Evaluación de la disminución de la expresión de Pink1 en eventos

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Evaluación de la disminución de la expresión de
Pink1 en eventos de fusión y fisión mitocondrial en
un modelo de neuronas dopaminérgicas
Liliana Alexandra Rojas Charry
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Ciencias Fisiológicas
Bogotá D.C., Colombia
2012
Evaluación de la disminución de la expresión de
Pink1 en eventos de fusión y fisión mitocondrial en
un modelo de neuronas dopaminérgicas
Liliana Alexandra Rojas Charry
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magíster en Bioquímica
Director:
Gonzalo Humberto Arboleda Bustos, MD MSc PhD
Grupo de Investigación en Muerte Celular
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Ciencias Fisiológicas
Bogotá D.C., Colombia
2012
"It is not knowledge, but the
act
of
learning,
not
possession, but the act of
getting there, which grants
the greatest enjoyment"
Carl Friedrich Gauss
Agradecimientos
Expreso mis más sinceros agradecimientos a las personas que hicieron una
gran contribución al desarrollo de este trabajo y que me acompañaron en esta
etapa de formación tanto académica como personal:
A mi familia y a Duván
Al profesor Gonzalo Humberto Arboleda
A Ruth Sánchez, a Rita Baldrich y a Andrea Niño
A Mark Cookson y a Melissa McCoy
A los compañeros del grupo de investigación en neurociencias y muerte
celular
A los profesores de la maestría en bioquímica
Resumennn
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
Las mitocondrias están muy lejos de ser organelos estáticos. Actualmente está
bien establecido que las mitocondrias están sometidas a un proceso constante
de cambio, al cual se le ha denominado dinámica mitocondrial que incluye
procesos de fusión y fisión. Hay muchas evidencias acerca de que la pérdida
de función de Pink1 y de la dinámica mitocondrial son responsables de
diferentes enfermedades neurodegenerativas, incluyendo el Parkinson tipo 2.
En este trabajo se estudió el efecto del silenciamiento de Pink1 eventos de
fusión y fisión mitocondrial en neuronas dopaminérgicas. La disminución de
la expresión de Pink1 se realizó usando plásmidos lentivirales con dos
secuencias de shRNA y mediante qPCR se comprobó que los niveles de
Pink1 disminuyeron en más del 80%. Se hicieron ensayos de MTT para
evaluar actividad mitocondrial, mientras que las proteínas de fusión fisión
fueron analizadas mediante western blot y la morfología mitocondrial con
microscopía confocal. Las células transducidas con el constructo shPink1
muestran una disminución en actividad mitocondrial y menores niveles de
expresión de Drp1
y de Mfn2, en un 31 y 55%, respectivamente. Sus
mitocondrias tienen una morfología principalmente fragmentada y también se
encontró que estas células no responden de la misma manera que las células
control ante el estímulo generado por la forskolina, un potenciador de la vía
del cAMP que fosforila a Drp1, inactivándolo. De esta manera se propone que
Pink1
puede
ejercer
un
papel
neuroprotector
promoviendo
fusión
mitocondrial.
Palabras clave: Pink1, fusión, fisión, mitocondria, neuronas dopaminérgicas,
enfermedad de Parkinson
VI
Abstract
Mitochondria are organelles far from being static. It is now well established
that mitochondria are subject to a constant process of change, which has been
called mitochondrial dynamics, including fusion and fission processes. There
are a lot of evidences that show that the loss of function of Pink1 and
mitochondrial dynamics are responsible for various neurodegenerative
diseases, including Parkinson type 2. In this work, we studied the effect of
silencing Pink1 in events of mitochondrial fusion and fission, in dopaminergic
neurons. Two lentiviral shRNA sequences were used to knockdown Pink1 and
by qPCR it was found that Pink1 levels decreased more than 80%. MTT
assays were conducted to assess mitochondrial activity, while fission-fusion
proteins were analyzed by western blot and mitochondrial morphology by
confocal microscopy. The cells transduced with the construct against Pink1
show a decrease in mitochondrial activity and reduced levels of expression of
Drp1 and Mfn2, by 31 and 55%, respectively. Their mitochondrial
morphology was mainly fragmented and we also found that these cells do not
respond the same way that the control ones to the stimulus generated by
forskolin, an enhancer of cAMP pathway that phosphorylates Drp1,
inactivating it. Thus it is proposed that Pink1 can exert a neuroprotective role
by promoting mitochondrial fusion.
Keywords: Pink1, fission, fusion, mitocondria, dopaminergic neurons,
Parkinson disease
VI
Contenido
Resumen .......................................................................................................VI
Abstract .........................................................................................................VI
Lista de Figuras .............................................................................................. X
Lista de Tablas ..............................................................................................XI
Lista de Abreviaturas .................................................................................. XII
1
2
Capítulo 1 ................................................................................................. 1
1.1
Introducción ........................................................................................ 1
1.2
Problema Científico ............................................................................ 2
1.3
Justificación ........................................................................................ 3
Capítulo 2 ................................................................................................. 5
2.1
Enfermedad de Parkinson .................................................................... 5
2.2
Pink1 ................................................................................................... 6
2.3
Posibles mecanismos neuroprotectores de Pink1 ................................. 8
2.4
Pink1 y función mitocondrial .............................................................. 9
2.5
Pink1 y su interacción con parkin ...................................................... 12
2.6
Pink1 y citoesqueleto ........................................................................ 14
2.7
Función mitocondrial ........................................................................ 16
2.8
Fusión y fisión mitocondrial.............................................................. 18
2.9
C2-Ceramida y Rotenona .................................................................. 26
2.10 Células CAD y M17 .......................................................................... 27
VII
3
4
Capítulo 3 ............................................................................................... 29
3.1
Objetivo General ............................................................................... 29
3.2
Objetivos Específicos ........................................................................ 29
Capítulo 4 ............................................................................................... 30
4.1
Cultivos Celulares ............................................................................. 30
4.2
Conteo y viabilidad celular................................................................ 32
4.3
Establecimiento de las poblaciones de CAD y M17 .......................... 32
4.4
Transformación de E.coli JM109 con los plásmidos lentivirales para
shRNA de Pink1......................................................................................... 33
4.5
Purificación de los plásmidos lentivirales .......................................... 33
4.6
Transducción y establecimiento de las líneas celulares CAD y M17
con silenciamiento permanente shRNA de Pink1 ....................................... 33
4.7
Extracción de RNA ........................................................................... 35
4.8
Transcripción reversa ........................................................................ 36
4.9
PCR en tiempo real ........................................................................... 36
4.10 Determinación de la actividad mitocondrial ...................................... 38
4.11 Extracción y cuantificación de proteínas ........................................... 39
4.12 Electroforesis en SDS-PAGE ............................................................ 40
4.13 Detección de proteínas por Western blotting ..................................... 40
4.14 Análisis de la distribución mitocondrial por tinción con Mitotracker 41
4.15 Inmunofluorescencia ......................................................................... 42
4.16 Análisis de los eventos de fusión y fisión mitocondrial por
transfección con mito-YFP ......................................................................... 43
VIII
4.17 Análisis estadístico ............................................................................ 44
5
Capítulo 5 ............................................................................................... 45
5.1
La disminución de la expresión de Pink1 disminuye la actividad
mitocondrial y aumenta la vulnerabilidad al daño inducido por C2-ceramida
45
5.2
La disminución de la expresión de Pink1 induce cambios en la
morfología y distribución mitocondrial, éstos se incrementan en presencia de
agentes neurotóxicos .................................................................................. 49
5.3
El silenciamiento de Pink1 afecta la expresión de algunas proteínas
involucradas en fusión/fisión ...................................................................... 53
5.4
6
7
Discusión de Resultados.................................................................... 61
Capítulo 6 ............................................................................................... 66
6.1
Conclusiones ..................................................................................... 66
6.2
Perspectivas ...................................................................................... 66
Anexos .................................................................................................... 68
7.1
RT-PCR para determinación de la temperatura óptima de anillamiento
de los primers de Pink1 .............................................................................. 68
7.2
Picos de fusión de Pink1 (azul) y de β–actina (verde) tomando como
temperatura de anillamiento 51°C .............................................................. 68
7.3
Curvas de amplificación (A) y picos de fusión (B) de Pink1 y de β–
actina .......................................................................................................... 69
7.4
Comprobación de la eficiencia de los primers para Pink1 mediante
diluciones seriadas ..................................................................................... 70
8
Bibliografía ............................................................................................. 71
IX
Lista de Figuras
Figura No. 1 Dominio quinasa y mutaciones de Pink1 asociadas a EP. ........... 8
Figura No. 2 Disfunción mitocondrial en la EP. ............................................ 10
Figura No. 3 Esquema de las principales proteínas involucradas en fusión y
fisión mitocondrial .................................................................................. 21
Figura No. 4 Esquema de la dinámica mitocondrial ...................................... 22
Figura No. 5 Microfotografías de las células CAD y M17. ........................... 31
Figura No. 6 Programa usado en la amplificación de Pink1 por qPCR .......... 38
Figura No. 7 Determinación de la dosis tóxica mínima de blasticidina para las
células CAD. ........................................................................................... 46
Figura No. 8 Niveles de expresión de Pink1. ................................................. 47
Figura No. 9 Disminución de la actividad mitocondrial en células shPink1. .. 48
Figura No. 10 Distribución mitocondrial en células CAD. ............................ 50
Figura No. 11 Procesamiento de las imágenes mitocondriales obtenidas por
microscopía confocal. ............................................................................. 51
Figura No. 12 Microfotografías in vivo de las mitocondrias de células M17
Control shPink1 y shPink1. ..................................................................... 53
Figura No. 13 Morfología mitocondrial de las células M17. .......................... 54
Figura No. 14 Cuantificación de la morfología mitocondrial de células M17
control shPink1 y shPink1. ...................................................................... 55
Figura No. 15 Western blot de algunas de las proteínas involucradas en fusión
y fisión mitocondrial. .............................................................................. 56
Figura No. 16 Densitometría de las proteínas de fusión/fisión detectadas por
western blot. ............................................................................................ 57
Figura No. 17 Inmunofluorescencia de Fis1. ................................................. 58
Figura No. 18 Inmunofluorescencia de p-Drp1. ............................................. 59
Figura No. 19 Inmunofluorescencia de Mfn1. ............................................... 60
X
Lista de Tablas
Tabla No. 1 Secuencias de los constructos de shRNA para Pink1 y de los
controles de silenciamiento. .................................................................... 34
Tabla No. 2 Lista de reactivos y su concentración final en la reacción de
transcripción reversa. .............................................................................. 36
Tabla No. 3 Primers específicos usados en la amplificación de Pink1 y de βactina por qPCR. ..................................................................................... 37
Tabla No. 4 Anticuerpos empleados para los ensayos de western blot ........... 41
XI
Lista de Abreviaturas
m
Diferencia de potencial de membrana mitocondrial
µg
Microgramo
µM
Micromolar
µm
Micrómetro
AR
Relación de aspecto
ATCC
American Type Culture Collection
Aup1
Fosfatasa 2 C
BCA
Ácido bicinconínico
BSA
Albúmina sérica bovina
cAMP
AMP cíclico
CCCP
Carbonil 3-clrofenil hidrazona
cDNA
DNA complementario
Cit C
Citocromo C
CL
Cardiolipina
CMT2A
Charcot Marie Tooth tipo 2 A
Ct
Ciclos necesarios para alcanzar el umbral
DIC
Contraste de interferencia diferencial
DMSO
Dimetil sulfóxido
DNA
Ácido desoxirribonucleico
DOA
Atrofia óptica dominante
dPink1
Pink1 de Drosophila
Drp1
Proteína relacionada a la dinamina 1
ECL
Quimioluminiscencia mejorada
EP
Enfermedad de Párkinson
ER
Retículo endoplasmático
XII
FF
Factor de forma
Fis1
Proteína de fisión
FK
Forskolina
FRAP
Recuperación
de
la
fluorescencia
después
de
photobleaching
HR-1
Repeticiones de héptadas
Hsp75
Proteína de choque térmico 75
HtrA2
Proteína de alto requerimiento de temperatura A2
IMM
Membrana interna mitocondrial
IMS
Espacio intermembranal
LRRK2
Quinasa con repeticiones ricas en leucina
Mff
Factor de fisión mitocondrial
Mfn1
Mitofusina 1
Mfn2
Mitofusina 2
MiD51
Proteína de dinámica mitocondrial de peso molecular 51
MIEF1
Factor de elongación mitocondrial
mL
Mililitro
mRNA
RNA mensajero
mtDNA
DNA mitocondrial
NO
Óxido nítrico
OMM
Membrana externa mitocondrial
Opa1
Proteína relacionada a atrofia óptica tipo 1
PAGE
Electroforesis
PBS
Tampón fosfato salino
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
PI3K
Fosfatidil inositol 3 quinasa
Pink1
Quinasa inducia por PTEN
XIII
PTEN
Fosfatasa y homóloga de tensina
p-Drp1
Drp1 fosforilado
qPCR
PCR cuantitativa
RING
Nuevo gen realmente interesante
RNA
Ácido ribonucleico
RNAi
RNA de interferencia
ROS
Especies reactivas de oxígeno
RT
Transcripción reversa
RT-PCR
Transcripción reversa y PCR
SDS
Dodecil sulfato de sodio
SFB
Suero fetal bovino
shRNA
RNA de horquilla corta
TBS
Tris buffer salino
TBST
TBS Tween
TH
Tirosina hidroxilasa
TIM
Transportador de membrana interna mitocondrial
TNF-1
Factor de necrosos tumoral 1
TOM
Transportador de membrana externa mitocondrial
TRAP-1
Proteína asociada al receptor de TNF 1
UCHL-1
Ubiquitil carboxil terminal esterasa L1
WB
Western blot
YFP
Proteína amarilla fluorescente
α-syn
Alfa-sinucleína
XIV
1 Capítulo 1
1.1
Introducción
La Enfermedad de Parkinson (EP) es un desorden neurodegenerativo
caracterizado por la pérdida selectiva de neuronas dopaminérgicas en la
substancia
nigra
del
mesencéfalo.
Es
la
segunda
enfermedad
neurodegenerativa más común después de la Enfermedad de Alzheimer.
Afecta tanto a hombres como a mujeres con edad promedio de inicio 60 años
y su incidencia aumenta significativamente con la edad. Aproximadamente 5 10 % de los pacientes tienen menos de 40 años de edad y se estima que una de
cada 100 personas mayores de 60 años puede tener EP. La EP se caracteriza
por generar una gran discapacidad entre los afectados, ya que sus síntomas
son temblor en estado de reposo, rigidez y lentitud para realizar los
movimientos; también se puede encontrar inestabilidad postural, disminución
del balanceo de los brazos, de la expresión de la cara o del tono de voz;
dificultad para la deglución, alteraciones del sueño, ansiedad, depresión y
otras alteraciones mentales. Todo esto conlleva grandes pérdidas económicas
y graves consecuencias sociales y familiares. En Colombia afecta a unos
230.000 individuos aproximadamente y la tendencia demográfica mundial es
al aumento de la población anciana por lo que se espera que en los próximos
20 años la EP aumente cuatro veces su prevalencia actual, convirtiéndose en
un serio problema de salud pública.
La EP es una enfermedad compleja y presenta una amplia heterogeneidad
clínico-genética, lo que ha dificultado profundizar en el conocimiento de sus
mecanismos fisiopatológicos básicos, a pesar de los avances en el tratamiento
sintomático y en su diagnóstico. Algunas formas genéticas mendelianas se han
1
descrito recientemente gracias a los progresos de la genómica; así se han
identificado varios genes (α-Sinucleína, Parkin, UCHL-1, DJ-1, Pink1,
LRRK2 y HtrA2) que constituyen las únicas causas definidas de la EP hasta
la fecha. Estos avances han revolucionado y esclarecido algunos de los
procesos subyacentes de su etiología, sin embargo, el papel de sus proteínas en
la fisiología neuronal, aún está por aclararse.
En este trabajo se analizó en células CAD y M17 el impacto del gen Pink1
sobre las proteínas de fusión y fisión mitocondrial. Se simuló el efecto de
pérdida de función de la proteína Pink1 y se evaluó su impacto sobre la
homeóstasis mitocondrial a nivel de los mecanismos de fusión-fisión
mitocondrial. Como hipótesis de trabajo se propone que la disminución de la
expresión de Pink1 con short hairpin RNA (shRNA) de la proteína Pink1
produce una alteración en la fisiología neuronal alterando la homeóstasis
mitocondrial
(fusión-fisión),
lo
que
conlleva
a
muerte
neuronal.
Metodológicamente, las células fueron transducidas con vectores plasmídicos
lentivirales shRNA para Pink1 con el fin de disminuir su expresión y
posteriormente se caracterizaron sus efectos sobre el mecanismo de fusiónfisión mitocondrial.
1.2 Problema Científico
La Enfermedad de Parkinson (EP) es un desorden neurodegenerativo
progresivo que se caracteriza por causar una gran discapacidad, generando
consecuencias negativas tanto a nivel económico como social. En Colombia la
padecen cerca de 230.000 personas y en 20 años incrementará hasta cuatro
veces, convirtiéndose en un problema de salud pública. Se ha determinado que
la principal causa de esta enfermedad es la muerte de las neuronas
2
dopaminérgicas de la substancia nigra, aunque los mecanismos moleculares
por los cuales estas neuronas mueren selectivamente aún son desconocidos.
Recientes estudios demuestran que esta susceptibilidad puede deberse a la
existencia de factores genéticos que junto con factores de riesgo ambientales
podrían contribuir a la forma esporádica de esta enfermedad.
La identificación de pacientes de EP con variantes en genes que codifican
para proteínas mitocondriales constituye la primera evidencia de una serie de
estudios bioquímicos que implican una disfunción mitocondrial en la
patogénesis de la EP. Sin embargo, el mecanismo molecular de esta
disfunción no se conoce con exactitud, por lo tanto el análisis molecular in
vitro de la función mitocondrial y de procesos fisiológicos como fusión-fisión
podrían esclarecer aspectos relevantes de esta anomalía. Un gen muy
importante asociado a EP es Pink1 el cual parece ejercer un efecto
neuroprotector. Sin embargo, su estudio no ha sido fácil debido a que se
encuentran niveles endógenos muy bajos, por lo que ha sido necesario emplear
una gran variedad de modelos. En este trabajo se estudió el efecto del
silenciamiento de Pink1 en las principales proteínas que regulan los procesos
de fusión y fisión mitocondrial en neuronas dopaminérgicas.
1.3
Justificación
Aunque en los últimos años se han empleado diferentes estrategias
terapéuticas para el tratamiento de la EP, ésta sigue siendo considerada una
enfermedad incurable. Esto posiblemente se debe al desconocimiento de los
mecanismos moleculares involucrados en la muerte de las neuronas
dopaminérgicas. En los últimos años se ha avanzado en el conocimiento de
3
estos procesos y se sabe que Pink1 es determinante en la correcta función
mitocondrial. Adicionalmente, el grupo de investigación en muerte celular de
la Universidad Nacional de Colombia ha obtenido resultados importantes en
cuanto a la relación de la proteína Pink1 y la vía de supervivencia de fosfatidil
inositol 3 quinasa (PI3K/AKT) indicando la necesidad de continuar con el
desarrollo de estudios que se enfoquen en evidenciar los mecanismos de
fisión-fusión mitocondrial con el objetivo de que a futuro este conocimiento
permita el diseño racional de fármacos contra blancos terapéuticos específicos
o la identificación de proteínas y genes que sirvan como marcadores
bioquímicos tempranos útiles para la detección de la enfermedad.
4
2 Capítulo 2
Estado del Arte
2.1 Enfermedad de Parkinson
Este desorden neurodegenerativo asociado a la edad se caracteriza por la
pérdida preferencial de las neuronas que secretan dopamina y por la
acumulación de inclusiones intraneuronales (conocidas como cuerpos de
Lewy) (Forno, 1996). La enfermedad es lentamente progresiva y causa
movimientos lentos, rigidez de las extremidades y temblor en las manos.
La EP se presenta de forma esporádica, es decir, sin antecedentes familiares
conocidos en el 90 % de los casos y en el 10 % restante la enfermedad puede
ser hereditaria, afectando tanto a hombres como a mujeres. La forma
esporádica de la enfermedad es más frecuente después de los 60 años mientras
que en las formas hereditarias la edad de inicio es más temprana (Forno,
1987).
El tratamiento de la enfermedad depende del estado de severidad en que
encuentre el paciente. En la actualidad se conoce un grupo numeroso de
medicamentos para tratarla entre los cuales la Levodopa con Carbidopa
(Sinemet) o con benserazida (Madopar) son los de mayor beneficio. El
tratamiento incluye además medidas de rehabilitación física y de los trastornos
asociados que puedan afectar al paciente como depresión, insomnio, ansiedad,
etc.
5
En las formas familiares de la EP se han encontrado mutaciones en genes que
han sido asociadas a formas autosómicas dominantes; como la α-sinucleína
(PARK1), Parkin (PARK2), DJ1 (PARK3) y Pink1 (PARK6) (responsables de
formas autosómicas recesivas) (Gasser, 2007). A pesar de los múltiples
esfuerzos por conocer la causa de la muerte neuronal en el modelo de esta
enfermedad, esto todavía es considerado un enigma.
Probablemente, la EP es resultado de la interacción de múltiples factores, que
incluyen el envejecimiento normal, la susceptibilidad genética y la exposición
a factores ambientales.
2.2 Pink1
Pink1 (PTEN-induced kinase) es una proteína de 581 aminoácidos que
contiene un dominio serina/treonina quinasa y un dominio de localización
mitocondrial. El gen Pink1 se localiza en el cromosoma 1, en la región 1p3536, tiene 8 exones y abarca 1.8 kb. Pink1 fue descubierto en el año 2001 a
través de un estudio de perfiles de genes que son activados por la fosfatasa
supresora de tumores y homóloga de tensina PTEN (Unoki y Nakamura,
2001). En el año 2004 esta proteína fue identificada como el tercer gen
autosómico recesivo asociado a parkinson juvenil. Los autores de este estudio
mostraron que Pink1 silvestre, más no el mutante, estabilizaba el potencial de
membrana mitocondrial (
m)
y protegía a las células de apoptosis cuando
eran expuestas a inhibición de proteosoma.
acentúan
las
condiciones
de
la
Las mutantes del gen Pink1
enfermedad,
induciendo
trastornos
mitocondriales y apoptóticos (Valente et al., 2004).
6
Lo anterior sugiere que Pink1 puede funcionar en vías de señalización
intracelulares implicadas en la patogénesis de la EP. Tres propiedades de
Pink1 son especialmente relevantes; en primer lugar, análisis de secuencias
primarias y estudios bioquímicos han demostrado que Pink1 es miembro de
una familia de proteínas quinasas eucarióticas involucradas en la transducción
y amplificación de señales intracelulares (Silvestri et al., 2005).
En segundo lugar, el dominio N-terminal de Pink1 contiene un motivo de
localización mitocondrial que sugiere que Pink1 es candidata potencial en la
regulación de procesos mitocondriales asociados con apoptosis (Muqit et al.,
2006) y en tercer lugar, Pink1 ha mostrado una interacción funcional con otros
genes asociados a EP como Parkin y HtrA2 (Clark et al., 2006; Park et al.
2006; Wang et al. 2006; Plun-Favreau et al., 2007).
La proteína Pink1 tiene una actividad de autofosforilación in vitro; Beilina y
colaboradores explicaron los efectos de las mutaciones del gen Pink1 sobre su
actividad quinasa y los niveles de expresión y localización en células
mamíferas. Ellos confirmaron la actividad quinasa y demostraron que las
proteínas mutantes son estables pero carecen de esta actividad. La mutación
L347P desestabiliza y reduce la actividad quinasa, mientras que la mutación
G309D tiene un menor efecto en la actividad quinasa in vitro. En este trabajo
también demostraron la localización, procesamiento y los niveles de la
proteína en células mamíferas, encontrando que Pink1 es procesada en su
secuencia N-terminal de una manera consistente con su importación
mitocondrial. Además demostraron que la proteína madura también existe en
el citosol. Estos resultados implican que una porción de Pink1 podría ser
exportada después de procesarse en mitocondria (Beilina et al., 2005).
7
Figura No. 1 Dominio quinasa y mutaciones de Pink1 asociadas a EP. En a) Se muestra un
esquema lineal de Pink1, con mutaciones asociadas a EP, subdominios quinasa. Las flechas
indican la posible ubicación de hélices α, los cilindros hojas β. En b) se muestra un esquema
de un dominio serina-treonina quinasa (Mills et al., 2008).
2.3 Posibles mecanismos neuroprotectores de Pink1
La
expresión de
la
superóxido dismutasa
1 humana
suprime
la
neurodegeneración inducida por la inactivación de Pink1 en Drosophila.
8
Adicionalmente el tratamiento con superóxido dismutasa y vitamina E en
moscas con RNAi de dPink1 inhibe la degeneración ommatidial (Wang et
al., 2006). De esta manera dPink1 jugaría un rol esencial en la supervivencia
neuronal previniendo que las neuronas sigan en estrés oxidativo.
¿A través de qué moléculas estaría ejerciendo este efecto? Hasta ahora se
conocen pocos substratos de Pink1 y el mecanismo por el cual las mutaciones
de esta proteína conducen a la neurodegeneración también es desconocido. El
gen Pink1 es transcripcionalmente activado por fosfatasas y homólogos del
gen de la tensina (Pten), un gen supresor tumoral involucrado en la regulación
de vías señalizadoras de transducción. Pridgeon et. al, 2007, reportó la
identificación de una proteína asociada al receptor TNF-1 (TRAP1), una
chaperona molecular mitocondrial conocida como proteína 75 de choque
térmico (Hsp75), como substrato celular para la quinasa Pink1. Esta proteína
se une y colocaliza con TRAP1 en la mitocondria y la fosforila in vitro e in
vivo. Además se desmostró que Pink1 protege contra el estrés oxidativo que
induce muerte celular, suprimiendo la liberación del CitC desde la
mitocondria. Esta acción protectora del gen Pink1 depende de su actividad
quinasa para fosforilar a TRAP1 (Pridgeon et al., 2007).
2.4 Pink1 y función mitocondrial
La deleción del gen Pink1 en ratones altera de forma significativa las
funciones mitocondriales. Estudios de microscopía electrónica cuantitativa del
striatum de estos ratones evidenció que no hay cambios apreciables en la
ultraestructura del número total de mitocondrias, pero sí un aumento
importante en el número de mitocondrias alargadas. En este mismo estudio
también se pudo detectar una reducción en la actividad de la aconitasa, la cual
9
está asociada con el ciclo de Krebs y las actividades respiratorias en la corteza
cerebral de estos ratones se ve disminuida en ratones de 2 años de edad con
Pink-/- , pero no en los ratones más jóvenes de 2 a 4 meses, lo que indica que la
edad exacerba la disfunción mitocondrial en estos ratones (Gautier et al.,
2008).
Figura No. 2 Disfunción mitocondrial en la EP. Se han identificado muchas alteraciones a
nivel de la biología mitocondrial en la EP; a) actividad reducida del complejo I; b) mayor
producción de ROS; c) daño en el mtDNA; d) daño bioenergético; e) liberación de citocromo c
mediada por Bax, apoptosis mediada por mitocondria; f) mitofagia defectuosa; g) aumento en
la capacidad buffer de Ca2+. Se muestran también los genes mutados en EP (Perier et al.
2012).
El rol de las proteínas de control de calidad de la mitocondria en la etiología
de la EP se sugiere después de hallazgos de mutaciones en las proteínas
HtrA2/OMI. HtrA2 se localiza en el espacio intermembranal de la mitocondria
10
y protege del estrés mitocondrial ya que puede degradar polipéptidos mal
plegados y hace parte de la cascada de señalización adaptativa al estrés
oxidativo. HtrA2 se asocia con Pink1 y tanto Pink1 como HtrA2 parecen
interactuar en la misma vía protectora ya que Pink1 es necesario para la
fosforilación de HtrA2, la cual incrementa su actividad proteolítica in vitro
(Plun-Favreau et al., 2007). Sin embargo, aún no se tiene claro si HtrA2 es un
sustrato de Pink1. Llama la atención que aunque los roles fisiológicos de
Pink1, HtrA2 y TRAP1 no han sido determinados, la relación entre estrés
oxidativo, control de calidad mitocondrial y señalización de estrés está
emergiendo como posible patogénesis en EP.
En un estudio realizado por Wang y colaboradores en 2007, se demostró que
Pink1 silvestre inhibe la muerte celular apoptótica causada por inhibidores del
proteosoma, los cuales inducen la liberación de CitC por disminución de la
expresión del gen Bax. Este estudio demostró que la sobreexpresión de Pink1
silvestre bloquea la liberación de CitC inducida por un inhibidor de
proteasoma (Atractosida) y mostró como las mutantes fallan para inhibir la
citotoxicidad producida por éste (Wang et al., 2007). Los resultados han
demostrado que Pink1 silvestre expresado en mitocondria ejerce su papel
antiapoptótico por inhibición de la apertura del poro mitocondrial y
mutaciones en la proteína interfieren en la habilidad para prevenir la apertura
del poro (Gautier et al., 2008), este mismo grupo encontró que la pérdida de
Pink1 causa un incremento selectivo en la apertura del poro y del calcio
mitocondrial y que una apertura excesiva de este poro puede ser la responsable
de los defectos mitocondriales encontrados en las células que carecen Pink
(Gautier et al., 2012).
11
Fisiológicamente se demostró que Pink1 puede regular el flujo de calcio
mitocondrial a través del intercambiador Na +/Ca2+ la deficiencia de Pink1
causa una acumulación mitocondrial de calcio lo que conduce a una
“sobrecarga”. Esta sobrecarga estimula la producción de ROS a través de la
NADPH oxidasa. La producción de ROS inhibe el transportador de glucosa,
reduciendo el envío de este sustrato lo que conlleva a una disfunción de la
cadena respiratoria. Cuando se suministran sustratos de los complejos I y II, el
daño en la cadena respiratoria puede ser superado. Posiblemente las ROS
disminuyen el umbral de apertura del poro de permeabilidad mitocondrial,
inducido por calcio. Estos hallazgos permiten proponer un mecanismo por el
cual la disfunción de Pink1 hace que las neuronas sean más vulnerables a la
muerte celular (Gandhi et al., 2009).
2.5 Pink1 y su interacción con parkin
La pérdida del homólogo de Pink1 en Drosophila es indistinguible de moscas
deficientes en parkin (PARK2), una proteína ubiquitina ligasa E3 localizada
principalmente a nivel citosólico, que media la marcación de porteínas para su
posterior degradación. Las moscas exhiben defectos motores debido a la
pérdida de neuronas dopaminérgicas por déficits mitocondriales. Este fenotipo
debido a la deficiencia de Pink1 puede ser rescatado mediante la
sobreexpresión de parkin, pero lo contrario no ocurre, lo que lleva a la
conclusión de que Pink1 posiblemente actúa corriente arriba de parkin en la
misma vía molecular (Clark et al., 2006;Park et al., 2006;Yang et al., 2006).
Otros estudios en Drosophila sugieren que la pérdida de Pink1 y parkin tiene
como consecuencia cambios en la morfología mitocondrial, encontrándose
que éstas se alargan. Este fenotipo puede ser rescatado mediante la
12
sobreexpresión de la proteína mitocondrial del fisión Drp1, por lo cual se
concluye que el homólogo de parkin en Drosophila está promoviendo fisión
mitocondrial (Deng et al., 2008;Poole et al., 2008) Sin embargo, en células
humanas parkin y Pink1 parecen promover fusión mitocondrial. El
silenciamiento de Drp1 puede rescatar el fenotipo mitocondrial inducido por la
deficiencia en Pink1 y en parkin (Lutz et al., 2009;Sandebring et al., 2009).
Lutz adicionalmente demostró que en células S2 de Drosophila, la fisión
mitocondrial es un efecto temprano de parkin y Pink1, que progresa a fusión
con el tiempo, lo cual puede explicar la discrepancia entre los modelos.
También existen reportes que relacionan el papel que parkin y Pink1
desempeñan en el modelamiento de la mitocondria. Parkin media la
degradación de mitocondrias dañadas (Narendra et al., 2010) mientras que
Pink1 (silvestre, no los mutantes) es necesario para que parkin se pueda
translocar a la mitocondria (Vives-Bauza et al., 2010). Adicionalmente, Gegg
demostró que el silenciamiento de Pink1 da como resultado una disminución
de la síntesis mitocondrial (Gegg et al., 2009), mientras que Kuroda mostró
que parkin se une al DNA mitocondrial lo cual promueve su síntesis en células
de neuroblastoma humano (Kuroda et al., 2006;Rothfuss et al., 2009).
Pink1 regula el dominio RING1 de parkin (dominio importante para la
translocación a la mitocondria) fosforilando directamente la tirosina 175, la
cual se localiza en la región de unión de parkin (Kim et al., 2008). VivesBauza confirmó que la relocalización de parkin en mitocondria es dependiente
de Pink1, pero esto no involucra la fosforilación de parkin. Sin embargo, un
estudio más reciente mostró que Pink1 es activado cuando hay depolarización
mitocondrial y directamente fosforila y activa a parkin. El monitoreo de la
13
fosforilación de parkin en la serina 65 y/o en Pink1 en la treonina 257
representa los primeros biomarcadores para examinar la actividad de la vía de
señalización Pink-parkin in vivo. En este estudio también se sugiere que
pequeñas moléculas activadoras de parkin pueden conferir una nueva
aproximación terapéutica para la EP (Kondapalli et al., 2012).
En cuanto al reclutamiento de parkin a nivel mitoconcondrial, Lazarou y
colaboradores mostraron que Pink1 endógeno forma un complejo de 700 kDa
con la translocasa de la membrana externa TOM selectivamente en
mitocondrias depolarizadas mientras que Pink1 ectópicamente dirigido a la
membrana externa mitocondrial mantiene la asociación con TOM en
mitocondrias polarizadas. Cuando Pink1 es dirigido hacia los lisosomas o
hacia los peroxisomas, que carecen del complejo TOM, recluta a parkin e
induce la actividad ubiquitina ligasa en estos organelos. Una vez allí, parkin
induce autofagia organelo-selectiva de peroxisomas pero no de lisosomas. En
este estudio se propone que la asociación de Pink1 con el complejo TOM
permite el rápido reimporte de Pink1 para rescatar mitocondrias repolarizadas
de mitofagia y reducir factores específicos mitocondriales para la
translocación y activación de parkin. La unión de Pink1 a TOM puede
funcionar para rápidamente reimportar Pink1 y regular la vía Pink1/parkin
(Lazarou et al., 2012).
2.6 Pink1 y citoesqueleto
El transporte mitocondrial en neuronas y su distribución espacial están
directamente relacionadas con la actividad sináptica. Las neuronas requieren
de mecanismos especializados para regular el transporte y la retención de las
mitocondrias en la proximidad de conos de crecimiento activos, nodos de
14
Ranvier y terminales sinápticas, en donde la producción de energía y la
capacidad homeostática del calcio tienen una alta demanda (Hollenbeck y
Saxton, 2005).
Este transporte de larga distancia depende de proteínas
motoras basadas en microtúbulos. Mientras que motores de dineína
citoplasmáticas conducen el movimiento retrógrado, la quinesina-1 fue la
primera proteína motora identificada para el transporte anterógrado de
mitocondrias. Varios adaptadores, incluyendo a Miro-Milton y sintabulina han
sido identificados por unir la mitocondria al motor de quinesina en neuronas
(Cai y Sheng, 2009).
En el año 2009, Weihofen y colegas, reportaron la identificación de un
complejo multiproteínico mitocondrial que contiene a Pink1, la GTPasa Miro
y la proteína adaptadora Milton. Se sabe que el complejo Miro-Milton tiene un
papel importante en el tráfico mitocondrial a lo largo de los microtúbulos.
Adicionalmente una variante de Pink1 que no expresa el dominio de
localización mitocondrial pudo encontrarse en las fracciones subcelulares
mitocondriales al inducir la expresión de Miro y Milton, lo que podría sugerir
un papel de Pink1 en este importante proceso (Weihofen et al., 2009).
La expresión de Pink1 con el dominio quinasa inactivo da como resultado el
aumento en la fosforilación de cofilina, una proteína importante para el
remodelamiento del filamento de actina, lo que sugiere que una dinámica
alterada de actina y el incremento de la asociación de parkin con el filamento
de actina pueden conllevar a condiciones patológicas resultantes de la
deficiencia de Pink1 (Kim y Son, 2010).
Las células mantienen su balance energético y evitan el estrés oxidativo
regulando el movimiento mitocondrial, su distribución y remoción. Pink y
parkin participan en esta regulación arrestando el movimiento mitocondrial, ya
15
que Pink1 fosforila a Miro un componente del componente primario del
complejo motor/adaptador que ancla a la quinesina a la superficie
mitocondrial. La fosforilación de Miro activa su degradación proteosomal
dependiente de parkin. Al remover Miro la proteína quinesina se separa de la
superficie mitocondrial. Previniendo el movimiento de las mitocondrias la vía
Pink1/parkin puede “poner en cuarentena” las mitocondrias dañadas antes de
removerlas. En este estudio se propone que la fosforilación de sustratos por
parte de Pink1 desencadena la subsecuente acción de Parkin y del proteosoma.
(Wang et al., 2011).
2.7 Función mitocondrial
Las mitocondrias son organelos celulares muy especializados. Más allá de su
clásica función como fuente de energía celular, gracias a contener la cadena
respiratoria, desempeñan papeles cruciales en diversos procesos que incluyen
apoptosis, almacenamiento de calcio y rutas biosintéticas, que inciden
directamente en la homeostasis celular. Por eso no sorprende que su
disfunción tenga consecuencias muy serias para la célula y que esté
relacionada con envejecimiento y desórdenes neurológicos (Lin y Beal, 2006).
La mayoría de sus proteínas residen en la matriz y son importadas a este
subcompartimento por la cooperación de dos principales translocasas, el
complejo TOM en la membrana externa y el complejo TIM 23 en la
membrana interna. Estos complejos interactúan entre sí para trasferir preproteínas al interior de las dos membranas de una manera concertada. El
complejo TOM es la translocasa en la membrana externa que media el importe
de virtualmente todas las proteínas de la mitocondria. Reconoce proteínas
precursoras en el citosol, facilita la liberación de factores de unión citosólicos,
16
contribuye al desplegamiento de proteínas, transfiere polipéptidos a través de
los poros de la membrana externa y media la inserción de algunas proteínas
que residen en ésta (Neupert y Herrmann, 2007).
El complejo TIM23 es la principal translocasa en la membrana interna de la
mitocondria. Transloca todos los precursores
de proteínas de matriz, la
mayoría de las proteínas de la membrana interna y muchas proteínas del
espacio intermembranal. La translocación por el complejo TIM 23 es dirigida
energéticamente por el potencial eléctrico de la membrana interna y por la
hidrólisis de ATP. Los componentes de este complejo pueden ser subdivididos
en dos grupos, que operan de una manera secuencial y cooperativa: el sector
membranal, que forma el canal conductor de proteínas y el motor de importe,
que conduce la translocación en el espacio de la matriz mitocondrial (Donzeau
et al., 2000).
Tres importantes descubrimientos han corroborado el concepto de que las
mitocondrias participan en señalización celular. En primer lugar, las ROS y
especies de nitrógeno pueden participar en lo que se conoce como la
“señalización celular redox”. En segundo lugar, la interacción entre la oxidasa
citocromo c y el óxido nítrico (NO•) constituye una vía de señalización para la
producción controlada de peróxido de hidrógeno (H2O2) para transducción de
señales. En tercer lugar, proteínas mitocondriales como el citocromo c pueden
ser liberadas hacia el citosol e iniciar vías de señalización que conducen a
apoptosis.
Las ROS representan un reto adicional para la integridad mitocondrial ya que
inducen modificaciones en las proteínas, peroxidación de lípidos y daño al
DNA. Éstas son un inevitable subproducto de la fosforilación oxidativa. Las
17
mitocondrias disfuncionales deben lidiar
con el riesgo de una hidrólisis
insignificante de ATP y un aumento del estrés oxidativo. Aun más, un daño
extensivo a nivel mitocondrial, puede conducir a la disipación del potencial de
membrana a través de la membrana interna e inducir muerte celular por la
liberación de proteínas proapoptóticas. Así que es crucial el control de la
fosforilación oxidativa y el monitoreo de la funcionalidad de la cadena
respiratoria para mantener la integridad del DNA mitocondrial y limitar el
daño en la mitocondria (Tatsuta y Langer, 2008).
2.8 Fusión y fisión mitocondrial
Las mitocondrias están muy lejos de ser organelos estáticos. Actualmente está
bien establecido que las mitocondrias están sometidas a un proceso constante
de cambio, al cual se le ha denominado dinámica mitocondrial que incluye
procesos de fusión y fisión.
Varios estudios han demostrado que las mitocondrias están en movimiento
constante e interaccionan con otros orgánulos como el retículo endoplasmático
o con otras mitocondrias (Bakeeva et al., 1978).
Mediante análisis de
grabación en video de imágenes adquiridas por microscopía de fluorescencia,
se han visualizado las mitocondrias moviéndose desde las regiones
perinucleares de la célula a las regiones más periféricas unidas tanto a
microtúbulos como a filamentos de actina (Krendel et al., 1998).
Durante su movimiento a través de los elementos del citoesqueleto, las
mitocondrias se fusionan con otras formando filamentos, o éstas se disgregan
produciendo mitocondrias aisladas, las cuales, a su vez, se dirigen en distintas
direcciones para volverse a fusionar con otras mitocondrias. Pero, ¿cuál es el
papel fisiológico de este mecanismo? Los estudios realizados por Skulachev y
18
colaboradores mostraron que filamentos extensos y otros filamentos
conectados, se despolarizaban cuando se generaba una lesión en la membrana
mitocondrial (en un único punto de 0,5 mm de diámetro) demostrando que las
redes mitocondriales funcionaban como una unidad eléctrica compartiendo el
mismo potencial de membrana.
Estas extensas redes son constitutivas en tejidos compuestos de células con
gasto energético elevado (como células musculares y neuronas), lo que llevó a
proponer la teoría de “los cables transmisores de energía” (Skulachev, 2001).
Esta teoría propone que una red mitocondrial extensa es eficiente en
condiciones en las que la disponibilidad de oxígeno en la región central de la
fibra muscular se convierte en el paso limitante con el objeto de mantener la
actividad de la cadena respiratoria. Se han obtenido conclusiones similares por
otros grupos, mediante medidas de recuperación de fluorescencia después del
photobleaching (FRAP), o siguiendo sucesos sincrónicos de despolarización.
Estudios genéticos han revelado la importancia de estos procesos en el
funcionamiento normal de las células y también se han descrito varios de los
componentes moleculares que los caracterizan. Dentro de la maquinaria de
fusión de los mamíferos se encontraron
dos proteínas denominadas
Mitofusina-1 (Mfn1) y Mitofusina-2 (Mfn2) que son GTPasas altamente
conservadas localizadas en la membrana externa mitocondrial (Chen et al.,
2003).
En ausencia de estas dos proteínas, no hay fusión mitocondrial y se cree que
su acción se desarrolla a través de unos dominios hidrofóbicos (HR1) que son
19
esenciales para la asociación con otras mitofusinas en las mitocondrias
cercanas.
Otra proteína involucrada en este proceso es Opa1, que fue inicialmente
identificada como un gen mutado en atrofia óptica dominante autosomal
(DOA, por sus siglas en inglés), una causa común de pérdida visual (Delettre
et al., 2000). El silenciamiento de Opa1 conduce a aberraciones en la
morfología de las crestas mitocondriales y genera fragmentación mitocondrial
(Chen y Chan, 2005).
Misko y colaboradores presentaron evidencias acerca de que mitofusina 2 es
necesaria para el transporte axonal de mitocondrias y además interactúa con el
complejo Miro/Milton. En este trabajo se identificó un rol para las mitofusinas
hasta el momento desconocido, en regular directamente el transporte
mitocondrial, lo cual ofrece una importante contribución al entendimiento del
mecanismo molecular de la degeneración axonal en la enfermedad de CMT2A
y en la atrofia óptica dominante (Misko et al., 2010).
En cuanto a la maquinaria
de la fisión mitocondrial las proteínas más
importantes que se han caracterizado son Drp1 y Fis 1. Drp1 se encuentra en
el citosol, pero una subpoblación se localiza en sitios puntuales de los túbulos
mitocondriales, estos sitios marcan lugares en donde se llevará a cabo la fisión
(Chan, 2006).
Drp1 contiene dominios característicos de la familia de GTPasas de dineína y
aparentemente puede constreñir las membranas mitocondriales. Análisis in
vitro demostraron que la hidrólisis de GTP es suficiente para que Drp1
constriña y tubule membranas liposomales, lo que indica que Drp1 tiene la
20
capacidad de ejecutar tanto la unión, constricción y liberación de membranas
sin la adición de otros factores (Elgass et al., 2012).
Figura No. 3 Esquema de las principales proteínas involucradas en fusión y fisión
mitocondrial (Chan, 2012)
En cuanto a Fis 1 se sabe que es una pequeña proteína de 17 kDa localizada
uniformemente en la membrana mitocondrial externa y su sobreexpresión
conduce a fragmentación mitocondrial dependiente de Drp1. La importancia
fisiológica de la fisión mitocondrial ha sido demostrada por la identificación
de un paciente con una mutación dominante negativa en Drp1. Este paciente
21
exhibió varias anormalidades incluyendo un pobre desarrollo cerebral, atrofia
óptica, acidosis láctica y mortalidad 37 días después de la gestación.
Figura No. 4 Esquema de la dinámica mitocondrial (Perier y Vila, 2012)
Recientemente se han identificado nuevas proteínas dentro de la maquinaria
de fusión y fisión mitocondrial.
En el año 2011 Zhao y colaboradores
reportaron que el factor de fisión mitocondrial MIEF1, también conocido
como MiD51, al ser sobreexpresado induce una extensiva fusión mitocondrial,
mientras que su depleción conduce a fragmentación de las mitocondrias.
MIEF1 interactúa y recluta a Drp1 en la mitocondria de una manera
independiente de Fis1, de Mff (una proteína que también puede reclutar a
Drp1 en la mitocondria y generar fisión mitocondrial) (Gandre-Babbe y van
22
der Bliek, 2008;Otera et al., 2010) y de Mfn2, pero inhibe la actividad de
Drp1, ejecutando así un efecto negativo en la fisión mitocondrial. MIEF1
también interactúa con Fis1 y cuando los niveles de expresión de esta última
aumentan parcialmente se revierte el fenotipo de fusión inducido por MIEF1.
Además de inhibir a Drp1, MIEF1 promueve fusión pero de una manera
independiente de las mitofusinas. Estos hallazgos develan un nuevo
mecanismo que controla la maquinaria de fusión y fisión mitocondrial en
vertebrados. Al ser MIEF1 una proteína específica de vertebrados, también se
muestra que hay importantes diferencias en la regulación de la dinámica
mitocondrial entre levaduras y vertebrados (Zhao et al., 2011).
Hay muchas evidencias acerca de que la pérdida de función y de la dinámica
mitocondrial
son
responsables
de
diferentes
enfermedades
neurodegenerativas, incluyendo el parkinson tipo 2. Mutaciones en Mfn2 se
han descrito como causa de la enfermedad CMT2A (Charcot-Marie-Tooth
subtipo 2A), una neuropatía periferal caracterizada por debilidad muscular y
pérdida sensorial en el limbo distal (Zuchner et al., 2004). La disminución de
la expresión de Opa1 hace a las células más susceptibles a la inducción de
apoptosis, mientras que la ausencia de Fis1 inhibe la muerte celular. El
silenciamiento de Drp1, también aumenta la viabilidad celular aunque en una
menor proporción que el silenciamiento de Fis1, lo que sugiere un rol proapoptótico para Drp1 y Fis1, y uno antiapoptótico para Opa1 (Lee et al.,
2004).
No sólo los genes recesivos causantes de EP tipo dos se han relacionado con
efectos en la morfología mitocondrial, también se ha encontrado α-syn puede
participar de este proceso. Una proteína muy importante ya que no sólo es el
componente
predominante
de
los
cuerpos
de
Lewy
(deposiciones
23
intracelulares proteínicas, muy características de la patología) sino que como
se mencionó anteriormente también presenta mutaciones causantes de la
enfermedad. Esta proteína de 140 aminoácidos está ampliamente distribuida
en el cerebro y se expresa en altos niveles en las neuronas, en donde puede
alcanzar concentraciones entre 0.5 y 1% de proteína total.
Se sabe que
interactúa con membranas lipídicas y que adopta conformaciones de tipo
amiloide. Su toxicidad puede ser consecuencia de interacciones membranales
anormales y alteraciones en el tráfico vesicular. Una de las propiedades
bioquímicas bien descritas de α-sinucleína es su unión a membranas, lo que
se asocia con cambios estructurales. En un estudio publicado en el año 2010 se
demostró por primera vez que α-sinucleína inhibe la fusión de membranas y
que su expresión induce fragmentación mitocondrial, mientras que la
disminución de la expresión de esta proteína conduce a la elongación de la
mitocondria. Sorpresivamente el fenotipo mitocondrial causado por la
expresión de α-sinucleína
es rescatado por la coexpresión de tres genes
asociados a la EP recesiva: Pink1, Parkin y DJ1(Kamp et al., 2010).
A nivel fisiológico, la dinámica parece participar en muchas funciones. Como
las mitocondrias son organelos altamente móviles y dinámicos que
continuamente se funden y se dividen, pueden intercambiar contenidos como
el DNA mitocondrial. En un estudio realizado en músculo esquelético de ratón
se mostró que la pérdida de función de las mitofusinas causa una severa
disfunción mitocondrial y atrofia muscular. Los ratones mutantes también
mostraron depleción en el mtDNA y sus genomas rápidamente acumularon
mutaciones puntuales y deleciones. Posiblemente la fusión mitocondrial es un
factor proactivo en enfermedades humanas asociadas a mutaciones en el DNA
mitocondrial (Chen et al., 2010).
24
La yuxtaposición entre el retículo endoplasmático y la mitocondria es una
característica estructural común, que provee la base física para la
intercomunicación durante la señalización por Ca 2+; los mecanismos
moleculares que controlan esta interacción aún son desconocidos. Un estudio
mostró que mitofusina 2 se encuentra enriquecida en la interfase entre la
mitocondria y el retículo endoplasmático. Al silenciar mitofusina 2 en
fibroblastos embriónicos de ratón y en células HeLa la morfología del ER se
ve afectada y se pierde la interacción ER-mitocondria, reduciendo la eficiencia
de la toma de Ca2+ a nivel mitocondrial en respuesta al estímulo generado por
el 1,4,5-inositol trifosfato. Ensayos in vitro así como evidencias genéticas y
bioquímicas soportan un modelo en el cual Mfn2 en el ER haría las veces de
un “puente” entre los dos organelos anclando complejos homo y heterotípicos
con mitofusina 1 o 2 en la superficie mitocondrial. Una yuxtaposición
necesaria para el ingreso eficiente de Ca 2+ (de Brito y Scorrano, 2008), de esta
manera se amplía el panorama en el cual actúan estas proteínas.
Las mitocondrias despliegan diferentes morfologías dependiendo del tipo
celular y de situación fisiológica en la que se encuentren. En muchos tipos
celulares senescentes, se ha observado una
extensiva elongación de las
mitocondrias, lo que podría tener alguna implicación funcional. Esta hipótesis
fue probada en células de endotelio humano que fueron envejecidas in vitro.
Las células jóvenes mostraban mitocondrias tubulares, mientras que las
envejecidas
se
interconectadas.
caracterizaron
por
tener
mitocondrias
alargadas
Al inducir un daño con luz UV en células jóvenes
e
se
observó la formación de ROS, la cual desencadena fragmentación celular y
pérdida de
m en las células jóvenes, mientras que las células senescentes
mostraron resistencia y alteraciones en los niveles de expresión de Fis1, Drp1
25
y Pink1. Estos resultados indican que hay un mecanismo de protección frente
al estrés oxidativo en células senescentes mediado por Drp1, Fis 1 y Pink (Mai
et al., 2010).
Todavía quedan muchas preguntas sin responder con respecto a estos dos
procesos. No se sabe cómo interactúan, pero se ha observado que las
mitocondrias sanas tienden a fusionarse mientras que la segregación por fisión
puede ser una forma de la célula para deshacerse de mitocondrias dañadas a
través de la degradación por lisosoma.
La funcionalidad de mitocondrias dañadas puede ser restaurada mediante
fusión con una mitocondria vecina que esté intacta (Detmer and Chan, 2007).
Mitocondrias
con
daños
severos
terminan
fragmentándose
y
son
selectivamente removidas por un proceso autofágico, conocido como
mitofagia. La mitofagia previene la liberación de proteínas proapoptóticas, así
que consistentemente con su función citoprotectora, el proceso apoptótico es
suprimido después de su inducción pero inducido cuando hay inhibición de
autofagia (Maiuri et al., 2007). Dos proteínas mitocondriales, llamadas Uth1 y
Aup1, han sido ligadas específicamente a mitofagia en Sacharomyces y no
hacen parte de la maquinaria autofágica general, compuesta por alrededor de
30 proteínas conocidas como Atg (Kissova et al., 2004;Scherz-Shouval et al.,
2007).
2.9 C2-Ceramida y Rotenona
Las ceramidas (N-acetil-esfingosina) hacen parte de un grupo de segundos
mensajeros basados en esfingomielina (Kolesnick y Kronke, 1998), son
generadas principalmente por dos mecanismos enzimáticos, a través de la
26
síntesis de novo por condensación de serina y palmitoil-CoA o mediante el
ciclo de esfingomielina. Además, la ceramida induce de-fosforilación de Akt,
lo cual hace que interactúe con Bcl-2 y Bcl-xL (mediadores anti-apoptóticos)
desencadenando la cascada apoptótica (Stoica et al., 2003). También, se ha
demostrado que la ceramida induce muerte celular por alteración de la función
mitocondrial, incluyendo generación de ROS, alteración en la homeóstasis del
calcio, colapso del potencial de membrana mitocondrial y liberación de
citocromo c (Kolesnick et. al., 1998; Mathias et. al., 1998).
Adicionalmente un estudio del año 2008 muestra que la ceramida estimula la
fisión mitocondrial y que este evento está asociado con una activación
temprana de apoptosis en cardiomiocitos. C2-ceramida también promueve un
rápido descenso en el potencial de membrana y liberación de CitC, mientras
que la disminución de la expresión de Mfn2 acentúa los efectos de C2ceramida en la fragmentación mitocondrial (Parra et al., 2008).
En este trabajo también se utilizó la rotenona como agente neurotóxico ya que
la inhibición del complejo I de la cadena respiratoria por esta molécula induce
muerte celular apoptótica en una gran variedad de células y esto ocurre a
través de la acelerada producción de ROS (Li et al., 2003). La rotenona
también es muy usada como modelo sistémico de la enfermedad de Parkinson
ya que replica muchos aspectos de la patología (Cannon et al., 2009).
2.10 Células CAD y M17
Las células CAD son una variante de la línea celular CATH.a y fueron
donadas por la Dra. Chikaraishi DM del departamento de Neurobiología del
27
Duke University Medical Center, Durham, North Carolina al Dr. Gonzalo
Arboleda del grupo de muerte celular de la Universidad Nacional de
Colombia. Se trata de una línea murina de neuronas catecolaminérgicas de
origen mesencefálico recientemente descrita que expresan las enzimas βhidroxilasa dopamina y tirosina hidroxilasa (TH), además de sintetizar altos
niveles de dopamina y norepinefrina (Suri et al., 1993) . También expresan
varios marcadores de neuronas diferenciadas, incluyendo proteínas de
neurofilamentos, sinaptofisina (Suri et al., 1993), canales dependientes de
voltaje sensibles a corrientes de K+ (Baraban et al., 1995), Na+ (sensibles a
tetrodotoxina) y Ca2+ similares a los reportados en otras neuronas, lo cual
indica que estas células poseen una membrana excitable, propiedad
característica de las neuronas (Lazaroff et al., 1996;Lazaroff et al., 1995).
Las células humanas BE(2)-M17 (designación ATCC CRL-2267) son células
humanas de neuroblastoma que expresan enzimas de síntesis de dopamina así
como actividad de tirosina hidroxilasa y dopamina-β-hidroxilasa. Fueron
derivadas de la biopsia de médula ósea de un paciente masculino con
neuroblastoma diseminado. Las células crecen en multicapas y tienden a
agregarse, ocasionalmente muestran neuritas alargadas (Thiele, 1991).
28
3 Capítulo 3
Objetivos
3.1 Objetivo General
Analizar el efecto de la disminución de la expresión de Pink1 en eventos de
fusión y fisión mitocondrial en un modelo de células catecolaminérgicas.
3.2 Objetivos Específicos
1. Analizar el efecto de la disminución de la expresión de Pink1 sobre la
viabilidad celular con o sin exposición a agentes neurotóxicos.
2. Determinar el efecto de la disminución de la expresión de Pink1 sobre
proteínas involucradas en procesos de fusión y fisión mitocondrial con o sin
exposición a agentes neurotóxicos.
3. Determinar el efecto de la disminución de la expresión de Pink1 en la
distribución y morfología mitocondrial con o sin exposición a agentes
neurotóxicos.
29
4 Capítulo 4
Metodología
El modelo de estudio empleado en este trabajo es de neuronas dopaminérgicas
CAD y M17, las cuales fueron transducidas de manera permanente con
vectores lentivirales para la interferencia de Pink1. La eficiencia de
transducción se determinó por
qPCR. Los eventos de fusión-fisión se
analizaron por medio de western blot: fusión (mitofusina2 y Opa1) y fisión
(Drp1 y Fis1) y mediante microscopía confocal (utilizando mitotracker y
transfección transitoria con Mito-YFP). Para analizar estos paradigmas en un
contexto neurotóxico modelo de EP, se utilizó C2-ceramida y rotenona.
4.1 Cultivos Celulares
Los cultivos se establecieron a partir de células CAD y M17 criopreservadas
en el pasaje 17. Las Células CAD fueron cultivadas en medio DMEM/F12
suplementado con 10% de suero bovino fetal en platos de cultivo estándar a
una densidad de 5 x 106 para frascos de 75 cm2, 1.8 x 104 por pozo, para
placas de 6 pozos y 7 x 103 por pozo para placas de 96 pozos, en una
incubadora con medio humidificado y una concentración de CO 2 al 5% y
temperatura de 37 ºC. El medio de cultivo fue remplazado cada 3 días, y al
obtener una confluencia aproximada del 80 %, se realizaron subcultivos o
pasajes. Para inducir la diferenciación, las células CAD fueron sembradas en
medio DMEM-F12 con 0,25% de suero; suplementado con sodio selenita 50
ng/mL y transferrina 1X. Las células M17 fueron cultivadas en medio
OPTIMEM I suplementado con 10% de suero fetal bovino y mantenidas en las
30
mismas condiciones anteriormente mencionadas, éstas células se diferencian
por tratamiento con ácido retinoico 1µM y en medio con SFB al 2%.
A
C
B
D
Figura No. 5 Microfotografías de las células CAD y M17. En A se muestran las células CAD
diferenciadas y en B células CAD no diferenciadas. En C se muestran las células M17 no
diferenciadas y en D diferenciadas (West et al., 2004) Barra de escala: 10 µm.
31
4.2 Conteo y viabilidad celular
Cada vez que fue necesario conocer el número de células viables y valorar la
evolución del cultivo se siguió el mismo procedimiento de conteo celular, para
lo cual se usó el azul de Trypan, un colorante de exclusión que permite
diferenciar las células viables (no teñidas) de las no viables (teñidas). Para
esto, las células se despegaron y resuspendieron usando Tripsina al 0.25% p/v
en una solución de PBS y EDTA 0.1% p/v, se tomó una muestra de la
suspensión y se diluyó en una solución de azul de Trypan al 0.4% en una
proporción de 1:4. Se colocaron 10 μl en un hemocitómetro, se contaron los
cuatro cuadrantes de las esquinas de ambos retículos. Para reportar el número
de células vivas por ml se tiene en cuenta el número de cuadrantes contados (8
cuadrantes cada uno con un volumen de 0,1 ml) y el factor de dilución que por
lo general fue de 2, con estos datos se aplicaba la siguiente ecuación.
4.3 Establecimiento de las poblaciones de CAD y M17
El diseño propuesto llevó a la creación de una población celular de CAD y
M17 silenciando Pink1 con vectores lentivirales generando así un modelo de
estudio de células dopaminérgicas que permitieron evaluar el rol que
desempeña esta proteína en eventos de fusión-fisión.
32
4.4 Transformación de E.coli JM109 con los plásmidos lentivirales para
shRNA de Pink1
Los plásmidos lentivirales con los insertos de shRNA para Pink1 fueron
donados por el Dr. Mark Cookson del Laboratorio de Neurogenética
del
Instituto Nacional de Envejecimiento (NIH) USA. La transformación en la
cepa de E.coli JM109 se realizó por termo competencia.
Una vez obtenidas las bacterias transformadas, se realizó la selección de las
colonias que tenían el inserto y se cultivaron toda la noche en medio LB con
ampicilina 100µg/ml y se congelaron en glicerol al 10% para posteriores
experimentos.
4.5 Purificación de los plásmidos lentivirales
Las colonias positivas para cada inserto fueron cultivadas toda la noche y la
purificación de los plásmidos se realizó utilizando el kit Zyppy Plasmid
Midiprep (Zymo Research). Después de la purificación se realizó un toothpick
para confirmar la purificación. Los plásmidos se cuantificaron en Nanodrop
y se congelaron para ser utilizados en la transducción de las líneas celulares.
4.6 Transducción y establecimiento de las líneas celulares CAD y M17
con silenciamiento permanente shRNA de Pink1
Los plásmidos lentivirales shRNA para Pink1 tienen el gen de blasticidina
para realizar la selección en células eucariotas. Para poder realizar esta
selección se realizó una curva inicial de blasticidina, determinando así la
dosis en la cual se podía realizar la selección después de la transducción. Se
utilizaron varias dosis (0-1-2-3-4-5-6-7-8-9-10 µg /ml) durante 10 días y se
33
determinó la dosis de la selección, que en este caso fue de 6 µg/ml para las
células CAD y de 5 µg/ml para las M17, durante 3 días para las dos líneas
celulares.
La transducción de las líneas celulares se realizó utilizando 1 ug de los
plásmidos shRNA para Pink1 usando liposomas; para las células CAD se usó
Hifect (Lonza) durante 24 horas, mientras que para la línea celular M17 se usó
X-treme Gene 9 (Roche) también durante 24 horas. Posteriormente se
seleccionó con blasticidina (6 µg/ml y 5 µg/ml, para las células CAD y M17,
respectivamente) por aproximadamente 15 días. Luego se verificó el
silenciamiento del gen midiendo los niveles de mRNA por PCR en tiempo
real.
Estas líneas celulares silenciadas fueron criopreservadas y se
denominaron Control shPink1 y shPink1, las cuales se usaron posteriormente
para
caracterizar sus efectos sobre el mecanismo de
fusión-fisión
mitocondrial. Las secuencias empleadas para el silenciamiento de Pink se
unen empezando por el nucléotido 550 de Pink1 (secuencia shPink1 A) y el
nucleótido 1141 (shPink1 C), también se usaron dos secuencias scrambled o
control de silenciamiento (Tabla No. 1).
Constructo
Secuencia
shPink1 A
5´- GCTGGAGGAGTATCTGATAGG-3´
shPink1 C
5´-GGGAGCCATCGCCTATGAAAT-3´
Control 1
5´- GCCTAGACGCGATAGTATGGA-3´
Control 2
5’- CCTAGACGCGATAGTATGGAC-3´
Tabla No. 1 Secuencias de los constructos de shRNA para Pink1 y de los controles de
silenciamiento.
34
4.7 Extracción de RNA
El RNA de las células CAD fue extraído utilizando Trizol (Invitrogen). Las
células fueron lisadas directamente en platos de 10 cm2 de área adicionando 1
mL de Trizol, el lisado celular se pasó varias veces a través de la pipeta y se
transfirió a un tubo eppendorf de 1.5 mL. La muestras homogenizadas fueron
incubadas durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir la completa
disociación de los complejos de nucleoproteína. Después se agregaron 200 µl
de cloroformo, se taparon los tubos, se agitaron vigorosamente a mano durante
15 segundos y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 minutos.
Después las muestras fueron centrifugadas a 12000 xg por 15 minutos a 4°C.
Después de la centrifugación, la fase acuosa, que contiene el RNA, fue
transferida a un nuevo tubo y el RNA fue precipitado agregando 500 µl de
alcohol isopropílico, las muestras se incubaron a temperatura ambiente
durante 10 minutos y se centrifugaron a 12000 xg durante 10 minutos a 4°C.
Después se removió el sobrenadante y el pellet de RNA se lavó una vez con 1
mL de etanol al 75% en agua DEPC mezclando con vórtex, en seguida se
centrifugó a 7500 xg durante 8 minutos a 4°C. Finalmente se removió el
sobrenadante y se secó el RNA en Speed Vac durante 5 minutos.
El RNA se disolvió en 30-50 µl de agua DEPC (dependiendo del tamaño del
pellet). La integridad del RNA fue evaluada mediante electroforesis en gel de
agarosa al 0.8% teñido con SYBR safe. Las muestras fueron cuantificadas en
NANO Drop, empleando 2 µl de muestra y haciendo la medición de cada una
por duplicado.
35
4.8 Transcripción reversa
La síntesis de cDNA fue realizada usando el kit Superscript III (Invitrogen).
El procedimiento consistió en poner el volumen equivalente a 5 µg de RNA en
un tubo de PCR libre de RNasas y agregar 1 µl de Oligo dT´s y 1 µl y
completar el volumen hasta 10 µl con agua DEPC. Después se agregaron los
siguientes reactivos en el orden en que se presentan a continuación:
Reactivos
Concentración
ARN total
5 μg
OligoDTs
10μM
dNTPs
0,50 mM
Agua DEPC
Completar a volumen
de 20μl
Buffer de
50 mM Tris-HCl pH
Transcripción
8,3
reversa
75 mM KCl
3 mM MgCl2
DTT
10 mM
SuperScript III RT
10 U
RNase OUT
40 U
Tabla No. 2 Lista de reactivos y su concentración final en la reacción de transcripción
reversa.
4.9 PCR en tiempo real
Para evaluar la disminución de la expresión de Pink1 se hizo la medición de la
cantidad de transcrito usando la metodología de PCR cuantitativa relativa a los
36
niveles de expresión de β–actina, la secuencia de los primers específicos
empleados se muestra en la tabla No. 3.
Gen de
Orientación
Secuencia
Pink1
Directo
5’-GTGGAACATCTCGGCAGGTT-3’
Pink1
Reverso
5’-CCTCTCTTGGATTTTCTGTAAGTGAC-3’
β-actina
Directo
5´-CTTGGGTATGGAATCCTGTGG-3’
β-actina
Reverso
5´- TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3´
Interés
Tabla No. 3 Primers específicos usados en la amplificación de Pink1 y de β-actina por qPCR.
Primero se hizo una PCR convencional en gradiente de temperatura para
determinar el rango de temperatura de anillamiento de los primers de Pink1.
Una vez determinado ese rango se empezaron los ensayos en el equipo de
tiempo de real probando las temperaturas de anillamiento encontradas en la
PCR convencional hasta determinar que 51°C era la temperatura óptima
(anexo 7.1 y 7.2).
El equipo empleado fue el Light Cycler 4.1 (Roche Molecular Biochemicals;
Mannheim, Germany). En la figura No. 6 se muestra el programa de
amplificación empleado para Pink1. El método del
Ct fue utilizado para
analizar los resultados ya que provee una rápida estimación de la proporción
relativa de la expresión de un gen (Kubista et al., 2006;Livak y Schmittgen,
2001). Posteriormente se recuperaron los amplificados y se corrieron en un gel
de agarosa al 5% para corroborar su identidad de acuerdo al tamaño esperado
37
del producto. La eficiencia de los primers fue evaluada haciendo uso de
diluciones seriadas de cDNA (1:3; 1:9; 1:27; 1:81) (anexo 7.3).
Figura No. 6 Programa usado en la amplificación de Pink1 por qPCR
4.10 Determinación de la actividad mitocondrial
Este parámetro se evaluó empleando el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difeniltetrazolio (ensayo de MTT). Las células fueron sembradas a una
densidad de 7 x 103 en 200 µl de medio por pozo en una placa de 96 pozos.
Las células CAD y CAD-shPink1 diferenciadas fueron tratadas con
C2-
ceramida 25 µM (Aldrich,St.Louis,MO,USA) durante 6 horas. Después de
remover 50 µl de medio, 25 µl de la solución stock de MTT (5mg/ml en PBS)
fueron añadidos a cada pozo, seguidos de incubación durante 2 horas a 37°C.
Después, el medio fue removido y las células fueron lisadas y el producto
púrpura de formazán fue solubilizado mediante la adición de 100 µl de
tampón de lisis de MTT (20% w/v SDS, 50% v/v dimetilformamida en agua
destilada, pH 4.7) por pozo. Las placas fueron incubadas a 37°C durante 120
38
minutos y la absorbancia fue leída a 590 nm. Las células sin tratar fueron
usadas como control positivo. El porcentaje de sobrevivencia celular fue
calculado como:
En donde X es la lectura promedio del metabolismo de MTT en un grupo con
un solo tratamiento.
4.11 Extracción y cuantificación de proteínas
Las células CAD y M17 shPink1 fueron cultivadas en placas de 6 pozos, se
aplicaron los tratamientos y se lisaron en frío usando tampón de lisis RIPA
suplementado con inhibidores de proteasas (Complete Mini, EDTA Free,
Roche) y fosfatasas (PhosphoStop Roche) dejando el reactivo en contacto con
las células durante 20 minutos. Los lisados se pasaron a tubos eppendorf y se
centrifugaron a 7200g por 10 min a 4°C y el sobrenadante se separó y se
almacenó a -20°C.
La concentración de proteína de cada muestra se determinó usando Ácido
Bicinconínico (BCA Protein Assay, Pierce) que tiene la ventaja de ser un
método muy sensible y que tiene muy pocas interferencias ya que es
compatible con la mayoría de detergentes iónicos y no iónicos, de acuerdo a
las instrucciones del fabricante. Para este ensayo se empleó la relación
reactivo: muestra (50:1) recomendada en el kit, se realizó una curva de
calibración con 5 patrones de trabajo desde 5 a 25 mg de BSA, que abarca el
rango de linealidad del ensayo. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30
39
minutos y la absorbancia se midió mediante espectofotometría en placas de 96
pozos a una longitud de onda de 540 nm.
4.12 Electroforesis en SDS-PAGE
Se utilizó una cámara de electroforesis BIORAD mini PROTEAN III para la
separación de proteínas de acuerdo a su tamaño en geles SDS-poliacrilamida
en gradiente de 6-15%. El gel se colocó entre dos placas de vidrio separadas
por espaciadores de 0,75 mm en un soporte vertical. Luego de la
polimerización del gel, este se colocó en tanques de electroforesis y se cubrió
con buffer de corrido. Las muestras de proteína (40 µg en total) diluidas en
buffer Lae mmli y el marcador de peso molecular se adicionaron en los pozos
y se llevó a cabo la electroforesis a 100V.
4.13 Detección de proteínas por Western blotting
Luego de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa usando una cámara de transferencia BIORAD Mini Trans-Blot.
El gel se cubrió con la membrana de nitrocelulosa que se coloca entre papel
Whatmann y dos esponjas de filtración. El ensamblaje se colocó en un cassette
de soporte, se insertaron en el tanque lleno de buffer de transferencia, con la
membrana de nitrocelulosa del lado del ánodo. La transferencia se llevó a
cabo por 1h a 100V.
Luego de la transferencia, la membrana se removió del ensamblaje y se incubó
en buffer de bloqueo (5% leche descremada en TBS con 0,1% (v/v) Tween20, TBS-T) por 1h. La membrana de nitrocelulosa se incubó con 3 ml de la
solución apropiada de anticuerpos primarios en buffer de bloqueo durante toda
la noche a 4ºC, se lavó 3 veces en TBS-T (5min/lavado). El anticuerpo unido
40
se visualizó mediante incubación de la membrana con el anticuerpo
secundario específico por 2h a temperatura ambiente y se lavó luego 3 veces
con TBS-T (5min/lavado). El anticuerpo secundario unido se detectó usando
quimioluminiscencia (ECL, Thermo Scientific). La membrana se incubó con
una mezcla 1:1 de los reactivos A y B de ECL por 1min, y se expuso a una
película ECL para visualizar los productos de quimioluminiscencia. Las
bandas en la placa fotográfica se escanearon utilizando un analizador de
imágenes (Phospho Imageur Storm 840, Molecular Dynamics).
Proteína
Marca
Dilución
Anticuerpo 2°
Tamaño
(kDa)
Mfn2
Sigma Aldrich
1:500
Rabbit
86
Opa1
BD Biosciences
1:500
Mouse
80-100
Drp1
BD Biosciences
1:500
Mouse
79-84
Fis1
Biovision
1:500
Rabbit
17
β-actina
Cell Biolabs
1:5000
Mouse
43
Tabla No. 4 Anticuerpos empleados para los ensayos de western blot
4.14 Análisis de la distribución mitocondrial por tinción con Mitotracker
Las células CAD fueron cultivadas según las indicaciones arriba mencionadas
sobre cubreobjetos tratados de la siguiente manera: Los cubreobjetos fueron
sumergidos en ácido clorhídrico 10N para retirar cualquier elemento orgánico
de su superficie. Posteriormente se lavaron con agua desionizada para retirar
el ácido. Los cubreobjetos se colocaron dentro de pozos del diámetro
correspondiente según el experimento y se cubrieron con una solución de PoliL-Lisina a una concentración de 0.01 mg/ml durante 1 hora. Seguidamente se
41
lavaron con agua desionizada y se irradiaron con luz ultravioleta para asegurar
la esterilidad durante 1 o 2 horas. Se sembraron las células a la densidad
correspondiente según el diámetro del pozo y se adicionó MitoTracker® Red
CM-H2XRos (Invitrogen) a una concentración de 200 nM durante 30 minutos,
se lavó dos veces con DMEM-F12 precalentado a 37°C y se fijó con
paraformaldehído a 4% en PBS durante 20 minutos. Después se pusieron
sobre un portaobjetos con medio de montaje apropiado para fluorescencia
(VectaShield®, Vector Labs) y se observó en un microscopio láser confocal
marca Nikon Eclipse Ti.
Como control positivo de fusión mitocondrial las células fueron tratadas con
forskolina (FK) 25 µM durante 45 minutos. La FK tiene la función de activar
la vía de señalización del cAMP, lo que termina por fosforilar a Drp1. La
forma fosforilada de esta proteína no es reclutada en la membrana
mitocondrial y por lo tanto no promueve fisión mitocondrial. Como control
positivo de fisión
las células CAD se trataron con CCCP en una
concentración de 10 µM durante 1 hora. Transcurrido ese tiempo el medio se
reemplazó con medio DMEM-F12 suplementado con SFB al 10% fresco. Las
células se fijaron y se pusieron en portaobjetos, como se describió
anteriormente.
4.15 Inmunofluorescencia
Las células CAD fueron se sembradas en cajas de 6 pozos que contenían
cubreobjetos de 2,2 cm. Cumplidos los tiempos de los tratamientos se realizó
la tinción de las mitocondrias con MitoTracker® como se explicó en 4.14.
Posteriormente se retiró el medio y las células CAD se fijaron con
paraformaldehído al 4% por 20 minutos, después se lavaron con PBS1X tres
42
veces durante 5 minutos y se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,1% en
PBS1X durante 10 minutos. Posteriormente se agregó buffer de bloqueo (BSA
al 1% y Tritón X-100 al 0,05% en PBS 1X) y se dejó en contacto con las
láminas durante 1 hora. Las láminas se incubaron con anti Fis1 (SantaCruz
Biotechnology sc-98900, 1:50); anti p-Drp1 (Ser-637) (Cell Signaling, 1:50) y
anti Mfn1 (SantaCruz Biotechnology sc-50330, 1:50) durante toda la noche. El
anticuerpo primario fue lavado 3 veces
con PBS1X durante 5 minutos.
Después se adicionó el anticuerpo secundario fluorescente: Alexa Fluor 568
rabbit anti—goat IgG (1:200, Invitrogen, A-11079) que estuvo en contacto
con las células fijadas durante 2 horas, se lavó y después el núcleo fue teñido
con Hoechst (1:5000, SIGMA 33258). Las imágenes celulares fueron
visualizadas en el microscopio confocal (C2-Confocal, Nikon) y analizadas
con el software ImageJ.
4.16 Análisis de los eventos de fusión y fisión mitocondrial por
transfección con mito-YFP
Las células M17 fueron transfectadas transitoriamente con 1 µg del plásmido
mito-YFP usando el reactivo X-treme Gene 9 (Roche). Posteriormente fueron
fijadas (como se explicó anteriormente) y puestas en portaobjetos esta vez con
Prolong Gold Antifade Reagent, invitrogen como medio para conservar la
fluorescencia. Las imágenes fueron adquiridas en un microscopio confocal
(Zeiss Confocal Microscope LSM 500). Las células transfectadas con mitoYFP fueron excitadas usando el láser HeNe a 488 nm usando un objetivo
PlanApochromat de 63x/1.4 Oil DIC. Las fotos mitocondriales se obtuvieron
con z-stacks de 20 imágenes separadas por 1µm a lo largo del eje z, el tiempo
total de adquisición de cada stack fue de 1.4 segundos.
43
Las imágenes obtenidas por microscopía confocal fueron optimizadas
ajustando el contraste y se pasaron a imágenes binarias por conversión a
imágenes de 8 bits. Después de reducir el ruido causado por la señal de
fluorescencia inespecífica se aplicó un filtro espacial (filtro de convolución)
así como un filtro de umbral para definir las estructuras mitocondriales.
Usando el programa Image J 1.47 (Wayne Rasband; National Institutes of
Health, USA) cada mitocondria fue marcada para analizar sus características
morfológicas como área, perímetro y ejes menor y mayor. Con base en estos
parámetros, la relación de aspecto (aspect ratio, AR; relación entre los ejes
mayores y menores de la elipse equivalente al objeto) de una mitocondria y su
factor de forma (FF; perímetro2/4π*área), consistentes con el grado de
ramificación, fueron calculados.
4.17 Análisis estadístico
Los datos presentados son promedio ±SEM de tres
experimentos
independientes. El análisis estadístico fue realizado usando ANOVA de una
vía (seguido de
la prueba Tukey-Kramer para comparación múltiple) y
ANOVA de dos vías, dependiendo de los datos a analizar, usando el programa
GraphPad 5 (Prism 5, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).
44
5 Capítulo 5
Resultados
5.1 La disminución de la expresión de Pink1 disminuye la actividad
mitocondrial y aumenta la vulnerabilidad al daño inducido por C2ceramida
En la figura No. 7 se muestran microfotografías de las células CAD durante el
proceso de selección de la dosis mínima del antibiótico capaz de matar el
100% de las células en un periodo de 48-72 horas. Para las células CAD la
dosis seleccionada fue de 6 µg/ml, mientras que para las células M17 fue de 5
µg/ml.
Día/Dosis
1
2
3
(µg/ml)
0
2
45
4
6
8
10
Figura No. 7 Determinación de la dosis tóxica mínima de blasticidina para las células CAD.
Como se ve en las fotos las dosis más altas (8 y 10 µg/ml) mataban el 100% de las células en un
periodo de 24h, sólo la dosis de 6 µg/ml lo hizo en un periodo de 72 horas, tiempo apropiado
para la selección de las células que captaron el plásmido exitosamente.
46
Una vez establecida esta dosis se procedió con la transducción
vectores
lentivirales
que
contienen
secuencias
específicas
usando
para
el
silenciamiento de Pink1 y secuencias scrambled o control de silenciamiento.
A partir de un único clon seleccionado con blasticidina se dio inicio al
crecimiento de las líneas celulares denominadas Control shPink1 y shPink1.
La eficiencia de la transfección fue evaluada mediante qPCR, la cuantificación
de los niveles de expresión relativa de Pink1 con respecto a β-actina, se
realizó con el método del
Ct (Livak, 2001). En la figura No. 8 se muestra la
disminución de la expresión de Pink1 en un 83% para las células CAD y en un
1.5
***
***
***
***
1.0
0.5
sh
Pi
nk
1
M
17
C
M
17
nk
1
on
tr
ol
sh
Pi
B
as
al
17
A
D
M
nk
1
C
C
A
D
C
on
tr
ol
sh
Pi
D
A
C
sh
Pi
nk
1
0.0
B
as
al
Expresión relativa de Pink1/ -actina
88% para las células M17.
Figura No. 8 Niveles de expresión de Pink1. Fueron medidos por qPCR en células CAD y M17
basales y transducidas con las secuencias control de silenciamiento y shPink1; ***, p<0,0001,
n=3, cada dato fue tomado por duplicado.
47
Habiendo establecido las líneas celulares se evaluó la actividad mitocondrial
mediante el ensayo de MTT. Las células fueron sembradas en cajas de 96
pozos y en medio de diferenciación. Las células sobrevivieron hasta 96 horas
después de iniciado el experimento. Las células shPink1 presentaron un menor
actividad mitocondrial comparadas con las células basales y control shPink1
en todos los tiempos (figura No. 9) mostrando un comportamiento similar a
% A ctividad mitocondrial
las células basales y control shPink1 tratadas con C2-ceramida 25µM.
CAD Basal
100
Control shPink1
shPink1
CAD Basal+C2-Ceramida
Control shPink1+C2 Ceramida
50
***
***
shPink1+C2-Ceramida
***
***
***
***
***
***
0
0
20
40
60
80
100
Tiempo (h)
Figura No. 9 Disminución de la actividad mitocondrial en células shPink1.Ensayo de MTT
para evaluar la actividad mitocondrial de células CAD basales, control shPink1 y shPink1 con
y sin exposición a C2-ceramida. ***, p<0,0001, n=3, 16 datos fueron tomados por línea
celular/tratamiento.
Así mismo, las células shPink1 tratadas con C2-ceramida presentan menor
actividad mitocondrial comparadas con las células control shPink1 en esta
48
misma condición. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas en
todos los tiempos evaluados.
5.2 La disminución de la expresión de Pink1 induce cambios en la
morfología y distribución mitocondrial, éstos se incrementan en
presencia de agentes neurotóxicos
Las células CAD fueron teñidas con Mitotracker. En la figura No. 10 se
observan diferencias con respecto a la distribución de las mitocondrias. En las
células shPink1 no tratadas se observan las mitocondrias organizadas
alrededor del núcleo, mientras que en las control shPink1 se alcanzan a
distinguir redes que se extienden a lo largo del citoplasma. El tratamiento con
C2-ceramida retrae esas redes, al igual que lo hace el CCCP.
La tinción con Mitotracker no permitió analizar la morfología de las
mitocondrias, a pesar de que se probaron diferentes dosis del reactivo y
tiempos de incubación del mismo. En su lugar, se optó por transfectar las
células transitoriamente con un plásmido fluorescente de localización
mitocondrial: mito-YFP. La transfección con mitoYFP es el método más
utilizado para visualizar mitocondrias ya que es mucho más estable que los
pigmentos fluorescentes y su localización no depende del
m
y no afecta el
comportamiento de las mitocondrias (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010).
49
Figura No. 10 Distribución mitocondrial en células CAD. Microfotografías de las células CAD
control shPink1 y shPink1 con y sin exposición a C2-ceramida. Las mitocondrias fueron
marcadas con Mitotracker Red 200nM durante 30 minutos. Barra de escala: 3,2 µm.
50
A
B
C
D
E
Figura No. 11 Procesamiento de las imágenes mitocondriales obtenidas por microscopía
confocal. El programa empleado fue Image J. En A se muestra la imagen original
(superposición de cada una de las 20 imágenes que componen el stack); B, Proyección 3D de la
imagen obtenida en A; C, Ajuste de contraste y aplicación de filtros espaciales de la imagen
obtenida en B; D, Conversión a imagen binaria de 8 bits de la imagen obtenida en C para
posterior análisis de partículas y de descriptores de forma, algunos descriptores se muestran
en la imagen representativa que se muestra en E.
Con ayuda del programa Image J las imágenes fueron procesadas (figura
No.11) y sobre éstas se midieron diferentes parámetros morfológicos como
51
AR y el factor de forma (F/F). AR es una medida de la longitud mitocondrial,
mientras F/F es una medida tanto de la longitud como del grado de
ramificación (De Vos et al., 2005;De Vos and Sheetz, 2007).
Con base en esos descriptores morfológicos, las mitocondrias se dividieron en
dos grupos: fragmentadas/no ramificadas y asociadas/ramificadas. En la figura
No. 12 se presentan algunas de las imágenes representativas de las
mitocondrias de las células M17 control shPink1 y shPink1 que fueron
tomadas in vivo. Mientras que en la figura No. 13 se muestran las diferentes
morfologías de las células fijadas, encontrándose que hay correlación entre
éstas. Las células control de silenciamiento presentaron menor porcentaje de
células fragmentadas comparadas con las células silenciadas para Pink1
(figura No. 14) este mismo efecto se observó al tratar las células con rotenona.
De igual manera, las células silenciadas para Pink1 no responden de manera
similar a las células control al estímulo generado por la forskolina. Las células
shPink1 presentaron un 52% de células ramificadas o asociadas, mientras que
las control shPink1 muestran este tipo de morfología en más de un 90%.
Con estas microfotografías también se corroboran las diferencias en cuanto a
distribución mitocondrial, ya que es notable que en las células control se
encuentran más distribuidas a lo largo del cuerpo celular mientras que en las
silenciadas tienden a concentrarse alrededor del núcleo. Un comportamiento
similar al observado en estas células cuando son tratadas con rotenona y con
CCCP. El tratamiento con FK genera mitocondrias muy alargadas y redes
extensas en los dos tipos celulares.
52
Figura No. 12 Microfotografías in vivo de las mitocondrias de células M17 Control shPink1 y
shPink1. En las células shPink1 tratadas y no tratadas con rotenona se observan mitocondrias
fragmentadas en mayor proporción comparadas con las células control de silenciamiento.
Barra de escala: 5 µm.
5.3 El silenciamiento de Pink1 afecta la expresión de algunas proteínas
involucradas en fusión/fisión
Teniendo en cuenta que se obtuvieron diferencias en la morfología de las
mitocondrias silenciadas para Pink1, el siguiente paso fue evaluar si éstas
diferencias estaban relacionadas con los niveles de expresión de algunas de las
proteínas involucradas en los procesos de fusión/fisión. Se realizaron western
blot para Drp1 y Fis1 (para evaluar fisión) y Mfn2 y Opa1 (para evaluar
fusión).
53
Figura No. 13 Morfología mitocondrial de las células M17. Las células M17 control shPink1 y
shPink1 fueron transfectadas con mito-YFP y sometidas a diferentes tratamientos. Las
imágenes de las mitocondrias fueron obtenidas por microscopía confocal y procesadas con
54
Image J. Las flechas señalan mitocondrias fragmentadas. Barra de escala: 5 µm.
P<0.0001
% de células
100
Fragmentadas/No ramificadas
Asociadas/Ramificadas
50
Co
nt
ro Con
ls
tr
h
Co Pin ol s
k1 hPi
nt
Co
ro
nk
+R
nt
l
1
ro
sh
ot
ls
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Pi
hP
nk non
1+
in
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k1
CC
+F
or CP
sk
ol
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Pi
a
sh
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P
1+
in
k1
R
sh
ot
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P
n
sh
in
Pi
k1 ona
nk
+C
1+
F o CC
P
rs
ko
lin
a
0
Figura No. 14 Cuantificación de la morfología mitocondrial de células M17 control shPink1 y
shPink1. Entre 280-400 células en total fueron evaluadas por cada tratamiento, n=3. Los
valores están expresados como porcentaje del número total de células contadas. La
significancia estadística fue analizada por ANOVA de dos vías por morfología mitocondrial y
línea celular.
Los niveles de Drp1 total disminuyeron significativamente en las células
shPink1. Un resultado muy similar se observó en las células tratadas con
rotenona y forskolina. En cuanto a Fis1 solamente hubo cambios destacables
en las células tratadas con CCCP, encontrándose un aumento importante de
esta proteína en las células shPink1 comparadas con las células control. Con
respecto a las proteínas de fusión, sólo se observaron cambios con relevancia
55
estadística para Mfn2, ya que los niveles de esta proteína disminuyen en las
células silenciadas para Pink1 no tratadas y además en las estimuladas con FK
y con CCCP (figuras No. 15 y 16). En Opa1 no se encontraron diferencias
estadísticamente significativas.
Figura No. 15 Western blot de algunas de las proteínas involucradas en fusión y fisión
mitocondrial. Imágenes representativas de 3 experimentos independientes.
En las células CAD se realizó inmunofluorescencia para detectar a Fis1, pDrp1 y Mfn1 (figuras 17 a 19). En las figuras se observa que hay una mayor
intensidad de fluorescencia de Fis1 en las células shPink1, mientras que ocurre
lo contrario para p-Drp1 y para Mfn1.
56
Co
Co
Expresión relativa de F is1/ -actina
nt
nt
ro
ro
ls
l
sh
hP
Pi
in
nk
k1
1
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Co
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ro
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Pi
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1
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1+
sh
FK
Pi
nk
1+
CC
CP
1.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
***
***
0.5
0.0
***
Co
Co
Expresión relativa de M fn2/ -actina
nt
nt
ro
ro
ls
l
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hP
Pi
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k1
1
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Co
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1+
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FK
Pi
nk
1+
CC
CP
***
Co
Co
Expresión relativa de Opa1/ -actina
nt
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ro
ro
ls
l
sh
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Pi
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nk
k1
1
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Co
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Pi
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sh
FK
Pi
nk
1+
CC
CP
Co
Co
Expresión relativa de D rp1/ -actina
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ro
ro
ls
l
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Pi
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nk
k1
1
+R
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Pi
Pi
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1+
1
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Pi
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1+
sh
FK
Pi
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CC
CP
1.5
1.5
***
***
1.0
***
0.5
0.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Figura No. 16 Densitometría de las proteínas de fusión/fisión detectadas por western blot. La
densitometría fue realizada con el programa Image J.
57
Figura No. 17 Inmunofluorescencia de Fis1. Microfotografías representativas en donde se
muestra una mayor intensidad de fluorescencia de Fis1 en las células shPink1 tratadas y no
tratadas con C2-ceramida, comparadas con las células control. Barra de escala: 3,2 µm.
58
Figura No. 18 Inmunofluorescencia de p-Drp1. Microfotografías representativas en donde se
muestra una mayor intensidad de fluorescencia de p-Drp1 en las células basales comparadas
con los demás tratamientos. Barra de escala: 3,2 µm.
59
Figura No. 19 Inmunofluorescencia de Mfn1. Microfotografías representativas en donde se
muestra una mayor intensidad de fluorescencia de Mfn1 en las células basales comparadas
con los demás tratamientos Barra de escala: 3,2 µm.
60
5.4 Discusión de Resultados
Muchos estudios se han realizado con el objetivo de entender la etiología de la
enfermedad de Párkinson. Sin lugar a dudas la mayor fuente de información se
ha obtenido a través de las formas genéticas de la enfermedad, que son las
menos comunes. Desde el 2004, se han reportado numerosos avances en
cuanto al posible papel biológico que ejerce Pink1 y que puede ser relevante
con respecto a la patología en la cual fue inicialmente involucrado. Sin
embargo, todavía la función bioquímica de Pink1 y las vías de señalización
que la regulan son desconocidas.
Diferentes estudios han mostrado que Pink1 puede actuar como un
neuroprotector (Haque et al. 2012; Sánchez-Mora et al. 2012) y que su
deficiencia promueve una mayor susceptibilidad a apoptosis (Deng et al.
2008; Gautier et al. 2008; Valente et al. 2004). Las células CAD que
sobreexpresan Pink1 y que son tratadas con C2-ceramida muestran menores
porcentajes de mitocondrias depolarizadas, menor expresión de Bax y una
mayor
expresión de Bcl-2 comparada con las células no transfectadas.
Además Pink1 rescata l inhibición de la fosforilación de Akt inducida por C2ceramida (Sanchez-Mora et al., 2012).
En este trabajo se realizaron ensayos de MTT para evaluar la función
mitocondrial de células CAD con niveles de expresión de Pink1 disminuidos
en presencia y en ausencia de un insulto neurotóxico generado por C2ceramida (que causa muerte celular apoptótica en modelos dopaminérgicos,
(France-Lanord et al. 1997;Arboleda et al., 2010;Arboleda et al., 2009). Como
se muestra en la figura No. 9, las células CAD que tienen menores niveles de
expresión de Pink1 presentan una menor absorbancia a 590 nm (menor
61
producción de formazán), lo que es indicativo de una menor cantidad de
células vivas con una actividad mitocondrial normal. Estas diferencias entre
líneas celulares fueron significativas estadísticamente, demostrando así que
Pink1 es importante para el normal funcionamiento de las mitocondrias.
El efecto neurotóxico de la C2-ceramida es mayor en las células que expresan
niveles más bajos de Pink1, lo que muestra no sólo la C2-ceramida (un
inhibidor de la vía de supervivencia PI3K/Akt) está afectando la supervivencia
de éstas células sino también la deficiencia de Pink1; a su vez este resultado
permite asumir que posiblemente hay una relación entre esta
vía de
señalización y Pink1, como lo sugieren algunas investigaciones (Qi et al.,
2011;Timmons et al., 2009; Stiles, 2009).
Queda claro que Pink1 es necesario para que haya una función mitocondrial
normal, pero ¿está eso asociado a la morfología de las mitocondrias? Esta
pregunta es válida teniendo en cuenta que la dinámica mitocondrial está
involucrada en procesos de muerte celular y que a su vez existe polémica
alrededor del efecto que Pink1 puede ejercer en el balance entre fusión y
fisión mitocondrial.
En este trabajo se encontró que cuando Pink1 está silenciado, el número de
células que contiene mitocondrias fragmentadas aumenta (de 40% a 57%
cuando se comparan con las células control shPink1) y que el tratamiento con
rotenona tiene un efecto aditivo. La fragmentación de las mitocondrias está
vinculada con la muerte celular pero todavía no se tiene claro si éste efecto es
una causa o una consecuencia. Las mitocondrias tienden a fragmentarse
cuando tienen un daño para posteriormente ser eliminadas mediante un
proceso de muerte selectivo conocido como mitofagia. De acuerdo a los
ensayos de MTT se puede asumir que las células silenciadas para Pink1
62
tienden a morir en mayor proporción que las células control y de esta manera
se justifica que muestren en mayor proporción una morfología redondeada y
que ésta incremente cuando se inhibe el complejo I de la cadena respiratoria
con la dosis usada de rotenona (Hoppins et al., 2007).
Llama la atención que las células shPink1 no respondieron de igual manera al
estímulo generado por la FK, la cual actúa como potenciadora de cAMP,
conduciendo a la fosforilación de Drp1, una forma inactiva a nivel de fisión y
que no se localiza en la mitocondria y que por lo tanto inclina la balanza hacia
la fusión mitocondrial (Cribbs y Strack, 2007;Cribbs y Strack, 2009) .
Mientras que las células control shPink1 presentan un 94% de células
ramificadas o asociadas en presencia de FK, sólo el 47% de las shPink1 tienen
esa misma morfología. Es posible especular que la diminución de la expresión
de Pink1 en estas células de alguna manera afecta la fosforilación de Drp1 y
por esto más de la mitad de las células conservan su morfología fragmentada.
Esta afirmación la apoya un estudio previo en donde se vio que Pink1
silvestre, más no las versiones mutantes recesivas con dominios quinasa
inactivos protegen contra la fragmentación mitocondrial inducida por
rotenona, mientras que células deficientes en Pink1 muestran menor conexión
mitocondrial. La expresión de la proteína relacionada a dinamina 1 (Drp1)
exagera los fenotipos deficientes de Pink1 y la interferencia de Drp1 los
rescata. Drp1 es defosforilado en células deficientes de Pink1 debido a la
activación de la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (Sandebring et
al., 2009).
63
Los experimentos de western blot mostraron que hay una diminución
significativa de Drp1 total en las células shPink1no tratadas. El hecho de que
las células shPink1 muestren mayor proporción de mitocondrias fragmentadas
pero niveles más bajos de Drp1 con y sin tratamiento con rotenona comparada
con las células control shPink, puede atribuirse a que no sólo de esta proteína
dependa la fragmentación mitocondrial, sino que existe un mecanismo
independiente de Drp1 que participa en la fisión de este organelo como lo
sugiere un trabajo en donde al inhibir a Drp1, se retrasa, pero no se previene
por completo la fisión mitocondrial (Ishihara et al., 2009).
Proteínas como Bax y Bak también pueden hacer parte de este proceso
(Martinou y Youle, 2011), así como las modificaciones post-traduccionales de
Drp1, que son muy complejas (hasta el momento se ha reportado
fosforilación, sumoilación, desumoilación y ubiquitinación) y de las cuales
todavía se sabe muy poco acerca de su función y regulación (Reddy et al.,
2011;Santel y Frank, 2008). Una importante disminución también se observa
en presencia de FK ya que las células se estimulan para fusionarse, sin
embargo, como se vio anteriormente aproximadamente la mitad de la
población celular shPink1 responde a este estímulo. Con respecto a Fis1 sólo
se obtuvieron cambios significativos entre las líneas celulares al ser tratadas
con CCCP, como si éste estímulo implicara una mayor proporción de ésta
proteína en las células shPink1.
Mfn2 también presenta cambios cuando en células shPink1. Como es de
esperarse sus niveles en células aumentan en presencia de FK (ya que se
promueve la fusión mitocondrial) con respecto a las células shPink no
tratadas, pero éste aumento no es tan alto como el que se observa en las
células control shPink1. Lo que confirma una vez más que las células no están
64
respondiendo de manera adecuada a dicho estímulo. Los niveles de Mfn2 en
las células shPink1 no tratadas son significativamente menores a los de las
control shPink1, lo que coincide con la mayor presencia de mitocondrias
asociadas o ramificadas en éstas. Sin embargo, los niveles de Opa1 no
mostraron cambios relevantes. Probablemente el silenciamiento de Pink1 no
está modulando los niveles de esta proteína y son otros los factores
involucrados en su regulación. También algunos estudios han mostrado que
las mitofusinas y Opa1 actúan en distintos pasos durante el proceso de fusión,
ya que MEFs knockout para esta proteína mantienen la fusión de la membrana
externa pero carecen de fusión de la membrana interna (Chan, 2012).
Un aspecto relevante en este estudio y sumamente repetitivo fueron las
diferencias encontradas en cuanto a la distribución de las mitocondrias. Esta
organización parece tener implicaciones a nivel a funcionalidad como se ha
visto en estudios previos, en donde se mostró que las mitocondrias
perinucleares tienen un papel en la regulación espacial de las ondas de Ca 2+
(Hashitani et al., 2010). La carencia de Pink1 tiende a desplegarlas de esta
manera, al igual que los tratamientos con rotenona y CCCP. Se sabe que Pink1
puede regular las corrientes de Ca2+ (Ghandi et al., 2009) y esto podría ser a
través de la regulación de la morfología mitocondrial. Estudios futuros podrán
aclarar más el panorama en este aspecto.
65
6 Capítulo 6
6.1 Conclusiones
Resulta claro que Pink1 es importante en la actividad mitocondrial y que este
efecto está relacionado con el balance entre fusión y fisión. La ausencia de
Pink1 en este modelo está inclinando la balanza hacia la fisión de las
mitocondrias, aunque este efecto no está relacionado con mayores niveles de
la proteína Drp1 y posiblemente otros mecanismos estén involucrados en este
proceso, entre los que no se descartan las diferentes modificaciones posttraduccionales de dicha proteína, en las cuales Pink1 parece tener un papel
significativo, en relación específicamente con la fosforilación. En este
contexto Pink1 promovería neuroprotección regulando la fusión mitocondrial,
por lo cual sigue siendo un gen relevante en el estudio, entendimiento y
posible tratamiento de la EP.
6.2 Perspectivas
Hacer estudios concluyentes acerca de la dinámica mitocondrial ha resultado
muy difícil. Aunque se han desarrollado varias técnicas (ensayo de células
híbridas, FRAP, fotoactivación de proteínas, etc) las mitocondrias son muy
diferentes dependiendo del tipo celular y esto dificulta su análisis. Por
ejemplo, en los fibroblastos, se observan estructuras muy definidas, mientras
que en las neuronas no ocurre lo mismo. El hecho de que aparezcan cada vez
66
más nuevas proteínas involucradas en la fusión y fisión hace que el panorama
se expanda aún más y que sea más complejo.
El desarrollo de metodologías más precisas para el estudio de mitocondrias es
esencial para develar con mayor exactitud los mecanismos de fusión y fisión.
Desde luego, no existe la técnica perfecta, pero las que se tienen hoy en día
admiten un alto grado de subjetividad. En cuanto a Pink1 también es
importante anotar que hoy en día, más de 10 años después de su
descubrimiento, todavía no se cuenta con anticuerpos confiables para la
detección de la proteína, además sus niveles endógenos son muy bajos y por
eso se debe acudir a procedimientos que pueden estresar a las células, como
las transfecciones.
Todavía queda un largo camino por recorrer en cuanto a los mecanismos, las
vías de señalización y
las funciones de la fusión y fisión mitocondrial;
procesos esenciales a nivel celular que al ser develados podrían conducir al
entendimiento de muchas patologías y al desarrollo de tratamientos
terapéuticos.
67
7 Anexos
7.1 RT-PCR para determinación de la temperatura óptima de
anillamiento de los primers de Pink1
7.2 Picos de fusión de Pink1 (azul) y de β–actina (verde) tomando como
temperatura de anillamiento 51°C
68
7.3 Curvas de amplificación (A) y picos de fusión (B) de Pink1 y de β–
actina
69
7.4 Comprobación de la eficiencia de los primers para Pink1 mediante
diluciones seriadas
La pendiente de la gráfica es de 2.2, que es igual a la eficiencia
70
8 Bibliografía
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