LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA DGE-InDRE–RNLSP 2013 EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 1 de 52 Julio 2013 PRIMERA EDICIÓN, 2013 EDA BACTERIANA–RNLSP Este documento fue avalado por los representantes de las instituciones que conforman el Grupo Técnico Interinstitucional del Comité Nacional de Vigilancia Epidemiológica (CoNaVE). TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY, © INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA” VERSIÓN NO. 01. INDRE, 2013. COLECCIÓN PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE: ISBN: EN PROCESO INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICO. PROLONGACIÓN DE CARPIO 470, COL. SANTO TOMÁS DEL. MIGUEL HIDALGO, C. P. 11340, MÉXICO, D. F. TEL. (55)53-42-75-50 WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE: EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 2 de 52 Julio 2013 SECRETARÍA DE SALUD DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ SECRETARIA DE SALUD DR. PABLO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD DR. CUITLÁHUAC RUÍZ MATUS DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DEL INDRE EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 3 de 52 Julio 2013 INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DRA. MA. DEL CARMEN GUZMÁN BRACHO DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO LIC. DIANA ALEX FLORES ROMERO SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN M EN C IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS M EN C MAYRA GISELA MELÉNDEZ HERNÁNDEZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA M EN C JUDITH ESTÉVEZ RAMÍREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE TÉCNICAS QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA Q.F.B. MARÍA ASUNCIÓN MORENO PÉREZ JEFA DEL LABORATORIO DE CÓLERA Y ENTEROBACTERIAS COORDINADORA DE LA RED DE CÓLERA Y ENTEROBACTERIAS EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 4 de 52 Julio 2013 LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA DGE-InDRE–RNLSP 2013 EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 5 de 52 Julio 2013 ÍNDICE INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 7 ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA (RNLSP) PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA ............................................................................................................................. 7 RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA ...................................................................................... 9 MARCO LEGAL DEL LABORATORIO ................................................................................. 10 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 10 ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA) BACTERIANA......................................................................... 11 FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE EDA BACTERIANA................... 12 DEFINICIÓNES OPERATIVAS ............................................................................................... 14 TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRA ........................................................................... 16 ALGORITMO DIAGNÓSTICO ................................................................................................ 17 ESTÁNDARES DE CALIDAD ................................................................................................. 18 CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS .............................................................................. 19 PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) ......................... 19 CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO ............................................... 20 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ..................................................................................... 20 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 21 ANEXO 1. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ............................................................................... 23 ANEXO 2. INTERPRETACIÓN Y RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS ........... 44 ANEXO 3. RESULTADO DE PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN........................................... 51 Grupo somático ................................................................................................................... 51 Antisuero flagelar ............................................................................................................... 51 EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 6 de 52 Julio 2013 INTRODUCCIÓN Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud pública. Son una de las principales causas de mortalidad y morbilidad de la niñez en el mundo y generalmente son consecuencia de la exposición a alimentos y agua contaminados. En países industrializados, los niños menores de tres años presentan en promedio tres episodios de diarrea al año. Esta alta incidencia hace necesario que la población, esté sujeta a vigilancia epidemiológica para identificar de forma oportuna eventos que signifiquen un riesgo de salud para la población y con base en los hallazgos, tomar decisiones para las acciones de planeación, control y prevención de las enfermedades sujetas a vigilancia. En México, las acciones de vigilancia se apoyan en el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE), el cual cuenta con el subsistema de laboratorio para llevar a cabo las actividades de vigilancia de manera oportuna y uniforme para el diagnóstico de cólera, salmonelosis, shigelosis y otras enfermedades bacterianas transmitidas por alimentos. El presente documento establece los lineamientos de operación para la vigilancia basada en los hallazgos de laboratorio de la enfermedad diarreica aguda bacteriana incluyendo las funciones por niveles; la toma, manejo y envío de muestras; la metodología para el análisis de muestras (métodos tradicionales y métodos moleculares); la evaluación del desempeño así como los estándares de calidad. ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA (RNLSP) PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA El Laboratorio de Cólera y Enterobacterias, de forma conjunta con la Dirección General Adjunta de Epidemiología (DGAE) y el Programa de Cólera y Urgencias, son responsables de la vigilancia epidemiológica del cólera en México. A nivel internacional, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha desarrollado una estrategia creando una red de vigilancia de las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA). El objetivo primario de esta red es apoyar la vigilancia de los patógenos transmitidos por alimentos, con base en el orden de prioridades y de acuerdo al impacto y severidad de enfermedad que ocasiona cada uno de los patógenos asociados. Este proyecto es coordinado por la (Organización Panamericana de Salud y la Organización Mundial de la Salud) OPS-OMS, la Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS) “Dr. Carlos G. Malbran” de Argentina a través del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas y los Centros de Control de Enfermedad y Prevención [Centers for Disease Control and Prevention (CDC), por sus siglas en ingles]. En 1939 fue creado en México el Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales (ISET) y al interior de éste el Centro de Salmonelas. Años más tarde, en 1971, se incorporan nuevos diagnósticos para dar origen al Laboratorio de Bacteriología Entérica como una necesidad para tener un sitio destinado al estudio de patógenos entéricos con fines de apoyo a la vigilancia epidemiológica. Este nuevo laboratorio inició su trabajo analítico con el aislamiento e identificación de Shigella dysenteriae tipo 1 y en 1972 tuvo una participación muy importante en el estudio de los brotes de tifoidea. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 7 de 52 Julio 2013 Debido a la inminente llegada al Continente Americano de la séptima pandemia de cólera que inició en 1961 en Indonesia, en 1990 se fundó en el Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) el Laboratorio de Cólera para identificar al agente etiológico en los casos compatibles con este padecimiento. A partir de junio de 1991, cuando se reportó el primer caso de cólera en México, se creó paulatinamente la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública en apoyo a la vigilancia epidemiológica y desde entonces, el InDRE coordina a los laboratorios que realizan la búsqueda de patógenos entéricos como Vibrio cholerae, Salmonella spp y Shigella spp. En 1992 se creó el Laboratorio de Bacteriología Entérica II y se dio inicio a la realización de estudios moleculares para Escherichia coli y posteriormente para Vibrio cholerae. En la actualidad, el InDRE es el Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) para Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. Realiza pruebas serológicas, pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos y pruebas moleculares para la búsqueda de genes de toxigenicidad, determinación de patotipos o el análisis de clonas. Proporciona los reactivos para la caracterización de Vibrio cholerae y la identificación de grupo de Salmonella spp y Shigella spp, imparte cursos de capacitación y capacitaciones en servicio al personal del sector salud y lleva a cabo el aseguramiento de la calidad de la red a través de programas de evaluación del desempeño. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 8 de 52 Julio 2013 RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA PRUEBA Autosuficiencia Aislamiento e en el identificación. diagnóstico Pruebas moleculares (PCR) 2009 31 LESP 2010 31 LESP 2011 31 LESP 0 0 0 VIGILANCIA DE LA 2012 META 31 31 y D.F. LESP 0 31 y D.F. Estados de la República Mexicana que realizan el aislamiento y la identificación de agentes causantes de Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana (Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus). Fig. 1. Conformación de la red para el diagnóstico de EDA Bacteriana. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 9 de 52 Julio 2013 MARCO LEGAL DEL LABORATORIO 1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF 05/02/1917, Última Reforma D.O.F. 15/02/2012. 2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y 141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012. 3. NORMA Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica. DOF: 19/02/2013 4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Protección ambiental-salud ambiental-residuos peligrosos biológico-infecciosos-clasificación y especificaciones de manejo. 5. NORMA Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006. 6. PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-016-SSA2-2009. Para la vigilancia, prevención, control, manejo y tratamiento de cólera. DOF 21/02/2012. 7. Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, publicado en el Diario Oficial de la Federación el 19 de enero de 2004. OBJETIVOS Objetivo general Instaurar los procedimientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico de cólera y enterobacterias y establecer el manejo adecuado de la información generada por laboratorio, a través de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP), en apoyo a la Vigilancia Epidemiológica de la enfermedad diarreica aguda bacteriana. Objetivos específicos Detectar la circulación de los principales agentes bacterianos causantes de enfermedad diarreica aguda. Realizar la caracterización de los aislamientos de Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus. Mantener la vigilancia de la circulación de Vibrio cholerae O1 y Vibrio cholerae O139. En situaciones de brote, realizar estudios de electroforesis de campos pulsados (PFGE) del agente bacteriano relacionado. Proporcionar datos relevantes sobre estos patógenos en la Enfermedad Diarreica Aguda, que sean útiles para estudios epidemiológicos de vigilancia bacteriológica. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 10 de 52 Julio 2013 ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA) BACTERIANA DE La Red Nacional de Laboratorios de Diagnóstico de Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana la encabeza el Laboratorio de Cólera y Enterobacterias, adscrito al Departamento de Bacteriología del InDRE, integrada por los Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) a través de los componentes de cólera y enterobacterias y los laboratorios locales, aunado a los laboratorios públicos y privados que realicen el diagnóstico de EDA bacteriana. LABORATORIO DE CÓLERA Y ENTEROBACTERIAS InDRE [(Laboratorio Nacional de Referencia (LNR)] Muestras Resultados Laboratorios de Diagnóstico de EDA Bacteriana (LESP) (Redes Estatales de Diagnóstico) Laboratorios Locales de Diagnóstico de EDA Bacteriana (Redes Locales de Diagnóstico) Redes de Apoyo Jurisdiccionales Laboratorios Locales de Diagnóstico públicos y privados que realicen el diagnóstico de EDA Bacteriana Fig. 2. Flujo de trabajo de la Red Nacional de Laboratorios para el diagnóstico de Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 11 de 52 Julio 2013 FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE EDA BACTERIANA FUNCIONES DEL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA El laboratorio de cólera y enterobacterias del InDRE, es el Laboratorio Nacional de Referencia y la pieza normativa para el diagnóstico. Se considera que entre sus funciones que competen al área de la Red de Laboratorios, se encuentran: Realizar el análisis de muestras y confirmación inmediata de las cepas que por su naturaleza se consideren urgentes. Mantener algoritmos de referencia y criterios de interpretación de resultados preestablecidos. Realizar el control de calidad de la red mediante el programa de evaluación del desempeño a los LESP a través de: o Monitorear el desempeño de la Red de Laboratorios de Diagnóstico de EDA Bacteriana. o Aplicar el programa de evaluación externa del desempeño (PEED). Proveer capacitación en servicio para la formación de recursos humanos con base a las necesidades detectadas. Supervisar a los laboratorios estatales. Proporcionar apoyo técnico a los laboratorios que lo requieran y lo soliciten. Realizar investigación operativa en apoyo a la vigilancia epidemiológica. Generar información de orden nacional en materia de diagnóstico, control de calidad, formación de recursos humanos e investigación en la vigilancia epidemiológica que coadyuve a la toma de decisiones en el control y prevención de la enfermedad en el marco del programa nacional de salud. FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS ESTATALES DE SALUD PÚBLICA Para el diagnóstico Realizar los estudios analíticos básicos para el diagnóstico de enfermedad diarreica aguda bacteriana de importancia en salud pública: aislamiento e identificación de Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. Realizar la búsqueda de Escherichia coli sólo en situación de brote o cuando se trate de menores de cinco años que presenten evacuaciones con sangre y moco. Enviar de 3 a 5 aislamientos en cualquier caso, de cada paciente al InDRE. Asegurar la calidad del diagnóstico en el laboratorio de cólera y enterobacterias. o Enviar al InDRE el 100% de los aislamientos de Vibrio cholerae O1, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. o Enviar al InDRE del 100% de los aislamientos de Vibrio cholerae no O1 aislados de seres humanos. o Enviar al InDRE del 30% de los aislamientos de Vibrio cholerae no O1 aislados de muestras ambientales y de alimentos. Emitir en tiempo y forma los resultados de los exámenes de laboratorio. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 12 de 52 Julio 2013 Generar evidencia y notificar al órgano normativo estatal correspondiente los casos confirmados. Participar como mecanismo de apoyo técnico, proporcionando la información relacionada y requerida por el Programa de Cólera y Urgencias de su entidad federativa. Determinar la resistencia a los antimicrobianos ajustándose a los lineamientos vigentes del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Para el monitoreo del desempeño Coordinar a los laboratorios locales que realicen el análisis de muestras para la vigilancia epidemiológica de EDA Bacteriana. Asegurar que se lleven a cabo los procedimientos, métodos y técnicas estandarizadas. Seleccionar las muestras para referencia del área de influencia del LESP. Compilar las muestras de los laboratorios locales o jurisdiccionales y realizar el control de calidad indirecto de los mismos. Reportar inmediatamente las incongruencias encontradas. Realizar el análisis de la información generada. Recabar y analizar la información sobre la prestación de servicios de diagnóstico de los laboratorios locales para el aseguramiento de la calidad de la red. Para el Programa de Evaluación Externa del Desempeño Participar en la evaluación del desempeño del InDRE, a través de los programas oficiales correspondientes. Realizar la evaluación del desempeño en los componentes de cólera y enterobacterias a los laboratorios locales. Generar la evidencia de la evaluación para la red y enviar copia de resultados al laboratorio evaluado y al InDRE. Organizar la información de estas actividades y proporcionarla cuando sea requerida por las instancias evaluadoras. Para capacitación Capacitar en el área de EDA Bacteriana al personal de los laboratorios locales y demás instituciones del Sector Salud que lo requieran en su entidad de acuerdo con las necesidades detectadas para la participación en estrategias especiales de vigilancia como son los Núcleos Trazadores de Vigilancia Epidemiológica. Apoyo técnico Participar en las urgencias epidemiológicas en el área de su competencia. Podrán colaborar y/o elaborar trabajos de investigación operativa que proporcione información prioritaria estatal, una vez que los protocolos sean aceptados por los comités de investigación. Apoyar con la preparación y/o evaluación de los reactivos que utilizan los integrantes de la red. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 13 de 52 Julio 2013 Apoyar en la selección para la adquisición y en el suministro de materiales y reactivos requeridos por los laboratorios de la red estatal de acuerdo a la evaluación proporcionada por el InDRE. Participar en la elaboración y actualización de los manuales técnicos referentes a diagnóstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos biológicoinfecciosos, etc.) para uso en el ámbito estatal y local. FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS A NIVEL LOCAL Recepción e identificación de las muestras recibidas. Realizar los estudios analíticos para el diagnóstico de enfermedad diarreica aguda bacteriana de importancia en salud pública de acuerdo con los lineamientos preestablecidos: Aislamiento e identificación de Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. Realizar la búsqueda de Escherichia coli sólo en situación de brote o cuando se trate de menores de cinco años que presenten evacuaciones con sangre y moco. Enviar de 3 a 5 aislamientos de cada paciente al InDRE. Participar como mecanismo de apoyo técnico, proporcionando la información relacionada y requerida por el Programa de Cólera y urgencias de su jurisdicción sanitaria. Reportar los casos encontrados diariamente a la instancia correspondiente. Aplicar las recomendaciones del nivel estatal. Cumplir con el programa de control de calidad indirecto que establece el nivel estatal. Participar en la evaluación del desempeño que organice el nivel estatal. Recibir capacitación y asesoría del nivel estatal. DEFINICIÓNES OPERATIVAS (Salud, 2012) Caso de EDA: Todo paciente de cualquier edad que demande atención médica por presentar cinco o más evacuaciones diarreicas en 24 horas durante no más de cinco días con o sin signos de deshidratación. Definición de caso EDA sin deshidratación: Paciente que presenta menos de cuatro evacuaciones líquidas en 24 horas, con o sin presencia de vómito, sin pérdida de peso y sin signos clínicos de deshidratación. Caso de EDA moderada: Paciente de cualquier edad que demande atención médica por presentar cuadro diarreico con cinco o más evacuaciones en 24 horas, cuya evolución sea menor a cinco días y que presente datos de deshidratación moderada: Inquietud o irritabilidad, ojos hundidos (llanto sin lágrimas), mucosas secas, sed aumentada, polipnea o taquipnea, taquicardia, llenado capilar mayor a tres segundos y menor de cinco, oliguria. Caso de EDA grave: Paciente de cualquier edad que demande atención médica por presentar cuadro diarreico con cinco o más evacuaciones en 24 horas, cuya evolución sea menor a cinco días y que tenga dos o más de los siguientes signos o síntomas: Vómito de más de cinco en 24 horas, cuadro disentérico, temperatura mayor a 38° C, datos de deshidratación moderada a grave; letargo o inconsciencia, incapacidad para beber, pulso débil o no perceptible, llenado capilar igual o mayor de cinco segundos. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 14 de 52 Julio 2013 Caso sospechoso de cólera, a todo enfermo de diarrea que presente las siguientes características: Que en su lugar de residencia no se haya demostrado o se desconozca la circulación de Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxigénicos, a todo enfermo de diarrea que tenga cinco años de edad o más, que presente cinco evacuaciones o más en 24 horas y cuyo cuadro diarreico tenga una evolución menor a cinco días. Que en su lugar de residencia donde se ha demostrado la circulación de Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxigénicos en los últimos 90 días o en las comunidades ubicadas dentro del área de los cercos epidemiológicos, se considerará como sospechosa a toda persona con diarrea no mayor a cinco días de evolución, independientemente de su edad y en situación de desastres. Brote de cólera, a la presencia de dos o más casos confirmados relacionados epidemiológicamente entre sí o la presencia de un caso en un área donde no se ha demostrado la existencia previa del padecimiento. Caso confirmado de cólera, a todo enfermo en el que se aísle, mediante cultivo bacteriológico, en materia fecal o contenido gastrointestinal, Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxigénicos, así como los que por asociación epidemiológica se determinen. Caso hospitalizado por cólera, a toda persona a la que se brinde atención médica en un establecimiento de salud, fijo o móvil y que permanezca en el mismo 24 horas y en quien se aísle o demuestre Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxigénicos, mediante cultivo bacteriológico. Contacto, a toda persona que en el hogar, lugar de trabajo o sitio de reunión haya compartido, preparado o manipulado alimentos, agua o hielo o que haya realizado cambio de pañal de los casos sospechosos o confirmados en los cinco días previos al inicio de la enfermedad. Defunción por cólera, al fallecimiento de un caso confirmado que ocurra hasta dos semanas posteriores al inicio de las manifestaciones clínicas y en cuyo certificado de defunción aparezcan como causa básica o asociada los siguientes términos: Gastroenteritis o diarrea más deshidratación; gastroenteritis; diarrea más desequilibrio hidroelectrolítico. Enfermedad del cólera, la infección intestinal aguda causada por el Vibrio cholerae O1 y O139 toxigénicos que se transmite al hombre por la ingesta de agua y alimentos contaminados por este microorganismo. Fuente de infección de cólera, a todo alimento, agua, bebida, hielo, heces o vómito donde se aísle Vibrio cholerae O1 y/o Vibrio cholerae O139 toxigénicos. Portador, a la persona que alberga al agente infeccioso en ausencia de enfermedad clínica aparente y en quien se aísle Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxigénicos en materia fecal o contenido gastrointestinal. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 15 de 52 Julio 2013 TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRA Las muestras de materia fecal se deben obtener en los primeros estadios de cualquier enfermedad entérica, cuando los agentes patógenos están en mayor número y antes de que se haya iniciado el tratamiento antibiótico. Una excepción a esta regla es el caso de las heces obtenidas de pacientes con enfermedad febril y se sospeche de fiebre tifoidea ya que el agente etiológico, Salmonella ser. typhi, puede estar presente en las heces en mayor cantidad, entre la segunda y la tercera semana de la enfermedad por lo que si se sospecha de este padecimiento se debe tomar muestra para hemocultivo durante la primera semana de evolución. El número de hisopos fecales o rectales que se tomen por paciente debe ser igual al número de análisis que se realizarán. Para la búsqueda de Vibrio spp y enterobacterias se deben tomar dos hisopados fecales o rectales y deben ser enviados al laboratorio en medio de transporte de Cary-Blair. La toma de materia fecal se realiza con un hisopo estéril con punta de algodón, pudiendo ser hisopo fecal (obtenido a partir de una muestra directa de materia fecal), o bien mediante hisopo rectal, el cual se obtiene introduciendo el hisopo en el esfínter anal más de un centímetro y girando el hisopo, el cual debe salir manchado con materia fecal. Cuando se trata de un cuadro característico de cólera, la muestra se toma de las heces en forma de agua de arroz. El hisopo se introduce en el tubo de Cary-Blair, tapando bien el tubo e identificándolo al menos con el nombre del paciente y la fecha de la toma de la muestra. El transporte de las muestras diagnósticas y de agentes patógenos (cepas) se debe hacer en sistema de triple básico de triple embalaje [1] para reducir al mínimo el riesgo para los seres humanos, para el medio ambiente y para proteger la viabilidad de los microorganismos. Las cepas deben ser enviadas en tubos herméticamente cerrados, preferentemente con medio de cultivo Base de Agar Sangre (BAB) o algún otro medio apropiado que no contenga azúcares. 1 El sistema básico de triple embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia, suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermético para evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o número de muestra del paciente. El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material absorbente para evitar algún derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8° C. Los recipientes secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico y señal de orientación del recipiente, a su vez el recipiente secundario deberá ir contenido en un paquete externo de envío (caja de cartón o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente, destinatario y señal de orientación. La documentación que se integre al triple embalaje deberá colocarse en la parte interior del paquete. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 16 de 52 Julio 2013 ALGORITMO DIAGNÓSTICO Materia fecal *Medio de baja selectividad Enriquecimiento para Salmonella spp Aislamiento en 2 medios de alta selectividad Enriquecimiento (APA) Aislamiento en TCBS **Identificación Bioquímica **Identificación Bioquímica Aglutinación para grupo y serotipo Aglutinación para grupo Aglutinación para serotipo Prueba de susceptibilidad antimicrobiana Pruebas moleculares PFGE (Solo en caso de brote) * En caso de brote y se sospeche de Escherichia coli picar cinco colonias e identificar. Prueba de susceptibilidad antimicrobiana Identificación de genes de toxigenicidad Pruebas moleculares PFGE (Solo en caso de urgencia) ** Se pueden emplear métodos automatizados o semi automatizados para la identificación. Fig. 2. Algoritmo para el diagnóstico de EDA Bacteriana Clave de Tabulador: 1B2547012, 1B2542002 EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 17 de 52 Julio 2013 ESTÁNDARES DE CALIDAD Con la finalidad de verificar el cumplimiento de los objetivos de la vigilancia por laboratorio de las diarreas agudas bacterianas se definen los siguientes estándares. ESTÁNDARES DE EVALUACIÓN DE LA CALIDAD Indicador Estándar Cálculo Acción La define el laboratorio local o (Muestras estatal. Puede ser aceptadas/muestras capacitación dirigida recibidas) X 100 u oficio de notificación (Muestras La define el aceptadas hasta 5 laboratorio local o días posteriores a estatal. Puede ser su fecha de capacitación dirigida toma/total de u oficio de muestras notificación aceptadas) X 100 Evaluación Calidad de las muestras 90% de las muestras cumplen con los criterios de aceptación Oportunidad en el envío de la muestra 90% de las muestras aceptadas se recibieron hasta 5 días posteriores a su fecha de toma Concordancia analítica 90% de concordancia de las cepas enviadas al InDRE (Cepas concordantes/Total de cepas aceptadas en el InDRE) X 100 La define el laboratorio con base en el análisis de causas que deberá enviar al InDRE Trimestral Evaluación del desempeño Al menos 80% de cumplimiento en cada uno de los componentes (cólera y enterobacterias) Se realiza con base en los criterios que se especifican en el informe del análisis de resultados El laboratorio realizará un análisis de causas y enviará su plan de acciones al InDRE Semestral Cumplimiento del envío de cepas Envío de los aislamientos de Vibrio cholerae O1, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. (Cepas aceptadas en el InDRE/cepas informadas en el Sistema de Información en Salud) X 100 El laboratorio de referencia nacional enviará oficio de notificación Trimestral EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Mensual Mensual Página 18 de 52 Julio 2013 CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS Las actividades de captura de datos y resultados la realizará cada Laboratorio Estatal de Salud Pública con sus recursos disponibles. Para el informe de resultados se deberá cumplir con lo siguiente: El laboratorio es responsable de la realización del formato de informe. Este formato (ya sea electrónico o en papel) y la manera en que va a ser comunicado por el laboratorio, deben ser determinados en acuerdo con los usuarios de los servicios del laboratorio. El laboratorio comparte la responsabilidad con el solicitante para asegurar que los informes son recibidos por las personas apropiadas dentro del intervalo de tiempo acordado. Los resultados deben ser legibles, sin errores de trascripción e informados a las personas autorizadas para recibir y utilizar la información médica. El informe también debe incluir, sin estar limitado a la siguiente información: Identificación clara y sin ambigüedad del examen. Identificación del laboratorio que emite el informe. Identificación única, ubicación del paciente cuando sea posible y destino del informe. Nombre u otra identificación única del solicitante y la dirección del mismo. Fecha y hora de la toma de la muestra primaria, cuando esté disponible y sea pertinente para el cuidado del paciente, así como la hora de recepción en el laboratorio. Fecha y hora de la liberación del informe, las cuales si no están en el informe, deben estar fácilmente accesibles cuando sea necesario. Tipo de muestra primaria. Resultados de los exámenes. Otros comentarios (calidad de la muestra primaria condiciones que puedan haber comprometido el resultado). Identificación de la persona que autoriza la liberación del informe. Si es pertinente, los resultados originales y los corregidos. Firma o autorización de la persona que verifica o libera el informe, cuando sea posible. PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) El InDRE enviará a los Laboratorios Estatales de Salud Pública un panel de cepas o muestras cada seis meses, el cual deberá ser procesado con la metodología establecida en el laboratorio y remitirá los resultados obtenidos al InDRE. El InDRE analizará los resultados de la red de laboratorios y elaborará un informe con el resultado global y particular de los participantes de la red. Con base en los resultados obtenidos, se evaluará el desempeño de cada participante y se definirán las acciones a seguir. Estas pueden ser desde reconocer el esfuerzo realizado hasta de ser necesario, establecer un plan de acciones correctivas y/o preventivas, evaluar si se requiere capacitación o si amerita una visita de supervisión. Los laboratorios locales serán evaluados por el Laboratorio Estatal de Salud Pública que le corresponda bajo los lineamientos anteriormente descritos. Análisis de la informa EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Envío de plan de Acciones (<80) Página 19 de 52 Julio 2013 Evaluación Externa de la Calidad Actividades a realizar durante el ciclo anual del Programa de Evaluación Externa del Desempeño Fig. 4. Ciclo PEED en los componentes de Cólera y Enterobacterias CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO La liberación del diagnóstico de enfermedad diarreica aguda bacteriana se realiza únicamente cuando el LESP obtiene más del 90% en los indicadores: "Concordancia analítica" y "Evaluación del desempeño" sin embargo, deben seguir enviando las cepas al InDRE para realizar la vigilancia de susceptibilidad a los antimicrobianos, la vigilancia de circulación de cepas de Vibrio cholerae O139 y la realización de pruebas moleculares de alta complejidad para el estudio de brotes y atención de urgencias nacionales e internacionales. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 20 de 52 Julio 2013 DIC NOV OCT SEP AGO JUL JUN MAY ABR MAR FEB ACTIVIDAD ENE CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Capacitación en A programar, previa solicitud a través del Departamento de Control servicio de Muestras y Servicios del InDRE Envío del primer panel a los Laboratorios x Estatales de la Red de EFES Recepción de resultados del Panel en x el InDRE Envío de resultados a la x RNLSP Envío del segundo panel a los x Laboratorios Estatales de la Red de EFES Recepción de resultados del Panel en x el InDRE Envío de resultados a la x RNLSP BIBLIOGRAFÍA 1. Organización Panamericana de la Salud. Organización Mundial de la Salud. Manual de procedimientos para la serotipificación de V. cholerae. Washington, D. C. 2004. 2. Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades: Centro Nacional para las Enfermedades Infecciosas y Organización Mundial de la Salud, Enfermedades Transmisibles: Vigilancia y Respuesta. Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo. Atlanta, Georgia: CDC; 2004. 3. Organización Panamericana de la Salud. Organización Mundial de la Salud. Manual de procedimientos para la serotipificación de Salmonella y Shigella. Washington, D. C. 2004. 4. Antigenic Formulae Of The Salmonella Serovars, 2007, 9th edition WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella Patrick A.D. Grimont, François-Xavier Weill, Institute Pasteur, 28 rue du Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, France. 5. Ewing, W.H, Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae, 4th Edition. Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York 1986:135-172. 6. Aidara A. Koblavi S, Boye CS, Raphenon G, Gassama A, Girmoni E, Grimont PAD. Phenotypic and genotypic characterization of Vibrio cholerae isolates from a recent outbreak in Senegel: Comparison with isolates from Guinea-Bissau. Am J Trop Med Hyg 1988; 58: 163-7. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 21 de 52 Julio 2013 7. Fields PI, Popovic T, Wachsmuth K, Olsvik O, 1992. Use of Polymerase Chain Reaction for Detection of Toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic. J Clin Microbiol 30: 2118-2121. 8. Albert M, Islam D, Nahar S, Qadri F, Falklind S, Weintraub A, 1997. Rapid Detection of Vibrio cholerae O139 Bengal from Stool Specimens by PCR. J Clin Microbiol 35: 16331635. 9. Raja N, Nor-Shamsudin M, Somarny W, Rosli R, Rahim RA, Radu S, 2001. Detection and molecular characterization of the zot gene in Vibrio cholerae and V. alginolyticus isolates. Southeast Asian J Trop Med Public Health 32: 100-104. 10. Sarkar A, Nandy RN, Nair BG, Ghose AC, 2002. Vibrio Pathogenicity Island and Cholera Toxin Genetic Element-Associated Virulence Genes and Their Expression in Non-O1 NonO139 Strain of Vibrio cholera. American Society for Microbiology 70: 4735-4742. 11. Cabrera-García ME, Vázquez-Salinas C, Quiñones-Ramírez EI, Serologic and Molecular Characterization of Vibrio parahaemolyticus Strains Isolated from Seawater and Fish Products of the Gulf of Mexico, 2004. American Society for Microbiology 70: 6401-6406. 12. Tadaa J, Ohashia T, Nishimuraa N, Shirasakia Y, Ozakia H, Fukushima S, Takanoa J, Nishibuchib M, Takedab Y. Detection of the thermostable direct hemolysin gene (tdh) and the thermostable direct hemolysin-related hemolysin gene (trh) of Vibrio parahaemolyticus by polymerase chain reaction. Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Kyoto University. 1992. 13. Vibrio cholerae and Cholera molecular to global perspectives, Edited by I. Kaye Wachsmuth, Paula Blake and Orjan Olsvik. ASM PRESS, Washington D.C. American Society for Microbiology, 1994. 14. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. MMWR Surveill Summ. 6; 61:1-102; 2012. 15. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement / Vol. 60; 2011. 16. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of Infectious Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012. 17. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories – 5th ed. CDC-NIH; 2009. 18. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory biorisk management standard. Brussels: CEN; 2011. 19. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual – 3rd ed. Geneva: WHO Press; 2004. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 22 de 52 Julio 2013 ANEXO 1. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS 1. Aislamiento e identificación de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus 1.1. Principio del método El método se fundamenta en la capacidad de Vibrio spp para crecer en medios alcalinos y de sus diferentes capacidades metabólicas para descarboxilar aminoácidos como la lisina, ornitina y arginina; fermentar azúcares como sacarosa, lactosa y glucosa; producir indol a partir del triptófano; de ser móvil y poseer la enzima citocromo oxidasa. La serotipificación de Vibrio cholerae se fundamenta en la detección de antígenos específicos del lipopolisacárido bacteriano a través de una reacción antígeno-anticuerpo. 1.2. Sistema de muestra primaria Muestra de materia fecal o cepas de Vibrio spp. 1.3. Tipo de contenedor y aditivos La muestra de materia fecal deberá recolectarse con hisopo de algodón (hisopo rectal o hisopo fecal) e introducirse en un tubo con medio de transporte de Cary Blair; las cepas de Vibrio spp deberán estar sembradas en un medio de cultivo de soporte (base de agar sangre). 1.4. Equipos 1.5. Incubadora a 36 +1° C Refrigerador de 4 a 8° C Lámpara de luz blanca Termómetro de -5 a 15° C Termómetro de 20 a 50° C Materiales Mechero Bunsen, cuadro básico número 533.604.0042 Manguera de látex para la conexión del gas al mechero, cuadro básico número 080.909.5383 Asas de nicromel con punta recta, cuadro básico número 537.085.0018 Placa Petri de 100 x 15 mm cuadro básico número 080.148.0120 Tubo de 16 x150 mm con tapón de rosca de baquelita Tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca de baquelita Gradillas para 72 tubos, cuadro básico número 533.461.0507 Pipetas graduadas de vidrio de 5 mL, cuadro básico número 080.709.2606 Portaobjetos 12 x 75 x 0.8 mm, cuadro básico número 080.729.0010 Aplicadores de madera sin algodón, cuadro básico número 060.082.0054 EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 23 de 52 Julio 2013 1.6. Jeringa desechable para tuberculina de 1 mL, cuadro básico número 060.550.0636 Bulbo de seguridad de tres vías Gasa simple, cuadro básico número 060.436.0669 Pinzas de disección de acero inoxidable, de 12.7 cm. cuadro básico número 535.701.0056 Pizeta con solución desinfectante de hipoclorito de sodio dilución 1:100 (1%) Frasco con solución salina formalinizada 0.6% Reactivos y material biológico Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS), cuadro básico número 080.610.2448, 30 mL en placa Petri. Base de agar sangre (BAB), cuadro básico número 080.610.1200, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de hule. Base de agar sangre (BAB), cuadro básico número 080.610.1200, 30 mL de medio en placa Petri. Medio de movilidad indol ornitina (MIO), cuadro básico número 080.610.1770, 4.0 mL de medio sin inclinar en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Agar de hierro y triple azúcar (TSI), cuadro básico número 080.610.2364, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Agar de hierro y lisina (LIA), cuadro básico número 080.610.0269, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Peptona de caseína, cuadro básico número 080.610.1879, cloruro de sodio, cuadro básico número 080.830.0677, para preparar agua peptonada alcalina pH 9 (APA) 10 mL en tubo de 16x150 mm con tapón de rosca. Peptona de caseína, cuadro básico número 080.610.1879, cloruro de sodio, cuadro básico número 080.830.0677, para preparar caldo peptonado (CP), 4 mL.0 en tubo de 13x100 mm con tapón de rosca. Base descarboxilasa de Möeller, cuadro básico número 080.610.2455, L-arginina, cuadro básico número 080.832.4107, para preparar caldo arginina 4.0 mL en tubo de 13x100 mm con tapón de rosca. Reactivo de Kovac, cuadro básico número 080.783.1557. Reactivo de oxidasa, cuadro básico número 080.889.0172. Vaselina líquida. Cloruro de sodio, cuadro básico número 080.830.0677. Formaldehido, cuadro básico número 080.830.1311. Hipoclorito de sodio. Agua destilada. Todos los medios de cultivo se deben preparar siguiendo las especificaciones del fabricante. Suero polivalente Vibrio cholerae O1. Suero monovalente Vibrio cholerae Inaba. Suero monovalente Vibrio cholerae Ogawa. 1.7. Pasos del método EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 24 de 52 Julio 2013 Aislamiento La muestra de materia fecal debe ser fresca y estar en medio de transporte de Cary-Blair y deberá ser procesada lo antes posible una vez que llega al laboratorio. Depositar el hisopo del Cary-Blair en tubo de Agua Peptonada Alcalina (APA), incubar a 36 +1° C durante 6-8 h. Con una asa redonda previamente quemada y enfriada en el agar depositar 3 asadas de la superficie del APA en una placa de agar TCBS, sembrar por estría cruzada sin quemar el asa entre cuadrantes. Incubar a 36+1° C durante 18 a 24 h. Las cepas de origen clínico, alimentos o ambientales para referencia o control de calidad se siembran directo en agar TCBS por estría cruzada quemando el asa entre el primer o segundo cuadrante. Incubar a 36+1° C durante 18 a 24 h. Identificación Seleccionar del agar TCBS colonias, sacarosa positivas (colonias amarillas, planas de 2 mm, generalmente pegajosas) y/o sacarosas negativas (colonias verdes, de 2 mm, generalmente pegajosas). Quemar una asa en punta y enfriar en un extremo de la placa donde no haya crecimiento, tomar la colonia sin extender en el agar (con esta única colonia se siembran todas las pruebas bioquímicas), inocular en tubo de caldo arginina (CA) y caldo peptonado (CP), depositando el inóculo, MIO picadura hasta el fondo, TSI, LIA y tubo de BAB, picadura hasta el fondo y estría en la superficie (las bioquímicas que se utilicen para identificar las colonias verdes se deben adicionar con 1% de cloruro de sodio; adicionalmente se deben sembrar caldos nutritivos con 0%, 1%, 3%, 6%, 8% y 10% de cloruro de sodio. Sellar con vaselina líquida estéril el caldo arginina; sembrar también una placa de BAB por estría cerrada. Incubar a 36+1° C durante 18 a 24 h. De la placa de BAB hacer la prueba de oxidasa, depositar un inóculo con asa desechable o aplicador de madera en la zona reactiva de la tira o en el papel impregnado con el reactivo, leer el resultado en un tiempo máximo de 10 segundos. Antes de leer las pruebas bioquímicas agregar 0.5 mL de reactivo de Ehrlich o Kovac en el caldo peptonado, interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas utilizando la tabla 1, e identificar el patrón bioquímico de V. cholerae o V. parahaemolyticus con la tabla 2. Serotipificación Si bioquímicamente se identificó Vibrio cholerae, realizar la serotipificación a partir de la placa de BAB. En un portaobjetos limpio y desengrasado depositar 5 gotas de solución salina formalinizada en el extremo superior del portaobjetos, separadas lo suficiente para evitar que se mezclen. En el extremo inferior colocar una gota de solución salina (testigo negativo), una gota de suero polivalente Vibrio cholerae O1, una gota de suero monovalente Vibrio cholerae O1 Ogawa, una gota de suero monovalente Vibrio cholerae O1 Inaba y una gota de suero monovalente Vibrio cholerae O: 139. Con un asa estéril o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB y depositar en cada una de las gotas de solución salina formalinizada, mezclar las gotas de suspensión con cada antisuero, agitar por 1 minuto e interpretar. Registrar los resultados. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 25 de 52 Julio 2013 1.8. Interpretación por laboratorio Para emitir un resultado positivo a Vibrio cholerae O1 (Ogawa o Inaba), N O1 u O139 de una muestra procesada, se considera la identificación bioquímica que debe corresponder al patrón bioquímico de dicha especie, así como los resultados de serotipificación del antígeno somático. Para emitir un resultado positivo a Vibrio parahaemolyticus de una muestra procesada, se considera la identificación bioquímica que debe corresponder al patrón bioquímico de dicha especie. Un resultado negativo corresponde a la ausencia de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus en la muestra fecal o cepa recibida. Realizar pruebas moleculares a las cepas identificadas como Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae O1 y Vibrio cholerae O139. 1.9. Medidas de bioseguridad El nivel de bioseguridad requerido es nivel 2 por lo que se recomienda: Usar bata de laboratorio blanca, limpia y abotonada, esta vestimenta no debe ser usada fuera de las áreas de trabajo. Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo antes y después de procesar muestras. Mantener cerrada la puerta del laboratorio. Lavarse las manos antes y después de trabajar. No hablar, estornudar ni toser durante el sembrado de la muestra. No pipetear directamente con la boca. 2. PCR punto final para la detección de cepas toxigénicas de Vibrio cholerae 2.1. Principio del método La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica mediante la cual se replican de forma exponencial miles de copias de un gen o segmento de ADN específico. Esta técnica molecular utiliza dos iniciadores (oligonucleótidos) específicos y complementarios a la secuencia buscada en la bacteria y consiste en separar con calor ambas cadenas de ADN, posteriormente cada iniciador se hibrida complementariamente a una cadena de DNA, interviniendo en ese momento la ADN polimerasa que utiliza los desoxioligonucleotidos (dNTPs) presentes para sintetizar a su vez dos cadenas complementarias a las del molde. Este proceso se repite varias veces, hasta obtener cantidades detectables y visibles del ADN presente originalmente en las muestras. 2.2. Sistema de muestra primaria Cultivo puro de Vibrio cholerae O1 o Vibrio cholerae O139. 2.3. Tipo de contenedor y aditivos Las cepas deben estar sembradas por aislamiento en medio de Agar Base Sangre sin aditivos. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 26 de 52 Julio 2013 2.4. Equipo 2.5. Termociclador-PCR Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A Cabina para PCR Cámara de electroforesis horizontal Fotodocumentador Fuente de poder Congelador vertical Refrigerador vertical Termoagitador Sistema de purificación de agua Balanza analítica Aire acondicionado Materiales 2.6. Micropipetas de: 1-10, 2-20, 20-200 y 100-1000 µL Micropipeta Guantes de nitrilo Tubos tipo eppendorf de: 0.2, 0.5 y 1.5 mL Puntas para micropipeta de: 10, 200 y 1000 µL Tubos para centrifuga de: 50 mL Pipetas desechables de 5.0 y 10 mL Marcadores indelebles Gradillas para tubos eppendorf Bolsas de polipropileno Contenedores para desecho de puntas Gasas Reactivos y material biológico Reactivos y materiales biológicos dNTP´s (A, T, C, G) 100µM Taq polimerasa 5U/µL CTX2 5’ CGG GCA GAT TCT AGA CCT CCT G 3’ (1,2) CTX3 5’ CGA TGA TCT TGG AGC ATT CCC AC 3’ (1,2) CTX7 5’ GGT TGC TTC TCA TCA TCG AAC CAC 3' (5) CTX9 5’ GAT ACA CAT AAT AGA ATT AAG GAT 3' (5) ACE1 5´-TAA GGA TGT GCT TAT GAT GGA CAC CC 3´ (1) ACE2 5´-CGT GAT GAA TAA AGA TAC TCA TAG-3’ (1) ZOT1 5’ TGG CTT CGT CTG CTG CCG GCG ATT 3' (1,4) ZOT2 5’ CAC TTC TAC CGA CAG CGC TTG CG 3' (1,4) 1-39Vc 5’ GCG TTA TAG GTA TCA TCA AGA GA 3’ (3) EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Fabricante Roche Roche Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Página 27 de 52 Julio 2013 2-39Vc 5’ GTC ATT ATT AAA ACT GCT CCA TT 3’ (3) MgCl2, 25mM Regulador 10 X Solución amortiguadora TBE Agarosa Bromuro de etidio Agua destilada y desionizada Marcador de peso molecular Naranja de acridina Alcohol etílico al 70% 2.7. Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Sigma MILLIPORE Pasos del método Re-suspender una colonia de una cepa aislada y caracterizada como Vibrio cholerae en 200 µL de agua destilada para obtener el ADN molde. Hervir la suspensión durante 15 minutos e inmediatamente colocar en baño de hielo. Consideraciones antes de iniciar la PCR Antes de empezar a trabajar descontaminar el gabinete de bioseguridad. Usar el equipo de seguridad. Mantener las suspensiones de las muestras en hielo listas para PCR. Descongelar previamente los reactivos para PCR. Rotular los tubos de acuerdo al número y tipo de muestra a trabajar. Preparación de la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se prepara en el ÁREA BLANCA del laboratorio. El volumen de los reactivos se calculará de acuerdo al número de muestras a analizar, siguiendo el formato de trabajo para PCR. Una vez preparada la mezcla de reacción, homogenizar suavemente con pipeta aproximadamente 30 veces (aspirando y expulsando con ayuda de la pipeta), finalmente adicionar 22 µL de esta mezcla en el fondo de cada tubo. En el ÁREA DE TEMPLADOS, adicionar 3.0 µL del ADN extraído de cada muestra en el tubo correspondiente. Formato de trabajo para PCR REACTIVOS VOLUMEN (L) H2O Reg 10X MgCl2 25mM dNTP´s 1µM Iniciador 1 (ctx 2, ctx 7, ace 1, zot 1, 1-39Vc) Iniciador 2(ctx 3, ctx 9, ace 2, zot 2, 2-39Vc) 9.35 2.5 4.0 4.0 1.0 1.0 EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 28 de 52 Julio 2013 Taq 5U/µL ROCHE ADN 1 ciclo 35 ciclos 1 ciclo 0.15 3.0 Programa 94oC–1 min 94oC–30 s 55oC–30 s 72oC–1 min 72oC–2 min Controles En el ÁREA DE CONTROLES adicionar 3.0 µL de control positivo y negativo respectivamente. Control negativo: Colocar una muestra de ADN confirmada como negativa a V. cholerae. Control positivo: Colocar ADN extraído de una cepa caracterizada como V. cholerae O139 toxigénica bajo el resguardo del InDRE. Control de reactivos: utilizar 3.0 µL de agua inyectable o calidad Milli-Q. NOTA: Asegurarse de que todos los tubos queden bien tapados para evitar que el contenido se evapore. Colocar los tubos en el termociclador, seleccionar el programa para Vibrio cholerae y dar inicio a la corrida. Los productos de ADN obtenidos se someten a 120 V por 30 minutos a electroforesis en un gel de agarosa al 2% en regulador Tris-EDTA-ácido acético. Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV. 2.8. Interpretación por laboratorio Presencia de una banda de aproximadamente 564 pb indica la presencia del gen de la subunidad A de la toxina colérica. Presencia de una banda de aproximadamente 460 pb indica la presencia del gen de la subunidad B de la toxina colérica. Presencia de una banda de aproximadamente 314 pb indica la presencia del gen de la toxina accesoria ace. Presencia de una banda de aproximadamente 1083 pb indica la presencia del gen de la toxina accesoria zot. 2.9. Medidas de bioseguridad Todas las muestras y controles deben manejarse como potencialmente infecciosos y analizarse en un laboratorio de bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) dentro de un gabinete de bioseguridad tipo II 2A. El analista debe usar equipo de protección personal, bata (una para cada área del proceso), guantes desechables (un par para cada proceso) y lentes de seguridad. Disponer de los contenedores y bolsas correspondientes para los desechos de Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI) en cada área. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 29 de 52 Julio 2013 Descontaminar las micropipetas, gabinetes y cabinas antes y después de trabajar con etanol al 70% o benzal-metanol 1:1 v/v. Todo el material a utilizar deberá ser estéril. El personal que realice la electroforesis no podrá hacer mezcla para PCR en la misma jornada. El área limpia o ÁREA BLANCA está libre de toda contaminación por ADN por lo que solo podrán manejarse reactivos. El ÁREA DE TEMPLADOS será la única en donde se podrán abrir los tubos que contienen el DNA de las muestras. El ÁREA DE CONTROLES será la única permitida para la colocación del ADN control. Solo en el ÁREA SUCIA o de electroforesis se podrán abrir los tubos con cADN y cargarse en los geles. Cada área deberá estar separada físicamente para evitar contaminaciones. Es muy importante que cada área cuente con su propio material (puntas, guantes, agua, etc.), y éste no deberá compartirse entre áreas. Los equipos deberán descontaminarse antes de una reparación, mantenimiento o antes de ser removidos del laboratorio. El analista debe lavar sus manos antes y después de trabajar. La prueba se realizará en un laboratorio entre 18-25° C. Las diferentes áreas deberán estar separadas y selladas para evitar el paso de aire con polvo y evitar así la contaminación. 3. PCR punto final para la detección de genes de patogenicidad en cepas de Vibrio parahaemolyticus 3.1. Principio del método Como ya se mencionó, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica mediante la cual se replican de forma exponencial miles de copias de un gen o segmento de ADN específico. Esta técnica molecular utiliza dos iniciadores (oligonucleótidos) específicos y complementarios a la secuencia buscada en la bacteria y consiste en separar con calor ambas cadenas de ADN, posteriormente cada iniciador se hibrida complementariamente a una cadena de ADN, interviniendo en ese momento la ADN polimerasa que utiliza los desoxioligonucleotidos (dNTPs) presentes para sintetizar a su vez dos cadenas complementarias a las del molde. Este proceso se repite varias veces, hasta obtener cantidades detectables y visibles del ADN presente originalmente en las muestras. 3.2. Sistema de muestra primaria Cultivo puro de Vibrio parahaemolyticus 3.3. Tipo de contenedor y aditivos Las cepas deben estar sembradas por aislamiento en medio de Agar Base Sangre sin aditivos. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 30 de 52 Julio 2013 3.4. Equipo 3.5. Termociclador Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A Cabina para PCR Cámara de electroforesis horizontal Fotodocumentador Fuente de poder Congelador vertical Refrigerador vertical Sistema de purificación de agua Balanza analítica Aire acondicionado Horno de microondas Materiales 3.6. Micropipetas de: 1-10, 2-20, 20-200 y 100-1000 µL Guantes desechables Tubos tipo eppendorf de: 0.2, 0.5 y 1.5 mL Puntas para micropipeta de: 10, 200 y 1000 µL Tubos para centrifuga de 50 mL Pipetas desechables de 5 y 10 mL Marcadores indelebles Gradillas para tubos eppendorf Bolsas de polipropileno Contenedores para desecho de puntas Gasas Reactivos y material biológico Reactivos y Materiales biológicos dNTP´s (A, T, C, G) 100µM Taq polimerasa 5U/µL Tdh1 5'-GGT ACT AAA TGG CTG ACA TC-3' (1,2) Tdh2 5'-CCA CTA CCA CTC TCA TAT GC-3' (1,2) Trh1 5'-GGC TCA AAA TGG TTA AGC G-3' (1,2) Trh2 5'-CAT TTC CGC TCT CAT ATG C-3' (1,2) MgCl2, 25mM Regulador 10 X Solución amortiguadora TBE Agarosa Bromuro de etidio Agua destilada y desionizada Marcador de peso molecular EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Marca Roche Roche Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Sigma MILLIPORE Página 31 de 52 Julio 2013 Naranja G Alcohol etílico al 70% EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 32 de 52 Julio 2013 3.7. Pasos del método Resuspender una colonia de la cepa aislada y caracterizada como Vibrio parahaemolyticus en 200 µL de agua destilada. Hervir 15 minutos la suspensión e inmediatamente colocar en baño de hielo. Consideraciones antes de iniciar la PCR Antes de empezar a trabajar descontaminar el gabinete de bioseguridad utilizando el sanitizante asignado. Colocarse el equipo de seguridad. Mantener las suspensiones de las muestras en hielo listas para la PCR. Descongelar previamente los reactivos para la PCR. Rotular los tubos de acuerdo al número y tipo de muestra a trabajar. Preparación de la mezcla de reacción Esta se hará en el ÁREA BLANCA del laboratorio. El volumen de los reactivos se calculará de acuerdo al número de muestras a diagnosticar, siguiendo el formato de trabajo para PCR. Una vez preparada la mezcla de reacción homogenizar suavemente con la pipeta (aspirando y expulsando con ayuda de la pipeta) aproximadamente 30 veces, finalmente adicionar 22 µL de esta mezcla en el fondo de cada tubo. En el ÁREA DE TEMPLADOS, adicionar 3.0 µL del DNA extraído de cada muestra en el tubo correspondiente. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 33 de 52 Julio 2013 Formato de trabajo para PCR de Vibrio parahaemolyticus Reactivos H2O Reg 10X MgCl2 25mM dNTP’s 1µM tdh 1 1:80 tdh 2 1:80 Taq 5U/µL DNA Volumen (L) 4.35 2.5 10 3 1 1 0.15 3 Reactivos Volumen (L) H2O Reg 10X MgCl2 25mM dNTP’s 1µM trh 1 1:80 trh 2 1:80 Taq 5U/µL DNA 12.35 2.5 2 3 1 1 0.15 L 3 Programa 1 ciclo 94o C–1 min 94o C–20 s 25 ciclos 55o C–20 s 72o C–30 s 1 ciclo 72o C-2 min Controles En el ÁREA DE CONTROLES, adicionar 3.0 µL de control positivo y negativo respectivamente en el tubo que corresponda. Control negativo para tdh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus trh positivo. Control negativo para trh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus tdh positivo. Control positivo para tdh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus tdh positivo. Control positivo para trh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus trh positivo. Control de reactivos: utilizar 3.0 µL de agua inyectable o agua calidad Milli-Q. NOTA: Asegurarse de que todos los tubos queden bien tapados, para evitar que el contenido se evapore. Colocar los tubos en el termociclador, seleccionar el programa para Vibrio parahaemolyticus y dar inicio a la corrida. Los productos de ADN obtenidos se someten a 120 V por 30 minutos a electroforesis en un gel de agarosa al 2% en regulador Tris-EDTA-ácido acético. Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV. 3.8. Interpretación por laboratorio Positivo: EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 34 de 52 Julio 2013 Presencia de una banda de aproximadamente 251 pb indica la presencia del gen tdh que codifica para la hemolisina termoestable directa. Presencia de una banda de aproximadamente 250 pb indica la presencia del gen trh que codifica para la termolisina relacionada a la directa. Negativo: Ausencia de los genes que codifican para las termolisinas, ausencia de bandas tdh (251 pb) y trh (250 pb). 3.9. Medidas de bioseguridad Todas las muestras y controles deben manejarse como potencialmente infecciosos y trabajarse en un Laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) dentro de un gabinete de bioseguridad tipo II 2A. El analista debe usar su equipo de protección personal, bata (una para cada área del proceso), guantes desechables (un par para cada proceso) y lentes de seguridad. Disponer de los contenedores y bolsas correspondientes para los desechos RPBI en cada área. Descontaminar las micropipetas, gabinetes y cabinas antes y después de trabajar con etanol al 70% o benzal-metanol 1:1 v/v. Todo el material a utilizar deberá estar estéril. El personal que realice la electroforesis no podrá hacer mezcla para PCR en la misma jornada. El área limpia o ÁREA BLANCA está libre de toda contaminación por ADN por lo que solo podrán manejarse reactivos. El ÁREA DE TEMPLADOS será la única en donde se podrán abrir los tubos que contienen el DNA de las muestras. El ÁREA DE CONTROLES será la única permitida para la colocación del ADN control. Solo en el ÁREA SUCIA o de electroforesis se podrán abrir los tubos con cADN y cargarse en los geles. Cada área deberá estar separada físicamente para evitar contaminaciones. Es muy importante que cada área cuente con su propio material (puntas, guantes, agua, etc.) y éste no deberá compartirse entre áreas. Los equipos deberán descontaminarse antes de una reparación, mantenimiento o antes de ser removidos del laboratorio. El analista debe lavar sus manos antes y después de trabajar. La prueba se realizará en un laboratorio entre 18-25° C. Las diferentes áreas deberán estar separadas y selladas para evitar el paso de aire con polvo y evitar así la contaminación. 4. Producción de toxina colérica En toda cepa aislada de Vibrio cholerae O1 se determina su capacidad para producir toxina colérica a través de la técnica de ELISA descrita en el Manual de Técnicas de Laboratorio Vol. I, 1995 del InDRE. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 35 de 52 Julio 2013 Se preparan placas sensibilizadas con el receptor GM1 y se agrega el sobrenadante del cultivo donde podría estar la toxina. La presencia de interacción receptor-toxina se determina agregando un anticuerpo de conejo antitoxina. La reacción se pone en evidencia al adicionar anticuerpos contra las inmunoglobulinas de conejo conjugados a una enzima. Al agregar el sustrato específico el desarrollo de color significa que el cultivo de prueba es productor de toxina colérica. 5. Diferenciación de Vibrio cholerae O1 en biotipos Clásico o el Tor Después de identificar el grupo y el serotipo, se procede a la caracterización del biotipo (Clásico o El Tor). Se siembra la cepa en BAB y se incuba 24 h a 36 + 1° C. Se realizan las pruebas siguientes que se interpretan de acuerdo con lo que se indica. Reacción Biotipo Vp (modificado con 1% NaCl) Inhibición de crecimiento polimixina b (50 u) Hemólisis Aglutinación de eritrocitos de pollo o carnero Classical El tor N P P N N P N P 6. Aislamiento, identificación y serotipificación de Salmonella spp y Shigella spp. 6.1. Principio del método El método se fundamenta en el uso de técnicas bacteriológicas de aislamiento e identificación de las propiedades fenotípicas de Salmonella y Shigella, así como en la técnica inmunológica de aglutinación en placa para ambos géneros y aglutinación en tubo para Salmonella. 6.2. Sistema de muestra primaria Muestra de materia fecal o cepas de Salmonella spp y Shigella spp. 6.3. Tipo de contenedor y aditivos La muestra de materia fecal deberá recolectarse con hisopo de algodón (hisopo rectal o hisopo fecal) e introducirse en un tubo con medio de transporte de Cary Blair. Las cepas de Salmonella spp y Shigella spp deben sembrarse en un medio de cultivo de soporte. 6.4. Equipo Incubadora a 36 + 1° C Refrigerador a 4 a 8° C Agitador vortex Lámpara de luz blanca EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 36 de 52 Julio 2013 6.5. Baño María a 50 + 1° C Termómetro de -10 a 100° C Termómetro de -5 a 15° C Termómetro de 15 a 50° C Materiales Mechero Bunsen, cuadro básico número 533.604.0042 Manguera de látex para la conexión del gas al mechero, cuadro básico número 080.909.5383 Asas de nicromel con punta redonda, cuadro básico número 537.085.0018 Asas de nicromel con punta recta, cuadro básico número 537.085.0018 Placa Petri de 100 x 15 mm, cuadro básico número 080.148.0120 Tubo de 16 x150 mm, con tapón de rosca de baquelita Tubo de 13 x 100 mm, con tapón de rosca de baquelita Gradillas para 72 tubos cuadro, básico número 533.461.0507 Pipetas graduadas de vidrio de 5.0 mL, cuadro básico número 080.709.2606 Pipetas graduadas desechables de 1.0 o 2.0 mL, cuadro básico número 080.709.0311 o 080.709.0329 Tubo de vidrio de 12x75 mm, cuadro básico número 080.909.0525 Portaobjetos de 25 x75 x0.8 mm, cuadro básico número 080.729.0010 Aplicadores de madera cuadro básico número 060.082.0054 Vaso de precipitados de vidrio de 500 mL, cuadro básico número 080.951.0639 Tubo cónico de polipropileno para centrífuga de 50 mL, cuadro básico número 080.909.1648 Placa Petri de 60x15 mm, cuadro básico número 080.148.0195 Jeringa desechable para tuberculina de 1.0 mL, cuadro básico número 060.550.0636 Unidad de filtración tipo pirinola para jeringa desechable con membrana de acetato de celulosa de 0.22 micras, cuadro básico número 080.421.0714 Contenedor para RPBI punzocortantes de 3.70 a 4.75 L, cuadro básico número 060.218.0093 Bulbo de seguridad de tres vías Gasa simple, cuadro básico número 060.436.0669 para limpieza de mesas Tripie de acero fundido, cuadro básico número 533.898.0021 Pinzas de disección de acero inoxidable de 12.7 cm, cuadro básico número 535.701.0056 Contenedor plástico con solución desinfectante de hipoclorito de sodio dilución 1:10 (10%) Pizeta con solución desinfectante de hipoclorito de sodio dilución 1:100 (1%) Frasco con solución salina formalinizada 0.6% 6.6. Reactivos y material biológico Reactivos EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 37 de 52 Julio 2013 Base de agar sangre (BAB), cuadro básico número 080.610.1200, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de hule. Base de agar sangre (BAB), cuadro básico número 080.610.1200, 30 mL de medio en placa Petri. Agar Mac Conkey, cuadro básico número 080.610.1531, 30 mL de medio en placa Petri. Agar verde brillante, cuadro básico número 080.610.2497, 30 mL de medio en placa Petri. Agar sulfito de bismuto, cuadro básico número 080.610.0574, 30 mL de medio en placa Petri. Medio de movilidad indol ornitina (MIO), cuadro básico número 080.610.1770, 4.0 mL de medio sin inclinar en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Agar de hierro y triple azúcar (TSI), cuadro básico número 080.610.2364, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Agar de hierro y lisina (LIA), cuadro básico número 080.610.0269, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Ácido músico, peptona de caseína cuadro básico número 080.610.1879 y azul de bromotimol, cuadro básico número 080.830.4893, para preparar caldo mucato 4.0 mL de medio en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. L-sorbitol, peptona de caseína, cuadro básico número 080.610.1879, 4.0 mL de medio en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Rojo de fenol, cuadro básico número 080.830.3408. Cloruro de sodio, cuadro básico número 080.830.0677, 4.0 mL de medio en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Caldo malonato, cuadro básico número 080.610.9559, 4.0 mL de medio en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Base agar urea de Christensen, cuadro básico número 080.610.1432, agar, cuadro básico número 080.610.8254 para preparar 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Agar citrato de Simmons, cuadro básico número 080.610.7454, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Base caldo tetrationato, cuadro básico número 080.610.2265, 5.0 mL de medio en tubo de 16 x 150 mm con tapón de rosca. Caldo soya tripticasa (TSB), 10 mL de medio en tubo de 16 x 150 mm con tapón de rosca. Caldo infusión cerebro corazón, cuadro básico número 080.610.1317, agar, cuadro básico número 080.610.8254. Reactivo de Kovac, cuadro básico número 080.783.1557. Cloruro de sodio, cuadro básico número 080.830.0677. Formaldehido, cuadro básico número 080.830.1311. Yodo metálico, cuadro básico número 080.830.5304. Yoduro de potasio, cuadro básico número 080.830.5312. Hipoclorito de sodio. Agua destilada. Todos los medios de cultivo se deben preparar siguiendo las indicaciones del fabricante. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 38 de 52 Julio 2013 Material biológico: Antisueros somáticos para Salmonella (B, C1, O:6, O:8, O:20, D1, E polivalente [Epol], E1, E2, E3, E4, F, G1, G2, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, W, X, Y, Z, 51 al 67). Antisueros flagelares para Salmonella (f, g, s, h, r, i, 2, v, m, t, 7, z4, z23, b, 5, d, enx, x, z15, z10, k, q, z28, 6, w, z6, y, z13, z24, a, c, p, z29, z32, z51, z41). Antisuero somático polivalente Shigella dysenteriae (A1-7). Antisuero somático polivalente Shigella flexneri (B1-6). Antisuero somático polivalente Shigella boydii (A1-7). Antisuero somático monovalente Shigella sonnei I. Antisuero somático monovalente Shigella sonnei II. Antisueros somáticos monovalentes para Shigella A (1-15), B (1-6), C (1-18). Todos los antisueros son hidratados y diluidos como se indica en los marbetes de los viales y se conservan a temperatura de refrigeración de 4 a 8° C. 6.7. Pasos del método Aislamiento La muestra de materia fecal deberá ser procesada lo antes posible una vez recibida en el laboratorio. Si la muestra de materia fecal viene en envase estéril, tomar un poco de heces con un hisopo de algodón estéril y hacer una impronta en un cuadrante de agar Mac Conkey, si la muestra está en medio de transporte de Cary-Blair, extraer el hisopo y hacer una impronta en un cuadrante de agar Mac Conkey. Sembrar por estría cruzada, quemar y enfriar el asa entre el segundo y el tercer cuadrante. El hisopo con el que se inóculo la placa de Mac Conkey se introduce en un tubo con base caldo tetrationato adicionado con 0.2 mL de solución de yodo. Incubar la placa y el tubo a 36 + 1° C de 18 a 24 h. Las cepas de Salmonella y Shigella para referencia o control de calidad se siembran en agar Mac Conkey por estría cruzada. Incubar las placas a 36 + 1° C de 18 a 24 h. Tomar el hisopo del caldo tetrationato y hacer una descarga en un extremo de una placa de agar verde brillante y en una placa de sulfito de bismuto. La placa de verde brillante se siembra con asa redonda por estría cruzada, quemar y enfriar el asa entre el segundo y el tercer cuadrante. La placa de sulfito de bismuto se siembra con una asa redonda por estría cruzada sin quemar el asa entre cuadrantes. El agar verde brillante se incuba de 18 a 24 h y el agar sulfito de bismuto se incuba durante 48 h, ambos a 36 + 1° C. Identificación bioquímica De la placa de agar Mac Conkey, seleccionar colonias lactosa negativas (colonias incoloras, probables Salmonella o Shigella), quemar una asa en punta y enfriar en un extremo de la placa donde no haya crecimiento, tomar una colonia sin extender en el agar y sembrar los siguientes medios: Caldo sorbitol y caldo mucato, depositar inóculo; medio MIO, introducir el asa hasta el fondo en posición vertical; TSI y LIA, picadura hasta el fondo y estriar la superficie; citrato y urea, estriar en la superficie; BAB, picadura hasta el fondo y estriar la superficie del agar. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 39 de 52 Julio 2013 Incubar los tubos a 36 + 1° C de 18 a 24 h. Antes de leer las pruebas bioquímicas adicionar al medio MIO 0.5 mL de reactivo de Ehrlich o Kovac, interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas utilizando la Tabla 1 e identificar los patrones bioquímicos de Salmonella y Shigella con las Tablas 3-5, registrar los resultados. Del agar verde brillante seleccionar colonias lactosa negativas (colonias rojas). Quemar un asa en punta y enfriar en un extremo de la placa donde no haya crecimiento, tomar una colonia sin extender en el agar y sembrar las pruebas bioquímicas como se indicó previamente. De la placa de agar de sulfito de bismuto hacer una selección de colonias características a Salmonella, las cuales se observan negras con halo y brillo metálico, tomar una colonia sin extender en el agar y sembrar las pruebas bioquímicas como se indicó previamente. Serotipificación del antígeno somático “O” de Shigella Si la cepa se identifica bioquímicamente como Shigella, conservar los tubos de TSI y BAB; a partir del crecimiento bacteriano del tubo de TSI sembrar en condiciones de esterilidad una placa de BAB por estría cerrada e incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C. En un portaobjetos limpio y desengrasado colocar 6 gotas de solución salina formalinizada (SSF) en el extremo superior separándolas lo suficiente para evitar que las gotas se mezclen; en el extremo inferior del portaobjetos colocar en forma correspondiente una gota de SSF y una gota de cada uno de los siguientes antisueros somáticos polivalentes y monovalentes de Shigella A (1-7), B (1-6), C (1-7), DI y DII. Con un asa desechable o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB e ir depositando en cada una de las gotas superiores de SSF para tener una suspensión bacteriana, mezclar cada gota de suspensión con la gota inferior correspondiente utilizando asa desechable o aplicador de madera y evitando contaminación cruzada. Rotar suavemente el portaobjeto y observar a contra luz una reacción de aglutinación utilizando una lámpara de luz blanca, la observación se hace durante un minuto; después de ese tiempo la prueba se invalida. Interpretar el resultado usando la Tabla 6. Si la cepa aglutina con cualquiera de los antisueros polivalentes A, B o C; se realiza la prueba de aglutinación en portaobjetos con los antisueros monovalentes correspondientes al grupo somático con el cual se observó la aglutinación. Si la cepa aglutina con los antisueros monovalentes DI o DII, se reportará como Shigella sonnei I Shigella sonnei II. En el caso de que la cepa no aglutine con ninguno de los antisueros polivalentes ni monovalentes sonnei, será necesario aglutinar con los antisueros monovalentes A (8-15) y C (8-18). Si la cepa no aglutina con ninguno de los antisueros polivalentes o monovalentes en existencia, se reportará como Shigella spp. Cualquiera que sea el resultado de las pruebas serológicas, éste deberá ser registrado. Serotipificación del antígeno somático “O” de Salmonella EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 40 de 52 Julio 2013 Si se identifica bioquímicamente una cepa como Salmonella, separar los tubos de TSI y BAB; tomar crecimiento del tubo de TSI con un asa de punta estéril y sembrar en placa de BAB por estría cerrada para obtener un crecimiento masivo, incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C. En un portaobjetos limpio y desengrasado colocar 6 gotas de solución salina formalinizada en el extremo superior separándolas lo suficiente para evitar que se mezclen, en el extremo inferior colocar en forma correspondiente a las gotas superiores una gota de SSF y una gota de cada uno de los antisueros somáticos de Salmonella B, C1, O: 8, D y E pol. Con un asa desechable o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB e ir depositando en cada una de las gotas superiores de SSF para tener una suspensión bacteriana, mezclar cada gota de suspensión con la gota inferior correspondiente utilizando un asa desechable o aplicador de madera evitando contaminación cruzada. Rotar suavemente el portaobjeto y observar a contra luz una reacción de aglutinación utilizando una lámpara de luz blanca, la observación se hace durante un minuto. Interpretar el resultado utilizando la Tabla 6 y reportarlo. Si la cepa aglutina con el antisuero O: 8, aglutinar con los antisueros O: 6 y O: 20; si como resultado de la aglutinación la cepa aglutina con el antisuero E pol aglutinar con los antisueros E1, E2, E3 y E4. Si el resultado de la aglutinación es negativo repetir la prueba utilizando los antisueros somáticos del grupo F al 67 hasta identificar el grupo somático al que corresponde la cepa y registrar. Si después de aglutinar con todos los antisueros somáticos en existencia no se logra identificar el grupo somático, debe hacerse la búsqueda de la especie arizona. Inocular un tubo de caldo malonato con la cepa problema e incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C. Interpretar el resultado y consultar la Tabla 5. Si la prueba es positiva, reportar como Salmonella arizona. Si la prueba es negativa reportar como Salmonella spp. Serotipificación del antígeno flagelar “H” de Salmonella Inocular la cepa problema identificada bioquímicamente como Salmonella en un tubo con caldo soya tripticasa (TSB), incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C. Adicionar v/v solución salina formalinizada (SSF) al tubo de TSB. Dejar reposar a temperatura ambiente de 2 a 24 horas. De acuerdo al grupo somático de la cepa a probar, consultar la Tabla 9 para identificar los antisueros flagelares de prueba correspondiente a ese grupo. Colocar en una gradilla tubos de 12x75 mm sin labio, marcarlos y depositar 0.1 mL de cada antisuero flagelar, adicionar 0.9 mL de antígeno formalinizado. Incubar los tubos en baño María a 50° C por una hora y revisarlos (al sacar las gradillas del baño es importante no sacudirlas ni agitarlas, de lo contrario se podría perder la aglutinación). Interpretar los resultados utilizando la Tabla 7. Considerando el antígeno somático y las fases flagelares identificadas, buscar en el esquema de Kauffman-White el serotipo correspondiente y registrar. Si como resultado de la aglutinación flagelar, se detecta solo una fase flagelar, realizar la técnica de inducción de fase. Si no se detecta ninguna fase flagelar, realizar un pase en medio GARD para inducir movilidad como se menciona a continuación. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 41 de 52 Julio 2013 Poner en baño María un tubo de medio GARD, cuando el medio se haya licuado y alcance una temperatura aproximada de 40° C, verterlo en una placa Petri estéril y dejar solidificar en condiciones de esterilidad. Con un asa en punta, tomar crecimiento de un cultivo fresco en BAB de la cepa problema e inocular el agar al centro de la placa. Incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C. Revisar la placa de GARD. Si la bacteria muestra una zona de crecimiento circundante al inoculo, tomar con una asa en punta crecimiento del área más lejana al centro de la placa e inocular un tubo de caldo TSB, incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C. Formalinizar el cultivo de TSB, con solución salina formalinizada, y realizar la técnica de aglutinación flagelar, considerando para ello el grupo somático de la cepa. Leer aglutinación, si se detectan las dos fases flagelares, reportar como lo indica el punto 9.5.5. Si solo se detecta una fase flagelar, realizar la técnica de inducción de fase (ver más adelante). Si en la placa de GARD no se observa ninguna zona de crecimiento circundante al inóculo, reportar el género bacteriano y el grupo somático correspondiente. Inducción de fase para Salmonella Sembrar la cepa problema por estría cerrada en medio de BAB. Incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C. Licuar utilizando baño María, un tubo con medio de GARD y dejar enfriar a 40° C aproximadamente. Adicionar en condiciones de esterilidad con jeringa para insulina, 0.1 mL del antisuero concentrado correspondiente a la fase flagelar identificada, agitar en vortex, verter el medio en placa Petri estéril y dejar solidificar en condiciones de esterilidad. Con un asa estéril en punta, tomar crecimiento de la placa de BAB e inocular la placa de GARD justo al centro. Incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C. Revisar la placa al término de este tiempo o en el intervalo de este tiempo. Si la bacteria muestra una zona de crecimiento circundante al inoculo, tomar con una asa en punta crecimiento del área más lejana al centro de la placa e inocular un tubo de caldo TSB, incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C. Formalinizar el crecimiento del tubo de TSB, empleando solución salina formalinizada, dejar reposar de 2 a 24 horas. Revisar el esquema de Kauffman-White (4) para seleccionar los antisueros correspondientes a las posibles combinaciones flagelares con la fase ya detectada. Realizar la prueba de aglutinación flagelar como se indicó con anterioridad. Si el resultado de la aglutinación es la detección de la segunda fase flagelar, registrar. Si como resultado de la aglutinación no se detecta la segunda fase flagelar, reportar la cepa como monofásica. Si se observa nuevamente aglutinación de la fase inicialmente encontrada es necesario repetir el procedimiento de inducción de fase hasta tres veces, para lo cual se tomará crecimiento de la placa de GARD anterior para inocular la segunda y de la segunda para inocular la tercera. Si como resultado de la última aglutinación, se identifica la segunda fase, registrar; si por el contrario persiste la aglutinación de la primera fase, reportar la cepa con género y grupo EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 42 de 52 Julio 2013 somático, otra posibilidad es que se logre inhibir la primera fase pero no se expresa la segunda, reportar entonces género, grupo somático y la leyenda monofásica. 6.8. Interpretación por laboratorio Para emitir un resultado positivo a Salmonella o Shigella de una muestra procesada, se considera la identificación bioquímica que debe corresponder a los patrones bioquímicos de dichos géneros, así como a los resultados de serotipificación de los antígenos somáticos para ambos géneros bacterianos y antígenos flagelares de Salmonella. Un resultado negativo corresponde a la ausencia de Salmonella spp y Shigella spp en la muestra fecal o cepa recibida. 6.9. Medidas de bioseguridad El nivel de bioseguridad es 2 por lo que se recomienda: Usar bata de laboratorio blanca, limpia y abotonada en las áreas de trabajo y nunca fuera de ellas. Dejar fuera del laboratorio artículos personales. Mantener cerrada la puerta del laboratorio. Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo antes y después de procesar muestras. Lavarse las manos antes y después de trabajar. No hablar, toser o estornudar durante la inoculación y el sembrado de las muestras. Evitar pipetear directamente con la boca (usar bulbo de seguridad). Mantener las manos lejos de la boca, nariz, ojos y cara. EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 43 de 52 Julio 2013 ANEXO 2. INTERPRETACIÓN Y RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS TABLA 1. INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS MIO PRUEBA POSITIVA Medio turbio, Movilidad crecimiento en todo el medio El reactivo de Ehrlich Producción de indol o Kovac toma una coloración roja Descarboxilación de Color púrpura en el ornitina fondo del medio TSI PRUEBA POSITIVA Fermentación de Fondo del medio glucosa amarillo (A) Fermentación de Inclinación del medio lactosa y sacarosa amarillo (A) Burbujas o Producción de gas rompimiento del medio Precipitado negro en Producción de H2S el fondo o en todo el medio LIA PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH Crecimiento sólo a lo Púrpura de bromocresol largo de la picadura pH neutro = morado No cambia la pH alcalino = K = púrpura = coloración del descarboxilación positiva reactivo pH ácido = amarillo = Color amarillo en el descarboxilación negativa fondo del medio PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH Fondo del medio sin Rojo de fenol cambio pH neutro = naranja Inclinación del medio pH alcalino = K = rojo pH ácido = A = amarillo roja (K) Sin formación de Gas = producto de la burbujas ni ruptura fermentación de la glucosa del medio H2S = reacción enzimática con el Sin precipitado negro tiosulfito de sodio y citrato férrico para formar un precipitado negro PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH Púrpura de bromocresol pH neutro = morado pH alcalino = K = púrpura = Descarboxilación de Fondo del medio Fondo del medio descarboxilación positiva lisina color púrpura color amarillo pH = ácido = A = amarillo = descarboxilación negativa Púrpura de bromocresol pH neutro = morado Desaminación de Inclinación del medio Inclinación del medio pH alcalino= R = rojo = lisina color rojo o vino color morado desaminación positiva pH ácido = A = amarillo = desaminación negativa Burbujas o Ausencia de burbujas Gas = producto de la Producción de gas rompimiento del o rompimiento del fermentación de la glucosa medio medio EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 44 de 52 Julio 2013 TABLA 1. INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS (CONTINUACIÓN) Producción de H2S Caldo Arginina Descarboxilación de la arginina Caldo peptonado Producción de indol Oxidasa UREA DE CHRISTENSEN Hidrólisis de la urea CITRATO DE SIMMONS Ausencia de Precipitado negro en precipitado en el el fondo o en todo el fondo o en todo el medio medio PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA Color del medio púrpura PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA No cambia la El reactivo toma una coloración del coloración roja reactivo Color azul en la tira Ausencia de reactiva coloración PRUEBA POSITIVA Inclinación del medio color rosa PRUEBA POSITIVA Utilización del citrato Inclinación del como única fuente de medio carbono color azul CALDO SORBITOL Fermentación del sorbitol Color del medio amarillo PRUEBA POSITIVA Color amarillo EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 PRUEBA NEGATIVA Inclinación del medio sin cambio de color o amarillo PRUEBA NEGATIVA Inclinación del medio color verde PRUEBA NEGATIVA Color rojo o sin cambio INDICADOR DE pH Púrpura de bromocresol pH = neutro = ámbar pH = alcalino = púrpura = descarboxilación (+) pH = ácido = amarillo INDICADOR DE pH Presencia de la enzima citocromo oxidasa INDICADOR DE pH Rojo de fenol pH neutro = amarillo o ligeramente rosa pH alcalino = rosa = hidrólisis de la urea positiva pH ácido = amarillo o sin cambio = hidrólisis de la urea negativa INDICADOR DE pH Azul de bromotimol pH neutro = verde pH alcalino = azul = utilización del citrato como única fuente de carbono INDICADOR DE pH Rojo de fenol pH neutro = anaranjado pH ácido = amarillo pH alcalino = anaranjado Página 45 de 52 Julio 2013 TABLA 1. INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS (CONTINUACIÓN) CALDO MUCATO Utilización del mucato CALDO MALONATO Utilización del malonato PRUEBA POSITIVA Color amarillo PRUEBA POSITIVA Azul EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 PRUEBA NEGATIVA Sin cambio o verdoso PRUEBA NEGATIVA Verde INDICADOR DE pH Azul de bromotimol pH neutro = azul menta pH ácido = amarillo pH alcalino = azul menta verdoso INDICADOR DE pH Azul de bromocresol Página 46 de 52 Julio 2013 TABLA 2. IDENTIFICACIÓN DE DIFERENTES ESPECIES DEL GÉNERO VIBRIO MICROORGANISMO COLONIA TSI Vibrio cholerae Vibrio alginolyticus Vibrio charchariae Vibrio cincinnatiensis Vibrio damsella ** Vibrio fluvialis Vibrio furnissi Amarilla Amarilla Vibrio hollisae Verde Vibrio metschnikovii Vibrio mimicus Vibrio parahaemolyticus * Vibrio vulnificus Amarilla A/A Verde A (K)/A Azul-verde K/A Azul-verde A (K)/A Amarilla Amarilla Amarilla Amarilla LIA A (K)/A K/K A/A K/K A (K)/A K/K A (K)/A K/K (A) K/A K/K (A) A/A K/A A (K)/A K/A K/A K/A K/A K/K K/K K/K M I O + + + -/+ + + + (7 días) + + + + + +/+ -/+ -/+ + V - + + + + + + -/+ + + + ROJO DE METILO +/+ V + + - + - + - -/+ + + + + + V + + + + +/- CALDO ARGININA PEPTONADO CALDO NUTRITIVO CON NaCl (%) V.P OXIDASA 0 1 3 6 8 10 12 + +/+ + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + V + + + + + + + +/+/+/- +/- -/+ - + - - + - + + + - - - - + - + + + + + + + + - + + + + + + + V + + + +/- V + - - - - * : Ureasa positivo - : 0 a 10 % de positividad -/+ : 11 a 39 % de positividad V : 40 a 60 % de positividad +/- : 61 a 90 % de positividad + : 91 a 100 % de positividad Fuente: Giono Cerezo S, Escobar Gutiérrez A, Valdespino Gómez JS, Diagnóstico de Laboratorio de Infecciones Gastrointestinales, 1994. InDRE, SSA, pp 310-315, Zinsser, Microbiología, 1998, 20ª edición, Edit. Panamericana, pp 771 A EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 GAS Página 47 de 52 Julio 2013 TABLA 3. RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE ENTEROBACTERIAS QUE DAN PRUEBA DE INDOL NEGATIVA MICROORGANISMO Salmonella spp Shigella spp A,B,C,D Citrobacter freundii Proteus mirabilis Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae Klebsiella rhinoscleromatis Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter sakasakii Pantoea agglomerans Serratia marcescens Providencia heimbachae CITRATO +(95) -(100) -(100) +(78) +(65) -(85) +(98) -(100) UREA -(99) -(100) -(100) -(56) +(98) +(95) +(95) -(100) LIA K/K(98) K/A(100) K/A(100) K/A(100) R/A(100) R/A(100) K/K(98) K/A(100) H2S TSI M I O +(95) K/A(99) +(95) -(99) +(97) -(100) K/A(100) -(100) -(50) -(99) -(100) K/A(98) -(100) -(100) +(98) +(78) K/A(78) +(89) -(77) -(100) +(98) K/A(98) +(95) -(98) +(99) +(95) K/A(98) +(95) +(98) -(100) -(100) A/A(98) -(100) -(100) -(100) -(100) K/A(100) -(100) -(100) -(100) +(95) +(100) +(99) +(50) +(98) -(100) -(98) +(65) -(99) -(80) -(85) -(100) K/K(98) K/A(100) K/A(100) K/A(100) K/K(99) R/A -(100) A/A(95) -(100) A/A(93) -(100) A/A(99) -(100) K/A(60) -(100) K/A(98) -(100) K/A(100) EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 +(97) -(100) +(98) +(95) -(100) +(96) +(96) -(88) +(91) +(85) -(80) -(100) +(97) -(99) +(99) -(54) -(100) -(100) Página 48 de 52 Julio 2013 MUCATO +(90) -(100) -(90) +(100) -(100) -(100) +(90) -(100) SORBITOL +(95) -(70) -(98) +(100) -(100) -(100) +(99) +(100) +(90) +(75) -(99) -(60) -(100) -(100) +(100) +(95) -(100) -(70) +(99) -(100) TABLA 4 RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE ENTEROBACTERIAS QUE DAN PRUEBA DE INDOL POSITIVA MICROORGANISMO CITRATO UREA LIA H2S TSI M I O MUCATO SORBITOL E. coli -(99) -(99) K/K (90) -(99) A/A (95) +(95) +(98) +(65) +(95) +(94) K/A (60) E. coli (inactiva) -(99) -(99) -(99) K/A(75) -(95) +(80) -(80) -(70) -(75) Klebsiella oxytoca +(95) +(90) K/K(99) -(100) A/A(100) -(100) +(99) -(100) +(93) +(99) Citrobacter diversus +(99) +(75) K/A(100) -(100) K/A o A/A +(95) +(99) +(99) +(95) +(99) (50) Citrobacter +(95) +(85) K/A(100) -(95) K/A(65) +(95) +(100) +(95) +(96) +(99) amalonaticus Morganella -(100) +(95) R/A(99) -(80) K/A(99) +(95) +(95) +(95) -(100) -(100) morganii Morganella -(100) +(100) K/K(100) -(85) K/A(100) -(100) +(100) +(80) -(100) -(100) morganii biogrupo 1 Edwarsiella tarda -(99) -(100) K/K(100) +(100) K/A(100) +(98) +(99) +(100) -(100) -(100) Edwarsiella tarda Hafnia alvei Providencia rettgeri -(100) -(100) +(95) EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 -(100) -(96) +(98) K/K(100) K/K(100) R/A -(100) -(100) -(100) K/A(100) K/A(95) K/A(95) +(100) +(85) +(94) +(99) -(100) +(99) Página 49 de 52 Julio 2013 +(100) +(98) -(100) -(100) -(100) -(100) -(100) -(100) -(99) TABLA 5. Diferenciación de Salmonella atípica CARACTERÍSTICA Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella typhi paratyphi A sp arizona choleraesuis Movilidad + + + + + Producción de indol Descarboxilación de la + + + + ornitina Fermentación de la + + + + + glucosa Fermentación de sacarosa Fermentación de lactosa Producción de gas + + +(-) + Producción de H2S +* + +(-) +/Descarboxilación de la + + + + lisina Uso del malonato + Utilización de citrato + + Hidrólisis de la urea Caldo mucato +(-) +(-) Caldo sorbitol + + + + + + :Reacción positiva - :Reacción negativa ( - ):Reacción ocasionalmente negativa +/- reacción al 50 % * se produce en poca cantidad EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 50 de 52 Julio 2013 ANEXO 3. RESULTADO DE PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN TABLA 6. Prueba de aglutinación en portaobjetos PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA CONTROL NEGATIVO Formación de grumos Suspensión homogénea Suspensión homogénea TABLA 7. Lista de antisueros para la prueba de aglutinación flagelar de Salmonella en tubo O:2 O:4 O:7 O:8 O:9 O:3,10 O:3,19 O:11 O:13,22 O:13,23 O:6,14 O:16 O:17 O:18 O:21 O:28 O:30 O: 35 O:40 O:44 O:47 Grupo somático (A) (B) (C1 ) (C2 ) (D1 ) (E1-E3 ) (E4 ) (F) (G1 ) (G2 ) (H) (I) (J) (K) (L) (M) (N) (O) PRUEBA POSITIVA Formación de grumos Antisuero flagelar a, g, m, p, v, 5 f, g, s, h, r, i, 2, v, m, t, 7, z4, z23, b, 5, d, enx, x, z15 b, g, m, s, t, r, w, 5, z10, d, h, k, z29, enx, x, z15 d, h, r, 2, z4, z24, k, 5, enx, z10, i, z6, g, d, m, v, q, s, t, 5, 2, p, z28 h, v, 5, 6, 7, w, z10, z6, r, y g, s, t, i, 2 a, r, 5, enx, z28, z13, x, z15, z29 z, 6 f, g, z, w, b, 5, 6, s 7, d, y c, 5, y d, 5 z23, z4 b, enx, y 7, y b, enx f, g, z4, z23 b, enx, x, z15 7, c, z10, enx, x, z15 i, enx, x, z15 TABLA 8. Prueba de aglutinación en tubo PRUEBA NEGATIVA CONTROL NEGATIVO Suspensión homogénea Suspensión homogénea EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 51 de 52 Julio 2013 TABLA 9. DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS SOMÁTICOS DE VIBRIO CHOLERAE POR AGLUTINACIÓN EN PORTAOBJETOS Control Interpretación del resultado O1 Poliv O1 O1 Ogawa O:139 negativo Inaba + + V. cholerae O1 Inaba - + - + - V. cholerae O1 Ogawa - - - - - V. cholerae No O1 Neg a O:139 - - - - + V. cholerae No O1 Pos a O:139 + + + + + V. cholerae No O1 Neg a O:139 - + - - - V. cholerae No O1 Neg a O:139 - - + - - V. cholerae No O1 Neg a O:139 - + + débil + - V. cholerae O1 Ogawa EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versión No.01 Página 52 de 52 Julio 2013