DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN SELECTIVA DE Salmonella DE HORTALIZAS FRESCAS Y CONGELADAS. SIP: 20070845 DIRECTOR: OSCAR RODOLFO RODAS SUÁREZ RESUMEN Actualmente las infecciones alimentarias provocadas por miembros del género Salmonella, tienen importancia mundial. Los alimentos involucrados en la transmisión de esta bacteria son; productos hortícolas, carnes, productos lácteos, peces, entre otros. Diversos estudios concluyen que Salmonella es sensible al proceso de congelación. El objetivo del trabajo fue aislar a Salmonella a partir de muestras de vegetales frescos y congelados. Se analizaron 1700 muestras de productos hortícolas adquiridos en la central de abastos de la ciudad de México y 128 muestras de verduras congeladas adquiridas en diferentes supermercados del DF, el aislamiento e identificación de Salmonella se hizo de acuerdo al procedimiento establecido por el Manual de Bacteriología Analítica de la Administración de Medicamentos y Alimentos (BAM/FDA,EUA). Salmonella spp se aisló en un 34.37% (44/128) en verduras congeladas y en el 5.7% (98/1700) de las muestras frescas analizadas, encontrándose principalmente en la Mezcla Juliana que consiste en verduras troceadas. Esto puede deberse a factores como: la manipulación, el agua utilizada para el riego y lavado, las condiciones de cultivo y postcosecha, el envase, el rompimiento de la cadena de frío entre otras, lo que puede favorecer la presencia y sobrevivencia de este microorganismo en los alimentos estudiados. Por lo que es necesario tomar en cuenta que la congelación no debe ser considerada un procedimiento para destruir los microorganismos y asegurar su inocuidad, ya que existen algunos microorganismos que soportan la deshidratación cuando el medio se congela. Estos resultados permiten determinar que estos alimentos pueden ser un problema de salud pública en México. INTRODUCCIÓN Actualmente las infecciones alimentarias provocadas por los microorganismos patógenos del género Salmonella, tienen una gran importancia a nivel mundial, por el gran número de personas afectadas así como por la industrialización en la producción de alimentos (vegetales congelados, carne, etc.) que favorecen la diseminación de este patógeno. El género Salmonella está constituido por bacilos cortos Gram-negativos, no esporulados, anaerobios facultativos, oxidasa negativos, catalasa positivos, móviles por flagelos peritricos (a excepción de Salmonella gallinarum y Salmonella pullorum). Se caracterizan por producir H2S en forma abundante y por ser lactosa y sacarosa negativos, pero glucosa positivos, teniendo la capacidad de producir gas a partir de la fermentación de este carbohidrato (Miller et al., 2000). Aunque las salmonelas se identifican, inicialmente, por sus características bioquímicas, los grupos y las especies se determinan mediante el análisis antigénico (Jawetz, 1996; Jay, 1994). Los miembros del grupo Salmonella son microorganismos patógenos, causantes de síntomas clínicos en humanos y en animales. La naturaleza de la enfermedad varía de acuerdo al serotipo. Los principales cuadros de infección que le provocan las salmonelas a los seres humanos son: gastroenteritis, diarrea, bacteriemia e infecciones extraintestinales y fiebre entérica (Bailey & Scott, 2004). Las salmonelas son microorganismos que forman parte de la biota intestinal normal de muchos animales, entre los que están los seres humanos. Como formas intestinales, los microorganismos son excretados en las heces desde las que pueden ser transmitidos a un gran número de lugares. Cuando se liberan al medio ambiente, tienen la capacidad de sobrevivir en los materiales con los que entran en contacto, y bajo condiciones favorables suelen multiplicarse en ellos. Cuando el agua y los alimentos que han sido contaminados, son consumidos por personas y animales, estos microorganismos son diseminados de nuevo por medio de la materia fecal, cerrándose de este modo su ciclo en la naturaleza (Jay, 1994; Natvig et al., 2002; Islam et al., 2004). La cifra de microorganismos en un alimento fresco se puede utilizar para reflejar las condiciones generales de la calidad del alimento fresco, del tratamiento a que ha sido sometido, de su manipulación y de su estado de conservación. OBJETIVO Aislar microorganismos del género Salmonella a partir de muestras de hortalizas frescas y congeladas, y observar si esta bacteria mantiene su viabilidad bajo las condiciones de almacenamiento del producto. METODOLOGIA. CARACTERÍSTICAS DE LA ZONA DE MUESTREO La Central de Abasto de la Ciudad de México (CEDA) se abastece de las principales ciudades del sur y sureste del país, desempeñando el papel de ser un gran centro reexpedidor de mercancías. SELECCIÓN DE LAS MUESTRAS. Las muestras de hortalizas fueron adquiridas, tomando un promedio de tres muestras de cada hortaliza por semana, para un total de 140 aproximadamente por mes, durante ese mes se seleccionaba un pasillo y las muestras eran adquiridas en dos o tres locales de esa línea. Se analizaron 1700 muestras de hortalizas frescas, obtenidas en las naves mayores de la Central de Abastos de la Cd. de México. Se estudiaron 100 muestras de cada una de las siguientes hortalizas: berros, betabel, apio, brócoli, calabacita, cebolla blanca redonda, cilantro, col, coliflor, espinaca, lechuga orejona, lechuga romana, papa, pápalo quelite, perejil, perejil chino y verdolaga. En el caso de las verduras congeladas se adquirieron en los centros comerciales de la periferia de la central de abastos en promedio 10 muestras por semana, considerando la marca y el contenido de verduras mezcladas. Se analizaron 128 muestras de verduras congeladas que presentaban mezcla de vegetales como son: juliana, mediterránea, oriental, primavera, mezcla California, mezcla campesina, mezcla cortadillo, guarnición de verduras, mezcla caribeña, mezcla invierno, zanahoria con chícharos, brócoli y espinacas TRATAMIENTO DE LA MUESTRA. Cada muestra de verdura fresca con un peso aproximado de 4 Kg fue transportada, en bolsa de polietileno etiquetada, evitando el contacto entre ellas y con el ambiente. El tiempo entre la recolección y análisis fue aproximado entre 2 y 4 horas. Se trabajaron 35 muestras semanales. Las verduras congeladas se transportaron en recipientes térmicos para mantener la temperatura (-20ºC), el peso de cada bolsa es de 500 g, el tiempo de recolección y análisis de las muestras fue entre 2 y 4 horas. Se trabajaron 10 muestras por semana. El análisis microbiológico se realizó según la metodología indicada en el Manual de Bacteriología Analitica de la Administración de Alimentos y Medicamentos (BAM-FDA) (Wallace, 1995). Se pesaron 50 g de cada muestra en condiciones asépticas y se colocaron en una bolsa de polietileno conteniendo 450 mL de caldo lauril sulfato triptosa (LST), posteriormente se efectuó un lavado suave por frotación. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. El LST se transfirió a matraces de 1L y se incubó a 37°C por 24 horas. Posteriormente se transfirieron 10 mL a frascos con 90 mL de caldo caldo tetrationato (TT) y 1 mL a caldo Rapapport Vasiliadis (RV), se mezcló cuidadosamente y se incubó a 43°C y 37ºC respectivamente por 18 horas. Transcurrido ese tiempo se sembró por estría cruzada en medios selectivos: agar verde brillante (VB), agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar MacConckey (MC). La incubación se realizó a 37°C por 18-24 hrs. Para la identificación bioquímica se seleccionaron nueve colonias características (3 colonias por cada agar selectivo), se inoculó agar triple azúcar hierro (TSI) y agar hierro lisina (LIA), Se incubaron a 35ºC por 24 ± 2 h. Posteriormente se hizo la identificación bioquímica y serológica. Para la serotipificación las cepas identificadas como Salmonella spp se enviaron al Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológica de la Secretaría de Salud. RESULTADOS Del total de muestras de hortalizas frescas analizadas, en el 5.7% (98/1700) fue posible poner en evidencia al género Salmonella (Figura 1). Mientras que para verduras congeladas fue del 34.37% (44/128).(Figura 2) La frecuencia de aislamiento fue del 7.76% (142/1828) del total de verduras frescas y congeladas.(Figura 1 y2) 5.7%POSITIVAS 94.3% NEGATIVAS Figura 1. Aislamiento de Salmonella spp. en hortalizas. El aislamiento de Salmonella spp por tipo de muestra fue: 3% para apio, berros 8%, betabel 4%, brócoli 9%, cilantro 11%, col 1%, coliflor 9%, espinacas 7%, lechuga orejona 7%, lechuga romana 3%, papa 1%, papaloquelite 9%, perejil 13%, perejil chino 6% y verdolaga 9%; en calabacita y cebolla no se obtuvo aislamiento (Figura 3). En el caso de verduras congeladas la frecuencia de Salmonella fue 20% para guarnición de verdura, el 15.9% para la mezcla juliana, 9% par el combinado de vegetales, 6.8.% para el combinado primavera y mezcla campesina, 4.5 % para la mezcla California y chícharo con zanahoria y el 2.2% para espinaca, ensalada mediterránea, mezcal invierno y chícharo. Cepas de Salmonella spp (65%) Muestras positivas 44 (38%) 35% Otros géneros Muestras negativas 84 (62%) Figura 2. Gráfica de los resultados obtenidos durante el aislamiento de Salmonella spp en vegetales congelados De las 142 cepas identificadas bioquímicamente como probables Salmonella spp.en verduras frescas y congeladas el 72.4 % (102/142), fue serotipificado, mientas que el 27.6% (39/142) correspondió a cepas no tipificables. Las serovariedades tipificables fueron: S. edimburg, S. gallinarum, S. houtenae, S. typhi, S. agona, S. anatum, S. arizonae, S. cholerasuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. pullorum, S. bongor, S. salame, Salmonella C1 flagelar b (Figura 3), podemos observar los aislamientos por tipo de hortaliza. S. C1 flagelar b S. Typhi S. Pollorum S. Bongor S. Salame Serotipo S. Ent erit idis S. Edimburg S. Agona S. Hout enae S. Anat um S. Gallinarum S. Cholerasuis S. Arizona S. Typhimurium 0 5 10 Porcentaje 15 2 0 25 Figura 3. Porcentajes de serotipificación de cepas de Salmonella spp aisladas de hortalizas. En la figura 3 se observa que la serovariedad S. typhimurium fue la que se aisló en mayor porcentaje (23.9%), seguida de S. arizona y S. choleraesuis en 16.9%, S. gallinarum con 11.1%, S. anatum y S. houtenae con 9.7%, S. agona y S. edimburgo 4.22%, S. enteritidis y S. salame2.81%, S. bongor, S. pollorum ,S. typhi y flagelar C1 en un 1.4%. DISCUSIÓN La presencia de Salmonella spp en productos hortícolas informa del riesgo en el consumo de estos alimentos sin ningún tratamiento posterior, en este trabajo se encontró en una proporción del 5.7% (98/1700) para verduras frescas (Figura 1) y el 34.37% (44/128) para verduras congeladas (Figura 2). Estos resultados puede compararse con los obtenidos por otros autores como Rude et al. quienes reportaron un 8% de aislamiento en estos mismos alimentos, en España García et al 1987 informaron de la presencia de este patógeno en el 7.5% de las muestras analizadas y Wells y Butterfierld en 1999.en Nueva Yersey mostraron una frecuencia de aislamiento del 9-10% Así pues, resulta importante manifestar que el hallazgo de éste patógeno es de suma importancia debido al riesgo potencial de generar casos de enfermedades entéricas. Observando dicho resultado podemos percatarnos que las hortalizas se encuentran expuestas a contaminación por microorganismos patógenos antes, durante y después de la cosecha. En la precosecha son de interés la tierra, el agua de riego, la presencia de materia fecal humana o animal, el tipo de abono utilizado, el aire, y las personas que cuidan de las tierras de cultivo. En la poscosecha destacan la maquinaria, el equipo, el método de transporte, los trabajadores y el polvo de la atmósfera (Beuchat, 1996). La presencia de Salmonella spp en hortalizas es favorecida por la utilización de abono orgánico y el riego con agua contaminada (Islam et al, 2004). El uso indiscriminado de estos abonos generan riesgos muy serios para la salud pública, tanto en los agricultores que están en contacto con las aguas residuales como en los consumidores de los productos crudos. (Foster et al., 2001), Durante la cosecha y poscosecha el producto se encuentra en constante contacto con trabajadores los cuales son una fuente de contaminación de suma importancia , ya que las heces tanto de ellos como de animales asintomáticos, pueden contener a Salmonella spp. la cual puede ser excretada durante varias semanas (5 en promedio), y en algunos casos de manera permanente (Vougth y Tatini, 1998). La importancia epidemiológica de los portadores debe subrayarse; ya que se pueden arrojar hasta cien millones de bacilos por gramo de materia fecal (Lee, 1978). Durante la cosecha la maquinaria utilizada puede contaminar a las hortalizas tanto por contaminación cruzada, como por el daño físico que puede causar, por ejemplo, la mayoría de las raíces y los tubérculos comestibles, que crecen bajo tierra, están muy expuestos a sufrir daños físicos (FAO, 1993). Cuando la hortaliza llega a su destino para su comercialización puede estar expuesta a fauna nociva (roedores, insectos, aves, etc,) la cual juega un papel importante como contaminante, en el caso particular de las moscas (Musca domestica) se ha revelado mediante un lavado superficial, la presencia de entre dos y medio y treinta millones de bacterias, incluidas las salmoneras. Se pudo observar que cuando la mosca se alimenta con materiales contaminados con S. enteritidis no solo se infectaron los insectos sino que fueron capaces de transmitir al patógeno a otros moscas y contaminaron los alimentos con los que estuvieron en contacto. Se determinó que las salmonelas pueden sobrevivir hasta 4 semanas en las moscas infectadas y a lo largo de las diferentes etapas de su metamorfosis (Ostrolensk, 1942). Los roedores son también una fuente de contaminación importante, ya que fácilmente se infectan y son colonizados por este microorganismo, siendo así generosos proveedores al medio ambiente, utensilios, equipo y directamente a los alimentos a través de las heces (Galton et al, 1955). Después de la comercialización lo adecuado es llevar a cabo un lavado minucioso. Los objetivos del lavado son remover la tierra y los restos de tejido vegetal muerto, los fluidos celulares ricos en nutrientes generados como consecuencia del corte, los residuos de pesticidas y los numerosos microorganismos causantes de deterioro (Nguyen-the y Carlin, 1994). Sin embargo sabemos que esta práctica no es aplicada en la mayoría de los lugares donde adquirimos dichos productos. Otra observación importante y que es un problema muy común es el agua de lavado que se utiliza para la remoción de detritus orgánicos e inorgánico. Dicha agua se reutiliza constantemente para el lavado de toros vegetales, aumentando en cada lavado la contaminación. En México esta agua no está adecuadamente sanitizada por lo que constituye una fuente de contaminación cruzada para cada pieza de producto que pase a través de ella (IFPA, 2003). El conocimiento de la epidemiología de la salmonelosis a lo largo del tiempo constituye la principal herramienta para el control sanitario de esta enfermedad que es la causa principal de las toxicoinfecciones alimentarias, con variaciones en la frecuencia de las serovariedades de un país a otro, con importancia en las áreas que no han alcanzado las condiciones de saneamiento e higiene adecuados y no cuentan con medidas de salud pública óptimas. El marcador epidemiológico más usado en el género Salmonella es la serotipificación, técnica estable, sencilla y que por su amplia utilización permite el seguimiento de los principales serotipos a lo largo de los años (Echeita et al 1999). La importancia de las serovariedades identificadas radica en que pueden llegar a estar involucradas en cuadros entéricos, tal es el caso de S. enteritidis, S.typhimurium y S. anatum, así como enfermedades tíficas (S. paratyphi B). Los serotipos más frecuentes en México, tanto en muestras clínicas como de alimentos son: S.typhimurium, S. enteritidis, S. derby, S. agona y S. anatum, lo que concuerda con los resultados obtenidos en nuestro trabajo con excepción de S. derby que en nuestro caso no aislamos. Desde el punto de vista epidemiológico es necesario conocer cuáles son las serovariedades prevalentes en nuestro entorno y determinar los de nueva introducción para poder implementar las acciones de prevención requeridas para todos los casos (Gutiérrez et al, 2000). En este estudio se aisló en mayor proporción a la serovariedad S. typhimurium con un 23.9%, Monté y colaboradores en 1982 en un estudio de serotipificación de 1000 cepas de Salmonella encontraron que la serovariedad S. typhimurium era la que se aislaba con mayor frecuencia, Ramírez en el año 2001, realizó un estudio de 473 cepas de Salmonella aisladas en un período de 18 meses, obteniendo resultados similares a los nuestros, identificándose S. typhimurium como la serovariedad más frecuente (66/473). Un dramático incremento de la salmonelosis en humanos producida específicamente por S. enteritidis, ocurrió a finales de la década de 1980 y principios de la década de 1990 (Rodríguez et al., 1990). En 1995 del total de informes recopilados por los sistemas de vigilancia epidemiológica de los países miembros de la OMS se encontró (en 35 paises) que 76.1% de los aislamientos correspondieron a la serovariedad S. enteritidis, seguido por S. typhi (12 países) y S. typhimurium (8 países). En nuestros resultados obtuvimos el 2.81% para S. typhi, lo cual concuerda con lo obtenido por Poppe y col. en 1991 donde obtuvo a este serotipo en 2.7% de muestras ambientales. El incremento de éstas y de otras serovariedades es el resultado de una combinación de factores que se relacionan con el desarrollo en la industrialización en todas las fases de producción de alimentos, cambios en las prácticas de manejo, almacenamiento, distribución y preparación de los mismos. Estas variaciones han tenido como consecuencia nuevos problemas en la higiene de los alimentos al originar una fácil diseminación de Salmonella spp., así como de otros gérmenes patógenos (Acha et al., 2001). En mayor proporción también se aisló S. cholerasuis, S. arizona (16.9%), S. gallinarum (11.1%), S. anatum y S. houtenae (9.7%) además de 9 serotipos que también son importantes clínicamente, ya que tienen el mismo potencial de causar enfermedad que los que se aíslan con mayor frecuencia. Epidemiológicamente es importante conocer cuales son las serovariedades prevalentes y las de nueva introducción para estar alerta en caso de que alguno de ellas presente un potencial de diseminación mayor que los demás (Gutiérrez, 2000). Es importante mencionar que las serovariedades no tíficas de Salmonella spp., pueden causar septicemia, estado de portador o infecciones como meningitis, artritis, osteomeliltis, colangitis, neumonía, arteritis, endocarditis o infecciones del aparato urinario (Uribe et al., 2006). En los adultos la bacteriemia debida a serovariedades no tíficas de Salmonella spp., es más grave, aunque sólo representa un pequeño porcentaje de las personas con infección clínica y subclínica. Una complicación grave es el desarrollo de arteritis infecciosa, sobre todo si esto implica la aorta abdominal. En los niños las infecciones debidas a este microorganismo incluyen meningitis, artritis séptica, osteomielitis, colangitis y neumonía (Root, 1999) En un estudio de serovariedades que realizó Gutiérrez en el 2000 en México, reportó un total de 199 serotipos, de los cuales 8 corresponden a los aislados por nosotros (S. typhimurium, S. enteritidis, S. agona, S. anatum, S. typhi, S. arizona, S. gallinarum, S. cholerasuis), sin embargo 6 serotipos más no se encuentran reportados en el articulo antes mencionado los cuales son: S. edimburg, S. houtenae, S. pullorum, S. bongor, S. salame y C1 flagelar b, esto puede ser indicativo de la introducción de nuevas serovariedades al país. Cabe mencionar que fueron reportadas serovariedades no tipificables (27.6%) (27/98) lo que representa una incógnita epidemiológica, ya que no se sabe que papel juegan estas cepas. Estas serovariedades no tipificables podrían estar en fase rugosa, lo que las convierte en autoaglutinables por cambios en la síntesis de los antígenos somáticos, también puede tratarse de cepas monofásicas, en las que no es posible detectar los flagelos de primera o segunda fase o incluso cepas inmóviles que carecen de ambos tipos de flagelos (Fuzihara et al., 2000) La conservación inadecuada del agua y de los alimentos puede favorecer el crecimiento de microorganismos patógenos, resultando en enfermedades con alta morbilidad y mortalidad, ya que una única fuente contaminada puede afectar a un gran número de personas. Las salmonelas que parasitan a muchas especies son de difícil y a veces imposible control y mantienen infecciones endémicas. Generalmente se transmiten por los alimentos contaminados, por productos o desechos de los animales. IMPACTO En México, la primera causa de enfermedades gastrointestinales en niños y adultos que consumen alimentos contaminados, es Salmonella spp; lo cual permite suponer, que la incidencia de este tipo de microorganismo en alimentos que no requieren cocción como son los vegetales frescos y congelados, no es más que un reflejo de la deficiente calidad higiénica con la que son preparados y del estado microbiológico del alimento en su estado fresco o antes de ser tratado. Las poblaciones de microorganismos en vegetales varían ampliamente y a menudo dependen del tipo de vegetal, condiciones ambientales durante la producción y la cosecha, de la cercanía a la tierra cuando se desarrollan, de la humedad, el viento, el abono, la estación del año, el riego con aguas residuales o contaminadas, las malas prácticas de manufactura del personal, así como de las condiciones de envasado y almacenaje. Los alimentos que sirven como vehículo de Salmonella spp, tienen especial importancia en los brotes de salmonelosis humana y animal, debido a que permiten la sobrevivencia del microorganismo. (Dube, 1983). Así pues, resulta importante denotar que la presencia de éste patógeno es de suma importancia, debido al riesgo potencial de generar casos de enfermedades entéricas. En este estudio, Salmonella spp se aisló en un 38% (34/90) de las muestras congeladas analizadas, lo cual indica que es una bacteria resistente a las temperaturas de congelación a las que son sometidos los vegetales para su almacenamiento, por lo tanto, no se asegura la calidad microbiológica de alimentos que no requieren algún tratamiento térmico a fin de conservar su calidad comercial, debido a que preservan la viabilidad de los microorganismos que puedan estar presentes, incluyendo aquellos que poseen la capacidad de ocasionar un brote de infección alimentaria (BIA) entre la población que ingiere los productos que están contaminados. Por lo cual, es necesario tomar en cuenta que desde el punto de vista estricto de la conservación de alimentos, la congelación no debe ser considerada un procedimiento para destruir los microorganismos que contienen, debido a que existen algunos que soportan la deshidratación cuando el medio se congela (M. Jay, 1994). Estos resultados permiten determinar que este tipo de problema sanitario es un reflejo de la deficiente calidad con la que están llegando al mercado estos productos. Sin embargo, lo más adecuado es que antes de que los vegetales sean consumidos, deben lavarse al chorro de agua potable, lo que va a garantizar la remoción de alrededor del 90% de eliminación de microorgnaimos acompañantes y si es posible llevar a cabo una sanitización, se garantizará la eliminación del 99.9% de estos microorganismos dependiendo del desinfectante. Las consideraciones ideales sería que los productos hortícolas no se regaran con aguas residuales, que el abono orgánico utilizado fuera elaborado a tiempos y temperaturas adecuadas, que se conocieran los puntos críticos en la cadena de producción, transporte, almacenamiento y venta y que se reconocieran a los portadores asintomáticos de Salmonella spp. Todos estos conocimientos deberían ser establecidos en programas de análisis de peligros y puntos críticos, dando la información necesaria a productores, trabajadores y consumidores. En el país debería existir un programa de evaluación de riesgos, investigación y mejores sistemas de tratamiento de vegetales congelados e investigar los brotes relacionados con este tipo de productos (Quiroz, 2007). CONCLUSIÓN Se aislaron microorganismos del género Salmonella a partir de muestras de vegetales frescos y congelados. Las serovariedades identificadas en este trabajo coinciden con las reportadas en otros países. Los productos congelados más manipulados mostraron una contaminación mayor por Salmonella spp Se comprobó que estas bacterias mantienen su viabilidad aún cuando el alimento se encuentra almacenado a bajas temperaturas (-20ºC) durante períodos prolongados. En los productos frescos la incidencia de Salmonella spp fue mayor en los vegetales que presentar una mayor superficie de exposición (berro, pápalo quelite, perejil, verdolaga, cilantro, etc.) BIBLIOGRAFÍA Acha, P., Szyfres B. 2001. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y los animales. Vol I Bacteriosis y micosis. Publicación Científica No. 580. 3ra ed. Washintong: OPS. p 240-253 Bailey & Scott; Forbes, B.A.; Sahm, D.F. y A., Weissfeld. 2004. Diagnóstico Microbiológico. 11a ed. Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Beuchat, L.R. 1996. Pathogenic microorganisms associated with fresh produce. J. Food Prot. 59:204-216. Dube, S.D.1983. Outbreak of Food poisoning Caused by Lactose-Fermenting Salmonella tuebingen. 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