proyecto: riqueza de especies bacterianas y diversidad de

PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y DIVERSIDAD DE
GENES RELEVANTES EN EL TRACTO DIGESTIVO DE INSECTOS
DESCORTEZADORES DEL GENERO DENDROCTONUS
SIP 20070651
INFORME FINAL
I. INTRODUCCION
I.1. MICROORGANISMOS DEL INTESTINO
En el tracto digestivo de los insectos se albergan una gran variedad de
microorganismos; algunos de cuales habitan cavidades concretas, están rodeados
por las células de tejido epitelial o se mantienen como simbiontes intracelulares
(endosimbiontes). Los microorganismos del intestino están compuestos por una
amplia variedad de especies, que incluyen bacterias, arqueas y eucariotes. En
particular, la región del proctodeo es la más densamente poblada y con mayor
diversidad de especies de microorganismos asociados (Anklin-Mϋhlemann et al.,
1995; Bignell et al., 1980; Cazemier et al., 1997; Cruden y Markovetz, 1987;
Werner, 1926; Wiedenmann, 1930).
El proctodeo de termitas, grillos y cucarachas; que sobreviven a base de
dietas de difícil asimilación y limitadas en nutrientes, tienen poblaciones de
bacterias firmemente adheridas al integumento (Breznak y Pankrast, 1977; Cruden
y Markovetz, 1979; Fogelsong et al., 1975; Ulrich et al., 1981). Sin embargo, otros
microorganismos del intestino de insectos, como los protozoarios y las
espiroquetas, establecen grandes y persistentes poblaciones sin estar adheridos a
las superficies del canal alimentario (Breznak, 2000).
La dieta influye claramente en la densidad y proporción de los diferentes
microorganismos que podemos encontrar en el canal alimentario de mamíferos y
artrópodos (Hungate, 1966; Kauffman et al., 2000). Mientras que algunas bacterias
de los tractos digestivos son capaces de utilizar una amplia variedad de nutrientes,
otras sólo sobreviven empleando nutrientes específicos. El crecimiento y
supervivencia de diferentes especies microbianas está en función de las
condiciones ambientales que se pueden encontrar en el tracto digestivo de los
huéspedes. Estas condiciones pueden variar temporal y espacialmente dentro del
mismo individuo o entre diferentes individuos (Nardi et al., 2002).
La naturaleza facultativa u obligatoria de las interacciones insectomicroorganismo es dinámica y compleja. La interrelación entre las funciones
microbianas y la fisiología de los insectos es una área aún pobremente estudiada
de la biología de los insectos. De los microorganismos del intestino de los
insectos, sólo los de las termitas se han estudiado ampliamente y la
interdependencia obligada de esta asociación se ha reconocido (Breznak, 1982).
Otros insectos en los cuales también se ha estudiado con cierta profundidad a los
microorganismos del intestino son las cucarachas y los áfidos (Cruden y
Markovetz, 1979; Douglas, 1998).
Así por ejemplo, el tiempo de vida de las termitas superiores se puede
reducir de 250 a 13 días si son eliminadas las bacterias y espiroquetas de su
intestino empleando algunos antibióticos (Eutick et al., 1978). Aunque las células
del mesenterón de las termitas superiores son capaces de digerir la lignocelulosa
sin necesitar la cooperación directa de los microorganismos de su intestino se ha
propuesto que la producción de estas celulasas endógenas no es suficiente para
abastecer a las termitas de la energía que ellas necesitan para su desarrollo y
reproducción. (Bignel, 2000; Tokuda y Watanabe, 2007) Las células de ningún
insecto son capaces de fijar nitrógeno ni de convertir el dióxido de carbono en
acetato; todos estos procesos anaeróbicos son exclusivos de los microorganismos
del intestino. En particular, la acetogénesis microbiana provee, al menos, la
tercera parte de la energía requerida por las termitas (Breznak, 2000).
Asimismo, la mayoría de las especies de cucarachas se alimentan de
cualquier material orgánico disponible, incluso de los residuos celulósicos de las
plantas, los cuales son pobres en nitrógeno. Si las poblaciones microbianas
asociadas al tracto alimentario de las cucarachas se eliminan, se observa un
efecto negativo sobre el peso del adulto, el volumen del proctodeo, la producción
de metano y el tiempo de generación (Gijzen y Barugahare, 1992).
Finalmente, las bacterias del intestino de los áfidos mantienen un sutil
balance entre ellas y el insecto huésped. Erwinia aphidicola puede mostrarse
como un patógeno en su relación con los insectos, sin embargo generalmente
mantiene un equilibrio con otras poblaciones de enterobacterias que suprimen su
crecimiento excesivo. Si esto sucede, se inhibe el cambio del exoesqueleto
(ecdisis) y causa una mayor mortalidad en los insectos adultos (Harada
y
Ishikawa, 1997).
I.2. ESCARABAJOS DESCORTEZADORES
Los
escarabajos
descortezadores
se
encuentran
en
la
subfamilia
Scolytinae, éstos típicamente se alimentan de sustratos pobres. Ellos colonizan y
se alimentan de una gran variedad de tejidos de las plantas que incluyen los
tejidos de la madera (corteza y floema), frutos y la médula de las ramas.
Solamente los escarabajos de la ambrosia no se alimentan de los tejidos de las
plantas, sino de sus hongos asociados. Los escolítidos se pueden agrupar en tres
categorías con base en sus estrategias de alimentación: saprófagos, los cuales se
alimentan exclusivamente de tejidos de árboles muertos o decaídos; fitófagos, que
se alimentan de de tejidos de plantas vivas o recientemente muertas y los
micetófagos, que viven en la madera ó en otros tejidos de las plantas donde
cultivan hongos, de los que se alimentan (Six, 2003).
1.3 SIMBIOSIS EN Dendroctonus
Los escarabajos descortezadores comprenden un grupo económicamente y
ecológicamente importante que habita en los tejidos subcorticales de los árboles,
especialmente en el floema y la corteza externa (Wood, 1982). Algunas especies
de descortezadores se alimentan de árboles enfermos ó muertos y juegan un
papel ecológico benéfico, debido a que participan en la descomposición y el
reciclaje de nutrientes, además de proveer de alimento a algunas aves y otros
animales silvestres (Schowalter, 1981; Raffa et al., 1993), como es el caso de
Dendroctonus
valens.
Sin
embargo,
otras
especies
de
escarabajos
descortezadores son importantes plagas forestales que se pueden extender a
millones de hectáreas contiguas de bosque y que causan pérdidas a gran escala
(Coulson, 1979; Wallin y Raffa, 2004).
Dada la pobre composición de nutrientes que tienen la albura (parte más
externa del xilema secundario) y el floema de los cuales se alimentan los
escarabajos del género Dendroctonus, parece probable que los microorganismos
asociados provean de algunos nutrientes que suplementan su dieta o les facilitan
su asimilación.
La mayoría del conocimiento de los microorganismos asociados al género
Dendroctonus involucra a los hongos, particularmente a aquellos que son
transportados
externamente
sobre
el
exoesqueleto
o
en
estructuras
especializadas conocidas como micangios (Hsiau y Harrington, 2003; Krokene y
Solhein, 1998; Lim et al., 2004, 2005; Paine et al., 1997). El micangio es una
invaginación del integumento que posee glándulas o células secretoras que
alberga hongos simbióticos, entre los que se encuentran Entomocorticium spp.,
Ceratocystiopsis ranaculosus, etc. (Batra, 1963; Levieux et al., 1991; Six, 2003).
Se ha sugerido que los hongos micangiales proveen de compuestos nitrogenados,
vitaminas, esteroles y otros factores de crecimiento a escarabajos del género
Hypothenemus (Beaver, 1986).
Algunos hongos micangiales de D. frontalis pertenecientes al género
Entomocorticium concentran y transportan compuestos nitrogenados de la savia
(proteínas y aminoácidos) a la cámara de alimentación de las larvas del insecto, lo
cual favorece el crecimiento de las poblaciones de los insectos (Ayres, 2000). Las
poblaciones de D. frontalis que se desarrollan en presencia de Entomocorticium
poseen un alto contenido lipídico, lo que disminuye el tiempo de desarrollo mínimo
de las larvas de ~40 a ~18 días (Barras y Hodges, 1973; Wagner et al., 1984).
Los hongos micangiales parecen beneficiarse de la simbiosis al recibir
nutrientes producidos por las glándulas asociadas al micangio, al ser
transportados e inoculados a otros árboles durante los periodos de dispersión y
colonización del insecto (Paine y Birch, 1983) y posiblemente también reciben una
protección física contra la luz UV y la desecación (Six, 2003).
Otros hongos como Pichia pinus y Kuraishia capsulata asociados a D.
ponderosae convierten el trans-verbenol, una feromona de agregación, a
verbenona, una feromona de antiagregación. Esta conversión posiblemente juega
un papel muy importante en la terminación del ataque masivo al árbol por este
insecto (Hunt y Borden, 1990).
En D. terebrans, D. frontalis e Ips avulsus se han aislado constantemente
cepas de Pantoea agglomeras (anteriormente clasificada como Enterobacter
agglomerans) y Enterobacter spp. las cuales son bacterias fijadoras de nitrógeno
potenciales y posiblemente suplementan la dieta de estos insectos con
compuestos
nitrogenados
(Bridges,
1981).
Por
otra
parte,
Penicillium
chrysogenum que tiene la capacidad de degradar la carboximetil-celulosa se aisló
en una ocasión del tracto digestivo de D. frontalis, aunque no se lograron aislar
bacterias celulolíticas, por lo que se mantuvo la duda acerca del impacto que tiene
la microbiota asociada al intestino de este insecto sobre la degradación de la
celulosa (Delalibera et al., 2005).
A pesar de la gran importancia económica y ecológica de los escarabajos
en general y en particular del género Dendroctonus, se conoce poco sobre la
diversidad de la microbiota de su intestino.
II. DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO
III. MATERIAL Y METODOS
III.1. COLECTA DE INSECTOS
Los insectos se colectaron en bosques de pinos de diferentes localidades
de la República Mexicana, se extrajeron de árboles infestados y se colocaron en
recipientes de plástico, con un papel húmedo, debidamente etiquetados indicando
fecha y localidad. Los insectos se mantuvieron a 4ºC y se transportaron
al
laboratorio donde se procedió a su disección.
En el cuadro 1 se muestran los lugares donde se realizaron las colectas de
insectos. Todos los ejemplares se mantuvieron a 4ºC y se transportaron al
laboratorio. Los insectos se disectaron para obtener su tracto digestivo, el cual se
seccionó en mesenterón anterior (MP), mesenterón posterior (MP) y proctodeo
(P), estas partes se colocaron en tubos de 1.5 ml que contenían 200 μl de medio
de cultivo líquido
cuando la muestra se procesó para el cultivo de
microorganismos ó 200 μl de agua para la muestras a las cuales se les extrajo
DNA metagenómico
Cuadro 1. Escarabajos descortezadores colectados en este estudio.
Coordenadas
Fecha de
Especie
Estado
Localidad
geográficas
colecta
San Juanito
Chihuahua
Casas Grandes
Dendroctonus
valens
Jalisco
Los Pozos, Gómez
Farias
Distrito Federal
CICS, Milpa Alta
27o55’22’’ N
107º55’47’’ O
30º09’76’’ N
108 º 57’03’’ O
19º88’20’’ N
103º40’40’’ O
19º 04’ N
98º 58’ O
25 de Octubre
2005
28 de Octubre
de 2005
25 de Junio de
2006
25 de Marzo de
2006
III.2 DISECCIÓN Y EXTRACCIÓN DEL TUBO DIGESTIVO DE LOS INSECTOS
Los escarabajos se limpiaron superficialmente con etanol al 96%, se
expusieron durante 10 minutos a luz UV y se lavaron en una solución reguladora
de fosfatos (50 mM, pH 7.2), en esta solución se sacrificaron por ahogamiento.
Una vez sacrificado el insecto, se colocó en una caja Petri con regulador de
fosfatos y se inició la disección quitando los élitros y las alas, posteriormente se
cortó la parte abdominal y se separó el cuerpo graso del tubo digestivo. Una vez
obtenido el tubo digestivo se pasó a otra caja Petri con PBS, se separó en las
distintas secciones: mesenterón anterior, mesenterón posterior y proctodeo y cada
sección se colocó en tubos Eppendorf estériles con 100 μL de PBS 120 mM pH 8.
Se almacenaron a -20ºC hasta su posterior uso.
III.3 ANÁLISIS BASADOS EN MÉTODOS MOLECULARES
III.3.1 EXTRACCIÓN DEL DNA TOTAL
Se descongelaron los tubos conteniendo las partes del tubo digestivo y se
agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de
0.5 mm previamente esterilizadas. Se agitaron con Vortex hasta el rompimiento
total del tejido y se centrifugaron 10 min a 14,000 rpm. Se hicieron extracciones
del sobrenadante con 200 μL de fenol-cloroformo 25:25, el DNA de la fase acuosa
se precipitó con un volumen de isopropanol e incubación a -20ºC por 30 min.
Finalmente, el DNA se lavó con 0.5 mL de etanol 70% y se resuspendió en 50 μL
de agua desionizada estéril y se almacenó a -20ºC hasta su uso.
III.4 CUANTIFICACIÓN Y VISUALIZACIÓN DEL DNA
Para cuantificar y determinar la pureza el DNA, se empleó un espectrofotómetro
de UV y se tomaron lecturas de absorbencia a 260 y 280 nm del DNA en la
muestra (Sambrook et al., 2002). También se visualizó el DNA extraído por
electroforesis en gel de agarosa al 0.7% en amortiguador TAE 1X.
III.5 CONSTRUCCIÓN DE LA LIBRERÍA DE GENES RIBOSOMALES
III.5.1 AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES 16S rRNA
Se amplificó un fragmento de aproximadamente 1,500 pb del gen 16S rRNA
con un protocolo e iniciadores descritos previamente en la literatura (Relman,
1993). Los iniciadores utilizados fueron: Derecho 8 (5’GCG GAT CCG CGG CCG
CTG CAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG3’) y Reverso 1492 (5’GGC TCG AGC
GGC CGC CCG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T3’)
III.5.2 CLONACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR
Se purificaron los productos de PCR para la clonación con el kit de
purificación “PCR Purification Kit” (Qiagen, Valencia, CA). El amplificado purificado
se clonó en el vector pCR2.1-TOPO de 3.9 Kb del kit TOPO TA Cloning
(Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. La tranformación
se realizó en células quimiocompetentes de la cepa DH10b de Escherichia coli.
El crecimiento de las clonas se efectuó en medio LB con ampicilina (50
μg/mL), X-gal (40 μg/ mL) e IPTG (0.5 mM). Las clonas con los plásmidos
recombinantes se reconocieron por la coloración blanca de las colonias y por su
resistencia a la ampicilina.
III.5.3 CULTIVO DE LAS CLONAS SELECCIONADAS Y OBTENCIÓN DEL DNA
PLASMÍDICO
Las clonas seleccionadas se picaron con palillos de madera estériles y se
sembraron en tubos con tapón de rosca con 5 mL de medio LB con ampicilina (50
μg/mL) durante 24 h a 37°C.
El DNA plasmídico se obtuvo por medio de la técnica de lisis alcalina
(Sambrook et al., 2002).
III.5.4 BÚSQUEDA DE CLONAS POSITIVAS
Se identificaron las clonas que contenían el inserto por liberación del mismo
con la endonucleasa de restricción EcoRI (Invitrogen, Carlsbad, CA) cuyas
secuencias de corte flanquean el sitio de inserción en el plásmido.
III.6 SECUENCIACIÓN
Para priorizar los esfuerzos de secuenciación se realizó un análisis RFLP
con la enzima HpaII y se secuenció una clona de cada perfil representativo. La
secuenciación de los plásmidos purificados se realizó de manera automatizada
con un secuenciador ABI PRISM 310 Genetic Analyzer PE (Applied Biosystems).
Se realizaron reacciones de secuenciación por clona representativa a partir del
extremo 5’ y 3’ con los iniciadores M13-F (5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’) y M13-R
(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’).
III.7 ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS OBTENIDAS
Las secuencias obtenidas de los diferentes microorganismos fueron
analizadas con el programa CHIMERA-CHECK del Ribosomal Database Project
(http://rdp8.cme.msu.edu/htm/analyses.html)
para
descartar
las
posibles
secuencias quiméricas. Posteriormente las secuencias obtenidas se sometieron a
una búsqueda de secuencias similares en GenBank por medio del programa
BLASTN versión 2.2.3 (Altschul et al., 1997) en la página de la NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Una vez determinada la identidad, las secuencias
relacionadas se seleccionaron considerando los niveles jerárquicos y linaje
taxonómico
descrito
en
la
base
de
datos
TaxBrowser
del
NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=taxonomy). Para obtener el mejor
alineamiento, múltiples alineamientos de las secuencias se hicieron con el
programa CLUSTAL X versión 2.0 (Thompson, 1997); los parámetros usados
fueron los de lento/seguro, 15.5 para apertura de gaps, 6.6 para extensión de los
mismos, eliminación de secuencias divergentes en 30% o más, peso de 0.5 para
las transiciones y la matriz IUB para peso del DNA, no se utilizó matriz negativa.
Los alineamientos se terminaron de editar manualmente con el programa
“Seaview” (Galtier et al., 1996).
Las relaciones filogenéticas entre las secuencias se establecieron por
métodos de distancia. El modelo de sustitución nucleotídica para estimar las
distancias evolutivas (ED) se eligió tomando en cuenta las frecuencias
nucleotídicas determinadas con el programa DAMBE (Xia y Xie, 2001), que por
medio de una tabla de contingencia de
Χ2 indica si las proporciones nucleotídicas
corresponden a lo esperado y si esto es significativo estadísticamente; el índice de
transiciones y transversiones se calculó con el programa MEGA versión 2.1. Para
obtener los árboles filogenéticos se empleó el paquete de programas
computacionales MEGA versión 4.0, se empleó el método de agrupamiento de
Neighbor Joining y se realizó un análisis de remuestreo (“bootstrap”) con 1000
aleatorizaciones.
III.8 ANÁLISIS DE RAREFACCIÓN E ÍNDICES DE DIVERSIDAD
Para efectuar los analisis de rarefacción y calcular el estimador de la
riqueza Chao 1, las secuencias de las clonas obtenidas a partir de la librería de
genes ribosomales del tracto digestivo de 3-5 hembras de D. valens se alineron,
con el programa Clustal X 2.0 (Thompson et al., 1997). Una matriz de distancia fue
calculada empleando la paquetería PHYLIP 3.67 apartir del modelo de sustitucion
de Kimura-2-Parámetros (Felsestein, 1993). La determinacion de la riqueza y
unidades taxonómicas operativas se llevo a cabo con en el programa DOTUR. Las
curvas de rarefación se construyeron a niveles de distancia genética de 20, 10, 5,
3 y 1%, las cuales corresponden a los niveles taxonómicos de phylum, clase,
género, especie y cepa respectivamente (Scholoss y Handelsman, 2005).
En nuestro caso, los análisis de rarefacción fueron útiles para estimar el
grado en que el muestreo cubrió la diversidad presente en el intestino de D. valens
a partir de la librería de genes. Las curvas de rarefacción son construidas
mediante el trazado del número total de OTUs encontradas versus el número total
de secuencias analizadas. Generalmente, la inclinación de una curva de
rarefacción es alta al inicio y gradualmente disminuye, provocando que la curva
alcance un punto máximo y se vuelva asintótica; en este punto, el muestreo se
considera adecuado. En este trabajo, solo se presentan las curvas de rarefacción
para las OTUs con una distancia genética no mayor de 20, 5 y 3%, la cuales
indicativas de las diferencias nivel de phylum, género y especie respectivamente.
A pesar de que los análisis de rarefacción son útiles para estimar si el
muestreo fue adecuado, éstos no son adecuados para estimar la riqueza de una
comunidad. Por lo tanto el estimador de la riqueza Chao 1 fue también calculado
con la paquetería DOTUR (Scholoss y Handelsman, 2005). Chao 1 es en
estimador no paramétrico que determina la diversidad de una comunidad
basándose en el numero de “singletons” (OTUs representadas por sólo una
secuencia) y “doubletons” (OTUs representadas por dos secuencias) encontrados
en una muestra (Bohannan y Hughes, 2003). La riqueza terminal de Chao 1 se
reporta para secuencias con diferencias no mayores al 3% entre ellas.
El estimador de la riqueza terminal Chao 1 se calcula empleando la
siguiente relación:
SChao1 = Sobs +[n2(n1-1)/2(n2+1) ], cuando n1>0 y n2≥0 y cuando n1=0 y n2=0
SChao1 = Sobs + (n1²/ 2n2), cuando n1=0 y n2≥0
Donde,
S Chao1 = Riqueza estimada
Sobs= Número de especies observadas
n1 = Número de OTUs con sólo una secuencia
n2 = Número de OTUs con sólo dos secuencias
III.9 ANÁLISIS MEDIANTE DGGE DE LA REGIÓN V3 DEL GEN 16S rRNA
III.9.1 AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN V3 DEL GEN 16S rRNA
Para amplificar la región variable 3 del gen 16S rRNA se usaron los
iniciadores Derecho 2 (5’GCG CCG CCG CGC GCG GGC GGG GCG GGG GCA
CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG3’) (en negritas se destaca el broche
de GC) y Reverso 3 (5’ATT ACC GCG GCT GCT GG3') (Muyzer et al., 1993).
La mezcla de reacción fue la siguiente:
Reactivo
DNA
Regulador
Oligonucleótidos
DNTPs
Taq polimerasa
MgCl2
Agua
Concentración final
4 ng
1X
0.4 pM
0.2 mM
1 unidad
3 mM
Hasta completar 25 μL
Las condiciones para la PCR fueron las siguientes:
Ciclos
Desnaturalización inicial
Desnaturalización
Hibridación
Polimerización
Extensión final
Temperatura Tiempo
(°C)
(seg)
92
300
92
45
55
30
72
45
72
420
No. de ciclos
1
35
1
III.9.2 ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DESNATURALIZANTE
(DGGE)
Para la DGGE se prepararon las siguientes soluciones madre:
Capacidad relativa de desnaturalización
Reactivo
Acrilamida-Bis acrilamida (37.5:1) 40%
TAE 50X
Glicerol
Urea
Formamida
Solución A
100 %
50 mL
2.5 mL
5.0 mL
105.4 g
100 mL
Solución B
0%
50 mL
2.5 mL
5.0 mL
0
0
Agua desionizada hasta completar 250 mL
Las soluciones se guardaron en frascos ámbar a 4°C. La solución A se
diluyó con la solución B para obtener los porcentajes de desnaturalización relativa
del 60% y 30%. Se prepararon dos tubos con 12 mL de las soluciones de alto y
bajo porcentaje, se agregaron 13 μL de TEMED y 40 μL de persulfato de amonio
al 10% (APS). El gradiente de desnaturalización se formó con un gradientador de
vasos comunicantes al tiempo que se introdujo la mezcla para llenar el espacio
entre los vidrios que contienen el gel, a los que previamente se les colocó un
cuadro de “gel bond”. Finalmente se preparó un tubo con 7 mL de solución B, 7 μL
de TEMED y 20 μL de APS al 10% con el cual se formó el gel de carga. Se dejó
polimerizar la poliacrilamida durante hora y media.
La cámara de electroforesis se llenó con amortiguador TAE 1X, se montó el
gel y se calentó a 60°C. Se colocaron las muestras en el gel (aproximadamente 20
μL con 4 μL del amortiguador de carga). Se corrió el gel a 200 V durante 5 min
para introducir las muestras al gel de carga. Para separar las muestras, el gel se
corrió a 85 V durante 16 h.
III.9.3 TINCIÓN Y OBSERVACIÓN DE PERFILES
La tinción con sales de plata se realizó en cuatro etapas:
1. Fijación. El gel se colocó en 200 mL de solución de fijación y se mantuvo en
agitación durante 3 min a 26 rpm.
2. Tinción. Posteriormente, el gel fijado se colocó en 200 mL de solución de
tinción y se mantuvo en agitación durante 10 min a 26 rpm. Después se
lavó con agua destilada durante 2 min.
3. Revelado. El gel se colocó en otra charola, que previamente se lavó con
aproximadamente 10 mL de la solución de revelado para eliminar las sales
contaminantes que pudieran precipitar la plata. Los geles se mantuvieron
en 200 mL de la solución de revelado y en agitación hasta la aparición de
las bandas. La reacción de revelado se detuvo añadiendo con 200 mL de
solución de fijación durante 5 min. Después se lavó con 200 mL de agua
destilada durante 5 min.
4. Preservación: En seguida el gel se colocó en 200 mL de solución de
preservación en agitación durante 10 min.
Finalmente, el gel se colocó en un transiluminador de luz blanca y se digitalizó
en un Eagle Eye o con ayuda de una cámara forográfica. El análisis de los perfiles
obtenidos se realizó manualmente.
El análisis de DGGE se llevó a cabo para comparar la fracción bacteriana
cultivable con los amplificados de genes ribosomales provenientes del DNA
metagenómico, que teóricamente se aproxima a la comunidad bacteriana total. El
DNA metagenómico se aisló de las diferentes partes del tracto digestivo de 3-5
individuos (hembras y machos) de D. valens colectados en el campo. Las cepas
aisladas a partir de los tractos digestivos se crecieron en medio LB durante toda la
noche y posteriormente se les extrajo el DNA. Los productos de PCR se
obtuvieron a partir de la amplificación de la región 3 variable del gen 16S rRNA y
se separaron por electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante. La
población mínima de una especie detectable por PCR-DGGE usualmente debe
constituir al menos el 1% de la total de poblaciones que componen la comunidad
en estudio. Asimismo, las especies con poblaciones más abundantes forman las
bandas más intensas (Muyzer y Smalla, 1998).
III.9.4 DETECCIÓN POR PCR DE LOS GENES REPRESENTATIVOS
DEL
CICLO DEL NITRÓGENO.
Los genes que codifican para la amonio monooxigenasa (amoA), nitrito
reductasa dependiente de cobre (nirK) y citocromo cd1 (nirS), óxido nítrico
reductasa (nosZ) y 16S rRNA del género Nitrobacter se amplificaron por
procedimientos previamente descritos, cuyos oligonucleótidos iniciadores se
describen en el Cuadro 1.
Debido a que existen varias familias del gen que codifica para la
dinitrogenasa (nifH) y éstas mantienen una conservación a nivel de nucleótidos
relativamente baja, fue necesario diseñar 4 juegos de iniciadores para PCRs
específicas que nos permitieran abarcar la mayoría de los miembros de cada una
de las familias de este gen. En la medida de lo posible se evitó incluir nucleótidos
degenerados
para
mantener
una
especificidad
relativamente
alta.
Los
oligonucleótidos se diseñaron a partir de alineamientos múltiples de las
secuencias completas de los genes nifH disponibles en el banco de genes
(GeneBank). Cada par de iniciadores amplifica uno de los cuatro grupos o familias
de genes nifH reconocidos en el alineamiento (Cuadro 2).
Cuadro 2. Oligonucleótidos utilizados para amplificar los genes importantes en el
ciclo del nitrógeno.
Gen
Nombre del
iniciador
Secuencia (5’ →3’)
Posición
amoA1F
GGGGTTTCTACTGGTGGT
N 332-N349
amoA2R
FGPS1269
CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC
TTTTTTGAGATTTGCTAG
N802-N822
FGPS872
nirK1
CTAAAACTCAAAGGAATTGA
GGMATGGTKCCSTGGCA
N526-N542
nirK5
nirS1
GCCTCGATCAGRARCCAGGTTTCC
CCTAYTGGCCGCCRCART
N1023-N1040
N763-N780
nirS6
CAMPNos661
CGTTGAACTTRCCGGT
CTACTACTACTACGGCTGGGGGCTG
ACCAA
N1638-N1653
CAMPNos1773
nifHEnter-F
CATCATCATCATATRTCGATCARCTG
BTCG TT
ACACCATTATGGAGATGG
N1773-N1803
nifHEnter-R
CTGATGGAGTTCGGCATC
N805-N822
nifHAzo-F
GACTCCACCCGCCTGATCCT
N130-N152
nifHAzo-R
ATGACCGTGATCGAATACGATC
N676-N697
nifHClo-F
GCTATTTAYGGAAARGTTG
N13-N26
nifHClo-R
ATGATGGCAHTRTATGC
N454-N470
AmoA
16S Rrna
Nitrobacte
r
NirK
NirS
Organismo
(número de acceso del
gen en GenBank)
Referencia
Nitrosomonas europea
Rotthauwe et al.,
1997
Nitrobacter
Degrande y
Bardin, 1995
Alcaligenes faecalis
Braker et al., 1998
Pseudomonas stutzeri
Braker et al., 1998
Pseudomonas stutzeri
Scala et al., 1999
N661-N691
NosZ
N167-N184
Klebsiella pneumonie
(43874)
Azotobacter vinelandii
(M11579)
Este trabajo
NifH
nifHRFZ-F
TYGGCAAGTCCACCACC
N41-N57
nifHRFZ-R
nifD-F
TCCGGYGAGATGATGGCGC
CGCGGCTGCGCCTAYGCMGG
N454-N472
nifD-R
GARTGCATCTGRCGGAAMGG
Clostridium
pasteurianum
(AY603957)
Azospirillum brasilense
(M64344)
Este trabajo
NifD
La mezcla de reacción para las amplificaciones fue la siguiente.
Reactivo
Concentración final
DNA
Regulador
Oligonucleótidos
10-100 ng
1X
1 pM
dNTPs
Polimerasa
MgCl2
Agua
0.2 mM
1 unidad
3 mM
Hasta completar 25 μL
Nota: Las cantidades de los reactivos pudieron variar dependiendo del protocolo descrito para cada gen en particular.
Las condiciones de la PCR para los genes nifH fueron las siguientes:
Ciclos
Desnaturalización inicial
Desnaturalización
Hibridación
Polimerización
Extensión final
Temperatura Tiempo
(°C)
seg
94
600
94
60
TMºC
60
72
60
72
600
No. de ciclos
1
35
1
Las temperaturas, los tiempos y el número de ciclos pueden variar dependiendo
del protocolo descrito para la amplificación de cada gen.
III.10 MÉTODOS BASADOS EN EL CULTIVO
III.10.1 CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS HETERÓTROFAS
De 5 a 10 partes del tubo digestivo de D. valens se colocaron en tubos con
PBS y se
maceraron suavemente con perlas de vidrio. Posteriormente, se
hicieron diluciones decimales hasta 10-5 en regulador de fosfatos y se sembraron y
extendieron por duplicado 100 μL de cada dilución en cajas de Petri con medio de
gelosa nutritiva. Las cajas se incubaron a 28ºC
durante 72 h. Los
microorganismos heterótrofos aerobios, cultivables y viables se reportaron en
UFC/tracto digestivo.
III.10.2 OBTENCIÓN DE DNA POR EL MÉTODO DE CULLEN Y HIRSCH
Se cosechó la biomasa de un cultivo de 72 h, el DNA genómico de cada
cepa se obtuvo con una técnica previamente descrita (Cullen y Hirsch, 1988).
III.10.3 ANÁLISIS RAPD COMO PRUEBA TAMIZ PARA SECUENCIACIÓN
Se desarrollaron PCR-RAPD’s (amplificación aleatoria del DNA polimórfico)
para distinguir entre los diferentes aislados de las cepas de bacterias aisladas de
los insectos adultos colectados en el estado de Chihuahua y para dar prioridad a
los esfuerzos de identificación basada en el análisis de la secuencia del gen 16S
rRNA. De este modo se partió del supuesto que las cepas que desplegaron
perfiles de RAPD iguales pertenecen a la misma especie, mientras que perfiles
diferentes pertenecen es altamente improbable que pertenezcan a la misma
especie. Se empleó el iniciador OPB-01 (Williams et al., 1990) y la siguiente
mezcla de reacción.
Reactivo
DNA
Regulador
Iniciador
dNTPs
Polimerasa
MgCl2
Agua
Concentración final
5 ng
1X
0.4 pM
0.2 mM
1U
3 mM
Hasta los 25 μL
Las condiciones generales para efectuar el RAPD fueron las siguientes:
1) Un ciclo de desnaturalización inicial a 94oC durante 5 minutos.
2) 40 ciclos con las siguientes condiciones:
i) Desnaturalización a 94oC durante 1 minuto.
ii) Hibridación a 38oC durante 1 minuto.
iii) Polimerización a 72oC durante 1 minuto.
3) Un ciclo final de
i) Polimerización a 72oC durante 1 minuto.
III.10.4 IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS AISLADAS.
Se realizaron infiriendo las relaciones filogenéticas utilizando la secuencia
del gen 16S rRNA. Se consideraron los criterios de Roselló-Mora que definen los
límites de especie (similitud >97%) y género (similitud entre 95% y <97%)
respectivamente (Rosello-Mora y Amann, 2002).
III.10.5 ENSAYO DE LA ACTIVIDAD CELULOLÍTICA
La capacidad de degradar celulosa fue probada en los microorganismos
aislados pertenecientes al phylum Actinobacteria. Se emplearon cajas de agar
Rojo Congo celulosa y la degradación de la celulosa se observó como un halo
amarillo o anaranjado alrededor de la colonia. La actividad de la enzima se definió
como el diámetro del halo claro dividido entre el diámetro de la colonia. Dos
mediciones de cada colonia fueron tomadas y al menos se les efectuó la medición
a dos colonias de cada microorganismo probado.
III.10.6 REDUCCION DE ACETILENO
Para estimar la fijación de nitrógeno, se llevaron a cabo ensayos de
reducción del acetileno. El acetileno fue producido mediante la disolución de
carburo de calcio en agua empleando una trampa de agua para capturar el
acetileno formado en la reacción. El acetileno fue inyectado en viales (10 mL) a
una concentración del 1% por reemplazo de un volumen idéntico de aire. El
ensayo se realizó en frascos viales que contenían un individuo (larva o adulto),
insectos esterilizados por calor húmedo fueron utilizados como testigos. Los
insectos se mantuvieron en este sistema cerrado durante de 68 h a 25°C. La
reducción de acetileno se midió por cromatografía de gases utilizando un detector
de ionización de flama (Varian 3300 gas chromatograph). Se realizó una ANOVA
de un factor para comprobar estadísticamente si existían diferencias significativas
entre todos los tratamiento formados y posteriormente si hubo diferencias
significativas se realizó la prueba secuencial de Tukey HSD con el programa
estadístico OpenStat4 ver 7 (Miller, 2005).
IV. RESULTADOS.
(NO SE INCORPORARON LAS IMÁGENES POR MOTIVOS DE ESPACIO)
IV.1 ANÁLISIS DE LA DIVERSIDAD BACTERIANA ASOCIADA AL TRACTO
DIGESTIVO DE Dendroctonus valens
IV.1.1 DIVERSIDAD DETECTADA POR MÉTODOS BASADOS EN EL CULTIVO
IV.1.1.1 CULTIVO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE LAS DIFERENTES
REGIONES DEL TRACTO DIGESTIVO DE Dendroctonus valens
La población total de bacterias heterótrofas aerobias cultivables en medio
gelosa nutritiva del tracto digestivo de D. valens fue de 2.11 x 106 UFC/intestino
aproximadamente. El proctodeo es la región que posee el mayor porcentaje (63%)
de la población total de bacterias heterótrofas aerobias, seguido del mesenterón
anterior y posterior (Cuadro 3.).
Cuadro 3. Número de bacterias por sección de tracto digestivo.
Población de Bacterias heterótrofas aerobias (106
UFC/sección)a
Especie
Mesenterón
Mesenterón
Proctodeo
anterior
posterior
Dendroctonus
valens
a
0.41 ± 0.0621
0.34 ± 0.056
1.35 ± 0.067
Los valores son la media de dos cuentas viables en medio gelosa nutritiva ± D. E.
Se aislaron 98 cepas provenientes de las diferentes secciones del tracto
digestivo de individuos de D. valens de las diferentes localidades geográficas.
La mayoría de las cepas fueron bacilos Gram negativos anaerobios
facultativos, también se aislaron algunos microorganismos Gram positivos. Tal es
el caso de las cepas MA1B, MA3A, MA2, PL2 y PL5 cuya identificación basada en
el gen 16S rRNA arrojó la presencia de las especies Janibacter melonis,
Cellulosimicrobium
celulans,
Leifsonia
sp.,
Cellulomonas
xylanilytica
y
Cellulosimicrobium celulans.
IV.1.1.2 Análisis RAPD
La PCR-RAPD con el oligonucleótido OPB-01 produjo 4 patrones de
bandas diferentes en las 22 cepas de bacterias aisladas del tracto digestivo de
insectos adultos de D. valens obtenidos en la localidad de San Juanito Chihuahua
(Fig. 4). La cepa 1.10E resultó ser una levadura por lo que su patrón desplegado
no fue considerado.
Figura 4. Patrones obtenidos por la técnica de RAPD con el oligonucleótido OPB-01 del DNA
genómico de las cepas aisladas del tracto digestivo de insectos adultos de Dendroctonus valens,
de la localidad de San Juanito Chihuahua (M. Marcador de talla molecular).
Este mismo oligonucleótido produjo 8 patrones diferentes en las 17 cepas
de bacterias aisladas del tracto digestivo de larvas de D. valens de la localidad del
CICS, Milpa Alta, Distrito Federal (Fig. 5).
Figura 5. Patrones obtenidos por la técnica de RAPD con el oligonucleótido OPB-01 del DNA
genómico de las cepas aisladas del tracto digestivo de insectos adultos de Dendroctonus valens,
del CICS, Milpa Alta, Distrito Federal (M. Marcador de talla molecular y TN Testigo negativo)
Tomando como molde el DNA de las 33 cepas de la localidad de El Wicle,
Casas Grandes, Chihuahua el oligo desplegó 4 patrones diferentes (Fig. 6). La
cepa P6W no fue considerada para secuenciación por tratarse de un posible
contaminante.
Figura 6. Patrones obtenidos por la técnica de RAPD con el oligonucleótido OPB-01 del DNA
genómico de las cepas aisladas del tracto digestivo de insectos adultos de Dendroctonus valens,
de El Wicle, Casas Grandes, Chihuahua (M. Marcador de talla molecular)
Para los insectos provenientes de la localidad de Los Pozos, Gómez Farias,
Jalisco se procedió a aislar microorganismos en gelosa nutritiva y en el medio
propuesto por Bridges para el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno, así
se obtuvieron un total de 26 cepas las cuales desplegaron 8 patrones diferentes
(Fig. 7).
Figura 7. Patrones obtenidos por la técnica de RAPD con el oligonucleótido OPB-01 del DNA
genómico de las cepas aisladas del tracto digestivo de insectos adultos de Dendroctonus valens,
de los Pozos, Gómez Farías, Jalisco (M. Marcador de talla molecular)
En resumen, todas las cepas consideradas se agruparon de acuerdo al
perfil RAPD desplegado y de ahí se seleccionaron entre 1 y 3 cepas de cada perfil
para su identificación molecular mediante el análisis de la secuencia del gen 16S
rRNA (Cuadro 4).
C
San
Juanito,
I
C Chihuahua
LOCALIDAD
Cuadro 4. Clasificación de las cepas aisladas del tracto digestivo de
Dendroctonus valens de acuerdo a los patrones que desplegaron con la técnica de
PCR-RAPD empleando el oligonucleótido OPB-01.
PATRÓN
CEPAS
1
3J, 12EF, 8EF, 11J, 8J, 10EF, 1.7E, 6EF, 7EF, 13EF,
1.4E y 17EF
2
5EF y 1EF
3
15EF y 5EFB
4
2EF
I
1L
El Wicle, Casas
Grandes,
Chihuahua.
Los Pozos, Gómez
Farías, Jalisco.
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
A
B
C
D
2LA, 6L, 7L, 17LA, 17LB y 3L
2LB
3LA, 12L y 19LB
8L
4L y 9L
16L y 5L
19LA
1WB
2WA, 2WC, 4WD, 4WB, 6WD, 8WB y 8WA
3WB, 3WD, 9WA, 9WB, 10WA y 10WC
5WA, 5WB, 7WB, 7WD, 11WA, 11WD, 12WA, 12WB,
13WD, 13WC, 14WC, 14WD, P1W, P2W, P3W, P5W,
P7W y P8W
a
b
c
d
e
f
MA1B, MA1A, PL3B Y PL3A
MA2, MA4, PL1
MA3A
MA3B, MA1Bfx, PL4, MP3A Y MP3B
MP1
MP3AB, PL5, MA1Afx, MPABfx, P1Afx, P1Bfx, P2fx,
P3Afx y P3Bfx
PL2
MP1Afx y MP2fx
g
h
5.1.1.3 AMPLIFICACIÓN DEL GEN 16S rRNA.
El gen 16S rRNA se amplificó a partir del DNA genómico de las cepas
aisladas del tracto digestivo de insectos adultos de D. valens que desplegaron
patrones de RAPD diferentes, los fragmentos del tamaño esperado (1,500 pb
aproximadamente) se muestran en la Fig. 8.
Figura 8. Amplificación del 16S rRNA de las cepas aisladas del tracto digestivo de Dendroctonus
valens. (M. Marcador de talla molecular)
IV.1.1.4 ANÁLISIS FILOGENÉTICO
El cultivo de bacterias heterótrofas aerobias hemos mostró 11 géneros
bacterianos asociados al tracto digestivo de larvas y adultos de D. valens. El
análisis de las secuencias del gen 16S rRNA de estos microorganismos indicó que
el 54.5% correspondieron a géneros del phylum γ-Proteobacteria y el 45.5% al
phylum Actinobacteria (Cuadro 5).
El tamaño de las secuencias de cepas representativas de los diferentes
patrones de RAPD varió entre 1268 y 1449 nucleótidos y el alineamiento final
consto de 1521 nucleótidos, los gaps no fueron considerados en el análisis. La
topología de estas secuencias y las obtenidas del GenBank se muestra en la
figura 9.
Cuadro 5. Aislados bacterianos obtenidos del tracto digestivo de Dendroctonus
valens identificados mediante el análisis de la secuencia del 16S rRNA.
Porcentaje
Organismo conocido más cercano
de
Aislado
Phylum
(No. de acceso)
similitud
(%)
13EF
17EF
3J
6J
7J
9J
2LB
2WA
3WB
1EF
2EF
15EF
19LA
2LA
3LA
1WB
5WA
11WA
P7W
16L
1L
MP1Afx
97.9
98
98
97.8
98
97.8
98.1
98
97.7
99.2
99.7
99.7
99.2
99.8
99.7
98.8
98.6
98.9
98.8
99.4
96
97
γ-Proteobacteria
Rahnella aquatilis (U90757)
Serratia liquefaciens (AJ306725)
Serratia proteamaculans (AY040208)
Enterobacter aerogenes (AJ251468)
Pantoea cedenensis (AF130971)
Erwinia mallotivora (AJ233414)
MP1
8L
MA3B
4L
MA2
MA1B
PL5
MA3A
PL2
96.9
98.8
97.8
99.4
98.8
99.6
98.5
98.6
99.2
Acinetobacter lwoffii (DQ328322)
Acinetobacter haemolyticus (AM184255)
Stenotrophomonas maltophilia (DQ424872)
Leifsonia shinshuensis (DQ232614)
Janibacter melonis (AY522568)
Cellulosimicrobium cellulans (AY665978)
Actinobacteria
Cellulomonas xylanilytica (AY303668)
Figura 9. Relaciones filogenéticas de las secuencias del gen 16S rRNA de las cepas aisladas del
tracto digestivo de Dendroctonus valens. El árbol se construyó a partir de un alineamiento múltiple
de secuencias de 1521 nucleótidos de γ-proteobacterias y actinobacterias empleando el modelo de
Jukes-Cantor y el método de agrupamiento de Neighbor-joining.
En el Cuadro 5 se muestra la asignación de las clonas a nivel de especie y
la ubicación en los correspondientes Phyla bacterianos. De este modo se
identificaron nueve especies de γ-proteobacterias y 4 de actinobacterias. Por otra
parte, en el Cuadro 6 se correlacionan los patrones desplegados por las cepas
mediante la técnica de RAPD-PCR y su afiliación taxonómica de las cepas
representativas de cada patrón de RAPD.
En la topología las cepas 2WA, 3WB, 2LB, 3J, 7J, 6J, 9J, 13EF, y 17EF se
asociaron con secuencias de microorganismos asociados a cepas de Rahnella
aquatilis aisladas del tracto digestivo de larvas y adultos de Dendroctonus frontalis
(Vasanthakumar et al., 2006).
Las cepas 1EF, 2EF, 15EF, 2LA, 3LA, y 19LA se asociaron con especies
del género Serratia; las cepas 1WB, 5WA, 11WA y
P7W se agruparon con
Enterobacter aerogenes, la cepa 16L se agrupa con Pantoea cedenensis y las
cepas MP1Afx, MP1 y 1L se agruparon con secuencias de cepas obtenidas de D.
frontalis (Vasanthakumar et al., 2006), todas ellas se agruparon con la secuencia
de una Erwinia mallotivora.
La cepa 4L se agrupó con Stenotrophomonas maltophilia, la cual ha sido
reportada como un organismos capaz de fijar nitrógeno (Park et al., 2005), la cepa
MA3B se agrupó con Acinetobacter haemolyticus y la cepa 8L con Acinetobacter
lwoffii.
Las cepas MA1B y MA2 se asociaron con Janibacter melonis y Leifsonia
shinshuensis respectivamente; las cepas MA3A y PL5 se asociaron con
Cellulomicrobium cellulans y la cepa PL2 con Cellulomonas xylanilytica.
Los porcentajes de similitud de las secuencias obtenidas con aquellas de
microorganismos reportadas en el banco de genes se muestran en el cuadro 5.
Las cepas 2LB, 3J, 9J, 13EF, 7J, 6J y 17EF tienen una similitud del 97.7-98.1%
con la secuencia de Rahnella aquatilis (U90757), las cepas 1EF, 2EF, 15EF y
19LA tuvieron una similitud de 99.2-99.7% con la secuencia de Serratia
liquefaciens (AJ306725). Mientras que las secuencias 2LA y 3LA tuvieron una
similitud del 99.8 y 99.7% con la secuencia de Serratia proteamaculans
(AY040208); no obstante todas ellas también tuvieron porcentajes de similitud muy
altos con otras cepas del genero Serratia (Datos no mostrados). Las cepas1WB,
5WA, 11WA y P7W presentaron una similitud del 98.6-98.9% con la secuencia de
Enterobacter aerogenes (AJ251468), la cepa 16L del 99.4% con la secuencia de
Pantoea cedenensis (AF130971) y las cepas 1L, MP1Afx y MP1 presentaron una
similitud del 96-97% con la secuencia de Erwinia mallotivora (AJ233414). La cepa
8L se asoció con un 98.8 con Acinetobacter lwoffii (DQ328322), la cepa MA3B
presentó una similitud del 97.8% con Acinetobacter haemolyticus (AM184255) y la
cepa 4L posee un similitud del 99.4% con Stenotrophomonas maltophilia
(DQ424872). Todos estos organismos pertenecen al phylum γ-Proteobacteria.
En éste mismo cuadro podemos observar que la cepa MA2 tuvo una
similitud del 98.8% con Leifsonia shinshuensis (DQ232614), la cepa MA1B del
99.6% con Janibacter melonis (AY522568), la cepa PL5 tuvo un 98.5% de similitud
con Cellulosimicrobium cellulans (AY665978) y la cepa MA3A y PL2 del 98.699.2% con Cellulomonas xylanilytica (AY303668). Todos estos microorganismos
pertenecen al phylum Actinobacteria.
Cuadro 6. Afiliación filogenética de las secuencias de los genes 16S rRNA de las cepas aisladas
del tracto digestivo de D. valens.
Localidad
San Juanito,
Chihuahua
o
27 55’22’’ N
107º55’47’’ O
CICS, Milpa
Alta, Distrito
Federal
19º 04’ N
98º 58’ O
El Wicle, Casas
Grandes,
Chihuahua
30º09’76’’ N
108 º 57’03’’ O
Los Pozos,
Gómez Farías,
Jalisco
19º88’20’’ N
103º40’40’’ O
Estadio
del
Insecto
colectado
Patrón
desplegado
de PCRRAPD
Aislado
representativo
Adultos
1
3J, 13EF, 17EF
2
1EF
3
15EF
4
2EF
I
1L
II
2LA
III
2LB
IV
3LA
V
8L
VI
4L
VII
16L
VIII
19LA
A
1WB
B
2WA
C
3WB
D
a
5WA, 11WA,
P7W
MA1B
b
MA2
c
MA3A
d
MA3B
e
MP1
f
PL5
g
PL2
h
MP1AFx
Larvas
Adultos
Adultos
Relación filogenética
Especie más cercana
reportada en GenBank
(No. de acceso)
Rahnella aquatilis
(U90757)
Serratia liquefaciens
(AJ306725)
Serratia liquefaciens
(AJ306725)
Serratia liquefaciens
(AJ306725)
Erwinia mallotivora
(AJ233414)
Serratia proteamaculans
(AY040208)
Rahnella aquatilis
(U90757)
Serratia proteamaculans
(AY040208)
Acinetobacter lwoffii
(DQ328322)
Stenotrophomonas
maltophilia
(DQ424872)
Pantoea cedenensis
(AF130971)
Serratia liquefaciens
(AJ306725)
Enterobacter aerogenes
(AJ251468)
Rahnella aquatilis
(U90757)
Rahnella aquatilis
(U90757)
Enterobacter aerogenes
(AJ251468)
Janibacter melonis
(AY522568)
Leifsonia shinshuensis
(DQ232614)
Cellulomonas xylanilytica
(AY303668)
Acinetobacter
haemolyticus (AM184255)
Erwinia mallotivora
(AJ233414)
Cellulosimicrobium
cellulans
(AY665978)
Cellulomonas xylanilytica
(AY303668)
Erwinia mallotivora
(AJ233414)
Similitud
(%)
Grupo microbiano de
afiliación
98, 97.9,
98
99.2
Rahnella aquatilis
Serratia liquefaciens
99.7
Serratia liquefaciens
99.7
Serratia liquefaciens
96
Erwinia sp. o Pantoea
sp.
Serratia
proteamaculans
Rahnella aquatilis
99.8
98.1
99.7
99.8
Serratia
proteamaculans
Acinetobacter lwoffii
99.4
Stenotrophomonas
maltophilia
99.4
Pantoea cedenensis
99.2
Serratia liquefaciens
98.8
98
Enterobacter
aerogenes
Rahnella aquatilis
97.7
Rahnella aquatilis
98.6, 98.9,
98.8
99.6
Enterobacter
aerogenes
Janibacter melonis
98.8
Leifsonia shinshuensis
98.6
Cellulomonas
xylanilytica
Acinetobacter
haemolyticus
Erwinia sp. o Pantoea
sp.
Cellulosimicrobium
cellulans
97.8
96.9
98.5
99.2
97
Cellulomonas
xylanilytica
Erwinia mallotivora
IV.1.1.5 ACTIVIDAD CELULOLÍTICA
Al observar que algunos de las cepas aisladas se identificaron como
Cellulomonas xylanilytica y Cellulosimicrobium cellulans, especies en las que se
ha reportado la capacidad de degradar la celulosa (Schumann, 2001; Rivas 2004),
se decidió hacer un ensayo para evaluar la actividad celulolítica de las cepas del
phylum Actinobacteria empleando agar rojo congo celulosa (Cuadro 7 y Fig. 10).
La población de bacterias celulolíticas aerobias asociadas al tracto digestivo de D.
valens fue de 9 x 102 ± 2.1 x 102 UFC/tracto digestivo.
Cuadro 7. Actividad celulolítica de las cepas pertenecientes al phylum
Actinobacteria asociadas al canal alimentario de Dendroctonus valens.
Insecto de
Clave del
Grupo microbiano de
Actividad
procedencia
aislado
afiliación
enzimáticaa
PL2
Cellulomonas xylanilytica
2.7
Cellulosimicrobium
PL5
2.9
Dendroctonus
cellulans
valens
MA1B
Janibacter melonis
3
(Adulto)
MA2
Leifsonia shinshuensis
3.1
MA3A
a
Cellulomonas xylanilytica
2.4
La actividad enzimática se definió como el diámetro del halo claro dividido entre el diámetro de la colonia.
Figura 10 Actividad celulolítica de algunas de las cepas aisladas en agar rojo congo. A. MA1B Janibacter melonis, B. PL2
Cellulomonas xylanilytica, C. PL5 Cellulosimicrobium cellulans.
La capacidad de algunas de las cepas de degradar la celulosa es una
evidencia indirecta de la posible participación de los microorganismos asociados al
canal alimentario de D. valens en la digestión de la celulosa.
IV.1.1.6 REDUCCIÓN DE ACETILENO EN LOS INSECTOS
La reducción de acetileno fue detectada en larvas e insectos adultos vivos
(15.96 ± 2.22; 12.59 ± 3.39 nmol de etileno/h/insecto; promedio ± ES), mientras
que en larvas e insectos adultos muertos y esterilizados, y en el testigo sin
insectos no se encontró actividad (1.12 ± 0.47; 0.34 ± 0.22; 0 ± 0 nmol de
etileno/h/insecto; promedio ± ES) (ANOVA de un factor: F= 15.09; P < 0.05). Estos
resultados indican que la fijación de nitrógeno ocurre in vivo en D. valens (Fig. 11)
y nos permite deducir que algún miembro de la comunidad procariótica asociada al
insecto realizó esta actividad, dado que es conocido que ninguna célula u
organismo eucariote tiene la capacidad para fijar nitrógeno molecular.
Figura. 11 Actividad de la nitrogenasa in vivo en larvas y adultos de D. valens. (LV, Larvas vivas;
AV, Adultos vivos; LM, Larvas muertas esterilizadas; AM, Adultos muertos esterilizados; T, Testigos
con papel.) (Las barras representan el error estándar).
Al efectuar la prueba de Tukey HSD encontramos que no existen
diferencias significativas entre la cantidad de etileno producido por las larvas y los
adultos (q= 1.645; P > 0.05) y si se encuentra una diferencia significativa entre los
experimentos efectuados con individuos vivos y los realizados con individuos
muertos y esterilizados, como ya se mencionó anteriormente (L.V.-L.M.: q=7.251;
A.V.-A.M.: q=5.99; P < 0.05; nomenclatura como en la figura 11).
IV.1.2 DIVERSIDAD DETECTADA POR MÉTODOS MOLECULARES
IV.1.2.1 ANÁLISIS RFLP DE LAS CLONAS POSITIVAS
Para evitar la secuenciación excesiva de las clonas de la librería de genes
ribosomales de las diferentes partes del tracto digestivo de hembras de D. valens
se efectuó una prueba de polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción
(RFLP) empleando la enzima HpaII (Moyer et al.,1996). Un total de 12 patrones
diferentes fueron observados. El mesenterón anterior y el proctodeo desplegaron
10 y 6 patrones diferentes respectivamente (Fig. 12 y Fig. 13). Ambas regiones
anatómicas del canal alimentario compartieron 4 patrones RFLP.
Figura 12. Perfiles de restricción de la enzima HpaII de las clonas de la librería de genes
ribosomales del mesenterón anterior de hembras de D. valens. Cada color representa un patrón
diferente. Los patrones que son iguales en este despliegue, pero que muestran un color diferente,
fueron distinguidos a partir de su patrón desplegado con EcoRI.
Figura 13. Perfiles de restricción de la enzima HpaII de las clonas de la librería de genes
ribosomales del proctodeo de hembras de D. valens. Cada color representa un patrón diferente.
Los patrones que son iguales en este despliegue, pero que muestran un color diferente, fueron
distinguidos a partir de su patrón desplegado con EcoRI.
IV.1.2.2 ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS DE LAS CLONAS DE LAS
LIBRERIAS DE GENES RIBOSOMALES.
Mediante la construcción de librerías de genes ribosomales logramos
asociar cuatro géneros bacterianos al mesenterón anterior y proctodeo de
hembras adultas de D. valens y ambas librerías se analizaron conjuntamente. El
análisis de las secuencias con el programa CHIMERA-CHECK permitió reconocer
que varias clonas correspondían a quimeras, posiblemente formadas durante la
amplificación de los genes ribosomales a partir del DNA metagenómico. En el
resto de las secuencias (n=9) se identificaron hasta especie miembros de los
géneros Rahnella, Erwinia o Pantoea, Lactococcus y Acinetobacter (Fig. 14).
Figura 14. Relaciones filogenéticas de las secuencias del gen 16S rRNA de las clonas obtenidas
de las librerías de genes ribosomales del DNA metagenómico del tracto digestivo de Dendroctonus
valens. El árbol se construyó a partir de un alineamiento de 1593 bases de secuencias de γproteobacterias y firmicutes empleando el modelo de sustitución de Kimura 2 Parámetros y el
método de agrupamiento de Neighbor-joining.
En el Cuadro 8 se correlacionan los patrones desplegados por las clonas
mediante la técnica de RFLP y su afiliación taxonómica obtenida a partir de la
secuenciación del gen 16S rRNA.
Cuadro 8. Afiliación filogenética de las secuencias de los genes 16S rRNA de las clonas obtenidas
a partir de las librerías de genes ribosomales del DNA metagenómico del tracto digestivo de D.
valens.
Localidad
Estadio
del
Insecto
colectado
Patrón
desplegado
por RFLP
(número de
clonas)
Relación filogenética
Clona
representativa
Especie más cercana
reportada en GenBank
(No. de acceso)
Similitud
(%)
Grupo microbiano de
afiliación
El Wicle, Casas
Grandes,
Chihuahua
30º09’76’’ N
108 º 57’03’’ O
Adultos
(Hembras)
A
(8)
B
(7)
C
(1)
D
(1)
E
(8)
F
(4)
MAF16
PF1
PF4
99.5
99.5
99.5
Lactococcus lactis
99.1
----
Acinetobacter
schindleri
----
Rahnella aquatilis
(U90757)
Rahnella aquatilis
(U90757)
Pantoea dispersa
(AB273743)
Quimera
96.8
Rahnella sp.
97.7
Rahnella aquatilis
----
Pantoea dispersa
----
97.5
Rahnella aquatilis
97.8
Rahnella aquatilis
MAF26
Rahnella aquatilis
(U90757)
Rahnella aquatilis
(U90757)
Quimera
----
----
MAF34
Quimera
----
----
MAF35
Quimera
----
----
PF23
MAF20
MAF2
MAF7
PF20
G
(9)
H
(3)
I
(1)
J
(1)
K
(1)
L
(1)
PF22
MAF4
MAF15
Lactococcus lactis
(EU104368)
Lactococcus lactis
(EU104368)
Acinetobacter schindleri
(AJ275041)
Quimera
Lactococcus lactis
97.6
IV.1.2.3 ANÁLISIS DE RAREFACCIÓN E ÍNDICES DE DIVERSIDAD
Las curvas de rarefacción de las librerias construidas a partir de DNA
metagenómico del canal alimentario de hembras adultas de D. indican que existe
una comunidad bacteriana relativamente simple, es decir con una riqueza de
especies baja (Fig. 15, 16 y 17). Aunque no se obtuvo una forma asintótica en la
curva de rarefracción de la librería de genes ribosomales a nivel de especie, es
decir con un máximo de 3% de disimilitud, la gráfica adquiere una tendencia
asintótica cuando analizamos las secuencias a nivel de género y phylum, lo que
implica considerar las secuencias con una diferencia no mayor al 5% y 20%
respectivamente (Fig. 16 y 17). Esto sugiere que logramos reconocer la mayoría
de los géneros y phyla asociados al tracto digestivo de este insecto.
Figura 15. Análisis de rarefacción de la librería del gen 16S rRNA construida a partir del DNA del
tracto digestivo de 3 individuos hembra adultos de D. valens. La curva de rarefacción se construyó
con base a análisis hecho en DOTUR empleando el algoritmo de asignación del vecino más lejano.
La curva de rarefacción representa a las secuencias con una similitud del 97% entre ellas, lo cual
corresponde al nivel taxonómico de especie.
Figura 16. Análisis de rarefacción de la librería del gen 16S rRNA construida a partir del DNA del
tracto digestivo de 3 individuos hembra adultos de Dendroctonus valens. La curva de rarefacción
se construyó con base en un análisis hecho en DOTUR empleando el algoritmo de asignación del
vecino más lejano. La curva de rarefacción representa a las secuencias con una similitud del 95%
entre ellas, lo cual corresponde al nivel taxonómico de género.
Figura 17. Análisis de rarefacción de la librería del gen 16S rRNA construida a partir del DNA del
tracto digestivo de 3 individuos hembra adultos de D. valens. La curva de rarefacción se construyó
con base a análisis hecho en DOTUR empleando el algoritmo de asignación del vecino más lejano.
La curva de rarefacción representa a las secuencias con una similitud del 80% entre ellas, lo cual
corresponde al nivel taxonómico de phylum.
Para determinar si se había analizado un número suficiente de secuencias
de la librería de genes ribosomales construida se calculó el estimador no
paramétrico de la riqueza de especies Chao 1. La curva de colector para el
estimador Chao 1 con una diferencia del 3% entre las secuencias muestra una
línea asintótica, lo cual indica que la mayoría de las especies ya han sido
analizadas (Datos no mostrados). La riqueza de Chao1 terminal estimada para la
librería ribosomal analizada fue de 5 OTUs, en la cual una OTU fue definida como
un grupo de secuencias que no difieren más del 3% entre ellas, es decir a nivel
de especie.
IV.1.2.4 PCR-DGGE DE LA REGIÓN V3 DE GENES RIBOSOMALES
El número mayor de bandas (n=12) fue desplegado en el mesenterón
anterior y el proctodeo de hembras adultas de D. valens. En el caso de los machos
las regiones que desarrollaron el mayor número de bandas fue el mesenterón
anterior y el proctodeo con 8 bandas cada uno. Si consideramos a cada una de las
bandas desplegadas en el DGGE como una especie diferente de microorganismo
podemos asumir que la comunidad bacteriana asociada a las diferentes partes del
tracto digestivo es relativamente simple (12 especies) y que mantiene cierta
homogeneidad a lo largo del canal alimentario (6 especies en común),
presentándose la mayor diversidad en el proctodeo (Fig. 18).
En total se comparten 6 bandas en todas las regiones del canal alimentario
tanto de hembras como de machos y solamente la banda No. 9 es exclusiva del
tracto digestivo de los machos (Fig. 18).
Durante las repeticiones del DGGE se observó que en la mayoría de los
geles la región que constantemente mostraba el mayor número de bandas era el
proctodeo tanto en las hembras como en los machos (Datos no mostrados).
También se observó que algunas bandas aparecían esporádicamente y existían
pequeñas variaciones en el patrón desplegado por las diferentes secciones del
canal alimentario tanto de hembras como de machos, lo que posiblemente indica
que la estructura poblacional que albergan estos insectos puede cambiar durante
el transcurso del tiempo o que hay un cierto grado de variación en la comunidad
de especies bacterianas en este hábitat (Datos no mostrados).
Al comparar los patrones desplegados por los amplificados de la región 3V
del 16S rDNA de las diferentes secciones del tracto digestivo y algunas de las
cepas aisladas podemos observar que la banda No. 5 puede corresponder a
Rahnella aquatilis y la banda No. 6 a Enterobacter aerogenes, dado que estas
bandas comigraron a la misma altura en ambos casos (Fig. 19).
Las banda No. 5 es muy evidente en el proctodeo de machos, lo cual nos indica
que la población de E. aerogenes es una de la más abundantes en esta sección.
Por otro lado, la banda No. 6 se presenta con gran intensidad en todas las
secciones del canal alimentario de hembras y machos. Lo anterior nos indica que
R. aquatilis es una bacteria que se encuentra ampliamente distribuida en el tracto
digestivo de este insecto.
Figura 18. PCR-DGGE de la región 3 variable de los genes 16S rRNA obtenidos a partir del DNA
metagenómico de las diferentes partes del tracto digestivo de individuos colectados en el campo de
D. valens. Los productos fueron separados por electroforesis en un gradiente de urea formamida
del 30 al 60%.
Figura 19. PCR-DGGE de la región 3 variable de los genes 16S rRNA obtenidos a partir del DNA
metagenómico de las diferentes partes del tracto digestivo de individuos de D. valens y algunas
cepas aisladas. Los productos fueron corridos en un gradiente urea formamida (30-60%). La flecha
No. 5 representa a una de las bandas que despliega Rahnella aquatilis y la flecha No. 6 representa
a una de las bandas que despliega Enterobacter aerogenes, estos dos organismos fueron aislados
e identificados mediante la secuenciación del gen 16S rRNA.
IV.1.2.5 DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS PARA AMPLIFICAR EL GEN nifH.
Debido a la falta de resultados positivos al tratar de amplificar el gen nifH
con los oligonucleótidos originalmente propuestos para efectuar éste trabajo, se
diseñaron nuevos. Los iniciadores se diseñaron a partir del alineamiento de
secuencias completas del gen nifH obtenidas del banco de genes de la NCBI, la
secuencia de los oligonucleótidos propuestos, la temperatura de alineamiento, el
tamaño del amplificado esperado y al grupo de microorganismos a los cuales van
dirigidos se resumen en el cuadro No. 9. Ahora que se tienen identificadas las
bacterias que posiblemente fijen nitrógeno se diseñaran oligos específicos para
amplificar el gen nif H con base a las secuencias de este gen ya reportadas en la
literatura.
Cuadro 9. Oligonucleótidos diseñados para la amplificación del gen nifH
Grupo
microbiano
Oligonucleótidos
Secuencia (5´- 3´)
Tm
(oC)
Enterobacterias
Fentero
Rentero
Fazoto
Razoto
Fclos
Rclos
FFRA
RFRA
ACACCATTATGGAGATGG
GATGCCGAACTCCATCAG
GACTCCACCCGCCTGATCCT
GATCGTATTCGATCACGGTCAT
GCTATTTAYGGAAARGTTG
GCATAYADTGCCATCATT
TYGGCAAGTCCACCACC
GCGCCATCATCTCRCCGGA
54
Tamaño
esperado
(pb)
650
65
550
51
450
55
400
Azotobacter spp.
Clostridium spp.
FrankiaRhizobiumAzospirillum
5.1.2.6 AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES IMPORTANTE EN EL CICLO DEL
NITRÓGENO
Hasta el momento sólo hemos logrado amplificar el gen nifH de
enterobacterias en el mesenterón anterior del macho (Fig 20.) y el gen nifD en
todas las partes del tubo digestivo de hembras (Fig. 21). La presencia de estos
genes, el aislamiento de bacterias capaces de reducir el acetileno y la reducción
de acetileno que llevaron a cabo larvas y adultos de D. valens in vivo son
evidencias de que existen poblaciones de microorganismos asociados al tracto
digestivo del descortezador que son capaces de fijar nitrógeno y estarían
participando activamente en el suplemento de la dieta de este insecto con
compuestos nitrogenados asimilables.
Figura 20. Amplificación del gen nifH de enterobacterias a partir del DNA metagenómico de las
diferentes partes del canal alimentario de D. valens.
Figura 21. Amplificación del gen nifD a partir del DNA metagenómico de las diferentes partes del
canal alimentario de D. valens.
Otros genes bacterianos asociados al ciclo del nitrógeno (amonio
monooxigenasa (amoA), nitrito reductasa dependiente de cobre (nirK) y citocromo
cd1 (nirS), óxido nítrico reductasa (nosZ) y los genes 16S rRNA del género
Nitrobacter) no han sido amplificado, a pesar de que se han ensayado diferentes
condiciones de amplificación por PCR (Datos no mostrados).
DISCUSION
Los insectos son unas de las formas de vida más exitosas sobre el planeta.
Uno de los factores más importantes del éxito de los insectos es que se han
adaptado a una amplia variedad de dietas. La flexibilidad de los hábitos
alimentarios de los insectos está asociada, de manera muy significativa, a la
contribución que llevan a cabo los microorganismos del intestino. Por otro lado,
poco se sabe acerca de la diversidad, fisiología y ecología de los microorganismos
asociados al tracto digestivo de los escarabajos que se desarrollan dentro de la
madera y la corteza de los árboles (Brand et al., 1975; Bridges, 1981; Bridges et
al., 1984; Delalibera et al., 2005; Moore 1972a, b; Vasanthakumar et al., 2006).
Por lo que el presente trabajo pretende contribuir al conocimiento de la diversidad
de bacterias y genes bacterianos relevantes asociados al tracto digestivo de D.
valens. Para lograr entender las posibles contribuciones que tienen los
microorganismos del intestino en la digestión y nutrición de su huésped es
necesario identificarlos y asociarlos a un nicho ecológico. Este es el primer trabajo
que estudia la microbiota asociada al canal alimentario de D. valens empleando
métodos basados en el cultivo y métodos independientes del cultivo.
El tracto digestivo de D. valens está constituido por las regiones estomodeo,
mesenterón y proctodeo que poseen estructuras tisulares bien diferenciadas y las
cuales están separadas por dos estrechamientos parecidos a una válvula (Díaz et
al., 1998). En este trabajo, inicialmente se encontró que el número de bacterias
cultivables asociadas al proctodeo es un orden de magnitud mayor al observado
en las otras dos secciones del mesenterón (Cuadro 3). Este resultado coincide con
otros trabajos realizados con otros artrópodos como termitas, cucarachas y grillos,
en los cuales se ha determinado que el proctodeo alberga un mayor número de
bacterias cultivables que otras partes del tracto digestivo (Breznak, 1982; Cruden
y Markovetz, 1984; Ulrich et al., 1981). La misma conclusión fue alcanzada
empleando técnicas basadas en la microscopía de fluorescencia donde se
determinó que el número de bacterias que residen en el proctodeo de las
cucarachas
Periplaneta
americana,
Periplaneta
australasia,
Pynoscelus
surinamensis, Blaberus fuscus y Gromphadorhina portentosa era diez veces
mayor al número encontrado en el estomodeo y mesenterón. En este mismo
trabajo se reportó que los proctodeos del miliápodo (Chicobulus sp), del grillo
(Acheata domestica) y del escarabajo (Pachnoda marginata) presentan un mayor
número de bacterias (Cazemier et al., 1997). El elevado número de bacterias
asociadas al proctodeo de D. valens sugiere, que esta parte del tubo alimentario
juega un papel muy importante en el proceso digestivo de este insecto.
Los resultados reportados en este trabajo demuestran que el mesenterón y
proctodeo de D. valens albergan una comunidad bacteriana poco diversa. Los
métodos basados en el cultivo y los independientes de éste permitieron reconocer
e identificar tan sólo 17 especies bacterianas (Cuadros 6 y 8) pertenecientes a los
grupos de γ-Proteobacteria, Actinobacteria y Firmicutes (Fig. 9 y 14). Esta
aparente baja diversidad observada se hace evidente cuando la comparamos con
la diversidad bacteriana observada en los intestinos de las termitas, los cuales
albergan 50 filotipos (Okhuma et al., 1996). En trabajos realizados en otros
coleópteros (Pachnoda ephippiata y Melolontha melolonta) se reportó que la
comunidad microbiana asociada a sus tractos digestivos pertenece a los
Firmicutes (Lactobacillales, Clostridiales y Bacillales), Actinobacteria,
γ−, β− y
δ−Proteobacteria, Bacteroidetes, y Actinobacteria (Egert et al., 2003 y 2005). Los
trabajos antes mencionados poseen un número amplio de microorganismos
identificados, lo cual contrasta con nuestros resultados y pone en evidencia la
escasa diversidad de microorganismos que se encuentran alojados en el canal
alimentario de D. valens. El único trabajo previo que explora la diversidad
microbiana en el tracto digestivo de una especie del género Dendroctonus, es el
de D. frontalis, en donde los microorganismos se afiliaron a los grupos α,
γ−Proteobacteria y Firmicutes (Vasanthakumar et al., 2006), lo cual concuerda con
los resultados que se obtuvieron en este trabajo.
Particularmente, no hemos encontrado microorganismos anaerobios
estrictos (Clostridiales y Bacteroidetes) que comúnmente se encuentran asociados
al canal alimentario de otros insectos (Egert et al. 2005; Moran et al., 2005;
Ohkuma et al., 1996), esto posiblemente es debido a que en el tracto digestivo de
D. valens no se alcanzan niveles de potencial de óxido-reducción suficientemente
bajos como los que se observan en los intestinos de termitas y otros insectos.
Entre las bacterias cultivables que se identificaron en este trabajo se
encuentran Rahnella aquatilis, Enterobacter aerogenes, Stenotrophomonas
maltophilia, Pantoea sp., Acinetobacter sp. y Serratia sp. Estos microorganismos
también se han detectado en D. frontalis. Sin embargo, en D. valens no se logró
documentar la presencia de bacterias como Pseudomonas fluorescens, Bacillus
sp.,
Microccocus
sp.,
Mycoplasma
sp.,
Rhodobacter
sp,
Leuconostoc
mesenteroides, Enterococcus sp. y Lactobacillus sp. (Bridges et al., 1984; Moore,
1972a, b; Vasanthakumar et al., 2006). Algunas de estas variaciones pueden ser
debidas a la diferente ecología y hábitos que tienen ambas especies ó a las
estrategias para el aislamiento de bacterias practicadas en cada uno de los
trabajos.
Muchos de los géneros bacterianos asociados al canal alimentario de D.
valens se han aislado de los intestinos de otros invertebrados. El género Rahnella
ha sido frecuentemente aislado del tracto digestivo de larvas y adultos de D.
valens y D. frontalis (Vasanthakumar et al., 2006). En particular, Rahnella aquatilis
o alguna de sus genomoespecies se han aislado del tracto digestivo del
escarabajo xilófago, Saperda vestita y del intestino de caracoles, babosas y
lombrices de tierra (Delalibera et al., 2005; Muller et al.; 1995a, b). Asimismo, este
género se ha identificado como un endófito de coníferas y se le ha reportado
como una endobacteria de ectomicorrízas (Cankar et al., 2005; Izumi et al., 2006),
lo cual sugiere que esta bacteria puede estar siendo ingerida constantemente por
el insecto al alimentarse del floema de su huésped. Investigaciones futuras podrán
revelar si las cepas de Rahnella en el tracto digestivo de Dendroctonus spp, son
las mismas que las que se encuentran en el floema de las coníferas o si se trata
de poblaciones o ecotipos independientes. Asimismo, será muy interesante
averiguar si estas bacterias, que tienen la capacidad potencial de fijar nitrógeno,
están activas reproductiva y metabólicamente y si llevan a cabo la fijación de
nitrógeno en el tracto digestivo del insecto. Para estos propósitos convendría
averiguar si los miembros de este género aparecen en una librería de cDNA de
genes ribosomales construida a partir de rRNA y estimar la expresión de alguno
de los genes de la nitrogenasa a partir del contenido del tracto digestivo de
miembros de Dendroctonus.
Otro género aislado frecuentemente en este trabajo fue Serratia. Las
secuencias generadas a partir de nuestros aislados se asociaron principalmente
con Serratia liquefaciens y Serratia proteomaculans, pero mantuvieron una alta
similitud con otras especies de Serratia. Esto obliga a realizar una caracterización
fenotípica que complemente la identificación molecular ensayada hasta este
momento (Holt et al., 1994). Miembros del género Serratia son comúnmente
aislados del canal alimentario de otros insectos (Brand et al., 1975; Broderick et
al., 2004; Lundgren et al., 2007). Serratia marcescens, Serratia entomophila,
Serratia proteamaculans se han descrito como entomopatógenos facultativos
(Hurts et al., 2007; Steinhaus, 1956). Asimismo, Serratia se reportó como un
patógeno de D. frontalis (Moore, 1972a). El constante aislamiento de estas
bacterias a partir de individuos aparentemente sanos y colectados en el campo de
D. valens, sugiere que estos microorganismos forman parte de la microbiota
normal del insecto y mantienen un balance con otras poblaciones bacterianas que
impiden el desarrollo de su potencial patogénico, como sucede con otras bacterias
entomopatógenas (Harada e Ishikawa, 1997).
En adultos y larvas del modelo de estudio de este trabajo se aislaron
microorganismos que se asociaron al grupo Erwinia/Pantoea. El género Erwinia se
ha asociado a diversos insectos como arañuelas, áfidos, escarabajos pepino y la
mosca del olivo (Capuzzo et al., 2005; de Vries et al., 2004; Ferrari et al., 2007;
Harada e Ishikawa, 1997). En algunos casos, las especies de este grupo actúan
como entomopatógenos (Grenier et al., 2006; Harada e Ishikawa, 1997) y en otros
aceleran el proceso de desarrollo y aumentan el número de huevos que ponen los
insectos (de Vries et al., 2004). El género Pantoea también se ha encontrado en
varios insectos como las arañuelas, mosquitos, áfidos, moscas y escarabajos
(Delalibera et al., 2005; Mramba et al., 2006; Straif, et al., 1998; Vorwerk et al.,
2007; Wells et al., 2002). En particular en el género Dendroctonus se ha reportado
la presencia de la bacteria fijadora de nitrógeno Pantoea agglomerans (Bridges,
1981; Bridges et al., 1984; Vasanthakumar et al., 2006). La baja similitud que
presentan las secuencias de genes ribosomales de los aislados obtenidos con los
diferentes especies del grupo Erwinia/Pantoea impide asociarlos a una especie en
particular, debido a ello, es complicado sugerir una función dentro de la comunidad
bacteriana o en la simbiosis con D. valens.
A partir de los tractos digestivos de insectos colectados en Casas Grandes,
Chihuahua se aislaron constantemente cepas de Enterobacter aerogenes. Esta
especie y otras del mismos género se han aislado también del canal alimentario
de las crisopas pardas, de termitas, de la polilla gitana y de escarabajos
barrenadores de la madera, entre otros insectos (Broderick et al., 2004; Eutick, et
al., 1978; Schloss et al., 2006; Woolfolk y Inglis, 2003). Previamente, Enterobacter
aerogenes también se aisló en D. frontalis. Las especies del género Enterobacter
son una de las principales poblaciones bacterianas que se albergan en el tracto
digestivo de varias termitas, entre ellas Coptotermes acinaciformis (Adams y
Boopathy, 2005; Eutick, et al., 1978). Enterobacter es una bacteria anaerobia
facultativa que se ha descrito como un “pepenador de oxigeno” y se ha sugerido
que elimina el oxígeno que se permeabiliza a través del exoesqueleto y que puede
afectar los procesos anaeróbicos (acetogénesis, hidrogénesis, metanogénesis,
reducción del sulfato, y fijación de nitrógeno) que son fundamentales para la
supervivencia de las termitas. La glucosa, sacarosa y xilosa son carbohidratos
fermentables que se forman durante la degradación de la celulosa y que pueden
ser metabolizados por varias especies del género Enterobacter (Adams et al.,
2005). La xilosa no se encuentra comúnmente en la naturaleza en un estado libre,
sino como un polímero denominado xilano, el cual se puede encontrar en
asociación con la celulosa de las plantas (Jeffries y Jin, 2000). Por lo que canal
alimentario del insecto ofrece un lugar en el cual estos polímeros del floema y la
albura de las plantas pueden ser degradados para su asimilación. E. aerogenes
dentro del canal alimentario de D. valens podría estar generando microambientes
anóxicos, que favorezcan la fijación de nitrógeno y participando en los pasos
finales de la degradación de la celulosa y el xilano.
Acinetobacter lwoffi y A. haemolyticus forman parte de los microorganismos
que se detectaron dentro del canal alimentario de D. valens. Especies del género
Acinetobacter se han encontrado en los tractos digestivos de diversos artrópodos
(Dunn y Stabb, 2005; Schäfer, 1996; Schloss et al., 2006; Sezen et al., 2007;
Xiang et al.; 2006). En D. frontalis se reportó la presencia de bacterias del género
Acinetobacter lo que coincide con los resultados para D. valens. Miembros de
Acinetobacter tienen la capacidad potencial de degradar celulosa y han sido
aislados del canal alimentario de las termitas y de otros ambientes (Ekperigin,
2006; Schfäer et al., 1996; Vimala et al., 2004). Con base en lo antes mencionado,
se puede inferir que las cepas de Acinetobacter podrían estar participando en la
degradación de la celulosa en el tubo digestivo de D. valens.
Stenotrophomonas maltophilia es otra bacteria que hemos identificado
como miembro de la comunidad bacteriana asociada a D. valens. El género
Stenotrophomonas también ha sido encontrado en otros insectos y en D. frontalis
(Campbell et al., 2004; Monttlor Curley et al., 2007; Schloss et al., 2006;
Vasanthakumar et al., 2006). Particularmente, S. maltophilia se ha reportado como
una bacteria fijadora de nitrógeno (Park et al., 2005) que podría estar
suministrando compuestos nitrógenados asimilables a D. valens.
El phylum Actinobacteria está representado por cuatro especies dentro de
la comunidad bacteriana asociada al tracto digestivo de D. valens, las cuales
fueron identificadas como Cellulosimicrobium cellulans, Cellulomonas xylanilytica,
Leifsonia shinshuensis y Janibacter melonis. Bacterias del phylum Actinobacteria
se han encontrado frecuentemente dentro de los canales alimentarios de diversos
insectos incluyendo a insectos que se alimentan de la madera y del floema de las
plantas (Bridges, 1981; Bridges et al., 1984; Broderick et al., 2004; Egert et al.,
2003 y 2005; Schäfer et al., 1996; Schloss et al., 2006; Vasanthakumar et al.,
2006).
En particular, Cellulosimicrobium cellulans secreta un complejo de enzimas
líticas capaces de degradar la pared celular de levaduras (varias preparaciones
comerciales de glucanasas se obtienen a partir de este microorganismo) (Ferrer,
2006). Se ha identificado y aislado a este microorganismo y creemos que puede
estar jugando un papel muy importante en el control de las poblaciones de
levaduras asociadas al canal alimentario de D. valens.
Todas las actinobacterias que se identificaron en este trabajo fueron
capaces de degradar la celulosa (Fig. 10 y Cuadro 7). Los resultados anteriores
son una evidencia indirecta de la posible participación de los microorganismos
asociados al canal alimentario de D. valens en la digestión de la celulosa
contenida en el floema de la plantas. Esta asociación ha sido ampliamente
estudiada en insectos como las termitas (Saxena et al., 1993; Schäfer et al., 1996;
Varma et al., 1994; Wenzel et al., 2002) y las cucarachas comedoras de madera
(Cruden y Markovetz, 1979) y se ha visto el impacto negativo que tiene la carencia
de estos microorganismos sobre el desarrollo y reproducción de los insectos. La
capacidad de degradar la carboximetilcelulosa (CMC) de Cellulomonas xylanilytica
y C. cellulans se ha reportado previamente (Rivas et al., 2004; Schumann et al.,
2001). Sin embargo, hasta nuestro conocimiento en el caso de Janibacter melonis
y Leifsonia shinshuensis no existen reportes previos en los cuales se les asocié
con dicha capacidad.
La densidad de bacterias celulolíticas aerobias asociadas a D. valens
determinada en este trabajo fue de 900 ± 210 UFC/tracto digestivo, lo que equivale
al 0.04% de la población total de bacterias cultivables en medio Gelosa Nutritiva.
En la cucaracha Eublaberus posticus se reportó que las bacterias capaces de
degradar la CMC constituyen alrededor del 1% de las bacterias cultivables
asociadas a su tracto digestivo (Cruden y Markovetz 1979). La aparente baja
proporción de bacterias celulolíticas asociadas al trato digestivo de D. valens
podría deberse, al menos parcialmente, a que nosotros empleamos como sustrato
celulosa en polvo y no CMC. La CMC es un derivado de la celulosa que
frecuentemente se usa en los ensayos de actividad de endoglucanasas (Karlsson
et al., 2002). La mayoría de los trabajos que caracterizan a los microorganismos
celulolíticos emplean la sal disódica de la CMC debido a que posee una alta
solubilidad en agua. Sin embargo, existen evidencias de que la capacidad de
degradar la celulosa se encuentra distribuida en un menor número de
microorganismos que la capacidad de degradar alguno de sus derivados como la
CMC (Reese et al., 1950).
Los nichos ecológicos en los cuales se encuentran involucradas las
bacterias asociadas a los intestinos de los insectos se ha estudiado en muy pocas
especies (Dillon y Dillon, 2004). Particularmente, la capacidad de degradar la
celulosa sólo se ha descrito en las termitas, cucarachas y algunos barrenadores
de la madera (Cruden y Markovetz, 1979; Delalibera et al., 2005; Saxena et al.,
1993; Schäfer et al., 1996; Varma et al., 1994; Wenzel et al., 2002). En este
trabajo identificamos y cuantificamos a las bacterias celulolíticas aerobias
asociadas al trato digestivo de D. valens e inferimos que conjuntamente con otras
poblaciones bacterianas (Serratia, Enterobacter y Acinetobacter) y de levaduras
pueden estar contribuyendo en la digestión completa de la celulosa y al
aprovechamiento
de
este
polisacárido
como
fuente
de
carbono.
Esta
interdependencia cometabólica también se ha documentado ampliamente en las
termitas (Schäfer et al., 1996).
Los métodos independientes del cultivo revelan comúnmente una mayor
diversidad de especies bacterianas en comparación con los métodos basados en
el cultivo (Broderick et al., 2004; Eckburg et al., 2005; Paster et al., 2001). En
nuestro caso, reconocimos 13 especies de bacterias de 11 géneros y dos phyla;
mientras que en las librerías de genes ribosomales solamente logramos
caracterizar 4 especies incluidas en 4 géneros y dos phyla (Fig. 9 y 14) (Cuadros 6
y 8). Este resultado no es inusual y se ha observado en otros ambientes (Dumbar
et al., 1999). Particularmente, los aislados bacterianos del phylum Actinobacteria
no se encontraron en las librerías de genes ribosomales. Sin embargo, el género
Lactobacillus solamente fue encontrado mediante el uso de métodos moleculares.
Una posible explicación para las diferencias observadas es el sesgo que pueden
introducir por una parte las técnicas de extracción de DNA y la amplificación por
PCR, y por otra parte los métodos de cultivo utilizados (medios y condiciones de
incubación). En particular los métodos basados en el cultivo sobre representan las
especies que crecen fácil y rápidamente en los medios sintéticos y no
necesariamente son los mas abundantes de una comunidad. En este caso, se
podrían aislar especies presentes en muy bajos números, lo cual los hace
indetectables por métodos moleculares. Por estos motivos, los estudios que
intentan describir de manera amplia la diversidad de especies en un ambiente
deben incluir métodos basados en el cultivo e independientes del cultivo; dado que
ambas estrategias se complementan y confirman.
Los análisis de rarefacción de nuestros datos sugieren que la riqueza de
especies presente en el tracto digestivo de D. valens es relativamente baja, sin
embargo, todavía falta por analizarse parte de la comunidad presente en este
ambiente ( Fig. 15, 16 y 17). Para poder llegar a una conclusión fiable de la
riqueza de especies de una comunidad los análisis de rarefacción deben ser
combinados con estimadores de la riqueza de especies (Hughes et al., 2001). Por
lo tanto, también calculamos el estimador de la riqueza de especies no
paramétrico Chao1, el cual es concordante con las curvas de rarefacción (Chao 1=
5 OTUs y Fig. 15). Estos datos coinciden con los obtenidos para D. frontalis en los
cuales el estimador Chao 1 tuvo un valor de 1-3 OTUs en las librerías de larvas y
de 3 y 6 OTUs en las librerías de adultos (Vasanthakumar et al., 2006)
La PCR-DGGE de la región 3 variable del 16S rRNA demostró que la
comunidad bacteriana presente en las diferentes partes del tracto digestivo de las
hembras y de los machos de D. valens fue homogénea; sin embargo, se observan
bandas comunes entre ellos y bandas exclusivas entre machos y hembras. La
región con mayor diversidad microbiana fue el proctodeo de las hembras (Fig. 18),
lo que sugiere que la comunidad bacteriana presente en el insecto no sobrepasa
12 especies bacterianas, lo cual de algún modo corrobora los resultados obtenidos
mediante el cultivo y la librería de genes ribosomales. Asimismo, estos datos son
consistentes con lo reportado en D. frontalis (Vasanthakumar et al., 2006). La
comparación del patrón e intensidad de las bandas observadas en el DGGE de la
comunidad total de las diferentes partes del canal alimentario y las cepas aisladas
(Fig. 19), permite inferir que E. aerogenes es una población abundante en el
proctodeo de las hembras y que R. aquatilis es una bacteria que se encuentra
ampliamente distribuida en el tracto digestivo de D. valens.
Durante las repeticiones del DGGE se observó que en la mayoría de los
geles la región que constantemente mostraba el mayor número de bandas era el
proctodeo tanto en hembras como en machos. También se observó que algunas
bandas aparecían esporádicamente y existían pequeñas variaciones en el patrón
desplegado por las diferentes secciones del canal alimentario tanto de hembras
como de machos, lo que posiblemente indica que la estructura poblacional que
albergan estos insectos puede cambiar durante el transcurso del tiempo o que hay
un cierto grado de variación en la comunidad de especies bacterianas en este
hábitat (Datos no mostrados). Sin embargo, en general no se observaron
diferencias substanciales en la comunidad bacteriana total de las diferentes partes
del canal alimentario, sexos y localidades de muestreo.
En la librería de genes ribosomales identificamos las siguientes especies
bacterianas: R. aquatilis, Pantoea dispersa, Acinetobacter schindleri y Lactococcus
lactis (Fig. 14 y Cuadro 8). Solamente las bacterias del género Lactococcus no se
encontraron mediante técnicas basadas en el cultivo. La presencia de bacterias
del género Lactococcus se ha documentado en diversos artrópodos (Bauer et al.,
2000; Peloquin y Greenberg, 2003). La presencia de bacterias lácticas, entre ellas
las del género Lactococcus, se ha demostrado extensamente en el proctodeo de
las termitas (Eutick et al., 1978; Tholen et al., 1997; Schultz y Breznak, 1978). En
el canal alimentario de los mamíferos las bacterias lácticas son importantes
colonizadores del epitelio intestinal (Tannock, 1997) y gracias a su actividad
antagonista contra otras bacterias se ha descrito que participan en la defensa del
tejido epitelial contra la invasión de patógenos (Rolfe, 1997). En las termitas las
bacterias lácticas reducen el oxígeno y desplazan los procesos de fermentación
hacia lactato y potencialmente pueden aumentar la obtención de energía (Condon,
1987). Otra ventaja selectiva de las bacterias lácticas asociadas a las termitas es
su capacidad de metabolizar el ácido úrico (Potrikus y Breznak; 1980, 1981). Con
las evidencias anteriormente mencionadas, se puede proponer que posiblemente
los microorganismos del género Lactococcus participan en el mantenimiento del
equilibrio entre las poblaciones bacterianas del tracto digestivo y en la mejora de la
ganancia energética producto de la fermentación de los azúcares liberados de la
degradación de la celulosa. Asimismo, esta bacteria puede contribuir en el
reciclaje del ácido úrico, lo cual aumenta la eficiencia del uso de los compuestos
nitrógenados, los cuales constituyen uno de los factores limitantes para el
desarrollo de los insectos que se alimentan de la albura y el floema de las plantas.
El contenido de nitrógeno en el tejido de las plantas es muy bajo si lo
comparamos con el de los tejidos de los herbívoros. Como consecuencia, el
nitrógeno de la dieta puede limitar el crecimiento y reproducción de los herbívoros
y seleccionar los atributos que incrementen su adquisición (Mattson, 1980). La
supervivencia y crecimiento de muchos artrópodos con dietas que presentan una
relación C:N muy alta sugiere que estos insectos no obtienen suficiente nitrógeno
de su alimento y que deben obtener compuestos nitrogenados de otras fuentes.
Particularmente, los insectos del género Dendroctonus se alimentan del floema de
las plantas, un sustrato que posee un bajo contenido de compuestos nitrogenados.
Debido a lo anterior los escarabajos de éste género requieren de 16 a 26 veces
más nitrógeno que el presente en los tejidos vegetales de los cuales se alimentan.
Uno de los posibles mecanismos mediante el cual los insectos pueden subsanar
esta deficiencia es la capacidad de fijar nitrógeno asociada a las bacterias de su
canal alimentario. Lo anterior se ha demostrado en una amplia variedad de
insectos como termitas, cucarachas, escarabajos descortezadores, escarabeidos,
la mosca mediterránea de la fruta y el escarabajo venado (Behar et al., 2005;
Benemann, 1973; Breznak et al., 1973; Breznak et al., 1974; Bridges, 1981;
Citernesi et al., 1977; Kuranouchi et al., 2006).
La presencia de las bacterias que potencialmente tienen capacidad para
fijar nitrógeno dentro del canal alimentario del insecto, como R. aquatilis,
Stenotrophomonas maltophilia y Pantoea spp.; la reducción de acetileno in vivo de
larvas e insectos adultos y de las bacterias aisladas del tracto digestivo (Datos no
mostrados); y la presencia de los genes nifH y nifD en el DNA metagenómico del
canal alimentario de D. valens apunta a que la fijación biológica de nitrógeno se
lleva acabo en el tracto digestivo de D. valens.
En la literatura se reporta que R. aquatilis, Serratia, Pantoea agglomerans,
Enterobacter spp. y S. maltophilia poseen la capacidad de fijar nitrógeno (Asis et
al., 2004; Berge et al., 1991; Gyaneshwar 2001; Heulin et al., 1994; Park et al.,
2005; Sandhiya et al., 2005; Wright et al., 1981), lo que sugiere de manera
indirecta que posiblemente estos microorganismos contribuyen al aporte de
nitrógeno a los insectos.
La capacidad de reducir el acetileno se demostró in vivo en larvas e
insectos adultos de D. valens (16.0 ± 2.2; 12.6 ± 3.4 nmol de etileno/h/insecto
respectivamente), si se compara este valor con lo obtenido para otros coleópteros
como el escarabajo venado, Dorcus rectus, en el cual se reporta 1.76 ± 0.52 nmol
de etileno/h/larva (Kuranouchi, 2006), se tiene que la capacidad de reducir el
acetileno de las larvas de D. valens es 9 veces mayor con respecto a la capacidad
de reducir el acetileno de las larvas de Dorcus rectus. Ambos insectos se
alimentan de sustratos pobres en nitrógeno. También estimamos que el nitrógeno
que pueden fijar las larvas y los adultos de nuestro modelo de estudio equivale a
5.6 y 4.4 μg de proteína/día/insecto respectivamente. Los datos anterior son muy
cercanos a lo reportado para la mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata,
a la cual se le estimó que puede fijar el nitrógeno equivalente a 6 μg de
proteína/día/insecto. El resultado anterior debe tomarse con cautela debido a que
en repeticiones posteriores se obtuvieron magnitudes variables (Datos no
mostrados). La fijación de nitrógeno se ha demostrado después de la ingesta
masiva de bacterias fijadoras de nitrógeno como Klebsiella y Enterobacter spp. en
insectos mantenidos por un periodo prolongado de tiempo en condiciones del
laboratorio (Murphy et al., 1994). La alta variación en la magnitud de la reducción
del acetileno podría deberse a la composición de la comunidad bacteriana
asociada al canal alimentario del insecto; a la edad y actividad fisiológica de los
adultos colectados; al lugar y temporada de muestro; a la etapa particular del ciclo
de vida del insecto; al alimento tomado; y al propio árbol huésped del que
provienen los insectos, entre otras variables.
También hemos demostrado la presencia de los genes nifH y nifD en el
DNA metagenómico de las diferentes regiones anatómicas del canal alimentario
de D. valens (Ueda et al., 1995; Zerh y McReynolds, 1989). Ambos genes son
ampliamente utilizados como marcadores que demuestran la presencia y permiten
estimar la presencia, diversidad y filogenia de estos genes, y por ende de
bacterias fijadoras de nitrógeno, en diferentes entornos.
Los datos obtenidos son evidencias directas e indirectas de que la fijación
biológica de nitrógeno se está llevando a acabo in vivo en algunos momentos del
ciclo de vida de D. valens. Para elucidar totalmente la capacidad de fijación de
nitrógeno in vivo asociada a D. valens son necesarios estudios diseñados para
específicamente resolver las preguntas que se mantienen vigentes.
CONCLUSIONES
Se identificaron 14 bacterias heterótrofas aerobias cultivables Cuyas
especies son: Rahnella aquatilis, Serratia liquefaciens, S. proteamaculans,
Acinetobacter lwoffii, A. haemolyticus, Stenotrophomonas maltophilia, Pantoea
cedenensis, Erwinia mallotivora, Erwinia/Pantoea sp., Enterobacter aerogenes,
Janibacter
melonis,
Leifsonia
Cellulosimicrobium cellulans.
shinshuensis,
Cellulomonas
xylanilytica
y
En las librerías de genes ribosomales identificamos 4 especies bacterianas
cuya identificación correspondió a: Lactococcus lactis, Acinetobacter schindleri,
Rahnella aquatilis y Pantoea dispersa.
Los genes nifH y nifD fueron detectados en el DNA metagenómico de las
diferentes regiones anatómicas del canal alimentario de D. valens
Los genes amoA, 16S rRNA de Nitrobacter, nirK, nirS y nosZ no fueron
detectados en el DNA metagenómico de las diferentes regiones anatómicas del
canal alimentario de D. valens
Las larvas e insectos adultos de D. valens llevan a cabo fijación de
nitrógeno.
Cellulosimicrobium
cellulans,
Cellulomonas
xylanilytica,
Leifsonia
shinshuensis y Janibacter melonis tienen capacidad de degradar la celulosa como
única fuente de carbono.
IMPACTO
Este trabajo es estrictamente básico, su trascendencia principal será en la
aportación de información científica y formación de estudiantes de licenciatura y
posgrado. Sin embarbo, el entender el papel de la simbiosis de Dendroctonus con
sus simbiontes microorganismos puede contribuir al entendimiento del ciclo de
vida, adaptación y sobrevivencia de este insecto descortezados que se constituye
en una plaga de los bosques de pinos en México, con el consecuente impacto
económico y ecológico. No se derivarán directamente de los resultados
informados aquí estrategias claras de control de la plaga, pero si revelamos la
importancia que tienen, en la biología del insecto, las bacterias simbiontes.
Posiblemente estos microorganismos contribuyen a que el insecto sobreviva en un
ambiente químicamente hostiles, a que su comunicación química ocurra de
manera eficiente y a que complemente su dieta que sabemos es muy pobre.
Cualquier factor o estrategia que limite o afecte la comunidad bacteriana del
insecto tendrá graves consecuencias sobre la sobrevivencia de este insecto y se
constituirá en una herramienta para de control de este insecto plaga.
BIBLIOGRAFIA
1. Adams, L. y R. Boopathy 2005 Isolation and characterization of enteric bacteria from the
hindgut of Formosan termite. Bioresour. Technol. 96: 1592-1598.
2. Ahmadjian, V., y S. Paracer. 1986. Symbiosis: An introduction to biological associations.
University Press of New England.
3. Altschul, S.F., T.L. Madden, A.A. Schäffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, y D.J. Lipman. 1997.
Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs,
Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.
4. Anklin-Mϋhlemann, R., D.E. Bignell, P.C. Veivers, R.H Leuthold y. M. Slaytor. 1995.
Morphological, microbiological and biochemical studies of the gut flora in the fungus-growing
termite Macrotermes subhyalinus. J. Insect Physiol. 41:929–940.
5. Asis C.A. Jr y K. Adachi. 2004. Isolation of endophytic diazotroph Pantoea agglomerans and
nondiazotroph Enterobacter asburiae from sweetpotato stem in Japan. Lett. Appl. Microbiol.
38:19-23.
6. Ayres, M.P. y S.F. MacLean, Jr. 1987. Development of birch leaves and the growth energetics
of Epirrita autumnata (Geometridae). Ecology 68:558-568.
7. Ayres, M.P., R.T. Wilkens, C.J. Ruel, M.J. Lombardero y E. Vallery. 2000. Nitrogen budges of
phloem-feeding bark beetles with and without symbiotic fungi. Ecology. 81:2198-2210.
8. Batra, L.R. 1963. Ecology of ambrosia fungi and their dissemination by beetles. Trans. Kansas.
Acad. Sci. 66:213-236.
9. Barras, S.J. 1973. Reduction of progeny and development in the southern pine beetle following
removal of symbiotic fungi. Can. Entomol. 105:1295-1299.
10. Barras, S.J. y T.J. Perry. 1975. Interrelationships among microorganisms, bark or ambrosia
beetles, and woody plant tissue: an annotated bibliography, 1965-1974. United States
Department of Agriculture Forest Service, Southern Forest Experiment Station, General
Technical Report SO-10.
11. Bauer, S., A. Tholen, J. Overmann y A. Brune. 2000. Characterization of abundance and
diversity of lactic acid bacteria in the hindgut of wood- and soil-feeding termites by molecular
and culture- dependent techniques. Arch Microbiol 173:126-137.
12. Beaver, R.A. 1986. The taxonomy, mycangia, and biology of Hypothenemus curtipennis
(Schedl), the first know cryphaline ambrosia beetle (Coleoptera: Scolytinae). Entomol. Scand.
17: 131-135.
13. Becker, G. 1971. Physiological influences on wood-destroying insects of wood compounds and
substances produced by microorganisms. Wood Sci. Tech. 5:236-246.
14. Behar, A., B. Yuval, y E. Jurkevitch. 2005. Enterobacteria-mediated nitrogen fixation in natural
populations of the fruit fly Ceratitis capitata. Mol. Ecol. 14:2637-2643.
15. Benemann J.R. 1973. Nitrogen fixation in termites. Science 181: 164-165.
16. Berge, O., T. Heulin, W. Achouak, C. Richard, R. Bally y J. Balandreau. 1991.
Rahnella aquatilis, a nitrogen-fixing enteric bacterium associated with the rhizosphere
of wheat and maize. Can. J. Microbiol. 37:195-203.
17. Bignell, D.E., H. Oskarsson y J.M Anderson.1980. Distribution and abundance of bacteria in the
gut of a soil-feeding termite Procubitermes aburiensis (Termitidae, Termitinae). J. Gen.
Microbiol. 117:393–403.
18. Bignell, D.E. 2000 Introduction to symbiosis. In: Abe, T., D.E. Bignell, M. Higashi
(Eds), Termites: Evolution, Sociality, Symbioses, Ecology. Kluwer Academic.
Dordrect, Netherlands.
19. Bishop, P.E. y R.D. Joerger. 1990. Genetics and molecular-biology of alternative nitrogenfixation systems. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41:109–125.
20. Bohannan, B.J.M. y J. Hughes. 2003. New approaches to analyzing microbial biodiversity data.
Curr. Opin. Microbiol. 6:282-287.
21. Braker, G., A. Fesefeldt y K.P. Witzel. 1998. Development of PCR primer systems for
amplification of nitrite reductase genes (nir K and nirS) to detect denitrifying bacteria in
environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 64:3769-3775.
22. Brand, J.M., J.W. Bracke, A.J. Markovetz, D.L. Wood y L.E. Browne. 1975. Production of
verbenol pheromone by a bacterium isolated from bark beetles. Nature 254:136–137.
23. Breznak, J.A., W.J. Brill, J.W. Mertins y H.C. Coppel. 1973. Nitrogen fixation in termites. Nature
244:577-580.
24. Breznak J.A., J.W Mertins y H.C. Coppel. 1974. Nitrogen fixation and methane production in
wood-eating cockroach, Cryptocercus punctulatus Scudder (Orthoptera: Blattidae). Univ. Wis.
For. Res. Notes 184, Madison, WI.
25. Breznak, J.A. y H.S: Pankratz. 1977. In situ morphology of the gut microbiota of wood-eating
termites [Reticulitermes flavipes (Kollar) and Coptotermes formosamus Shiraki]. Microbiol. 33:
406-426.
26. Breznak, J.A. 1982 Intestinal microbiota of termites and other xylophagous insects. Ann. Rev.
Microbiol. 36: 323-343.
27. Breznak, J.A. 2000 Ecology of prokaryotic microbes in the guts of wood- and litter-feeding
termites. In: Abe, T., D.E. Bignell, M. Higashi (Eds), Termites: Evolution, Sociality, Symbioses,
Ecology. Kluwer Academic. Dordrect, Netherlands. 209-231.
28. Bridges, J.R. 1981. Nitrogen-Fixing Bacteria Associated with Bark Beetles. Microb.
Ecol. 7:131-137.
29. Bridges, J.R., J.E. Marler y B.H. McSparrin. 1984. A quantitative study of the yeasts
and bacteria associated with laboratory-reared Dendroctonus frontalis Zimm. (Coleopt.,
Scolytidae). Sonderdruck aus Bd. 97:261-267.
30. Broderick N.A., K.F. Raffa, R.M. Goodman y J. Handelsman. 2004. Census of the bacterial
community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods.
Appl. Environ. Microbiol. 70: 293–300.
31. Boucher, D.H., S. James y K.H. Keeler. 1982. The ecology of mutualism. A. Rev. Ecol. Syst.
13:315-347.
32. Buchner, P. 1965. Endosymbionts of animals with plant microorganisms. John Wiley y Sons,
Inc., New York, N.Y.
33. Bürgmann, H., F. Widmer, W.V. Sigler, y J. Séller. 2004 New molecular screening tools for
analysis of free-living diazotrophs in soil. Appl. Environ. Microbiol. 70:240-247.
34. Campbell, B.C. 1989. On the role of microbial symbiotes in herbivorous insects. En E. Bernays
(ed.), Insect-plant interactions. CRC Press, Boca Raton, Fla.
35. Campbell, C.L., D.L. Mummey, E.T. Schmidtmann y W.C. Wilson. 2004. Culture-independent
analysis of midgut microbiota in the arbovirus vector Culicoides sonorensis (Diptera:
Ceratopogonidae). J. Med. Entomol. 41:340–348.
36. Cankar, K., H. Kraigher, M. Ravnikar y M. Rupnik. 2005. Bacterial endophytes from seeds of
Norway spruce (Picea abies L. Karst). FEMS Microbiol. Lett. 244: 341-345.
37. Capuzzo, C., G. Firrao, L. Mazzon, A. Squartini y V. Girolami. 2005. ‘Candidatus Erwinia
dacicola’, a coevolved symbiotic bacterium of the olive fly Bactrocera oleae (Gmelin). Int J. Syst
Evol Microbiol 55: 1641–1647.
38. Cazemier, A.E., J.H.P. Hackstein, H.J.M. OpdenCamp, J. Rosenberg y C. van der Drift. 1997.
Bacteria in the intestinal tract of different species of arthropods. Microb. Ecol. 33:189-197.
39. Cibrián, D.T., J.T. Mendez, R. Campos, H.O. Yates, y J.E. Flores. 2000. Insectos forestales de
México. Universidad Autónoma Chapingo.
40. Citernesi U, R. Neglia, A. Seritti, A.A. Lepidi, C. Gilippi, G. Bagnoli, M.P. Nuti y R. Galluzzi.
1977. Nitrogen fixation in the gastro-enteric cavity of soil animals. Soil Biol. Biochem. 9:71–72.
41. Clancy, K.M. 1992. Response of western spruce budworm (Lepidoptera: Tortricidae) to
increased nitrogen in artificial diets. Environ. Entomol. 21:331-344.
42. Clancy, K.M., M.R. Wagner y R.W. Tinus. 1988. Variation in host foliage nutrient concentrations
in relation to western spruce budworm herbivory. Can. J. For. Res. 18:530-544.
43. Condon, S. 1987. Responses of lactic acid bacteria to oxygen. FEMS Microbiol Rev 46:269–
280.
44. Coulson, R.N. 1979. Population dynamics of bark beetles. Annu. Rev. Entomol. 24:417-477.
45. Cruden, D.L. y A.J. Markovetz. 1979. CarboxymethylCellulose decomposition by intestinal
bacteria of cockroaches. Appl. Eviron. Microbiol. 38:369-372.
46. Cruden, D.L. y A.J. Markovetz. 1984. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Arch
Microbiol. 138:131-139.
47. Cruden, D.L. y A.J. Markovetz. 1987. Microbial ecology of the cockroach gut. Ann. Rev.
Microbiol. 41:617–643.
48. Cullen D.W. y P.R. Hirsch. 1988. Simple and rapid method for direct extraction of microbial
DNA from soil to PCR. Soil Biol Biochem 30:983-993.
49. de Bary, A.H. 1878 Vortrag: Über Symbiose. En Versammlung deutscher naturforscher und
arzte En Cassel Kassel: Baier & Lewalter.
50. de Vries, E.J., G. Jacobs, M.W. Sabelis, S.B.J. Menken y J.A.J. Breeuwer. 2004 Diet-
dependent effects of gut bacteria on their insect host: the symbiosis of Erwinia sp. and western
flower thrips. Proc. R. Soc. Lond. 271:2171-2178.
51. Delalibera, I., J. Handelsman y K.F. Raffa. 2005. Contrasts in cellulolytic activities of gut
microorganisms between the wood borer, Saperda vestita (Coleoptera : Cerambycidae), and
the bark beetles, Ips pini and Dendroctonus frontalis (Coleoptera : Curculionidae). Environ.
Entomol. 34:541-547.
52. Díaz, E., R. Cisneros, G. Zuñiga y E. Uria-Galicia. 1998 Comparative anatomical and
histological study of the alimentary canal of Dendroctonus parallelocollis, D. rhizophagus, and
D. valens (Coleoptera: Scolytidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 91:479-487.
53. Díaz, E., O. Arciniega, L. Sánchez, R. Cisneros y G. Zúniga. 2003 Anatomical and histological
comparison of the alimentary canal of Dendroctonus micans, D. ponderosae, D. pseudotsugae
pseudotsugae, D. rufipennis, and D. terebrans (Coleoptera: Scolytidae). Ann. Entomol. Soc.
Am. 96:144-152.
54. Dillon, R.J. y V.M. Dillon. 2004. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu.
Rev. Entomol. 49:71-92.
55. Douglas, A.E. 1989. Mycetocyte symbiosis in insects. Biol. Rev. 64:409-434.
56. Douglas, A.E. 1998. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their
symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol 42:17-37.
57. Douglas A. E. 2006. Phloem-sap feeding by animals: problems and solutions. J. Exp. Bot.
57:747–754.
58. Dunbar, J., S. Takala, S.M. Barns, J.A. Davis y C.R. Kuske. 1999. Levels of bacterial
community diversity in four arid soils compared by cultivation and 16S rRNA gene cloning. Appl.
Environ. Microbiol. 65:1662-1669.
59. Dunn, A.K. y E.V. Stabb. 2005. Culture-independent characterization of the microbiota of the
ant lion Myrmeleon mobilis (Neuroptera: Myrmeleontidae). Appl. Environ. Microbiol. 71:87848794.
60. Eckburg, P.B., E.M. Bik, C.N. Bernstein, E. Purdom, L. Dethlefsen, M. Sargent, S.R. Gill, K.E.
Nelson y D.A. Relman. 2005. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science
308:1635-1638.
61. Egert, M., B. Wagner, T. Lemke, A. Brune y M.W. Friedrich. 2003 Microbial community
structure in midgut and hindgut of the humus-feeding larva of Pachnoda ephippiata (Coleoptera:
Scarabaeidae). Appl. Environ. Microbiol. 69:6659–6668.
62. Egert, M, U. Stingl, L.D. Bruun, B. Pommerenke, A. Brune y M.W. Friedrich. 2005 Structure and
topology of microbial communities in the major gut compartments of Melolontha melolontha
larvae (Coleoptera: Scarabaeidae). Appl. Environ. Microbiol. 71:4556-4566.
63. Ekperigin, M.M. 2007 Preliminary studies of cellulase production by Acinetobacter anitratus and
Branhamella sp. Afr. J. Biotechnol. 1: 028-033.
64. Eutick, M.L., P. Veivers, R.W. O’Brien y M. Slaytor. 1978. Dependence of the higher termite,
Nasutitermes exitiosus and the lower termite, Coptotermes lacteus on their gut flora. J. Insect
Physiol. 24:363-368.
65. Falcon, L.I., F. Cipriano, A.Y. Chistoserdov y E.J. Carpenter. 2002. Diversity of diazotrophic
unicellular cyanobacteria in the tropical North Atlantic Ocean. Appl. Environ. Microbiol. 68:
5760–5764.
66. Felsestein J. 1989. PHYLIP-Phylogeny inference package version 3.5c. Cladistic 5:164-166.
67. Ferrari, M.J., D. Du, J.A. Winsor y A.G. Stephenson. 2007. Inbreeding depression of plant
quality reduces incidence of an insect-borne pathogen in a wild gourd. Int. J. Plant Sci.
168:603–610.
68. Ferrer, P., T. Halkier, L. Hedegaard, D. Savva, I. Diers y J.A. Asenjo. 2006. Nucleotide
sequence of a 13-1,3-glucanase Isoenzyme II(A) gene of Oerskovia xanthineolytica LL G109
(Cellulomonas cellulans) and initial characterization of the recombinant enzyme expressed in
Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 178:4751-4757.
69. Fogelsong, M.A., D.H. Walker, F.S. Puffer y A.J. Markovetz. 1975. Ultrastructural morphology
of some prokaryotic microorganisms associated with the hindgut of cockroaches. J. Bacteriol.
123:336-345.
70. Forcella, F. 1981. Twig nitrogen content and larval survival of twig girdling beetles Oncideres
cingulata (Coleoptera: Cerambycidae). Coleopterists Bulletin 35:211-212.
71. Francis C.A., J.M. Beman y M.M.M. Kuypers. 2007. New processes and players in the
nitrogen cycle: the microbial ecology of anaerobic and archaeal ammonia oxidation.
ISME J. 1:19-27.
72. Galtier, N., M. Gouy, y C. Gautier. 1996. SEAVIEW and PHILO_WIN: two graphic tools for
sequence alignment and molecular phylogeny. Comput. Appl. Biosci. 12:543-548.
73. Gill, S.R., M. Pop, R.T. DeBoy, P.B. Eckburg, P.J. Turnbaugh, B.S. Samuel, J.I. Gordon, D.A.
Relman, C.M. Fraser-Liggett y K. E. Nelson. 2006. Metagenomic analysis of the human distal
gut microbiome. Science. 312:1355-1359.
74. Gil, R., A. Latorre y A. Moya 2004. Bacterial endosymbionts of insects: insights form
comparative genomics. Environ. Microbiol. 6:1109-1122.
75. Gijzen, H.J. y M. Barugahare. 1992. Contribution of anaerobic protozoa and methanogens to
hindgut metabolic activities of the American cockroach, Periplaneta Americana. Appl. Environ.
Microbiol. 58:2565-2570.
76. Grenier, A.M., G. Duport, S. Pagès, G. Condemine y Y. Rahbé. 2006 The phytopathogen
Dickeya dadantii (Erwinia chrysanthemi 3937) is a pathogen of the pea aphid. Appl. Environ.
Microbiol. 72:1956-1965.
77. Gyaneshwar P, E.K. James, N. Mathan, P.M. Reddy, B. Reinhold-Hurek y J.K. Ladha. 2001
Endophytic colonization of rice by a diazotrophic strain of Serratia marcescens. J.
Bacteriol.183:2634-45.
78. Harada, H. y H. Ishikawa. 1997. Experimental pathogenicity of Erwinia aphidicola to pea aphid,
Acyrthosiphon pisum. J. Gen. Appl. Microbiol. 43:349-354.
79. Henry, S.M. 1962. The significance of microorganisms in the nutrition of insects. Transactions
of the New York Academy of Sciences, Series II 24:676-683.
80. Heulin, T., O. Berge, P. Mavingui, L. Gouzou, K.P. Hebbar y J. Balandreau. 1994. Bacillus
polymyxa and Rahnella aquatilis, the dominant N2-fixing bacteria associated with wheat
rhizosphere in French soils. Eur. J. Soil. Biol. 30:35-42.
81. Hodges, J.E. y P.L. Lorio, Jr. 1969. Carbohydrate and nitrogen fractions of the inner bark of
loblolly pines under moisture stress. Can. J. Bot. 47:1651-1657.
82. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley y S.T. Williams. 1994. Bergey’s manual of
determinative. Bacteriology. 9th ed. Editors.Williams and Wilkins. Baltimore, Maryland USA.
83. Hsiau, P.T-W. y T.C. Harrington. 2003. Phylogenetics and adaptations of basidiomycetous fungi
fed upon by bark beetles (Coleoptera:Scolytidae). Symbiosis. 34:111-131.
84. Hughes, J.B., J.J. Hellmann, T.H. Ricketts y B.J.M. Bohannan. 2001. Counting the uncountable:
statistical approaches to estimating microbial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 67:4399-4406.
85. Hungate, R.E. 1966. The rumen and its Microbes. Academic Press, New York.
86. Hunt, D.W.A. y J.H. Borden. 1990. Conversion of verbenols to verbenone by yeasts isolated
from Dendroctonus ponderosae (Coleoptera: Scolytidae). J. Chem. Ecol. 16:1386-1397.
87. Hurst, M.R.H., Jones S.M., B. Tan y T.A. Jackson. 2007 Induced expression of the Serratia
entomophila Sep proteins shows activity towards the larvae of the New Zealand grass grub
Costelytra zealandica. FEMS Microbiol. Lett. 275:160-167.
88. Ishikawa, H. 2003. Insect simbiosis: An introduction. En Insect symbiosis. Bourtzis, K., and T.A.
Miller. CRS Press.
89. Izumi, H., I.C. Anderson, I.J. Alexander, K. Killham y E.R.B. Moore. 2006 Endobacteria in some
ectomycorrhiza of Scots pine (Pinus sylvestris) FEMS Microbiol. Ecol. 56:34-43.
90. Jeffries, T.W. y Y.-S. Jin. 2000. Ethanol and thermotolerance in the bioconversion of xylose by
yeasts Adv. Appl. Microbiol. 47:221-268.
91. Kadavy D.R., B. Plantz, C.A. Shaw, J. Myatt, T.A. Kokjonh y K.W. Nickerson. 1999.
Microbiology of the oil fly, Helaeomyia petrolei. Appl. Environ. Microbiol. 65: 477-1482.
92. Karlsson, J., D. Momcilovic, B. Wittgren, M. Schϋlein. F. Tjerned y G. Brinkmalm. 2002.
Enzymatic degration of carboxymethyl cellulose hydrolyzed by the endoglunases Cel5A, Cel7B,
and Cel45Acore from Trichoderma reesei. Biopolymers. 63:32-40.
93. Kaufman, M.G., E.D. Walker, D.A. Odelson y M.J. Klug. 2000. Microbial community ecology
and insect nutrition. Am. Entomol. 46:173-184.
94. Kneip C., P. Lockhart, C. Voss y U.G. Maier. 2007 Nitrogen fixation in eukaryotes – New
models for symbiosis BMC Evol. Biol. 7:55-66.
95. Krokene, P. y H. Solheim. 1998. Pathogenicity of four blue stain fungi associated with
aggressive and nonaggressive bark beetles. Phytopathology. 88:39-44.
96. Kuranouchi, T., T. Nakamura, S. Shimamura, H. Kolima, K. Goka, K. Okabe y A. Mochizuki.
2006 Nitrogen fixation in the stag beetle, Dorcus (Macrodorcus) rectus (Motschulsky) (Col.,
Lucanidae). J. Appl. Entomol. 130:471-472.
97. Lammers, P.J. y R. Haselkorn. 1984. Sequence of the nifD geneogy coding for the alpha
subunit of dinitrogenase from the cyanobacterium Anabaena. Cell 44:905–911.
98. Levieux, J., P. Cassier, L. Guillaumin y A. Roques. Structures implicated in the transportation of
pathogenic fungi by the European bark beetle, Ips sexdentatus Boerner: ultrastructure of a
mycangium. Can. Entomol. 123:245-254.
99. Lim, Y.W., S.M. Alamounti, J.J. Kim y C. Breuil. 2004. Multigene phylogenies of Ophiostoma
clavigerum and closely related species from bark beetle-attacked Pinus in North America.
FEMS Microbiol. Lett. 237:89-96.
100. Lim, Y.W., J.J. Kim, M. Lu y C. Breuil. 2005. Determining fungal diversity on Dendroctonus
ponderosae and Ips pini affecting lodgepole pine using cultural and molecular methods. Fungal
Divers. 19:79-94.
101. Liu, X., S.M. Tiquia, G. Holguin, L. Wu, S.C. Nold, A.H. Devol, K. Luo, A.V. Palumbo, J.M.
Tiedje, y J. Zhou. 2003. Molecular diversity of denitrifying genes in continental margin
sediments within the oxygen-deficient zone off the Pacific coast of Mexico. Appl. Environ.
Microbiol. 69:3549-3560.
102. Lundgren, J.G., R.M. Lehman y J. Chee-Sanford. 2007 Physiology, biochemistry, and
topology: Bacterial communities within digestive tracts of ground beetles (Coleoptera:
Carabidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 100:275-282.
103. Maier, R.M., I.L. Pepper y C.P. Gerba. 1999 Environmental microbiology. Academic Press.
104.
Martin, M.M. 1979. Biochemical implications of insect mycophagy. Biol. Rev. 54:1-21.
105.
Mazur, B.J. y C.F. Chui, 1982. Sequence of the gene coding for the beta-subunit of
dinitrogenase from the blue-green alga Anabaena. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:6782-6786.
106. Mattson, W.J. 1980. Herbivore in relation to plant nitrogen content. Ann. Rev. Ecol. Syst.
11:119-161.
107. Mevarech, M., D. Rice y R. Haselkorn. 1980. Nucleotide sequence of a cyanobacterial nifH
gene coding for nitrogenase reductase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77:6476–6480.
108. Miller, B. 2005. OpenStat user's manual, portable data file (OS2MANUAL.PDF),
http://statpages.org/miller/openstat/ , 2003.
109. Mittler, T.E. 1988. Applications of artificial feeding techniques for aphids. En A.K. Minks and
P. Harrewijn (ed.), Aphids: their biology, natural enemies, and control. Elsevier Biomedical
Press, Amsterdam, TheNetherlands.
110. Monttlor Curley, C., E.L Brodie, M.G. Lechner y A.H. Purcell. 2007 Exploration for
facultative endosymbionts of glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Ann.
Entomol. Soc. Am. 100:345-349.
111. Moore, G.E. 1972 (a). Microflora from the alimentary tract of healthy southern pine beetles,
Dendroctonus frontalis (Scolytidae), and their possible relationship to pathogenicity. J. Invertebr.
Pathol. 19:72-75.
112. Moore, G.E. 1972 (b). Pathogenicity of ten strains of bacteria to larvae of the southern pine
beetle [Dendroctonus frontalis]. J. Invertebr. Pathol. 20:41-45.
113. Moran, N.A., P. Tran y N.M. Gerardo. 2005 Symbiosis and insect diversification: an ancient
symbiont of sap-feeding insects from the bacterial phylum Bacteroidetes. Appl. Environ.
Microbiol. 12:8802-8810.
114. Mramba, F., A. Broce y L Zurek 2006. Isolation of Enterobacter sakazakii from stable flies,
Stomoxys calcitrans L. (Diptera: Muscidae). J. Food. Prot. 69:671-673.
115. Mulder A, A.A. Graaf, L.A. Robertson y J.G. Kuenen. 1995. Anaerobic ammonium oxidation
discovered in a denitrifying fluized bed reactor. FEMS Microbiol. Ecol. 16:177-184.
116. Muller, H.E., G.R. Fanning y D.J. Brenner. 1995a. Isolation of Ewingella americana from
mollusks. Curr. Microbiol. 31:287-290.
117. Muller, H.E., G.R. Fanning, y D.J. Brenner. 1995b. Isolation of Serratia fonticola from
mollusks. Syst. Appl. Microbiol. 18:279-284.
118. Murphy K.M., D.S. Teakle y I.C. Macrae. 1994. Kinetics of colonization of adult Queensland
fruit-flies Bactrocera tryoni by dinitrogenfixing alimentary-tract bacteria. Appl. Environ. Microbiol.
60:2508–2517.
119. Muyzer G., E.C. De Waall y A.G. Vitterlinden. 1993 Profiling of complete microbial
populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of poliymerase chain reactionamplified genes coding for 16S rDNA. Appl Environ Microbiol 59:695-700.
120.
Muyzer, G. y K. Smalla 1998 Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antoine van
Leeuwenhoek. 73:127-141.
121. Nardi, J.B., R.I. Mackie y J.O. Dawson. 2002. Could microbial symbionts of arthropod guts
contribute significantly to nitrogen fixation in terrestrial ecosystems? J. Insect Physiol. 48:751763.
122. Noda, S., M. Ohkuma, R.
Usami, K. Horikoshi, y T. Kudo. 1999. Culture-independent
characterization of a gene responsible for nitrogen fixation in the symbiotic microbial community
in the gut of the termite Neotermes koshunensis. Appl. Environ. Microbiol. 65:4935-4942.
123. Ohkuma, M., S. Noda y T. Kudo. 1999. Phylogenetic diversity of nitrogen fixation genes in
the symbiotic microbial community in the gut of diverse termites. Appl. Environ. Microbiol
65:4926-4934.
124.
Ohkuma, M. y T. Kudo. 1996. Phylogenetic diversity of the intestinal bacterial community in
the termite Reticulitermes speratus. Appl. Environ. Microbiol. 62:461-468.
125. Paine, T.D. y M.C. Birch. 1983. Acquisition and main tenance of mycangial fungi by
Dendroctonus brevicomis (Coleoptera Scolytidae). Environ. Entomol. 12:1384-1386.
126. Paine, T.D., K.F. Raffa, y T.C. Harrington. 1997. Interactions among scolytid bark beetles,
their associated fungi, and live host conifers. Annu. Rev. Entomol. 42:179-206.
127. Park M., C. Kim, J.Yang, H. Lee, W. Shin., S. Kim y T. Sa. 2005. Isolation oand
characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricultural crops
of Korea. Microbiol. Res. 160:127-33.
128. Peloquin, J.J. y L. Greenberg. 2003. Identification of midgut bacteria from fourth instar red
imported fire ant larvae, Solenopsis invicta buren (Hymenoptera: Formicidae) J. Agric. Urb.
Entomol. 20:157-164.
129. Potrikus, C.J. y J.A. Breznak. 1980. Uric acid-degrading bacteria in guts of termites
[Reticulitermes flavipes (Kollar)]. Appl Environ Microbiol 40:117-124.
130. Potrikus C.J. y J.A. Breznak. 1981. Gut bacteria recycle uric acid nitrogen in termites: a
strategy for nutrient conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4601-4605.
131. Purkhold, U., A. Pommerening-Röser, S. Juretschko, M.C. Schmid, H.P. Koops y M.
Wagner. 2000. Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on
comparative 16S rRNA and amoA sequence analysis: Implications for molecular diversity
surveys. Appl. Environ. Microbiol. 66:5368-5382.
132. Paster, B.J., S.K. Boches, J.L. Galvin, R.E. Ericson, C.N. Lau, V.A. Levanos, A.
Sahasrabudhe y F.E. Dewhirst. 2001. Bacterial diversity in human subgingival plaque. J. Bact.
183:3370-3383.
133. Raffa, K.F., T.W. Phillips y S.M. Salom. 1993. Strategies and mechanisms of host
colonization by bark beetles. EN T. Schowalter and G. Filip (eds.), Beetle pathogen interactions
in conifer forests. Academic, San Diego, CA.
134. Raymond, J., J.L. Siefert, C.R. Staples y R.E. Blankenship. 2004. The natural history of
nitrogen fixation. Mol. Biol. Evol. 21:541–554.
135.
Reese, E.T., R.G.H. Siu y H.S. Levison. 1950. The biological degradation of soluble
cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. J. Bacteriol.
59:485-497.
136. Relman, D.A. 1993. Universal bacterial 16S rRNA amplification and sequencing. En
American Society of Microbiology (ed) Diagnostic molecular microbiology: principles and
applications. Nueva York.
137. Rivas, R., M.E. Trujillo, P.F. Mateos, E. Martínez-Molina y E. Velázquez. Cellulomonas
xylanilytica sp. nov., a cellulolytic and xylanolytic bacterium isolated from a decayed elm tree.
Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54:533-536.
138.
Robbins, C.T. 1983. Wildlife feeding and nutrition. Academic Press, New York, New York,
USA.
139. Rolfe, R.D. 1997. Colonization resistance. En: Mackie R.I. y White B.A. (eds)
Gastrointestinal microbiology, vol 2. Chapman and Hall, New York, USA.
140. Rosello-Mora R. y R. Amann. 2001. The species concept for prokaryotes. FEMS-Microbiol.
Rev. 25:39-67.
141. Rotthauwe, J.H, K.P. Witzel y W. Liesack. The ammonia monooxigenase structural gene
amoA as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing
populations. Appl. Environ. Microbiol. 63:4704-4712.
142. Sandhiya G.S., T.C. Sugitha, D. Balachandar y K. Kumar. 2005 Endophytic colonization and in
planta nitrogen fixation by a diazotrophic Serratia sp. in rice. Indian J Exp Biol. 43:802-807.
143. Sambrook J. y D.W. Russell. 2001. Molecular Cloning: a laboratory manual ·3rd Edition Cold
Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.
144.
Saxena, S., J. Bahadur y A. Varma. 1993. Cellulose and hemicelluloses degrading bacteria
from termite gut and mound soils of India. Indian J. Microbiol. 33:55-60.
145. Scala, D., y L.J. Kerkhof. 1999. Diversity of nitrous oxide reductase (nosZ) genes in
continental shelf sediments Appl. Environ. Microbiol. 65:1681-1687.
146. Schäfer, A. 1996. Hemicellulose-degrading bacteria and yeasts from the termite gut. J.
Appl. Bacteriol. 80:471–478.
147. Schloss, P.D. y J. Handelsman. 2005. Introducing DOTUR, a computer program for defining
operational taxonomic units and estimating species richness. Appl. Environ. Microbiol. 71:15011506.
148. Schloss, P.D., I. Delalibera, Jr., J. Handelsman y K.F. Raffa. 2006. Bacteria associated with
the guts of two wood boring beetles: Anoplophora glabripennis and Saperda vestita
(Cerambycidae). Environ. Entomol. 35:625-629.
149. Schowalter, T.D. 1981. Insect herbivore relationship to the state of the host plant: biotic
regulation of ecosystem nutrient cycling through ecological succession. Oikos 37:126-130.
150. Schultz, J.E. y J.A. Breznak. 1978. Heterotrophic bacteria present in hindguts of wood
eating termites [Reticulitermes flavipes (Kollar)]. Appl. Environ. Microbiol. 35:930-936.
151.
Schumann, P., N. Weiss y E. Stackebrandt. 2001. Reclassification of Cellulomonas
cellulans (Stackebrandt and Keddie 1986) as Cellulosimicrobium cellulans gen. nov., comb.
nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 1007-1010.
152.
Scriber, J.M. y F. Slansky, Jr. 1981. The nutritional ecology of immature insects. Annu. Rev.
Entomol. 26:183-211.
153.
Sezen, K., I. Demir y
Z. Demirbaǧ. 2006. Identification and pathogenicity of
entomopathogenic bacteria from common cockchafer, Melolontha melolontha (Coleoptera:
Scarabaeidae). New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 35:79-85.
154. Six, D.L. 2003. Bark beetle-fungus symbiosis. En Insect symbiosis. Bourtzis, K., and T.A.
Miller. CRS Press.
155. Slansky, E 1993. Nutritional ecology - the fundamental quest for nutrients. En Caterpillars.
N.E. Stamp y T.M. Casey, editors. Chapman & Hall, New York, New York, USA.
156. Slansky, F., Jr. y J.M. Scriber. 1985. Food consumption and utilization. En Comprehensive
insect physiology. G.A. Kerkut y L.I. Gilbert, editors, biochemistry, and pharmocology.
Pergamon, Oxford, UK.
157. Slansky, F. y G.S. Wheeler. 1992. Caterpillars compensatory feeding response to diluted
nutrients leads to toxic allelochemical dose. Entomol. Exp. Appl. 65:171-186.
158. Steinhaus, E.A. 1959. Serratia marcescens Bizio as an insect pathogen. Hilgardia 28:351380.
159. Straif, S.C., C.N.M. Mbogo, A.M. Toure, E.D. Walker, M. Kaufman, Y.T. Toure y J.C. Beier.
1998. Midgut bacteria in Anopheles gambiae and An. funestus (Diptera: Culicidae) from Kenya
and Mali. J. Med. Entomol. 35:222-6.
160. Tabashnik, B.E. 1982. Responses of pest and nonpest Colias butterfly larvae to
intraspecific variation in leaf nitrogen and water content. Oecologia 55:389-394.
161. Tannock, G.W. 1997. Probiotic properties of lactic-acid bacteria: Plenty of scope for
fundamental R and D. Trends. Biotechnol. 15:270–74.
162. Tholen, A., B. Schink y A. Brune. 1997. The gut microflora of Reticulitermes
flavipes, its relation to oxygen, and evidence for oxygen-dependent acetogenesis by the
most abundant Enterococcus sp. FEMS Microbiol. Ecol. 24:137-149.
163.
Thompson, J.D., T.J. Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin y D.G. Higgins. 1997. The
ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality
analysis tools. Nucleic Acids Res. 24:4876-4882.
164. Treusch A.H., S. Leininger, A. Kletzin, S.C. Schuster, H-P. Klenk y C Scheleper 2005 Novel
genes for nitrite reductase and Amo-related proteins indicate a role of uncultivated mesophilic
crenarchaeota in nitrogen cycling. Environ. Microbiol. 7:1985-1995.
165. Trier, T.M. y W.J. Mattson. 1997. Needle mining by the spruce budworm provides
sustenance in the midst o f privation. Oikos 79:241-246.
166. Tokuda, G. y H. Watanabe 2007 Hidden cellulases in termites: revision of an old
hypothesis. Biol. Lett. 3:336-339.
167. Ueda, T., Y. Suga, N. Yahiro y T. Matsuguchi. 1995. Remarkable N2-fixing bacterial
diversity detected in rice roots by molecular evolutionary analysis of nifH gene sequences. J.
Bacteriol. 177:1414-1417.
168. Ulrich, R., D. Buthula y M. Klug. 1981. Microbiota associated with the gastrointestinal tract
of the common house cricket, Anacheta domestica. Appl. Environ. Microbiol. 41:246-254.
169. Varma, A., B.K. Kolli, J. Paul, S. Saxena y H. König. 1994. Lignocellulose degradation by
microorganisms from termite’s hills and termite guts: a survey the present state of art. FEMS
Microbiol. Rev. 15:9-28.
170. Vasanthakumar A., I. Delalibera, Jr, J. Handelsman, K.D. Klepzig, P.D. Schloss y K.F.
Raffa. 2006 Characterization of gut-associated bacteria in larvae and adults of the southern
pine beetle, Dendroctonus frontalis Zimmermann. Eviron. Entomol. 35: 1710-1717.
171. Venter J.C., K. Remington, J.F. Heidelberg, A.L. Halpern, D. Rusch y J.A. Eisen. 2004.
Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science 304:66-74.
172. Vimala, A., A. Sree y M. Bapuji. 2004. Isolation and characterisation of Acinetobacter sp.
from a marine sponge Axinella agariciformis. Asian J Microbiol. Biotechnol. Environ. Sci. 6:297300.
173. Vorwerk, S., D. Martinez-Torres y A. Forneck. 2007. Pantoea agglomerans-associated
bacteria in grape phylloxera (Daktulosphaira vitifoliae, Fitch). Agric. For. Entomol. 9: 57-64.
174. Wagner, T.L., J.A. Gagne, P.J.H. Sharpe, y R.N. Coulson. 1984. A biophysical model of
southern pine beetle, Dendroctonus frontalis Zimmermann (Coleoptera: Scolytidae),
development. Ecol. Model. 21: 125-147.
175. Wallin, K.F. y K.F. Raffa. 2004. Feedback between individual host selection behavior and
population dynamics in an eruptive insect herbivore. Ecol. Monogr. 74:101-116.
176. Wells, M.L., R.D. Gitaitis y F.H.Sanders. 2002 Association of tobacco thrips, Frankliniella
fusca (Thysanoptera: Thripidae) with two species of bacteria of the genus Pantoea Ann.
Entomol. Soc. Am. 95: 719-723.
177. Wenzel, M., I. Schönig, M. Berchtold, P. Kämpfer y H. König. 2002. Aerobic and
facultatively anaerobic cellulolytic bacteria from the gut of the termite Zootermopsis
angusticollis. J. Appl. Microbiol. 92: 32-40.
178. Werner, E., 1926. Die ernährung der larvae von Potosia cuprea Fbr. (Cetonia floricola
Hbst.). En Beitrag zum problem der cellulosverdauung bei insectenlarven. Zeitschrift für
Morphologie und Ökologie der Tiere 6: 150–206.
179. White, T.C.R. 1993. The inadequate environment: nitrogen and the abundance of animals.
Springer-Verlag, New York, New York, USA.
180. Widmer, F., B.T. Shaffer, L.A. Porteuous y R.J. Seidler. 1999. Analysis of nifH gene pool
complexity in soil and litter at a Douglas Fir forest site in the Oregon cascade mountain range.
Appl. Environ. Microbiol. 65:374-380.
181. Wiedenmann, J.F., 1930. Die Zelluloseverdauung bei Lamellicornierlarven. Zeitschrift für
Morphologie und Ökologie der Tiere 19: 228-258.
182. Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalsky y S.V. Tingey. 1990. DNA
polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids
Res.18:6531-6535.
183.
Wood, S.L. 1982. The bark and ambrosia beetle of North and Central America (Coleoptera:
Scolytidae). A taxonomic monograph. Great Basin Nat. Mem.
184. Woolfolk, S.W. y G.D. Inglis. 2004. Microorganisms associated with field-collected
Chrysoperla rufilabris (Neuroptera: Chrysopidae) adults with emphasis on yeast symbionts. Biol.
Control. 29:155-168.
185. Wright S.F. y R.W. Weaver 1981. Enumeration and identification of nitrogen-fixing bacteria
from forage grass roots Appl Environ Microbiol. 42:97–101.
186. Wu, L., D.K. Thompson, G. Li, R.A. Hurt, J.M. Tiedje y J. Zhou. 2001. Development and
evaluation of functional gene arrays for detection of selected genes in the environment. Appl.
Environ. Microbiol. 67:5780-5790.
187. Xia X. y Z. Xie 2001 DAMBE: Data analysis in molecular biology and evolution. J. Heredity
92:371-373.
188. Xiang, H., G.F. Wei, S. Jia, J. Huang, X.X. Miao, Z. Zhou, L.P. Zhao y Y.P. Huang. 2006.
Microbial communities in the larval midgut of laboratory and field populations of cotton bollworm
(Helicoverpa armigera). Can. J. Microbiol. 52:1085-1092.
189. Yang, Y. y A. Joern. 1994. Compensatory feeding in response to food quality by Melanopus
differentiallis. Physiol. Entomol. 19:75-82.
190. Zehr, J.P., M. Mellon, S. Braun, W. Litaker, T. Steppe y H.W. Paerl. 1995. Diversity of
heterotrophic nitrogen fixation genes in a marine cyanobacterial mat. Appl. Environ. Microbiol.
61:2527-2532.