trabajo

Título:
Papel de las células B como células presentadoras de antígeno en Artropatía Psoriásica
y Artritis Reumatoide.
Solicitante:
Daniel Ramos Rodríguez
Alumno 4º Grado en Medicina. Facultad de Medicina de la Universidad de La Laguna.
S/C de Tenerife.
Introducción
La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad crónica de etiología
desconocida que causa inflamación de las membranas sinoviales y una destrucción
progresiva de las articulaciones diartrodiales. Actualmente se le atribuye a las células T
el principal papel en su patogénesis 1,2, aunque en los infiltrados inflamatorios de la
membrana y líquido sinovial también se pueden encontrar otros tipos celulares, como
los linfocitos B y macrófagos. Hasta hace poco tiempo el papel del las células B en la
patogénesis de la AR se consideraba colateral. Sin embargo, los buenos resultados
clínicos que la depleción sistémica de los linfocitos B por rituximab, un anticuerpo
monoclonal anti-CD20, ha mostrado en pacientes con AR 3,4 ha devuelto el interés sobre
la contribución que los linfocitos B a la patogénesis de la sinovitis reumatoide. En la
artritis psoriásica (APs), una enfermedad inflamatoria crónica articular asociada a la
presencia de psoriasis, el rituximab ha mostrado solo un efecto modesto en el control de
los síntomas musculoesqueléticos 5,6, lo que sugiere que el papel que juegan las células
B en la patogénesis de la APs debe ser diferente al de la AR.
Hasta la actualidad se han propuesto tres mecanismos potenciales por los cuales los
linfocitos B actúan en la patogénesis de la AR 7,8:
1. La más obvia es la producción de anticuerpos (células plasmáticas) y la
formación de inmunocomplejos que al unirse al receptor Fc y activar el
complemento, activan la producción de citoquinas proinflamatorias por el
macrófago.
2. El infiltrado de linfocitos B en la membrana sinovial produce localmente
factores proinflamatorios solubles, incluyendo el TNF-α o la IL-6 que conducen
a la sinovitis.
3. Los linfocitos B regulan la función de los linfocitos T, principalmente de los
CD4+ en la membrana sinovial, al actuar como células presentadoras de
antígeno (CPA).
Se desconoce cual de estos es el principal mecanismo patogénico de las células B en
la sinovitis reumatoide o si existen otros mecanismo adicionales. En este sentido, los
linfocitos B son capaces de producir metaloproteasas (enzimas que degradan la matriz
extracelular) 9 cuando son activados por diferentes estímulos, aunque se desconoce
cuanta es su relación con la capacidad de producir destrucción de la articulación en la
AR.
Las células dentríticas y los macrófagos juegan el papel más importante en la
respuesta inmune actuando como CPA profesionales. Los linfocitos T reconocen los
péptidos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase II que se
expresan en la membrana de las CPA. Sin embrago con el fin de convertirse en
linfocitos T efectores, estas células deben recibir una segunda señal de un péptido
específico de membrana que se expresa en la superficie de las CPA, en un proceso
denominado co-estimulación. CD40 y CD86 (también conocida como B7,2) son los dos
receptores de membrana presentes en la CPA responsables de las señales coestimuladoras necesarias para la activación de los linfocitos T. El papel de los linfocitos
B como presentadores de antígenos a linfocitos T naïve se ha investigado en modelos
animales durante las últimas dos décadas 10-12. En dos modelos murínos de artritis
inducida por proteoglicanos y colágeno, se ha propuesto que los linfocitos B pueden
estar involucrados en la patogenia de la artritis mediante la producción de
autoanticuerpos y además actuando como CPA 13,14.
Hipótesis de Trabajo
La hipótesis que este trabajo defiende es que las células B presentes en el tejido
sinovial pueden participar en la patogenia de la AR y de la APs mediante su capacidad
para actuar como célula presentadora de antígeno.
Desarrollo
Objetivos
Los objetivos concretos de este trabajo son:
1. Conocer mediante estudios de inmunohistoquímica la expresión de
moléculas de clase II y de moléculas co-estimuladoras: CD40 y CD86 en
las células B (CD20+) presentes en el infiltrado sinovial de pacientes con
AR.
2. Determinar mediante estudios de citometría de flujo el nivel diferencial
de expresión de moléculas de clase II, HLA-DR, -DP y DQ en células B
(CD20+) de sangre periférica (SP) respecto de las del líquido sinovial
(LS) en pacientes con AR y APs y determinar diferencias en las
relaciones de expresión SP/LS de estas moléculas entre ambas
patologías.
3. Mediante la misma aproximación experimental que en el punto 2,
conocer las diferencias de expresión de CD40 y CD86 en células B de SP
y LS de ambas patología.
4. Determinar mediante RT-PCR cuantitativa la expresión de factores
intracelulares relacionadas con la diferenciación hacia células dendrítica,
como el IFIT4 (Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats
4) 15 en células B de SP y LS de pacientes con AR y APs.
Metodología:
Pacientes
Las muestras biológicas de SP y LS se obtendrán simultáneamente de pacientes
con AR y APs por reumatólogos expertos del Servicio de Reumatología. Los pacientes
cumplirán con los criterios para AR del año 1986 del Colegio Americano de
Reumatología 16 y los criterios CASPAR para APs 17. Todos los pacientes firmarán un
consentimiento informado y el estudio será sometido a la aprobación del comité ético
del Hospital donde serán atendidos.
Estudios de inmunohistoquímica
Muestras de Tejido sinovial de pacientes con AR serán procesadas para realizar
doble marcaje con anticuerpos fluorescentes para determinal la presencia de
CD20/HLA-DR, CD20/CD40 y CD20/CD86. Las muestras de tejido serán analizadas
mediante microscopia confocal para determinar la presencia de moléculas de clase II
(HLA-DR) y co-estimuladoras (CD40 y CD86) en células B (CD20+) presentes en el
infiltrado sinovial.
Aislamiento celular y cultivo
Las células mononucleares (monocitos y linfocitos T y B) serán aisladas de
muestras heparinizadas de SP y LS obtenidos simultáneamente de pacientes con AR y
APs activas mediante centrifugación en gradiente de densidad en Ficoll. Después de un
lavado en buffer salino, la banda de mononucleares será estudiada mediante citometría
de flujo multicolor usando CD20 como marcador de células B. Algunas muestras de LS
y SP serán utilizadas para aislamiento de células B mediante inmunoselección negativa
utilizando bolas magnéticas acopladas a anticuerpos (StemCell Technologies, Grenoble,
France)
Citometría de flujo
Células mononucleares aisladas de SP y LS de RA y APs serán marcadas con
dos anticuerpos conjugados directamente a 4ºC durante 30 min, siendo uno de ellos un
anticuerpo anti-CD20 humano marcado con ficoeritrina (rojo) (para distinguir células B)
y el otro un anticuerpo marcado con fluoresceína (verde) anti-HLA-DR o anti-HLA-DP
o anti-HLA-DQ o anti-CD40 o anti-CD86 humanos. Después de un lavado, las células
serán analizadas en un ACCURI C6 (BD Bioscience) y los datos de niveles de
expresión en superficie adquiridos en escala logarítmica. Como controles de
fluorescencia se utilizarán anticuerpos controles marcados con fluoresceína o
ficoeritrina del mismo isotipo.
Debido a que la fluorescencia puede variar entre experimentos, los datos de
citometría de flujo (media de intensidad de fluorescencia, MFI) serán normalizados y
expresados como MFI relativa (rMFI) según la siguiente ecuación:
rMFI = (MFILS – MFIcontrol de isotipo) / (MFIsp – MFI control de isotipo × 100)
RT-PCR cuantitativa
Para el análisis cuantitativo de la expresión de genes, se analizará el mRNA de
células B aisladas por inmunoselección negativa de muestras de LS y SP de pacientes
con AR y APs mediante RT-PCR cuantitativa. Se utilizarán sondas específicas para
IFIT4 y para beta2 microglobulina como control de carga. Las condiciones de la PCR
serán establecidas según las características de las sondas que se diseñen.
Todos los datos de PCR serán expresados utilizando el método (2-∆∆CT) 18
Estadística
Las diferencias entre grupos serán examinadas para significación estadística
usando el Test de Wilcoxon para muestras pareadas. Valores de p menores de 0.05 serán
considerados significativos. Los datos se expresarán como media aritmética ±
desviación estándar.
Conclusión
Un estudio de las moléculas que intervienen en la presentación de antígenos por
parte de los linfocitos B así como la expresión de factores intracelulares relacionadas
con la diferenciación hacia células dendrítica podría ayudarnos a entender el papel de
los linfocitos B en la patogenia de la APs y además de la AR. De esta forma, en el caso
de que alguna de estas moléculas se viera involucrada en la patogenia de la enfermedad,
podríamos actuar farmacológicamente ya que hoy en día existen terapias biológicas
diana contra alguna de las moléculas de membrana que expresan los linfocitos B y que
se recogen en este estudio, ejemplo de ellas son: rituximab (CD20) y abatacept (CD86).
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