Criterios de Validación de Métodos Microbiológicos (CCAYAC-P-062)

UL
TA
NS
CO
DE
O
NT
ME
DO
CU
"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA ANTES DE HACER USO DE ÉSTA VERSIÓN, POR SI HA SIDO MODIFICADA"
COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE
COBERTURA
GUÍA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS
DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS PARA EL ANÁLISIS DE
ALIMENTOS
VIGENTE A PARTIR DE:
FECHA DE PRÓXIMA REVISIÓN:
2012-10-15
2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 2 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
3.1.8. Los microorganismos de prueba deberán ser obtenidos colecciones nacionales o
internacionales certificados o en su defecto microorganismos obtenidos a partir de
aislamientos en el mismo laboratorio, siempre que estos estén perfectamente bien
identificados en su identidad, pereza y viabilidad.
DE
CO
NS
UL
TA
3.2. Estrategia para la evaluación del desempeño del los métodos de prueba
microbiológicos.
3.2.1. Para cada método de análisis que se implemente en el laboratorio, es necesario realizar
la evaluación del desempeño del mismo, por lo que el laboratorio debe contar con un plan
general o documento maestro de validación donde se incluya la evaluación del
desempeño de los métodos de análisis microbiológicos, en el que se deberán describir las
estrategias para alcanzar la validación en las matrices de interés del laboratorio.
3.2.2. Cada evaluación del desempeño debe documentarse mediante un protocolo, en el que se
deben mencionar los parámetros y métodos estadísticos utilizados para evaluar el
desempeño de un método microbiológico, ademas de un Informe de la evaluación en el
cual se debera incluir la descripción de las actividades realizadas, la enumeración de los
materiales, medios, reativos y equipos utilizados, su rastreabilidad y los resultados
obtenidos, la aplicación de los parametros definidos y la conclución de la evaluación del
desempeño.
DO
CU
ME
NT
O
3.3. Lineamientos
3.3.1. Siguiendo el plan de validación, cada método de prueba debe evaluarse para demostrar
que es adecuado para el analisis en cada uno de los grupos de alimentos de interes,
evaluando almenos una de las matrices que lo conforman.
3.3.2. Las muestras utilizadas preferentemente deben ser ausentes del microorganismo de
interés, pero no limitarse estos, en la presente guía se describen los criterios para el uso
de muestras no contaminadas.
3.3.3. El uso de muestras naturalmente contaminadas debe describirse en cada protocolo y no
contra decir lo descrito en la presente guía, los criterios estadísticos y las referencias
utilizadas deberán incluirse como anexos en el protocolo de validación.
3.3.4. Para el alacence del este documento se ha propuesto la siguiente clasificación del
productos de interes sanitario, basada en la experiencia de la RNLSP y lo señalado en la
ISO 16140.
Grupos de
interés
Cárnicos
Aves
Tipos de
alimentos
Crudos
Procesados
Congelados
Otros
Crudos
Procesados
Congelados
Otros
Ejemplos de
matriz:
Carne molida
Guisados
Carne
congelada
Pollo
Nugets
Milanesas de pollo
congelado
Productos de la
pesca
Crudos
Procesados
Congelados
Secos
Otros
Moluscos
Pescado
Filete
Camarón
Frutas y
Vegetales
Crudos
Procesados
Congelados
Secos
Otros
Productos
Lácteos
Crudos
Procesados
Congelados
Secos
Otros
Mango
Coctel
Leche
Queso
Leche en polvo
"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA ANTES DE HACER USO DE ÉSTA VERSIÓN, POR SI HA SIDO MODIFICADA"
COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE
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FECHA DE PRÓXIMA REVISIÓN:
2012-10-15
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Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 3 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
DO
CU
ME
NT
O
DE
CO
NS
UL
TA
3.3.5. Los criterios de selección de una matriz deben estar descritos y justificados en cada
protocolo.
 Se deberán elegir las matrices representativas que tenga el alcance de la
metodología a evaluar, una vez elegida, se deben hacer pruebas previas de
ella para conocer su microbiota. Se deberá contar con cantidad suficiente de
muestra para hacer todos los análisis. Las matrices elegidas y su justificación
deben mencionarse en el protocolo de validación.
3.3.6. Cuando se indique dos analistas diferentes, deberá entenderse como dos analistas
diferentes o un mismo analista en condiciones de trabajo diferentes, por ejemplo, fechas
de análisis diferentes, lotes de medios de cultivo diferentes etc.
3.3.7. Las cepas empleadas deberán proceder de colecciones nacionales o internacionales
certificadas o en su defecto, cepas aisladas en el laboratorio siempre que se demuestre
su identidad, pureza y viabilidad.
3.3.8. Para métodos cualitativos deberán emplearse cepas control negativo y control positivo.
3.3.8.1.
Las cepas control positivo deberán ser aquellas de propósito de interés del
método
3.3.8.2.
Las cepas control negativo deberán ser aquellas indicadas en el método de
prueba o en su defecto las que puedan mencionarse biota acompañante o que se
puedan considerar como interferentes del microorganismo control positivo.
3.3.9. Para métodos cuantitativos:
3.3.9.1.
Para los métodos de grupos microbianos, pueden utilizarse mezclas de
microorganismos.
3.3.9.2.
La verificación puede realizarse por vaciado en placa utilizando un medio como
agar cuenta estándar para los métodos cualitativos y el mismo medio que se
describa para cuenta para los métodos cuantitativos, por ejemplo: Agar Rojo Bilis
Violeta, Agar Baird Parker, etc.
3.3.10. Criterios de Aceptación
3.3.10.1. Métodos Cualitativos
Parámetro
Verificación del tamaño del
inoculo
Verificación de la muestra.
Verificación del límite de
detección.
Falsos positivos
Criterio de aceptación Métodos Cuantitativos
Al verificar el tamaño del inoculo por lo menos seis veces en promedio se obtienen cuentas de
menos de 10 UFC* y ninguna de 10 UFC o mas.
Numero de repeticiones: 3
Analistas: uno
Resultados positivos: 0%
Numero de repeticiones: al menos 10 por analista
Analistas: al menos dos
Resultados positivos: al menos el 80 %
Tamaño del inoculo: menos de 10 UFC
Numero de repeticiones: al menos 10 por analista
Analistas: al menos dos
Resultados positivos: 100 %
Tamaño del inoculo: mas de 100 UFC
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2012-10-15
2015-10-15
Parámetro
Incertidumbre
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 4 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Criterio de aceptación Métodos Cuantitativos
Mencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a las mediciones.
* Preferentemente menores o iguales a 5 UFC
DE
Reproducibilidad
Resultado: r < 3
Muestras no contaminadas:
Número de repeticiones: por lo menos 10 por
analista
Número de analistas: por lo menos 2
Nivel de fortificación: Al menos 1 (medio)
Cálculo:
Resultado: r < 3
Muestras contaminadas:
Número de repeticiones: por lo menos 10 por
analista
Número de analistas: por lo menos 2
Nivel de fortificación: no aplica
Cálculo:
Resultado: R < 3
O
Resultado: R < 3
Solo muestras no contaminadas:
Numero de repeticiones: por lo menos 10
Número de analistas: uno
Nivel de fortificación: por lo menos uno (medio)
Cálculo:
NT
Recuperación
NS
Repetibilidad
Criterio de aceptación Metodos cuantitativos
Muestras no contaminadas:
Muestras naturalmente contaminadas:
Número de repeticiones: 10
Número de repeticiones: 10
Número de analistas: uno
Número de analistas: uno
Nivel de fortificación: Al menos uno (valor medio)
Nivel de fortificación: no aplica
Cálculo:
Cálculo:
CO
Parámetro
Métodos Cuantitativos
UL
TA
3.3.10.2.
DO
CU
ME
Resultado: Entre el 90% y el 110% log
Solo muestras no contaminadas:
Numero de repeticiones: por lo menos 10
Número de analistas: uno
Nivel de fortificación: por lo menos uno (medio)
Cálculo:
Sesgo
Resultado:
Incertidumbre
La diferencia absoluta de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log
a) Especificar el mensurando.
b) Identificar las fuentes de incertidumbre.
c) Realizar cálculos para la incertidumbre global
4. DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD.
Etapa
Actividad
Responsable
4.1 Elaboración Elabora el protocolo, cumpliendo con los requerimientos mínimos Responsable
del protocolo
indicados en el anexo: Elaboración del protocolo
de
la
validación
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2015-10-15
Hoja: 5 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
UL
TA
Actividad
Responsable
Selecciona la muestra con base en criterios definidos en el plan de Responsable
validación. Preferentemente muestras no contaminadas.
de
la
Validación
Se asegura de contar con la cantidad de muestra necesaria para
completar la evaluación del desempeño.
Verifica la presencia o ausencia del microorganismo(s) de interés
en la muestra.
Realiza los cálculos para determinar el tamaño del inóculo.
Responsable
de
la
Siguiendo un método comúnmente utilizado por el laboratorio validación.
realiza la estandarización del inoculo (puede consultarse el anexo
1 de la presente guía como referencia).
CO
4.3 Preparación
del inoculo
Rev. 1
NS
Etapa
4.2 Selección
de la Matriz
Clave: CCAYAC-P-062
DE
Verifica en tres ocasiones distintas la preparación del inoculo.
Durante la evaluación del desempeño verifica el inoculo empleado
y lo identifica como valor de referencia.
4.4 Preparación
de la muestras
NT
O
Nota: La verificación del tamaño de inoculo debe comprobarse durante la ejecución del protocolo
para cada suspensión de microorganismos empleada. Dicha verificación deberá realizarse por lo
menos por sextuplicado.
Homogeniza la muestra perfectamente.
ME
Nota: se recomienda que las muestras perecederas sean analizadas de inmediato o en su defecto
mantenerse en refrigeración.
Responsable
de
la
validación
DO
CU
Fortificación de la muestra.
En condiciones asépticas pesa la muestra conforme al método de
prueba he inocula la muestra con el microorganismo de prueba.
Alternativamente puede inocularse la muestra antes de realizar los
sub muestreos, procurando homogenizar perfectamente.
4.5 Ejecución
del protocolo.
La fortificación de la muestra debe realizarse conforme se
describe para cada tipo de método.
Siguiendo el método de prueba analiza la muestra el numero de Responsable
veces que corresponde, según los criterios de aceptación
de
la
validación
Ejemplo 1:
Métodos cualitativos
Se desea validar el método cualitativo para aislamiento de un patógeno; para la verificación del
límite de detección deberá prepararse un inóculo de menos de 10 UFC, preferente mente 5 UFC del
microorganismo control positivo y para verificación de los falsos positivos las muestras deberán
inocularse con mas 100 UFC del microorganismos control negativo
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2012-10-15
2015-10-15
Etapa
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 6 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Actividad
Responsable
Al realizar las pruebas para la preparación del inoculo control positivo se determina que en la
dilución 10-7, se obtienen 820 UFC/mL.
UL
TA
El día de la prueba se deberá preparar una suspensión de microorganismos de la misma forma que
en las pruebas anteriores y realizar diluciones decimales hasta 10 -9, en teoría en esta dilución
deberían encontrase aproximadamente 8 UFC, a partir de esta dilución, transferir 0.5 ml a cada una
de las muestras (10), inmediatamente después de cada inoculo colocar 0.5 ml de la suspensión del
microorganismo en una placa de Petri para realizar la verificación del inoculo.
NS
Para la verificación del inóculo, incubar en condiciones adecuadas y hacer los cálculos para
determinar la cantidad de microorganismos inoculados a la muestra. La prueba es válida si en
promedio se encuentran menos de 10 UFC, ya que los inóculos idealmente deben ser menores de 5
UFC, podrían encontrarse cuentas <1 UFC, sin embargo el promedio de todas las placas debe ser
menor de 10UFC y ninguno de los inóculos mayor de 10 UFC
CO
Podrían obtenerse resultados como:
3, 4, 2, <1, 3, 2, 4, 3, 8, 5
Promedio:3.4 es decir 3 UFC
Por lo tanto se cumple el criterio de verificación del inoculo.
DE
Para las muestras inoculadas proceder como se indica en el método de prueba. Registrar los
resultados de ausencia y presencia.
Supongamos que para la verificación de limite de detección se obtienen los siguientes resultados:
Ausencia 1
Presencia 9
NT
O
Puede concluirse que se cumple el criterio de aceptación del limite de detección, ya que el 90 % los
resultados tiene resultado esperado.
Para las muestras inoculadas con la cepa control negativo, debería obtenerse que
ME
Ausencia 10
Presencia 0
Por lo que puede concluirse que se cumple el criterio.
DO
CU
Al mismo tiempo que se analizaron las muestras inoculadas deberá analizarse por lo menos por
triplicado la muestra si en ninguna de las muestras se confirma la ausencia del microorganismo de
interés se puede concluir que no hay interferencia y por lo tanto se cumple el criterio de verificación
de la muestra.
Ejemplo 2:
Métodos cuantitativos
Para la preparación del inoculo se debe usar por lo menos pero no limitado un nivel de fortificación,
para fines de cálculo es necesario considerar el valor medio del intervalo de lectura. Cuando el
método de prueba indica que se deben contar cajas con cuentas entre 25 y 250 UFC, el valor medio
(realizando la linerización de la variable mediante el uso de logatimo) es de 79 UFC.
Por lo anterior, en las placas de lectura deberían encontrarse aproximadamente 80 UFC, si cada
placa se inocula con un mL, entonces deben inculcarse 80 UFC/ml, digamos de la dilución 10 -2, asi
que en la dilución 10-1 debería haber 800 UFC, si se utilizan muestras de 25 g entonces cada
muestra debería inocularse con 20 000 UFC
Nota: Todos los inóculos deben ser verificados utilizando la técnica de vaciado en placa, empleando
para el cálculo 6 cajas.
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Etapa
4.6 Cálculos.
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 7 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Actividad
Métodos cuantitativos
Responsable
Repetibiliad
Calcular las unidades formadoras de colonias en cada repetición y calcular el log.
Placa 1
Placa 2
Promedio
Cuenta
log
Repetición 1
Repetición 2
Repetición 3
Repetición 4
Repetición 5
Repetición 6
Repetición 7
Repetición 8
Repetición 9
70
71
80
76
78
77
56
87
77
90
91
80
82
82
88
80
80
86
80
81
80
79
80
83
68
84
82
8000
8100
8000
7900
8000
8300
6800
8400
8200
3.90
3.91
3.90
3.90
3.90
3.92
3.83
3.92
3.91
NS
UL
TA
Repetición
RSD =
CO
Calcular la desviación estándar relativa, como el cociente de la desviación estándar sobre la media.
s
x
0.03
3.90
0.007
10
1%
NT
O
Desviación estándar
Promedio
DSR
n
r
DE
Calcular el valor de r
ME
Reproducibilidad
DO
CU
Utilizando el método de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentes procederán
como se describió antes, considerando la aplicación de la siguiente formula.
Recuperación
Con los datos obtenidos en repetibilidad en muestras fortificadas calcular la cantidad de UFC, en
cada repetición y calcular el logaritmo de cada cuenta, promediar los logaritmos. Calcular el
logaritmo del inóculo verificado.
Sesgo
Finalmente calcular el % de recuperación
% Recuperación= Media de la cuenta de logaritmo de las cuentas x100
Logaritmo de las UFC inoculadas
A partir de los cálculos de recuperación, calcular la diferencia de la media de los logaritmos de las
cuentas menos el logaritmo del inóculo utilizado.
|
|
Donde:
Ve= valor esperado
Vo= valor obtenido
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2015-10-15
Rev. 1
Hoja: 8 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Actividad
Para métodos cualitativos menciona las fuentes de incertidumbre
Distribución de los microorganismos en la muestra;
Efecto de la matriz;
Personal operativo;
Mediciones (pesada o medición de la muestra);
Diluciones y volúmenes;
Homogeneización;
Calidad de los medios;
Tiempo hasta la inoculación;
Temperatura de incubación;
Responsable
Responsable
de
la
validación.
NS
UL
TA
Etapa
4.7 Definición
de la
incertidumbre
Clave: CCAYAC-P-062
ME
NT
O
DE
CO
Para métodos cuantitativos mencionar las fuentes de
incertidumbre, además considerar que:
La Naturaleza de los Métodos Microbiológicos de Recuento
Dado el carácter de los ensayos microbiológicos, métodos
empíricos, donde es difícil construir un modelo apropiado que
permita cuantificar las contribuciones de cada paso a la
incertidumbre del proceso de medida y, la poca disponibilidad de
materiales de referencia certificados que representen al
microorganismo en su hábitat natural, el consenso actual sobre la
estimación de la incertidumbre en los ensayos microbiológicos
cuantitativos es que la precisión es el componente más importante
y el único que puede determinarse de una manera práctica,
mediante la utilización de datos experimentales.
DO
CU
Un Método empírico:
Es un método que determina un valor al que sólo se puede llegar
en términos del método en cuestión y que, por definición, sirve
como el único método para establecer el valor aceptado del
parámetro medido (AOAC).
Un método de ensayo diferente (a menudo para el mismo analito)
puede dar un resultado diferente, dado que el mensurando se
define en los términos del método. Por esta razón, en los métodos
microbiológicos cuantitativos, el sesgo o “bia ” n c ntribuy a la
incertidumbre del método, dado que los resultados dependen de
las condiciones definidas en el método, tales como, la temperatura
y tiempo de incubación, los medios de cultivo, etc.
A partir de muestras naturalmente contaminadas o inoculadas.
Dos analistas, analizan simultáneamente 10 muestras, y se realiza
el siguiente calculo.
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2012-10-15
2015-10-15
Etapa
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 9 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Actividad
Responsable
DE
CO
NS
UL
TA
Donde
yij :son los datos transformados a logaritmo, en log10 (ufc / g) o log10 (ufc / ml);
i :es el índice de la muestra, i = 1 a n (n > 10);
j :es el índice de la condición de reproducibilidad, j = A o B.
NT
O
La incertidumbre expandida U tal como se define por GUM, se
deriva de la incertidumbre estándar combinada uc(y), con un factor
de cobertura k elegido en esta Especificación Técnica como un
valor de 2 (como para corresponder aproximadamente a un nivel
de confianza del 95%):
ME
U = 2uc(y) = 2 sR
Elabora informe conforme a lo descrito en el anexo: Elaboración
del Informe
DO
CU
4.8 Elaboración
del informe
Responsable
de
la
validación
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2015-10-15
5
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 10 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Diagrama de flujo
Etapa
Inicio
.

Elabora el protocolo.
.

Selecciona la muestra

Se asegura de contar
con la cantidad
de muestra necesaria

Verifica la presencia o ausencia
del microorganismo(s)
de interés en la muestra

Realiza los cálculos
para el inoculo

Estandariza inoculo

Verifica el inoculo por triplicado .

Registra como valor de
referencia.

Homogeniza la muestra
Perfectamente
.

Fortifica la Muestra

Analizar la muestra
.

Repetir según criterios

Realiza los cálculos para:

Métodos Cuantitativos:
Repetibilidad, Reproducibilidad,
Recuperación y Sesgo

Verifica el inoculo por triplicado .

Registra como valor de
referencia.

Métodos cualitativos:
Menciona fuentes
de incertidumbre.

Métodos Cualitativos
Determina Incertidumbre
expandida:

Elabora informe
.

FIN
O
DE
4.3 Preparación del inoculo
CO
NS
4.2 Selección de la Matriz
.
UL
TA
4.1 Elaboración del protocolo
Responsable de la valiación
NT
4.4 Preparación de la muestras
DO
CU
ME
4.5 Ejecución del protocolo.
4.6 Cálculos.
4.7 Definición de la incertidumbre
4.8 Elaboración del informe
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2015-10-15
6
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 11 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Glosario.
Analito: Componente medido por el método de análisis, puede ser un microorganismo o un grupo
microbiano. Microorganismo de prueba.
UL
TA
Blanco: Es el alimento usado como matriz, en el que no está el analito de interés.
Coeficiente de Variación (CV): Es la relación entre la desviación estándar y la media multiplicada
por 100.
NS
s
CO
CV= ´100
x
DE
Exactitud relativa ó recuperación:
Es la aproximación entre un resultado de la prueba y el valor de referencia aceptado. Para el
propósito de esta guía, es la cantidad de microorganismo recuperado entre la cantidad de
microorganismo inoculado o nivel de fortificación.
NT
O
Fase estacionaria.- Es el intervalo de tiempo en donde la curva de crecimiento microbiana se
hace constante y antecede a la muerte microbiana. En esta etapa se puede conocer con cierta
seguridad y durante un lapso corto de tiempo la concentración microbiana.
ME
Fortificación de la muestra. Inoculación de una cantidad conocida del o los microorganismos de
prueba.
DO
CU
Incertidumbre de medida: Parámetro, asociado al resultado de una medición, que caracteriza la
dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al mesurando.
Intervalo de trabajo: Intervalo comprendido entre las concentraciones superior e inferior, en el
cual el analito puede cuantificarse con un nivel satisfactorio de repetibilidad y recuperación.
Límite de detección: Es el numero más pequeño de microorganismos en una muestra que puede
ser detectado bajo las condiciones de análisis. El limite microbiológico de una prueba determina la
presencia o ausencia de microorganismos por ejemplo ausencia de Salmonella spp. en 25 g de
muestra.
Matriz: Es la muestra de alimento en la que potencialmente se encuentra el analito.
Método Normalizado: Proceso de medición robusto donde pequeñas variaciones en el
procedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones en los resultados.
Métodos internacionalmente aceptados y validados.
"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA ANTES DE HACER USO DE ÉSTA VERSIÓN, POR SI HA SIDO MODIFICADA"
COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE
COBERTURA
GUÍA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS
DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS PARA EL ANÁLISIS DE
ALIMENTOS
VIGENTE A PARTIR DE:
FECHA DE PRÓXIMA REVISIÓN:
2012-10-15
2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 12 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Nivel de fortificación o tamaño del inóculo: Es la cantidad conocida de microorganismos
inoculados a una muestra.
UL
TA
Protocolo para la evaluación del desempeño: Documento que describe los pasos a seguir
durante la evaluación del desempeño de un método analítico microbiológico, cuyo fundamento se
encuentra descrito en el presente documento.
NS
Resultado Aberrante: Corresponde a cualquier valor extremo que ocurra durante la ejecución de
la prueba. En menos de 1% de las pruebas esos resultados pueden ocurrir aleatoriamente en
situaciones normales.
DE
CO
Evaluación del desempeño: Es el proceso que realiza un laboratorio para demostrar que un
método normalizado produce consistentemente resultados confiables en las condiciones
particulares del laboratorio. Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que un
método analítico validado internacionalmente cumple con su propósito en las condiciones
particulares del laboratorio donde se realiza el análisis.
NT
O
Repetibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos individuales obtenidos
por la aplicación de un mismo procedimiento analítico, a diferentes porciones de la misma matriz,
en las mismas condiciones de análisis (analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortos
de tiempo.
Documentos de referencia.
DO
CU
7
ME
Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos individuales
obtenidos por la aplicación de un mismo procedimiento analítico, a diferentes porciones de la
misma matriz, realizadas bajo distintas condiciones de medición (personal) y en diferentes
tiempos (o a intervalos de tiempos más largos).
Documento
Criterios de aplicación de la norma 17025 de la EMA
USP 32, <1223> Validation of Alternative Microbiological Methods.
USP 32, <1225> Validation of Compendial Procedures
USP 32, <1227> Validation of Microbiological Recovery from Pharmacopeical
Articles
Dulce Toccheto S. Curso-teórico-práctico Validación de Métodos Microbiológicos
bajo un Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Santa Cruz de la Sierra Bolivia.
Proyecto TCC/ Bolivia-México. 2007.
European Cooperation for Accreditation EA-04/10 Accreditation for Microbiological
laboratories. 2002.
Código
No aplica
No aplica
No aplica
No aplica
No aplica
No aplica
"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA ANTES DE HACER USO DE ÉSTA VERSIÓN, POR SI HA SIDO MODIFICADA"
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Rev. 1
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SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Código
No aplica
No aplica
Registros:
Tiempo de
conservación
ME
Registro
NT
8
Responsable de
conservarlo
Permanente
Cada Laboratorio
Informes
Permanente
Cada Laboratorio
Generados por la
evaluación del desempeño.
Permanente
Cada Laboratorio
DO
CU
Protocolo
9
No aplica
No aplica
No aplica
No aplica
No aplica
O
DE
CO
NS
UL
TA
Documento
G.A. Leotta, I. Chinen. Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección
de Escherichia coli productor de toxina shiga. Revista Argentina de Microbiología.
Vol.37, No. 1 2005.
Guía de Validación de Métodos Analíticos. Colegio Nacional de Químicos
Farmacéuticos Biólogos de México, A.C. Edición 2002.
ISO/IEC. 2003. International Standard ISO 16140:2003 (E). Microbiology of food
and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods. First
Edition.
ISO/TR 13843:2000 - Water Quality — Guidance on Validation of Microbiological
methods. First Edition.
ISO 17994:2004 Water Quality—Criteria for Establishing Equivalence between
Microbiological methods. First Edition.
The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics. Eurachem Guide. 1998. Disponible en
http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf (febrero 2011)
Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods
Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food
Microbiological Official Methods of Analysis. 2002. Disponible en
http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-Appendix-X.pdf (febrero 2011)
Clave: CCAYAC-P-062
Código de registro e
identificación única
CCAYAC-PV-Número
asignado por GGC
CCAYAC-IV-Número
asignado por GGC
No aplica
Anexos
9.1 Elaboración del protocolo
9.2 Elaboración del informe
9.3 Anexo Informativo: Preparación y ajuste del inóculo
9.4 Guía Informativa para la fortificación de una matriz.
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2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 14 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
9.1 Elaboración del protocolo
Estructura para el protocolo para la evaluación del desempeño de métodos de análisis microbiológicos:
Protocolo para la evaluación del desempeño del método: el nombre y clave
del método que se pretende evaluar.
Considerar los parámetros de desempeño a evaluar y el analito a
determinar
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la validación
Elaborar un diagrama de flujo del método en cuestión
Mencionar el equipo a utilizar y las condiciones que requiere (verificación
y/o calibración, si aplica)
Indicar los materiales a utilizar
a) Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado.
b) Indicar los medios de cultivo a utilizar
c) Indicar las cepas que se usaran y la forma de preparar los inóculos
2. Campo de aplicación
3. Método de ensayo
4. Equipo
5. Materiales
6. Reactivos y Medios de
Cultivo
CO
1.Objetivo
NS
UL
TA
Título
DE
Indicar las características, forma de almacenamiento y cantidades de
muestra estimadas para llevar a cabo la validación.
Detallar la preparación de los blancos de muestra o muestras adicionadas.
8. Desarrollo
Detallar las instrucciones para cada uno de los parámetros de desempeño
experimental
a ensayar.
9. Resultados
Formato para el registro de resultados
Establecer para cada parámetro de desempeño la herramienta estadística
10. Análisis estadístico
a utilizar para su evaluación.
11. Criterios de
Establecer los criterios de aceptación que deben cumplirse con su
aceptación
respectiva referencia bibliográfica.
Nota: El protocolo debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó.
DO
CU
ME
NT
O
7. Muestras
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2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
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SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
9.2 Elaboración del Informe
Estructura del informe de evaluación del desempeño:
4. Equipo
5. Materiales
6. Reactivos y Medios de
cultivo
Indicar las características, forma de almacenamiento, marca, presentación,
caducidad y cantidades de muestra utilizadas para llevar a cabo la
validación.
Detallar la preparación de los blancos de muestra o muestras adicionadas
utilizadas.
O
DE
7. Muestras
Incluir el diagrama de flujo del método.
NT
8. Método de ensayo
Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los
parámetros de desempeño.
Presentación de resultados en forma de tablas, señalando fechas de inicio
10. Resultados
y término, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de prueba, matriz,
unidades y clave de bitácora o registro primario
Presentar en forma de tabla los criterios de aceptación considerados y los
11. Análisis de resultados
resultados obtenidos y hacer las observaciones correspondientes.
Efectuar una conclusión final en donde se señale que el método se ajusta al
12. Conclusión
uso propuesto (Numeral 5.4.3 17025)
13. Bibliografía
Referencias utilizadas.
Los que aplique:
 Registros primarios,
 Bases de datos utilizadas
 Certificados de equipos,
14. Anexos
 Medios de cultivo
 Cepas
 Formatos de verificación,
 Gráficos de control, etc.
Nota: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó.
DO
CU
ME
9. Desarrollo
experimental
UL
TA
2. Campo de aplicación
NS
1.Objetivo
Informe de resultados de la evaluación del desempeño del método: el
nombre y clave del método que se evalúo.
Considerar los parámetros de desempeño evaluados y el analito
determinado.
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplicó la validación
Listado
de
los
equipos
utilizados
y su
estado
de
calibración/verificación/mantenimiento
Listado de los materiales utilizados.
Listar los reactivos y medios utilizados y su estado de calidad.
CO
Título
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2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 16 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
9.3 Anexo Informativo: Preparación y ajuste del inóculo.
Este procedimiento es general y adecuado para la mayoría de los microorganismos de prueba, pueden
aplicarse variaciones en este, siempre que se obtengan inóculos constantes.
NS
UL
TA
Inocular una colonia tomada a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba en 9ml de caldo
BHI o cualquier otro caldo de enriquecimiento, incubar a 35ºC +/- 2ºC, por 22h a 24h, (este tiempo
puede ser diferente dependiendo de la experiencia en el laboratorio y el tipo de microorganismo del que
se trate) del cultivo transferir un mililitro a 90ml de BHI e incubar a 35ºC +/- 2ºC, por 22h a 24h, a partir
del cultivo hacer diluciones decimales, de cada una de ellas transferir por duplicado un mililitro a cajas
de Petri y adicionar agar cuenta estándar, incubar a 35ºC +/- 2ºC, por 18h a 24h, realizar el conteo en
cada dilución para conocer la concentración de microorganismos.
DE
CO
Registrar los resultados indicando la concentración de microorganismos en cada dilución. Estos
resultados servirán de referencia para la estimación de la dilución adecuada a utilizar durante la
fortificación de las muestras en la evaluación del desempeño del método de prueba.
O
Antes de cada prueba deberá repetirse la preparación del inóculo de forma idéntica que en la
determinación de concentración de la cuenta bacteriana en la fase estacionaria y cada inóculo deberá
ser verificado por vaciado en placa utilizado al menos dos cajas.
DO
CU
ME
NT
Nota 1: Con la prueba previa de fase estacionaria se fija el tiempo de incubación, volumen necesario que lleve la concentración
microbiana, para fortificar cada una de las alícuotas de acuerdo al protocolo de evaluación de desempeño del método en particular.
Durante su manipulación se recomienda sumergir el recipiente que contiene la FE en agua fría.
Nota 2: Cuando la matriz sea sólida, fortificar las alícuotas. Si es líquida se puede fortificar la matriz completa o las alícuotas.
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COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE
COBERTURA
GUÍA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS
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ALIMENTOS
VIGENTE A PARTIR DE:
FECHA DE PRÓXIMA REVISIÓN:
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Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 17 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
9.4 Guía Informativa para la fortificación de una matriz
La fortificación de muestras se hace por medio de la adición de diluciones conocidas del
microorganismo a prueba, a partir de un inoculo conocido, en la matriz en cuestión, como sigue:
UL
TA
Estimación de la dilución de trabajo
A partir de un cultivo del microorganismo de interés en BHI (o cualquier otro medio de enriquecimiento).
Hacer diluciones decimales hasta 10-9 en agua peptonada amortiguada al 0.1%; o el diluyente que
utilice el laboratorio.
NS
Hacer recuento por triplicado de las diluciones, 10-6, 10-7, 10-8 y 10-9 en agar soya tripticaseina o Agar
cuenta estándar.
DE
CO
Realizar las lecturas y cálculos de los números de células en cada una de las diluciones para establecer
la dilución que será usada en la fortificación de la matriz y registrar los resultados de los recuentos y
cálculo.
DO
CU
ME
NT
O
Preparación del Inóculo
Preparar un nuevo cultivo en caldo BHI, preparar las diluciones necesarias con base en los resultados
obtenidos en la estimación de la dilución de trabajo, verificar la concentración del inóculo por
sextuplicado.
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COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA
CONTROL DE CAMBIOS DE DOCUMENTOS DEL SISTEMA DE
GESTIÓN DE LA CALIDAD
Revisión No:
CLAVE:
1
Fecha de emisión:
2012-10-15
GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE
MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS PARA EL
ANALISIS DE ALIMENTOS
PÁGINA
REVISIÓN: 0
NUMERAL O
PÁRRAFO
Todo el
documento
CLAVE:
CAMBIOS:
Se especifica el alcance a alimentos
Titulo
CCAYAC-P-062
UL
TA
FECHA: 2011-03-28
CCAYAC-P-062
NS
Se organizo toda la información, para cumplimiento del nuevo formato
de procedimientos.
Todo el
documento
CO
De 1 a 17
Se modifican los criterios de aceptación:
Se reduce el número de repeticiones para métodos cualitativos y se
incluye el uso de cepas control positivo y negativo.
DE
Se eliminan los anexos informativos de formatos y guías para hojas de
calculo.
O
2
DO
CU
ME
NT
1/17
Se incluyen los cálculos para incertidumbre de métodos cuantitativos.
Se especifica el alcance a alimentos y agua.
Cambio de redacción.
CCAYAC-F-001/3
"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA ANTES DE HACER USO DE ÉSTA VERSIÓN, POR SI HA SIDO MODIFICADA"