res; 2001 Apr. 34(4):379-93.
5. Chanda S, Mehendale M: Role of nutritional fatty acid and L-carnitine in the final outcome
of thioacetamide hepatotoxicity. FASEB J 1994 Oct;8(13):1061-8
6. Chen Q, Shi H and Ho ChT: Effects of Rosemary extracts and major constituents on lipoxidation
and soybean lipoxigenase activity. JACOS; 1992, 69(10):999-1002.
7. Halim AB, el-Ahmady O, Hassab-Allah S, Abdel-Galil F, Hafez Y, Darwish A: Biochemical effect of
antioxidants on lipids and liver function in experimentally-induced liver damage. Ann Clin Biochem
1997 Nov 34 ( Pt 6):656-63
8. Halliwell B. Gutteridge JMC. Free radicals in biology and medicine 2nd ed. Oxford. Clarendon
Press. 1989.
9. Hoefler C, Fleurentin J, Mortier F, Pelt JM and Guillemain J.: Comparative Choleretic and
Hepatoprotective properties of young sprouts and total plant extracs of Rosmarinus officinalis in
rats. Jounal of Ethnopharmacology. 1987, 19, pp,133-143.
10. Inatani R, Nakarani N and Fuwa H: Antioxidant effect of the constituents of rosemary (Rosmarinus
officinalis L.) and their derivatives. Agric Biol Chem, 1983; 47:521-528.
11. Joyeux M, Rolland A, Fleurentin J, Mortier F and Dorfman P: Tert-Butyl Hydroperoxide-Induced
Injury in Isolated Rat Hepatocytes: A Model for Studing Antihepatotoxic Crude Drug. Planta
Medica, 1990; 56: 171-174.
12. Mourelle M, Yahuaca P, and M Rojkind: Ca++ and [Na+, K+] liver ATPases decrease after
treatment with CCl4. Hepatology 3(5):815, 1983.
13. Muriel P: Nitric oxide protection of rat liver from lipid peroxidation, collagen accumulation, and liver
damage induced by carbon tetrachloride. Biochem Pharmacol 1998 Sep 15;56(6):773-9
14. Ohta Y, Sasaki E, Nishida K, Hayashi T, Nagata M, Ishiguro I : Preventive effect of oren-gedoku-to
(huanglian-jie-du-tang) extract on progression of carbon tetrachloride-induced acute liver injury in
rats. Am J Chin Med 1997 25:57-68
15. PLM, Diccionario de Especialidades Farmacéuticas, 46a edición, 2000.
16. Ryu BK, Ahn BO, Oh TY, Kim SH, Kim WB, Lee EB: Studies on protective effect of DA-9601,
Artemisia asiatica extract, on acetaminophen- and CCl4-induced liver damage in rats. Arch Pharm
Res 1998 Oct;21(5):508-13
17. Singletary KW and Nelshoppen JM.: Inhibition of 7,12-dimethylbenz (a) anthracene (DMBA)induced mammary tumorigenesis and of in vivo formation of mammary DMBA-DNA adducts by
rosemary extract. Cancer Letters, 1991, 60, pp, 169-175.
18. Sotelo JI, Martínez-Fong D, Muriel P, Santillán RL, Castillo D and Yahuaca P: Evaluation of the
effectiveness of Rosmarinus officinalis L. (Lamiaceae) in the alleviation of carbon tetrachlorideinduced acute hepatotoxicity in the rat. J. Ethnopharmacology; En prensa, 2001.
19. Sundari PN, G W, Ramakrishna B : Does oxidative protein damage play a role in the pathogenesis
of carbon tetrachloride-induced liver injury in the rat? Biochim Biophys Acta 1997, 1362:169-76
20. Trease GE and Evans WC: Tratado de Farmacognosia. 12ª.edición. Editorial Interamericana.
México, 1987.
21. Waters WA: The Chemistry of Free Radicals, Oxford Univ. Press, Londres, 1948.
22. Yahuaca P, Alvarez MC and Alvarado JL: Rosemary (Rosmarinus officinalis) effects in
experimental CCl4-induced liver cirrhosis in rats. Planta Medica; Enviado, 2001.
23. Yahuaca P, Amaya A, Rojkind M and Mourelle M: Cryptic ATPase activities in plasma membrane
of CCl4 cirrhotic rats. Its modulation by changes in cholesterol/phospholipids ratios. Laboratory
Investigation, 53(5):541-545, 1985.
5as Jornadas de Investigación
Universidad Autónoma de Zacatecas
25 al 29 de Junio del 2001
Trabajo: BIO/UMH-04/019
24. Yahuaca-Mendoza Patricia y Alvarado-Acosta José Luis: Uso clínico de colchicina y propranolol
en la cirrosis hepática alcohólica. Investigación Científica. 1 (4):52-58; 1993.
25. Yahuaca-Mendoza Patricia y Mourelle-Mancini Marisabel: Efecto del propranolol y la colchicina en
la cirrosis hepática experimental. Revista Médica ISSSTE Zacatecas. 2(3):53-56, 1991.
26. Yamamoto H, Yamamoto Y, Yamagami K, Kume M, Kimoto S, Toyokuni S, Uchida K, Fukumoto
M, Yamaoka Y: Heat-shock preconditioning reduces oxidative protein denaturation and
ameliorates liver injury by carbon tetrachloride in rats. Res Exp Med (Berl) 2000 Jun;199(6):309-18
27. Yoon S, Maruyama Y, Kazusaka A, Fujita S: Accumulation of diacylglycerol induced by CCl4derived radicals in rat liver membrane and its inhibition with radical trapping reagent--FT-IR
spectroscopic and HPLC chromatographic observations. Jpn J Vet Res 2000 Feb 47:135-44
28. Zhu W, Fung PC: The roles played by crucial free radicals like lipid free radicals, nitric oxide, and
enzymes NOS and NADPH in CCl(4)-induced acute liver injury of mice. Free Radic Biol Med 2000
Nov 29:870-80