0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 7. APÉNDICE 1 7

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
Sección 7. APÉNDICE
7. APÉNDICE. PREPARACIÓN DE REACTIVOS.
SECCIÓN I. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Determinación de concentración de proteínas por Lowry y Absorbancia a 280 nm
Solución
Método de preparación
Solución de carbonato- Pesar y disolver 10 g de Na2CO3 en un volumen aproximado de
tartrato y cobre (CTC)
60 mL, todavía en agitación añadir 0.1 g de CuSO4 y 0.2 g de
tartrato de Na+ y K+, añadir H2O cuanto baste para 100 mL
10% Dodecil sulfato de 10 g de SDS y disolver con H2O
sodio (SDS o también
llamado lauril sulfato de
sodio)
0.8 NaOH
Reactivo A
3.2 g NaOH para 1000 mL
Mezclar con partes iguales de CTC, 10% SDS, NaOH, 0.8 N y
H2O
Reactivo B
Dilución del reactivo Folin Ciocalteau.
1 Folin Ciocalteau + 5 H2O
Solución estándar de Pesar 100 mg y disolver en 100 mL de agua destilada.
albúmina
de
suero
bovino 1mg/mL
SECCIÓN II. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS.
Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino.
Parte I. Extracción y precipitación por salado
Solución
Método de preparación
0.03M KOH
Pesar 1.6833 g de KOH para 1L
Comentarios
Es estable 2 meses a temperatura
ambiente.
Usar cubrebocas para su preparación.
No almacenar en frío ya que se
precipita a temperaturas menores de
17°C, pero se redisuelve si la
temperatura se eleva.
Se prepara antes de usarse
Guardar la solución en alícuotas a –
20°C
Comentarios
Solución por grupo
Guardar a 4°C.
Parte II. Desalado y purificación por cromatografía de intercambio iónico y de afinidad
Solución
Método de preparación
Comentarios
2.5 % Sephadex-G25 Hidratar 10 g Sefadex-G-25 con 160 mL de agua estéril durante El sefadex hidratado se puede
(p/V)
24 h a 4ºC. Cantidad que alcanza como para 50 columnas.
almacenar a 4°C por al menos un mes.
Los laboratoristas entregarán una
columna
empacada
con
sefadex/equipo.
1
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Enpacado de la columna
A una columna de cromatografía se le adicionan 2.0 mL
con Sephadex G-25
de la suspensión de Sephadex-G25. Centrifugar a 3,000
rpm durante 5 min, o esperar a que el líquido drene de la
columna. Repetir la operación hasta que la columna
llegue a un volumen final de 1 mL.
Amortiguador Tris-βmercaptoetanol (10 mM
de Tris/HCl pH 8.8; 0.5
mM β-Mercaptoetanol)
400mM PMSF
Sección 7. APÉNDICE
1. Cada vez que se centrifuga la
columna, es importante revisar que
no se hayan producido burbujas y
que el flujo del líquido sea
constante.
2. Las columnas se pueden reusar
varias veces, mantenerlas
húmedas, tapadas con parafilm y a
4°C. Lavarlas antes de usar.
Para 104 mL disolver 0.126 g Tris en un poco menos de 90 mL Se usará para preparar dos soluciones
de agua destilada, ajustar el pH a 8.8 con HCl, después distintas ver abajo.
adicionar 3.6 µL de β-Mercaptoetanol y ajustar el volumen a 104
mL con agua destilada.
Disolver 0.209 g de PMSF en 3 mL de etanol, mezclar bien y 1. El PMSF; se añade justo antes de
usarse.
almacenar en microtubos de centrífuga a -20°C.
2. Proporcionar por grupo 250 µL de
400 mM PMSF.
84 mL / grupo
Para 13 mL de amortiguador los
A 4 equipos entregarles alícuotas de 13 mL de Tris-βestudiantes añadirán 32.5 µL de 400
mercaptoetanol a los otros 4 equipos darles 8 mL a cada uno y
mM PMSF. Para 8 mL añadir 20 µL de
además proporcionar una solución stock de PMSF/grupo para
400 mM PMSF.
añadirle al amortiguador.
Amortiguador Tris-βmercaptoetanol-PMSF
(10 mM de Tris/HCl pH
8.8; 0.5 mM βMercaptoetanol y 1 mM
PMSF).
Macro-Prep
High
S Lavar la matriz con 2 a 3 volúmenes del amortiguador de Proporcionar lavada a los estudiantes
support (BIORAD)
equilibrio (de preferencia esterilizar antes el amortiguador).
Guardar a 4°C.
Amortiguador
de 8 mL/ equipo
equilibrio (50 mM de
fosfatos pH 7.0)
Mezclar 30.75 mL 1M K2HPO4 y 19.25 mL de 1M NaH2PO4 y
ajustar el volumen a 1 L (solución suficiente para 8 grupos y
para lavar la matriz).
2
Se sugiere hacer los stocks de 1 M
K2HPO4 y 1M NaH2PO4, ya que
también se utilizará amortiguador de
fosfatos en la parte de cinética
enzimática. Se almacenan por al menos
1 mes a 4°C.
1M NaH2PO4ּH2O, para preparar 100
mL pesar 13.79 g
1M K2HPO4 pesar 17.41 y ajustar a 100
mL
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Matriz
Cibacrón-blue Lavar la matriz con 2 a 3 volúmenes del amortiguador Tris-βagarosa presentación en mercaptoetanol (de preferencia esterilizar antes el
suspensión
(SIGMA amortiguador).
C1535)
Amortiguador de elución 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0 y 1 M de NaCl.
Mezclar 7.7 mL 1M K2HPO4 y 3.85 mL de 1M NaH2PO4 en un
volumen menor 200 mL, añadir 11.7 g de NaCl, disolver y
ajustar el volumen a 200 mL.
+
Amortiguador de NAD
20mL/ 4 equipos (solución que se entrega por grupo)
(10 mM de Tris-HCl pH Repartir 20 mL de Tris-β-mercaptoetanol y proporcionar 0.0018
8.8, 0.5 mM de β- g de NAD+
mercaptoetanol y 5 mM
de NAD+).
Sección 7. APÉNDICE
Guardar a 4°C.
Entregar en un frasco al profesor 16-20
mL de matriz ya lavada.
Almacenar a 4°C.
Disolver el NAD+ justo antes de
usarse.
Parte III. Determinación de concentración de proteínas y separación por electroforesis en gel de poliacrilamida- SDS
Solución
Método de preparación
Comentarios
Reactivo de Bradford
Reactivo preparado (SIGMA)
Guardar a 4°C.
Solución estándar de
albúmina de suero
bovino (BSA) 0.1mg/mL.
pesar 0.1g de BSA en un tubo microfuga, y disolverla en 1 mL Guardar a –20°C
de H2O bidestilada. Tomar 100 µL de la solución de BSA 100
mg/mL colocarla en un tubo para microfuga y añadirle 900 µL de
H2O bidestilada, la solución quedo 10 mg/mL. Volver ha hacer
una dilución 1:10 para obtener una solución de 1 mg/mL de
BSA. Por último volver ha hacer una dilución 1:10 para obtener
una solución de 0.1 mg/mL de BSA. Esta es la solución de
referencia.
Separación de las proteínas en gel de poliacrilamida-SDS
Solución
Método de preparación
Comentarios
Acrilamida.
Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% N’N’metilen-bisacrilamida,
disuelto en agua.
2 M Tris /HCl pH 8.8
Para 200 mL pesar 48.45 g de Tris. Ajustar el pH con HCl.
Precaución. La acrilamida es un
neurotóxico y es absorbido por la piel.
Usar guantes al manipularlo.
Almacenar a temperatura ambiente.
0.5 M Tris/HCl pH 6.8
Para 200 mL pesar 12.114 g de Tris. Ajustar el pH con HCl.
Almacenar a temperatura ambiente.
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10% SDS
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1 g de SDS para 10 mL de agua destilada
de 350 µL de 1M Tris base.
250 µL al 20% SDS.
160 µL de 1 M ditiotreitol (DTT).
150µL al 50% Glicerol.
20 µL de azul de bromofenol (20%).
70 µL de H2O.
Hacerlo en tubos de microfuga
Amortiguador de corrida -Preparar un stock a 5X
0.25N Tris Base, 1.9M Glicina, 0.5 % SDS (30.285 g Tris; 142.62
g Glicina, 5 g SDS para 1L)
-Tomar 200mL del amortiguador 5X y llevarlo a 1L.
Solución teñidora
0.125% (p/v) azul de Coomasie Blue R250.
50% (v/v) metanol.
10% (v/v) ácido acético
Solución desteñidora
45% Metanol.
10% ácido acético
SECCIÓN III. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Amortiguador
muestra
Sección 7. APÉNDICE
Pesar usando cubrebocas.
No colocar en frío.
Almacenar a –20 0C
Almacenar a 40C, este reactivo se
puede reutilizar hasta que la solución
cambie a un color amarillo.
Solución reutilizable
Parte I: Curvas temporales de actividad enzimática de la lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino.
Solución
Método de preparación
Comentarios
1 M Amortiguador de Mezclar 30.75 mL de K2HPO4 1M y 19.25 mL de NaH2PO4 1M y Guardar a 4°C.
fosfatos pH 7.0
aforar a 500 mL. Solución suficiente para todo un semestre.
10 mM Piruvato
sodio
4 mM NADH.
de Para un volumen de 2 mL, pesar 0.0022g de piruvato de sodio.
Para un volumen de 2 mL, pesar 0.0054g de NADH.
Reactivo que debe ser preparado justo
antes de usarlo.
Reactivo que debe de disolverse justo
antes de usarlo.
SECCIÓN V: ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Solución
Cultivo de E. coli
Transferencia de material genético I: Conjugación
Método de preparación
Comentarios
Cultivada por una noche en caldo Luria a 37ºC.
Proporcionada por el cepario.
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JM1452StrR
(cepa receptora)
Cultivo de E. coli
W3110/F´KmTn3
(cepa donadora)
Cultivada por una noche en caldo Luria a 37ºC.
Luria líquido
Medio Luria líquido en tubos para realizar conjugación
5 cajas Petri con medio Una vez esterilizado el medio líquido o en agar en autoclave a
Luria-agar-2%
121°C, dejar enfriar a 50-55°C antes de adicionar el antibiótico
estreptomicina
(25 par evitar que sea inactivado por el calor.
Preparar una solución de 20 mg/mL de sulfato de estreptomicina
µg/ml)
en agua. Esterilizar por filtración y guardar en alícuotas a –20°C.
Adicionar al medio estéril enfriado a 50-55°C para tener una
concentración final de 25 µg/mL
2 cajas Petri con medio Una vez esterilizado el medio líquido o en agar en autoclave a
Luria-agar-2% sulfato de 121°C, dejar enfriar a 50-55°C antes de adicionar el antibiótico
kanamicina (30 µg/ml)
par evitar que sea inactivado por el calor.
Preparar una solución de 25 mg/mL de sulfato de kanamicina en
agua. Esterilizar por filtración y guardar en alícuotas a –20°C.
Adicionar al medio estéril enfriado a 50-55°C para tener una
concentración final de 30 µg/mL
Transferencia de material genético II: Transformación
Solución
Método de preparación
Células competentes de Se describe la técnica para preparar 200 µL de las células
E. coli
competentes:
− Inocular 3 mL de medio Luria con E. coli BL21 y se deja
crecer en agitación toda la noche a 37°C.
− Tomar 0.2 mL del precultivo y agregárselo a 10 mL de
medio Luria. Las bacterias se dejan crecer hasta llegar a
una absorbencia de 0.6 a 0.8 (lectura a 600 nm).
− Centrifugar la suspensión de células a 5000 rpm durante
5 min a 4°C. Descartar sobrenadante
− Resuspender el paquete celular muy bien en 3 mL de
Sección 7. APÉNDICE
Se solicitan al inicio del semestre. Se
intercambian tubos por los tubos por
cultivo de bacterias.
Proporcionada por el cepario.
Se solicitan al inicio del semestre. Se
intercambian tubos por los tubos por
cultivo de bacterias.
Almacenar a 4°C.
Almacenar a 4°C.
Almacenar a 4°C.
Comentarios
Los laboratoristas entregaran los tubos
de microfuga con las células
competentes congeladas.
5
0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
NaCl 10 mm isotónico frío.
− Centrifugar a 5000 rpm durante 5 min a 4°C. Descartar el
sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 mL de
CaCl2 30 mm frío.
− Dejar incubando en hielo por 20 min con agitación
ocasional suave y centrifugar a 2500 rpm por 7 min. El
precipitado debe ser de forma anular.
− Resuspender el precipitado en 0.5mL de CaCl2 30 mM
frío. Tomar 0.2 mL y pasarlo a un tubo microfuga.
Plásmido PET-TEM-1
Se prepara de acuerdo al protocolo que se encuentra en la
sección V, Parte II: Obtención del plásmido.
Medio LB/Kanamicina
(30 µg/mL)
Medio SOC.
Para 200 mL de medio líquido se adicionan el volumen
necesario de un stock 25 mg/mL Kanamicina
Medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa.
Transferencia de material genético II: Aislamiento de plásmidos
Solución
Método de preparación
Solución GTE
50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10 mM pH 8.0.
Sección 7. APÉNDICE
Se entregará la preparación de
plásmido aislada de un cultivo reciente.
Entregar en alícuotas en tubos de
Microfuga
Guardar el stock de Kanamicina a –
20°C
Guardar a 4°C
Comentarios
Mantener a 4°C
3 M Acetato de potasio
pH 4.8
Para una solución 3M de acetato de potasio; A 60 mL de acetato Mantener a -20°C
de potasio adicionar 11.5 mL de ácido acético y 28.5 mL de H2O
70% Etanol
Mantener a -20°C
10 N NaOH
Para 100mL de solución de etanol al 70%, se mezclan 70 mL de
etanol y 30 mL de agua
Para 10 mL de solución NaOH 10 N, se pesan 0.4 g de NaOH.
10% SDS
Disolver 10 g de SDS en 100 mL de agua destilada
Utilizar cubre bocas para su
preparación. No almacenar en frío
Los alumnos la preparan justo antes de
usarla.
Solución de lisis (0.2 N Tomar 10 µL de 10 N NaOH y 50 µL 10% SDS, aforar con agua
NaOH y 1% SDS p/v)
destilada.
500 µL
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0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
Transferencia de material genético II: Ensayos de restricción de plásmido.
Solución
Método de preparación
NdeI
100U/µL Marca Fermenta. Viene acompañada la enzima con un
vial que contiene el amortiguador TANGO.
BamH1
10U/µL Marca Fermenta
TAE 1X
Bromuro de etidio
Preparación para TAE 50X, pesar 242 g Tris base, 57.1 mL
ácido acético glaciar y 100 mL de 0.5 M de EDTA (pH 8). Aforar
a 1L
10 mg/mL Marca Gibco BRL.
Transferencia de material genético II: Inducción de proteína recombinante.
Solución
Método de preparación
Comentarios
IPTG
Para 1 mL de solución 100 mM de IPTG, se pesan 0.0238 g de
IPTG.
SECCIÓN VI: REGULACIÓN DEL METABOLISMO
Parte I: Operón de la lactosa
Solución
Cultivo
de
E. coli
W3110 en medio M9glicerol.
Método de preparación
4 mL medio M9-glicerol Preparación de Sales M9 10X 60g
estéril
Na2HPO4 30 g
KH2PO4 5 g
NaCl 5 g
NH4Cl 10 g
H2O cuanto baste para 1L, esterilizar la solución en autoclave a
121°C, dejar enfria a 50-55°C antes de adicionar el resto de
soluciones.
Sales M9 10X
Sección 7. APÉNDICE
Comentarios
Guardar a –20°C.
Será proporcionada por el laboratorio
Guardar a –20°C.
Será proporcionada por el laboratorio
Almacenar a temperatura ambiente.
Diluir y proporcionar a los alumnos el
TAE 1X.
Ya viene preparado a la concentración
sugerida.
Manejar con mucho cuidado,
reactivo mutagénico
Almacenar a –20°C
Comentarios
Proporcionado por el cepario.
Se solicitan al inicio del semestre. Se
intercambian tubos limpios por los tubos
con cultivo de bacterias.
Cada una de las soluciones deberá
esterilizarse por separado por filtración.
La mezcla deberá hacerse en
condiciones de esterilidad.
100 mL
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0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
Glicerol 20%
10 mL
MgSO4 0.1M
10 mL
10 mL
CaCl2 0.01M
H2O estéril c.b.p. 1L.
Solución de glucosa al
2% estéril
Sección 7. APÉNDICE
Preparar las soluciones y luego filtrar
para esterilizar.
No esterilizar en autoclave.
Preparar las soluciones y luego filtrar
para esterilizar.
No esterilizar en autoclave.
Preparar las soluciones y luego filtrar
para esterilizar.
No esterilizar en autoclave.
Solución de lactosa al
2% estéril
Solución de glucosa 2%
+ lactosa 2% estéril
Amortiguador
Z
(Na2HPO4-7H2O 60 mM,
NaH2PO4-H2O 40 mM,
KCl 10 mM, MgSO47H2O
1mM,
βmercaptoetanol 50 mM,
pH 7.0)
Reactivo ONPG (0.1%
de
o-nitrofenil-βgalactósido)
SDS al 0.1%
Na2HPO4-7H2O 16.1g, NaH2PO4-H2O 5.5 g, KCl 0.75 g, MgSO47H2O 0.264 g, β-mercaptoetanol 2.7 mL, disolver en menos de 1
L de agua, ajustar el pH 7.0 y aforar a 1 L.
Disolver 0.2 g en 50 ml de solución amortiguadora Z
Disolver 0.1 g en 100 mL de agua destilado
Usar cubrebocas al preparar el reactivo.
Almacenar a temperatura ambiente.
Na2CO3 1M
Parte II: Regulación hormonal del metabolismo de la glucosa
Solución
Método de preparación
Solución Krebs-RingerPara 250 mL disolver 1.89 g NaCl, 0.093g KCl, 0.040g KH2PO4,
Glucosa-Hepes (130mM 0.122g MgSO4 . 7 H2O, 0.45 g glucosa, 0.036g CaCl2 . 2 H2O,
NaCl, 5mM KCl, 1.2 mM 0.5 g de BSA y 10 mL de HEPES de un stock de 500 mM ( o
bien calcular el peso para 20 mM y disolver) ajustar a pH 7.0
KH2PO4, 2mM MgSO4 .
7 H2O, 10 mM Glucosa,
.
1 mM CaCl2 2 H2O,
0.2% BSA y 20 mM
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Comentarios
Almacenar a 4°C
0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
HEPES).
Solución de insulina
Dependiendo de la presentación habrá que calcular la dilución.
2000 µU/mL
Solución patrón de
Pesar 0.02 g de glucosa y disolverlo en 100 mL de agua
destilada, guardar en alícuotas.
glucosa, 200 µg/mL.
Solución A para
12.5 g carbonato de sodio anhidro + 12.5 g tartrato de sodio y
determinación de
potasio +10 g bicarbonato de sodio +100 g sulfato de sodio
glucosa
anhidro y se lleva a 500 mL con agua destilada
Solución B para
determinación de
glucosa
el Reactivo de cobre
mezclado (RCuM):
Reactivo de
arsenomolibdato
4 µM Wormanina
Sección 7. APÉNDICE
Depende de la presentación, se
almacena a 4°C o –20°C.
Almacenar a –20°C.
Proporcionado en alícuotas por el
laboratorio.
7.5 g sulfato de cobre en 50 mL de agua destilada + 50 µL
H2SO4 concentrado
Proporcionado en alícuotas por el
laboratorio.
24 partes de solución A + 1 parte de solución B.
Los estudiantes lo prepararan en el
momento
La solución debe presentar una
coloración amarilla, de lo contrario
desechar.
Repartir por equipo 28 mL
•
Disolver 25 g de (NH4)6Mo7O24 en 450 mL de agua
destilada añadir 21 mL de ácido H2SO4 concentrado.
• Disolver por separado 3 g de Na2HAsO4·7H2O en 25 mL
de agua destilada.
Mezclar ambos reactivos y colocar en un frasco ámbar, incubar
a 37°C durante 24 h, no agitar.
Se recomienda disolver el contenido total de un vial que
Almacenar a –20°C.
contiene 0.25 mg en 1 mL de DMSO. Después de esa solución
que queda a 583.8 µM tomar 34 µL y añadírselos a 5 mL DMSO,
así la solución final queda a 4 µM. Por grupo usaran 450 µL de 4
µM wormanina
9