12/2/2009 INGENIERíA BIOFARMACÉUTICA Mario Moisés Álvarez Centro de Biotecnología FEMSA TECNOLÓGICO DE MONTERREY Grupo Ingeniería de Bioreacción y Biotecnología Farmacéutica. DIA. 2nd Latin American Regulatory Conference (LARC) Ciudad de México, México. Noviembre 2009 1 12/2/2009 INGENIERÍA BIOFARMACÉUTICA ¿Qué es un Biofármaco? ¿Qué es un Biofármaco? •Proteína ó Ácido Nucleico • Fines terapéuticos • Obtenidos por vía biotecnológica • No obtenidos directamente por extracción de fuentes No obtenidos directamente por extracción de fuentes naturales (“non‐engineered”)… entonces, generalmente hay una célula recombinante de por medio… Walsh G. (2003). Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology. Second Editions. Wiley. 551 pp. EJEMPLOS DE BIOFARMACOS • Insulina recombinante • Eritropoyetina • Interferón • Hormona del Crecimiento Humana Recombinante • Anticuerpos Monoclonales •Terapias basadas en suministro de RNAi T i b d i i t d RNAi 2 12/2/2009 HISTORIA Y NÚMEROS • Industria Farmacéutica: apenas 65 años de historia • Valor “total” en 1980: 100 billones de dlls= 100,000,000,000 dlls • Industria Biofarmacéutica: comenzó a principios de los 80 • Grandes nombres: Genentech, Amgen, Centocor, Chiron, G d b G t h A C t Chi Wyeth, Serono, Roche, Cytogen, Eli Lily. •Farma migrando a biofarma: Merck, BMS, Abbott, Novartis. According to: Biotech 2007. Life Sciences: A global Transformation. 21st Annual Report On the Industry. Burrill&Company. STEVE Burrill. VALOR SOLO BIOFARMA… SOLO LAS 10 PRIMERAS SOLO LAS 10 PRIMERAS: Billon nes dlls $491 $441 $52 $39 $15 1986 1991 1996 2001 2006 3 12/2/2009 Billones dlls $491 $441 •Genentech •Cetus •ALZA ALZA •Applied Biosystems •Centocor •Amgen •Nova •Chiron •Genetics Institute •Biogen Biogen Genentech Amgen Gilead Sciences Celgene Biogen Idec Genzyme Serono Shire Quest Diagnostics MedImmune Amgen Genentech Chiron ALZA Biogen G Genzyme Genetics Institute Centocor IDEXX Immunex $52 $39 $15 1986 1991 1996 2001 2006 The Cancer Stem Cell Hypothesis Red= CSC; less than 1% of tumor cells 90% will not develop tumors 90% will develop tumors 4 12/2/2009 PC3 (Prostate Cancer) CD 133 + PC3 (Prostate Cancer) 5 12/2/2009 N IgG, Inmunoglobulina G OPTIMIZACIÓN ¿Quién sintetiza el gen? 6 12/2/2009 Recodificación de codones Fragmento de la región constante de la cadena ligera En menos de 350 En menos de 350 pb pb hay 7 vs 3 codones con < 15% de uso VERSIONES IRES 1 • IRES 1 ( IRES 1 (LL‐P) – Versión 1: Bicistrónico fluorescente ((L‐P + + G G) – Versión 2: Tricistrónico ( Versión 2: Tricistrónico (L‐P‐D) 7 12/2/2009 Aumento en la eficiencia de transfección (Co‐transfeccion no requerida) José Manuel Aguilar Yáñez Sergio García Echauri Gonzalo Mendoza Ochoa Roberto Portillo Lara David Bulnes Abundis Ernesto José Aguirre Ezkauriatza Johari Salgado Mario Moisés Álvarez Vacuna InfA H1N1 Grupo M.M. Álvarez Escuela de Biotecnología y Salud 8 12/2/2009 El virus Inf A H1N1 Introducción http://gamapserver.who.int/h1n1/atlas.html ?select=ZZZ&filter=filter4,confirmed El virus Inf A H1N1 Introducción A. HA MP MP NA MP B. 9 12/2/2009 Una nueva vacuna Concepto Inactivación Purificación El virus Inf El virus Inf A H1N1 HA NA NP M1 M2 NS1 NS2 PB1, PB2, PA 10 12/2/2009 Una nueva vacuna Concepto NA HA CATCATCAT CATCATCAT NA HA Purificación VACUNA Una nueva vacuna Concepto HA de la Influenza A H1N1, 1918 11 12/2/2009 • • • • • • Retiene inmunogenicidad Vacuna sin virus Se expresa en cantidades superiores a 1 g/L Bajo costo de producción Corto tiempo de proceso (24 horas cada lote) No es intuitivo el diseño de la molécula y del proceso Producción controlada Proceso Fermentación I, reactores Infors 250 ml 37 KDa cTorHA-H1N1 cTorHA26 KDa 25 KDa M = marcador de peso molecular BIORAD Precision Plus Kaleidoscope (Cat.No. 161-0375) G41 A G41 B G41 C 41 CC- T41 B T41C TRB TRC M 12 12/2/2009 Producción controlada Proceso G41A G41B T41 B G41C T41 C TR B TR C WESTERN BLOT DEL GEL ANTERIOR Anticuerpo antianti-6HIS peroxidado Proceso de bioreacción Reacción biológica (5 L) 1.8 6 X (absorbance units) 1.6 5 y = 1.6291x + 0.102 R² = 0.9862 1.4 R² = 0.9971 1.2 4 5 L Bioreactor 1 3 0.8 T41 C 0.6 Ln T41C 2 Linear (región exponencial) 1 0.4 0.2 0 0 0 2 4 6 8 10 Time (h) 13 12/2/2009 Producción controlada Proceso Fracción Fracción Región soluble insoluble no unida REACTOR 5L 37 KDa Cuerpos de inclusión cTorHA‐ H1N1 25 KDa cTorHA‐ H1N1 Marcador 1 2 3 4 5 6 7 8 Producción controlada Proceso Gel electroforético 2D al 11%, pH 3-11. Fracción insoluble de lisado celular. 14 12/2/2009 Producción controlada Proceso de purificación Método de purificación desarrollado Proteína cTorHA-H1N1 99.5% pura Marcador de peso molecular cuerpos de inclusión Lavados del Lisado celular retenido en resina Eluído de columna de afinidad Producción controlada Proceso de purificación 637 mg/L 63.7 mg/L Considerando reacción y purificación 100% pureza 15 12/2/2009 Producción controlada Proceso de purificación 63.7 mg/L considerando reacción y purificación 4000 dosis/L 400,000 dosis/100 L Por día Planta piloto de producción Planta GMP Centro de Biotecnología 400,000 dosis/100 L/día 16 12/2/2009 Proceso completo Reacción más purificación 1 A Cromatografía de afinidad B Lisis celular Solubilización de Cuerpos de inclusión C D E 3 Cultivo Microfiltración o centrifugación 2 4 N IgG, Inmunoglobulina G 17 12/2/2009 18 12/2/2009 Modelación tridimensional vista anterior 19 12/2/2009 Modelación tridimensional, vista posterior Curva Estándar de IgG anti-TNFα Abs 450 nm 1.2 1 0.8 0.6 y = 0.043x + 0.0029 R² = 0.999 Y 0.4 0.2 Predicted Y 0 Más concentración -0.2 0 5 10 15 20 25 30 [IgG ng/mL] 3 repeticiones Menos concentración Muestras 20 12/2/2009 Técnica de ELISA Indirecta (Enzyme Linked Immuno‐Sorbent Assay) Fundamento: formación de inmunocomplejos Ventajas: Alta sensibilidad Especificidad Reproducibilidad Masiva Bajo costo $$$ 5ta MTX (1 uM): 3ra MTX (250 nM): (250 nM): 0.4 pg/cel*día 6ta MTX (2 uM): 9 pg/cel*día 2 pg/cel*día DHFR: L‐P, P‐L GFP: L‐P, P‐L UCOE: L‐P, P‐L 21 12/2/2009 Cuantificación de IgG anti‐TNFα, de un Biorreactor APLICON 1 L Curva Están ndar Muestras Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Técnica de ELISA Indirecta Curva Estándar de IgG anti-TNFα Abs 450 nm 1.2 1 0.8 0.6 y = 0.043x + 0.0029 R² = 0.999 Y 0.4 0.2 Predicted Y 0 -0.2 0 5 10 15 20 25 [IgG ng/mL] 30 Producción de IgG anti‐TNFα (9 pg/ cel*día )(5x106 cel/ml)(7 días batch)= 0.315 mg/ml En reactor 50L = 15.75 g x batch DHFR: L‐P, P‐L GFP: L‐P, P‐L UCOE: L‐P, P‐L 22 12/2/2009 INGENIERÍA DE BIOREACCIÓN CULTIVO DE CÉLULAS CHO EN REACTORES CHO‐DG44 en Medio FreeStyle CHO 6 00E 06 6.00E+06 100 00 100.00 90.00 5.00E+06 80.00 70.00 Densidad celular 4.00E+06 60.00 3.00E+06 50.00 Vivas Muertas 40.00 2.00E+06 30.00 Viabilidad Anticuerpo Total 20.00 1.00E+06 10.00 0.00E+00 0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Días 23 12/2/2009 INGENIERÍA DE BIOREACCIÓN (“Screening de condiciones”) • 4 Reactores de Screening Independientes • Completamente instrumentados •Flujo de gases controlado: O2, CO2, N2, aire Sistema DASGIP® INGENIERÍA DE BIOREACCIÓN (Screening de condiciones) Sistema Infors 24 Re eactor NB 50 0 L 12/2/2009 Biotecnología en equipo: nuestra planta piloto 25 12/2/2009 INGENIERÍA DE BIOSEPARACIONES Afinidad…es la palabra High affinity‐low cost cromathography particles for purification of recombinant proteins 26 12/2/2009 High affinity‐low cost cromathography particles for purification of recombinant proteins La Topografía de una partícula Fragmentos de anticuerpo en células de planta Células NT (tabaco) cultivadas en un reactor agitado (prueba de viabilidad) 27 12/2/2009 José Manuel Aguilar‐ Yáñez Leydi Maribel Carrillo Cocom Alfonso García Ullóa David Bulnes Abundis Felipe López 28