desarrollo de metodologías hplc-ms/ms para el estudio y

DESARROLLO DE METODOLOGÍAS HPLC-MS/MS
PARA EL ESTUDIO Y MONITOREO DE UNA
REACCIÓN DE OBTENCIÓN DE BENZNIDAZOL
Galetti, Mariana A.; Checura, Cintia C.; Gandolfi Donadio, Lucía;
Comin, María J.; Santos, Marina
E-mail: msantos@inti.gob.ar
INTRODUCCION
Figura 1
H
N
NH2
Benznidazol es el ingrediente farmacéutico activo (IFA) más utilizado para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Es un
IFA clave para la salud pública de la población nacional y regional. Debido a que el proceso de producción que se utiliza
actualmente es costoso, de alta peligrosidad y baja eficiencia, se desarrolló una ruta sintética que se destaca por utilizar
material de partida económico y emplear intermediarios de menor peligrosidad (Figura 1). El desarrollo analítico se realizó
en forma simultánea al sintético y resultó imprescindible para lograr un proceso productivo exitoso.
N 2 + C l-
1 ) H C l, N a N O 2
O
O
N
H
4
Cl
2 ) U re a
N
Cl
Cl
2
3
5
p H = 9-10
80%
9
Ph
N
N
K 2C O 3, D M F, 70
o
6
C
6
74%
5
(E )
1)
P d /C , H 2 ( g ), M e O H
2)
TFA (
1
e q)
62%
Cl
O
O
N
N
H
OBJETIVO
N
N aN O 2, H F B 4, H 2O
N H 2 .T F A
4 4 .5 %
7
N
N
N
H
NO2
1
7
Desarrollar métodos HPLC-MS/MS para monitorear el grado de avance de las reacciones y la pureza de los productos
intermedios.
N
H
N
N
H 2O , N a2C O 3,
N
H
Cl
N
N
N
1
Esquema de síntesis propuesto para la obtención de Benznidazol (1)
CONDICIONES EXPERIMENTALES
Equipo: espectrómetro Quattro Premier XE equipado con módulo de separación HPLC Alliance (Waters)
Separación por HPLC
Columna: ACE 3 C18 (50 mm x 2.1 mm, 3 µm)
Fase móvil A: 0.1 % (v/v) CH2O2 en Agua
Fase móvil B: 0.1 % (v/v) CH2O2 en Acetonitrilo
Temperatura = 30oC
Flujo: 0.5 mL/min
Detección MS:
Modo de ionización: ESI+ Capilar: 3.2 kV
Cono: 20 V
Detección MS/MS:
Energía de Colisión: 18
Flujo Ar: 0.2 ml/min
Temperatura de la fuente: 150 oC
RESULTADOS
Inicialmente se desarrolló un
método HPLC/MS que permitió
el monitoreo rápido de los
intermediarios y producto de la
síntesis, resolviendo todos los
compuestos en menos de 5 min
(Figura 2, Gradiente A:B (min):
85:15 (0); 30:70 (15)).
Figura 2
Para el seguimiento del compuesto 5, primer intermediario de la
síntesis, fue necesario modificar el método HPLC para incluir a los
compuestos de partida 2 y 4, detectados por RMN´H en los crudos
de reacción (Figura 3).
Figura 3
Cromatograma de iones extraídos de un crudo de reacción de
obtención del compuesto 5.
Gradiente A:B (min): 90:10 (0-1); 85:15(1.1-2); 50:50 (4-6)
Se modificaron las condiciones de reacción extendiendo el tiempo de
la etapa de diazotación y modificando la temperatura de la misma.
La presencia de los compuestos de partida 2 y 4 en los productos
obtenidos bajo las nuevas condiciones de reacción se monitorearon
por HPLC/MS, obteniéndose finalmente un rendimiento de 80% y un
producto de alta pureza.
En la obtención de 6 se observó la presencia del isómero Z (Figura 4A) junto con otras impurezas. La identidad de este
isómero se corroboró mediante HPLC-MS/MS, ya que se observó el mismo patrón de fragmentación para ambos
compuestos (Figura 4B).
Figura 4B
Figura 4A
Se analizó la eficiencia de distintos sistemas de recristalización del crudo de reacción, seleccionando aquel que
proporcionó una pureza adecuada en función de la eficiencia y reproducibilidad de la siguiente etapa de la síntesis.
El crudo de reacción, obtenido por
reducción del grupo azo de 6 en
condiciones de hidrogenación catalítica,
presentó una impureza correspondiente al
compuesto sobrehidrogenado (m/z = 233,
Figura 5A).
Se confirmó la identidad de la impureza
mediante experimentos HPLC-MS/MS
(Figura 5B).
Figura 5A
Estos resultados indicaron la necesidad de suavizar las condiciones de
hidrogenación, realizando la reacción bajo atmósfera de hidrógeno a
presión atmosférica en lugar de a 40 Psi. De esta forma, se obtuvieron
resultados reproducibles de rendimiento y pureza en la escala de cientos
de miligramos.
Figura 5B
CONCLUSIONES
Los métodos HPLC-MS/MS permitieron examinar rápidamente el progreso de las reacciones, confirmar la formación
de productos de reacción, comparar la abundancia relativa de los productos y obtener información estructural acerca
de las impurezas generadas. Estos estudios permitieron optimizar las condiciones de reacción mejorando la
eficiencia del desarrollo sintético y reduciendo el tiempo y costo de los análisis.
A futuro se proyecta trabajar en el escalado de la reacción de hidrogenación para la obtención de 7 y la optimización
de la última etapa para la obtención de Benznidazol (1).