Erijman_3.pdf
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DIVERSIDAD MICROBIANA
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
1
Estimaciones de la diversidad
microbiana
La diversidad genética en 1 g de suelo coresponde
aproximadamente 4,000 genomas diferentes
2
Torsvik et al. 1990 Appl. Environ. Microbiol. 56: 782-787
Qué es una especie bacteriana?
Otros términos:
Ecotipo: definido por el ambiente
Filotipo: definido por el grupo filogenético
Ribotipo: definido por la secuencia del ARN ribosomal
Unidad Taxonómica Operacional (OTU)
Science (2009) 323, 741-746
3
Niveles de organización biológica
Comunidad
Población
Organismo
Comunidad
microbiana
Población
microbiana
Microcolonia
Organo
Tejido
Colonia
Célula
Célula procariota
Macromolécula
Macromolécula
4
Panikov, N.S. 2010 Microbial Ecology en Environmental Biotechnology (Wang, Ivanov, Tay, Hung eds.) pp 121-192. Humana Press
Cuanta diversidad?
Número de individuos
Numero de especies (Riqueza)
Equitabilidad (evenness)
25
5
5
Cuanta diversidad?
Es improbable que el muestreo sea 100% efectivo
Estimamos el total basado en el subset muestreado
6
Cuanta diversidad?
Muestrear
Reconocer (diferenciar)
Identificar
7
Indices de diversidad
Index
Discriminant
ability
Sample
Size
Sensititivy
Richness,
Evenness,
Dominance
Calculation
Widely
used?
Sensitivity
to abund
models
Log α
Good
Low
Richness
Simple
Yes
N (?)
Log Normal λ
Good
Moderate
Richness
Complex
N
Yes
Q
Good
Low
Richness
Complex
N
N
S
Good
High
Richness
Simple
Yes
N
Margalef
Good
High
Richness
Simple
N
N
Shannon
Moderate
Moderate
Richness
Intermediate Yes
N
Brillouin
Moderate
Moderate
Richness
Complex
N
N
McIntosh U
Good
Moderate
Richness
Intermediate N
N
Simpson
Moderate
Low
Dominance
Intermediate Yes
Yes
BergerParker
Shannon E
Poor
Low
Dominance
Simple
N
N
Poor
Moderate
Evenness
Simple
N
N
Brillouin E
Poor
Moderate
Evenness
Complex
N
N
McIntosh D
Poor
Moderate
Dominance
Simple
N
N
= Desirable Traits in an Index
8
Magurran, A.Ecological diversity and its measurements
1988 Princeton University Press
Ensamblado de comunidades: la
funcionalidad aumenta con la diversidad
Riqueza
Bell, T, et al, Vol
436|25August2005|doi:10.1038/nature03891
Equitabilidad
Wittebolle, Vol 458 | 2 April 2009 |
doi:10.1038/nature07840
9
La importancia de la equitabilidad en la
función de una comunidad
10
La importancia de la equitabilidad en la
función de una comunidad
Mayor equitabilidad dentro de
la
2009
comunidad está asociada a
mayor actividad metanogénica
A
A+ B
Porcentaje acumulado de
ingreso
G=
Porcentaje acumulado de gente
de menor a mayor ingreso
11
Réplicas
A
A
B
B
Diversidad
B
B
A
A
12
Manefield et al., Environmental Microbiology (2005) 7, 715–722
Cómo se ensamblan las
comunidades?
13
Ensamblado de comunidades: concepto
de metacomunidad
14
Cuáles son las fuentes de inmigración?
cloaca
humano
agua superficial
15
McLellan et al. Diversity and population structure of sewage-derived microorganisms in wastewater treatment
plant influent, Environ Microbiol (2010) 12, 378–392
La comunidad microbiana es muy variable,
no converge en una comunidad estable
Digestor metanogénico
Archaea
Bacteria
El reactor mantiene constante el pH y la actividad de
reducción de DQO
16
Fernandez et al., 1999 How Stable is stable? Function versus community composition. Appl. Environ. Microbiol. 65: 3697-3704
Dynamic
nature bacteriana
of activated es
sludge
was
La
comunidad
dinámica
demonstrated
DGGE replicados
y varía entrewith
bioreactores
Intensity
Reactor A
Reactor B
Barros activados
200
Day 17
0
200
Day 58
0
200
Day 109
0
200
Day 160
0
50
60
70
80
Nornalized Relative Front
90
100
17
Kaewpipat and Grady., 2002 Water Sci Technol 46 (1-2): 19-27
Un continuo de especies a lo largo
de gradientes ambientales
Abundancia de especies
Factores
ambientales
bajo
gradiente de factor ambiental
Mínimo ecológico
alto
pH
Intensidad lumínica
Salinidad
Oxígeno disuelto
Potencial redox
Nutrientes
Temperatura
18
Un continuo de especies a lo largo
del tiempo (sucesión)
celulosa
glucosa
19
Importancia de entender la
sucesión
fertilización
8
12
semana
tratam
+
-
+
24
-
-
-
Las poblaciones en sitios contaminados
son diferentes de los sitios no
contaminados.
Los cambios ocurren rapidamente
20
Ogino et al., Journal of Applied Microbiology 2001, 91, 625-635
Análisis pre-genómico:
basado en 16S rRNA
Universal
Regiones conservadas y variables
Útil sobre un amplio rango de distancias filogenéticas
Cambio sobre inserciones o deleciones
Tamaño adecuado
21
Análisis pre-genómico:
el ciclo completo del 16S rRNA
1995
{
DGGE/TGGE
t-TFLP
SSCP
ARISA
ARDRA
Bibliotecas de clones
22
Biblioteca de clones
Extracción
de DNA
Generación
de árboles
filogenéticos
Amplificación
por PCR
Alineamiento con
secuencias de
bases de datos
Purificación
de amplicón
Secuenciación
de insertos
Clonado
Extracción de
plasmidos
Tranformación
en E coli
Preparación
de libraries
23
decano
petróleo
crudo
pristano
mezcla de
alcanos
hexadecano
naftaleno
24
25
McKew et al., Environmental Microbiology (2007) 7, 165–176
Electroforesis en geles con gradientes
desnaturalizante (DGGE)
26
Electroforesis
consludge
gradientes
Dynamic natureen
of geles
activated
was
demonstrated
with DGGE(DGGE)
desnaturalizante
27
Dynamic nature of activated sludge was
demonstrated de with DGGE
fibras
Water Research (2010) 44 1785-1796
28
Dynamic nature of activated sludge was
demonstrated de with DGGE
Water Research (2010) 44 1785-1796
benceno
MTBE
29
Fingerprinting:
t-RFLP
30
31
Reactor I, pH 2.2
Reactor II, pH 4.0-4.5
32
Limitaciones del análisis
basado en 16S rRNA
T a b l e1 . Examples of the unique and disparate phenotypiccharacteristics of closely related organisms in the Proteobacteria
Organism
Aerobicity
I d e n t i f y i nmge t a b o l i s m
Fermentation
Electron
acceptors
utilized
Ferribacterium
limneticum
Strict anaerobe
Fe(III) reduction
Non-fermentive
Ferric iron, nitrate,
fumarate
Rhodocyclustenuis
Facultative anaerobe
Phototrophy
Ferments storage
polysaccharides
Oxygen
Strain SIUL
Facultative anaerobe
Perchlorate reduction
Non-fermentative
Oxygen, chlorate,
perchlorate
Strain RCB
Facultative anaerobe
Chlorate reduction
Non-fermentative
Oxygen, nitrate
Strain WD
Microaerophile
Perchlorate reduction
Non-fermentative
Oxygen, nitrate,
chlorate
Magnetospirillum
gryphiswaldense
Microaerophile
Magnetosome production
Not determined
Not determined
33
Achenbach and Coates., 2000 ASM News 65: 3697-3704
Asociar identidad a función:
Stable Isotope Probing
• Marcar DNA
• Extraer DNA
• Separar fracciones livianas y pesadas por ultracentrifugación
• Amplificar DNA (PCR)
• Analizar usando tecnicas como DGGE, T-RFLP, clonado y sequenciación
Muestra
ambiental
Extracción de DNA
Fraccionamiento
(Ultracentrifugacion)
Microorganismos responsables de la
degradación de un contaminante
34
Radajewski et al. Nature 2000 403:646-9
RNA Stable Isotope Probing
Cultivo en MM + fenol-13C6
24 h
P. putida
P. chlororaphis
48 h
Crecimiento en fenol
P. putida
P. chlororaphis
+
-
35
Manefield et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 5367-5373
Polaromonas naphthalonivorans
PNAS November 11, 2003 100: 13591–13596
RNA vs DNA
• más abundante
• mayor turnover
• no depende de la
replicación
37
Manefield et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 5367-5373
Análisis de diversidad funcional
utilizando RNA-SIP
A
B
B
A
Pseudomonas
Acidovorax
Acidovorax
El reactor
más inestable tiene mayor diversidad
B
de grupos degradadores de fenol?
A
38
Manefield et al., 2005 Environ. Microbiol. 7: 715-722
Limitaciones de SIP
•
Necesita altas concentraciones de sustrato (bias de
cultivo)
•
Largos tiempos de incubación
- Enriquecimiento de poblaciones minoritarias
- Condiciones ex-situ no refleja necesariamente los
ambientes in situ
39
Manefield et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 5367-5373
Fluorescence in situ hybridization
FISH
40
FISH revela alta diversidad en
barros activados
41
Amann et al., 1996 In Situ Visualization of High Genetic Diversity in a Natural Microbial Community J. Bacteriol. 178: 3496–3500
Diversidad bacteriana en
reactores nitrificantes
Nitrospira
competencia por NH3
otras AOB
heterótrofos
mu
asimilación
tua
org
lism
o
liberación
SMP
Nitrosococcus mobilis
10 µm
competencia
otros recursos
CSLM
42
Adaptado de: Daims et al. (2006) Trends in Biotechnology 24, 483489
Práctica de FISH:
problemas y soluciones
43
Wagner et al. Fluorescence in situ hybridisation for the identification and characterisation of prokaryotes. Curr Opinion Microbiol
2003, 6:302–309
Práctica de FISH:
problemas y soluciones
44
Wagner et al. Fluorescence in situ hybridisation for the identification and characterisation of prokaryotes. Curr Opinion Microbiol
2003, 6:302–309
Microautoradiografía (MAR)
• Se expone la emulsión a la
radioactividad y se revela
• Las células que degradan el
sustrato aparecen como
puntos negros, que pueden
ser contados
• El número de células totales
se determina con DAPI o NA
45
Ito et al., Appl. Environ. Microbiol., 68, 356-364, 2002
Microautoradiograpía- FISH
MAR-FISH
46
Combinación de técnicas
47
Limitaciones de MAR-FISH
• No se pueden detectar varios elementos simultáneamente
• No ofrece buena resolución celular en agregados densos
• Requiere el uso de isótopos radioactivos
• Algunos elementos no posees isótopos con vidas medias
apropiadas (e.g. O y N)
• La cuantificación de incorporación es complicada
• Las células fijadas y cubiertas por emulsión no se pueden
manipular para hacer genómica de células individuales
48
Espectroscopía Raman
Diagrama de Jablonski
A mayor masa mayor energía
del desplazamiento de
Stokes
fenilalanina
49
Wagner, M. Anal. Rev. Microbiol 2009, 63, 411-429
Microscopía Raman confocal
Imagen 100X
Espectro típico de
una célula individual
50
Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458
El corrimiento al rojo provocado por
el uso de 13C se puede calibrar
51
Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458
Las diferencias espectrales se deben al
% de 13C-glucosa en el medio
13C
52
Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458
Degradación de naftaleno en
un acuífero
Control estéril
13C-naftaleno
Formación de
salicilato
12C-naftaleno
53
Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241
Degradación de naftaleno en un
acuífero analizado por SIP-DGGE
Acidovorax : alta afinidad
revelado en SIP-DGGE
P. fluorescence: baja afinidad
obtenida por cultivo
54
Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241
Degradación de naftaleno en un
acuífero analizado por SIP-Raman
bacteria total
Pseudomonas sp
Acidovorax sp
FISH
55
Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241
Secondary Ion Mass Spectrometry
(SIMS)
56
Wagner, M. Anal. Rev. Microbiol 2009, 63, 411-429
Secondary Ion Mass Spectrometry
(SIMS)
Comunidad microbiana degradadora de fenol en suelo
57
DeRito,C. M. Appl. Environ. Microbiol 2005, 71, 7858-7865
SIMSISH usando NanoSIMS
El reactivo fluorescente usado en FISH es reemplazado por una
molécula conteniendo isótopos estables o elementos raramente
presentes en la biomasa, e.g. halógenos
E. coli cultivadas en un medio con 99% de 13C mezcladas
con B. subtilis con abundancia isotópica natural.
E. coli se pre-hibridó con la sonda I6-Eub338-Cy3
Imagen secundaria 12C Imagen secundaria 13C
Imagen secundaria 127I Imagen secundaria 32S
Biomasa cont proteína
Li et al., Environ. Microbiol 2008, 10, 580-588
PCR cuantitativo
(real time PCR)
4
3
1
2
Conversión de una señal fluorescente en un
valor numérico
59
PCR cuantitativo
(real time PCR)
Sybr Green
Fluorescencia
TaqMan
1. Pegado de primer y sonda
Sybr green
Quenching de señal
fluorescente
libre
Primer
forward
DNA sc
desnaturalización
Sonda
TaqMan
DNA sc
Desnaturalización
Sybr green
2. Extensión y clivaje de sonda fluorescente
libre
Fluorescencia
annealing
Amplificación por
PCR
Fluorescencia
Liberación de
fluorescencia
Fluorescencia
extensión
Producto
de PCR
(DNA dc)
Taq
Taq polimerasa
Marca fluorescente en 5’
Marca fluorescente en 5’
quencher
60
Práctica de Q-PCR
diluciones
Rango de detección
end-point PCR
E=104%
plateau
lineal
exponencial
Eficiencia = (10pendiente – 1)*100
61
Alcanos totales
PAH totales
Pristano + fitano
qPCR
62
McKew et al., Environmental Microbiology (2007) 9, 1562–1571
Phylogenetic
Oligonucleotide Arrays
• PhyloChip – 500,000 probes (300k target 16S)
16S rRNA gene used as biomarker
due to large database and availability
of “universal” primers.
PhyloChip is scanned,
fluorescence data analyzed and
probe sets with >90% probes
positive are considered present
16S rRNA gene is amplified from
genomic extract or 16S rRNA
molecules are used directly
PhyloChip stained and washed
using automatic fluidics station
Amplicon pool fragmented,
biotin labeled
Biotin labeled 16S hybridizes to its
complement sequence on the array surface.
63
Aplicación de microarrays en la
reducción y reoxidación de uranio
Pre-estimulación
reducción
oxidación
U(VI)
U(IV)
Geobacteraceae
No hay declinación en las
poblaciones reductoras de
U durante la reoxidación
64
Brodie et al., 2006 Application of a High-Density Oligonucleotide Microarray Approach To Study Bacterial Population Dynamics during Uranium
Reduction and Reoxidation Appl Environ Microbiol 72: 6288-6298
Anaerochip
Microarray para digestores metanogénicos
65
Franke-Whittle et al., 2009 Design and development of the ANAEROCHIP microarray for investigation of methanogenic communities
Journal of Microbiological Methods 79: 279-288
Microarray de isotopos
66
Adamczyk et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69: 6875-6887
Microarray de isotopos
Incubación con H14CO3
Incubación con H14CO3
-
-
Inhibidor de
nitrificación
Marcación de rRNA con cy3
67
Adamczyk et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69: 6875-6887
Functional Gene Arrays
(Geochip)
24253 - 50mer
>10000 genes
>150 grupos funcionales
68
Functional Gene Arrays
(Geochip)
muestras de
diferentes días
Los genes correlacionan
con la concentración de U
Análisis de remediación in situ de acuífero contaminado con U
69
The ISME Journal (2007) 1, 67–77
Functional Gene Arrays
(Geochip 3.0)
28000 - 50mer
>57000 genes
>292 grupos funcionales
70
He et al., 2010 GeoChip 3.0 as a high-throughput tool for analyzing microbial community composition, structure and functional
activity. ISME J (2010) 4, 1167 – 1179
?
A great challenge now lies in integrating this new knowledge into conceptual frameworks that
enable us to predict the consequences of manipulating environments in specific ways for
ecosystem function. Integrating the knowledge acquired through the methods reviewed here should
guide us in resolving issues such as how to manipulate activated sludge, contaminated soil or
decentralised composting systems to improve ecological services and minimise the negative
impacts of human activity. Other issues to resolve include how to increase the activity of phosphate
accumulating bacteria, reduce bulking by filamentous bacteria, achieve more efficient denitrification
and fatty acid and protein removal in wastewater treatment plants. Likewise, important questions to
explore are for example: can we enhance in situ biodegradation of pollutants by facilitating or
inhibiting specific microbial taxa? Can we favour specific methanogens over sulphate or nitrate
reducing clades in anaerobic digestors? The vast amount of information gained from applying these
sophisticated methods will most certainly result in addressing these issues and questions in an
effective way.
Gutierrez Zamora + Manefield, 2010 An appraisal of methods for linking environmental processes to specific
microbial taxa Rev Environ Sci Biotechnol 9:153–185
71
