XXX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia efectuando centenares a miles de lecturas repetidas de cada una de las bases en estudio y dando información exhaustiva de las moléculas analizadas8. Esto ha aumentado considerablemente el rendimiento dado que los secuenciadores tradicionales resolvían pocas kilobases al día y ahora pueden estudiar cientos de megabases en el mismo tiempo. Asimismo, es posible estudiar más genes a la vez así como la totalidad de las regiones exónicas e intrónicas de estos genes. Dependiendo del tipo de aparato de que se disponga y de la información que se quiera obtener se analizan genomas completos, exomas, paneles de genes o genes completos o regiones génicas que se quieran caracterizar. Para definir la estrategia de análisis a seguir es importante preguntarse qué otros sitios del gen pueden tener mutaciones. Por ejemplo, así como hay inversiones que afectan los dos grandes intrones 22 y 1, el gen del FVIII posee otros intrones de gran tamaño como el 6, 13, 14 y 25, y es posible plantear la hipótesis de que algún paciente pudiera presentar una alteración rara que involucre alguno de ellos u otros grandes rearreglos aislados9. Recientemente se ha confirmado la existencia de cambios mutacionales en zonas internas de los intrones que afectan el proceso de splicing generando un sitio de unión no convencional (sitio de unión críptico)10,11. Finalmente, como los estudios de mutación se aplican al ADN procedente de leucocitos de sangre periférica y el gen del FVIII actúa en el hígado, que es el lugar de síntesis más importante, sería posible que existiera una línea celular mutada en el hígado pero casi ausente en sangre periférica. Esto se conoce como mosaicismo somático de baja frecuencia y fue demostrado en algunas madres de casos esporádicos de hemofilia A con mutación identificada y que habían sido diagnosticadas, erróneamente, como no portadoras12. La metodología de secuenciación de Sanger puede llegar a detectar casos de mosaicismo pero casi nunca cuando es menor del 15%13. La secuenciación masiva permitiría estudiar en profundidad estos casos para determinar la presencia de un alelo mutado aun con muy bajo porcentaje (alrededor del 1%) de representación en el ADN de linfocitos. Cabe insistir en el hecho de que un gen puede estar indemne en su estructura pero albergar una alteración en sus zonas reguladoras y, por lo tanto, no transcribirse ni funcionar. La zona promotora del FVIII abarca unas 2 kb y pocos cambios descritos como posiblemente patológicos en el promotor o zona 3’UTR en pacientes con hemofilia A14,15. Se ha descrito también la ausencia o disminución del ARNm del gen del FVIII en sangre periférica de un paciente con hemofilia A grave. Este hallazgo es compatible con el concepto de gen no funcionante, ya sea por mutaciones en zonas reguladoras o por otros factores epigenéticos como la metilación de zonas promotoras que actúan silenciando los genes16. El estudio del ARNm para detectar alteraciones en su tamaño y/o cantidad es esencial para descubrir estos hallazgos de la patología molecular del gen del FVIII. Por último, hay que señalar que en el diagnóstico diferencial de la hemofilia A se deben descartar la enfermedad de von Willebrand, particularmente los casos con niveles de factor VIII moderados o leves (2N), y el déficit combinado de FV y FVIII. Este último ocurre por mutaciones en los genes que codifican las proteínas LMAN1 (antes ERGIC-53) y MCFD2, localizados en los cromosomas 18 y 2, respectivamente, que transportan el FV y el FVIII desde el retículo endoplásmico hasta el aparato de Golgi. Las mutaciones encontradas predicen la falta de función de estas proteínas y provocan un déficit moderado a leve de FV y FVIII. Este trastorno constituye un ejemplo de enfermedad por déficit de proteínas cuyos genes están intactos y subraya la importancia de los procesos postraduccionales. Tabla 2. Mutaciones que podrían ser causa de hemofilia A y que no son detectadas mediante los métodos rutinarios de secuenciación en ADN genómico Mutaciones en el gen del FVIII • Alteraciones splicing por mutaciones intrónicas • Mosaicismo somático de baja frecuencia • Posibles inversiones en intrones 6, 13, 14 y 25 u otros rearreglos Regulación de la expresión del gen del FVIII • Mutaciones en zonas promotoras o región 3’ no traducida (UTR) • Factores epigenéticos no conocidos Mutaciones en otros genes • Genes de las proteínas de transporte del FVIII • Genes que actúan en la modificación postraduccional de la proteína Figura 1. Algoritmo de diagnóstico molecular en la hemofilia A. A partir del ADN de un paciente hemofílico se inicia el estudio con las inversiones de los intrones 22 y 1. A continuación el método de secuenciación automática de Sanger permite obtener resultados fiables de los exones y las zonas de unión intrón-exón y promotor. Si es negativo es posible detectar deleciones o duplicaciones exónicas con métodos cuantitativos, ya sea con la amplificación selectiva de exones o estudiando la totalidad de los exones en un solo experimento como la Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA). Si todo es negativo y la hemofilia es leve o moderada es necesario descartar enfermedad de von Willebrand 2N (que cursa con niveles bajos de FVIII) y el más raro déficit combinado de FV y FVIII por alteración del transportador común de ambos factores. Estudios más complejos incluyen el análisis de ARN mensajero para determinar alteraciones raras del splicing, estudios de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) y CGH (Comparative Genome Hybridization) para detectar grandes rearreglos estructurales, y la secuenciación masiva (NGS) para descubrir mutaciones intrónicas o en regiones menos estudiadas del gen. La confirmación genética del paciente permite el estudio de portadoras y el adecuado asesoramiento genético de la familia incluyendo las opciones reproductivas. Siempre es aconsejable realizar el estudio indirecto con marcadores polimórficos intragénicos que permiten identificar el cromosoma X de riesgo en la familia en caso de no encontrar la mutación o de ser necesario un diagnóstico de portadoras con rapidez. Los marcadores también son necesarios para definir el haplotipo de riesgo en los estudios prenatales y preimplantatorios. En la hemofilia B puede seguirse un razonamiento similar pero no hay inversiones, por lo que el diagnóstico empezaría por la secuenciación y los estudios cuantitativos. 62