Ciencias de la Vida Anatomía Patológica Microscopía Óptica

2 /2013
izasa.es
Evolución de la
Citometría:
SONY SP6800 Spectral
Analyzer.
Pg. 3
Ensayo múltiplex de
secreción de IL-6
y viabilidad celular
empleando una línea
tumoral de células
epiteliales de ovario.
Pg. 5
Nuevo Espectrómetro
IRTracer-100 de Shimadzu:
El FTIR de gama media con
mejor relación señal ruido
en su clase.
Pg. 20
Análisis multiresiduo
de 210 pesticidas en
alimentos por
UHPLC-MS/MS.
Pg.24
Pg
Ciencias de la Vida
Anatomía Patológica
14
Microscopía Óptica
16
Electroforesis Capilar
20
Espectrometría
22
Cromatografía
28
Fluorescencia de Rayos x 33
Medio Ambiente
X-Supreme 8000:
cumpliendo con el nuevo
método ISO13032 para
la determinación de
bajos niveles de azufre
en combustibles de
automoción.
Pg.33
902 20 30 80
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3
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@IzasaGIC
34
IZASALAB
Destacamos
acuerdo de distribución en exclusiva Izasa
-Sony Biotechnologies para toda la gama
de sorters, analizadores y reactivos de citometría de flujo en España y Portugal
Situado en Champaign IL, Sony Biotechnology Inc. aprovecha
la experiencia de Sony Corporation en tecnología láser de
alta precisión, óptica y micro fabricación de electrónica, para
desarrollar productos de calidad y soluciones innovadoras para el
mercado de citometría de flujo.
Sony Biotechnology Inc. ofrece una amplia gama de equipos y
reactivos de citometría de flujo, software potente e innovador
y una tecnología líder e innovadora en citometría de flujo. Los
sorters y analizadores de Sony Biotechnology Inc. tienen una gran
capacidad de análisis y alta sensibilidad, con diferentes líneas de
productos para adaptarse a cualquier presupuesto.
Este acuerdo completa línea Izasa de citometría de flujo,
ofreciendo a los clientes la última tecnología en este campo.
Contenidos
Evolución de la Citometría: SONY SP6800 Spectral Analyzer
IZASALAB 2/2013
3
Ensayo múltiplex de secreción de IL-6 y viabilidad celular empleando una línea tumoral de células epiteliales
de ovario.
5
Nuevo FlowCAM III. Combinación de citometría de flujo y microscopía 8
Aplicaciones de los sistemas de Acea Biosciences
10
Cada célula "cuenta": Expresión Génica de Célula Única
12
Equipamiento para preparación de muestras en anatomía patológica
14
Nuevos microscopios estereoscópicos Nikon SMZ25 y SMZ18
16
Análisis de aniones y cationes por electroforesis capilar 18
Nuevo espectrómetro infrarrojo por transformada de fourier IRTracer-100 de Shimadzu
20
Análisis de pesticidas por FAST GCMS/MS 22
Analísis multiresiduo por UHPLC-MS/MS de 210 pesticidas en alimentos
24
Tracera: La tecnología del plasma es el futuro de la detección en cromatografía de gas
28
Análisis de plantas medicinales por cromatografía en capa fina
30
Nueva Serie HS-20 muestreadores de espacio en cabeza de Shimadzu
32
X-Supreme 8000 cumpliendo con el nuevo método ISO13032 para la determinación de bajos niveles de
azufre en combustibles de automoción
33
Medición química y olfativa para preservar la calidad del aire
34
2 IZASALAB 2/2013
Redacción:
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CIENCIAS DE LA VIDA
Evolución de la Citometria:
SONY SP6800 Spectral Analyzer
El último
analizador que
ha lanzado Sony
supone un avance
en el análisis
de células y
biomarcadores
que se realiza en
la actualidad.
El equipo SP6800 emplea una bancada óptica
innovadora y algoritmos desarrollados por
Sony. Esta tecnología abre la limitación de las
combinaciones de fluorocromos que existen
actualmente. Permite trabajar con datos hasta
ahora nunca vistos como el espectro completo
de las células marcadas, o detectar y substraer
el espectro de autofluorescencia de cada célula
aumentando el rango dinámico.
TECNOLOGíA
Óptica
La óptica del equipo recoge
toda la fluorescencia de
500 nm a 800 nm. Emplea
10 prismas consecutivos
y un PMT de 32 canales
con óptica de enfoque
mediante micro lentes.
Análisis Espectral
La tecnología que emplea este equipo incluye
algoritmos para separar los espectros de
cada fluorescencia. Esto supone una gran
mejora respecto a los sistemas tradicionales
de compensación de fluorescencia. Estos
algoritmos permiten el empleo de fluorocromos
con espectros solapantes, incluso con proteínas
fluorescentes en el mismo experimento (como
Measured data
Analysis results
FITC y GFP). Permite la detección de 15 colores
mediante el empleo de tan solo 2 láseres.
Virtual Filter
Gracias al detector exclusivo que emplea de 32
canales y al análisis espectral, el investigador
puede controlar de manera individual la ganancia
de cada canal para aumentar el MFI de cada
fluorescencia.
Para aumentar la resolución y sensibilidad
para aplicaciones complejas, el software tiene
una novel aplicación, llamada virtual filter.
Esta aplicación permite controlar el número de
canales atribuidos a cada canal de fluorescencia,
optimizando el ratio señal ruido.
Intensity
Esta aplicación puede realizarse durante la
adquisición u offline, lo cual supone la capacidad
de análisis postadquisición más potente que
existe en la actualidad.
Spectral
Deconvolution
Intensity per bandwidth [Area/nm]
Intensity
Spectrum
Dye: PE
Virtual Filter
566 – 573nm
559 – 581nm
552 – 607nm
4 ..............................................32
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3
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5,81%
2,99%
10,9%
2,86%
Flow Point
El SP6800 emplea un sistema de localización
y posición mediante láser adaptado de la
tecnología blu-ray Disk para la visualización
del core central y la localización de cada
evento en la cámara de flujo.
Mediante este sistema se puede reducir
la variabilidad de los eventos totales, o
de poblaciones específicas. Esto permite
la adquisición de células o eventos a alta
velocidad para aplicaciones que requieren
trabajar con velocidad de flujo lenta.
Untreated
Drug A Treated
Drug B Treated
Autofluorescencia
Se pueden observar diferencias en células
Jurkat tratadas y sin tratar incluso sin
marcar. Mediante la sustracción de la autofluorescencia de cada muestra, el ratio
señal/ruido mejora notablemente.
Aplicación
Proteínas Fluorescentes
Monitorización de la regulación espaciotemporal de células del sistema inmune
mediante el uso de proteínas fluorescentes.
Mediante el uso de citometría de flujo
convencional es difícil analizar la expresión
de diversas proteínas fluorescentes
simultáneamente. El analizador espectral
SP6800 permite separar los espectros
de emisión solapantes de proteínas
fluorescentes y fluorocromos.
4 IZASALAB 2/2013
CIENCIAS DE LA VIDA
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Ensayo múltiplex de secreción de IL-6
y viabilidad celular empleando una línea
tumoral de células epiteliales de ovario.
En esta nota
de aplicación
mostramos como
un ensayo in vitro
en microplaca
puede monitorizar
la secreción de
IL-6 en células
SKOV-3 de
carcinoma de
ovario, inducidas
por unión del
ligando a EGFR
y la activación
de NFkB.
Figura 1. Cytation™3.
Usando el lector multimodo con modulo de imagen celular
Cytation™3, para monitorizar la secreción de IL-6. Ensayo HTRF
para la detección de IL-6 y de viabilidad celular.
El flujo de trabajo del ensayo implicó un protocolo
de 2 microplacas, la primera donde las células
fueron dispensadas y se realiza la activación del
EGFR por unión de ligando, y la segunda donde
se realizaran las mediciones de IL-6 mediante
la transferencia de una parte del sobrenadante
de las células. También demostramos que la
secreción de IL-6 puede ser inhibida en el nivel
de EGFR o por el uso de inhibidores de NFkB
conocidos. Inhibidores que son potencialmente
tóxicos para las células cultivadas en placas y
pueden ser evaluados a través de microscopía
de fluorescencia utilizando sondas fluorescentes.
Esto proporciona una determinación cuantitativa
de si la supresión de IL-6 es causada por la
inhibición del receptor / activación del factor de
transcripción o a través de la toxicidad celular.
Todas las mediciones se realizaron en el lector
multimodo con modulo de imagen celular
Cytation3.
Cytation™3 Lector Multimodo
con Imagen Celular
Cytation3 combina un microscopio de
fluorescencia automatizado y un lector
multimodo de microplacas en un único
instrumento. Con estas prestaciones podemos
obtener de un ensayo celular datos cualitativos
y datos cuantitativos de nuestra muestra, en un
único protocolo de lectura.
Equipado con la patente BioTek Hybrid
Technology™ para detección en microplaca
de
fluorescencia/luminiscencia.,
Cytation3
incluye un detección de alta sensibilidad basada
en filtros y un sistema flexible de detección
basado en monocromadores, ofreciendo así
una gran eficacia y versatilidad en la lectura
de microplacas, con dos PMTs, cada uno
dedicado a cada óptica de detección intensidad
de fluorescencia/luminiscencia. Asímismo se
incluye un sistema óptico para la detección de
Absorbancia UV-VIS por monocromador, y un
modulo de adquisición imágenes mediante
cámara CCD Sony 16 bits, y con la capacidad
de trabajar en cuatro canales de fluorescencia
o campo claro, empleando hasta 5 posibles
magnificaciones (objetivos de microscopia 2X,
2.5X, 10X y 20X).
El diseño del Cytation3 pone especial énfasis en
los ensayos de célula viva: sus características
incluyen el control de temperatura a 45 °C,
control de gases CO2 / O2, agitación orbital y
soporte completo para los estudios cinéticos con
el software de análisis de datos de BioTek el
Gen5™, específicamente diseñado para realizar
de manera sencilla una lectura del pocillo y
la adquisición de la imagen. Otros avances
tecnológicos en el diseño de Cytation3 son el
uso de LED de alta intensidad como fuentes de
luz, emparejados con cubos de filtros Shemrock,
objetivos Olympus y un enfoque automático
basado en el soltare/imagen que permite adquirir
siempre imágenes enfocadas, de manera eficaz,
ágil, automatizada y sin sufrir fenómenos de
fototoxicidad.
El sistema basado en filtros se utiliza para
detectar los 665 nm y 620 nm de emisión
fluorescente del ensayo HTRF ® IL-6. Luego la
imagen se adquirió con el ensayo de viabilidad
celular Nuclear-ID ™ Azul / Red diseñado
para uso con microscopía de fluorescencia. El
software Gen5 se utilizó para el análisis de los
datos.
Protocolo de lectura y adquisición
de imágenes del ensayo HTRF
IL-6 y citotoxicidad en el
Gen5™, en dos microplacas
Un único protocolo de lectura de 2 microplacas
se ha creado con el software Gen5 para permitir
el procesamiento eficiente de la placa de ensayo
HTRF y la placa de las células. La disposición de
la microplaca creada en el Gen5 para la placa
IZASALAB 2/2013
5
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de ensayo HTRF identifica la ubicación de los
pocillos de ensayo y de control. El posterior y
automatizado análisis de los datos convertirá
los resultados de fluorescencia en Delta F (%) e
identifica los pocillos "hit" donde la inhibición de
la secreción de IL-6 es ≥ 50 % .
Calculo Delta F(%)
((HTRF Value (Test Well) - HTRF Value (Neg Ctl)) / HTRF Value (Neg Ctl))*100
En la misma programación de protocolo
empleada para generar los resultados de
HTRF, se seleccionan los pocillos de la placa
de las células para evaluar los posibles efectos
citotóxicos de las concentraciones del inhibidor
de interés. Se adquieren imágenes 4X y 20X
de núcleos en células vivas y células muertas,
teñidas con el reactivo de viabilidad celular
Nuclear-ID™ (Figura 2).
Estimulación de la cascada
de señales EGFR
Los resultados generados en el análisis de la
estimulación mediante EGF en distintos tiempos
(Tabla 1), demuestran que una incubación de
48 horas con las células SKOV-3, proporciona
el mayor cambio en la señal (ventana de
ensayo) entre los pocillos que contienen células
estimuladas y no estimuladas. (Tabla 1)
A
B
C
Figura 2. (A) Imágenes 4X
de células vivas/muertas
para AG 1478. Se muestran
imágenes de dos pocillos
preseleccionados junto
con el pocillo de valor IC50
y el control negativo del
inhibidor. (B) Campo claro
20x y fluorescencia azul en la
misma imagen, mostrando la
morfología celular y la tinción
de los núcleos.
La herramienta de Análisis Celular del Gen5 es
entonces empleada para determinar el número
de células vivas y muertas mediante un contaje
celular automatizado en cada imagen 4X. El
tamaño de objeto fluorescente y la definición
de un umbral de fluorescencia, junto con el
cruce de los datos de señal de fluorescencia
de la detección por PMT, son criterios que nos
garantizan un apropiado y preciso contaje de
células incluso en casos de elevada confluencia
en el pocillo (Figura 3).
6 IZASALAB 2/2013
Figura 3. Comparación de los distintos métodos
cuantitativos de contaje celular, empleados de
manera simultanea por el Cytation3, para llegar
a una máxima precisión y eficacia en el contaje
celular en cada pocillo. El contaje de células
y la media de la señal en imágenes adquiridas
mediante objetivo 20X, fueron comparadas con la
media de la intensidad de fluorescencia tomada
mediante una lectura en TOP, con detección
por PMT. Esta comparativa se hizo en cada uno
de los dos canales de fluorescencia analizados
en este ensayo. (A) Datos de contaje Celular de
ROI definidos (B) Valor medio de las señales de
fluorescencia cuantificadas en las imágenes
adquiridas y (C) Señal de fluorescencia en lectura
TOP, representados frente al número de células
sembradas en la microplaca. Los puntos de datos
representan la media de 8 replicados.
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Tabla 1.
Tiempos de
incubación
del ensayo de
estimulación
por EGF.
Ratio (Delta F(%)
Maximum IL-6 Stimulation
/ Delta F (%) Unstimulated)
24 Hours
48 Hours
72 Hours
96 Hours
2.8
4.3
2.8
2.8
Figura 4. Estimulación EGF de
la secreción de IL-6 . Curva de
la estimulación de la secreción
de IL-6 tras la incubación
de células SKOV-3 con EGF
durante 48 horas.
Figura 5. Inhibición de
la secreción IL-6 por (A)
pequeñas moléculas
inhibidoras y (B)
anticuerpos anti-EGFR.
Confirmación de los
inhibidores de la cascada de
señales de EGFR y análisis de
su citotoxicidad
Las curvas de inhibición para todos los
compuestos y los anticuerpos anti-EGFR
ensayados, se muestran en relación con los
valores Delta F (%) calculados por el software
Gen5 ™ usando los 620 nm originales y 665 nm
de emisión de señales (Figura 5).
B
A
A
B
Figura 6. Ratios de células
vivas y muertas para
todas las concentraciones
testadas de inhibidores,
(A) pequeñas moléculas
y (B) anticuerpos antiEGFR .
Solo en las concentraciones más altas
de inhibidores probados, hay una notable
disminución de la viabilidad celular. Un último
experimento se realizó para confirmar la unión
al receptor de los anticuerpos anti EGFR. Cada
anticuerpo primario se añadió a las células
SKOV-3, seguido por la adición de XL665 de
cabra marcado con anticuerpo anti-Fc humano.
Se espera que una imagen fluorescente de color
rojo donde la unión entre anticuerpo primario/
receptor y el anticuerpo anti-Fc se lleva a cabo
(Figura 7).
A partir del análisis celular desarrollado con
las imágenes 4X (Figura 2), se generan las
siguientes curvas de citotoxicidad. (Figura 6)
Los resultados obtenidos de las imágenes
de células vivas / muertas, demuestran que
los efectos citotóxicos son mínimos en las
concentraciones IC50, cuando se utiliza un
período de incubación de 48 horas (Figura 6).
Figura 7. Imagenes 20x . Azul indica núcleos
teñidos con DAPI. Verde indica marcaje FITCFaloidina Actina.
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completo en este
enlace
IZASALAB 2/2013 7
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CIENCIAS DE LA VIDA
Nuevo FlowCAM III. Combinación de
citometría de flujo y microscopía
FlowCAM es el
nuevo sistema
dirigido a todos
aquellos usuarios
que habitualmente
requieren de la
última tecnología
en monitorización
rápida de
partículas en
fluídos de diferente
naturaleza.
FlowCAM combina
las posibilidades
de la citometría
de flujo y de la
microscopía, ambas
mejoradas en este
sistema, en un
orden de magnitud.
Análisis de Materia Orgánica Particulada
FlowCAM es un equipo capaz de contar, captar
imágenes y analizar las células de una muestra en
flujo contínuo con resultados significativamente
precisos de forma instantánea.
El sistema de procesamiento del FlowCAM,
captura imagenes digitales de cada célula y
presenta los datos en un formato general de
fácil interpretación o bien a través de nuestro
patentado Escatergrama.
Posibilidad de ajustar la adquisición de la
imagen en el modo de AutoImage (de 1/sec
hasta 15/sec) y posibilidad de contar el número
de partículas por ml introduciendo un volumen
conocido en los modos de triggering scatter y
triggering fluorescencia. (Imágenes 2 y 3).
Las aplicaciones de esta técnica son muy
variadas, debido a la gran diversidad de
partículas en cuanto a tipos y tamaños así como
a los diferentes fluidos con los que el sistema
puede trabajar.
Entre las más importantes, destacamos:
El nuevo procesador digital de señales permite
que el FlowCAM sea más rápido y más fiable
cuando se trabaja tanto
en fluorescencia como en
Scatter. El tiempo de captura
de la imagen ahora es de
25 milisegundos, lo que
equivale a 40 frames/sg. Esto
nos permite ahora manejar
hasta 20 acontecimientos
fluorescentes por segundo.
Podremos medir la anchura
del pulso del acontecimiento
fluorescente.
El rango de detección se
amplía por lo que se pueden
captar
partículas más
pequeñas que despidan
luz
fluorescente
(en
consecuencia una mejor
separación señal/ruido).
Procesamiento de imágenes
capturadas más rápido.
8 IZASALAB 2/2013
Control mejorado de la intensidad de luz y de
la duración del flash, juntado con una fuente
de alimentación más estable, proporciona más
luz uniforme y por lo tanto mejor calidad de la
imagen.
APLICACIONES
CARACTERÍSTICAS
Imágenes 2 y 3.
determine el caudal y/o la concentración óptimos.
Es posible modificar la
frecuencia
de
eventos
permitiendo que el usuario
Química
FlowCAM representa un avance exponencial
en cuanto a la determinación y precisión de
la calidad de las mezclas químicas de baja
viscosidad. Además del contaje, distribución y
datos sobre el diámetro esférico equivalente,
es capaz de determinar la forma exacta de la
partícula, lo que supone una mejora excepcional
del ESD (diámetro esférico equivalente).
Estudios recientes han demostrado que el
conocimiento de la anchura y la longitud de las
partículas en las formulaciones químicas, es de
vital importancia la hora de evaluar la efectividad
del producto. El FlowCAM te da esta información
de inmediato y además de la precisión en la
distribución de las partículas, es también posible
adquirir imágenes de cada una de ellas.
Puede utilizarse para mantener el control de
calidad y para procesos en línea, en los que es
necesario medir el tamaño y la frecuencia de
distribución de estas.
Dentro de las aplicaciones químicas de baja
viscosidad cabe destacar
dispersiones,
Impresiones térmicas, emulsiones y mezclas.
(Imagen 4)
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de la investigación y desarrollo en drogas.
El objetivo prioritario en este campo es el de
conseguir sacar al mercado en el menor tiempo
posible, la mayor cantidad de fármacos efectivos
contra determinadas enfermedades.
En la fase de test, puede funcionar como un
sistema de feedback para la determinación del
tamaño y forma exactos de los materiales y
componentes biológicos.
Calidad en Aguas
Imagen 4.
Oceanografía
FlowCAM ofrece diferentes posibilidades
y aplicaciones en Oceanografía, tanto en
muestreos puntuales como en ensayos
continuos o in situ. Con este equipo, es posible
recoger información de partículas y células de
1 mm a 3 mm en determinadas fracciones de
tiempo, a demás de poder integrar otro tipo de
instrumentación como fluorómetros o monitores
de temperatura y salinidad
Puede incluso ser usado en combinación con
estaciones de medición submarinas para la
monitorización continua de las aguas y estudiar
así cambios en el fitoplancton y en otras
partículas, así como en las condiciones de
temperatura y salinidad.
FlowCAM
es el instrumento ideal, tanto
en laboratorio como en campo, para la
monitorización de aguas costeras, fitoplancton,
acuicultura, etc.
Farmacéuticas
FlowCAM puede desempeñar un papel
fundamental en la industria farmacéutica dentro
En el laboratorio o en campo, FlowCAM es
el equipo de elección ya que puede aportar
información imprescindible en cuanto a la calidad
de las aguas que se desean testar.
Genera información cuantitativa y cualitativa que
puede ser usada para la creación de valores
referenciales que se pueden comparar con los
niveles de algas en disolución o masas extensas
de las mismas en el agua de estudio.
Con la técnica de Spot-checking, FlowCAM es
capaz de encontrar donde se producen cambios
en el entorno acuático y mostrar visualmente los
microorganismos causantes de los disturbios.
Esta información tan útil, obtenida en tiempo real,
ayuda al control de la calidad de las aguas online,
así como a determinar si las modificaciones o
alteraciones puntuales en el entorno acuático
son fruto de eventos accidentales o introducidos.
CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS:
El nuevo Flow Cam viene equipado con una serie
de mejoras que permiten una mayor versatilidad
a la hora de trabajar con diferentes aplicaciones.
• Nuevo procesador digital de señales (DSP).
Hasta 30 veces más rápido que el anterior
procesador.
• Cámara a color de alta resolución.
• Hasta tres canales de fluorescencia y un canal de Scatter con detector por diodo.
• Puertos USB 2.0.
• Procesador Intel Pentium 1.7 GHz, 2 GB
RAM, 60 GB HD.
CONCLUSIÓN
Estamos pues ante un sistema de múltiples
aplicaciones que combina la precisión de la
citometría de flujo con la versatilidad de la
captura de imágenes de hasta 3 mm, lo que
le convierte en el elemento idóneo no sólo
para el estudio de partículas en fluídos sino
incluso para la identificación de especies
vegetales y animales como algas y larvas
marinas.
IZASALAB 2/2013 9
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CIENCIAS DE LA VIDA
Aplicaciones de los sistemas de Acea
Biosciences
ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN
Y VIABILIDAD CELULAR
Es una de las aplicaciones más usadas. Como
ya se ha comentado antes, el índice celular es
proporcional al número de células que hay en
los pocillos en un momento dado. Por lo tanto,
gracias a esta tecnología se puede monitorizar
en tiempo real como está creciendo un cultivo
celular en diferentes condiciones, o bien se
puede estudiar el estado y la calidad de las
células, ya que el valor del índice celular
reflejaría si un cultivo celular tiene problemas de
viabilidad.
CITOTOXICIDAD MEDIADA
POR COMPUESTOS, CÉLULAS
Y MICROORGANISMOS
Es otra de las aplicaciones más usadas. Dado
que la medida del índice celular correlaciona
con el número de células, la morfología celular
y el nivel de adherencia de un cultivo de
células, estos equipos permiten estudiar si un
determinado compuesto y/o microorganismo
afecta de alguna forma a un cultivo celular.
Posteriormente una aplicación del software
permite fácilmente calcular el valor del IC50 y
EC50 de los compuestos.
ADHESIÓN Y EXPANSIÓN CELULAR
La sensibilidad de estos equipos permite medir
fácilmente con alta precisión procesos tan
complejos de monitorizar como la adhesión
celular, la expansión celular o cambios en la
morfología celular.
MIGRACIÓN E INVASIÓN CELULAR
Cell index
Los sistemas de
Acea Biosciences
permiten estudiar
sin necesidad
de marcar o
manipular las
células procesos
tan importantes
como la adhesión,
migración,
invasión o
viabilidad celular.
Gracias al empleo
de la matriz
de electrodos
se pueden
monitorizar
en tiempo real
una serie de
aplicaciones que
tradicionalmente
se basaban
en ensayos de
punto final.
La versatilidad que ofrece la tecnología de
estos equipos se demuestra en las numerosas
aplicaciones que se pueden llevar a cabo, todas
ellas respaldadas por numerosas publicaciones
en las revistas internacionales de mayor impacto.
Entre las aplicaciones más establecidas se
encuentran:
Time (h)
Normalized Cell Index
Cell proliferation curves of four different cell lines
displayed as Cell index of the RTCA SP instrument.
Debido a la dificultad que existe en la
monitorización y cuantificación de los procesos
de invasión y migración, esta aplicación es una
de las que más éxito está reportando a Acea
Biosciences. Para realizar experimentos de
migración e invasión se requiere usar las placas
E-16 CIM (Cellular Migration and Invasion) y el
sistema RTCA DP. A diferencia de los ensayos
tradicionales que utilizan medidas cuantitativas
de punto final, con estos equipos se puede
monitorizar y cuantificar a tiempo real y de
manera muy precisa cómo están migrando las
células o cómo invaden una matriz.
Dose-response curve and IC50 value calculation at 70 hours and 21 minutes.
10 IZASALAB 2/2013
Hours post compound treatment
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MONITORIZACIÓN DE LATIDO
DE CARDIOMIOCITOS
Es la nueva aplicación de Acea Biosciences y
sólo se puede llevar a cabo en el sistema RTCA
Cardio. Debido a la alta frecuencia con la que
este sistema toma las medidas de impedancia,
se puede monitorizar, sin necesidad de marcar o
manipular las células, el latido de cardiomiocitos
en cultivo. Esta aplicación es de gran utilidad
y relevancia en el mundo farmacéutico, ya
que permite saber si un compuesto afecta a la
fisiología cardiaca sin tener que recurrir al Patch
Clamp o a otros sistemas más costosos.
RASTREO MASIVO DE
COMPUESTOS
Quantitatively measure the rate and onset of invasion
MONITORIZACIÓN DE LA
SEÑALIZACIÓN CELULAR
Muchas líneas celulares sufren rápidos y
pequeños cambios en su morfología cuando
se activan ciertos receptores por sus ligandos.
El caso más estudiado son los receptores de
la familia GPCR. Gracias a la sensibilidad de
los sistemas de Acea Biosciences se pueden
estudiar sin necesidad de marcar las células
estos pequeños cambios en la morfología celular,
lo que permite cuantificar de manera muy precisa
cómo determinados compuestos afectan a este
tipo de receptores y a su inmediata respuesta
Value calculation at 70 hours fisiológica.
and 21 minutes.
RTCA HT Plate Stations
E-Plate-384
Los equipos RTCA MP y RTCA HT están
diseñados para adquirir gran cantidad de
datos de impedancia en tiempo real, lo que les
convierte en una fuente de información muy
valiosa para el rastreo masivo de compuestos.
Estos sistemas son especialmente útiles en
el estudio a gran escala de la citotoxicidad de
compuestos. Además el sistema RTCA HT es
fácilmente integrable con todos los robots y
dispensadores de líquidos del mercado.
Compoand
Beating Profile (After Compound Addition)
DMSO
E4031
Astemizole
Cisapride
Integrated into Automation Platform
Droperide
Sertindole
1000 mg
Monitorización de latido de cardiomiocitos.
IZASALAB 2/2013 11
CIENCIAS DE LA VIDA
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Cada célula "cuenta":
Expresión Génica de Célula Única
Hasta la fecha,
los estudios
de perfiles
de expresión
génica se han
llevado a cabo en
poblaciones de
células, donde
los niveles
de expresión
observados
eran más bien
una amalgama
de cada estado
de expresión
individual de
cada una de las
células de dicha
población.
El advenimiento del Análisis de Expresión
Génica de Célula Única ha proporcionado el
camino a nuevas vías de estudio para poder
dilucidar y acceder a las relaciones, hasta el
momento ocultas, de cada célula individual
dentro del grupo de la población.
Existen infinitos campos de estudio que se
pueden beneficiar de este tipo de tecnología.
Tres áreas de investigación que son ya pioneras
en este tipo de técnica son: cáncer, células
madre e inmunología.
PLATAFORMA nCounter - NanoString
La plataforma nCounter de Nanostring y su
Ensayo de Expresión Genética para Célula
Única permite a los investigadores trabajar
con patrones complejos de expresión, hasta
800 genes en simultáneo, convirtiéndola en la
solución ideal para realizar estudios de rutas
(“pathways”) a nivel de célula única.
Rutas biológicas completas y perfiles génicos
a medida pueden ser estudiados de células
individuales, sin la necesidad de encajar en
un formato cerrado de genes, típico de PCRs
microfluídicas.
El
ensayo
de
N a n o S t r i n g
proporciona
una solución de
elevada sensibilidad,
reproducible
y
de
elevado
grado
de
multiplexing de células únicas
o de muestras de tan solo 10 pg de RNA total.
La tecnología patentada que NanoString utiliza
en su sistema nCounter es de detección digital
directa.
En esta tecnología, cada molécula diana viene
identificada por un “código de barras” de seis
unidades de colores. Estos códigos de barras
hibridan directamente con las moléculas diana,
y pueden ser contados individualmente –
proporcionando así datos digitales de una muy
elevada sensibilidad.
El Potencial del Análisis
de Célula Única
Para demostrar como el analizar células
individuales
puede
revelar
diferencias
significativas en perfiles de expresión génica,
que no se ven al estudiar una población celular,
se separaron (mediante “sorting”) Linfocitos T
CD8+ individuales y en pequeñas poblaciones.
Tras llevar a cabo el protocolo de NanoString
para Expresión Génica de Célula Única, se
generó para cada muestra un perfil de expresión
génica de 191 genes con un CodeSet a medida
(“Custom CodeSet”). Los resultados claramente
demuestran que las células individuales
presentan perfiles de expresión diferentes entre
sí, pero que dicha diversidad está enmascarada
en las muestras conteniendo grupos de 10
células, y que prácticamente está oculta por
completo en las muestras conteniendo grupos
de 100 células.
Flujo de Trabajo
Cada molécula de “Código de Barras” se une a una molécula diana individual
y específica. Cada molécula es contada digitalmente.
12 IZASALAB 2/2013
El flujo de trabajo que presenta este tipo
de ensayos en la Plataforma nCounter es
prácticamente el mismo que el ensayo estándar
de Análisis de Expresión Génica de NanoString,
pero con una pequeña modificación inicial.
Se realiza un paso de Enriquecimiento
Mulitplex de Dianas (MTE – Multiplexed Target
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Gene Expression Profile
(191 probes)
1
Cell Number
10
100
Enrichment), el cual permite que los
tránscritos de las células individuales
sean amplificados de manera lineal tras
la transcripción reversa. La técnica de
MTE puede amplificar linealmente hasta
800 genes de una única célula en un
único tubo, sin sesgos. Posteriormente,
el material obtenido se hibrida con el
típico CodeSet de NanoString para
estudiar los genes de interés. Este
protocolo de célula única, no requiere ni
tener que partir y repartir la muestra en
varias reacciones ni tener que realizar
pasos de limpieza intermedios. Tras la
hibridación, las muestras son procesadas
de forma completamente automática por
la Prep Station y el Analizador Digital, tal
y como se hace con el ensayo estándar
de Expresión Génica.
Elevada Sensibilidad con
Respuesta Lineal
Para comprobar la linealidad del
protocolo, se llevó a cabo un estudio
donde se realizó un MTE con 800 parejas
de primers con 100 pg de RNA total de
cerebro y con 100 pg de RNA total humano
de referencia. Se calcularon los cambios
de expresión para todas aquellas sondas
que presentaban detección significativa,
y se compararon contra los cambios de
expresión en esas mismas muestras sin
amplificación MTE.
Los resultados obtenidos son una
correlación 1:1 entre dichos ensayos,
demostrando la amplificación simultánea
y sin sesgos de cientos de transcritos diana a
la vez, con el protocolo nCounter de Expresión
Génica de Célula Única.
Así pues, el ensayo de Expresión Génica de
Célula Única nCounter permite:
• Más Genes. Análisis de hasta 800 genes en
simultáneo.
• Alta Sensibilidad. Elimina el reparto de
muestra entre varias reacciones y minimiza
la amplificación necesaria, obteniéndose mejores resultados de cada célula.
• Contaje Digital. Determina cambios fraccionarios de expresión génica, eliminando la variabilidad de datos analógicos.
• Alta productividad. Análisis de cientos de
muestras al día.
IZASALAB 2/2013 13
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14 IZASALAB 2/2013
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IZASALAB 2/2013 15
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MICROSCOPÍA ÓPTICA
Nuevos microscopios estereoscópicos Nikon
SMZ25 y SMZ18
Nikon presenta
la nueva gama
de microscopios
estereoscópicos
de alta gama
SMZ25 y SMZ18.
Con el lanzamiento
de estos dos
microscopios
Nikon se pone a la
cabeza en cuanto
a prestaciones
en microscopía
estereoscópica.
Microscopío Nikon SMZ25.
SMZ25: potencia y flexibilidad
El nuevo microscopio SMZ25 con su increíble
rango de zoom de 25:1 (0.63x – 15.75x) permite
la visualización de Placas de Petri de 35 mm
enteras con el objetivo Plan Apo 1x a zoom
mínimo.
El sistema de zoom del bloque óptico “Perfect
Zoom System”, al cambiar dinámicamente
la distancia entre los dos ejes ópticos del
microscopio permite elevados rangos de zoom y
la maximización de la cantidad de luz que entra
en el sistema.
Ambas vías ópticas, de tipo apocromático,
permiten obtener la misma resolución en ambos
oculares. Con el objetivo Plan Apo 2x es posible
obtener una Apertura Numérica a máximo zoom
de 0.321 o lo que es lo mismo una resolución de
1.100 líneas / mm.
Cuando se cambia entre un objetivo y otro en
el revólver doble el zoom del bloque óptico se
16 IZASALAB 2/2013
ajusta automáticamente para que el campo visual
sea el mismo. Esto permite la visualización de
organismos a bajos y altos aumentos de forma
continua sin interrupciones.
El microscopio SMZ25 permite la obtención de
imágenes en epi-fluorescencia más brillantes que
nunca gracias a la lente “Fly Eye” que asegura un
brillo uniforme en todo el campo visual (incluso a
bajos aumentos) y al nuevo diseño óptico que
permite una mejora significativa en la relación
señal/ruido del sistema.
La nueva base diascópica LED ultrafino P2-DBL
permite la obtención de imágenes altamente
contrastadas de muestras transparentes gracias
a su sistema de iluminación OCC (Oblique
Coherent Contrast Illumination).
Todos los componentes del equipo están
motorizados y pueden manejarse fácilmente a
través de un teclado control remoto o a través del
software NIS-ELEMENTS. Esto permite la puesta
en marcha de experimentos multidimensionales.
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Live zebrafish expressing
GFP- and RFP-neurons.
SMZ18: magnífica relación
calidad/precio
El microscopio SMZ18, con un rango 18:1
permite la obtención de imágenes desde 7.5 a
135 aumentos con el objetivo Plan Apocromático
1x.
Comparte con la SMZ25 los diferentes accesorios
de epifluorescencia, bases diascópicas LED
o motorizaciones. Permite la motorización
del módulo de epi-fluorescencia o el eje Z.
Adicionalmente la información de factor de zoom
en uso del microscopio se transmite al teclado
de control remoto o al software NIS-ELEMENTS
por lo que la realización de experimentos
multidimensionales automatizados con este
microscopio también es posible.
Nuevos objetivos Plan
Apocromáticos SHR
Los objetivos Plan Apo SHR (Super High
Resolution), diseñados específicamente para
estos dos microscopios poseen una total planitud
y superior corrección cromática desde el centro
hasta la periferia del campo visual. Permiten el
trabajo con longitudes de onda desde 380 hasta
700 nm.
El objetivo Plan Apo SHR 1x posee una Apertura
Numérica máxima de 0.156 (SMZ25) o 0.15
Zebrafish (GFP and OCC)
(using SHR Plan Apo 2x
at zoom magnification of
15.75x with SMZ25).
2 days old Transgenic Zebrafish embryo, Tg (isl1-GFP)
(using SHR Plan Apo 1x at zoom magnification of 6x
with SMZ25).
(SMZ18) a máximo zoom. Posee una distancia
de trabajo de 60 mm.
El objetivo Plan Apo SHR 2x, con una Apertura
Numérica máxima de 0.321 y una distancia de
trabajo de 20 mm, posee un anillo de corrección
para agua entre 0 y 3 mm. Permite ver estructuras
de unas pocas micras, imposibles de ver hasta
ahora en un microscopio estereoscópico.
Estos objetivos al ser instalados sobre un
revólver doble son siempre parfocales,
independientemente de la combinación de
objetivos utilizada. El revólver doble posee
dos posiciones: la posición “stereoscopic view”
permite ver las muestras en estereoscopía;
en la posición “on-axis view” el objetivo es
trasladado lateralmente para obtener imagen
únicamente a partir de una de las dos vías
ópticas del microscopio. De esta forma se mejora
sustancialmente la calidad de las imágenes
tomadas mediante cámaras digitales.
IZASALAB 2/2013 17
ELECTROFORESIS CAPILAR
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Análisis de aniones y cationes
por electroforesis capilar
La electroforesis
capilar (CE) es
una tecnología de
separación que
destaca por su
capacidad para
proporcionar
una separación
cuantitativa y de
alta resolución
de analitos con
carga empleando
una plataforma
automatizada.
Cuando se introdujo la electroforesis capilar
por primera vez se consideró una técnica
revolucionaria. En la actualidad, juega un
papel importante como técnica analítica bien
establecida en laboratorios de todo el mundo.
Principio de funcionamiento de la electroforesis capilar.
La electroforesis capilar ofrece separaciones
muy eficientes, tiempos de análisis cortos y
consumo mínimo de disolventes y reactivos en
comparación con otras técnicas separativas.
Algunos ejemplos de áreas de aplicación donde
se utiliza la electroforesis capilar incluyen
caracterización de pureza y heterogeneidad de
Detección indirecta de iones empleando luz UV.
18 IZASALAB 2/2013
productos bioterapéuticos, análisis de glicanos y
control de bioprocesos.
La electroforesis capilar se debe considerar en
primer lugar como técnica separativa cuando
se trata de analitos altamente polares, con
carga o quirales. Los aniones y cationes,
por ejemplo ácidos orgánicos y aminas
alifáticas, son especies polares con
carga que se adaptan muy bien a las
características de la electroforesis capilar.
Los métodos más robustos para análisis
de aniones y cationes se basan en el
uso de capilares de sílice fundida con
un recubrimiento interno dinámico para
modular el flujo electroosmótico.
Dado que muchas moléculas pequeñas
no absorben luz UV, el método primario
de detección es indirecto, añadiéndose un
cromóforo que absorbe UV al electrolito
de fondo. Cuando pasa el analito por el
detector, se observa una disminución en la
absorbancia, permitiendo la detección.
Ya sea en análisis de contraiones, bebidas
o aplicaciones industriales, los kits para
análisis por electroforesis capilar proporcionan
resultados robustos incluso cuando se manejan
diferentes matrices de muestra. Tan solo se
necesita una pequeña cantidad de muestra y,
generalmente, se requiere solo una pequeña
preparación de la misma.
Las ventajas del uso de kits de análisis incluyen
detección rutinaria de más iones, tiempos
de análisis más cortos y menor tiempo de
preparación de muestra previa a cada análisis.
Estos kits son genéricos, resultando en menores
tiempos de desarrollo de métodos.
En la fase de desarrollo de un nuevo fármaco,
uno de los puntos más importantes es la correcta
asignación de peso molecular al compuesto
bajo estudio. La fórmula de la mayoría de los
medicamentos no se puede determinar de forma
exacta sin antes haber cuantificado el contraión.
Compuestos básicos pueden tener una sal
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Separación de ácidos orgánicos.
Separación de aniones.
Los kits de Beckman Coulter incluyen todos los
reactivos necesarios e instrucciones detalladas para la
puesta a punto de cada método.
inorgánica o un ácido orgánico como contraión,
mientras que compuestos ácidos pueden tener
un catión metálico. Las agencias regulatorias,
como la FDA o la European Pharmacopoeia,
requieren que los productos farmacéuticos estén
caracterizados en cuanto a identidad, fuerza,
calidad y pureza de sus ingredientes activos e
inactivos. Por lo tanto, el análisis de contraión
es una parte importante de la determinación de
pureza de un producto farmacéutico.
Los kits permiten el análisis de compuestos
en un amplio rango de polaridades, y se
pueden procesar bibliotecas de compuestos
para determinar el contenido de contraión en
ausencia de datos de solubilidad.
Separación de cationes.
Los kits de aniones y cationes están
específicamente formulados para su uso
en sistemas Beckman Coulter P/ACE MDQ
configurados con detector UV. Están diseñados
para análisis de concentraciones de iones en
el rango 1—100 ppm. Mayores sensibilidades
solo son posibles bajo condiciones especiales.
Típicamente, se consigue un %CV del 1% en
tiempo de migración.
Para el análisis de iones se recomienda el
sistema P/ACE MDQ con refrigeración del
capilar por líquido y detección UV. El P/ACE
MDQ admite una variedad de formatos de
muestra, incluyendo placas de 96 pocillos, lo
que le hace compatible con muchos sistemas de
automatización de laboratorio.
El P/ACE MDQ se puede emplear también
para análisis de compuestos quirales, fármacos
básicos, determinación de pKa, análisis de
pureza de ácidos nucleicos, y muchas otras
aplicaciones.
Sistema de Electroforesis Capilar P/ACE MDQ
de Beckman Coulter.
IZASALAB 2/2013 19
ESPECTROMETRÍA / FTIR
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Nuevo espectrómetro infrarrojo por
transformada de fourier
IRTracer-100 de Shimadzu:
"El FTIR de gama media con mejor relación señal ruido en su clase"
El Espectrómetro
FTIR IRTracer-100
es un sistema
FTIR de gama
media con un
alto rendimiento
de trabajo
que incluye el
mejor nivel de
sensibilidad de su
clase (relación S/N
de 60,000:1) una
alta resolución
(0,25 cm-1) y
gran velocidad
de medida.
Su alto rendimiento significa que se puede
usar en análisis sofisticados por FTIR tales
como la medida con gran sensibilidad de microcontaminantes, el seguimiento de reacciones
químicas rápidas o medir semiconductores u
otros materiales con precisión.
Para asegurar ese alto rendimiento y su
mantenimiento de forma estable, cuenta con
un interferómetro con alineación dinámica
avanzada (ADA, patente de Shimadzu) y un
deshumidificador que ioniza la humedad;
además, se han mejorado las especificaciones
de hardware y software.
Usando el IRTracer-100 en combinación con el
nuevo software LabSolutions IR, desarrollados
conjuntamente, poder utilizar plenamente esa
capacidad y alto rendimiento del sistema es fácil
y sencillo.
CARACTERÍSTICAS
DEL HARDWARE
• Relación S/N de 60,000:1 que indica el rendimiento del sistema. Por tanto, puede medir
20 IZASALAB 2/2013
espectros de muestras con muy bajo nivel de
concentración y con niveles de ruido bajos.
• Su resolución máxima de 0,25 cm-1 le permite medir no sólo muestras sólidas y líquidas, sino también gaseosas con estructura
rotacional fina.
• Su divisor de haz es reemplazable por el
usuario y su interferómetro optimiza su señal
mediante control de ordenador; esto significa
que no son necesarios ajustes manuales
de usuario. El interferómetro se ajusta mediante un mecanismo de alineación dinámica
patentado ADA para mantener la interferencia
óptima no sólo después de la sustitución del
divisor de haz, sino además mientras la alimentación está encendida o durante los análisis.
• El interferómetro está sellado y tiene un divisor de haz de KBr revestido con un material
a prueba de humedad así como un deshumidificador incorporado que por ionización electrostática le mantiene deshumidificado. Además, el mantenimiento es extremadamente
fácil debido a que el divisor de haz se puede
quitar del interferómetro manualmente por el
usuario y almacenarlo en un desecador.
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•
•
•
Resolución máxima 0,25 cm-1.
• El equipo cuenta también con un mecanismo
de reconocimiento automático de accesorios, que detecta el tipo y número de identificación de los accesorios que se instalan en
el compartimento de la muestra y optimiza los
parámetros de medida para cada accesorio
dado. Esto permite que cualquier persona trabaje con el sistema.
• Se mantiene un registro de la fuente IR y
del tiempo de utilización del láser; cuando
se están acercando a las inspecciones programadas se visualiza un aviso procurando
que el mantenimiento sea extremadamente
fácil.
CARACTERÍSTICAS
DEL SOFTWARE
• Gracias a su rápida velocidad de procesamiento y conversión de Fourier, los espectros
se visualizan durante las medidas en tiempo
real.
• El software LabSolutions IR que se utiliza
para controlar el IRTracer-100 es rápido, fácil de usar y trabaja en entorno Windows 7
Prof. de 32-64 bits. Tiene una amplia funcionalidad en el proceso de datos que incluye
análisis cuantitativo y cualitativo (búsqueda
espectral) como característica estándar. Se
pueden crear Informes sencillos en base a lo
que se muestra en la pantalla o bien crear informes libremente con cualquier diseño especifico del usuario. Además, se pueden utilizar
otras aplicaciones de Windows para generar
informes con un formato fijo.
• El trabajo se realiza a través de programas
macro, por lo que los espectros se pueden
medir, detectar las bandas, e incluso imprimir los resultados, simplemente siguiendo las
instrucciones que aparecen en pantalla. Incluso los usuarios más profanos pueden utilizarlo fácilmente.
• Se pueden generar rutinas de trabajo a medida mediante la disposición de una serie de
•
•
operaciones de uso frecuente que se registran como un programa macro.
La función de corrección atmosférica elimina
automáticamente la humedad del agua, CO2,
o de otros picos de interferencia, lo que elimina la necesidad de instalar una función de
purga.
Dispone de un programa específico de análisis de contaminantes que permite el análisis cualitativo de muestras con contaminantes desconocidos.
El LabSolutions IR contiene una biblioteca
con más de 10.000 espectros de reactivos
de uso general, polímeros, pesticidas, aditivos alimentarios y contaminantes que permite el análisis inmediato de tales sustancias.
Para ayuda a la validación del sistema, el
LabSolutions IR incluye también macros para
el cumplimiento de estándares europeos, chinos y japoneses bien farmacopea o requisitos de ASTM, que simplifica las inspecciones
FTIR.
El software incluye una función de auditoría que examina a fondo la funcionalidad del
software y su seguridad: nombre de usuario
/ contraseña de entrada y registros de operaciones. Además, almacena los datos de
origen incluyendo los interferogramas de la
muestra y referencia antes de la transformación de Fourier y permite el procesamiento de
datos de registros de la historia y firma electrónica para cumplimiento de GLP / GMP y
FDA 21 CFR Part 11.
CAPACIDAD DE EXPANSIÓN
• Las fuentes de luz IR, los divisores de haz y
los detectores se pueden conifugurar en intercambiar permitiendo ampliar el intervalo espectral de medida desde el NIR al FIR ambos
inclusive. Las muestras se pueden medir en
la región del infrarrojo cercano sin diluir permitiendo reducir el tiempo de muestreo.
• El IRTracer-100 tiene un gran compartimiento de muestra de uso general que permite utilizar accesorios de medida de reflectancia difusa y de muchos otros tipos permitiendo el
análisis en gran variedad de aplicaciones.
• El IRTracer-100 permite la salida de la luz IR
a otros dispositivos, habilitando la conexión
del microscopio AIM-8800 y el uso de ambos
sistemas libremente. Cambio de los haces de
luz IR se ejecuta fácilmente utilizando el software LabSolutions IR.
• Uso del programa opcional de registro temporal (Time Course) se pueden analizar procesos de reacción basados en el espectro infrarrojo. Utilizando el programa opcional de
escaneo rápido se pueden rastrear reacciones rápidas que sólo duran unos pocos minutos.
IZASALAB 2/2013 21
ESPECTROMETRÍA / MASAS FAST GCMS/MS
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Análisis de pesticidas por FAST GCMS/MS
Los niveles de
residuos de
plaguicidas, que
pueden aparecer
en pequeñas
cantidades en
los cultivos
cosechados,
deben ser tan
bajos como
sea posible
por razones de
protección de los
consumidores.
Por ello, la
Comisión Europea
especifica los
niveles máximos
de residuos
(LMR) para todos
los alimentos
y piensos [1].
El LMR indica el nivel máximo de residuos
permitido de pesticidas y se almacena en la
base de datos de LMR [2].
Si el LMR no se menciona específicamente, se
aplica un valor de LMR por defecto de 0,001 mg
/ kg.
PARTE EXPERIMENTAL
El conocido método de pretratamiento de
muestra QuEChERS, se utilizó para el
tratamiento previo de las muestras de frutas y
verduras. En comparación con los métodos
usados previamente, QuEChERS reduce
drásticamente la complejidad de la preparación
de la muestra para obtener rápidamente el
extracto final para el análisis. Por otro lado, los
extractos inyectables obtenidos por QuEChERS
dan lugar a numerosas señales de matriz.
El uso de instrumentos de triple cuadrupolo
selectivos reducirá al mínimo la superposición
de picos de matriz. Además, los instrumentos
rápidos MS / MS permiten la adquisición de
MRM y espectros de masas en un único análisis,
lo que conducirá a la mayor fiabilidad posible en
la evaluación de residuos de plaguicidas.
El tiempo de análisis se puede reducir con
el uso de FASTGC. El uso de columnas de
calibre estrecho hace que sea posible reducir
considerablemente el tiempo de análisis,
mientras que, al mismo tiempo, permita
mantener la resolución cromatográfica.
Equation 1:
QS ~ dc3
Qs ~ df
QS: Column capacity,
dc: Inner diameter (ID) of the column,
df: Film Thickness of the column.
Un efecto secundario favorable es el aumento
de la sensibilidad, debido a que los picos salen
más estrechos debido al menor diámetro interno
de las columnas.
La capacidad de muestra de una columna
depende del diámetro interno y el espesor
de la película de la columna (ecuación 1). A
partir de la ecuación se hace evidente que la
capacidad de una columna es proporcional
a la tercera potencia del diámetro interno.
Cuando se analizan muestras con matrices
muy abundantes, la capacidad de la columna
se convierte en un parámetro importante. Por
lo tanto como compromiso de columna rápida,
se seleccionó la columna Restek Rxi-5Sil MS
(L = 20 m, dc = 0,15 mm, df = 0,15 micras). En
esta columna se acelera el tiempo de análisis
y proporciona la suficiente capacidad para la
separación de muestras reales.
RESULTADOS
Después de la optimización del método, más de
50 pesticidas podrían ser separados en menos
de 12 minutos. En esta columna, las anchuras
de los picos en FWHM (anchura total a la mitad
de altura) son entre 0,7 y 0,8 segundos. El
tiempo entre un punto de datos a otro (intervalo
de tiempo) se establece en 0,1 segundos. Se
utiliza una velocidad de barrido de 20.000 amu
/ s.
El sistema patentado Advanced Protocolo
Velocidad de escaneado (ASSP) asegura que no
hay distorsión espectral ni pérdida de intensidad
a velocidades tan altas de barrido. La celda
de colisiones CID única de Shimadzu, permite
hasta 600 transiciones MRM por segundo sin
efecto memoria.
Ecuación 1.
Fig 1: TIC del análisis por MRM / Full-Scan de una muestra de pera..
22 IZASALAB 2/2013
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TIC full spectra:
Spectral confirmation in combination with LRI for
precise target analysis, to minimize false positive or
false negative results.
Additional qualitative non-target information.
MRM:
Quantitative target analysis provides highest
sensitivity and selectivity.
Fig.2: Tanto la información MRM como la Full-Scan se
muestran en la misma ventana.
Las curvas de calibración lineal para los 52
pesticidas se registraron en el intervalo de 0,1
ng / ml a 100 ng / ml, con una transición de
cuantificación. Además, se obtuvo una transición
MRM referencia.
La Tabla 2 muestra los resultados para muestras
de pera.
Name
Tabla 2: resultados para
muestras de pera.
Concentration
(ppb)
Diphenylamine
227.49830
Cadusafos
79.77332
Diazinone
29.75388
Phthalide
27.88969
Cypronidil
314.96069
Folpet
428.61754
Fludioxonil
194.94226
Hexazinone
1.06163
Phosmet
93.51728
Boscalid
226.29339
CONCLUSIÓN
Los resultados del método desarrollado para
GCMS/MS muestran que , incluso utilizando
columnas de pequeño diámetro interno,
específicas para FASTGC, se puede
obtener información fiable y robusta gracias
a la utilización de la información procedente
del MRM y del Full-Scan, en un solo análisis.
La información de MRM se utiliza para la
medida cuantitativa con gran selectividad
y sensibilidad, mientras que el modo FullScan permite la identificación cualitativa,
incluso puede utilizarse la información de
LRI, para una mejor identificación de los
compuestos, y todo esto en un análisis de
menos de 12 minutos.
Literature
[1] http://ec.europa.eu/food/plant/protection/pesticides/explanation_pesticide_residues.pdf
[2] http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm
IZASALAB 2/2013 23
ESPECTROMETRÍA / MASAS UHPL-MS / MS
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Analísis multiresiduo por UHPLC-MS/MS
de 210 pesticidas
en alimentos
Los plaguicidas y
sus metabolitos
son de gran
interés para
la sociedad,
ya que son
perjudiciales para
la salud humana,
contaminan los
recursos naturales
y perturban el
equilibrio del
ecosistema.
Por ello, las normas más estrictas de seguridad
alimentaria se están aplicando en todo el mundo,
y se presiona a los laboratorios de análisis de
plaguicidas para expandir la lista de plaguicidas
específicos, detectar analitos a niveles más
bajos y con mayor precisión, reducir los tiempos
de respuesta de análisis, y al mismo tiempo
mantener o reducir costos.
En este estudio se desarrolló un método con
éxito para la cuantificación de 210 pesticidas
comúnmente analizados en las muestras de
alimentos utilizando el Nexera UHPLC y LCMS8040. La validación inicial se realizó para
demostrar las capacidades del instrumento.
Los límites de detección (LOD) del 90% de los
compuestos fueron menos de 0.001 mg/kg (1
ppb), y todos los compuestos fueron menos de
0,01 mg/kg (10 ppb), tanto para las transiciones
cuantitativas como las de referencia utilizando
sólo 2 μl de inyección.
La repetibilidad en el nivel de 0.01 mg/kg
fue típicamente menor que 5 % RSD y los
coeficientes de correlación eran típicamente
mayor que 0.997 en una variedad de extractos
de alimentos estudiados. En consecuencia, el
LCMS-8040 es ideal para el control rutinario de
pesticidas por debajo del nivel de 0.01 mg/kg,
valor por defecto establecido por la legislación
europea y japonesa.
INTRODUCCIÓN
Residuos de plaguicidas en los alimentos siguen
siendo el blanco de los estudios debido a la
incertidumbre sobre los efectos adversos que
estos residuos puedan tener sobre la salud
humana después de una exposición prolongada
a bajos niveles. Más de 1.000 ingredientes
activos se han utilizado y se formulan en
miles de diferentes productos comerciales.
Ellos incluyen una variedad de compuestos,
principalmente insecticidas, herbicidas y
fungicidas, así como sus metabolitos, con
muy diferentes características físico-químicas
y con grandes diferencias en la polaridad, la
volatilidad y persistencia. Por consiguiente, con
el fin de garantizar la seguridad alimentaria para
los consumidores y para facilitar el comercio
internacional, los organismos reguladores
de todo el mundo han establecido límites
máximos de residuos (LMR) de plaguicidas en
los productos alimenticios, es decir, la cantidad
máxima de residuos de plaguicidas y sus
metabolitos tóxicos que se podría esperar en un
producto bajo buenas prácticas agrícolas.
24 IZASALAB 2/2013
En la Unión Europea la regulación 396/2005/
EC se implementó en 2008, con la armonización
de LMR de plaguicidas en todos los Estados
miembros de 435 sustancias activas plaguicidas
en 378 matrices. Esta regulación de la UE se
aplica a plaguicidas usados tanto en la actualidad
y como anteriormente en la agricultura dentro o
fuera de la UE. Para los plaguicidas y alimentos
que no figuran en la regulación de un LMR se
aplica por defecto el valor de 0,01 mg/kg (Art
18 (1b) del Reglamento Unión Europea n º
396/2005).
En general, los LMR en la regulación alimentaria
europea se encuentran en la rango de 0,01 a 10
mg/kg en función de la combinación de pesticidas
de productos básicos, con los niveles más
bajos establecidos para plaguicidas prohibidos.
Para las verduras, frutas y cereales destinados
a la producción de alimentos para bebés, la
Directiva 2006/141/CE establece que alimentos
para bebés no contiene niveles detectables de
residuos de plaguicidas definidos como <0.01
mg/kg y prohíbe el uso de ciertos plaguicidas
muy tóxicos en la producción de alimentos para
lactantes y establece los LMR aún más bajos
para algunos otros pesticides.
En EE.UU., las tolerancias para más de 450
pesticidas y otros ingredientes que se indican en
el Código electrónico de Regulaciones Federales
(EE.UU. Agencia de Protección Ambiental de
la Oficina de Programas de Pesticidas) y se
hacen cumplir por el sistema de lista positiva de
los EE.UU. FDA. En Japón la lista de residuos
químicos agrícolas en alimentos, introducida en
2006, contiene más de 400 LMR de plaguicidas
en diversas matrices. China publicó el estándar
nacional GB 2763-2005 en 2005 y, más
recientemente, GB 28260 hasta 2011 que se
introdujo en 2012 y especifica 181 LMR de 85
pesticidas en alimentos.
En consecuencia, los laboratorios de análisis
de plaguicidas están bajo una creciente
presión para expandir la lista de plaguicidas
específicos, detectar analitos a niveles más
bajos y con mayor precisión, reducir los
tiempos de respuesta de análisis, reducir el
uso de disolventes peligrosos y mantener o
reducir los costos.
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LCMS-8040.
Nexera.
Los
residuos
de
plaguicidas
tradicionalmente se analizaron por
métodos de GC basados a menudo
con detección MS. Sin embargo,
muchos compuestos modernos (semi)
polares y / o compuestos iónicos no
se pueden analizar de esta manera
debido a la pobre estabilidad térmica
o la poca volatilidad. Mejoras recientes en la
cromatografía líquida, espectrometría de masas
en tándem, combinado con las desventajas
comentadas de GCMS, han hecho que LCMSMS
se haya convertido en una técnica vital.
Reglamento Federal Parte 136, utilizando una
desviación estándar de 7 réplicas en matriz de
pera.
En este trabajo, se discute el desarrollo de un
método multiresiduos de plaguicidas para 210
plaguicidas utilizando el Nexera UHPLC y el
LCMS-8040. Los pesticidas fueron añadidos en
la matriz alimentaria (lechuga, pera y fruta seca)
seguida de la preparación de la muestra por
QuEChERS. El método se evaluó en la matriz
para asegurar que los límites de información
necesarios se obtuvieron de acuerdo con las
diversas directrices reguladoras en todo el
mundo, con una precisión aceptable, además
de asegurar la resolución cromatográfica de los
isómeros de plaguicidas con transiciones de
SRM idénticos.
Con el fin de tratar de evitar las interferencias
de las transiciones de SRM de la matriz, los
iones de productos superior a m / z 100 fueron
seleccionados cuando fue posible, ya que son
típicamente parámetros de MS específicos de
analito.
EXPERIMENTAL
Los pesticidas se obtuvieron de la Agencia de
Alimentos y Medio Ambiente, Reino Unido, a
una concentración de 0,01 mg/kg (para cada
pesticida) en acetona: acetonitrilo 01:01. La
linealidad se investigó sobre una calibración de
nueve puntos con muestras que van desde 0,5
μg/kg - 0,2 mg/kg (0,5 a 200 ppb) y se analizaron
por duplicado, las muestras de calibración se
inyectaron una vez en orden creciente y una vez
en orden decreciente. La linealidad se evaluó
con cuatro curvas de calibración preparadas por
dilución en serie de:
(1) acetonitrilo
(2) el extracto de fruta seca
(3) extracto de lechuga
(4) extracto de pera
La repetibilidad de área instrumental se
determinó por replicas (n = 6) de inyección de la
matriz de pera a 0,01 mg/kg. Los disolventes de
la fase móvil del LC-MS y aditivos eran todas de
calidad LC-MS y adquiridos de Sigma-Aldrich.
Los extractos de alimentos fueron suministrados
por la Agencia de Alimentos y Medio Ambiente,
Reino Unido, siguiendo los protocolos
establecidos QuEChERS.
Los límites de detección de los plaguicidas se
calcularon basándose en el método descrito
por la US-EPA en el Título 40 del Código del
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Optimización SRM
Los iones precursores y productos fueron
seleccionados en base a las recomendaciones
de la Agencia de Alimentos y Medio Ambiente,
Reino Unido, y los datos de la EURL DataPool.
Normalmente la molécula protonada o
desprotonada se utilizó para el ión precursor.
Los patrones de plaguicidas se colocaron en el
muestreador automático, a partir de donde se
inyectan rápidamente en la MS, cada compuesto
se optimizó en pocos minutos utilizando el
software automatizado previsto en LabSolutions.
Esto permitió que un gran número de compuestos
fueran optimizados durante la noche, lo que está
en marcado contraste con la optimización por
bomba de infusión, usada habitualmente.
Los compuestos estudiados y su transición
asociados se muestran en la Tabla-1.
Evaluación rápida de la respuesta de la señal
según diferentes composiciones de fase
móvil
La intensidad de la señal en LCMS puede estar
fuertemente influenciada por la composición de
la fase móvil. Con el fin de optimizar la intensidad
de la señal, se añadieron pesticidas en viales
que contienen diferentes composiciones de fase
móvil y se inyectaron sin columna.
El muestreador automático Nexera fue
programado para inyectar un espacio de aire
tanto antes como después de la muestra
inyectada con el fin de evitar que la muestra se
mezcla con la fase móvil. Este enfoque permite
un gran número de composiciones de fase
móvil potenciales que se analizan en un período
corto de tiempo y sin la necesidad de cambiar
manualmente las fases móviles. Diez diferentes
composiciones de fase móvil se pusieron a
prueba, incluyendo: acetato de amonio, formiato
de amonio, ácido fórmico, ácido acético, y
formiato de amonio con ácido fórmico en agua:
metanol o acetonitrilo 1:1. Se evaluaron un total
de 23 plaguicidas diferentes, seleccionados para
incluir una gama de diferentes polaridades y en
ambos modos positiva y negativamente.
IZASALAB 2/2013 25
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Las diferentes fases móviles probadas y su
respuesta se muestran en la Tabla 2.
Como era de esperar con los métodos para
residuos múltiples, no había una fase móvil
óptima para todos los plaguicidas. En general,
la señal más baja se consiguió para las fases
móviles que contienen agua: metanol solo, y la
fase móvil que contiene agua: acetonitrilo acetato
de amonio 10 mM. Los compuestos de ionización
negativa (fludioxinil y ioxinilo) dieron respuestas
superiores en agua: metanol, acetato de amonio
10 mM, mientras que la adición de ácido fórmico
o ácido acético disminuye la respuesta.
Las señales más elevadas se encuentran
típicamente en 10 mM de formiato de amonio,
acetato de amonio 10 mM, y formiato de amonio
10 mM con ácido fórmico al 0,1%. También se
investigó el efecto de metanol y acetonitrilo en la
fase móvil. Comparación de formiato de amonio
10 mM en metanol y acetonitrilo mostró que las
intensidades eran típicamente más baja con
el uso de acetonitrilo. Del mismo modo el uso
de acetato de amonio en metanol y acetonitrilo
presentó la misma tendencia.
Figura 1.
(A) 3 μL pear extract injection without the POISe
Optimización de la secuencia de inyección
En UHPLC de fase reversa, los compuestos que
eluyen primero muestran normalmente cierta
deformación. La distorsión de los picos es un
problema particular en el análisis de plaguicidas
ya que las muestras se extraen típicamente por
QuEChERS, diluidas en 100% de acetonitrilo
(un disolvente de elución fuerte). Para resolver
este problema, los laboratorios pueden decidir
diluir los extractos de acetonitrilo en agua antes
de la inyección LCMS. Sin
embargo, esto agrega un paso
adicional de preparación de
la muestra y la dilución en el
agua también pueden afectar
negativamente a la estabilidad
de algunos analitos.
(B) 3 μL pear extract injection without the POISe (30 μL water)
26 IZASALAB 2/2013
Para minimizar la dispersión
de pico con la inyección de
extractos de acetonitrilo, una
solución potencial es el uso
de un la técnica de banda
de compresión. La banda
se consigue mediante la
inyección de un disolvente de
débil elución en la columna
después de los analitos. A
medida que el analito y el
disolvente de elución débil
viajan hacia la columna, se
produce el mezclado. Por lo
tanto, los analitos se disuelven
en un disolvente de elución
débil cuando llegan a la
columna, que conduce a la
compresión de los analitos en
cabeza de columna.
La secuencia de inyección para optimizar el
rendimiento se evaluó mediante la inyección de
entre 5 - 40 μl de agua después de una inyección
de 3 μl de extracto de pera en acetonitrilo
100 %. Esto se logró utilizando el muestreador
automático (SIL-30AC) programa de pretratamiento para llevar a cabo esta función.
La Figura 1 muestra la inyección de extracto
de pera con y sin la secuencia de inyección.
La dispersión de banda se minimiza
considerablemente en los plaguicidas de elución
temprana, con anchos máximos reducidos en un
5-69 %. Se encontró que la cantidad óptima de
agua para inyectar después de la muestra es de
30 μl. El aumento de este volumen de
40 μl no proporcionó ninguna mejora significativa.
Compuestos de elución temprana se ven
afectados por la inyección de una banda de
disolvente de elución débil en un grado mucho
mayor en comparación a los analitos con los
factores de retención más altos.
Esta mejora se debe a la reducción en la muestra
de la fuerza disolvente de elución, el cual tiene
un gran impacto en los compuestos de elución
temprana. Se observa que los analitos con
tiempos de retención más altos experimentarán
algún grado de compresión de banda en la fase
móvil.
La Tabla 3 muestra la anchura de pico para
11 compuestos de elución temprana. Los
compuestos se organizan en orden de tiempo de
retención para mostrar la mejora de los analitos
que eluyen primero.
Optimización del gradiente UHPLC
Basándose en los resultados de la investigación
de la fase móvil, fueron probadas: 1) formiato de
amonio 10 mM, 2) acetato de amonio 10 mM y 3)
de formiato de amonio 10 mM con ácido fórmico
al 0,1%. La separación se realizó usando un
Shim-pack XR-ODS III, 2,0 x 150 mm, tamaño
de partícula 2,2 micras. Se encontró que la fase
móvil de formiato de amonio tiene el compromiso
más eficaz para los 210 compuestos en términos
de relaciones de señal a ruido y formas de los
picos.
Sin embargo, se observaron dos problemas
con formiato de amonio; elución temprana de
asulum y mala forma de pico de propamocarb.
Por consiguiente, se ensayó el ácido fórmico
0,01 % y se encontró que aumenta la retención
de asulum, y mejorar la forma del pico de
propamocarb. El empleo de un gradiente de
16 minutos dio lugar a una resolución superior
a 1 entre todos los plaguicidas, incluyendo:
butocarboxim sulfóxido / aldicarb sulfóxido,
sulfona etiofencarb / methiocarb sulfona, diurón
/ fluometronsulam y desmedifam / fenmedifam.
Figura 2 destaca las excelentes formas de los
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Peak width (min)
No.
Compound
Without
POISe
With
POISe
Peak
width
change
(%)
1
Methamidophos
1.193
0.466
-60.9
2
Propamocarb
0.937
0.473
-49.5
3
Omethoate
0.773
0.247
-68.0
4
Butocarboxim
sulfoxide
0.664
0.205
-69.1
5
Aldicarb sulfoxide
0.545
0.195
-64.2
6
Dinotefuran
0.460
0.247
-46.3
7
Oxamyl
0.317
0.248
-21.8
8
DMPF
0.309
0.254
-17.8
9
Demeton-S-methyl
sulfoxide
0.418
0.271
-35.2
10
Demeton-S-methyl
sulphone
0.277
0.248
-10.5
11
Ethiofencarb
sulphone
0.233
0.220
-5.6
Tabla 3.
Figura 2.
picos alcanzados en el Nexera UHPLC.
Rendimiento del método
Con el fin de evaluar el rendimiento del
LCMS-8040 para las muestras reales, se
determinaron los límites de detección,
linealidad y repetibilidad en los extractos
de alimentos. La linealidad se evaluó
de 0,5 a 200 ppb en cuatro tipos de
muestras:
(1) acetonitrilo
(2)extracto de fruta seca
(3) extracto de lechuga
(4) extracto de pera
Los 210 pesticidas logran excelentes
coeficientes de correlación superiores
a 0,99 en los cuatro tipos de matriz con
valores típicos de más de 0.997. Los
coeficientes de correlación se enumeran
en la Tabla 1 para todos los plaguicidas
en el extracto de pera, Las curvas
de calibración de ocho plaguicidas
seleccionados se muestran en la Figura
3.
Los límites de detección de los
plaguicidas se calcularon basándose en
el método descrito por la US-EPA. Los
límites de detección fueron evaluados
tanto para la transición de cuantificacion
y como para la transición de cualificación,
y se enumeran en la Tabla 1. Todos los
pesticidas estudiados presentan LD
menor que el nivel de 0.01 mg/kg para ambos
transiciones.
Se logró un límite de detección de menos
de 0.001 mg/kg (1 ppb) para la transición de
cuantificación y menos de 0.002 mg/kg (2 ppb)
para la transición de cualificación para el 90%
de los compuestos: poniendo de manifiesto el
excelente sensibilidad del LCMS-8040 para el
análisis de plaguicidas. Por otra parte, estos
límites de detección se lograron con un volumen
de inyección de sólo 2 μl. Por lo tanto, los
Figura 3
límites de detección podrían reducirse aún más
con volúmenes de inyección más grandes.
La repetibilidad se evaluó al nivel de 0,01 mg/kg
como área del pico (%RSD) de seis inyecciones
repetidas de extractos de pera. Se logró una
repetibilidad de menos de 5 % RSD en el 92%
de los 210 pesticidas estudiados.
Todos los compuestos estudiados presentan
repetibilidad menor del 10 % RSD, con excepción
del ácido haloxifop (13,4 %).
CONCLUSIÓN
Los resulatdos de la metodología desarrolada
con el Shimadzu LCMS-8040 de triple
cuadrupolo puede lograr una excelente
sensibilidad, linealidad y repetibilidad en
los extractos de alimentos para más de 200
pesticidas comúnmente analizados. Los límites
de detección eran menores de 0,01 mg/kg
(10 ppb), tanto para la cuantificación y las
transiciones de cualificación, para todos los
compuestos estudiados, mientras que
para el 90% de los compuestos era menos
de 0,001 mg/kg (1 ppb) (cuantificación) y
0,002 mg/kg (2 ppb) (cualificación), por lo que
proporciona una excelente respuesta, sobre
todo teniendo en cuenta que el volumen de
inyección fue de sólo 2 μL. La sensibilidad
de la LCMS-8040 fue capaz de cumplir con
los 0,01 mg/kg (10 ppb) de los requisitos de
las directrices reguladoras tales como los
establecidos por la Unión Europea y Japón.
En consecuencia, el LCMS-8040 es ideal para
el control rutinario de los pesticidas en los
laboratorios reglamentarios.
IZASALAB 2/2013 27
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CROMATOGRAFÍA / GASES
Tracera:
La tecnología del plasma es el futuro de la
detección en cromatografía de gas
Shimadzu
Corporation
presenta Tracera,
un cromatógrafo
de gas de alta
sensibilidad.
Tracera está
equipado con
el flamante y
nuevo detector
de ionización
por descarga
de barrera BID –
Barrier Discharge
Ionization, que
es capaz de
detectar todo tipo
de compuestos,
orgánicos e
inorgánicos, a
niveles de trazas
con la excepción
del helio (He) y
del neón (Ne).
Hablamos de niveles de 0,1 ppm (es decir
sub-ppm, donde ppm se refiere a partes por
millón). El cromatógrafo de gas Tracera es
de aplicación en numerosos tipos de análisis
en los que se demanda una alta sensibilidad
y se realizan normalmente con sistemas de
GC más complejos que incorporan más de
un detector.
Los cromatógrafos de gas se utilizan tanto
para I+D como para control de calidad en
diversos campos tales como petroquímica,
química fina, medio ambiente, productos
farmacéuticos, alimentación, electrónica/
semiconductores y fragancias. En los últimos
años, se ha incrementado la demanda por
una mayor sensibilidad así como el análisis
de cantidades de muestra a nivel de trazas.
Estos ejemplos incluyen el análisis de
impurezas del orden de unas pocas ppm
en los materiales utilizados en productos de
química fina, y el análisis de la pureza del
gas para la fabricación de semiconductores.
Los detectores de conductividad térmica
(TCD) y los de ionización de llama (FID) son
detectores de propósito general usados en
cromatógrafos de gas convencionales. Un
TCD detecta gran variedad de compuestos
inorgánicos y orgánicos, excluyendo el
componente del gas portador, pero la sensibilidad
es insuficiente. Una FID es capaz de detectar
trazas a nivel de ppm, pero solo puede detectar
compuestos orgánicos (con la excepción del
formaldehído y del ácido fórmico). Así pues, hay
análisis que requieren sistemas complejos que
incorporan varios de detectores para adaptarse
a la aplicación pretendida.
Con este tipo de análisis en mente, Shimadzu
investigó la tecnología de detección por plasma de
He como un medio para aumentar la estabilidad,
sensibilidad y rango de concentración detectable.
Esto dio como resultado el detector de ionización
de descarga de barrera (BID), un nuevo detector
de alta sensibilidad para compuestos tanto
orgánicos como inorgánicos que ofrece, al mismo
tiempo, una excelente durabilidad.
1% 1000 ppm 100 ppm 10 ppm 1 ppm 0,1 ppm
TCD
FID
Comparación de rangos de
concentraciones detectables.
28 IZASALAB 1/2013
BID
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2. Detector Universal: Capaz de detectar tanto
compuestos orgánicos como inorgánicos sin
diferencia en la sensibilidad.
Tubo de cuarzo
(con sustancia dieléctrica)
Fuente de Baja-Frecuencia
Electrodo de Alto-Voltaje
1ª línea de purga
Columna
2ª Línea de Purga
Electrodo de Colección
Estructura del detector BID Plus.
Estructura del detector BID Plus
Según las palabras de Masahito Ueda, Director
General de la Unidad de Negocio de GC y TA,
División Instrumentos Analíticos y de Medida:
El nuevo detector de plasma de He (BID) tiene
una energía extremadamente alta. Esto le
hace capaz de detectar todos los compuestos
orgánicos e inorgánicos, con la excepción de
He y Ne, sin diferencia en la sensibilidad. Se
mejora la sensibilidad incluso en el análisis de
aldehídos, alcoholes, halogenuros en los que
ésta disminuye dramáticamente si se usa un
FID.
Un único sistema Tracera realiza análisis que
hasta ahora requerían de forma convencional
sistemas complicados equipados con múltiples
detectores y demás accesorios. Estos ejemplos
incluyen entre otros el análisis de hidrógeno y
compuestos orgánicos tales como ácido fórmico
que se generan como parte del proceso de
reacción durante la fotosíntesis artificial; el
análisis de hidrocarburos en baja concentración
y gases permanentes generados en las baterías
recargables de iones de litio, etc.
"El Tracera es un sistema innovador que
combina el cromatógrafo de gases capilar GC2010 Plus de alto rendimiento de Shimadzu con
este nuevo tipo de detector, con características
no previstas por los detectores convencionales
….. Se espera que mejore la eficiencia de la alta
sensibilidad, los análisis de cantidades a nivel
de trazas y que reduzca los costes de equipos
y análisis."
PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS:
1. Alta sensibilidad: Sensibilidad de detección
más de 100 veces la de un detector TCD
(Conductividad Térmica), y más del doble
que un detector FID (Ionización de Llama).
El detector de ionización de descarga de barrera
(BID) genera plasma de helio. La enorme
energía de los fotones de este plasma ioniza
los componentes de la muestra, lo que permite
la detección de alta sensibilidad. Este sistema
alcanza por lo menos 100 veces la sensibilidad
de un TCD convencional, y por lo menos dos
veces la sensibilidad de FID, es decir, permite la
detección de todo tipo de componentes a nivel
de trazas (0,1 ppm).
3. Estabilidad a largo plazo: Gracias a su
tecnología de generación de plasma de baja
temperatura que preserva el electrodo.
En el nueva BID, el plasma se genera dentro
de un tubo de cuarzo; esto hace que no haya
contacto en el electrodo la descarga utilizada
para la generación de plasma.
Como resultado, el electrodo detector no se
degrada y se garantiza la estabilidad analítica a
largo plazo.
IZASALAB 2/2013 29
CIENCIAS DE LA VIDA
CROMATOGRAFÍA
/ HPTLC
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Análisis de plantas medicinales por
cromatografía en capa fina
La cromatografía
en capa fina de alta
eficacia (HPTLC)
se ha establecido
como el método
de elección para
llevar a cabo
análisis complejos
en productos
botánicos
y plantas
medicinales.
La combinación única de instrumentación
de
última
generación,
procedimientos
estandarizados y fundamentos teóricos sólidos,
permite a la cromatografía en capa fina ofrecer
resultados fiables con cumplimiento de cGMP.
La cromatografía en capa fina de alta eficacia
(HPTLC) ha sido adoptada como metodología
oficial estándar para la identificación de plantas y
extractos como parte de monográficos en varias
farmacopeas como USP, Ph.Eur, PhPRC y AHP,
y es ampliamente a aceptada la idea de que
HPTLC es el mejor método para la identificación
de productos complejos, tales como productos
botánicos y suplementos dietéticos.
El análisis por HPTLC proporciona una huella
dactilar cromatográfica de la muestra completa,
lo que hace a la técnica especialmente adecuada
para el análisis de productos botánicos, muestras
de plantas y preparados de plantas medicinales,
siendo todos ellos muy complejos, consistiendo
en una mezcla de muchos componentes
diferentes. Aparte de esto, la composición
química exacta de productos botánicos es
desconocida y puede variar ampliamente tanto
cualitativa como cuantitativamente. Finalmente,
conocer el contenido en componentes activos
o inactivos no es suficiente como criterio de
calidad. La presencia o ausencia de otras
sustancias debe formar parte del análisis de las
muestras.
en una misma placa. Esto no solo incrementa
la fiabilidad del proceso, sino que además es
extremadamente rápido.
Económico
HPTLC
procesa
múltiples
muestras
simultáneamente, no requiere tiempo de
arranque y emplea cantidades mínimas de
disolvente, resultando en una técnica de análisis
muy económica.
Flexibile
HPTLC es un sistema abierto, lo que permite
ajustar y optimizar cada uno de los parámetros
que tienen influencia independientemente de
los otros y admite un número de fases móviles
prácticamente ilimitado.
¿POR QUÉ USAR HPTLC?
Las ventajas ofrecidas por HPTLC son un
argumento de peso para la elección de la técnica:
Resultado visual
A diferencia de otros métodos, HPTLC produce
cromatogramas visibles. Las placas conteniendo
muchas muestras se pueden comparar
fácilmente. Las similitudes y diferencias se ven
de inmediato. Se pueden capturar y almacenar
imágenes electrónicamente, proporcionando los
datos de referencia necesarios para futuros lotes
y registros para auditorías.
Detección múltiple
La derivatización post-cromatográfica permite el
uso de varios modos de detección y hace que
las diferencias en las huellas dactilares sean
claramente visibles. Esto es posible con HPTLC
porque todos los componentes permanecen en la
placa después del desarrollo del cromatograma.
Análisis paralelo de muestras
Es posible analizar hasta 72 muestras
simultáneamente, bajo condiciones idénticas,
30 IZASALAB 2/2013
Huella dactilar HPTLC (polifenoles) de muestras de
diferentes tipos de té. Calles: 1 sustancia de referencia,
2-3 té verde de China, 4-7té negro de India, 8-11 té
negro de China.
Placas desechables
Las placas HPTLC se desechan después del
análisis, eliminando los problemas causados por
muestras con matrices altas en columnas HPLC:
bloqueos de columna y picos fantasma.
Cumplimiento de cGMP
La instrumentación moderna para HPTLC
se controla por software y genera registros
electrónicos adecuados para archivar.
HPTLC es una técnica totalmente reproducible y
estandarizada. Genera resultados comparables
en el análisis e identificación de materias
primas y es adecuada para controles durante
el proceso, así como análisis de producto
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final, como conformidad de lotes, o ensayos
de estabilidad. Es posible obtener resultados
cuantitativos directamente de la placa HPTLC o
mediante evaluación de la imagen.
ENSAYOS ANALÍTICOS CLAVE
EN PRODUCTOS BOTÁNICOS
Y PLANTAS MEDICINALES
Detección de adulteración con 1
ppm de ácido aristoloquico A en
Stephania tetranda. Calles: 1-2
Stephania tetranda pura (10 y 30
µL), 3-4 Stephania adulterada con
1 µg/g de ácido aristoloquico A (10
y 30 µL), 5-9 cantidades crecientes
de ácido aristoloquico A.
Huellas dactilares de varios extractos
de cálamo en placas modificadas
con cafeína. Calles: 1 α-asarone, 2
β-asarone, 3 Calami rhizoma, 4 Acori
graminei rhizoma, 5 A. graminei
rhizoma, 6 C. rhizoma, 7 C. rhizoma
Poland, 8 C. rhizoma North America,
9 C. rhizoma China, 10 C. rhizoma
Macedonia, 11 α-asarone, 12
β-asarone.
Identificación de materias primas y productos
HPTLC genera una huella dactilar cromatográfica
de la muestra en forma de una secuencia única
de picos o zonas debido a los componentes
de la muestra. La huella dactilar de materias
primas autentificadas sirve como referencia para
la caracterización de materiales desconocidos.
Ambos, material de referencia y muestra se
aplican uno al lado del otro en la misma placa.
Las huellas dactilares resultantes se comparan
en cuanto a número, secuencia, posición y color
de las zonas separadas.
Detección de adulteraciones
Un problema común en el control de calidad
de productos botánicos es la sustitución
intencionada o inadvertida de especies de
plantas. La adulteración se hace crítica
cuando la especie de planta empleada para la
falsificación es tóxica. Por lo tanto, cualquier
método empleado para la identificación debe ser
específico y suficientemente sensible.
Cuantificación de compuestos marcadores
La medida de calidad más comúnmente
empleada es la cuantificación de un componente
activo y/o un componente marcador. La
cuantificación se realiza mediante densitometría
de barrido o mediante software de análisis de
imagen.
OTRAS APLICACIONES
Desarrollo de productos
Se emplea HPTLC para optimizar parámetros
del proceso y detectar cambios y degradaciones
en el material durante la formulación.
Control de proceso
HPTLC es ideal para demostrar la consistencia
de la calidad del producto ya que prueba que las
materias primas retienen su integridad y que no
ocurre descomposición durante la producción.
Curva de calibración de β-asarone en una
placa modificada con cafeína.
Densitograma mostrando separación
hasta línea de base de α– y β-asarone.
Ensayos de estabilidad
Gracias a la instrumentación y estandarización
ofrecida por HPTLC, es posible repetir los
ensayos sobre periodos de tiempo prolongados.
Esto lo convierte en un método adecuado para
ensayos de estabilidad.
INTRUMENTACIÓN PARA HPTLC
La compañía Camag (Muttenz, Suiza) diseña y
fabrica toda la instrumentación necesaria para
obtener el máximo provecho de ésta técnica
con los más altos estándares de calidad. Los
equipos permiten automatizar todas las fases de
la cromatografía:
•
•
•
•
•
•
Aplicación de muestra.
Desarrollo del cromatograma.
Derivatización.
Detección y cuantificación.
Documentación.
Transferencia de muestra a espectrómetro de
masas.
El proceso completo se controla desde el software
winCATS, que permite tener toda la información
relativa a un ensayo documentada en un mismo
archivo, permitiendo el cumplimiento de cGMP.
Camag ofrece una gama completa de instrumentos para automatizar todas las fases de la
cromatografía en capa fina.
IZASALAB 2/2013 31
Para más información de estos productos enviar un e-mail a
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CROMATOGRAFÍA / GASES
Nueva Serie HS-20
muestreadores de espacio
en cabeza de Shimadzu
HS-20, HS20T,con trampa
de enfriamiento
electrónica, y
HS-20LT,
con línea de
transferencia
larga, para
análisis fácil,
fiable y con alta
sensibilidad
de compuestos
volátiles con
amplio intervalo
de ebullición.
Shimadzu, lanza
la
Serie HS-20
de
muestreadores de espacio de cabeza y
herramienta de suma importancia en la
cromatografía de gases para el análisis preciso
de una amplia gama de compuestos volátiles con
un gran intervalo de puntos de ebullición desde
los más bajos a los más altos. La Serie HS-20
calienta las muestras tanto sólidas como líquidas
que están selladas en un recipiente (vial sellado
a prueba de gas) a una temperatura específica
para inyectar más tarde los compuestos volátiles
(difundidos en fase gaseosa) en un GC o
un GCMS. Estos muestreadores se utilizan
de forma amplia en el ámbito de aplicación
ambiental y farmacéutico fundamentalmente, así
como en los materiales y productos de análisis
de alimentos, fragancias y medicina forense.
La Serie HS-20 ayuda en estos análisis en
particular así como a las organizaciones de
pruebas e inspección.
La configuración única de sus líneas de flujo
y horno permite el análisis de compuestos de
alto punto de ebullición y reducir al mínimo
la contaminación por arrastre. Al ofrecer la
opción de utilizar una trampa de enfriamiento
electrónico, también es posible concentrar el gas
del espacio de cabeza para realizar análisis de
compuestos con muy alta sensibilidad bajando
al máximo los límites de detección.
Los muestreadores
de
espacio
en
cabeza
hacen
Temp
fácil
el
análisis
300 ºC
300 ºC
300 ºC
Incubación
de
compuestos
Temp.
volátiles. Se utilizan
Temp. amb
50 ºC a 300 ºC
150 ºC a 300 ºC
Linea
+10 ºC a 220 ºC
en diversos campos
Muestra
que necesitan una
Temp.
Temp. amb
Temp. amb
Temp. amb
mayor
fiabilidad,
Línea
+10 ºC a 350 ºC +10 ºC a 350 ºC +10 ºC a 200 ºC
Transfer.
tales
como
el
análisis de VOC
Línea
Estándar
Estándar
Larga
Transfer.
(compuestos
orgánicos volátiles)
Trampa
No
Si
No
en aplicaciones en
medio ambiente así
como en control de calidad de los productos
Comparativa de los modelos
farmacéuticos.
de la Serie HS-20.
Modelo
HS-20
HS-20
Tramp
HS-20 LT
Asimismo, en productos alimenticios y control
de materiales en los que una amplia gama de
compuestos volátiles con gran variedad de
puntos de ebullición han a ser detectados con
alta sensibilidad con el fin de proporcionar
resultados cualitativos y cuantitativos precisos.
32 IZASALAB 1/2013
ALGUNOS ASPECTOS
DESTACADOS
Mínima contaminación por arrastre para
análisis altamente fiables
Con el fin de aumentar la fiabilidad de los datos
en el análisis de espacio en cabeza, se necesita
minimizar lo máximo posible la contaminación
por arrastre dada a existencia de compuestos
altamente adsorbentes que pueden permanecer
en las líneas de flujo. Esto es posible en los
muestreadores de la Serie HS-20 gracias a la
estructura única de la línea de flujo así como la
desactivación de las líneas de flujo de muestra
que reducen la adsorción de la muestra para
lograr una contaminación por arrastre muy baja,
del orden de 0,0001 % o menos, incluso para el
ácido acético que es altamente adsorbente.
Análisis eficiente de compuestos de alto
punto de ebullición
El horno de la Serie HS-20 se puede ajustar a
un máximo de 300 °C para permitir el análisis de
compuestos de alto punto de ebullición difíciles
de detectar con muestreadores de espacio de
cabeza convencionales. Con tan solo 30 cm, el
HS-20 ofrece la línea de transferencia más corta
de su clase entre el espacio en cabeza y el GC.
De esta manera, incluso componentes de alto
punto de ebullición, tales como los ésteres de
ftalato o siloxanos cíclicos se pueden introducir
de manera eficiente a la columna de GC para
lograr un análisis de alta sensibilidad.
Esto significa que el aparato también se puede
aplicar en el control de calidad de materiales de
productos químicos.
Aumento de la sensibilidad con la trampa
electrónica refrigerado
El modelo HS-20T de la serie HS-20 lleva una
trampa donde se concentra el gas del espacio
en cabeza para el análisis de alta sensibilidad
de compuestos volátiles generados a partir de la
muestra. También, por enfriamiento de la unidad
de trampa a -20 °C utilizando la función de
refrigeración de electrónica, los componentes de
bajo punto de ebullición se pueden concentrar de
manera eficiente en la trampa. Así, por ejemplo,
componentes con una amplia gama de puntos de
ebullición, tales como los componentes del olor,
se pueden analizar con alta sensibilidad para
lograr fácil cualificación mediante la obtención
de espectros de masas con un GC-MS así
como una fácil cuantificación de componentes a
niveles de trazas.
FLUORESCENCIA DE RAYOS X
Para más información de estos productos enviar un e-mail a
dac2@izasa.es o visitar nuestra web www.izasa.es
El X-Supreme 8000 cumple con el nuevo
método ISO13032 para la determinación
de bajos niveles de azufre en combustibles
de automoción
El X-Supreme
8000 de Oxford
Instruments,
líder mundial en
analizadores de
fluorescencia
de rayos X de
sobremesa, es
el analizador
EDXRF más
potente, compacto
y flexible.
La reducción en la concentración de azufre
en combustibles de automoción trae consigo
una serie de beneficios medioambientales,
incluyendo la reducción en los niveles de
dióxido de azufre en el escape de los vehículos,
produciendo una menor contaminación y
contribuyendo a una mejor calidad del aire.
Los combustibles de automoción están sujetos
a regulaciones estrictas y muchos países
ya producen, o tienen previsto producir,
combustibles con ultra bajos niveles de azufre,
por debajo de 10 o 15 mg/kg. La norma de
reciente introducción ISO13032 cubre una
amplia gama de combustibles de automoción,
incluyendo tanto gasóleo estándar como
gasóleo conteniendo hasta un 10% de ésteres
metílicos de ácidos grasos (FAME). Asimismo
incluye gasolina con contenido en oxígeno hasta
el 3,7%, y gasolina mezclada con etanol hasta
el 10%. Para realizar la medida del azufre, la
norma especifica el uso de la fluorescencia de
rayos X por dispersión de energía (EDXRF) de
alto rendimiento.
Detalle del sistema de detección, con tubo de rayos
X, celda de muestra y detector SDD.
La fluorescencia de rayos X por dispersión de
energía es una técnica que ha sido ampliamente
empleada en laboratorios de control de calidad
en refinería, por ejemplo en los equipos de
sobremesa de Oxford Instruments modelos
Lab-X y X-Supreme. El excelente rendimiento,
versatilidad, facilidad de uso, velocidad
y rentabilidad de ésta técnica hacen del
espectrómetro EDXRF la herramienta analítica a
elegir para análisis de combustibles, desde los
límites de detección más bajos hasta niveles de
alta concentración.
Con la adición del X-Supreme a la gama de
espectrómetros EDXRF de sobremesa para
análisis de combustibles, Oxford Instruments
ofrece un espectrómetro de alto rendimiento,
probado en campo, que es capaz de llevar a cabo
con éxito todos los ensayos de azufre requeridos
por la industria petroquímica. El X-Supreme es el
analizador perfecto para la determinación rápida
de azufre, desde niveles de partes por millón
(ppm) hasta altos porcentajes, en todos los tipos
de combustibles.
El Oxford X-Supreme 8000 incorpora automuestreador de 10 posiciones, PC integrado,
teclado de membrana resistente al polvo y derrames, y pantalla táctil de 12”.
Además de la norma ISO13032, el X-Supreme
cumple con las normas ASTM D4294, ISO20847
e ISO8754.
IZASALAB 2/2013 33
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MEDIO AMBIENTE
Medición química y
olfativa para preservar
la calidad del aire
Creada en 1993,
Alpha M.O.S es
una empresa que
se especializa en
la digitalización
del olfato, el
gusto y la vista.
Con más de 1.800
instrumentos
vendidos en
el mundo, la
compañía es líder
en la fabricación
de nariz
electrónica, lengua
electrónica y ojos
electrónicos para
uso industrial.
Con un enfoque de "tecnologías limpias", las
soluciones y los servicios ofrecidos por Alpha
MOS ayudan a las industrias a alcanzar sus
objetivos de desempeño medioambiental:
• Reducción del impacto de las emisiones ambientales.
• Optimización del consumo de recursos: agua,
energía, aditivos, etc.
• Mejorar el desempeño de los sistemas de tratamiento de olores y reducir los costos asociados.
LA CONTAMINACIÓN
OLFATIVA INDUSTRIAL
El control de la contaminación olfativa es
esencial para garantizar el desarrollo y la
sostenibilidad de una zona industrial.
La posible molestia del olor no solo está
relacionada con sus propiedades (concentración,
la intensidad, la calidad, el tono hedónico), sino
también a su dispersión en el aire, su frecuencia,
su percepción y a las peculiaridades físicas o
psicológicas de cada individuo que percibe el
olor.
El olor se convierte en contaminación desde el
momento en que se percibe como (excesiva)
molestia para la población. Molestia olfativa es
la segunda causa más común de la denuncia
pública después de ruido.
Los vertederos, las plantas de reciclaje de
residuos, plantas de tratamiento de aguas
residuales,
plantas
de
transformación,
Nariz electrónica
caja RQ.
34 IZASALAB 2/2013
petroquímica, papel y alimentos son los sectores
en los que la gestión de los malos olores se ha
convertido en una preocupación importante.
LA SOLUCIÓN RQ-Box
Redes para el monitoreo continuo de olores
industriales con el fin de anticipar y actuar con
rapidez en el caso de contaminación por olores.
Diagnosticar, prevenir, controlar y tratar la
contaminación por olores
La prevención y el tratamiento de la
contaminación del olor requieren un diagnóstico
preciso de los fenómenos involucrados. Una vez
que se implementen las acciones preventivas
o correctivas, es necesario comprobar su
eficacia con el fin de disipar las preocupaciones
de los vecinos y las autoridades locales, a fin
de garantizar que no se superen los umbrales
reglamentarios.
Una red de narices electrónicas para la
medición en tiempo real
La red de narices electrónicas y estaciones
meteorológicas miden continuamente las
emisiones de olores y parámetros meteorológicos
locales. RQ Box es compatible con cualquier
tipo de fuente: fuentes superficiales (estanques),
fuentes difusas (pilas de residuos) o fuentes
canalizadas (chimeneas).
Modelo de pluma para ver y predecir la
dispersión de olores y contaminantes
El software de modelización calcula de forma
dinámica la dispersión de las emisiones. Las
plumas de olor y gas siguen el modelo de las
concentraciones medidas continuamente de las
diferentes fuentes de emisión, los parámetros
meteorológicos y la topografía local.
Para más información de estos productos enviar un e-mail a
dac2@izasa.es o visitar nuestra web www.izasa.es
Compilación de informes de olor
Esta opción permite recoger, a través de internet
o por teléfono, los informes de malos olores
en el terreno con el fin de correlacionar las
predicciones de la contaminación de olores con
la percepción de los vecinos.
•
Panel de control de la contaminación de olor
en una web dedicada y segura
Todos los resultados del monitoreo
están disponibles de forma remota y en
tiempo real en una página web dedicada
y segura. Los operadores y agencias
gubernamentales controlan los olores y
emisiones de gas sobre una base 24/7 a
diversas escalas: a nivel de instalación,
nivel de sitio o nivel regional.
RQ Box con un innovador servidor nube:
control de olor con un presupuesto controlado
y mantenimiento sin preocupaciones
•
•
•
• Una bomba interna con un caudal de
1 l/min.
• Un sistema de filtrado externo para limitar la entrada de polvo cuando el sistema de DnD no se utiliza.
Un sistema de detección con 6 sensores en
dos cámaras de medida:
• 1 detector PID.
• 2 células electroquímicas.
• 3 Sensores de óxido de metal (Metal
Oxide Sensor).
Un sistema de monitorización de humedad y
temperatura en la cámara de medida.
Un dispositivo electrónico.
Un dispositivo de alimentación.
El sistema de muestreo del RQ Box se puede
utilizar en fuentes de olor difusas o superficiales.
Para este tipo de fuentes, no es necesario el
sistema de DnD.
El servidor nube de RQ Box es una solución
diseñada para satisfacer estas necesidades.
El servidor y las aplicaciones centralizan y
procesan datos de forma que se pueden
entregar datos de forma online. Las limitaciones
de espacio en las instalaciones, de
gestión de almacenamiento de datos
y de mantenimiento informático se
eliminan por completo, mientras que se
mejora la seguridad de datos.
Los operadores y los miembros de
los organismos ambientales pueden
controlar los olores sin tener que
preocuparse por las restricciones
habituales de mantenimiento del equipo.
Fuente superficial.
1 Analizador RQ Box.
2 Filtro de partículas.
3 Caja de datos.
Fuente difusa.
1 Analizador RQ Box.
2 Filtro de partículas.
3 Caja de datos.
ANALIZADOR RQ BOX
El analizador RQ Box mide en continuo las
siguientes emisiones: olores, COVs, NH3, H2S o
mercaptanos. Cada analizador se instala lo más
cerca posible a la fuente emisora. Dependiendo
de la concentración y la humedad relativa de la
muestra de aire, puede ser necesario instalar
un sistema de secado/dilución (DnD) antes del
analizador.
La caja RQ Box preparada para trabajar en
intemperie contiene:
• Un sistema de muestro con:
IZASALAB 2/2013 35
Super Resolución:
Microscopía Óptica más allá del límite
N-SIM alzanca una resolución lateral dos veces superior a la de los
microscopios tradicionales a una velocidad increíblemente rápida: 0.6
segundos / cuadro. Adicionalmente permite la obtención de imágenes en
3D e imágenes en TIRF mediante el nuevo iluminador iluminador TIRF-SIM
Antes
Después
N-STORM, con una resolución lateral de 20 nm. y una resolución axial de
50 nm., permite la obtención de imágenes en dos y tres dimensiones e
imágenes multiespectrales
Después
Antes
IZASA, S.A.
Tel.: 902 20 30 80
dac2@izasa.es
izasa.es @izasaGIC
Ensayo múltiplex de secreción de IL-6 y viabilidad celular
empleando una línea tumoral de células epiteliales de ovario.
Usando el lector multimodo con modulo de imagen celular Cytation ™3, para monitorizar la secreción de IL-6.
Ensayo HTRF para la detección de IL-6 y de viabilidad celular utilizando microscopía digital de fluorescencia y de
campo claro.
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se expresa hasta en el 70% de los cánceres epiteliales de ovario
(EOC). Los altos niveles de IL-6 también se han encontrado en las ascitis de pacientes EOC. Se ha demostrado que el
ligando estimula EGFR activando la transcripción dependiente de NF-kB y la secreción inducida de las citoquinas
pro-inflamatorias IL-6 . En este trabajo vamos a realizar un ensayo en multiplex para los inhibidores a nivel del EGFR y
NFkB, para controlar la secreción de IL-6 y la viabilidad celular. En este ensayo de multiplex se utiliza una placa de
ensayo y una placa de detección de HTRF. Después del tratamiento de las células, el sobrenadante se transfiere a la
placa de detección de HTRF donde se determinan las concentraciones de IL-6, a continuación, se evalúa la viabilidad
celular en la placa de ensayo usando sondas fluorescentes. Todos los ensayos se llevaron en el Cytation ™3.
Introducción
Según los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (CDC), cada año, alrededor de 20.000 mujeres en los Estados
Unidos contraen cáncer de ovario [1]. 90% de estos cánceres se clasifican como "epitelio" y se cree que surge de la superficie
(epitelio) del ovario y se denominan cáncer de ovario epitelial (EOC). Aunque el pronóstico es bueno para el diagnóstico precoz de
enfermedades en etapas I / II, los síntomas no son específicos y son difíciles de rastrear. La mayoría de los cánceres de ovario
se diagnostican en etapa tardía III / IV, donde los síntomas se hacen más evidentes. Desafortunadamente en este momento, el
pronóstico es malo. Una manifestación común de EOC en esta etapa tardía de su progresión, es una acumulación de líquido en la
cavidad abdominal (ascitis). Se ha demostrado que altos niveles de IL-6 están presentes en estos ascitis [2].
El origen de la alta expresión de IL-6 está unido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). El EGFR se expresa
hasta en el 70% de los EOC, y su expresión alterada se asocia con la enfermedad en etapa tardía y el mal pronóstico [3]. EGFR,
un miembro de la familia ErbB de receptores tirosina quinasas, activa múltiples cascadas de señalización, incluyendo la activación
de NFkB, que se sabe activa la transcripción de las proteínas relacionadas con la inflamación, tales como la IL-6 [4]. En una
publicación reciente, se demostró que la unión del ligando de EGFR induce la expresión de IL-6 a través de la vía de NFkB en el
cáncer epitelial de ovario en estadio avanzado [5].
En esta nota de aplicación mostramos como un ensayo in vitro en microplaca puede monitorizar la secreción de IL-6 en células
SKOV-3 de carcinoma de ovario inducidas por unión del ligando a EGFR y la activación de NFkB . El flujo de trabajo del ensayo
implicó un protocolo de 2 microplacas, la primera donde las células fueron dispensadas y se realiza la activación del EGFR por
unión de ligando. Las mediciones de IL-6 se realizan en una microplaca separada mediante la transferencia de una parte del
sobrenadante de las células. También demostramos que la secreción de IL-6 puede ser inhibida en el nivel de EGFR o por el uso
de inhibidores de NFkB conocidos. Inhibidores que son potencialmente tóxicos para las células cultivadas en placas y pueden ser
evaluados a través de microscopía de fluorescencia utilizando sondas fluorescentes. Esto proporciona una determinación
cuantitativa de si la supresión de IL-6 es causada por la inhibición del receptor / activación del factor de transcripción o a través de
la toxicidad celular. Todas las mediciones se realizaron en el lector multimodo con modulo de imagen celular Cytation ™3.
Materiales y Métodos
Materiales
Células
Células tumorales de Ovario SKOV-3 (Catalog Nº. AKR-253) fueron obtenidas de Cell Biolabs, Inc. (San Diego, CA). Las células
se hicieron crecer en RPMI 1640 Medium (Catalog No. 11875) añadiendo suero bovino fetal al 10% (Catalog No. 10437) y
Pen-Strep-Glutamine, 1x (Catalog No. 10378) de Life Technologies (Carlsbad, CA). Las células fueron dispensadas en microplaca
5
con una densidad de 1.0x10 células/mL 24 horas antes de desarrollar el ensayo.
Inductor cascada de señales EGFR
Factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Catalog No. CYT-217) de ProSpec (Rehovot, Israel) fue empleado para estimular la
cascada de señales del EGFR, conduciendo a una secreción eventual del citoquina pro-inflamatoria IL-6
Anexo - IZASA LAB 02 /13 Página 1 Inhibidores
AG 1478 (Catalog No. 1276), Cardamonin (Catalog No. 2509), U0126 (Catalog No. 1144), y LY 294002 (Catalog No. 1130) fueron
comprados a R&D Systems (Minneapolis, MN). Cetuximab fue proporcionado by Cisbio Bioassays (Codolet, France). Anti-EGFR
anticuerpos 225 (Catalog No. LS-C88001) y 111.6 (Catalog No. LSC88141) fueron adquiridos en LifeSpan BioSciences (Seattle,
WA).
Microplacas
Microplacas de 96 pocillos con fondo plano y transparente, paredes negras y tratamiento TC (Catalog No. 3904), y microplacas
384 pocillos de bajo volumen, fondo redondo y color blanco, con recubrimiento PS NBS (Catalog No. 3673) fueron compradas a
Corning Life Sciences (Corning, NY).
Instrumentación
Cytation™3 Lector Multimodo con Imagen Celular.
Cytation3 combina un microscopio de fluorescencia automatizado y un lector multimodo de microplacas en un único instrumento.
Con estas prestaciones podemos obtener de un ensayo celular datos cualitativos y datos cuantitativos de nuestra muestra, en un
único protocolo de lectura, consiguiendo así información ortogonal a partir de la detección de señales de
fluorescencia/luminiscencisa o absorbancia y por medio de la adquisición de imágenes mediante cámara CCD Sony..
Equipado con la patente BioTek Hybrid Technology™ para detección en microplaca de fluorescencia/luminiscencia., Cytation3
incluye un detección de alta sensibilidad basada en filtros y un sistema flexible de detección basado en monocromadores,
ofreciendo así una gran eficacia y versatilidad en la lectura de microplacas, con dos PMTs, cada uno dedicado a cada óptica de
detección de intensidad de fluorescencia/luminiscencia. Así mismo se incluye un sistema óptico de detección de Absorbancia
UV-vis por monocromador, y un modulo de adquisición imágenes mediante cámara CCD Sony 16 bits, y con la capacidad de
trabajar en cuatro canales de fluorescencia o campo claro, empleando hasta 5 posibles magnificaciones (objetivos de microscopia
2X, 2.5X, 10X y 20X).
La microscopía de fluorescencia es una técnica poderosa para la visualización de las respuestas celulares y monitorizar la
proliferación celular, expresión de la proteína, citotoxicidad y otros procesos celulares. La capacidad de realizar tanto las
mediciones de fluorescencia cuantitativas convencionales como la adquisición de imagen celular ofrece capacidades únicas, tales
como la detección pocillos de la microplaca mediante un umbral de intensidad de fluorescencia que permite al lector realizar el
seguimiento de los pocillos que han superado el umbral de intensidad, y realizar la adquisición de las imágenes en dichos pocillos.
Esto sirve para reducir el tiempo de análisis y realizar solo el almacenamiento de imágenes en los pocillos de interés que pasan el
umbral de intensidad (Funcion “Hit Picking”).
El diseño del Cytation3 pone especial énfasis en los ensayos de célula viva: sus características incluyen el control de temperatura
a 45 ° C, control de gases CO2 / O2, agitación orbital y soporte completo para los estudios cinéticos con el software de análisis de
datos de BioTek el Gen5™, específicamente diseñado para realizar de manera sencilla una lectura del pocillo y la adquisición de
la imagen. Otros avances tecnológicos en el diseño de Cytation3 son el uso de LED de alta intensidad como fuentes de luz,
emparejados con cubos de filtros Semrock, objetivos Olympus y un enfoque automático basado en el soltare/imagen que permite
adquirir siempre imágenes enfocadas, de manera eficaz, ágil, automatizada y sin sufrir fenómenos de fototoxicidad.
El sistema basado en filtros se utiliza para detectar los 665 nm y 620 nm de emisión fluorescente del ensayo HTRF ® IL-6 con los
siguientes valores: retardo después de movimiento de las placas: 0 ms, retardo después de la excitación: 150 microsegundos,
tiempo de integración: 500 microsegundos; altura sonda de lectura: 10,5 mm. Luego la imagen se adquirió con el ensayo de
viabilidad celular Nuclear-ID ™ Azul / Red diseñado para uso con microscopia de fluorescencia. El software Gen5 se utilizó para el
análisis i de los datos.
®
HTRF Human IL-6 Assay
Anexo - IZASA LAB 02 /13 Página 2 Figura 1.
®
2-Plate HTRF Human IL-6 Assay.
En el ensayo, la IL-6 se midió utilizando un inmunoensayo de tipo sándwich que implica dos anticuerpos monoclonales: anti-IL-6
(mAb1) marcado con Eu-criptato y anti-IL-6 (mAb2) marcado con XL665. Estos anticuerpos pueden ser pre-mezclados y se
añadieron en una único paso de dispensación, para simplificar aún más el protocolo. El ensayo se realiza en dos pasos (Figura 1).
(A) En las células se realiza el paso de estimulación incubándolas con los activadores e inhibidores. (B) En el sobrenadante las
células han secretado la IL-6, y este sobrenadante es transferido a una segunda placa, seguido de la adición de anticuerpos en
esta segunda microplaca para desarrollar la detección de IL-6.
Nuclear-ID™ Blue/Red Cell Viability Assay
El reactivo de viabilidad celular nuclear-ID ™ azul / rojo (N º de catálogo ENZ-53005) de Ciencias de la Vida Enzo (Farmingdale,
Nueva York) es una mezcla de un fluorocromo azul de marcaje de acido nucleico permeable a las células y un fluorocromo rojo de
marcaje de acido nucleico impermeable a las células, que es adecuado para la tinción de núcleos muertos. Los núcleos de las
células vivas se tiñen de azul. Cuando disminuye la viabilidad de las células, sus membranas pierden la integridad y el rojo es
entonces capaz de teñir el núcleo. El patrón de tinción que surge de la combinación simultánea de estos dos fluorocromos permite
la determinación de las poblaciones de células vivas y muertas por microscopía de fluorescencia.
Métodos
Protocolo de 2 placas de ensayo
Células SKOV-3 , en un volumen de 100 µL, fueron dispensadas en una placa de 96 pocillos e incubadas durante 24 horas.
50 µL de 3x EGF o 25 µL de 6x EGF y el inhibidor fueron entonces añadidos al pocillo y se incubo el tiempo adecuado. Al finalizar
la incubación, 16 µL de sobrenadante fueron transferidos a la placa de 384 pocillos. 4 µL de anticuerpo mix HTRF fueron entonces
añadidos, incubándose durante 4 horas antes de desarrollar la lectura
El medio restante fue retirado de la microplaca de 96 pocillos, y la placa se lavó una vez con PBS 1X. A continuación se añaden
50 µl de PBS conteniendo el reactivo nuclear-ID, y se incubó a 37 º C / 5% de CO2 durante 30 minutos. Al finalizar la microplaca
se lavó dos veces con PBS, y un volumen final de 50 µl de PBS se añadió a los pocillos antes de la adquisición de las imágenes.
Optimización cascada de señales EGFR
Se realizó un primer experimento para evaluar el nivel de secreción de IL-6 mediante la estimulación de la vía de señalización de
EGFR. Una titulación de 11 puntos se ha conseguido usando diluciones seriadas 1:04 a partir de una concentración 1x de 2000
ng / ml de EGF. El factor de crecimiento se añadió a las células SKOV-3 y se incubó durante 24, 48, 72, o 96 horas. La porción
restante del ensayo HTRF de IL-6 a continuación, se llevó a cabo como se ha explicado anteriormente.
Anexo - IZASA LAB 02 /13 Página 3 Confirmación de inhibición de la cascada EGFR
Pequeñas moléculas y los inhibidores de anticuerpos anti-EGFR se ensayaron a continuación para determinar su capacidad para
atenuar la secreción de IL-6, así como sus propiedades citotóxicas. Los compuestos incluyen el inhibidor de EGFR AG 1478, la
Cardamonin anti-inflamatorio, conocida por inhibir la activación de NFkB, el inhibidor de la MAP quinasa U0126, y el inhibidor de
PI3 quinasa LY 294002. También se incluyeron tres anticuerpos anti-EGFR con reactividad conocida humana, 225, 111.6 y
Cetuximab,. Inhibidores de EGF y se añadieron a las células SKOV-3 y co-incubaron durante 48 horas antes de la realización de
la medida de IL-6 y los ensayos de citotoxicidad.
Protocolo de lectura y adquisición de imágenes del ensayo HTRF IL-6 y citotoxicidad en el Gen5™, en dos microplacas
Un único protocolo de lectura de 2 microplacas se ha creado con el software Gen5 para permitir el procesamiento eficiente de la
placa de ensayo HTRF y la placa de las células. La disposición de la microplaca creada en el Gen5 para la placa de ensayo HTRF
identifica la ubicación de los pocillos de ensayo y de control . El posterior y automatizado análisis de los datos convertirá los
resultados de fluorescencia en Delta F (%) e identifica los pocillos "hit" donde la inhibición de la secreción de IL-6 es ≥ 50%
Se emplea la reducción de datos y el análisis de Cut-Off llevado a cabo después del ensayo HTRF, para poder indicar en que
pocillos la inhibición de la secreción de IL-6 es ≥ 50% (Figura 2).
Figura 2. Resultados del análisis Cutoff de lo datos de inhibición. Los pocillos “Hit”, marcados en rojo, muestran valores de Delta
F(%)≤50%.
En la misma programación de protocolo empleada para generar los resultados de HTRF, se seleccionan los pocillos de la placa de
las células para evaluar los posibles efectos citotóxicos de las concentraciones de inhibidor de interés.
Se adquieren imágenes 4X y 20X de núcleos en células vivas y células muertas, teñidas con el reactivo de viabilidad celular
Nuclear-ID™ (Figura 3).
Anexo - IZASA LAB 02 /13 Página 4 Figura 3. Imágenes en azul/rojo 4x de los pocillos seleccionados.
La herramienta de Análisis Celular del Gen5 es entonces empleada para determinar el número de células vivas y muertas
mediante un contaje celular automatizado en cada imagen 4X. El tamaño de objeto fluorescente y la definición de un umbral de
fluorescencia, junto con el cruce de los datos de señal de fluorescencia de la detección por PMT, son criterios que nos garantizan
un apropiado y preciso contaje de células incluso en casos de elevada confluencia en el pocillo (Figuras 4 y 5).
Anexo - IZASA LAB 02 /13 Página 5 Figura 4. Gen5™ Herramienta de Análisis celular en imagen.
Figura 5. Comparación de los distintos métodos cuantitativos de contaje celular, empleados de manera simultanea por el
Cytation3, para llegar a una máxima precisión y eficacia en el contaje celular en cada pocillo. El contaje de células y la media de la
señal en imágenes adquiridas mediante objetivo 20X, fueron comparadas con la media de la intensidad de fluorescencia tomada
mediante una lectura en TOP, con detección por PMT. Esta comparativa se hizo en cada uno de los dos canales de fluorescencia
analizados en este ensayo.
(A) Datos de contaje Celular de ROI definidos (B) Valor medio de las señales de fluorescencia cuantificadas en las imágenes adquiridas y
(C) Señal de fluorescencia en lectura TOP, representada os frente al numero de células sembradas en la microplaca. Los puntos de datos
representan la media de 8 replicados.
Resultados y Discusión
Estimulación de la cascada de señales EGFR
Los resultados generados en el análisis de la estimulación mediante EGF en distintos tiempos (Tabla 1), demuestran que una
incubación de 48 horas con las células SKOV-3, proporciona el mayor cambio en la señal (ventana de ensayo) entre los pocillos
Anexo - IZASA LAB 02 /13 Página 6 que contienen células estimuladas y no estimuladas.
Table 1. Tiempos de incubación del ensayo de estimulación por EGF
El tiempo de incubación 24 horas parece no ser lo suficientemente largo como para ver la estimulación máxima de la secreción de
IL-6, mientras que las citoquina puede comenzar a ser degradadas por las células SKOV-3 con incubaciones prolongadas, tal
como 72 y 96 horas. Por lo tanto, el tiempo de incubación optimo para ser utilizado para la prueba de inhibidor, fue de 48 horas.
Figure 6. Estimulación EGF de la secreción de IL-6 . Curva de la estimulación de la secreción de IL-6 tras la incubación de células
SKOV-3 con EGF durante 48 horas.
A partir de la curva de estimulación 48 horas (Figura 6) se puede ver que la estimulación máxima se produce entre 1 y 100 ng / ml
de EGF. Una concentración de 35 ng / ml se utilizó para los análisis de inhibición subsiguientes.
Confirmación de los inhibidores de la cascada de señales de EGFR
Las curvas de inhibición para todos los compuestos y los anticuerpos anti-EGFR ensayados se muestran en relación con los
valores Delta F (%)calculados por el software Gen5 ™ usando los 620 nm originales y 665 nm de emisión de señales (Figura 7).
Anexo - IZASA LAB 02 /13 Página 7 Figura 7. Inhibición de la secreción IL-6 por (A) pequeñas moléculas inhibidoras y (B) anticuerpos anti-EGFR.
Si bien con todos los inhibidores probados se observa una disminución en la secreción de IL-6, una disminución más significativa
se observó a partir de AG 1478, Cardamonin, y cetuximab. Esto es consistente con los hallazgos previos que demostraron que la
inhibición a nivel del receptor y la activación de la vía de NFkB dando lugar a una disminución posterior en el EGF, estimula la
secreción de IL-6 [5]. La falta de inhibición apreciable por U0126 y LY 294002 indica que la activación de EGFR / MEK / ERK y
EGFR/PI3K / AKT dependiente de ligando desempeña un papel menos importante como estimulante de la secreción de IL-6 en
las células SKOV-3. Por último, el aumento de la potencia de Cetuximab en comparación con los otros anticuerpos anti-EGFR
probados, también está de acuerdo con los resultados publicados de las comparaciones anteriores [6].
Los efectos citotóxicos de los inhibidores se evaluaron mediante la captura de imágenes de 4x y 20x de células vivas y muertas de
los pocillos predeterminados en la placa de células tras identificar estos pocillos en el análisis de corte (Figura 8). En pocillos
adicionales también se obtuvieron imágenes con el fin de determinar el potencial de citotoxicidad en el valor de IC50 identificado,
para los distintos compuestos y los pocillos de control negativo
Anexo - IZASA LAB 02 /13 Página 8 Figura 8. (A) Imágenes 4X de células vivas/muertas para AG 1478. Se muestran imágenes de dos pocillos preseleccionados
junto con el pocillo de valor IC50 y el control negativo del inhibidor. (B) Campo claro 20x y fluorescencia azul en la misma
imagen, mostrando la morfología celular y la tinción de los núcleos.
A partir del análisis celular desarrollado con las imágenes 4X (Figura 4), se generan las siguientes curvas de citotoxicidad.
Anexo - IZASA LAB 02 /13 Página 9 Figura 9 .Ratios de células vivas y muertas para todas las concentraciones testadas de inhibidores, (A) pequeñas moléculas y (B)
anticuerpos anti-EGFR .
Los resultados obtenidos de las imágenes de células vivas / muertas, demuestran que los efectos citotóxicos son mínimos en las
concentraciones IC50, cuando se utiliza un período de incubación de 48 horas (Figura 9). Sólo en las concentraciones más altas
de inhibidores probados, hay una notable disminución de la viabilidad celular. Un último experimento se realizó para confirmar la
unión al receptor de los anticuerpos anti-EGFR. Cada anticuerpo primario se añadió a las células SKOV-3, seguido por la adición
de XL665 de cabra marcado con anticuerpo anti-Fc humano. Se espera que una imagen fluorescente de color rojo donde la unión
entre anticuerpo primario/receptor y el anticuerpo anti-Fc se lleva a cabo (Figura 10).
Figura 10. Imágenes 20x . Azul indica núcleos teñidos con DAPI. Verde indica marcaje FITC-Faloidina Actina.
La unión del receptor de EGF con el anticuerpo anti-FC se observó sólo con el Cetuximab. Esto es debido al hecho de que el
anticuerpo contiene regiones Fab y Fc de humanos. Los anticuerpos 225 y 111.6 son origen de ratón, y por lo tanto sólo
Anexo - IZASA LAB 02 /13 Página 10 demuestran reactividad humana en la región Fab. Esta unión tampoco se observo en el control negativo (sin anticuerpo primario)
confirmando que la unión al receptor no específica del anticuerpo secundario no tiene lugar.
Conclusiones
El ensayo de HTRF ® IL-6 proporciona un método fácil de usar y de gran sensibilidad para la evaluación de la secreción de
citoquinas a partir de células tumorales. Cuando se ejecuta utilizando el protocolo de dos microplacas, el ensayo puede ser
multiplexado con el análisis de viabilidad celular nuclear-ID ™ azul / rojo, para la evaluación rápida de las poblaciones de células
vivas y muertas. Las capacidades combinadas del Cytation ™ 3 ofrecen la capacidad de realizar fácilmente cada ensayo con un
solo instrumento y protocolo de lectura. Las ópticas avanzadas y el software Gen5 ™ proporcionan unas características que
aseguran la detección precisa de los dos ensayos basándose en lecturas de PMT e imágenes de microscopia, proporcionando un
rendimiento eficiente de todo el flujo de trabajo experimental
Referencias
1.
CDC webpage for Gynecologic Cancers, Ovarian Cancer: http://www.cdc.gov/cancer/ovarian/index.htm
2.
Kryczek I, Grybos M, Karabon L, Klimczak A, Lange A. (2000). IL-6 production in ovarian carcinoma is associated with
histiotype and biological characteristics of the tumour and influences local immunity. Br J Cancer 82: 621–628.
3.
Hudson LG, Zeineldin R, Silberberg M, Stack MS. (2009). Activated epidermal growth factor receptor in ovarian cancer.
Cancer Treat Res 149: 203–226.
4.
Karin M. (2006). Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression. Nature 441: 431–436
5.
Alberti C, Pinciroli P, Valeri B, Ferri R, Ditto A, Umezawa K, Sensi M, Canevari S and Tomassetti A. (2012).
Ligand-dependent EGFR activation induces the co-expression of IL-6 and PAI-1 via the NFkB pathway in
advanced-stage epithelial ovarian cancer. Oncogene 31, 4139–4149.
6.
Galizia G, Lieto E, De Vita F, Orditura M, Castellano P, Troiani T, Imperatore V, and Ciardiello F. (2007). Cetuximab, a
chimeric human mouse anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in the treatment of human colorectal
cancer. Nature 26: 36543660.
Anexo - IZASA LAB 02 /13 Página 11 Table 1 - Studied compounds and their chemical formulas, CAS numbers, SRMs, retention times, limits of detection and R 2
Compound
Formula
CAS
Transition 1
Transition 2
Pear extract
RT (min.)
Transition 1
LOD (ppb)
Transition 2
LOD (ppb)
%RSD
(10ppb)
R2
$YHUPHFWLQ%D
&+2
!
!
$FHSKDWH
&+1236
!
!
$FHWDPLSULG
&+&O1
!
!
$FULQDWKULQ
&+)12
!
!
$ODFKORU
&+&O12
!
!
$OGLFDUE
&+126
!
!
$OGLFDUEVXOIRQH
&+126
!
!
$OGLFDUEVXOIR[LGH
&+126
!
!
$PLGRVXOIXURQ
&+126
!
!
$VXODP
&+126
!
!
$WUD]LQH
&+&O1
!
!
$]LQSKRVPHWK\O
&+1236
!
!
$]R[\VWURELQ
&+12
!
!
%HQGLRFDUE
&+12
!
!
%HQWKLDYDOLFDUELVRSURS\O
&+)126
!
!
%LVS\ULEDFVRGLXP
&+11D2
!
!
%RVFDOLG
&+&O12
!
!
%URPR[\QLO
&+%U12
!
!
%URPXFRQD]ROH
&+%U&O12
!
!
%XWDFKORU
&+&O12
!
!
%XWRFDUER[LP
&+126
!
!
%XWRFDUER[LPVXOIRQH
&+126
!
!
%XWRFDUER[LPVXOIR[LGH
&+126
!
!
&DUEDU\O
&+12
!
!
&DUEHQGD]LP
&+12
!
!
&DUERIXUDQ
&+12
!
!
&DUER[LQ
&+126
!
!
&KORUDQWUDQLOLSUROH
&+%U&O12
!
!
&KORUIHQYLQIRV
&+&O23
!
!
&KORULGD]RQ
&+&O12
!
!
&KORURWROXURQ
&+&O12
!
!
&KURPDIHQR]LGH
&+12
!
!
&OHWKRGLP
&+&O126
!
!
&ORIHQWH]LQH
&+&O1
!
!
&ORWKLDQLGLQ
&+&O126
!
!
&\D]RIDPLG
&+&O126
!
!
&\FOR[\GLP
&+126
!
!
&\IOXIHQDPLG
&+)12
!
!
&\PR[DQLO
&+12
!
!
&\SURFRQD]ROH
&+&O12
!
!
&\SURGLQLO
&+1
!
!
&\URPD]LQH
&+1
!
!
'HPHWRQ6PHWK\OVXOIR[LGH
&+236
!
!
'HPHWRQ6PHWK\OVXOIRQH
&+236
!
!
'HVPHGLSKDP
&+12
!
!
'LFOREXWUD]RO
&+&O12
!
!
Table 1 – Continued...
Compound
'LHWKRIHQFDUE
Formula
&+12
CAS
Transition 1
!
Transition 2
!
Pear extract
RT (min.)
Transition 1
LOD (ppb)
Transition 2
LOD (ppb)
%RSD
(10ppb)
R2
'LIHQRFRQD]ROH
&+&O12
!
!
'LIOXEHQ]XURQ
&+&O)12
!
!
'LPHWKRDWH
&+1236
!
!
'LPHWKRPRUSK
&+&O12
!
!
'LPR[\VWURELQ
&+12
!
!
'LQRWHIXUDQ
&+12
!
!
'LVXOIRWRQVXOIR[LGH
&+236
!
!
'LXURQ
&+&O12
!
!
'03)
&+1
!
!
'RGLQH
&+12
!
!
(SR[LFRQD]ROH
&+&O)12
!
!
(WKLRIHQFDUE
&+126
!
!
(WKLRIHQFDUEVXOIRQH
&+126
!
!
(WKLRIHQFDUEVXOIR[LGH
&+126
!
!
(WKLULPRO
&+12
!
!
(WRIHQSUR[
&+2
!
!
)HQDPLGRQH
&+126
!
!
)HQDPLSKRV
&+1236
!
!
)HQDPLSKRVVXOIRQH
&+1236
!
!
)HQDPLSKRVVXOIR[LGH
&+1236
!
!
)HQEXFRQD]ROH
&+&O1
!
!
)HQKH[DPLG
&+&O12
!
!
)HQR[\FDUE
&+12
!
!
)HQSURSLPRUSK
&+12
!
!
)HQS\UR[LPDWH
&+12
!
!
)HQWKLRQVXOIR[LGH
&+236
!
!
)HQWKLRQVXOIRQH
&+236
!
!
)LSURQLO
&+&O)126
!
!
)OXD]LIRSDFLG
&+)12
!
!
)OXD]LQDP
&+&O)12
!
!
)OXGLR[RQLO
&+)12
!
!
)OXIHQDFHW
&+)126
!
!
)OXIHQR[XURQ
&+&O)12
!
!
)OXRPHWXURQ
&+)12
!
!
)OXRSLFROLGH
&+&O)12
!
!
)OXR[DVWURELQ
&+&O)12
!
!
)OXUR[\S\U
&+&O)12
!
!
)OXWULDIRO
&+)12
!
!
)RVWKLD]DWH
&+1236
!
!
)XUDWKLRFDUE
&+126
!
!
+DORIHQR]LGH
&+&O12
!
!
+DORVXOIXURQPHWK\O
&+&O126
!
!
+DOR[\IRSDFLG
&+&O)12
!
!
+HSWHQRSKRV
&+&O23
!
!
+H[\WKLD]R[
&+&O126
!
!
2
Table 1 – Continued...
Compound
,PD]DOLO
Formula
&+&O12
CAS
Transition 1
!
Transition 2
!
Pear extract
RT (min.)
Transition 1
LOD (ppb)
Transition 2
LOD (ppb)
%RSD
(10ppb)
R2
,PLGDFORSULG
&+&O12
!
!
,QGR[DFDUE
&+&O)12
!
!
,R[\QLO
&+,12
!
!
,SURYDOLFDUE
&+12
!
!
,VD]RIRV
&+&O1236
!
!
,VRFDUERIRV
&+1236
!
!
,VRIHQSKRV
&+1236
!
!
,VRIHQSKRVPHWK\O
&+1236
!
!
,VRSURFDUE
&+12
!
!
,VRSURWKLRODQH
&+26
!
!
,VRSURWXURQ
&+12
!
!
,VR[DEHQ
&+12
!
!
.UHVR[LPPHWK\O
&+12
!
!
/HQDFLO
&+12
!
!
/LQXURQ
&+&O12
!
!
/XIHQXURQ
&+&O)12
!
!
0DODWKLRQ
&+236
!
!
0DQGLSURSDPLG
&+&O12
!
!
0HFDUEDP
&+1236
!
!
0HSDQLS\ULP
&+1
!
!
0HSURQLO
&+12
!
!
0HVRVXOIXURQPHWK\O
&+126
!
!
0HWDIOXPL]RQH
&+)12
!
!
0HWDOD[\O
&+12
!
!
0HWDPLWURQ
&+12
!
!
0HWFRQD]ROH
&+&O12
!
!
0HWKDEHQ]WKLD]XURQ
&+126
!
!
0HWKDPLGRSKRV
&+1236
!
!
0HWKLRFDUE
&+126
!
!
0HWKLRFDUEVXOIR[LGH
&+126
!
!
0HWKRP\O
&+126
!
!
0HWKR[\IHQR]LGH
&+12
!
!
0HWREURPXURQ
&+%U12
!
!
0HWRODFKORU
&+&O12
!
!
0HWROFDUE
&+12
!
!
0HWRVXODP
&+&O126
!
!
0HWR[XURQ
&+&O12
!
!
0HWUDIHQRQH
&+%U2
!
!
0HWVXOIXURQPHWK\O
&+126
!
!
0HYLQSKRV
&+23
!
!
0ROLQDWH
&+126
!
!
0RQRFURWRSKRV
&+123
!
!
0RQXURQ
&+&O12
!
!
0\FOREXWDQLO
&+&O1
!
!
1HRTXDVVLQ
&+2
!
!
3
Table 1 – Continued...
Compound
1LWHQS\UDP
Formula
&+&O12
CAS
Transition 1
!
Transition 2
!
Pear extract
RT (min.)
Transition 1
LOD (ppb)
Transition 2
LOD (ppb)
%RSD
(10ppb)
R2
1XDULPRO
&+&O)12
!
!
2PHWKRDWH
&+1236
!
!
2[DGL[\O
&+12
!
!
2[DP\O
&+126
!
!
3DFOREXWUD]RO
&+&O12
!
!
3HQFRQD]ROH
&+&O1
!
!
3HQF\FXURQ
&+&O12
!
!
3KHQPHGLSKDP
&+12
!
!
3KHQWKRDWH
&+236
!
!
3KRUDWHVXOIRQH
&+236
!
!
3KRUDWHVXOIR[LGH
&+236
!
!
3KRVSKDPLGRQ
&+&O123
!
!
3KR[LP
&+1236
!
!
3LFROLQDIHQ
&+)12
!
!
3LFR[\VWURELQ
&+)12
!
!
3LULPLFDUE
&+12
!
!
3LULPLFDUEGHVPHWK\O
&+12
!
!
3URFKORUD]
&+&O12
!
!
3URIHQRIRV
&+%U&O236
!
!
3URPHFDUE
&+12
!
!
3URPHWU\Q
&+16
!
!
3URSDPRFDUEIUHHEDVH
&+12
!
!
3URSDTXL]DIRS
&+&O12
!
!
3URSLFRQD]ROH
&+&O12
!
!
3URSR[XU
&+12
!
!
3URS\]DPLGH
&+&O12
!
!
3URVXOIXURQ
&+)126
!
!
3URWKLRFRQD]ROH
&+&O126
!
!
3\PHWUR]LQH
&+12
!
!
3\UDFORVWURELQ
&+&O12
!
!
3\UHWKULQ,
&+2
!
!
3\UHWKULQ,,
&+2
!
!
3\ULPHWKDQLO
&+1
!
!
3\ULSUR[\IHQ
&+12
!
!
4XDVVLD
&+2
!
!
4XLQPHUDF
&+&O12
!
!
4XLQR[\IHQ
&+&O)12
!
!
5LPVXOIXURQ
&+126
!
!
5RWHQRQH
&+2
!
!
6SLQRV\Q$
&+12
!
!
6SLQRV\Q'
&+12
!
!
6SLURPHVLIHQ
&+2
!
!
6SLUR[DPLQH
&+12
!
!
6XOFRWULRQH
&+&O26
!
!
7HEXFRQD]ROH
&+&O12
!
!
4
Table 1 – Continued...
Compound
Formula
CAS
Transition 1
Transition 2
Pear extract
RT (min.)
Transition 1
LOD (ppb)
Transition 2
LOD (ppb)
%RSD
(10ppb)
R
2
7HEXIHQR]LGH
&+12
!
!
7HEXIHQS\UDG
&+&O12
!
!
7HIOXEHQ]XURQ
&+&O)12
!
!
7HUEXIRVVXOIRQH
&+236
!
!
7HUEXIRVVXOIR[LGH
&+236
!
!
7HWUDFRQD]ROH
&+&O)12
!
!
7KLDEHQGD]ROH
&+16
!
!
7KLDFORSULG
&+&O16
!
!
7KLDPHWKR[DP
&+&O126
!
!
7KLRGLFDUE
&+126
!
!
7KLRSKDQDWHPHWK\O
&+126
!
!
7ROIHQS\UDG
&+&O12
!
!
7ULDGLPHIRQ
&+&O12
!
!
7ULDGLPHQRO
&+&O12
!
!
7ULDVXOIXURQ
&+&O126
!
!
7ULD]DPDWHDFLG
&+126
!
!
7ULD]RSKRV
&+1236
!
!
7ULFORS\U
&+&O12
!
!
7ULF\FOD]ROH
&+16
!
!
7ULIOR[\VWURELQ
&+)12
!
!
7ULIOXPL]ROH
&+&O)12
!
!
7ULIOXPXURQ
&+&O)12
!
!
7ULIRULQH
&+&O12
!
!
7ULWLFRQD]ROH
&+&O12
!
!
=R[DPLGH
&+&O12
!
!
'
&+&O2
!
!
1HJDWLYHHOHFWURVSUD\LRQLVDWLRQ
5
+20H2+
+20H2+
)RUPLFDFLG
+20H2+
)RUPLFDFLG
+20H2+
)RUPLFDFLG
+20H2+
P0$PPRQLXPDFHWDWH
+20H2+
P0$PPRQLXPDFHWDWH
+20H2+
P0$PPRQLXPDFHWDWH
+20H2+
P0$PPRQLXPDFHWDWH
+20H&1
P0$PPRQLXPDFHWDWH
+20H2+
P0$PPRQLXPIRUPDWH
+20H&1
P0$PPRQLXPIRUPDWH
+20H2+
$FHWLFDFLG
+20H2+
)RUPLFDFLG
P0DPPRQLXPIRUPDWH
Table 2 - Results of rapid mobile phase screening using flow injection analysis for 23 pesticides. All peaks areas were normalised against
the maximum peak area achieved for that compound. Accordingly, 100 % indicates the highest peak area achieved and is highlighted.
$WUD]LQH
100
$]LQSKRVPHWK\O
100
$]R[\VWURELQ
100
&DUEHQGD]LP
100
&KORUDQWUDQLOLSUROH
100
&\SURGLQLO
100
'LIHQRFRQD]ROH
100
)OXGLR[LQLO
100
,PD]DOLO
100
,R[\QLO
100
,VRSURWXURQ
100
0HWDOD[\O
100
0\FOREXWDQLO
100
3LULPLFDUE
100
3LULPLFDUEGHVPHWK\O
100
3URFKORUD]
100
3\UDFORVWURELQ
100
3\ULPHWKDQLO
100
7HEXIHQR]LGH
100
7KLDEHQGD]ROH
100
7KLDFORSULG
100
7KLRSKDQDWHPHWK\O
100
7ULDGLPHQRO
100
0LQLPXP
0D[LPXP
Average
50
64
62
57
61
80
72
58
49
91
63
52
83
&RPSRXQG