PEPTIDOS NATRIURETICOS DRA. BIBIANA FABRE Docente de Bioquímica Clínica I, Área Endocrinología. FFyB. UBA. Especialista en Bioquímica Clínica, Área Endocrinología. FFyB. UBA Especialista en Bioquímica Clínica, Área Gestión de Calidad y Auditoria. FFyB. UBA brfabre2000@yahoo.com.ar Antecedentes 1954 Gauer y col. presencia de gránulos densos en células miocárdicas de aurículas. 1961 Wardener y col postulan la existencia de una hormona natriurética, inhibidora de la Na-K-ATPasa renal. 1964 se demostró que los gránulos almacenaban una mezcla de polipéptidos de carácter básico. 1974 Linden y col. efecto diurético por distensión de la aurícula derecha era debido a la inhibición refleja vagal de nervios renales. 1976 Marie y Guillemot cambios en la ingesta de sodio y agua modificaban el numero de gránulos en los cardiocitos. 1980 Bold y col. separan las aurículas de un grupo de ratas. Extrajeron el contenido de los gránulos inyectando el extracto a un segundo grupo de ratas causando una brusca natriuresis y diuresis. No se produce el mismo efecto al inyectar extractos ventriculares. Extractos auriculares contenían un factor responsable de estos efectos al que denominaron FACTOR NATRIURETICO ATRIAL (FNA) Clasificación ANP (factor natriurético atrial) BNP (péptido natriurético tipo B) CNP (péptido natriurético tipo C) Cardionatrina, atripeptina, auriculina, péptido natriuretico auricular TNP Urodilatina Saldarriaga Giraldo y col. Medicina & Laboratorio 2011; 17:127-144 ORIGEN Saldarriaga Giraldo y col. Medicina & Laboratorio 2011; 17:127-144 PROHORMONA ANP URODILATINA BNP CNP DNP TNP Forssmann et al, Histochem Cell Biol, 1998. Estructura y Composición química Saldarriaga Giraldo y col. Medicina & Laboratorio 2011; 17:127-144 PRODUCCIÓN DE ANP AD VD Venugopal J., J Clin Pharm Ther, 2001. AI VI BNP ANP Prohormona 108 aa Prohormona 126 aa Serino proteasa COOH 99-126aa ANP endoproteasa NH2 1-98aa proANP ACTIVO COOH 77-108aa BNP ACTIVO VM=2-5 min 1-30aa PNLD 31-67 79-98 PV PK NH2 1-76aa proBNP SINTESIS Potter LR et al, Handb Exp Pharmacol, 2009 ANP BNP CNP AURICULAS VENTRICULOS HUESO VENTRICULOS AURICULAS CEREBRO RIÑON CEREBRO ENDOTELIO TEJ ADIPOSO CEREBRO (HIPOTALAMO, SEPTUM) CORAZON BNP glicosilacion RECEPTORES DE PÉPTIDOS NATRIURÉTICOS G-protein-gated inwardly rectifying KC (GIRK) channels Ahluwalia and Hobbs, Trends in Pharmacological Science, 2005. DEGRADACIÓN DE PÉPTIDOS NATRIURÉTICOS Potter LR, FEBS J, 2011. NEP= neprilysin IDE= insulin degrading enzyme MECANISMOS QUE REGULAN LA SÍNTESIS Y LIBERACIÓN DE ANP Y BNP CARDÍACOS Estímulo mecánico Estiramiento de la pared auricular Hipoxia Estímulos neuro-endócrinos noradrenalina adrenalina angiotensina II (AT1) endotelina I vasopresina citoquinas PN centrales EFECTOS FISIOLÓGICOS DE ANP Y BNP Carga Sanchez Sanchez y col. Quimica Clinica 2004; 23 (6) 410-416 FACTORES DERIVADOS DEL ENDOTELIO EDHF: FACTOR HIPERPOLARIZANTE DEL ENDOTELIO Ahluwalia and Hobbs, Trends in Pharmacological Science, 2005. CNP y crecimiento (condrocitos) ANP Y BNP EN INSUFICIENCIA CARDÍACA CONTROLES, NYHA CLASS I-IV E IR PRE Y POST DIÁLISIS Clerico et al, Horm Metab Res, 1999. ´LVEF vs. ANF Y BNP PLASMÁTICOS INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO HTA E HIPERTROFIA VENTRICULAR IZQ, HT PULMONAR ANP BNP (12-14 HS) ANP y BNP BNP > HVI concéntrica BNP ANP INSUFICIENCIA CARDÍACA Nishikimi T. et al, Heart, 2010 proBNP-108/BNP-32 ACCIÓN DE LOS PÉPTIDOS NATRIURÉTICOS EN TEJIDO ADIPOSO PERILIPINA Langin D., Pharmacol Res, 2006. Schlueter N., Pharm Ther, 2014 ANF EN PATOLOGÍAS ENDÓCRINAS Hipertiroidismo ANP y BNP (Kato et al, 2009) Hipotiroidismo ANP y BNP (Polak et al, 2007) Aldosteronismo 1º ANP y BNP (Kato et al, 2005; Jakubik et al, 2006) Tumores carcinoides Embarazo Mujeres vs Hombres Nt-proBNP (Zuetenhorst et al, 2004; Bhattacharyya, 2008) Nt-proBNP (Franz et al, 2009) ANF EN PATOLOGÍAS ENDÓCRINAS Diabetes mellitus y síndrome metabólico ANP y BNP (Magnusson et al, 2012) Acromegalia Nt-proBNP (Verhelst J. et al, 2013) SIADH ANP y BNP (Costa K et al, 2009) Testosterona Correlación inversa con BNP y NtproBNP (Chang et al, 2007) LABORATORIO: PREANALITICA FN OBTENCION DE LA MUESTRA: VENAS, ARTERIAS, CAPILARES. EN CUALQUIER MOMENTO DEL DIA. POSTURA: EXTRACCION EN CUALQUIER POSICION. TIPO DE ESPECIMEN: SUERO O PLASMA (EDTA, HEPARINA) CALIDAD DE MUESTRA: HEMOLISIS Y LIPOLISIS PUEDEN CAUSAR ERRORES EN SU MEDIDA. ESTABILIDAD: DEGRADADOS IN VIVO EN INVITRO POR PROTEASAS. TRAS LA CENTRIFUGACION DEBE SER PROCESADO E INMEDIATAMENTE ALMACENADO A -20°c. BNP, NT-proBNP Y NT-proANP, SON ESTABLES A TEMPERATURA AMBIENTE. FACTORES QUE AFECTAN SU CONCENTRACION -INGESTA RICA EN SODIO (DUPLICAR LA CONCENTRACION) -EJERCICIO INTENSO -EDAD 3-5 VECES MAS ALTA EN MAYORES DE 75 AÑOS, -SEXO FEMENINO VALORES SUPERIORES METODOLOGIAS proANP (1-126) (gránulos) corina (serina proteasa) Nt proANP (1-30) = LANP EIA Nt proANP (31-67)=VDP EIA Nt proANP (79-98)= KP Nt proANP (1-98) ELISA, IRMA proBNP (1-108) (ventrículos) Ruskoaho H., Endocrine Rev, 2003. Ichiki T., Adv Clin Chem 2013 Nt proANP (1-98) ELISA, IRMA ANP 28 (99-126, 2-5 min) furina (endoproteasa) Nt proBNP (1-76) RIA, EIA, ECLIA BNP 32 (77-108, 22 min.) IRMA, RIA, MEIA,Triage® RIA ANP y BNP Preparación de la muestra Depuración de la muestra (filtro químico) Enriquecimiento de trazas (concentración de la muestra) Fraccionamiento de componentes (gradientes) Cartuchos SEP-PAK Liofilización del extracto Reconstitución con buffer RIA Sarda et al, Clin Biochem, 1989. Togashi et al, FEBS Lett, 1989 ELISA proANP (1-98), BNP (8-29), Nt-proCNP Ac antiFc de oveja adsorbido en wells + Ac de captura (específico) anti proANP, BNP o Nt-proCNP (cantidad limitada) Lavado + streptavidina conjugada con peroxidasa 18-24 horas, 4ºC 20 min. T amb 5 horas T amb. Reacción de color Biomedica Gruppe, 2009. Website: www.bmgrp.com Péptido ? de Standards o muestras + Trazador biotinilado (cl) 1 hora, 37ºC Unión del conjugado a biotina + Lavado + sustrato (TMB) Triage® BNP Test Sangre en “sample port” con filtro que separa GR de plasma. Incubación 15 min. Biosite Diagnostics, 2001. Website: www.biosite.com En cámara de reacción plasma + Ac murino anti-BNP marcado con colorante fluorescente unido a fase sólida [BNP] proporcional a fluorescencia detectada en Triage® Meter ¡¡MUCHAS GRACIAS!! REGULACION DE LA SECRECION Liberados en condiciones basales por el corazón (ANP y BNP), pero estímulos neuroendocrinos aumentan su liberación. Uno de los mecanismos fisiológicos que promueven la liberación ANP, tanto in vivo como in vitro, es el estiramiento del músculo atrial. Glucocorticoides, acetilcolina, vasopresina, adrenalina, endotelina, oxido nítrico, estimulan su secreción. Péptido natriurético atrial (ANP) Es un péptido de 28 aminoácidos producido en los miocitos auriculares. Se deriva de un precursor de 151 aminoácidos, el pre-proANP. Se almacena en gránulos en las aurículas como una pro-hormona, el proANP, de 126 aminoácidos, que al ser liberado es fraccionado por una proteasa de serina, la corina, produciéndose así los fragmentos N-terminal y el C-terminal, el péptido natriurético atrial o ANP, que es el biológicamente Activo. Se expresa y almacena principalmente en gránulos en las aurículas; sin embargo, también se encuentra en bajas concentraciones en los ventrículos y riñones. El principal estímulo para la liberación del péptido natriurético atrial es el estiramiento que se da como resultado del aumento del volumen intravascular. Péptido natriurético atrial (ANP) Se comporta como un antagonista del Sistema Renina-Angiotensina. Produce efectos vasodilatadores, diuréticos y natriureticos al disminuir la absorción renal de sodio inducida por angiotensina II. En forma indirecta inhibe la neurotransmisión de noradrenalina, inhibe la secreción de vasopresina, aldosterona, CRF y PRL. El ANP controla el equilibrio hidroelectrolítico, regulando el intercambio de agua y electrolitos a nivel de bilis, saliva, páncreas, riñon e intestino, donde modifica la reabsorción de agua y sodio. Actúa como un factor de inhibición del crecimiento, inhibe los procesos de mitosis y apoptosis e inhibe oncogenes como C-fos y C-jun Inhibe la actividad simpática regulando el metabolismo de las catecolaminas a nivel de la terminal presinaptica. Modula el metabolismo de NA a nivel periférico y central (disminuye la actividad de MAO sin afectar a COMT) Péptido natriurético cerebral (BNP) Su nombre deriva por el descubrimiento del mismo a partir de cerebro porcino, que posteriormente se encontró en altas concentraciones, unas 200 a 300 veces mayor, en los ventrículos de pacientes y animales sometidos a estrés cardiaco, como ocurre en la falla cardiaca congestiva o en el infarto de miocardio. En su forma activa es un péptido de 32 aminoácidos, estructuralmente similar al péptido natriurético atrial). Producido principalmente en los miocitos ventriculares, y no se encuentra almacenado sino que su producción comienza desde el principio con la expresión de los genes. El precursor pre-proBNP consta de 134 aminoácidos, el cual es fraccionado para convertirse en proBNP de 108 aminoácidos, el cual posteriormente fraccionado por una proteasa de serina, la furina, produciéndose dos polipéptidos de importancia clínica, el residuo inactivo N-terminal de 76 aminoácidos, el Nterminalpropéptido natriurético cerebral o NT-proBNP, y la forma biológicamente activa de 32 aminoácidos, el BNP o péptido natriurético cerebral. Péptido natriurético cerebral (BNP) -EL BNP actúa como regulador del agua, balance electrolítico y de la homeostasis cardiovascular. -Su función mas importante intervención en los procesos de regulación de la expresión génica y de síntesis enzimática y/o proteica relacionados con la diferenciación (su concentración ventricular es mayor en etapas fetales) y fundamentalmente con la hipertrofia cardiaca asociada a procesos patológicos y de sobrecarga. Péptido natriurético tipo C (CNP) Secreción constitutiva, se libera a medida que se procesa el propeptido sin ser almacenado ni exocitado. Es un péptido vasoactivo que puede funcionar en forma paracrina y autocrina en el control del tono vascular. Carece de acción natriuretica y produce potente vasorelajacion en ileo y recto CARACTERISITCAS BIOQUIMICAS MECANISMOS DE ACCION