manual de prácticas de productos naturales

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
MANUAL DE PRÁCTICAS
DE
PRODUCTOS NATURALES
AUTORES:
Dr. GUSTAVO VALENCIA DEL TORO
M. en C. MARÍA EUGENIA GARÍN AGUILAR
Primera Edición
Enero 2010
CONTENIDO
PRÁCTICA NOMBRE
PRESENTACIÓN
REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE PRODUCTOS
NATURALES
I
MÉTODOS BÁSICOS DE EXTRACCIÓN
1.1
Medidas de seguridad en el laboratorio y manejo de residuos
1.2
Análisis de compuestos puros
1.3
Operaciones básicas de separación de sustancias químicas para
la obtención de productos naturales
II
SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS
2.1
Cromatografía en capa fina y en Papel
2.2
Cromatografía en columna
III
ANÁLISIS PRELIMINAR FITOQUÍMICO DE PLANTAS
MEDICINALES Y HONGOS
3.1
Preliminar fitoquímico
3.2
Análisis espectroscópico infrarrojo y resonancia magnética.
IV
DETECCIÓN DE ÁCIDOS FENÓLICOS DE TEJIDOS
VEGETALES
V
ANÁLISIS DE PIGMENTOS FLAVONOIDES DE
SEMILLAS DE Phaseolus spp.
VI
ANÁLISIS DE ACEITES ESENCIALES DE SEMILLAS
DE Umbeliferaceas
ANÁLISIS DE ALICINA EN Allium spp.
VII
VIII
EXTRACCIÓN DE CAFEÍNA DE HOJAS DE TÉ NEGRO
APÉNDICE 2. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
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2
PRESENTACIÓN
El área de los Productos naturales se ha desarrollado ampliamente a lo largo de la existencia de
la humanidad, iniciando con el interés de los pueblos indígenas por el uso empírico que le
dieron a las plantas y otros organismos para satisfacer sus necesidades de alimentación y
salud, así como, para el desarrollo de actividades religiosas. Con el paso del tiempo la
confluencia de disciplinas científicas como la Botánica, Etnobotánica, Fitoquímica, Farmacología,
etc. han dado soporte al estudio de los metabolitos de los productos naturales que se obtienen
de las plantas y otros organismos. Asimismo, una gran cantidad de fármacos provienen de los
productos naturales que generan los organismos vivos. Es por ello que surge la necesidad de
que los futuros ingenieros Farmacéuticos conozcan los principales métodos procedimientos y
técnicas de obtención de los metabolitos secundarios que conforman el basto campo de los
productos naturales.
En el presente manual se describen los experimentos básicos que permiten manejar los
métodos y técnicas de obtención, caracterización y purificación de metabolitos secundarios
presentes en los productos naturales.
Es conveniente indicar que este manual de prácticas de productos naturales se utilizó para
cubrir la parte práctica de la asignatura optativa de Productos Naturales del plan rediseñado de
la Carrera de Ingeniería Farmacéutica. Las prácticas contenidas en este manual fueron
impartidas al grupo 7FV1 durante el primer semestre del ciclo escolar 2009-2010.
Los autores agradecen a los estudiantes su entusiasta participación durante el curso, ya que
con ello se realizaron las modificaciones pertinentes a los desarrollos experimentales en el
transcurso del semestre.
También, estamos concientes que todo manual de prácticas elaborado requiere de su contínua
adecuación e implementación en el laboratorio, por lo que tomaremos en cuenta todas las
observaciones y modificaciones, que tanto alumnos como profesores nos indiquen, con la
finalidad de mejorar éste manual.
Esperando que el material didáctico elaborado cumpla con la función de introducir a los
estudiantes en la disciplina de los productos naturales nos congratulamos en ponerlo a su
disposición.
ATENTAMENTE
Los autores. Dr. GUSTAVO VALENCIA DEL TORO
M. en C. MARÍA EUGENIA GARÍN AGUILAR
3
Reglamento del laboratorio de Productos Naturales
El objetivo del presente reglamento es contribuir a la instrumentación de medidas de
seguridad básicas que prevengan y/o eliminen los accidentes en laboratorio.
Responsabilidades:
-
Los Profesores responsables de impartir el curso de laboratorio de Productos Naturales
serán los responsables conocer y hacer cumplir las normas establecidas en el presente
reglamento. Así como de su comunicación a los alumnos de sus grupos respectivos.
Normas generales del Laboratorio:
Las normas incluyen reglas, recomendaciones o prohibiciones relacionadas con el conocimiento,
el sentido común y la seguridad en el trabajo de laboratorio.
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Estará PROHIBIDO comer, beber, almacenar alimentos, correr, fumar, maquillarse o
manipular lentes de contacto en el laboratorio.
El área de trabajo deberá estar limpia y ordenada. No debe colocarse libros, abrigos o
bolsas sobre las mesadas de trabajo. Se deberá verificar que la mesa de trabajo esté
limpia al comenzar y al terminar el trabajo realizado.
En el laboratorio de enseñaza se deberán almacenar la menor cantidad posible de
drogas y reactivos. Los mismos deberán estar debidamente etiquetados y almacenados
en forma segura y en el lugar adecuado.
Se deberá usar vestimenta adecuada: bata con MANGA LARGA que cubra la ropa de
calle, preferentemente de algodón, zapatos cerrados no huaraches o sandalias,
asimismo, se deberá tener el pelo recogido.
Es obligatorio el uso de ANTEOJOS DE SEGURIDAD, según sea lo que corresponda,
durante la realización de los Trabajos Prácticos. Los ojos son órganos muy
vascularizados que pueden absorber rápidamente algunos compuestos químicos. Las
gafas deberán de uso personal y no pueden ser intercambiadas entre los alumnos.
Los alumnos o docentes que realicen tareas experimentales en el laboratorio es de
CARÁCTER OBLIGATORIO usar guantes apropiados acorde a los riesgos y los reactivos
que se manipulen. Los guantes previenen el contacto con agentes tóxicos o biológicos,
quemaduras por superficies calientes, frías o corrosivas y cortes por objetos punzantes.
Cuando corresponda utilizar cubrebocas y gorro para el pelo.
PROHIBIDO pipetear con la boca. Se podrán utilizar pipetas de vidrio o plástico con
propipetas o pipetas automáticas.
Los alumnos y docentes deberán estar familiarizados con los elementos de seguridad
disponibles, salidas, extintores, duchas, lavaojos, etc.
Toda herida, aún los pequeños cortes, que se produzca durante un trabajo práctico
deben ser informados obligatoriamente al docente.
Cuando el trabajo práctico involucre gases, vapores, humos o partículas, solventes, etc.
deberá realizarse en la campana de extracción.
No debe recibirse material de vidrio visiblemente defectuoso. Debe informarse al
profesor responsable del grupo de las roturas de material o desperfectos detectados
durante la operación de materiales y equipos.
En el caso de que alguna sustancia química entre en contacto con la piel (manos, cara y
sobre todo con los ojos), debe lavarse la zona afectada con abundante agua durante 15
minutos por lo menos. Avise a los profesores responsables.
4
Considerar el siguiente letrero de una universidad española:
5
Práctica I
MÉTODOS BÁSICOS DE EXTRACCIÓN
1.- Medidas de seguridad en el laboratorio y manejo de residuos
OBJETIVO
El alumno comprenderá las medidas de seguridad, el manejo adecuado de los reactivos y
disolventes, así como, el tratamiento de los residuos generados durante cada experimento.
INTRODUCCIÓN.
1.1 Medidas de seguridad
Al igual que los laboratorios de Química, Química Orgánica, Fisicoquímica, Bioquímica, etc, el
laboratorio de Fitoquímica requiere de las precauciones de seguridad adecuadas. Es por ello que en
todo laboratorio experimental se deben de seguir reglas generales de a comportamiento para el
trabajo con los materiales, equipos y reactivos químicos del laboratorio. Entre las reglas básicas para
el laboratorio de Fitoquímica están las siguientes:
1.
Usar bata de algodón durante su estancia en el laboratorio.
2.
Ubicar y tener en mente las de salidas de emergencia, extinguidores de fuego y botiquín de
primeros auxilios.
4.
Distinguir los códices de colores de tuberías y llaves de suministro de agua, aire, vacío y gas.
5.
No poner objetos personales sobre la mesa de trabajo.
6.
Trabajar en la campana de extracción o en un lugar bien ventilado, cuando se utilicen
sustancias tóxica, solventes, o reactivos químicos que desprendan vapores.
7.
No fumar en el laboratorio, ni ingerir alimentos.
8.
Traer protección en los ojos durante su permanencia en el laboratorio.
9.
No usar lentes de contacto en el laboratorio.
10.
Informar inmediatamente sobre cualquier accidente que ocurriera, sea un daño físico como
quemaduras, cortaduras o algún daño al equipo del laboratorio.
11.
En caso de mancharse la bata con algún reactivo peligroso, quitársela lo más pronto posible.
12.
Usar guantes adecuados para cada caso, cuando se manejen materiales corrosivos o tóxicos,
objetos punzo-cortantes (vidrio, tubo, etc.) materiales muy calientes o muy fríos.
13.
Usar una toalla para proteger sus manos cuando corte vidrio o inserte tubo de vidrio o
termómetros en tapones. Lubricar las perforaciones de tapones antes de introducir el tubo o el
termómetro.
14.
Leer con cuidado las etiquetas en los frascos de reactivos que va a utilizar, y tomar en cuenta
sus indicaciones.
15.
Manipular adecuadamente los líquidos y sólidos de los frascos que los contienen, usando
pipetas, probetas o espátulas. Para el caso particular de los líquidos, extraer con la perilla de
extracción, pro pipeta o jeringa adaptada con un trozo de manguera, NUNCA CON LA BOCA.
16.
Cuando se preparen soluciones ácidas, verter siempre el ácido al agua y nunca en forma
inversa.
1 7. Si un ácido, base o cualquier reactivo corrosivo salpica su cuerpo, enjuagarse con abundante
agua y llamar al profesor.
18.
Antes de encender un mechero asegurarse de que no haya cerca vapores o líquidos flamables.
19.
Nunca calentar un aparato que no esté abierto a la atmósfera.
20.
Antes de verter o evaporar un líquido orgánico asegurarse que no haya una flama cerca.
6
21.
Nunca calentar un líquido orgánico sobre la flama, utilice para ello parrilla o canastilla
eléctrica.
22.
No regresar sobrantes de reactivos a los envases originales y no pipetear en los frascos
originales de los reactivos, colocar siempre una pequeña cantidad en un recipiente.
23.
Usar siempre pipetas limpias para medir las diferentes sustancias.
24.
Si no se conoce el manejo de un equipo, leer el instructivo antes de utilizarlo y si aún así no
queda claro, preguntar al instructor.
25.
Antes de verter los residuos al caño, asegurase de que es posible si son diluidos con agua, de
lo contrario verterlos en recipientes adecuados para ello.
26. Antes de retirarse del laboratorio dejar limpio el material utilizado durante la práctica y el lugar
de la mesa utilizada, asegurarse de que no quede ningún equipo encendido o conectado o una llave
de agua o gas abierta.
1.2 Manejo de los residuos generados durante las prácticas.
La seguridad en el laboratorio no termina al finalizar el trabajo experimental sino hasta que se
coloquen adecuadamente los residuos generados, ya que debe de considerarse el impacto ecológico
que pueden causar si son desechados irresponsablemente.
Los residuos químicos son sustancias que fueron utilizadas en el laboratorio y no es posible
regresarlas a su recipiente original, debido a que han sufrido cambios durante la experimentación y
no son ya útiles para realizar nuevos experimentos, por lo que no tiene caso guardarlos en los
anaqueles específicos para reactivos químicos. Asimismo, en ocasiones los compuestos o mezclas
formadas pueden ser cancerígenos, mutágenos, infecciosos, teratológicos, o explosivos.
Algunas acciones y actitudes que se deben de tener al trabajar los residuos químicos son:
1.
Conocer la naturaleza de los residuos que se van a generar.
2.
Utilizar la menor cantidad posible de reactivos, haciendo un escalamiento de los
procedimientos, cuando el experimento así lo permita.
3.
Identificar las sustancias que se pueden recuperar o regenerar.
4.
Predeterminar los compuestos más peligrosos (cancerígenos, mutágenos, infecciosos,
teratológicos, etc.).
5.
Familiarizarse con las etiquetas de seguridad que tienen los reactivos.
En el laboratorio debe de contar con varios recipientes para que los residuos que se generan durante
las prácticas se depositen y posteriormente sean desechados de manera adecuada, dichos recipientes
deben ser etiquetados y cumplir las funciones siguientes:
A) Residuos acuosos.
En este recipiente se colocan residuos acuosos de ácidos orgánicos (ácido acético) o ácidos
inorgánicos (ácido nítrico, ácido sulfúrico, etc.).
Para tratar estos residuos se diluyen aproximadamente de 1:5 con agua. Se neutralizan lentamente
con hidróxido de sodio (en solución o escamas). Se diluye nuevamente de 1:10 con agua y se
elimina por el drenaje, dejando correr el agua en abundancia.
B) Residuos orgánicos.
En este grupo podemos se encuentran los alcoholes, aldehídos, cetonas, éteres, ésteres.
Si son solubles en agua diluir aproximadamente en 1:20 con agua y eliminar por el drenaje. Si no lo
son, evaporar en pequeñas dosis en la campana de extracción. Las cetonas insolubles se incineran en
7
la campana a pequeñas dosis. Los aldehídos insolubles se oxidan agregando permanganato de
potasio en solución o dicromato de potasio. Se diluyen 1:10 y se eliminan en el drenaje dejando
correr agua en abundancia.
C) Residuos halogenados.
Como ejemplos el diclorometano, el cloroformo, el ácido trifluoracético.
Se requiere de un procedimiento más elaborado que no es posible realizar en el laboratorio. Por ello
se canaliza al organismo apropiado para su tratamiento.
D) Residuos de fases estacionarias cromatográficas (sílica gel, alúmina, etc).
Se requiere de un procedimiento más elaborado que no es posible realizar en esta escala en el
laboratorio. Por ello se canaliza al organismo apropiado para su tratamiento.
Dependiendo del tipo de reactivo deberá elegirse las características de los recipientes que serán
utilizados para contenerlos.
MATERIALES
1.- Frascos vacíos de vidrio o plástico limpios y secos con capacidad de 0.5 a 2 L con motivo de
etiquetarlos para desechos, cinta adhesiva y marcadores (alumnos).
2.- Frascos con reactivos y disolventes que se emplearán durante el desarrollo del curso.
3.- Carteles que ilustran claves e instrucciones para trabajar con seguridad en el laboratorio.
PROCEDIMIENTO
Se hará un recorrido por el laboratorio para mostrar la ubicación de las salidas de emergencia,
extinguidores, campanas de extracción, sitio para realizar el desecho de residuos, lugar para la
limpieza del material utilizado durante las prácticas e instrucciones para su limpieza; asimismo se
indicará la ubicación de reactivos y disolventes.
Se revisarán las etiquetas de los disolventes y reactivos que se emplearán durante el desarrollo del
curso, así como, de carteles existentes en el laboratorio que tienen que ver con el manejo adecuado
de los mismos.
Se colocarán etiquetas a los frascos de desechos clasificándolos en los cuatro rubros antes
mencionados.
REFERENCIAS
Bernabei, D. 1994. Seguridad. Manual para el laboratorio. Merck. Alemania.233 pp.
Luzón, S.G. 1992. Hazards in the chemical laboratory. 5th. Ed. RSC Cambridge. 675 pp.
8
INFORME SESIÓN 1
TITULO DE LA PRÁCTICA:
NOMBRE DE INTEGRANTES:
FECHA:
Resultados:
1.- Mencione 3 medidas de seguridad que protejan su integridad física cuando trabaje en el
laboratorio:
2.- Realice la búsqueda en Internet de los principales símbolos de peligrosidad (pictogramas) que
son usados para los reactivos químicos y áreas de laboratorios. Hacer una descripción de cada unos
de ellos y decir cuales son las diferencias entre los símbolos usados en los Estados Unidos y en la
Unión Europea.
3.- Además de los pictogramas antes indicados, las etiquetas de los reactivos cuentan con un código
adicional (con letras) sobre riesgos específicos y consejos de prudencia. Indique para al menos 5
reactivos químicos que se encuentran en su mesa cuáles son dichas indicaciones.
No olvides reportar la bibliografía consultada, recuerda que para páginas Web se debe de escribir de
la siguiente forma:
El patrón básico para una referencia electrónica es:
Autor, inicial(es) de su nombre (año). Título. Mes, día, año, dirección en Internet.
Ejemplo:
Bancos, I. (n.d.). Los NHS marcan la pauta del cuidado de la salud. Obtenida el 29 de agosto de
2001, de http://www.healthcareguide.nhsdirect.nhs.uk/
Si no consigue identificar la fecha en que el documento fue publicado, utilice la abreviatura n.d. (no
date [sin fecha]).
Si no consigue identificar al autor, empiece su referencia con el título del documento.
Si el documento se ubica dentro de una página institucional, como la de alguna universidad o
departamento gubernamental, primero cite el nombre de la organización o del departamento en
cuestión, antes de dar la dirección electrónica, ver ejemplos:
1.- Alexander, J., & Tate, M. A. (2001). Evaluando las Fuentes Electrónicas. Consultado el 21 de
agosto de 2001, Widener University, página web conmemorativa de la biblioteca Wolfgram:
http://www2.widener.edu/Wolfgram-Memorial- ibrary/webevaluation/webeval.htm
2.- Decidiendo su futuro. (2000). Consultado el 5 de septiembre de 2001, Portsmouth University,
página
web
de
Servicios
Profesionales:
http://www.port.ac.uk/departments/careers/plancareer/deciding-your-future.htm
9
2.- Análisis de compuestos puros
OBJETIVO
El alumno determinará los puntos de fusión y ebullición de mezclas y sustancias puras y relacionará
las propiedades fisicoquímicas con la pureza de los compuestos químicos.
INTRODUCCIÓN:
Un problema que con frecuencia se encuentra en las investigaciones con productos naturales es la
identificación de sustancias y la determinación de su pureza. Una primera aproximación para
determinar la pureza de los compuestos químicos es la determinación de constantes físicas como
punto de fusión, punto de ebullición, densidad, índice de refracción, etc. Los puntos de fusión y
ebullición son especialmente útiles para la identificación de compuestos orgánicos. Actualmente
para caracterizar substancias se emplean técnicas modernas de análisis, tales como espectroscopia en
sus diversas modalidades Ultravioleta-Visible (UV-Vis), Infrarrojo (IR), Resonancia Nuclear
Magnética (RNM)), Espectrometría de masas (EM), cromatografía de gases (CG) y cromatografía
de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés).
a).-PUNTO DE FUSIÓN. El punto de fusión de un compuesto se puede definir, como la
temperatura a la cual un sólido pasa al estado líquido y por lo tanto en el punto de fusión el estado
sólido y líquido están en equilibrio. Se usa en la identificación de compuestos desconocidos y
también como un criterio de pureza. Los compuestos puros tienen un punto de fusión definido con
un intervalo de 0.5 a 1 °C. La presencia de impurezas abate el punto de fusión y amplia dicho rango
en ocasiones en más de 4 ºC. Para el caso de los compuestos orgánicos sólidos, la determinación del
punto de fusión del compuesto (Tf) es una técnica muy utilizada. Varias razones prácticas la
justifican: es rápida y requiere temperaturas moderadas (100-200 oC), los cambios de Tf con la
presión son muy pequeños, Tf es muy fácil de detectar experimentalmente, y se utiliza muy poca
cantidad de muestra.
b).-PUNTO DE EBULLICIÓN. El punto de ebullición se define como la temperatura a la cual la
fase vapor y la fase líquida coexisten. En cualquier combinación de presión y temperatura, una cierta
fracción de moléculas del líquido escapan o se evaporan de su superficie como vapor. Este proceso
se llama vaporización o evaporación y el proceso opuesto se denomina condensación. La presión
ejercida por este vapor que escapa se denomina presión de vapor de un líquido y su valor aumenta
con el aumento de temperatura. La temperatura a la cual la presión de vapor es igual a la
temperatura externa se llama punto de ebullición del líquido. El más familiar es el del agua, que
ocurre a 100 ºC y una atmósfera de presión y se conoce como punto de ebullición normal del agua.
Las moléculas de agua están unidas en la fase líquida por fuerzas de atracción moderadamente
fuertes llamadas puentes de hidrógeno. El calentamiento es necesario para romper estas fuerzas y
permitir que el líquido pase a la fase gaseosa. Al igual que el punto de fusión, la temperatura de
ebullición de una sustancia impura no es un punto fijo y preciso como el punto de ebullición de un
líquido puro, pero el análisis de pureza por medio del punto de ebullición es menos exacto, pues los
intervalos de temperatura que se obtienen dependen del aparato utilizado. El punto de ebullición de
un compuesto se define como la temperatura a la que la presión de vapor del líquido iguala la
presión atmosférica. Los líquidos puros tienen puntos de ebullición constantes. Mezclas de líquidos
muestran un intervalo de ebullición, excepto casos especiales que incluyen una mezcla con un punto
de ebullición constante llamada azótropo.
c).- PUNTO DE SUBLIMACIÓN.
Una técnica muy usada para purificar sólidos es la sublimación. El punto de sublimación de una
sustancia es aquella temperatura a la cual dicho compuesto pasa de la fase sólida a la fase gas
10
directamente, sin pasar por la fase líquida, mediante el mecanismo de sublimación. Algunos sólidos,
como el iodo o la quinina, experimentan dicha transición de fase. Termodinámicamente suele ser
una transición favorable debido al gran incremento de entropía que conlleva. La sublimación de un
sólido se lleva a cabo cuando se igualan la presión de vapor del sólido con la presión externa.
Consiste en que un sólido se calienta y se convierte en vapor sin pasar por el estado líquido, y el
vapor se vuelve a solidificar en contacto con una superficie fría. Si este proceso sólo lo sufre el
sólido que se quiere purificar y no sus impurezas, el resultado puede ser altamente satisfactorio.
REACTIVOS Y DISOLVENTES:
Ácido benzóico, glucosa, sal común, alcanfor, acetona, fármaco ibuprofeno, Hexano, metanol,
etanol, glicerol
MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO:
4
Tubos capilares para determinar
punto de ebullición
1
Termómetro
1
Aparato para la determinación del
punto de fusión
1
Mechero Bunsen
1
Embudo
1
Mortero con pistilo
1
Liga
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Cápsula de porcelana
Vaso de precipitado de 300 mL
Parrilla eléctrica
Tubo de ensayo
cristalizador
cápsula
espátula
vidrio de reloj
Balanza analítica
11
PROCEDIMIENTO:
DETERMINACIÓN DEL PUNTO DE FUSIÓN
a) En este experimento se determinarán los puntos de fusión del ácido benzóico y de la glucosa
puros (p.f. 121 – 123 y 146 °C, respectivamente), así como de una mezcla 50:50 de ambos
compuestos. Para ello colocar una pequeña cantidad del compuesto en el portaobjetos circular de la
platina de calentamiento del aparato Fisher, iniciar el calentamiento, en el momento en el cual se
funda la sustancia registrar la temperatura, hacer lo mismo para las demás sustancias. Para ilustrar el
abatimiento en el punto de fusión, determina el punto de fusión de la mezcla de benzóico-glucosa.
b) En esta parte del experimento se determinará el punto de fusión del principio activo de un
fármaco y de su excipiente.
Preparación de la muestra:
1.
Pesar 1 tableta de ibuprofeno (400 mg) y calcular la cantidad equivalente a 0,5 g de
ibuprofeno (se recomienda hacerlo un día antes de la práctica).
2.
Triturar en un mortero las tabletas necesarias, pesar la cantidad equivalente antes calculada
de material pulverizado, guardar cantidad sobrante para determinar punto de fusión, disolver el
equivalente a los 0.5 g de ibuprofeno en 10-20 mL de acetona agitar y filtrar, evaporar el filtrado
hasta sequedad sin calentarlo. Cristalizar el residuo con 10 mL de acetona, separar los cristales, dejar
secar al aire y utilizar el residuo como sustancia problema, determinarle el punto de fusión a la
pastilla completa (sustancia problema 1-2), al residuo del papel filtro (sustancia problema 2) y a los
cristales obtenidos (sustancia problema 1).
DETERMINACIÓN DEL PUNTO DE EBULLICIÓN
Con ayuda del mechero Bunsen fabricar algunas campanitas de ebullición cerrando un extremo de
los capilares. Colocar sobre la placa de calentamiento o parrilla el vaso de precipitados, un agitador
magnético y el aceite mineral o glicerol que servirá como baño caliente. Añadir 2 mL del líquido
problema a un tubo de ensayo pequeño y deja caer una campanita de ebullición con el extremo
cerrado hacia arriba, de modo que quede sumergida en el líquido. Fijar el tubo de ensayo al
termómetro con la banda de hule e iniciar el calentamiento. Cuando una corriente de burbujas
rápida, ascendente y continua salga del capilar, anotar la temperatura y desconectar la placa, Cuando
las burbujas dejen de salir del capilar y el líquido empiece a entrar en él, vuelve a registrar la
temperatura. Promediar ambas temperaturas para obtener la temperatura de ebullición del líquido.
Seguir el mismo procedimiento para los otros líquidos.
Determine el punto de ebullición de los siguientes compuestos: Hexano. Metanol, Etanol y mezcla
de metanol-etanol 50:50.
SEPARACIÓN DE SÓLIDOS POR SUBLIMACIÓN
En este experimento se trata de purificar alcanfor que está contaminado con sal común. Se realiza
con la finalidad de practicar la técnica de la sublimación y comprobar su utilidad. El alcanfor es un
sólido bastante volátil, que si se calienta puede convertirse en vapor todavía muy por debajo del
punto de fusión. En contraste, el cloruro de sodio no es volátil, dado que es una sustancia iónica
Colocar en el cristalizador una muestra de la mezcla de alcanfor y sal común. La masa de la muestra
debe ser aproximadamente 1 g, pero ha de ser pesada con exactitud. (Anotar el valor de esta pesada).
Pese también el vidrio de reloj. Ponga el vaso con la muestra sobre la parrilla de calentamiento.
Enfriar una cápsula colocando en ella trozos de hielo machacado y colocarla sobre la boca del
cristalizador. Graduar la calefacción de la parrilla de manera que el vaso se caliente suavemente.
Observar conforme se calienta el vaso se deposita el alcanfor sólido en la base de la cápsula. Cuando
ya no se aprecie que aumenta la cantidad de alcanfor sublimado, desconectar la parrilla y dejar
12
enfriar. Retirar con cuidado la cápsula de porcelana, retirar con cuidado el agua y el hielo de la
cápsula y secarla con papel absorbente. Colocar sobre la mesa una hoja de papel y sobre ella el
vidrio de reloj que ha pesado. Con ayuda de una espátula, raspe con cuidado el fondo de la cápsula
para separar el alcanfor, dejándolo caer sobre el vidrio de reloj. Pese el vidrio con el alcanfor
recuperado. Calcule el porcentaje de alcanfor en la mezcla inicial.
RESIDUOS Y SU MANEJO:
Tubos capilares cerrados por un extremo.
Se lavan y guardan para posteriores experimentos.
Solventes hexano, metanol y etanol, y mezcla metanol-etanol
Se colocan en el recipiente por separados para su destilación y re-uso, excepto la mezcla.
Glicerol.
Se enfría y se guarda para su uso posterior.
Alcanfor
Entregue el alcanfor obtenido al profesor para su re-uso
Residuo de salino
Disolver en agua y verter en el drenaje
REFERENCIAS:
Pavia D.L., Lampman, G.L., Kriz G.S. Jr. 1976. Introduction to organic laboratory Techniques: A
contemporary Approach. Saunders Co. Filadelfia. 699 p.
Brieger, G. 1970. Química Orgánica Moderna. Curso Práctico de Laboratorio Harper Rovc Pubs.
Inc. New York, 243 p.
13
INFORME sesión 2.
TITULO DE LA PRÁCTICA:
NOMBRE DE INTEGRANTES:
FECHA:
Resultados
1- Escribe en el siguiente cuadro los datos obtenidos de Punto de fusión:
Sustancia
Punto de fusión
*Tf (teórico)
Tf (experimental)
Observaciones
Ac. Benzóico
Glucosa
Mezcla Glucosa-Benzóico
Problema 1
Problema 2
Mezcla problema 1-2
*Buscar en bibliografía
2- Escribe en el siguiente cuadro tus datos obtenidos de Punto de ebullición:
Sustancia
Punto de ebullición
Observaciones
*Tb (teórico) Tb (experimental)
Hexano
Metanol
Etanol
Mezcla Metanol-etanol
*Buscar en bibliografía
3.- Discute los resultados obtenidos en tu experimento con los datos reportados en la bibliografía,
explica las diferencias o semejanzas.
4.- Para el caso de las muestras problema, en el punto de fusión, explica a que se deben los valores
obtenidos.
5.- Para el caso de las muestras problema, en el punto de ebullición, explica a que se deben los
valores obtenidos.
14
3.- Operaciones básicas de separación de sustancias químicas para la obtención de productos
naturales
OBJETIVO
El alumno utilizará las técnicas de filtración, decantación y cristalización para la separación de un
principio activo de un fármaco comercial. Y aplicará las técnicas de separación; destilación por
arrastre con vapor y extracción continua con disolventes orgánicos (en Soxhlet y a reflujo) para
aislar el aceite esencial de un producto natural.
INTRODUCCIÓN:
a) Procedimientos físicos.
La decantación, la filtración y la centrifugación son procedimientos físicos de separación de
sustancias químicas que permiten la separación de algún producto sólido que se encuentra mezclado
con algún líquido.
Decantación:
Cuando en una solución, una sustancia sólida se precipita o es depositado en el fondo del recipiente,
el líquido puede retirarse cuidadosamente inclinando ligeramente el recipiente y llevando la fase
líquida a otro recipiente, de tal forma que se logre la separación de las dos fases, a este proceso se le
llama decantación. Cuando se tienen dos líquidos inmiscibles que forman 2 fases se utiliza un
embudo de separación para realizar la separación de fases.
Filtración:
El proceso de filtración consiste en separar una sustancia sólida que no precipita y por tanto se
encuentra suspendida en el seno del líquido, para ello se utiliza un filtro que generalmente es de
papel y con ayuda de un embudo normal se vierte el líquido sobre el papel filtro previamente
colocado sobre el embudo y el líquido es obtenido en un recipiente limpio. También puede utilizarse
vacío para realizar la filtración, y generalmente se requiere un embudo Büchner, el cual se coloca
sobre un matraz Kitazato. Se coloca un círculo de papel filtro (de poro adecuado a lo que se va a
filtrar) en la base del embudo, el cual debe de quedar perfectamente ajustado, de tal forma que cubra
todos los orificios del embudo. Se humedece el papel con un poco del líquido de la mezcla que va a
ser filtrada. Se enciende el sistema de succión (de agua o bomba para vacío). Se agrega la mezcla a
ser filtrada. Después que ha pasado todo el líquido a través del embudo al matraz, se apaga el
sistema de vacío y se desconecta.
Centrifugación:
Una centrífuga es un equipo que es capaz de aplicar una fuerza centrífuga sostenida, esto es, la
fuerza generada a través de la rotación. La presencia de una fuerza que tiende hacia una dirección
exterior siempre que una masa cambia su dirección, fue demostrada por Sir Isaac Newton en el siglo
XVII, quien mostró en sus leyes del movimiento, que cuando un cuerpo moviéndose libremente en
una línea recta, cambia y es dirigido en una curva, a través de una cuerda por ejemplo, entonces el
cuerpo ejercerá una fuerza exterior en contra de la cuerda. La intensidad de esta fuerza puede ser
incrementada, aumentando: a) la velocidad de rotación, b) la masa del cuerpo, c) el radio o la
distancia del cuerpo al centro de la curva. Por lo tanto, incrementando la masa o el radio, se
intensifica la fuerza centrífuga proporcionalmente, pero aumentando la velocidad de rotación se
incrementa en proporción al cuadrado de la velocidad. La fuerza centrífuga se expresa por la
2
relación básica de: F = m ⋅ v
que equivale a F = 4π 2 ⋅ m ⋅ n 2 ⋅ R , donde F = fuerza centrífuga m =
R
masa, R = radio, v = la velocidad y n = el número de revoluciones por segundo. La fuerza centrífuga
15
es expresada como un múltiplo de g (aceleración debida a la gravedad). Con las centrífugas de
laboratorio se pueden generar campos centrífugos de 1x 109 g.
En los procesos de separación de productos secundarios se utiliza para la concentración y
purificación de materiales en suspensión, disueltos en fluidos.
Cristalización.
Es la técnica más simple y eficaz para purificar compuestos orgánicos sólidos. Consiste en la
disolución de un sólido impuro en la menor cantidad posible del disolvente adecuado en caliente. En
estas condiciones se genera una disolución saturada que al enfriar se sobresatura produciéndose la
cristalización. El proceso de cristalización es un proceso dinámico, de manera que las moléculas que
están en la disolución están en equilibrio con las que forman parte de la red cristalina. El elevado
grado de ordenación de una red cristalina excluye la participación de impurezas en la misma. Para
ello, es conveniente que el proceso de enfriamiento se produzca lentamente de modo que los
cristales se formen poco a poco y el lento crecimiento de la red cristalina excluya las impurezas. Si
el enfriamiento de la disolución es muy rápido las impurezas pueden quedar atrapadas en la red
cristalina. Para la cristalización de debe de considerar lo siguiente:
1)
Deberá disolver al compuesto en caliente y no en frío;
2)
Las impurezas deben ser completamente solubles o insolubles en el disolvente;
3)
No deberá reaccionar con el material por purificar.
Destilación:
a) Destilación simple
La destilación es un método comúnmente usado en la separación y purificación de líquidos.
Esencialmente consiste en la vaporización de la sustancia seguida por la condensación de vapores y
recolecta de ellos en otro recipiente. Diferentes tipos de destilación se usan dependiendo de los
compuestos a separar.
Un aparato de destilación simple se usa para destilar una sola sustancia o para separar líquidos con
un intervalo amplio en el punto de ebullición. La mezcla por separar se coloca en el matraz de
destilación al que previamente se le han colocado perlas de ebullición o pequeños trozos de tezontle
lavados y secados en la estufa a 100 ºC, se ensambla el aparato (como indica la figura) y se procede
a calentar el matraz; el componente más volátil hierve primero y más rápidamente;
consecuentemente los vapores de la mezcla son más ricos en este componente, que al pasar por el
refrigerante, se condensan y recolectan. Cuando disminuye la proporción de este componente en la
mezcla, el vapor se enriquece con el componente menos volátil; la temperatura del termómetro se
incrementa y se utiliza otro matraz para recolectar este componente.
Figura 1. Equipo de destilación simple
b) Destilación fraccionada
16
En cuando los componentes de la mezcla líquida tienen puntos de ebullición cercanos, se utiliza una
la destilación fraccionada, un columna de fraccionamiento se empaca con un material inerte (perlas
de vidrio, fibra de vidrio o acero etc.) y se coloca en forma vertical al refrigerante, (ver figura 2). El
calentamiento de la mezcla en e matraz causa que los vapores ricos en el componente más volátil
pasen a través de la columna de fraccionamiento, el vapor al tocar el material de relleno frío, se
condensa y regresa hasta que toca una parte de la columna que ha elevado su temperatura, entonces
vuelve a re-evaporizarse. El nuevo vapor es más rico en el componente menos volátil. Este proceso
de condensación-revaporización se efectuará varias veces a lo largo de la columna y se condensa en
el refrigerante. Se observa que una destilación fraccionada es equivalente a varias destilaciones
simples.
Figura 2. Aparato de destilación fraccionada
c) Destilación a presión reducida
Muchos de los productos naturales no pueden ser destilados a presión atmosférica debido a que se
descomponen al acercarse a su punto de ebullición. Este problema puede ser resuelto a través de una
destilación a baja presión ya que con ello se evita la descomposición de la muestra. La presión de
vapor de cualquier sustancia es una función directa de la temperatura, así, al disminuir la presión
dentro del aparato de destilación se abatirá el punto de ebullición. La destilación a presión reducida
puede realizarse con el rotaevaporador o bien con un equipo para destilación adaptado a una bomba
de vacío.
d) Destilación por arrastre de vapor
La destilación por arrastre con vapor es una técnica que se emplea para separar sustancias que son
insolubles en agua y volátiles, de otras sustancias no volátiles. Es una técnica aplicada en la
separación de sustancias poco solubles en agua. La destilación por arrastre de vapor se emplea para
separar una sustancia de una mezcla que posee un punto de ebullición muy alto y que se
descomponen al destilar. También se emplea para purificar sustancias contaminadas por grandes
cantidades de impurezas resinosas y para separar disolventes de alto punto de ebullición de sólidos
que no se arrastran. Este tipo de destilación se emplea principalmente para la separación de aceites
esenciales (ver figura 3).
17
Figura 3. Aparato para destilación por arrastre de vapor
d) Extracción contínua en Soxhlet
Esta forma de separación de metabolitos secundarios no es propiamente una destilación pero implica
el calentamiento de un solvente de tal forma que entre en contacto con el material biológico
repetidas veces y permite la extracción de sustancias de interés una vez que el solvente que esta en
contacto con el material biológico ya no presenta coloración, se considera que se ha llevado a cabo
la extracción total y se termina el proceso, en la figura 4 se muestra el equipo Soxhlet.
Figura 4. Aparato Soxhlet para extracción de componentes orgánicos
18
REACTIVOS Y DISOLVENTES:
Acetona, pastillas de ibuprofeno, hojas de eucalipto, u hojas de te de limón, o canela (alumnos),
piedras de ebullición, acetato de etilo, Papel aluminio sulfato de de sodio anhidro, Papel filtro.
Materiales y equipo
1 Cristalizador
1 Vaso de precipitados de 50 mL
2 Parrillas eléctricas
1 Equipo para determinar el punto de fusión
1 Termómetro
1 Equipo Soxhet
1 Equipo para destilación a presión reducida
o rotavapor
1 Equipo de destilación por arrastre con
vapor
1 Equipo de destilación simple
3 Matraces Erlenmeyer de 25 mL
1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL
2 Matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 Probeta graduada de 25ML
1 Probeta graduada de 100 mL
2 Pipetas Pasteur con bulbo
1 Bomba para vacío
Mechero Bunsen
3 Embudo de separación
2 Frasquito con tapa
1 Embudo de tallo recto
1 Matraz bola de 250 mL
Piedras de ebullición
1 Embudo de tallo corto
1 Espátula
PROCEDIMIENTO
CRISTALIZACIÓN
Para la cristalización de sustancias orgánicas se hace lo siguiente: el sólido impuro se disuelve en la
mínima cantidad de disolvente caliente. Las impurezas insolubles se eliminan por filtración de la
solución caliente. Se deja enfriar la solución lentamente a temperatura ambiente y luego en un baño
de hielo o en el refrigerador. En este lapso el material purificado se separa como cristales mientras
que las impurezas solubles permanecen en solución. Los cristales purificados se colectan por
filtración. Cuando hay trazas de contaminantes coloridos, se eliminan añadiendo carbón activado a
la solución caliente antes de filtrar.
Para llevar a cabo la cristalización de la sustancia activa del fármaco se realizará el procedimiento
indicado en la práctica anterior y que se describe a continuación, utilizando paracetamol en lugar de
ibuprofeno:
1.
Pesar 1 tableta de fármaco comercial y calcular la cantidad equivalente a 0,5 g de
paracetamol.
2.
Triturar en un mortero las tabletas necesarias, pesar la cantidad equivalente antes calculada
de material pulverizado, guardar cantidad sobrante para determinar punto de fusión, disolver el
equivalente a los 0.5 g de paracetamol en 10-20 mL de etanol agitar y filtrar, evaporar el filtrado
hasta sequedad calentando en baño maría. Cristalizar el residuo con 10 mL de acetona, separar los
cristales, dejar secar al aire y utilizar el residuo como sustancia problema, determinarle el punto de
fusión a la pastilla completa (sustancia problema 1-2), al residuo del papel filtro (sustancia problema
2) y a los cristales obtenidos (sustancia problema 1).Determine el punto de fusión del compuesto
impuro y del recristalizado.
DESTILACIÓN:
a).- Por Arrastre de vapor. Montar el aparato de destilación por arrastre de vapor, de acuerdo a al
figura 3, colocar 700 mL de agua destilada en el matraz no. 1: generador de vapor y agregue cuerpos
de ebullición. En el matraz no. 2 coloque 65 g del hojas cortadas en trozos pequeños o la cantidad
19
equivalente para que se cubran las 3/4 partes del matraz. Al tapar este matraz, cuide que la conexión
de vidrio no se obstruya con los trozos del material biológico; pues de ser así, no habrá paso de la
corriente de vapor. Caliente con el mechero el matraz no. 1 hasta ebullición, con el fin de generar el
vapor que pasará al matraz no. 2, extrayéndose de esta manera el aceite esencial de material
biológico utilizado; el cual es inmediatamente arrastrado por el vapor de agua en un proceso de codestilación. Suspenda el calentamiento cuando el volumen del destilado sea de 100 o 150 mL
aproximadamente; de este codestilado, extraiga totalmente el aceite esencial, mediante extracciones
con acetato de etilo en un embudo de separación, las fases acuosas se desechan y los extractos
orgánicos se colectan en un matraz Erlenmeyer o vaso de precipitados, agregue entonces la cantidad
necesaria de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua remanente. Elimine el disolvente con el
rotavapor, determine el volumen obtenido y el rendimiento. Conservar la muestra obtenida en
refrigeración perfectamente tapada. Con este extracto y los otros que obtenga de los siguientes
experimentos, haga una cromatografía en capa fina (c.c.f.) para comparar resultados.
b).- Extracción continua con equipo Soxhlet. Monte el equipo se la figura 4, en el matraz redondo
de 500 mL coloque 300 mL de acetato de etilo. Llene el cartucho de celulosa con 6.5 g de té limón
cortado en pequeños trozos y colóquelo en la cámara de extracción. Caliente cuidadosamente hasta
la ebullición del acetato de etilo, cuyos vapores deberán condensarse en el refrigerante para caer
sobre el material biológico, se considera que una gota por segundo es en el condensado es idónea
para la extracción. En el momento en que la cámara de extracción se llena con el acetato de etilo,
éste cae por diferencia de presiones al matraz. Este proceso se repite continuamente de tal manera
que cada vez se extrae mayor cantidad del aceite esencial. El número de descargas del extracto
puede variar en función de la cantidad y calidad de la muestra, suspenda el calentamiento cuando ya
no observe coloración del destilado en la cámara de calentamiento, se dará por terminada la
extracción.
Al finalizar, desmonte el equipo, pase a un vaso de precipitados de 500 mL, por medio de
decantación y filtración el extracto obtenido y séquelo con sulfato de sodio anhidro, decante el
solvente, concentre a presión reducida con ayuda del rotavapor, hasta que ya no tenga solvente,
colóquelo en un vial y utilícelo para la c.c.f. comparativa.
c).- Extracción continua directa. Montar el equipo para destilación simple, con el refrigerante
colocado en forma vertical, agregar en el matraz redondo de 500 mL, 300 mL de acetato de etilo y
65 g de té limón cortado en trozos, agregue cuerpos de ebullición. Caliente a reflujo durante 30
minutos para extraer el aceite esencial (el tiempo de reflujo empieza a partir de que cae la primera
gota de disolvente condensado). Desmonte el equipo, decante y filtre el extracto obtenido. Séquelo
con sulfato de sodio anhidro y decántelo en un matraz limpio y seco. Concentre a presión reducida
con ayuda del rotavapor, dejando aproximadamente 5 mL del solvente concentrado. Colóquelo en
un vial y utilícelo para la cromatografía en capa fina (c.c.p.) comparativa.
RESIDUOS Y SU MANEJO
Enfriar los trozos de material biológico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente
depositar en la basura.
Solventes orgánicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar.
REFERENCIAS:
Enciclopedia Británica. 2002. Reino Unido Vol. 3. pp 31-33
Ávila, Z. J., García, C. M., Gavilán, I. C. G., León, F. C., Méndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodríguez,
P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Química Orgánica.
Experimentos con enfoque ecológico. Universidad Nacional Autónoma de México. México. 622 p.
Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988
20
Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Química Orgánica Experimental
Alambra, Madrid, 1974.
Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA,
1976
Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and
Bacon, Inc. USA. 334p.
21
INFORME sesión 3.
TITULO DE LA PRÁCTICA
NOMBRE DE INTEGRANTES
FECHA
Resultados
1- Escribe en el siguiente cuadro los datos obtenidos para el principio activo del fármaco trabajado
Sustancia
Punto de fusión
*Tf (teórico)
Tf (experimental)
Observaciones
Rendimiento
Paracetamol
Excipientes
Pastilla completa
*Buscar en bibliografía
2.- Escribe en la siguiente tabla los datos de rendimiento obtenido al utilizar los tres métodos de
obtención aceite esencial:
Método
Punto de fusión
g de material
g aceite esencial
Rendimiento
Arrastre de vapor
Extracción en Soxhet
Extracción destilacion
Con los tres tipos de extractos obtenidos realiza una cromatografía en capa fina y discute la calidad
de los componentes obtenidos.
CUESTIONARIO:
1.
En una destilación
a)
¿Cuál es la función de los cuerpos de ebullición?
b)
¿Por qué no se debe poner más de la mitad del líquido en el matraz de destilación?
c)
¿Por qué debe colocarse el bulbo del termómetro a la altura del brazo lateral de la T de
destilación?
d)
En el refrigerante ¿Por qué entra el agua por abajo y sale por arriba?
e)
¿Qué precauciones se deben tomar al destilar líquidos muy flamables y volátiles?
2.
¿En qué casos es conveniente aplicar la decantación para la separación de fases?
3.
¿Para qué casos aplicaría una filtración por gravedad y cuando es necesario aplicar una
filtración por succión?
4.
¿Qué criterios aplicaría para seleccionar el poro del papel filtro que va a emplear en una
filtración?
5.
¿Para qué caso(s) sustituiría la filtración por la centrifugación?
22
Práctica II.- SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS
2.1.- Cromatografía en capa fina y en papel.
OBJETIVOS:
1.- Determinar por cromatografía en capa fina (TLC por sus siglas en inglés: Thin Layer
Chromatography) la composición de algunos medicamentos analgésicos para determinar los
principios activos presentes.
2.- Determinar por cromatografía en papel y en capa fina los pigmentos presentes en los
cloroplastos.
INTRODUCCIÓN:
La cromatografía en varias de sus modalidades (papel, capa fina, columna, etc.) es un método de
separación y purificación de compuestos orgánicos que depende de la distribución de ellos en la fase
estacionaria. Para efectuar una separación cromatográfica se requiere de una fase estacionaria sólida
(material adsorbente como alúmina, gel de sílice, carbón o celulosa) y de una fase móvil (eluyente).
Se elige el adecuado para efectuar la separación considerando las solubilidades relativas de los
componentes de la mezcla. La muestra se aplica en el adsorbente (en la columna, placa o tira de
papel) y luego se deja que pasen a través del adsorbente los componentes de la mezcla, que se
desplazarán dependiendo de su solubilidad relativa en el eluyente y en el adsorbente. Aquellos que
son más solubles y que son menos atraídos por la fase estacionaria se desplazarán más rápido,
mientras que componentes insolubles quedan en el punto de aplicación. Para el caso del papel y
placa fina, después del proceso se tiene como resultado un cromatograma en el cual los componentes
separados se revelan, ya sea por su color inherente o por medio de un método físico o químico.
La cromatografía generalmente se usa como un método cualitativo, pero también se puede usar para
efectuar análisis cuantitativo.
REACTIVOS Y DISOLVENTES:
Metanol, cloroformo, éter etílico, ácido acético, hexano, acetato de etilo, pastillas de analgésicos,
cafeína, ácido acetilsalicílico, iburofeno, paracetamol, hojas de espinaca y acelga, Papel filtro, placas
de sílica gel para cromatografía con indicador.
Materiales y equipo
2 Vaso de precipitados de 50 mL
2 Pipetas Pasteur
1 mortero con pistilo
2 Vidros de reloj
4 tubos de ensaye de 10 mL
10 tubos de ensaye de 5 mL
1 Pipeta de 5 mL
1 Gradilla para tubo de ensaye
1 Pipeta 10 mL
1 Pipeta 1 mL
2 Sopote universal con anillo
2 Vial con tapa
4 Tubos capilares
2 Pinzas para tubo de ensaye
2 Embudo de tallo recto
1 Embudo de tallo corto
1 Espátula
1 Caja Petri de vidrio de 10-15 cm diam.
1 Lámpara de UV
23
PROCEDIMIENTO:
1.- CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (ANÁLISIS DE PASTILLAS DE ANALGÉSICOS)
Los analgésicos comerciales tales como Aspirina, Gelocatil, Neobrufen, Dalsi, Apiretal, Frenadol,
Termalgin etc. contienen uno o más de los siguientes principios activos: Acido acetilsalicílico,
ibuprofeno, 4-acetamidofenol (paracetamol) y cafeína.
La presencia de alguna de estas moléculas se detectará por comparación con patrones de las
sustancias puras.
Cada equipo analizará dos pastillas distintas a las que denominará como X e Y, tomar
aproximadamente una octava parte de una pastilla y triturarla bien con ayuda del mortero. Introducir
el polvo obtenido en un vial. Añadir 1 mL de metanol, agitar con ayuda de una espátula durante un
par de minutos y dejar reposar. En una placa de sílica gel de 2x5 cm trazar una línea a lápiz 0.5 cm
por encima del borde inferior de la placa (figura 1).
Figura 1. Marcado y colocación de las muestras
en la placa de sílica gel.
Sobre la línea hacer marcas equidistantes etiquetándolas X, A, C, I, P, según sea las sustancias
disponibles. En cada una de esas marcas se agregará independientemente la siguientes substancias:
X, el compuesto desconocido; y A, C, I, P las disoluciones patrón de Ácido acetilsalicílico, Cafeína,
Ibuprofeno y Paracetamol respectivamente. Utilizar un capilar para realizar la colocación de la
muestra, es importante limpiar el capilar después de cada muestra introduciéndolo en un vial con
metanol y vaciando su contenido sobre un papel de filtro varias veces. En un vaso de precipitados de
50 mL (cámara cromatogáfica) agregar la Mezcla eluyente: Acetato de etilo: Hexano: Ácido acético,
80:20:1, teniendo cuidado que el nivel del eluyente en la cámara debe de ser menor que la distancia
entre el borde inferior de la placa de cromatografía y la línea trazada con lápiz, introducir
cuidadosamente la placa de sílica en el vaso de precipitados y taparlo con un vidrio de reloj. Una vez
que el eluyente haya alcanzado casi el final de la placa, extraer la placa de la cubeta y trazar una
línea con lápiz señalando el frente del eluyente. Dejar que el eluyente se evapore. Visualizar las
manchas con la lámpara de luz ultravioleta (UV). Marcar los contornos de las manchas obtenidas
con lápiz.
Repetir la operación para la pastilla Y. Una vez analizadas ambas pastillas completar la tabla
siguiente (pregunta al profesor los nombres comerciales de los analgésicos que has analizado) y
calcula los Rf de las cuatro sustancias.
24
2.- CROMATOGRAFÍA EN PAPEL (ANÁLISIS DE PIGMENTOS DE CLOROPLASTOS)
Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores: clorofila-a (verde intenso),
clorofila-b (verde), carotenos (amarillo claro) y xantofilas (amarillo anaranjado) en diferentes
proporciones. Aparecerán, por tanto, varias bandas de diferentes colores (hasta siete o más,
dependiendo del material utilizado) que estarán más o menos alejados de la disolución alcohólica
según la mayor o menor solubilidad de los pigmentos. Estas bandas poseerán diferente grosor,
dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolución.
Colocar en un mortero trozos de hojas de espinacas lavadas o acelgas por separado, quitando las
nervaduras más gruesas, junto con 10 o 15 mL de éter etílico. Triturar sin golpear hasta que el
líquido adquiera una coloración verde intensa (utilizar campana de gases a lo largo de toda la
práctica). Filtrar en un embudo con papel filtro y recoger en un tubo de ensayo (es suficiente con 2 o
3 mL. de solución de pigmentos). Colocar en un frasco de de vidrio metanol absoluto hasta una
altura de 0.5 a 1.0 cm. Cortar una tira de papel de filtro para cromatografía, Whatman No. 3, de unos
8 cm de ancho y unos 10 a 15 cm de alto, poner con el capilar en el papel de cromatografía entre 5 y
10 gotas de solución de pigmentos, espaciadas en el tiempo con el fin de que vaya secándose el éter
etílico y aumente la cantidad de pigmentos. Las gotas se pondrán siempre en el mismo punto
(marcar con un lápiz), situado a 2 cm por encima del borde inferior del papel. Doblar el papel
cromatográfico a lo largo y colocarlo en la placa de Petri con la mancha de pigmento a 1 cm. de la
superficie del eluyente. Cuando el frente del solvente esté aproximadamente a 1 cm. del borde
superior del papel filtro, retirar el papel y marcar el frente del solvente con lápiz. Determinar el Rf
de cada mancha obtenida. También se deberá hacer una cromatografía en capa fina, siguiendo las
instrucciones dadas en la primera parte de ésta práctica.
RESIDUOS Y SU MANEJO
Retirar los trozos de material biológico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente
depositar en la basura.
Solventes orgánicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar.
Residuos de los fármacos, dejar en el papel filtro y depositar en la basura.
Minicolumnas utilizadas, dejar que se seque completamente la sílica gel y retirarla de la pipeta
Pasteur, la cual deberá conservarse en un frasco de residuos para su posterior limpieza. Las pipetas
Pasteur pueden se lavan para utilizarse posteriormente.
REFERENCIAS:
Enciclopedia Británica. 2002. Reino Unido Vol. 3. pp 31-33
Ávila, Z. J., García, C. M., Gavilán, I. C. G., León, F. C., Méndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodríguez,
P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Química Orgánica.
Experimentos con enfoque ecológico. Universidad Nacional Autónoma de México. México. 622 p.
Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988
Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Química Orgánica Experimental
Alambra, Madrid, 1974.
Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA,
1976
Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and
Bacon, Inc. USA. 334p.
25
INFORME sesión 4.
TITULO DE LA PRÁCTICA:
NOMBRE DE INTEGRANTES:
FECHA:
Resultados
1- Escribe en el siguiente cuadro los datos obtenidos para el principio activo del fármaco trabajado
Sustancia
*teórico
RF
experimental
Observaciones
Muestra X
Muestra Y
Paracetamol
Ibuprofeno
Cafeína
Acetilsalicílico
*Buscar en bibliografía
De acuerdo con los valores de Rf obtenidos y el número y tipo de manchas, discute tus resultados.
2.- Escribe en la siguiente tabla los datos de los pigmentos detectados para hojas de espinaca y de
acelga, da los valores de Rf.
Pigmento
Color del pigmento
Espinaca
Acelga
Valor de Rf
De acuerdo al tipo de machas obtenido y a los valores de Rf, discute tus resultados.
CUESTIONARIO:
1.
La solubilidad en alcohol de los pigmentos es de mayor a menor: carotenos, clorofila a,
clorofila b y xantofila. Indicar qué pigmento corresponde a cada banda.
2.
¿Por qué empleamos éter etílico para extraer la clorofila?
3.
¿Qué pigmentos son los más abundantes?
4.
Por encima de las clorofilas aparece más de una banda, ¿qué significado tiene?
26
2.
SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS
2.2.- Cromatografía en columna
La cromatografía en columna (CC) es el método más utilizado para la separación y purificación de
compuestos orgánicos, sólidos o líquidos, a escala preparativa. La fase estacionaria (adsorbente) se
coloca en una columna de vidrio que termina en un estrechamiento con una llave y se impregna con
el eluyente (fase móvil). La mezcla a separar se deposita en la parte superior de la columna y la fase
móvil atraviesa el sistema (Figura 3). Los compuestos se van eluyendo disueltos en el eluyente, se
van recogiendo ordenadamente en fracciones de pequeño volumen (1,2,.....) y se analizan por
cromatografía en capa fina (CCF). Los productos van saliendo de la columna según su polaridad,
primero salen los menos polares que son los menos retenidos por el adsorbente y los últimos los más
polares por su mayor retención en la fase estacionaria. El adsorbente más utilizado para este tipo de
cromatografía es gel de sílice y en segundo lugar la alúmina.
El tamaño de partícula del adsorbente es importante para la separación y su elección depende en
gran medida de que la elución de la cromatografía se realice por gravedad o a media presión (flash
chromatography). En una elución a media presión se pueden emplear tamaños de partícula más
pequeños, que permiten una separación más eficaz. Sin embargo, en una elución por gravedad el uso
de tamaños de partícula pequeños impediría el flujo del disolvente.
Antes de realizar una separación en cromatografía de columna hay que elegir adecuadamente el
disolvente haciendo ensayos en CCF.
Figura 3. Montaje de una columna cromatográfica
PROCEDIMIENTO:
4.- CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (OBTENCIÓN DE CAROTENOIDES Y PIGMENTOS)
Separación de carotenoides
Pesar 1.0 g de chile guajillo seco, eliminando las semillas, cortarlo en trozos pequeños y agregar 10
mL de una mezcla de tolueno-éter de petróleo 1:1; macerar en el mortero y dejar reposar por 10
minutos; decantar el extracto orgánico y concentrar en baño María hasta un volumen de 1 mL (en
campana de extracción). Durante el periodo de reposo de la muestra empacar la columna. Para la
preparación de la columna: se toma una una columna de vidrio de 20 cm de longitud por 1.5 cm de
diámetro (en caso extremo se puede sustituir por una bureta), se sujeta en el soporte con las pinzas.
Se revisa que la llave y funcione correctamente (que no halla fugas) y se mantiene en posición de
27
cerrado. Se introduce hasta el fondo un pequeño trozo de algodón ayudándose con la varilla de
vidrio, se agregan 3 mL de la mezcla eluyente (Tolueno-éter de petróleo, 1:1), se presiona
suavemente el algodón para que quede bien colocado y sin burbujas, se prepara una suspensión de 8
g de gel de Sílice 60, 63-200 micras en 50 ó 60 ml de mezcla eluyente y se agita durante 5 minutos
para eliminar las burbujas.
A través del embudo se vierte la suspensión en la columna golpeando ligeramente con los dedos
para que el empacado sea uniforme. Se abre la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo
cuidado de no dejar secar la gel de Sílice. Se podría haber empaquetado en seco, pero teniendo
cuidado de que no queden espacios vacíos, y luego pasarle disolvente. Abriendo la llave de paso al
mismo tiempo; dejar que pase el eluyente hasta que quede un nivel de 1 mL arriba del adsorbente,
cerrar la llave y agregar el extracto de Capsicum con ayuda de pipeta Pasteur. Abrir la llave y drenar
la columna con Tolueno-éter de petróleo (1:1).
Observar la separación de los pigmentos a medida que se eluye la columna, y recolectarlos en tubos
de ensayo o matraces Erlenmeyer de 25 mL para su posterior análisis cromatográfico.
La separación del extracto también se puede hacer por cromatografía en capa fina, usando en este
caso una placa de silica gel de 20 x 20, se aplica el extracto en forma de banda
Hacer el mismo procedimiento en otra columna utilizando los extractos de espinaca o acelga
obtenidos en la sesión práctica anterior. Debes de re-disolver previamente tu extracto seco en éter
etílico.
Análisis cromatográfico.
Una vez que se tiene las fracciones de cada columna, se corren cromatografías en capa fina para
identificar los componentes obtenidos, se determinan los valore de Rf.
RESIDUOS Y SU MANEJO
Retirar los trozos de material biológico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente
depositar en la basura.
Solventes orgánicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar.
Sílica gel. Se retira de la columna empleando una corriente de aire y recibiéndolas sobre una toalla
de papel se depositan en el recipiente de los residuos de soportes cromatográficos para su posterior
limpieza.
Extractos vegetales obtenidos. Se agrega un poco de la mezcla eluyente a los tubos que los
contienen y se depositan en frascos etiquetados. Serán utilizados en otras prácticas.
REFERENCIAS:
Ávila, Z. J., García, C. M., Gavilán, I. C. G., León, F. C., Méndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodríguez,
P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Química
Orgánica. Experimentos con enfoque ecológico. Universidad Nacional Autónoma de
México. México. 622 p.
Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and
Bacon, Inc. USA. 334p.
Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Química Orgánica Experimental
Alambra, Madrid, 1974.
Elder, J.W., Abbruzzese, J., Murray, J. y Zielski, M. 1976. Separation of Paprika pigments J. Chem.
Ed. 53 (1): 43.
28
Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA,
1976
Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988
29
INFORME sesión 5.
TITULO DE LA PRÁCTICA:
NOMBRE DE INTEGRANTES:
FECHA:
Resultados
1.- Escribe en la siguiente tabla los datos de los pigmentos y caraotenoides detectados para hojas de
espinaca y de acelga, da los valores de Rf.
Pigmento
Color del pigmento
Carotenoide
Espinaca o Acelga
Valor de Rf
Menciona el número de fracciones obtenidas tanto para el guajillo como para la espinaca o acelga,
según corresponda.
De acuerdo al tipo de machas obtenido y a los valores de Rf, discute tus resultados.
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué ventajas tienen las separaciones cromatográficas (cromatografía en capa fina y columna)
comparadas con otros métodos de separación y cuáles son sus desventajas?
2. ¿En que otras fuentes se pueden encontrar carotenoides además de las plantas superiores ¿Cuál es
su función en el cuerpo humano?
30
Practica III.- ANÁLISIS PRELIMINAR FITOQUÍMICO DE PLANTAS MEDICINALES Y
HONGOS
3.1.- Preliminar fitoquímico
OBJETIVOS
1.- Realizar el análisis cualitativo de las sustancias químicas que se obtienen a partir de vegetales y
cuerpos fructíferos de macromicetos.
2.- Identificar los principales metabolitos secundarios presentes en plantas y hongos.
INTRODUCCIÓN
Este análisis se efectúa para determinar los principales grupos de metabolitos presentes en plantas y
hongos, los extractos obtenidos se ponen en contacto con diferentes reactivos químicos y se
observan las reacciones de coloración y/o precipitación que se obtengan y a partir de ellas se
determina la presencia o ausencia de los diferentes metabolitos.
Como ciencia, la fitoquímica estudia multitud de compuestos químicos que se encuentran en la
complejidad de las células vegetales, pero no sólo como entidades químicas, sino también como
productos de una serie de mecanismos que intervienen en su biogénesis, es decir que aporta
elementos importantes para el estudio de la relación entre estructura química y la acción fisiológica
de los metabolitos secundarios.
REACTIVOS Y DISOLVENTES:
Metanol, cloroformo, éter etílico, éter de petróleo, tolueno, placas de sílica gel para cromatografía,
placas de sílica gel con indicador.
Materiales y equipo
Matraz fondo plano de 250 mL
Refrigerante
1 mortero con pistilo
20 tubos de ensaye de 10-15 mL
1 Gradilla para tubo de ensaye
1 Pipeta de 5 mL
1 Pipeta 10 mL
1 Pipeta 1 mL
1 Baño María
1 Varillas de vidrio
2 Pipetas Pasteur
1 Parrilla
2 Sopote universal con anillo
2 Viales con tapa
4 Tubos capilares
2 Pinzas de tres dedos
2 Embudo de tallo corto
1 Espátula
1 Lámpara de UV
PROCEDIMIENTO
25 g de muestra o material biológico seco y molido (pueden ser hojas, corteza, semilla, etc deuna
planta o un cuerpo fructífero de champiñón, portobello u otro hongo) se colocan en un matraz de
fondo plano de 250 a 500 mL, se le agrega etanol procurando que cubra máximo 2/3 partes de su
volumen (no olvidar agregar perlas de ebullición). Se extrae por reflujo durante media hora. El
extracto etanólico obtenido después de filtrar, se concentra en baño María. El residuo semisólido se
usa para los siguientes ensayos:
Alcaloides.
31
Se tomar una porción del extracto y adicionar entre 5 mL a 10 mL de ácido clorhídrico al 10%,
calentar a ebullición por cinco minutos, se enfriar y filtrar. Posteriormente dividir el filtrado en 3
tubos de ensaye, uno de los cuales servirá como testigo.
Tubo 1. Se adiciona una gota del reactivo Dragendorff, la prueba se considera positiva si se forma
un precipitado naranja.
Tubo 2. Se adiciona una gota del reactivo Sonneschain la prueba se considera positiva si se forma un
precipitado naranja.
Flavonoides.
Se disolver 0.5 mL del extracto en 2mL de etanol absoluto y dividir en tres tubos. El tercero será el
testigo.
1) Reacción de Shinoda. Adicionar 2 gotas de ácido clorhídrico concentrado, si se obtiene una
coloración roja indica la presencia de auronas o chalconas. En caso de haber cambio, se colocar un
trozo de magnesio metálico, si se forma una coloración naranja a rojo, indica la presencia de
flavonas; si es rojo flavonoles y si es magenta flavononas.
2) Reacción de hidróxido de sodio al 10%. Se adicionan 3 gotas de hidróxido de sodio si se forma
una coloración de amarillo a rojo, indica la presencia de xantonas y flavonas; de café a naranja de
flavonoles; de púrpura a rojizo de chalconas y azul de antocianinas.
Glicosidos Cianogenicos.
En un tubo de ensaye con 0.5 mL de extracto, se adicionar 1 mL de ácido clorhídrico al 10% y 1 mL
de cloroformo. Calentar el tubo en baño María colocando en la boca del tubo una tira de papel filtro
impregnado con reactivo de Grignard. La formación de una mancha rosa a rojo indica prueba
positiva.
Azucares Reductores.
Se tomaron 2 mL del extracto, midiendo el pH y adicionando hidróxido de sodio al 10% (si es
necesario) hasta tener un pH de 11. Dividir el extracto en dos tubos de ensaye para las siguientes
pruebas.
1) Reacción de Fehling. Se adicionan 0.5 mL de solución Fehling A y 0.5 mL de solución Fehling B
y 1 mL de agua destilada.
2) Reacción de Benedict. Se adicionan 0.5 mL de reactivo Benedict y 1 mL de agua destilada.
Se preparar un blanco para cada tubo, sin extracto. Se colocar los cuatro tubos en baño maría por 15
minutos. Cuando hay azúcares en los tubos que contienen el extracto se forma un precipitado de
color naranja a rojo.
Saponinas.
Prueba de altura y estabilidad de espuma. En un tubo de ensaye se colocar 1 mL de extracto, agitar
vigorosamente y se tomar la altura de la espuma, en caso de que se presentara. Se considera positivo
si la espuma alcanza un altura de 8 mm a 10 mm y se mantenía estable por 30 minutos.
Reacción de Lieberman Bouchard. Se concentran 0.5 mL de extracto hasta 0.2 mL; después se
agregan 2 gotas de acético anhídro y se estratifica con 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. Al
formarse una coloración azul o verde en la interfase, hay presencia de saponinas esteroidales; si la
coloración es rosa, rojo, magenta o violeta habrá presencia de saponinas triterpenoides.
Reacción de Rosenthaler. A otra porción del extracto concentrado, adicionar dos gotas del reactivo
Rosenthaler y estratificando con dos gotas de ácido sulfúrico concentrado. Si se forma coloración
violeta, se considera positiva para saponinas triterpenoides.
32
Taninos.
A 1 mL del extracto adicionar 2 mL de agua destilada y 3 gotas de cloruro de sodio al 2%, calentar a
ebullición por un minuto, enfriando y filtrando. Dividir el filtrado en cuatro tubos de ensaye, el
cuarto utilizar como testigo.
Reacción con gelatina. Adicionar 2 gotas de reactivo de gelatina. La formación de un precipitado
blanco indica presencia de taninos.
Reacción de Cloruro férrico. Se adiciona una gota de cloruro férrico al 1%, la formación de
coloraciones de azul a negro indica la presencia de derivados del ácido gálico y coloraciones verdes
de derivados del catecol.
Al tercer tubo, se agrega una gota de ferricianuro de potasio al 1%. La formación de una coloración
azul, indica la presencia de compuestos fenólicos.
Quinonas.
Se colocan 2 mL del extracto en una cápsula de porcelana y se concentra a sequedad, posterior a ello
se divide el extracto siruposo en tres porciones.
Reacción de hidróxido de amonio. Se adiciona una gota de hidróxido de amonio concentrado al
extracto. Se considera positiva la prueba para antraquinonas al tener la presencia de una coloración
roja que aparece en los dos primeros minutos.
Reacción con ácido sulfúrico. Se agrega 1 gota de ácido sulfúrico concentrado a otra porción del
extracto. La formación de una coloración roja indica la presencia de antraquinonas.
Reacción de Börntraguer. Se diluye una porción del extracto con 3 mL de agua destilada, se filtra, al
líquido filtrado, se le añaden 3 mL de hidróxido de potasio al 5%; calentando a ebullición por 3
minutos, enfriando y realizando una extracción con 3 mL de cloroformo. Se elimina la fase acuosa y
a la fracción clorofórmica se le adicionan 2mL de hidróxido de potasio al 5%. Un color rojo indica
la presencia de benzoquinonas; si es amarillo verdoso, adicionar 1 gota de peróxido de hidrógeno al
6%. Si la coloración cambia a roja, se consideró positiva para derivados de antrona.
Cumarinas.
Reacción de Erlich. Se colocan 0.5 mL de extracto en una cápsula de porcelana, se concentra y se
agregan dos gotas de Reactivo Erlich y una gota de ácido clorhídrico concentrado. La coloración
naranja, indicó presencia de cumarinas.
Reacción con hidróxido de amonio. Se concentra otra porción del extracto y se le adicionan 0.5 mL
de etanol y dos gotas de hidróxido de amonio concentrado. Se considera positiva la prueba si se
presenta una fluorescencia azul-violeta.
Glicosidos Cardiacos.
Se transfieren 2 mL del extracto a una cápsula de porcelana y se concentran a la tercera parte de su
volumen original. Se divide en tres porciones en una placa de porcelana con muescas.
Reacción de Legal. Se deja evaporar el disolvente y se adicionan 2 o 3 gotas de piridina, se agrega
una gota de nitroprusiato de sodio al 5% y 4 gotas de hidróxido de potasio, una coloración roja poco
estable indica la presencia de glucósidos cardiacos.
Reacción de Baljet. Se adicionan 3 gotas del reactivo Baljet. Una coloración de naranja a rojo
obscuro indica presencia de glucósidos cardiacos.
Sesquiterpenlactonas.
Reacción con Hidroximato férrico. Se agrega una porción del extracto a una cápsula de porcelana, se
le adicionan dos gotas de clorhidrato de hidroxilamina 2 N y una gota de hidróxido de potasio 2 N
en metanol. Calentar la mezcla a ebullición de 1 a 2 minutos, enfriar y se llevar a pH de 1 con ácido
33
clorhídrico 0.5 N. Se adiciona una gota de cloruro férrico 1%. Las coloraciones roja, violeta o rosa
indican que la prueba es positiva para este metabolito.
Con los extractos etanólicos obtenidos hacer por duplicado una cromatografía en capa fina y revelar
primero una de las placas con luz ultravioleta y la otra con sulfato cérico amioniacal. Identificar las
manchas obtenidos y calcular el Rf correspondiente.
RESIDUOS Y SU MANEJO
Retirar los trozos de material biológico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente
depositar en la basura.
Solventes orgánicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar.
Extractos vegetales obtenidos. Se agrega un poco de la mezcla eluyente a los tubos que los
contienen y se depositan en frascos etiquetados. Serán utilizados en otras prácticas.
REFERENCIAS:
Ávila, Z. J., García, C. M., Gavilán, I. C. G., León, F. C., Méndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodríguez,
P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Química
Orgánica. Experimentos con enfoque ecológico. Universidad Nacional Autónoma de
México. México. 622 p.
Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and
Bacon, Inc. USA. 334p.
Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Química Orgánica Experimental
Alambra, Madrid, 1974.
Elder, J.W., Abbruzzese, J., Murray, J. y Zielski, M. 1976. Separation of Paprika pigments J. Chem.
Ed. 53 (1): 43.
Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA,
1976
Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988
34
Apéndice 1:
Preparación de reactivos que se utilizaron durante la realización del análisis fitoquímico preliminar.
REACTIVO DE WARNER: 1.27g de Yoduro de Potasio aforado a 100mL de agua destilada.
CLORURO FERRICO: Sol. al 1% 0.5g de Cloruro Ferrico aforado a 50mL de agua destilada.
REACTIVO DE GELATINA: 0.5g de grenetina pura aforado a 50mL de agua destilada.
REACTIVO DE BENEDICT: 8.65g de Citrato de Sodio + 5g de Na2CO3 anh. en 30mL de agua
destilada se añadió lentamente y agitando + 0.865 CuSO4 en 7.5mL de agua y se afora a 50mL.
REACTIVO DE FEHLING:
Sol. A: 3.5g de CuSO4 5H2O aforado a 50mL de agua destilada.
Sol. B: 17.5g de tartrato de sodio y potasio + 5g de NaOH aforado a 50mL de agua.
HIDROXIDO DE SODIO 5%: 2.5g de Hidróxido de Sódio aforado a 50mL de agua destilada.
HIDROXIDO DE SODIO 10%: 5g de Hidróxido de sódio aforado a 50mL de agua de agua
destilada.
REACTIVO DE EHRLICH: 15 mL de Ácido Clorhídrico concentrado, 25mL de agua destilada, 25
mL de etanol al 95% y 1g de para-dimetilaminobenzaldehido.
REACTIVO DE MAYER: 0.1355 g de Cloruro de Mercurio y 2.5 g de Yoduro de Potasio en agua.
Aforada a 50 mL.
REACTIVO DE ROSENTHALER: 0.5 g de vainillina a 50 mL con etanol.
REACTIVO DE GRIGNARD: 0.5g de Carbonato de sodio + 50 mg de Ácido pícrico y agua hasta
50 mL.
HIDROXIDO DE POTASIO 2N: 2.8 g de Hidróxido de potasio en 50 mL de agua destilada.
HIDROXIDO DE POTASIO AL 5 %: 2.5g de hidróxido de potasio a 50 mL de agua destilada.
FERROCIANURO DE POTASIO AL 1%: 0.5g de Ferrocianuro de potasio en 50 mL de agua
destilada.
CLORHIDRATO DE HIDROXILAMINA 2N: 1.7375 g en 50 mL de agua destilada.
REACTIVO DE SONNESCHAIN: Sol. Saturada de Molibdato de amonio en agua se añade
lentamente a una sol. saturada de fosfato disódico a 40º C. se forma un precipitado, este precipitado
se lava con agua y se pasa a un vaso donde se agrega una solución concentrada de carbonato de
calcio (puede ser al 40%).
NOTA: Se agregan 2.2g de Molibdato de amonio, 1.4g de Fosfato disódico y 20g de carbonato de
calcio.
35
INFORME sesión 6
TITULO DE LA PRÁCTICA.
NOMBRE DE INTEGRANTES
FECHA
Resultados
1.- Escribe en la siguiente tabla los datos de los metabolitos secundarios detectados para el material
biológico trabajado
Material
Metabolito
PRUEBA REALIZADA
Para cada metabolito indicar las pruebas que se realizaron y marcar con + presencia y - ausencia
Haz una tabla en la que indiques los valores de Rf obtenidos para los extractos trabajados.
CUESTIONARIO:
1. Escribe cuales son las principales reacciones químicas y el mecanismo de reacción de las mismas,
que se presentan en la detección de los metabolitos secundarios que identificaste en el práctica.
2. Una vez detectados los metabolitos secundarios que otros métodos utilizarías para realizar el
aislamiento y purificación de los mismos y como determinarías su estructura química?, describe por
lo menos tres métodos a emplear.
36
Practica III.- ANÁLISIS PRELIMINAR FITOQUÍMICO DE PLANTAS MEDICINALES Y
HONGOS
3.2.- Análisis espectroscópico infrarrojo y resonancia magnética
OBJETIVO
El alumno obtendrá los espectros de IR y 1HRMN de extractos y sustancias puras y utilizará dichos
espectros para caracterizar las substancias trabajadas.
INTRODUCCIÓN:
Espectroscopia Infrarroja (IR).
El espectro Infrarrojo (IR) de la mayoría de los compuestos orgánicos puede dividirse en dos partes:
la banda de vibración, de sustituibles específicos entre 1350 y 4000 cm-1 y las bandas de vibración
del esqueleto hidrocarbonado (C-C y C-H) entre 650 y 1400 cm-1.
Aunque algunas bandas en la zona de números de onda bajos pueden correlacionarse con grupos
específicos (por ejemplo: C-0 entre 1100 y 1250 cm-1, CH de distintos tipos), estos suelen ser menos
sensibles a cambios en el entorno de la molécula. Esta zona (de la impresión digital) se utiliza en
general para comparar compuestos. En el análisis estructural la zona entre 1400 y 4000 cm-1 es de
gran utilidad, así las bandas entre 1650 y 1800 cm-1 indican C=O y en estos últimos, según el valor
exacto puede referirse al tipo de grupo funcional del que forma parte el carbonilo, sí se encuentra
conjugado, etc.
La presencia de dobles enlaces aislados o conjugados y de sistemas aromáticos, al igual que los
distintos tipos de sustitución sobre anillos bencénicos, constituye información importante que
también puede obtenerse a partir del espectro de IR.
Resonancia Nuclear Magnética (RMN, por sus siglas en inglés).
La espectroscopia RNM, es aplicable a una variedad de problemas químicos y bioquímicos. Las
ventajas principales del método son su naturaleza no destructiva y el hecho de que en muchos casos
la información obtenida permite la asignación inequívoca de la estructura de un compuesto ya que a
diferencia de los métodos anteriores, cada señal obtenida puede ser asignada en general a un núcleo
(o grupos de núcleos) de la molécula.
Sí bien en un principio la mayoría de los estudios de RNM versaron sobre el 1H por su elevada
abundancia natural (99.9 %), sensibilidad sólo superada por 3H y por poseer spín, los instrumentos
modernos que funcionan por el sistema de pulsos y transformadas de Fourier han permitido extender
este método a la observación de cualquier núcleo cuyo spín, sea distinto de cero.
Desde el punto de vista de la determinación estructural de productos naturales, los núcleos
generalmente observados son aquellos más comunes en los compuestos orgánicos es decir 1H y 13C
(este último con una abundancia en la naturaleza de 1.1%) ambos de spin 1/2.
Un espectro RMN brinda especialmente la siguiente información:
1. La posición de señal (su desplazamiento químico) que indica las características del entorno que
rodea al núcleo en cuestión.
2.La estructura fina (dada por el acoplamiento spin-spin) que provee información sobre la
relación espacial y el número de núcleos acíclicos con spin distinto de cero.
3.El área de la señal que es proporcional al número de núcleos que constituyen dicha señal.
REACTIVOS Y DISOLVENTES:
Acetona, cloroformo, ibuprofeno, paracetamol, extractos de eucalipto, carotenoides, cloroplastos,
cloroformo deuterado, DMSO deuterado, agua deuterada. Hojas blancas para impresión (alumno).
37
Materiales y equipo
5 Tubos para resonancia
1 Vaso de precipitados de 50 mL
Espectrómetro de IR
Espectrómetro de RMN
PROCEDIMIENTO.
Espectro Infrarrojo:
Tomar una fracción pequeña de cada compuesto puro y de cada extracto, disolverlo y agregar unas
gotas en el aditamento ATR del espectrómetro de infrarrojo, ayudado del sofware obtener el
espectro correspondiente para cada una de las sustancias. Conservar cada espectro obtenido para su
posterior análsis.
Espectro de resonancia.
Disolver los compuestos puros y los extractos por separado en los disolventes deuterados y
colocarlos en los tubos para reonancia respectivos, etiquetar cada tubo. Con ayuda del profesor y
siguiendo sus indicaciones colocar los tubos en el equipo de resonancia y obtener el especto
característico, conservar la impresión de cada espectro obtenido para realizar el análisis
correspondiente. Retirar el tubo del equipo de resonancia y vaciar el contenido de cada uno de ellos
en viales diferentes para su posterior uso.
RESIDUOS Y SU MANEJO
Debido a que las técnicas empleadas utilizan cantidades mínimas de disolventes, se dejan evaporar
los disolventes en la campana de extracción.
Extractos vegetales y compuestos puros obtenidos. Se colocan en viales etiquetados, se deja que se
evapore el disolvente utilizado y se conservan para su utilización posterior. Serán utilizados en otras
prácticas.
REFERENCIAS:
Pecsok R. L. y Shields L. D. 1973 Métodos Modernos de análisis químicos. Limusa. México. p, 487
Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988
Silverstein RM y Webster FX .Spectrometric Identification of Organic Compounds, , 6th ed. John
Wiley & Sons Inc. 1998
38
INFORME sesión 7
TITULO DE LA PRÁCTICA:
NOMBRE DE INTEGRANTES:
FECHA:
Resultados
1.- Fotocopiar e insertar los espectros de RMN obtenidos de compuestos puros y extractos. Con base
en el análisis de los mismos hacer la asignación de protones para los compuestos puros y comparar
con los datos bibliográficos (reportar un cuadro de datos con los valores obtenidos).
2.- Para los espectros de RMN de los extractos hacer lo mismo y sugerir los posible compuestos que
se encuentran presentes en los extractos analizados.
3.- Para los espectros de infrarrojo obtenidos fotocopiarlos y presentarlos en este informe, después
del análisis correspondiente, indicar los principales grupos funcionales que se encuentran presentes
en los compuestos puros y complementar con el espectro de resonancia obtenido, comparar con
datos bibliográficos.
4.- Con los espectros de IR de los extractos identificar los principales grupos funcionales e indicar
de que posibles compuestos se trata (apoyarse con los espectros de resonancia obtenidos).
CUESTIONARIO:
1. Escribe cuales son las principales ventajas y/o desventajas del usos de la resonancia magnética
para la identificación de productos naturales.
2. Que otros estudios requerirías para caracterizar los compuestos trabajados, descríbelos.
39
Práctica IV. DETECCIÓN DE ÁCIDOS FENÓLICOS EN TEJIDOS VEGETALES
OBJETIVOS:
1.- Identificar a los ácidos fenólicos por reacciones cromogénicas específicas
INTRODUCCIÓN:
Los compuestos fenólicos incluyen un amplio grupo de substancias vegetales que poseen como
característica común un anillo aromático que contiene uno o más sustituyentes hidroxilos. Como los
compuestos fenólicos son todos aromáticos, muestran una intensa absorción en la región UV del
espectro electromagnético.
Los compuestos fenólicos tienden a ser solubles en agua, sin embargo frecuentemente en los
organismos vivos se encuentran combinados con azúcares como glucósidos y por lo tanto
generalmente están ubicados en las vacuolas de los vegetales.
Tanto los fenoles libres como los ácidos fenólicos son considerados como grupo único ya que la
mayoría de las veces se identifican juntos durante el análisis fotoquímico de las plantas. Los ácidos
p-hidroxibenzóico, vainíllico y siríngico se encuentran usualmente presentes en las angiospermas,
sin embargo, en las gimnospermas se ha indicado que el ácido siríngico está ausente. Otros ácidos
como el salicílico o el o-protocatecuíco son característicos de las Ericáceas.
REACTIVOS Y DISOLVENTES:
Hojas frescas de angiospermas y gimnospermas (alumno), Acetato de etilo, Acetona, cloroformo,
Acido acético, Hidróxido de amonio 2M, Ácido p-hidroxibenzóico, Ácido vainíllico, Ácido
siríngico, Ácido salicílico, Reactivo de Folin, ácido clorhídrico 2 M (500 mL), etanol de 96°
Materiales y equipo
5 Tubos para resonancia
2 Matraces Erlenmeyer 250 mL
1 Probeta graduada de 50 mL
2 Vasos de precipitados de 100 mL 2 Vasos
de precipitado de 10 mL
1 Embudo de separación de 150 mL 1
Cámara cromatográfica con tapa
1 Baño de agua con temperatura controlada
1 Lápiz suave
1 Regla de plástico de 30 cm
1 Vaso de precipitados de 50 mL
1 Soporte Universal y anillo
Rotaevaporador
Lámpara de Luz UV
Cromatoplacas de silicagel de 20X20cm
PROCEDIMIENTO:
Colocar hojas (5-10 g aproximadamente) del material vegetal elegido; también puede analizarse un
helecho o el cuerpo fructífero de un hongo. En cada caso, sumergir los trozos del tejido en un matraz
Erlenmeyer de 250 mL con HC1 2M (cantidad suficiente para que cubra las hojas) y calentar por 1
hora en un baño de agua hirviente. Enfriar, decantar y extraer la fase acuosa con acetato de etilo en
el embudo de separación (3 lavados con 20 mL cada uno). Separar el extracto orgánico y concentrar
a sequedad en el rotaevaporador. Disolver cada residuo en 1-2 gotas de etanol de 95%. Analizar por
cromatografía en capa fina cada extracto hidrolizado, para ello utilizar placas de sílicagel de 25 mm
y desarrollar la cromatografía, por duplicado utilizando ácido acético-cloroformo (1:9) como
eluyente. En las placas cromatográficas colocar también patrones de ácidos vainíllico, phidroxibenzóico y siríngico. Después de desarrollar las placas, dejarlas secar, observarlas bajo luz
ultravioleta y en seguida revelarlas primero con el reactivo de Folin y luego con vapores de
amoniaco, además de otros reveladores indicados por el profesor (Ver apéndice 2 para su
preparación). Los ácidos aparecerán como manchas azules o malva en un fondo blanco con el
40
reactivo de Folin. Verificar la presencia de ácido siríngico en el tejido de angiospermas y notar la
ausencia de ácidos de este tipo en el tejido de plantas inferiores o gimnospermas.
RESIDUOS Y SU MANEJO:
Residuos de tejidos vegetales.
Se colocan en una bolsa de papel de estraza y se depositan en el cesto de la basura.
Residuos ácidos.
Se ajusta el pH entre 6 y 7 con hidróxido de potasio 0.1 M y se vierten en el recipiente de residuos
acuosos.
Acetato de etilo.
Se obtiene como producto de la destilación en el rotaevaporador; puede ser reutilizado si se coloca
en un frasco limpio de color ámbar.
Mezcla eluyente (Ácido acético: cloroformo).
Se ajusta el pH entre 6 y 7 con hidróxido de potasio 0.1 M y se vierte en el recipiente de residuos
orgánicos.
Gel de sílice.
Se retira de las placas raspando con una navaja de un filo y se deposita en el frasco de residuos de
sílica gel para su posterior limpieza y reutilización. Este procedimiento se realiza con mascarilla y
lentes protectores.
REFERENCIAS:
Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3ra ed. Chapman & Hall. Londres. 288 p.
Ikan, R. 1991. Natural Products. A laboratory guide. Academic Press, New York. 360 p.
Stahl, E. 1969. Thin Layer Chromatography. Springer Verlag. New York. 1041 p.
Soto, H. M. R. 2007. Fitoquímica, Manual de prácticas. Colegio de Postgraduados Campus
Montecillos. 102 p.
41
INFORME sesión 8.
TITULO DE LA PRÁCTICA
NOMBRE
FECHA
Resultados
1.- En la siguiente tabla resuma los resultados obtenidos a partir de la cromatografía en capa fina.
Especie
vegetal
Rfs
Muestra
Estándar
Color
Muestra
Compuesto
probable
Estándar
2.- Indicar la estructura de los ácidos fenólicos empleados como estándar en la práctica.
3.- Realizar la discusión de resultados y comparar con datos bibliográficos.
CUESTIONARIO
1.- ¿Qué importancia tiene el estudio de los ácidos fenólicos?
2.- Hacer un diagrama de su ruta biosisntética de los ácidos fenólicos utilizados en al práctica.
42
Práctica V. ANÁLISIS DE PIGMENTOS FLAVONOIDES EN SEMILLAS DEL GÉNERO
Phaseolus
OBJETIVO:
Aislar e identificar el pigmento flavonoide más abundante en la testa de semillas del género
Phaseolus.
INTRODUCCIÓN:
Los flavonoides son compuestos que están considerados dentro del grupo de los compuestos
fenólicos, debido a la presencia de anillos aromáticos en su estructura. Poseen un esqueleto
carbonado C6-C3-C6, en el cual los fragmentos C6 son anillos de benceno que están unidos por C3.
Su estructura puede ser abierta o cerrada. La variación en el estado de oxidación del anillo central de
pirano de los flavonoides, da lugar a la diferenciación entre estos compuestos. Se han identificado
14 tipos de flavonoides, los cuales se mencionan a continuación: flavonas, flavonoles, flavanonas,
dihidroflavonoles, chalconas, dihidrochalconas, auronas, isoflavonoides, antocianidinas,
leucoantocianidinas, neoflavonoides, biflavonoides, rotenoides y pterocarpanos.
Los flavonoides están distribuidos universalmente en las plantas superiores tanto en angiospermas
como en gimnospermas. También están presentes regularmente en helechos musgos y hepáticas.
Recientemente se ha reportado su presencia en algas, hongos y bacterias. Por lo general se
encuentran en estado libre o como glucósidos o derivados metilados.
En el caso de los pigmentos, la glicosilación es de gran importancia porque los hace solubles en la
savia, los protege de la oxidación enzimática y los hace fotoestables. Al igual que en las hojas y
flores, las antocianinas son las principales contribuyentes en el color de los frutos de las plantas
superiores. En algunos casos se encuentran en todo el fruto como en la fresa (pelargonidina), o bien
confinadas en el epicarpio como en la manzana (cianidina), o en el jugo del fruto como en las uvas (
delfinidina).
En las leguminosas las antocianinas pueden colorear las vainas de algunas especies o la testa de las
semillas como en el género Phaseolus en donde las diferentes especies presentan pigmentaciones
que han sido estudiadas por Feenstra (1960) quien ha aislado las 6 antocianinas más comunes así
como varios flavonol glucósidos.
REACTIVOS Y DISOLVENTES:
Semillas de fríjol: Phaseolus vulgaris L. y Phaseolus coccineus L (alumno), Ácido clorhídrico 2M,
Ácido clorhídrico: metanol (1:1) Butanol, Ácido trifluoro acético, Amoniaco.
Materiales y equipo
1 Vaso de precipitados de 10 mL
1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL
1 Probeta graduada de 100 mL
1 Micropipeta
1 Agitador de vidrio
1 Soporte Universal
1 Campana y embudos para filtración con
vacío
2 Cubetas de vidrio para el análisis
espectofotométrico
Espéctrofotómetro UV-Vis
Rotaevaporador
43
PROCEDIMIENTO:
Se pesan 25 g de semillas de fríjol, se colocan en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y se agregan 50
mL de una solución de ácido trifluoroacético en metanol al 3%, dejándolo reposar a 4°C por al
menos 24 h; filtrar teniendo cuidado que durante el proceso permanezcan las semillas intactas.
Concentrar el extracto a presión reducida. Se resuspende la muestra en metanol acidificado con
ácido clorhídrico al 1%. Se analiza por espectrofotometría UV, Visible y por cromatografía
descendente en papel.
Para la cromatografía se toma una hoja de papel Whatman No. 3 de 46 x 57 cm y se coloca la
muestra en forma de banda. Se desarrolla la cromatografía en forma descendente utilizando butanol:
ácido acético y agua, 4:1:5, (BAW, por sus siglas en inglés) como mezcla eluyente. (Fase superior).
Revelar con luz UV, vapores de amoniaco y revelador (NP) sin dejar pasar mucho tiempo (Ver
apéndice para su preparación).
Para el análisis con el espectrofotometría, se utiliza el espectrofotómetro UV-Vis, obteniendo el
espectro al hacer un barrido a diferentes longitudes de onda, utiliza como blanco para ajustar el
espectro una solución de metanol acidificado al 1%.
RESIDUOS Y SU MANEJO:
1 Granos de fríjol.
Se colocan en una bolsa de papel de estraza y se depositan en el cesto de la basura.
Metanol acidificado y Mezcla eluyente
Se ajusta el pH entre 6 y 7 con NaOH 1M y se depositan en el recipiente de residuos orgánicos
REFERENCIAS:
Goodwin, T. W. 1976. Chemistry and Biochemistry of Pigments. 2da.Ed. Vol. 1. Academie Press.
New York.870 p.
Goodwin, T. W. 1976. Chemistry and Biochemistry of Pigments. 2da.Ed. Vol. 2 . 1
Academic
Press. New York.372 p.
Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3rded. Chapman & Hall. Londres. 288p.
Wagner, H., S. Bladtt. 1996. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas. 2d. Ed.
Springer Verlag. New York. 384 p.
Soto, H. M. R. 2007. Fitoquímica, Manual de prácticas. Colegio de Postgraduados Campus
Montecillos. 102 p.
44
INFORME sesión 9.
TITULO DE LA PRÁCTICA
NOMBRE
FECHA
Resultados
1.- Obtener el espectro de absorción graficando los datos de absorbancia contra longitud de onda,
revisar datos bibliográficos e indicar que tipo de compuestos se encuentran presentes en el extracto.
2.- De igual forma escanear el cromatograma en papel obtenido o fotografiarlo y anexarlo a este
informe, hacer el análisis y comparación con datos bibliográficos para identificar los tipos de
compuestos de los que se trata.
3.- Escribir la posible estructura química de los compuestos identificados.
4.- Menciona las ventajas y desventajas de las técnicas utilizadas para caracterizar los compuestos
químicos.
CUESTIONARIO
1.- Describe las principales funciones de los flavonoides en las plantas
2.- Escribe la ruta metabólica de los flavonoides y cuales son los principales usos que les ha dado la
humanidad.
45
Práctica VI. ANÁLISIS DE ACEITES ESENCIALES DE SEMILLAS DE umbelíferas
OBJETIVOS:
1.- Obtener aceites esenciales de semillas de umbelíferas y su detección por cromatografía en capa
fina.
2.- Identificar los compuestos volátiles de semillas de umbelíferas por reacciones cromógenas.
INTRODUCCIÓN:
Los aceites esenciales pertenecen al grupo de los terpenoides. Bajo este término se agrupa a una
enorme cantidad de sustancias vegetales que tienen como característica fundamental originarse a
partir de una ruta biosintética común. Todos los terpenoides tienen como punto de partida la
molécula del isopreno: CH2 = C (CH3 ) - CH = CH2 y su esqueleto carbónico se constituye a partir
de dos o más de esas unidades de 5 carbonos. En su calidad de terpenoides, los aceites esenciales
pueden ser químicamente divididos en 2 grupos: mono y sesquíterpenoides (C10, C15), los cuales
difieren en el intervalo de su punto de ebullición: monoterpenoides entre 140 a 180°C y
sesquiterpenoides > 200°C.
Los aceites esenciales son los responsables de los aromas y sabores característicos encontrados en
muchas plantas. Por ello son comercialmente importantes en la perfumería, la industria de la
alimentación y la medicina.
Entre las familias de plantas que son especialmente ricas en aceites esenciales se incluye a las
compuestas, pináceas, rosáceas, rutáceas y umbelíferas, estas últimas serán motivo de estudio en
esta práctica.
REACTIVOS Y DISOLVENTES:
Semillas de anís (Pinpinella anisum L.), cilantro (Coriandrum sativum L.), comino (Cominum
cyminum L.), eneldo (Anethum graveolens L. ), perejil (Pertroselinum crispum L.), Cardamomo
(Elleteria cardomomum L. Maton), alcaravea (Carum carvi L.) (alumno), Eter etílico
Tolueno, Revelador de anisaldehído en medio ácido*, Revelador vainillina-ácido sulfúrico*,
Revelador 2, 4-dinitrofenilhídrazina* (*ver apéndice 2 para su preparación)
Materiales y equipo
2 Pipetas de 1 mL
1 Mortero con pistilo
1 Matraz volumétrico de 25 mL
2 Vasos de precipitados de 10 mL
1 Vaso de precipitado de 250 mL
1 Probeta de 25 mL
1 Matraz bola de 250 o 500 mL
5 Micropipetas
1 Agitador de vidrio
2 Placas cromatográficas de silicagel FG254,
de 20 X 20 cm.
1 Cámara cromatográfica con tapa
Parrilla eléctrica.
Estufa de aire forzado
Lámpara de luz UV
PROCEDIMIENTO:
Moler las semillas en el mortero, cubrirlas con éter y dejar reposar el extracto durante 30 min.
Decantar y concentrar el extracto a baño María o tomar una placa cromatográfica y trazar una línea
horizontal, a una distancia de 2 cm. del borde inferior de la placa. Sobre la línea trazada, aplicar con
las micropipetas los extractos por analizar, es decir, apoyando el capilar sobre la línea. Repetir varias
veces la aplicación de las muestras. Preparar otra placa de la misma manera. Introducir las placas
46
cromatográficas en la cámara de elusión la cual deberá contener la mezcla de tolueno:acetato de
etilo 93:7, tapar la cámara y esperar a que el eluyente suba hasta 0.5 cm. del borde superior, (40-60
min. aproximadamente). Sacar las placas de la cámara, marcar inmediatamente con el lápiz la
distancia recorrida por la mezcla eluyente y dejarlas secar. Observar las placas bajo luz UV y marcar
las manchas.
Asperjar la primera placa con el revelador vainillina-ácido sulfúrico, calentar a 100°C durante 10
minutos para desarrollar color. Asperjar la segunda placa con el revelador 2,4-dinitrofenilhídrazina
(DNP) y observar las manchas de color naranja, alternativamente la placa se puede asperjar con el
revelador de anisaldehído-ácido sulfúrico, calentando a 100°C por 10 minutos para desarrollar color
(Ver apéndice para la preparación de los reveladores).
RESIDUOS Y SU MANEJO:
Tejido vegetal macerado
Se coloca en una bolsa de papel de estraza y se deposita al cesto de la basura.
Mezcla de elusión tolueno:acetato de etílo
Se vierte en el recipiente de los residuos orgánicos.
Gel de Sílice
Una vez que se tomaron todos los datos se retira la silicagel de la placa raspando con una navaja de
un filo y se coloca en el recipiente de desechos de silica gel, para su posterior limpieza y
reutilización.
Tener la precaución de realizar esta actividad con mascarilla y lentes.
REFERENCIAS:
Ikan, R. 1991. Natural Prroducts. A Laboratory Guide. Academic Press, New York.360p.
Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3rd ed. Chapman & Hall. Londres. 288p.
Wagner, H., S. Bladtt. 1996. Plant Drug Analysis A Thin Layer Chromatography Atlas. 2d. Ed.
Springer Verlag. New York. 384 p.
Soto, H. M. R. 2007. Fitoquímica, Manual de prácticas. Colegio de Postgraduados Campus
Montecillos. 102 p.
47
INFORME sesión 10.
TITULO DE LA PRÁCTICA
NOMBRE
FECHA
Resultados
1.- En el cuadro 1 se presentan los valores de Rf de diferentes aceites esenciales encontrados en
semillas de plantas de la familia umbelíferas, haz un cuadro con los datos obtenidos en la
cromatografía y compara los valores de Rf con el cuadro 1, escribe las conclusiones a las que
llegues.
Cuadro 1.- Listado e identificación por Rf y color de algunos de los aceites esenciales presentes en
las semillas de las umbelíferas en estudio.
Rf (X100)
COMPUESTO
GENERONOMBRE
COLOR Y
ESPECIE
COMUN
REVELADOR
APROX.
Anís
Perejil
Pimpinella anisum
Petroselinum
crispum
Coriandrum sativum
Cilantro
Comino
Cuminum cyminum
Alcaravea Carum-carvi L.
Anethum graveolens
Eneldo
Cardomomo Elleteria
cardomomum
85
40
64
Anetol
Anilsaldehído
Apiol
Naranja-DNP
Naranja-DNP
Café-Vainillina
30
59
46
43
40
Linalol
Cuminaldehído
Carvona
Carvona
Cineol
Malva-vainillina
Naranja-DNP
Naranja-DNP
Naranja-DNP
Azul y violeta
Vainillina
2.- Escriba las estructuras químicas de los compuestos identificados.
CUESTIONARIO
1.- Describe las principales funciones de los aceites esenciales en las plantas
2.-. Describe por lo menos 3 métodos de análisis que se reportan para el estudio de aceites esenciales
3.- Escribe cual es la ruta metabólica de biosíntesis de los aceites esenciales.
48
Práctica VII. ANÁLISIS DE ALICINA EN Allium spp.
OBJETIVO:
1.- Aislar el compuesto azufrado alicina de Allium spp.
INTRODUCCIÓN:
Además de los aminoácidos cisteína y metionina que contienen azufre, existen otros compuestos
orgánicos comprendidos dentro de los metabolitos secundarios que contienen azufre. Su distribución
dentro del Reino Vegetal es restringida. Muchos de ellos son volátiles y presentan un olor o sabor
irritante muy característico, lo que facilita su detección durante la extracción y aislamiento.
Dentro de este grupo encontramos a los glucosinolatos, universalmente distribuidos en la familia de
las Crucíferas y familias relacionadas del orden. Los glucosinolatos son precursores del aceite de
mostaza y sólo provocan el olor irritante después de sufrir hidrólisis enzimática. Ello ocurre cuando
el tejido fresco es macerado y la enzima hidrolítica, una tioglusidasa conocida como mirosinasa
libera los isotiocianatos.
Se conocen alrededor de 70 glucosinolatos siendo la mayoría derivados alifáticos con un remanente
con sustituyentes bencilo. La estructura es la misma y el azufre ligado al azúcar, que es siempre
glucosa. Los glucosinolatos son sintetizados a partir de aminoácidos. En cuanto a su función en las
plantas se sabe que tienen acción antibacteriana, y algunos ejercen atracción alimenticia a orugas y
áfidos que se alimentan de crucíferas.
Por lo que se refiere a los tiofenos, estos ocurren únicamente en la familia Asteraceae. Se encuentran
en asociación con poliacetilenos. El primero que se descubrió fue el α-tertienil en los pétalos de
Tapetes, el cual es un trímero de tiofeno, pero la mayoría de los 100 o más tiofenos descubiertos
tienen cadenas laterales que contienen sustituciones acetilénicas.
Como tercer grupo de compuestos azufrados podernos mencionar a los sulfuros orgánicos, los
cuales se encuentran ampliamente distribuidos en el género Allium (ajo). El sabor del ajo, rábano y
cebolla se debe a la presencia de estos compuestos.
Ellos son inmediatamente reconocidos por su olor pungente y sus propiedades lacrimógenas.
Probablemente se encuentran en los tejidos intactos como aminoácidos sulfurados. Entre ellos se
puede mencionar a la aliína y alicina. Este último ha sido aislado en estado puro como un líquido
incoloro que contiene aproximadamente un 40% de azufre en su molécula. Se ha demostrado
también su actividad antibacteriana (Cavallito y Bailey 1944).
REACTIVOS Y DISOLVENTES:
1 diente de ajo (alumno), Agua destilada, Etanol, Éter etílico, Cloroformo, Metanol, Tolueno,
Acetato de Etilo, Diclorometano.
Materiales y equipo
1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL
1 Vaso de precipitados de 250 mL 1 Embudo
de tallo largo
1 Agitador
1 Embudo de separación de 300 mL 1
Mortero con pistilo
1 Congelador
1 Matraz Erlenmeyer de 1 L 1 Probeta de 25
mL
Papel filtro Whatman # 1 1 Espátula metálica
1 Frasco de cultivo con tapa
Placas de sílicagel GF254 de 2X5 y de 20X20
cm.
1 Rotaevaporador
49
PROCEDIMIENTO:
El diente de ajo picado, se ponen en170 mL de etanol al 95% o 15 mL de amortiguador de fosfatos a
pH 6. Se agita por 15 minutos y se filtra. En el caso del extracto etanólico se concentra a presión
reducida hasta que todo el etanol sea removido. En el caso de la extracción con el amortiguador de
fosfatos agregar 10 mL de hexano y se prosigue como indica método. En el caso del concentrado
etanólico, éste se combina con 25mL de agua + 10 mL de hexano. Posteriormente, se separa la fase
orgánica y la fase acuosa se extrae con 4 porciones de 25 mL c/u de éter etílico o diclorometano; el
extracto obtenido se guarda en congelación para separar trazas de agua residual. Se evapora el
disolvente en el rotaevaporador obteniéndose un líquido incoloro, que corresponde a la alicina.
La detección de los compuestos de azufre en el extracto de ajo puede hacerse a través de la técnica
de CCF, para la cual se aplica la muestra según las técnicas ya indicadas y se desarrolla, utilizando
como mezcla eluyente tolueno:acetato de etilo 100:30 (v/v). Una vez desarrollado el cromatograma
se retira de la cámara, se permite la evaporación del disolvente y se observa bajo la lámpara de UV.
Enseguida se puede preparar el revelador con los siguientes reactivos:
1).- Cloruro estaño en medio ácido y anisaldehído en medio ácido.
2).- Vainillina en medio ácido.
Ver apéndice 2 para la preparación de estos reveladores. Se revela cada placa con cada uno de los
reveladores
RESIDUOS Y SU MANEJO:
Material vegetal macerado (ajo)
Se coloca en una bolsa de papel encerado y se deposita en el cesto de la basura.
Etanol, Éter etílico, Mezcla eluyente
Se colocan en el recipiente de residuos orgánicos
Placas cromatográficas.
Retirar la sílica, utilizando para ello una navaja de un filo, la cual se deposita en el recipiente sílica
gel, para su limpieza y posterior reuso.
REFERENCIAS:
Cavallito, C.J. y Bailey, H.J. 1944. the antibacterial principie of Allium sativum.I. Isolation,
physical properties and antibacterial action.J. Am. Chem. Soc. 66:1950.
Harborne, J.B. 1983. Phytochemical Methods. Chapman and Hall, Londres. 289 p.
Keusgen,M. 1997. TLC Analysis of Allium sativum Constituents. Planta Medica 63: 93- 94.
Wagner, H., Bladt, S. 1996. Plant Drug Analysis. Springer Verlag. Berlin. 384 p.
Soto, H. M. R. 2007. Fitoquímica, Manual de prácticas. Colegio de Postgraduados Campus
Montecillos. 102 p.
50
INFORME sesión 11.
TITULO DE LA PRÁCTICA
NOMBRE
FECHA
Resultados
1.- Indicar el rendimiento de alicina obtenido (escribir los cálculos correspondientes)
2.- Indicar Rf experimental y compararlo con el obtenido bibliográficamente, hacer al discusión
correspondiente y escribir conclusiones.
3.- Escriba las estructuras químicas de la alicina
CUESTIONARIO
1.- Describe las principales funciones de los compuestos azufrados en las plantas
2.- Menciona los principales usos que se le dan los compuestos azufrados de las plantas.
3.- Escribe cual es la ruta metabólica de biosíntesis de los compuestos azufrados.
51
Práctica VIII. EXTRACCIÓN DE CAFEÍNA DE HOJAS DE TÉ NEGRO
OBJETIVOS:
1.- Aislar cafeína de hojas de té negro.
2.- Caracterizar el producto obtenido por su p.f., pruebas de color y formación de un derivado.
INTRODUCCIÓN:
La cafeína es uno de los más importantes metil derivados naturales de la xantina (1, 3, 7trimetilxantina). La concentración de este alcaloide, que se encuentra en el café, té, nuez de cola,
mate, etc., varía dependiendo de las condiciones climáticas y topográficas en las que se desarrollan
los cultivos de donde se extrae. Se ha encontrado un intervalo de variación entre 2.0 a 4.6% de
cafeína en dichos vegetales.
La cafeína presenta varias acciones farmacológicas de interés terapéutico. Es fisiológicamente activa
produciendo un efecto estimulante sobre el sistema nervioso central (SNC). La popularidad de las
bebidas que contienen cafeína es parcialmente debida a este efecto; sin embargo, su consumo en
exceso puede causar efectos irritantes tales como nerviosismo e insomnio. Además de su efecto
sobre SNC la cafeína actúa sobre el riñón para producir diuresis; estimula el músculo cardiaco y
relaja el músculo liso, especialmente el bronquial.
REACTIVOS Y DISOLVENTES:
Hojas de Té Negro Camellia sinensis L. o en su defecto bolsitas de te negro (alumno),
Diclorometano, Acetato de plomo al 10%, Agua destilada, Hidróxido de amonio Acetona, Yoduro
de potasio, Yodo, Metanol, Acetato de etilo, Agua oxigenada, carbonato de calcio, Papel filtro,
Ácido clorhídrico, Tela de algodón.
Materiales y equipo
1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL
1 Anillo metálico
2 Vasos de precipitados de 400 mL
1 Embudo de vidrio tallo corto
1 Probeta graduada de 100 mL
1 Vaso de precipitado de 50 mL
1 Embudo de separación de 500 mL
1Matraz Erlenmeyer de 50 mL
1 Matraz Kitazato de 500 mL
1 Vidrio de reloj
1 Embudo Büchner de 8 cm diam.
1 Agitador de vidrio
1 Recipiente p/baño María
1 Pipeta Pasteur
1 Soporte metálico
1 Parrilla de calentamiento
1 Espátula
1 Cápsula de porcelana
Balanza analítica
Rotaevaporador
PROCEDIMIENTO:
Poner a hervir 100 mL de agua destilada en vaso de precipitados de 400 mL. Sumergir en el vaso
10-11 g de hojas de té (cinco bolsitas de té negro) y hervir por 15 min. Enfriar, remover las bolsas
de té, exprimiéndolas con unas pinzas. Añadir 5.0 g de carbonato de calcio y calentar por 5 min.
Filtrar la mezcla a un vaso limpio a través de la tela de algodón y exprimir la tela. Filtrar ahora con
vacío en un embudo Büchner para eliminar por completó el residuo de té. Enfriar el filtrado a
temperatura ambiente y pasarlo al embudo de separación; añadir 30 mL de diclorometano y agitar el
embudo suavemente, dejar separar las fases, quitar el tapón del embudo y drenar la fase orgánica
inferior de la fase acuosa superior. Repetir la extracción de la fase acuosa con dos porciones más de
diclorometano (30 mL c/u). Evaporar el disolvente en el rotaevaporador. Purificar la cafeína cruda
52
con acetona. Dejar secar los cristales. Pesar el producto, determinar su p.f. y efectuar las siguientes
pruebas:
a).- Poner unos cuantos cristales de cafeína en una cápsula de porcelana y añadir 3 gotas de H202 + 3
gotas de HC1. Evaporar a sequedad con calor y añadir 2 gotas de hidróxido de amonio; observar la
formación de un color púrpura. (Prueba de la Murexida).
b).- Como prueba adicional obtener el espectro UV de la cafeína, observándose λ max a 278 nm.
c).- Alternativamente realizar la cromatografía en capa fina utilizando como mezcla eluyente acetato
de etilo: metanol: agua (100:13.5:10). Revelar con el revelador de yodo/yoduro de potasio en medio
ácido (Ver apéndice 2 para su preparación).
RESIDUOS Y SU MANEJO:
Bolsitas con te negro
Se colocan en bolsa de papel de estraza y se depositan en el cesto de la basura.
Diclorometano
Se deposita en el recipiente de residuos halogenados.
Mezcla de etanol:éter etílico y Éter de petróleo
Se vierten en el recipiente de residuos orgánicos.
Residuos de la prueba de Murexida (ácido clorhídrico, hidróxido de amonio).
Dado que se trata de pequeñas cantidades del orden de unos cuantos mililitros, se diluye con agua y
se vierte en el recipiente de los residuos acuosos.
REFERENCIAS:
Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3a ed. Chapman & Hall. Londres. 288 p.
Ikan, R. 1991. Natural Products. A Laboratory guide. Academic Press New York. 293 P.
Pavia, D.D., Lampman, G.M. y Kriz, G.S. Jr. 1976. Introduction to Organic Laboratory Techniques.
W.B. Saunders Co. Filadelfia. 699 p.
Soto, H. M. R. 2007. Fitoquímica, Manual de prácticas. Colegio de Postgraduados Campus
Montecillos. 102 p.
53
INFORME sesión 12.
TITULO DE LA PRÁCTICA
NOMBRE
FECHA
Resultados
1.- Indicar el rendimiento de cafeína obtenido (escribir los cálculos correspondientes)
2.- Indicar los valores del punto de fusión, Rf experimental y espectro de la cafeína obtenida y
compararlo con datos bibliográficos, hacer la discusión correspondiente y escribir conclusiones.
3.- Escriba las estructura química de la cafeína y las reacciones químicas con su mecanismo de
reacción, que se efectúan en la la prueba de Murexida.
CUESTIONARIO
1.- Mencione fuentes naturales para el aislamiento de cafeína, incluyendo la referencia bibliográfica
2.- Explique el fundamento del proceso de extracción de cafeína
3.- En que se basa el proceso de recristalización por par de disolventes
4.- Menciona los principales usos que se le dan a la cafeína y sus efectos fisiológicos.
3.- Escriba cual es la ruta metabólica de biosíntesis de la cafeína.
54
APÉNDICE 2
REVELADORES
1)
Natural product's polietilenglicol (NP/PEG)
La placa se asperja con una solución al 1% en metanol (10mL) de: P-etíl-aminoéster del ácido
difenil bórico (NP), seguido por una solución al 5% de polietilenglicol 4000 en metanol (8 mL).
2)
Reactivo de Libebermann-Burchard.
Se añade cuidadosamente 5 mL de anhídrido acético y 5 mL de ácido sulfúrico concentrado a 50 mL
de etanol absoluto previamente enfriado en hielo. El reactivo se usa fresco. La placa se asperja con
10 mL del reactivo y se calienta a 100° C por 5–10 min.
3)
Reactivo de 2,4–dinitrofenilhidracina (DNPH).
Se disuelve 0.1 g del 2,4-dinitrofenilhidracina en 100 mL de metanol, se añade 1 mL de HCL al
36%. La placa se asperja en 10 ml del reactivo y se evalúa inmediatamente.
4)
Reactivo de Dragendorff (DRG)
Solución a) Se disuelven 0.85 g de nitrato básico de bismuto en 10 mL de ácido acético glacial y 40
ml de agua (con calentamiento y filtración si es necesario).
Solución b) Se disuelven 8 g de ioduro de potasio en 30 mL de agua.
Solución stock. Solución a y b se mezclan 1:1. La placa se asperja adicionalmente con 10 mL del
reactivo para asperjar: 1 mL de sol. Stock se mezcla con 2 ml de ácido acético glacial y 10 mL de
agua.
El color de las manchas se intensifica cuando la placa se asperja adicionalmente con 10mL de ácido
sulfúrico al 10% en etanol o Nitrito de sodio al 10% en agua. La placa se calienta en la estufa por 5–
10 min.
5)
Reactivo de vainillina – Ácido sulfúrico
Solución I. Vainilla al 1% en etanol
Solución II Ácido sulfúrico al 10% en etanol
La placa se asperja con 10 ml de solución I, seguida de 10 mL de solución II. La placa se calienta a
110° C por 5 – 10 min.
6)
Revelador de anisaldehído
Anisaldehído, ácido sulfúrico, ácido acético glacial. Se mezclan en la siguiente proporción:
10:0.2:0.1 mL.
La placa se calienta en la estufa por 5 – 10 min.
7)
Revelador de cloruro estanoso y anisaldehído.
a)
Se disuelven 250 mg de SnC12 en 5 mL de HC1 y 5 mL de metanol.
b)
Se disuelven 0.5 mL de anisaldehído en 10 mL de ácido acético, se añaden 85 mL de
metanol y 5 mL de ácido sulfúrico concentrado, en ese orden.
c)
La placa de asperja con 10 mL de "a" y enseguida con 10 mL de "b" y se calienta a 110°C
por 7 min.
8)
Revelador de Carr-Price.
Solución al 20% de tricloruro de antimonio en cloroformo o etanol.
La placa se asperja con 10-15 mL del reactivo y enseguida se calienta por 5-6 min a 100°C. Se
evalúa tanto en UV (365nm) como en visible.
Reveladores de Acidos Fenólicos
1)
Reactivo de Gibbs
Se prepara una solución de 0.5% de 2,6-dicloroquinona cloroimida
La placa de asperja con 10 mL de esta solución e inmediatamente se expone a vapores de amoniaco.
2)
Reactivo de Pauli
55
Sol. A. Se disuelven con calentamiento 450 mg de ácido sulfanílico en 4.5 mL de HC1 12N y se
diluyen a 50 mL.
Sol. B. Se prepara una solución acuosa al 4.5% de nitrito de sodio en agua. Ambas soluciones se
mantienen a 4°C. Al momento de asperjar la placa se usan volúmenes 1:1 de A y B mas 1 vol. igual
de Na2CO3; al 10%.
3)
Ferricianuro de potasio-cloruro férrico.
Sol. A. Se prepara una solución acuosa al 1% de ferricianuro de potasio
Sol. B. Se prepara una solución acuosa al 2% de cloruro férrico.
Cantidades iguales de A y B se mezclan al momento de asperjar la placa. Los colores se realzan al
asperjar la placa con HC1 2N
4)
Cloruro férrico Se prepara una solución al 1-5% de cloruro férrico en HC1 0.5N
5)
Reactivo de Folin-Ciocalteu
Sol. A. Carbonato de sodio al 20%
Sol. B: Reactivo de Folin
La placa se asperja primero con sol. A y luego con sol. B., después de un breve secado.
6)
Reactivote Vainillina-Ácido acético
0.8g de vainillina se disuelven en 40 mL de ácido acético glacial y se añaden en 2 mLl de ácido
sulfúrico concentrado.
La placa se asperja con 10 mL de la solución y se calienta por 3-5 min (110°C)
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