TABLA DE CONTENIDO

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIAUNAD
ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGÍA E
INGENIERIA
ESPECIALIZACION EN PROCESOS DE ALIMENTOS Y
BIOMATERIALES
BIOTECNOLOGIA AVANZADA
NELLY MORALES PEDRAZA
BOGOTA D.C. FEBRERO 2009
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TABLA DE CONTENIDO
UNIDAD 1. LA BIOTECNOLOGÍA Y LA VIDA
Capitulo 1. Lección 1. Biotecnología
Lección 2. Antecedentes de la Biotecnología
Lección 3. La vida y su manipulación
Capitulo 2. Lección 4. Que es la vida
Lección 5. Ácidos nucleicos
Lección 6. Reproducción asexual
Capitulo 3. Lección 7. Replicación
Lección 8. Nomenclatura gráfica de los ácidos
Nucleicos
Lección 9. Estudio de caso
UNIDAD 2. LOS MICROORGANISMOS Y SU TECNOLOGIA
Capitulo 4. Lección 10. Las enzimas y su tecnología
Lección 11. Modificación de las enzimas
Lección 12. Efectos de la temperatura y el PH en
Las reacciones Enzimáticos.
Capitulo 5. Lección 13. Los microorganismos
Lección 14. Los microorganismos y su tecnología
Lección 15. Las Bacterias
Capitulo 6. Lección 16. Modelos cinéticos de crecimiento
Lección 17. Tecnología de fermentación.
Lección 18. Ejercicios Balance de materia
ANEXOS: Estudios de caso
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UNIDAD UNO
LA BIOTECNOLOGÍA Y LA VIDA
Por la prisa de vivir se
olvidan a menudo
las razones de la vida.
Hanotaux
BIOTECNOLOGÍA
Introducción
Esta unidad define la Biotecnología no como una ciencia nueva, sino como un
nombre nuevo que se le ha dado a la reciente evolución e interacción de varios
campos de las ciencias y las ingenierías, resultante del desarrollo científico
acumulativo iniciado por Mendel en 1886, con los principios de la herencia; y
continuado, entre otros, por Watson y Crick, con la estructura de doble hélice
del ADN en 1953; por Sanford en 1984, con la transformación genética de
plantas mediante el bombardeo de proyectiles y por Williams en 1990, con el
desarrollo tecnológico para marcaje y mapeo de genes (Parra et al., 1998).
Incluye además una visión histórica y el panorama nacional, de tal forma que
permite visualizar el impacto que ha tenido el uso de la biotecnología moderna
en diferentes sectores de la producción, así como identificar las políticas y
estrategias que posee Colombia en cuanto a biociencia y biotecnología,
contribuyendo al desarrollo integral del profesional en las dimensiones
cognoscitiva, social y cultural.
Objetivo
Al terminar la unidad el profesional debe estar en capacidad de describir el
desarrollo histórico, la situación actual y las perspectivas de la Biotecnología, así
como de identificar las políticas y estrategias que posee Colombia en cuanto a
biociencia y biotecnología.
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Contenido
• Biotecnología
• Perspectivas de la Biotecnología en Colombia
• Antecedentes
• Programa Nacional de Biotecnología
• Simbiosis
• Comunidad Biotecnológica
• Marco legal
• Bibliografía de apoyo
• Bibliografía
• Trabajo de complementación
Bibliografía recomendada
1. Cohn, David. The life and time of Louis Pasteur. 1996.
www. louiville. edu/library/
2. Colciencias. Tecnologías de la Vida para el Desarrollo. Bases para un Plan
del Programa Nacional de Biotecnología. Colombia. 1993.
3. Colciencias. Simbiosis. www. colciencias.gov.co
4. Harshbarger, David; Hunter, Kim; Meinel, Richard; Reed, Charles and
Schlager, Steve. Biotech: What the Chemical. Chemical Engineering. Edited
by Agnes Shaley. November. 1995.
TUS COMPROMISOS
Para con el grupo
•
•
Reseñe la biografía de Louis Pasteur, James D.
Watson, Francis H. Crick, Sir Alexander Fleming,
Gregor Mendel, Eduard Buchner o Gobind
Khorana.
Presentar por ejemplo, la historia de Levapán S.
A., Instituto Colombiano del Petróleo, Sucromiles,
Centro de Investigación de Agricultura Tropical,
Laboratorio de genética y reproducción de la
Universidad
de
Antioquia,
Instituto
de
investigaciones inmunológicas de la Universidad
de Cartagena, Histolab.
17
Para aprender a aprender
BIOTECNOLOGÍA
•
•
•
•
•
Analice
Comuníquese
Confirme
Experimente
Organícese
El término biotecnología podría entenderse ampliamente como la
comercialización de los procesos biológicos, los cuales engloban descubrimientos
técnicos y científicos que han conducido al umbral de la revolución bioindustrial
(Montoya, 1989). Sin embargo si revisamos su etimología viene de las palabras
griegas que significan: bio: vida, tecno: arte y logía: ciencia; entonces sería
la ciencia que estudia el arte de la vida.
De acuerdo con el informe de Spinks en 1980 la biotecnología se define como la
utilización de organismos vivos, o bien sistemas o procesos biológicos para la
producción industrial o su empleo en los servicios de saneamiento (Wiseman,
1986).
Hacking en 1986 definió la biotecnología como la aplicación de los principios
básicos de las ciencias e ingenierías al procesamiento de materiales y agentes
biológicos para proveer bienes y servicios, e indicó que posee las siguientes
características: Es multidisciplinaria, emplea diferentes técnicas, presenta
diferentes estados de desarrollo y es multisectorial (Montoya, 1989).
Según Salazar en 1997 la biotecnología es el uso integrado de la bioquímica, la
microbiología y la ingeniería química, para encontrar aplicaciones tecnológicas a
las capacidades de los microbios y de las células; globaliza una serie de técnicas
y experiencias con tres objetivos particulares:
1. El aislamiento y propagación de células de tejidos animales o vegetales y de
microorganismos.
2. La obtención de productos metabólicos a partir de las células vivas aisladas
que los producen espontáneamente bajo ciertas condiciones o con técnicas
de ingeniería genética.
3. El logro de reacciones bioquímicas con células vivas o con enzimas
sintetizadas por las células.
18
Todo lo anterior busca obtener sustancias biológicas exclusivas, útiles para la
producción de alimentos, para la industria farmacéutica y para diversos
procesos industriales (Salazar, 1997).
Según la serie de monografías concisas de ILSI Europa, traducidas por ILSI SurAndino Colombia 2000. define el término Biotecnología como acuñado por el
Húngaro Kart Ereky, hacia fines de la primera guerra mundial Kart Ereky utilizó
esta palabra para referirse a métodos agrícolas intensivos. Desde, entonces, la
biotecnología ha sido definida ha sido definida de diversas formas, sin embargo,
casi siempre ha sido asociada con la producción de alimentos y su
procesamiento. En particular, la biotecnología generalmente ha abarcado la
manufactura tradicional del pan, vino, queso y otros alimentos fermentados.
Sobre estas bases, la biotecnología puede reconstruir sus raíces miles de años
atrás hasta los antiguos sumerios que fabricaban cerveza con levaduras
producidas naturalmente.
Las fermentaciones practicadas en la antigüedad no siempre llegaron a buen
resultado, los microbios que caían en la tinaja donde se hacía el vino, podían
producir la más fina cosecha o transformar todo el producto en vinagre. En el
siglo XIX, Lous Pasteur sentó las bases de la microbiología e identificó a los
microorganismos- bacterias, hongos, algas y protozoos, como la causa de los
cambios tanto deseables como indeseables en los alimentos. La aplicación de la
investigación de Pasteur llevó a un procesamiento más seguro y confiable y
ayudó a asegurar la consecuente alta calidad de, por ejemplo, vinos y quesos.
Pasteur aseguraba que los procesos de fermentación estaban vinculados
estrechamente con las actividades de los microbios vivos. Hacia fines del siglo
pasado, se descubrió que extractos libres de células provenientes de levaduras,
también podían originar cambios químicos sin la intervención de los microbios
de los cuales provenían. Los componentes activos de dichos extractos fueron
denominados enzimas (enzima significa ”en levadura”), las enzimas son
proteínas producidas por los seres vivos, que catalizan reacciones químicas
específicas. Sin darse cuenta, los productores de queso siempre han utilizado
una mezcla de enzimas naturales –cuajo- para transformar la leche en cuajada y
suero líquido.
Durante los años cuarenta se han desarrollados equipos para la fermentación a
gran escala, lo que condujo a la producción industrial eficiente, mediante la
utilización de microorganismos, de enzimas puras, aditivos y otros compuestos
valiosos (como las vitaminas) para su uso en los alimentos.
Así como las cervecerías tienen sus propias cepas de levaduras patentadas, las
cuales son mantenidas cuidadosamente, los productores de enzimas, cultivas
19
cepas especialmente seleccionadas de los microorganismos escogidos: Durante
muchos años se han hecho avances para mejorar la eficiencia en la producción,
seguridad, calidad y espectro de productos microbianos disponibles. Sin
embargo, todavía se depende, en gran medida, de hechos fortuitos seguidos
para el aislamiento sistemático de los organismos que posean las características
deseadas.
Durante los años setenta se obtuvo la capacidad para hacer cambios precisos en
el material genético, la biotecnología había sido transformada. El desempeño de
los organismos ahora puede ser “sintonizado finamente” y con ello ahora la
biotecnología casi se ha convertido en un sinónimo de “modificación genética”.
En 1980, un influyente informe británico(el “Informe Spinks”) intentó encapsular
casi medio siglo de pensamiento europeo y estaudinense, definiendo a la
biotecnología como “La aplicación de organismos, sistemas o procesos
biológicos a las industrias manufactureras y de servicios”. Esta amplia definición
sirve a nuestros propósitos, ya que incluye la producción de alimentos a través
de organismos vivos, su consiguiente procesamiento de la calidad y seguridad
de estos, utilizando las herramientas de la biología molecular.
PERSPECTIVAS DE
Castellanos O2
LA BIOTECNOLOGIA EN COLOMBIA. Villate S1 –
Hace dos siglos Malthus afirmaba que el crecimiento de la población mundial
superaría al suministro de alimentos. este pronostico no se ha cumplido porque
la actividad agrícola ha aumentado considerablemente, gracias a factores como
la mecanización, técnicas agrícolas intensificadas y la utilización de abonos entre
otros. Los sistemas agrícolas actuales, aunque son capaces de generar
excedentes regionales en los países desarrollados, dejan a la cuarta parte de la
población mundial subalimentada y es incierto si se abastecerán sus
necesidades para el 2030. Es así como la biotecnología bajo sus diferentes
formas, se puede evitar un empobrecimiento catastrófico de la humanidad y su
medio natural.
En cierto sentido, la biotecnología tiene una historia tan larga como la
fabricación del pan y la cerveza y se remonta a la época indígena con la
elaboración de productos alimenticios y bebidas como la chicha, obtenida por
fermentación del jugo de maíz. La producción industrial usando procesos
tecnificados con microorganismos se empieza a encontrar a finales del siglo
pasado y ha recibido un gran impulso en los años 50 de nuestro siglo cuando la
naturaleza y la función de los ácidos nucleicos fueron explicadas, abriéndose
camino a la descripción del código genético y a la tecnología del ADN
1
2
Bac: Docente Universidad Colegio Mayor del Cundinamarca.
Ph. D. Docente Universidad Nacional de Colombia
20
reconbinante. Entre los 70 y 80, llegó hacerse posible la producción de genes en
masa y transferirlos a otros organismos como en bacterias, levaduras, plantas y
animales.
En este contexto, la biotecnología se define como la aplicación de organismos,
sistemas y procesos biológicos a la producción de bienes y servicios en
beneficio del hombre con el fin de aumentar la productividad, el rendimiento y
resolver problemas de abastecimiento de alimentos a la población en general.
La biotecnología cambia, de forma espectacular, las vías mediante las cuales
los científicos pueden conocer las estructuras y las funciones de los sistemas
biológicos, implicando la revolución del conocimiento con consecuencias
científicas, éticas y sociales que irán mucha más allá que los efectos
económicos. (OCDE, 1993).
La biotecnología alimentaría ofrece vastas posibilidades en la mejora de la
calidad, el valor nutricional, el estado sanitario y la conservación de los
alimentos. pero ninguna introducción biotecnológica tendrá por si misma un
impacto decisivo en la industria, ya que dicha industria es demasiado
diversificada y amplia como se muestra a continuación:
a. Las enzimas en el. sector alimentario tienen numerosas aplicaciones en la
industria de los alimentos y de las bebidas, para la transformación y
producción de aromas y sus productos intermedios, tienen una creciente
importancia para los avances científicos y técnicos. Esos progresos están
ligados a los biorreactores, a la capsulación de enzimas innovadoras, más
eficaces con procesos de biocatálisis.
b. La biotecnología ofrece nuevos sistemas de conservación biológica a
través de microorganismos alimentarios modificados que tienen la
capacidad de proporcionar conservación de alimentos sin utilizar aditivos
químicos.
c. Los nuevos alimentos son transformados gracias a la biotecnología, la
cual ofrece nuevos recursos para crear nuevos nutrientes de calidad para
el hombre con una imagen positiva para la salud a partir de materias
primas baratas, como proteínas fúngicas con textura adecuada para
imitar a la carne.
d. Los cultivos de células vegetales ofrecen la oportunidad de obtener gran
diversidad de productos alimenticios intermedios y de moléculas
nutritivas que pueden ser obtenidas mediante el cultivo celular.
e. Las microalgas, que han sido la base de la alimentación humana
tradicional en muchos países, también pueden ser cultivadas para
21
producir una amplia gama de productos útiles, teniendo algunas un gran
interés como elementos para la alimentación humana o como moléculas
nutritivas especiales.
Actualmente el desarrollo de la biotecnología alimentaría en Colombia es
evidente y se evidencia en los diferentes renglones de la economía nacional.
entre las industrias que producen o consumen en el sector podemos encontrar
las de cerveza, productos lácteos, jugos y concentrados de frutas, panificadoras,
tejido de cultivos
De acuerdo con el Convenio de las Naciones Unidas sobre biotecnología, se
entiende toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y
organismos vivos para la creación o modificación de productos o procesos para
usos específicos, por ejemplo, introducir un gen que produce cáncer en un ratón
para producir ratones con predisposición al cáncer. Los sectores industriales en
los que se está aplicando la biotecnología son: farmacéutico, agrícola y medio
ambiente.
Enriquezca su vocabulario buscando las siguientes definiciones:
Anticuerpo monoclonal:
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Germoplasma:
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Hibridoma:
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Variedad híbrida:
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LECCION DOS
ANTECEDENTES DE LA BIOTECNOLOGIA
La historia de la biotecnología se divide en cuatro períodos:
1. Era anterior a Pasteur: Sus comienzos se confunden con los de la
humanidad y se extiende hasta la segunda mitad del siglo XIX. Incluye las
prácticas empíricas de selección de plantas y animales, así como la
fermentación orientada a preservar y enriquecer el contenido proteínico de
los alimentos (Cohn, 1996).
2. Era de Pasteur: Se desarrolló a partir de la segunda mitad del siglo XIX
cuando Pasteur y otros científicos de la época consolidaron las disciplinas de
microbiología, bioquímica e ingeniería química. Corresponde a la llamada
biotecnología industrial. Se caracteriza por la aplicación de las técnicas
de fermentación a la industria alimentaría y al desarrollo industrial de
productos como levaduras, ácido cítrico, ácido láctico, acetona, butanol y
glicerol. Incluye el descubrimiento de las enzimas y su utilización (Cohn,
1996).
3. Era de los antibióticos: Se inicia en la primera mitad del siglo XX cuando
Fleming descubre la penicilina y fija las bases para la producción en gran
escala (hacia la década de los cuarenta) de antibióticos; continúa con la
aplicación de las variedades híbridas, iniciando el camino hacia la revolución
verde (Scragg, 1996).
4. Era actual: Se ubica en la segunda mitad del siglo XX e incluye el
descubrimiento de la doble estructura del ácido desoxirribonucleico (ADN), la
inmovilización de enzimas, los primeros experimentos de ingeniería genética y
la aplicación en 1975 de la técnica del hibridoma para la producción de
anticuerpos monoclonales (Villé, 19??).
PROGRAMA NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA
Cinco tareas principales conforman los ejes de la estrategia propuesta para la
promoción de la investigación y el desarrollo en el ámbito de la biotecnología en
Colombia:
1. Formación de investigadores calificados al más alto nivel en las diversas
disciplinas que confluyen en la biotecnología.
2. Consolidación de la comunidad biotecnológica nacional.
23
3. Fortalecimiento de los vínculos entre el sector productivo y los investigadores.
4. Desarrollo de un sistema legislativo que reglamente la propiedad intelectual,
la bioseguridad y el uso del germoplasma.
5. Generación de una capacidad de monitoreo de la actividad científica e
industrial en todas las disciplinas, técnicas e industrias relacionadas con la
biotecnología que permita el análisis de tendencias internacionales
predominantes de investigación y desarrollo, y la visualización de las
oportunidades de mercados y clientes potenciales.
Las propuestas del Programa Nacional de Biotecnología están orientadas hacia:
1. Nuevas tecnologías para la salud humana: Trabaja con anticuerpos
monoclonales y técnicas de ingeniería genética (Orozco, 1992).
2. Biotecnología vegetal: Se dedica a las técnicas de desarrollo de nuevas
variedades de las plantas, desde los orígenes de la agricultura, alrededor de
10 mil años atrás los agricultores han estado tratando de mejorar sus
cultivos. Inicialmente, se replantaban las semillas de las mejores plantas,
llevando al mejoramiento gradual de las cepas.. alrededor del siglo XIX, se
comenzaron a comprender los principios científicos que rigen la herencia y la
crianza de plantas comenzó a ser desarrollada sobre bases más sistemáticas.
La mutación y la selección inducidas artificialmente, como la aplicada a las
cepas microbianas, han producido más variedades productivas de los cereales
principales del mundo. Los métodos de mapeo genético similares a aquellos
utilizados para determinar con exactitud los genes humanos, han permitido a los
científicos de manera precisa aquellas plantas que llevan genes específicos
deseables. Dichas técnicas han permitido progresos en la producción, calidad y
resistencia a las enfermedades. Por tanto, es probable que se hereden
características indeseables junto con las deseables. la mutación inducida
artificialmente, algunas ocasiones, produce mejoramientos; sin embargo es más
común que las mutaciones tengan un efecto nocivo.
La crianza tradicionalmente de plantas sigue siendo un proceso tediosamente
lento, rígido, principalmente por el tiempo que le toma crecer a la planta y
colocar semillas. La modificación genética, probablemente nunca remplazará a
los métodos tradicionales, complementa a estos últimos y ofrece la oportunidad
de superar algunas de sus limitaciones.
Alrededor del 80% de la investigación contemporánea en biotecnología de
plantas se dirige hacia el mejoramiento de plantas que sirven como alimento; el
24
20% restante se relaciona con productos no alimenticios, como el algodón,
tabaco, plantas ornamentales y medicinas. Generalmente, el énfasis inicial de la
biotecnología de plantas ha sido dirigida al mejoramiento de cualidades
agronómicas. La segunda y tercera generaciones de plantas alimenticias
modificadas genéticamente traerán ventajas directas al consumidor y al
procesador comercial.
Dentro de la biotecnología vegetal, las principales áreas de aplicación son la
propagación vegetativa, la liberación de patógenos, la conservación del
germoplasma, la obtención de variabilidad genética con características
seleccionadas, la resistencia a pestes, tolerancias a los herbicidas, resistencia a
las enfermedades y la obtención de metabolitos secundarios de interés
industrial. Como tecnologías complementarias se tienen la obtención de
biopesticidas, el desarrollo y utilización de biofertilizantes, el desarrollo de
sistemas diagnósticos para evaluación y certificación fitosanitaria del material
vegetal, tratamientos biológicos para degradación y utilización de residuos de
cosecha, la biodegradación de plaguicidas y otros compuestos orgánicos y la
utilización de las plantas como fuente de proteínas específicas (Hodson de
Jaramillo, 1992).
3. Biotecnología animal: En esta línea se están estudiando, os
probióticos, las bacterias del rumen, las hormonas bovinas del
crecimiento, salud y crianza de los animales
4. Biotecnología industrial: Para desarrollar mercados en el sector
farmacéutico, agrícola, en la industria química, de alimentos, en la minería
(Montoya, 1992).
¡Un momento!. ¿Cuál es su opinión?
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SIMBIOSIS
Es un sistema de información especializado en Biotecnología y Tecnología de
Alimentos para América Latina y el Caribe, organizado bajo el patrocinio del
Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico, del Departamento de
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Asuntos Científicos y Tecnológicos de la Organización de los Estados Americanos
(OEA). El nodo Colombia ha sido preparado y puesto en ejecución por el
Programa Nacional de Biotecnología y la División de Sistemas de Información
Científica y Tecnológica del Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia
y la Tecnología, Francisco José de Caldas, COLCIENCIAS, en noviembre de
1996. Agrupa las tecnologías que forman parte de la biotecnología en seis
grupos:
1. Cultivos de tejidos y células para la rápida micro propagación “in vitro” de
plantas, la obtención de cultivos sanos, el mejoramiento genético por cruza
amplia, la preservación e intercambio de germoplasma, la biosíntesis de
metabolitos secundarios de interés económico y la investigación básica.
2. El uso de enzimas o fermentación microbiana, para la conservación de
materias primas definidas como sustratos en determinados productos, la
recuperación de estos productos, su separación de caldos de fermentación y
su purificación final.
3. Tecnología del hibridoma, que se refiere a la producción, a partir de clones,
de anticuerpos de acción muy específica que reciben el nombre de
anticuerpos monoclonales.
4. Ingeniería de proteínas, que implica la modificación de la estructura de las
proteínas para mejorar su funcionamiento o para la producción de proteínas
totalmente nuevas.
5. Ingeniería genética o tecnología del ADN, que consiste en la introducción de
un ADN híbrido, que contiene los genes de interés para determinados
propósitos, para capacitar a ciertos organismos en la elaboración de
productos específicos, ya sean estos enzimas, hormonas o cualquier otro tipo
de proteína u organismo.
6. Bioinformática, que se refiere a la técnica basada en la utilización de
proteínas en aparatos electrónicos, particularmente censores biológicos y
biochips, es decir, microchips biológicos, capaces de lógica y memoria
(Colciencias, 19??).
Considerando que usted se está capacitando como investigador en el
área de biotecnología, ubique a nivel internacional, tres personas que
trabajen en el campo.
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COMUNIDAD BIOTECNOLÓGICA
Las empresas colombianas dedicadas a trabajar en el área de biotecnología, se
pueden agrupar según su actividad en productivas, centros de investigación y
centros académicos. En el primer caso se encuentran entre otras, Bioingeniería
Ltda., Laboratorios Veterinarios Biológicos Laverlam S.A., Vecol S.A., Levapan S.
A., Sucromiles, Histolab, Bavaria S.A. En el segundo instituciones como:
1.
2.
3.
4.
Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria - CORPOICA
Centro de Investigación de Abastecimiento y Remoción de Agua - CINARA
Instituto Colombiano del Petróleo - ICP
Centro de Investigación de Agricultura Tropical - CIAT
Y en el tercero están:
1. Universidad de Antioquia:
Laboratorio de genética y reproducción;
laboratorio centro de investigaciones ambientales.
2. Pontificia Universidad Javeriana: Programa de saneamiento y biotecnología
ambiental.
3. Universidad de la Salle: Facultad de ingeniería ambiental y sanitaria.
4. Universidad de los Andes: Centro de investigaciones microbiológicas - CIMIC.
5. Universidad del Valle: Laboratorio de biotecnología ambiental
6. Universidad Industrial de Santander: Laboratorio de investigaciones en
microbiología industrial: LIMI
7. Universidad Nacional de Colombia: Instituto de ensayos e investigación - IEI,
unidad de ingeniería ambiental; Instituto de biotecnología - IBUN.
MARCO LEGAL
La biotecnología en Colombia tiene como marco regulatorio para su desarrollo la
adhesión a acuerdos internacionales y regionales:
27
Fech
Acuerdos a los que está adherido
a
Colombia
1994 Acuerdo general sobre aranceles y comercio
(GATT). - Ley 70 de 1994
1996 Convenio de París.
1996 Convenio internacional para la protección de
las obtenciones vegetales (UPOV).
El grupo de los tres (G3) cuenta con algunas
normas relacionadas.
Marco regulatorio
Obtenciones Vegetales
Propiedad intelectual
Protección de
obtenciones vegetales
Propiedad industrial
Además, de las decisiones emanadas en la Junta del Acuerdo de Cartagena, las
cuales comenzaron a regir, a partir del 29 de octubre de 1993:
Decisión
Régimen Común sobre
344
Propiedad Industrial
345
Protección a los derechos de los obtentores de variedades vegetales
391
Acceso a los Recursos Genéticos
En materia de introducción, transporte, uso, manejo, producción, liberación y
comercialización de organismos vivos modificados (OVMs), se cuenta, para fines
agrícolas, con la resolución 00342 del antiguo Instituto Colombiano
Agropecuario - ICA (Colciencias, 19??).
28
BIBLIOGRAFÍA DE APOYO
1. Colciencias. Bases para un plan del programa nacional de biotecnología.
Tecnología de la vida para el desarrollo. 1993.
2. Colciencias. Diez casos exitosos de innovación Tecnológica. 1994.
3. Colciencias. Biotecnología: Legislación y Gestión para América Latina y el
Caribe. Programa multinacional de Biotecnología y Tecnología de Alimentos.
Programa Nacional de Biotecnología. 1995.
4. Colciencias.
Directorio de biotecnología.
Programa Nacional de
Biotecnología. 1995a.
5. Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB).
www.fsm.net/biologicalcontrol
6. Etall Ramos, Daniet. Fronteras de la Ciencia y la Tecnología. España. No.
14. Enero - Marzo. 1997.
7. Sasson A. Biotechnologies: challenges and promises. 2. Editado por la
UNESCO. 1985.
BIBLIOGRAFÍA
1. Universidad Nacional . Revista Colombiana de Biotecnología. Volumen I.
Número 2. 1998.
2. ILSI Sur –Andino. Serie de Monografias Concisas de ILSI Europa.
“Biotecnología de los Alimentos” 2000.
3. Cohn, David. The life and time of Louis Pasteur. 1996.
www.louiville.edu/library/
4. Colciencias. Simbiosis. www.colciencias.gov.co.
5. Hodson de Jaramillo, Elizabeth. Tecnologías de la Vida para el Desarrollo.
Biotecnología Vegetal: alcances, limitaciones y perspectivas en Colombia.
Colciencias. Colombia. 1992.
6. Montoya, Dolly. Las Fermentaciones como Soporte de los Procesos
Biotecnológicos. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, D.E. 1989.
7. Montoya, Dolly y Buitrago, Gustavo. Tecnologías de la Vida para el Desarrollo.
Biotecnología Industrial en Colombia. Colciencias. Colombia. 1992.
8. Orozco, Oscar. Tecnologías de la Vida para el Desarrollo. Nuevas
Biotecnologías y Salud Humana en Colombia. Colciencias. Colombia. 1992.
9. Palmer, Dennis. Proyecto Zero Universidad de Harward. Estrategias de
Evaluación Cualitativa para la Educación Superior Abierta y a Distancia.
UNAD. 2000.
10.Parra y otros. Incorporación de la Biotecnología en la Educación Básica y
Media. Revista Colombiana de Biotecnología. Julio. 1998.
11.Salazar Cáceres, Julio Roberto. Curso General de Biotecnología. Corporación
Tecnológica de Bogotá. 1997.
29
12.Scragg, Biotecnología para Ingenieros. Sistemas Biológicos en Procesos
Tecnológicos. Editorial Limusa. México. 1996.
13.Villé. Biología de Villé. 19??
14.Wiseman, Alan. Principios de Biotecnología. Editorial Acribia. Zaragoza.
1986.
TRABAJO DE COMPLEMENTACIÓN
1. Colciencias y el Programa Multinacional de Biotecnología y
Tecnología de Alimentos (PMBTA, OEA) financiaron la investigación
titulada “Extracción y caracterización de las pectinas de frutas
tropicales”. Elabore un cuadro sinóptico que permita visualizar sus
resultados. www.colciencias.gov.co/simbiosis.
2. ¿Qué opciones tiene la bioindustria en América Latina?
3. ¿Qué perspectivas le ve usted a la biotecnología de alimentos en
Colombia e indique qué papel desempeña de biotecnología en su
campo de especialización?
4. Investigue 3 métodos utilizados en la biotecnología
5. En que consiste la tecnología del antisentido y como puede mejorar
la calidad de los alimentos de dos ejemplos
6. Defina los términos prebiótico y probiótico y explique como pueden
actuar tanto en animales como en el hombre.
7. Reporte o construya una base de datos que incluya revistas de
biotecnología.
8. Visite diez páginas web que hablen sobre biotecnología y sean de su
interés; inicie la construcción de un portafolios3. www.google
Características distintivas de un portafolios: Los estudiantes coleccionan una diversidad de
trabajos que han llevado a cabo. Realmente reúnen lo que se ha dado en llamar “biografías de
los trabajos” o “rangos de trabajos” y sus reflexiones. La biografía de un trabajo revela la
geología de los diferentes momentos que subyacen en la producción de cualquier proyecto
principal; puede incluir notas, diagramas, borradores y la versión final de un documento. Las
reflexiones se resumen en documentos que se producen cuando se retorna a las colecciones de
trabajo, para tomar el papel de crítico o de un autobiógrafo y resaltar lo que es característico, lo
que ha cambiado con el tiempo y lo que aún está por hacerse. La organización del portafolio
incluye: establecer el propósito del mismo, seleccionar y organizar el material pertinente,
establecer puntos críticos para la reflexión y análisis de los resultados del trabajo, así como
plantear estrategias para mejorar los resultados (Palmer, 2000).
3
30
LECCION TRES
No hay que temer en la
vida, hay que comprender.
Marie Curie
LA VIDA Y SU MANIPULACIÓN
Esta temática estudia los principios que rigen la vida y su manipulación, así
como los beneficios que ésta puede generar, planteando desafíos y problemas
científicos, éticos, sociales e industriales, cuyo análisis conducirá a ampliar las
oportunidades de progreso que este campo ofrece al país.
Contenido
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
¿Existe vida en Marte?
¿Qué es la vida?
Las moléculas de la vida
La célula
Reproducción de las células y organismos
Los cromosomas
El ADN
Dogma central de la biología molecular
Manipulaciones in vitro
31
Fundamente sus conocimientos
Describa brevemente las teorías sobre el origen de la vida
Teoría
Cosmozoica
Descripción
De generación
espontánea
De Oparín
De evolución
Cuál es la suya?
Para posteriormente facilitar la comprensión del tema a tratar, escriba
la estructura de:
1. un hidrocarburo alifático y la de uno aromático
2. la estructura de la glucosa
3. La estructura de un ácido graso
4. la estructura y la naturaleza de los 20 aminoácidos esenciales y
explique ¿Por qué se dice que los aminoácidos presentan isómeros
ópticos?
5. Para apoyar sus conceptos, represente gráficamente las estructuras
primaria, secundarias, terciaria y cuaternaria de una proteína.
6. Escriba las estructuras de los ácidos nucleicos y haga un cuadro
donde explique las especificidades de cada uno
7. Explique en que consiste y los pasos a seguir en la manipulación in
Vitro
8. Busque un artículo que describa el proceso de clonación vegetal y
con él construya un documento gráfico que permita identificar cada
parte del proceso; defina términos.
32
9. La pectina es un componente esencial de muchas frutas, degradada
naturalmente por las enzimas poligalacturonasa y es posible utilizar
la tecnología antisentido para “neutralizar” la producción de
poligalacturonasa, retardando la maduración de las frutas una vez
han sido cosechadas.
Explique entonces, el principio de la
tecnología antisentido?
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
1. Martínez de la Cuesta, Pedro J. y Rus Martínez, Eloisa. La Replicación de
los Ácidos Desoxirribunocleicos y su Importancia en la Síntesis de Proteínas.
Alimentación: Equipos y Tecnología. Abril. 1999.
2. Old, R. y Primrose, S. B. Principios de Manipulación Genética. Editorial
Acribia.
3. Horton, Robert; Moran, Laurence; Ochs, Raymond; Rawn, David y
Scrimgeour, Gray. Bioquímica. Prentice-Hall Hispanoamericana, S. A.
México. 1995.
4. Watson, James; Toose, John; Kurtz, David.
ADN Recombinante.
Introducción a la Ingeniería Genética. Labor. 1988.
5. Wiseman, Alan. Principios de Biotecnología Industrial. Editorial Acribia.
Zaragoza. 1986.
BIBLIOGRAFÍA DE APOYO
1. Chandra, P y Appel, W. Métodos de Biología Molecular. Editorial Acribia.
2. Krautwurst, Hans; Encinas, María Victoria; Marcus, Frank; Latshaw, Steven;
Kemp, Robert; Frey, Perry and Cardemil, Emilio. Saccharomyces cerevisiae
Phosphoenolpyruvate Carboxykinase: Revised Amino Acid Sequence, SiteDirected Mutagenesis, and Microenvironment Characteristics of Cysteines
365 and 458. Biochemistry. 1995. 34. 6382 - 6388.
3. Martínez de la Cuesta, Pedro J. y Rus Martínez, Eloísa. La Replicación de
los ácidos desoxirribonucleicos y su importancia en la síntesis de proteínas.
Alimentación: Equipos y Tecnología. Abril 1999.
4. Pellón y otros. La Ingeniería Genética y sus Aplicaciones. Editorial Acribia.
5. Scragg. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas Biológicos en Procesos
Tecnológicos. Editorial Limusa, S.A. de C.V. Grupo Noriega Editores.
México. 1996.
6. Werner, R. Fundamentos de Bioquímica Moderna. Editorial Acribia.
BIBLIOGRAFÍA
1. Bernal Villegas, Jaime. Genética Inmunológica. Principios básicos y
aplicaciones clínicas. Editorial Norma. 1982.
2. García Pelayo, Ramón y Gross. Nuevo Larousse Manual Ilustrado. Editorial
Larousse.
33
3. Hodson, Elizabeth. Presentación. Tecnologías de la Vida para el Desarrollo.
Bases para un Plan del Programa Nacional de Biotecnología. Colciencias.
1993.
4. Horton, Robert; Moran, Laurence; Ochs, Raymond; Rawn, David y
Scrimgeour, Gray. Bioquímica. Prentice-Hall Hispanoamericana, S.A.
México. 1995.
5. Kimball. Biología. Cuarta Edición. Fondo Educativo Interamericano.
México. 1982.
6. Madden, Dean. Biotecnología de los Alimentos. Introducción. ILSI Europa.
Bélgica. 2000.
7. Montoya, Dolly.
Las fermentaciones como soporte de los procesos
biotecnológicos. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, D.E. 1989.
8. Watson, James; Tooze, John y Kurtz, David.
ADN Recombinante.
Introducción a la ingeniería genética. Primera edición. Editorial Labor, S.A.
1988.
9. Wiseman, Alan.
Principios de Biotecnología.
Editorial Acribia, S.A.
Zaragoza. 1986.
34
LA VIDA Y SU MANIPULACIÓN
Introducción
En la unidad anterior se estableció que la biotecnología moderna, gracias a su
potencial e impacto en aspectos económicos, sociales, culturales y políticos,
abrió un sinnúmero de oportunidades para los países en desarrollo; entre otros,
en los campos de la salud, agricultura, industrias farmacéutica y de alimentos,
manejo ambiental y energía, razón por la cual no se puede ser indiferente con
sus avances (Hodson, 1993). No obstante, cuando el húngaro Karl Ereky
acuñó el término biotecnología a finales de la Primera Guerra Mundial,
refiriéndose a métodos agrícolas intensivos, no esperaba que ésta ciencia
obtuviera la capacidad para hacer cambios precisos en el material genético, ni
que garantizara el desempeño de los organismos tan finamente (Madden,
2000). Por tanto, la presente unidad estudia los principios que rigen la vida y su
manipulación, así como los beneficios que ésta puede generar, planteando
desafíos y problemas científicos, éticos, sociales e industriales, cuyo análisis
conducirá a ampliar las oportunidades de progreso que este campo ofrece al
país.
Objetivo
Al terminar la unidad el profesional debe estar en capacidad de comprender y
explicar el dogma de la biología molecular y de utilizar los conceptos de
manipulación genética para el mejoramiento de alimentos y biomateriales.
Contenido
¿Existe vida en Marte?
¿Qué es la vida?
Las moléculas de la vida
La célula
Reproducción de las células y organismos
Los cromosomas
El ADN
Dogma central de la biología molecular
Manipulaciones in Vitro
Bibliografía de apoyo
Bibliografía
Trabajo de complementación
35
Bibliografía recomendada
6. Martínez de la Cuesta, Pedro J. y Rus Martínez, Eloisa. La Replicación de
los Ácidos Desoxirribunocleicos y su Importancia en la Síntesis de Proteínas.
Alimentación: Equipos y Tecnología. Abril. 1999.
7. Old, R. y Primrose, S. B. Principios de Manipulación Genética. Editorial
Acribia.
8. Horton, Robert; Moran, Laurence; Ochs, Raymond; Rawn, David y
Scrimgeour, Gray. Bioquímica. Prentice-Hall Hispanoamericana, S. A.
México. 1995.
9. Watson, James; Toose, John; Kurtz, David.
ADN Recombinante.
Introducción a la Ingeniería Genética. Labor. 1988.
10.Wiseman, Alan. Principios de Biotecnología Industrial. Editorial Acribia.
Zaragoza. 1986.
TUS COMPROMISOS
Para abordar el capitulo
Revisar un libro de bioquímica
Haber estudiado los items correspondientes a
los siguientes temas:
• ¿Existe vida en Marte?
• ¿Qué es la vida?
• Las moléculas de la vida
• La célula
• Reproducción de las células y
organismos
Para con el grupo
Preparar un documento de una página sobre:
• PCR
• Eelectroforesis
• Blotting.
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¿EXISTE VIDA EN MARTE?
El 20 de julio de 1976, a las 11:53 tiempo de Greenwich, y el 3 de septiembre
del mismo año, a las 10:39 TG, los módulos idénticos de dos naves espaciales
no tripuladas, Vikingo 1 y Vikingo 2, se posaron suavemente sobre la superficie
del planeta Marte. Cada módulo contenía cierto número de experimentos
diseñados para obtener más conocimientos sobre el planeta. Cinco de tales
experimentos buscaban pruebas significativas para dar respuesta a la pregunta:
¿Existe vida en Marte? Ellos fueron:
1. Colocar una cámara de televisión: Si de pronto la lente de la cámara
captaba un marciano mirando hacia ella, la pregunta hubiese encontrado una
respuesta definitiva. Sin embargo esto no ocurrió, ni tampoco la cámara
reveló signos de actividades de seres vivos. Se observó una multitud de
piedras, pero nada que pudiera parecerse a un perro.
2. Probar la presencia de moléculas orgánicas en una muestra de suelo
marciano: Una de las características más sobresalientes en cuanto a la
composición química de los seres vivos de nuestro planeta, es la presencia
de moléculas que contienen átomos de carbono. Así por ejemplo, las rocas
están formadas incluso por átomos de carbono, pero a menos que procesos
biológicos sean los responsables de su presencia en las rocas, éstas no
contienen moléculas orgánicas.
3. Hallar indicios sobre la existencia de algo en el suelo capaz de sintetizar
moléculas orgánicas complejas a partir de compuestos simples del
carbono, tales como bióxido de carbono y monóxido de carbono: En
este experimento se introdujo una mezcla de CO2 y CO radiactivos (en la
proporción de 95:5) en un recipiente que contenía una pequeña muestra de
atmósfera y de suelo marcianos. La síntesis de moléculas orgánicas a partir
de precursores simples requiere energía, y la forma principal de la energía
utilizada aquí en la Tierra es la luz solar (se utiliza en la fotosíntesis). Por lo
tanto, la mezcla de incubación se iluminó con una lámpara de arco brillante.
Después de cinco días, la muestra de suelo se calentó para extraer las
moléculas orgánicas radiactivas que hubieran podido sintetizarse a partir del
CO2 (y/o CO) radiactivos por seres vivientes presentes en el suelo marciano.
El experimento buscaba evidencia de actividad metabólica que comprendería
la síntesis de sustancias complejas a partir de sustancias simples, es decir,
mostraría indicios de anabolismo.
4. Buscar indicios de catabolismo, es decir, de metabolismo de
descomposición: En este experimento, una muestra de suelo se incubó
conjuntamente con un caldo diluido de moléculas orgánicas radiactivas.
Después de diez días, la atmósfera que rodeaba la muestra fue investigada a
intervalos regulares para determinar la presencia de gases radiactivos tales
como el bióxido de carbono. La existencia de gases radiactivos sería la
prueba de descomposición de las moléculas orgánicas radiactivas con las
cuales estaban empapadas las muestras de suelo.
37
5. Comprobar metabolismo en el suelo marciano: En este experimento se
colocó una mezcla de gases previamente conocida, sobre una muestra de
suelo y se analizó luego periódicamente para ver si algunos gases (por
ejemplo, CO2) habían desaparecido de la mezcla o habían sido añadidos a
ésta. Si el suelo por sí sólo hubiese fallado en producir un cambio en la
composición gaseosa (no ocurrió esto, al principio se produjeron grandes
cantidades de oxígeno), entonces se hubiera agregado un caldo de
nutrientes al suelo. Si hubiesen existido organismos para catabolizar las
moléculas orgánicas presentes en el caldo, algunos de los productos del
catabolismo tendrían que ser gases y su presencia sería detectable por los
equipos (Kimball, 1982).
¿Sabe usted qué resultados arrojaron los experimentos? ___.
Descríbalos. Internet es un buen punto de partida. www. Altavista.com
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CAPITULO 2
ORIGEN DE LA VIDA
No hay que temer en la
vida, hay que comprender.
Marie Curie
¿QUÉ ES LA VIDA?
Generalmente es más fácil reconocer la vida que definirla. El diccionario
Larousse la define como “Conjunto de los fenómenos que concurren al
desarrollo y la conservación de los seres orgánicos”, Kimball la presenta
teniendo en cuenta las características biológicas: Organización compleja de la
vida, metabolismo, reproducción, irritabilidad y evolución.
La organización compleja de la vida
Las células, generalmente demasiado pequeñas para poder ser observadas a
simple vista, están organizadas en tejidos, los cuales a su vez, forman órganos.
Varios órganos, funcionan conjuntamente y constituyen un sistema (Kimball,
1982).
Células
Tejidos
Órganos
Sistemas
Metabolismo
Se presenta como un intercambio rápido o lento de materiales en los seres
vivos y se manifiesta en dos fases diferentes:
39
• Anabolismo: Síntesis de sustancias complejas.
• Catabolismo: Degradación de sustancias (Horton et al., 1995).
Biomoléculas
Alimentos
Anabolismo
Trabajo
celular
Catabolismo
Energía
Energía
Luminosa
(Organismos
Fotosintéticos)
Alimentos
Desechos
Bloques de
construcción
Reproducción
Es la duplicación auto controlada de las estructuras características. Requiere
que el organismo tome materiales del medio ambiente, los procese y no los
regrese en su totalidad, es decir, que crezca y que cada cierto tiempo produzca
réplicas capaces de vivir con independencia.
Puede ser asexual, en
organismos poco complejos, partiendo de un progenitor y dando origen a hijos
idénticos; o sexual, en organismos complejos, partiendo de dos progenitores y
dando origen a hijos que presentan rasgos característicos (González, 2000).
Irritabilidad
Todos los seres vivos están capacitados para responder, de acuerdo con
patrones definidos, a ciertos cambios (estímulos) de su ambiente, pues
cuentan con medios para percibirlos (detectores) y con efectores para ejecutar
la respuesta. Ésta debe ser coordinada y el sistema de coordinación consume
energía (González, 2000).
40
Organismo vivo
Estímulo
Detectores
Coordinadores
Efectores
Alteración
Comportamiento
Perro
Llamada a comer
Oídos, ojos y nariz
Sistema nervioso y hormonas
Los músculos y las glándulas
El perro se mueve
El perro siempre va a comer
Entonces, el ser vivo presenta una manifestación activa y crea un cambio en
sus relaciones con respecto a su ambiente exterior inmediato.
Evolución
Cuando los organismos se auto reproducen, su patrón estructural se duplica
con exactitud maravillosa. Sin embargo a través de largos períodos de tiempo
ocurren cambios que dan origen a la evolución de los organismos. A menudo
ésta ha sido adaptativa; es decir, los cambios han capacitado a los organismos
para vivir en su medio más eficientemente de lo que sus antecesores pudieron
haberlo hecho en el mismo medio (Kimball, 1982). Asimismo, ha habido una
proliferación de especies y organismos, el número de especies que ahora
habitan en la Tierra son muchas más que el número de especies existentes
hace 500 millones de años.
Fundamente sus conocimientos
Describa brevemente las teorías sobre el origen de la vida
Teoría
Cosmozoica
Descripción
De generación
espontánea
De Oparín
De evolución
Cuál es la suya?
41
LAS MOLÉCULAS DE LA VIDA
Hidrocarburos
Son compuestos constituidos exclusivamente por carbono e hidrógeno, donde
los átomos de carbono pueden unirse unos con otros mediante enlaces
covalentes dobles o sencillos. Pueden existir en cadena abierta (Alifáticos) o
en cadena cerrada (Aromáticos).
Para posteriormente facilitar la comprensión del tema a tratar, escriba la
estructura de un hidrocarburo alifático y la de uno aromático, así como los
nombres correspondientes según la IUPAC
Hidrocarburo alifático
Hidrocarburo aromático
Lípidos
Son componentes importantes de las membranas biológicas. Los más sencillos
son los ácidos grasos. Estos son hidrocarburos de cadena larga con un grupo
carboxilo en uno de los extremos. Los ácidos grasos se encuentran con más
frecuencia como una parte de moléculas más grandes que se denominan
glicerofosfolípidos, los cuales consisten en glicerol 3-fosfato y dos grupos
acilo grasos. Los glicerofosfolípidos son componentes importantes de las
membranas biológicas (Horton et al., 1995).
Los lípidos de las membranas tienen por lo regular una cabeza polar, hidrofílica
capaz de interactuar con un ambiente acuoso y una cola no polar, hidrofóbica.
Las colas hidrofóbicas de tales lípidos se asocian, generan láminas de bicapas
lipídicas, las cuales forman las membranas. Estas membranas sirven para
separar una célula y se llaman membranas plasmáticas (Horton et al., 1995).
Para entender la organización de una membrana plasmática, escriba la
estructura de un ácido graso y su nombre correspondiente,
42
la estructura de un triacilglicérido y su nombre,
la estructura de un glicerofosfolípido y su nombre.
Ahora, elabore un diagrama que describa la estructura general de una
membrana plasmática
Carbohidratos
Son un grupo de Biomoléculas abundante y diverso que comparten la propiedad
común de estar compuestos de carbono, oxígeno e hidrógeno.
Los
carbohidratos incluyen azúcares sencillos, sus polímeros y otros derivados de
azúcar, los cuales a menudo contienen varios grupos oxidrilo. Uno de los
componentes principales de las paredes celulares de las plantas, la celulosa, es
la macromolécula biológica más abundante. Otros polímeros de carbohidratos
desempeñan también un papel en la estructura de las células y los tejidos, y
algunos, como el glicógeno y el almidón, sirven como moléculas de
almacenamiento (Horton et al., 1995).
Para facilitar su discernimiento sobre las moléculas de la vida escriba la
estructura de la glucosa utilizando las proyecciones de Fischer y de
Haworth
43
Proyección de Fischer
Proyección de Haworth
Así como la estructura de un polisacárido e indique cómo se estabilizan
los polímeros mediante puentes de hidrógeno
Proteínas
Aproximadamente el 50% del peso seco de la materia viva está compuesta de
proteínas y éstas son polímeros de aminoácidos.
Entonces, para fundamentar sus conceptos, describa la estructura y la
naturaleza de los 20 aminoácidos esenciales y explique ¿Por qué se dice
que los aminoácidos presentan isómeros ópticos?
Abreviaturas para representar los aminoácidos:
Tamaño - Polaridad
Pequeños no polares
Grandes no polares
Con polaridad
intermedia
Grandes polares
Aminoácido
Cisteina
Prolina
Alanina
Treonina
Valina
Isoleucina
Leucina
Metionina
Fenilalanina
Triptófano
Histidina
Tirosina
Arginina
Lisina
Glutamina
Abreviatura 1
Cis (Cys)a
Pro
Ala
Tre (Thr)
Val
Ile
Leu
Met
Fen (Phe)
Trp
His
Tir (Tyr)
Arg
Lis (Lys)
Gln
Abreviatura 2
C
P
A
T
V
I
L
M
F
W
H
Y
R
K
Q
44
Glutamato
Glu
E
N
Asn
Asparagina
D
Asp
Aspartato
G
Gli (Gly)
Glicina
S
Ser
Serina
a
Entre paréntesis, abreviaciones corrientes en inglés, cuando difieren de las
españolas.
Pequeños polares
Estructura de los polipéptidos: La gran mayoría de las proteínas se
componen de los mismos veinte aminoácidos, pero la proporción de cada
aminoácido varía de una proteína a otra. Los aminoácidos se unen mediante
enlaces peptídicos para formar polipéptidos. El resultado es una cadena de
aminoácidos, o más precisamente, de residuos de aminoácidos. En uno de los
extremos de la cadena se encuentra expuesto un grupo amino. Este recibe el
nombre de terminal amino o N-terminal del polipéptido. El otro extremo lleva
expuesto el grupo carboxilo y se denomina terminal carboxilo o C-terminal. Hay
proteínas de muchos tamaños: los polipéptidos que las conforman contienen
desde 30 o 40 hasta 3000 aminoácidos. La mayor parte de las proteínas se
componen de una sola cadena polipeptídica, pero otras muchas se forman por
agregación de cadenas de secuencia diferente sintetizadas por separado,
indicando que existen diferentes niveles de estructura en estas moléculas
poliméricas.
Para cimentar sus conocimientos, describa en un péptido la estructura del
enlace peptídico
Estructura primaria: Determinada por la secuencia de los aminoácidos en la
proteína y la localización de los puentes bisúlfidos.
Estructura secundaria: Determinada por distribuciones ordenadas de
aminoácidos en la cadena polipeptídica y pueden ser:
1. La configuración hélice alfa: Como el enlace peptídico es bastante rígido,
con todos los átomos situados en un mismo plano. La única oportunidad
para obtener flexibilidad en el polipéptido se presenta en los enlaces situados
en el carbono “alfa”. Esta flexibilidad se utiliza en la formación de un pliegue
helicoidal en la cadena polipeptídica, con las siguientes características:
Todos los grupos R de los aminoácidos se orientan hacia afuera; la hélice da
una vuelta cada 3.6 residuos; la hélice es diestra, al desenvolverse se vuelve
a torcer en el sentido de las manecillas del reloj; el grupo -C=O de cada
enlace peptídico se orienta paralelamente al eje de la hélice y apunta
45
directamente al grupo -NH del enlace peptídico, situado a cuatro aminoácidos
de distancia en la hélice. Tanto el oxígeno como el nitrógeno son átomos
bastante electronegativos, de modo que un enlace de hidrógeno se forma
entre estos grupos: -C=O ... H-N-.
2. La placa de plegamiento beta: Cuando las cadenas se disponen
paralelamente, se mantienen unidas mediante los enlaces de hidrógeno que
se forman entre los grupos -C=O y -N-H de una cadena con los grupos -N-H
y -C=O de la cadena adyacente (Kimball, 1982).
Estructura terciaria: Se presenta cuando las proteínas requieren estar
disueltas en el agua para poder cumplir sus funciones. Estas proteínas tienden
a ser globulares con cadenas polipéptidas intensamente plegadas, formando
una molécula compacta (Kimball, 1982). Consta de dos fibras beta conectadas
por un segmento de hélice alfa donde las tres piezas encajan entre sí
cómodamente cuando se disponen en determinados ángulos. Una faceta
estructural de esta clase, que típicamente comprende entre 30 y 150
aminoácidos, se llama dominio y puede considerarse una unidad, pues su
conformación está determinada casi exclusivamente por su propia secuencia de
aminoácidos.
La disposición geométrica de los dominios constituye la
estructura terciaria (Doolittle, 1985).
Estructura cuaternaria: Está determinada por la presencia de sub unidades
distintas que le imprimen un nivel superior de organización (Kimball, 1982); su
estructura resulta de la elaboración de la molécula con posterioridad a la
síntesis; consta de varias cadenas polipeptídicas, unidas entre sí por una
variedad de enlaces débiles y, a veces, estabilizadas por enlaces disulfuro. En
ocasiones contienen componentes no peptídicos como iones metálicos,
esenciales para la actividad de ciertas enzimas, una estructura denominada
anillo de porfirina, o cadenas de moléculas de azúcar, localizadas en la
superficie de la proteína (Doolittle, 1985).
Para apoyar sus conceptos, represente gráficamente las estructuras
primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias de una proteína
46
Y
de
igual
forma,
defina:
¿Qué
es
un
Dalton?
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Para visualizar tamaños, formas y propiedades de las proteínas, complete
el siguiente cuadro:
Proteína
1
Peso Molecular1
Estructura
Expresado en Daltons (Da)
Ahora, para ampliar sus horizontes, describa: ¿Cómo se puede utilizar en
biotecnología la microscopía electrónica y la cristalografía de rayos X? e
indique
¿Cuáles
son
los
instrumentos
a
emplear?
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47
Bases nitrogenadas
Son moléculas planas, en forma de anillo, que contienen carbono y nitrógeno.
Buscando la comprensión de los ácidos nucleicos, escriba la estructura
de las bases nitrogenadas
Purinas
Adenina (A)
Guanina (G)
Pirimidinas
Citosina (C)
Uracilo (U)
Timina (T)
Nucleósidos
Cada nucleósido contiene un azúcar (ribosa o desoxirribosa) y una base
purínica o pirimidínica.
Para posteriormente representar los ácidos nucleicos, escriba la
estructura de un nucleósido
Nucleótidos
Cada nucleótido contiene un grupo fosfato y un nucleósido.
Para basar un ácido nucleico, escriba la estructura de un nucleótido
Nomenclatura de bases, Nucleósidos y nucleótidos
48
Base
Adenina
Guanina
Citosina
Uracilo
Base
Ribonucleósido
Ribonucleótidos
Adenosina
Guanosina
Histidina
Uridina
AMP, ADP, ATP
GMP, GDP, GTP
CMP, CDP, CTP
UMP, UDP, UTP
Desoxirribonucleósido
Desoxirribonucleótidos
Adenina
Desoxiadenosina
Guanina
Desoxiguanosina
Citosina
Desoxicitidina
Timina
Desoxitimidina o timidina
Fuente: Horton et al., 1995
dAMP, dADP, dATP
dGMP, dGDP, dGTP
dCMP, dCDP, dCTP
dTMP, dTDP, dTTP
49
LECCION CINCO
ACIDOS NUCLEICOS
En los seres vivos se hallan dos clases de ácidos nucleicos: El ácido
desoxirribonucleico o ADN y el ácido ribonucleico o ARN. Cada una de estas
sustancias es un polímero lineal no ramificado de muchos nucleótidos unidos
entre sí.
Diferencias entre el ADN y el ARN
Diferencia
ADN
ARN
En el núcleo
En el núcleo y en el
Se encuentra
citoplasma
Desoxirribosa
Ribosa
Azúcar
Bases nitrogenadas
Adenina y guanina
Adenina y guanina
1.Purinas
Citosina y timina
Citosina y Uracilo
2.Pirimidinas
Los nucleótidos de los ácidos nucleicos están unidos regularmente por enlaces
fosfodiéster 5’-3’; es decir, en el ADN, el grupo fosfato une el carbono 5’ de una
desoxirribosa al carbono 3’ del nucleótido siguiente. Por otro lado, las cuatro
bases pueden estar unidas a este esqueleto en cualquier orden y esta
variabilidad hace distintas y específicas las moléculas de ADN y ARN.
Escriba las estructuras de los ácidos nucleicos
ADN
ARN
50
LA CÉLULA
Las células son las unidades más pequeñas de la vida, con diámetros muy por
debajo del milímetro. Fueron vistas por primera vez, al poco tiempo de la
construcción de los microscopios. A mediados del siglo XIX estaba claro que
todos los seres vivos se componen de células (Watson et al., 1988).
Todo organismos es, o bien una sola célula o está compuesto de muchas
células. Las células se presentan en una considerable variedad de formas y
tamaños. A pesar de tal diversidad, se pueden clasificar como:
1. Procarióticas: (Del griego, pro, antes; Kayron, núcleo) por lo regular son
organismos de una sola célula y carecen de núcleo unido a una membrana
(Horton et al., 1995).
2. Eucarióticas: (Del griego, eu, característico) son por lo general más
grandes y tienen casi siempre un núcleo unido a una membrana. Por lo
regular, contienen, a su vez, membranas internas que dividen la célula en
organelos con funciones específicas, necesarias para la vida de la célula
(Horton et al., 1995).
PARTES DE LA
CÉLULA
Membrana celular
Función
Actúa a manera de interfase entre el interior de la
célula y el fluido acuoso que la rodea.
Citoplasma
Describe todo cuanto se halla en el interior de la
célula, excepto el núcleo. La mayor parte de sus
funciones están dadas por las funciones de los
organelos.
Núcleo
Es el centro de regulación de la célula. Contiene el
material genético.
EL NÚCLEO
Membrana nuclear
Nucleolo
Observaciones
Dentro de esta se encuentra un medio semifluído,
en el cual se suspenden los cromosomas. Se
utiliza el término cromatina para referirse a los
cromosomas cuando se hallan en esta condición.
En él se sintetizan varios tipos de moléculas de
ARN.
Parte de este ARN se utiliza en la
configuración de los ribosomas.
51
EL CITOPLASMA
Observaciones
Citosol o hialoplasma
Es el fluido en el cual se hallan suspendidos los
organelos del citoplasma. Aquí está presente un
buen número de enzimas cruciales para el
metabolismo celular.
Organelos
Son estructuras claramente definidas.
ORGANELO
Mitocondrias
Cloroplastos
Ribosomas
Retículo
endoplasmático
Aparato de Golgi
Lisosomas
Peroxisomas
Vacuolas
Función
Convierten la energía potencial de alimentos en una forma
de energía utilizable por las células, para llevar a cabo sus
diversas actividades.
Es el sitio donde ocurre la fotosíntesis. La clorofila atrapa
la energía del sol y hace posible que ésta se utilice en la
síntesis del alimento.
En los ribosomas tiene lugar la síntesis de proteínas y
están adheridos a la membrana del retículo
endoplasmático.
Son complejas membranas internas propias de las células
eucarióticas.
Los ribosomas adheridos al retículo
endoplasmático áspero aparentemente depositan las
cadenas polipeptídicas recientemente sintetizadas. El
retículo endoplasmático liso probablemente toma parte en
la síntesis de otros tipos de moléculas tales como grasas,
fosfolípidos y esteroides.
Las proteínas del retículo endoplasmático áspero son
transferidas al aparato de Golgi, donde pueden agregarse
carbohidratos a las proteínas. Es el sitio donde tiene
lugar la síntesis de polisacáridos.
Encierran enzimas hidrolíticas. Contribuyen a la
desintegración de las células en deterioro o muertas.
Pueden contribuir al proceso de conversión de las grasas
en carbohidratos y en la ruptura de las purinas en el
interior de las células.
En su interior pueden hallarse sustancias alimenticias o
desperdicios.
52
Para entender el cómo alterar la naturaleza esquematice la estructura
esencial de las células bacterianas, animales y vegetales.
Lo esencial de la célula es su capacidad de crecer y dividirse para producir
células hijas, que puedan propagarse. Por consiguiente, las células son
fábricas diminutas que crecen incorporando moléculas sencillas, como glucosa
y anhídrido carbónico, a las que transforman en las miles de moléculas
carbonadas necesarias para su funcionamiento. Al crecer y dividirse necesitan
también una fuente de energía externa que asegure que las reacciones
químicas celulares ocurran en la dirección de biosíntesis deseada. Las células
se gobiernan, por las mismas leyes de la termodinámica que rigen la energía de
los átomos en física y la energía de las moléculas en química. La mayoría de
ellas obtienen la energía necesaria de la descomposición de moléculas de
alimento, pero las células fotosintéticas usan directamente la energía solar.
Por su tamaño, las moléculas de una célula se pueden clasificar en dos grupos
muy diferentes. Uno es el de las moléculas pequeñas o metabolitos, como
los azúcares, aminoácidos y ácidos grasos. En casi todas las células se
encuentran por lo menos 750 metabolitos diferentes. El otro es el de las
macromoléculas, entre las que destacan las proteínas y los ácidos nucleicos.
En la mayoría de las células, el número de macromoléculas diferentes supera al
de metabolitos diferentes. La suposición actual es que existen más de dos mil
macromoléculas diferentes por célula (Watson et al., 1988).
Las células, por tanto, son químicamente muy complejas, aunque no fuera más
que por el número y tamaño de sus moléculas. Sin embargo, su especificidad
química no reside tanto en la complejidad de sus moléculas como en la
naturaleza de las reacciones químicas que convierten unas moléculas en otras.
Las más importantes de estas reacciones son:
1. Las que descomponen los alimentos para dar moléculas que se puedan
volver a usar como componentes vitales
2. Las que adquieren parte de la energía liberada por la digestión o por la
absorción de luz y la transfieren después de asegurar que las reacciones
celulares ocurran en la dirección deseada
3. Las que sintetizan los monómeros de las macromoléculas
4. Las que unen esos monómeros para formar macromoléculas definidas
(Watson et al., 1988).
Cada una de las miles de moléculas distintas existentes en una célula podría
reaccionar de muchas maneras con otras moléculas. Pero en cada célula sólo
se da a velocidad detectable una proporción pequeñísima de esas reacciones
potenciales, porque la mayoría de las reacciones químicas tienen poca
probabilidad de ocurrir sin ayuda a temperaturas fisiológicas. Las reacciones
que se dan a velocidades compatibles con la vida son enormemente aceleradas
por las enzimas, catalizadores exclusivos de las células. Las enzimas actúan
53
ligando a su superficie los reactivos (sustratos) con los que han de reaccionar
(Watson et al., 1988).
Todos los organismos han evolucionado a partir de un ancestro antiguo
La idea de que la información es pasada de generación en generación implica
que la progenie hereda copias exactas de los genes de sus padres. Esto puede
ser cierto en un corto plazo, pero no a una escala de millones de años. La
información genética puede ser alterada por mutación, y las mutaciones nuevas
pueden convertirse en fijas en una población por medio de la selección natural y
la deriva genética (Horton et al., 1995).
Gradualmente, poblaciones de organismos similares divergen unas de otras y
evolucionan nuevas especies. La evolución biológica se puede rastrear a
través del registro de fósiles o por comparación directa de las secuencias de
genes y de proteínas. Estas observaciones sugieren que todas las especies,
millones de ellas, que ahora existen descienden de un solo ancestro que vivió
hace varios miles de millones de años.
Esta célula ancestral antigua fue sin duda capaz de realizar la glucólisis (la
degradación de la glucosa) y muchos otros procesos bioquímicos
fundamentales que son comunes a todas las células. Podría haber sintetizado
aminoácidos y lípidos y casi con certeza utilizó el ATP como la unidad
fundamental de energía. Utilizó el mismo código genético que encontramos en
sus descendientes modernos. ¿Cómo la célula ancestral evolucionó desde los
organismos más simples? es un problema que todavía no se ha podido resolver
(Horton et al., 1995).
Clasificación de organismos vivos
El sistema popular de clasificación en cinco reinos que se describe en la
mayoría de los textos coloca a los procariotes en un sólo reino que se denomina
Monera. Los eucariotes quedan distribuidos en cuatro reinos: Fungi, Plantae,
Animalia y Protista.
Hace poco, los datos moleculares aclararon las
interrelaciones de muchos grupos de bacterias que eran difíciles de clasificar,
sobre la base única de la morfología.
Un esquema de clasificación que promovió Carl Woese y sus colaboradores
divide a los organismos a un nivel por arriba de los reinos en tres dominios
filogenéticos que son los más evolutivamente divergentes. Dentro de los tres
dominios, los organismos se dividen en reinos, que no corresponden por
completo a los habituales del sistema de cinco reinos (Horton et al., 1995).
54
Dominios
Eubacterias
Archaea
Eucarya
Procariotes
Eucariotes
Reinos
Protista
Monera
Fungi
Animalia
Plantae
Fílum
Los organismos descienden de un ancestro que vivió hace cientos de millones
de años.
Clase
Defina:___________________________________________________
Orden
Defina:___________________________________________________
Familia
Defina:___________________________________________________
Género
Organismos cuya divergencia ha sido relativamente reciente
Eubacteria: Bacterias comunes, incluyendo aquellas especies que dieron
origen a las mitocondrias y a los cloroplastos dentro de las células eucarióticas.
Archaea: Procariotes que viven en lo que parecen ser ambientes primitivos
Eucarya: Eucariotes
Protista: La mayor parte de ellos son organismos unicelulares.
55
Para una mejor comprensión del esquema anterior, consulte las normas
internacionales de clasificación y complete el siguiente cuadro, indicando
en la columna correspondiente las características de cada grupo:
Categoría
Taxón
Ejemplo 1
Característica
s
Reino
Fungí
Fílum
Subfílum
Grupo
Ficomícetes
Superclase
Clase
Zigomícetes
Subclase
Orden
Mucorales
Familia
Mucoráceas
Subfamilia
Tribu
Género
Especie
Mucor
Mucor
mucedo
Taxón
Ejemplo 2
Característica
s
Micomícetes
“Hongos con
puente”.
Forman
zigoesporas y
poseen un
micelio sin
tabiques
Ascomícetes
Protascales
Endomícetales
El micelio es
unicelular .....
Una única
célula puede
transformarse
en un asca
Endomycetaceas
Saccharomycoid
ea
Saccharomycete
ae
Saccharomyces
Saccharomyces
cerevisiae
Resuma los aspectos más importantes a tener en cuenta para la
clasificación sistemática internacional
__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
56
Características más importantes de los cinco reinos:
Protista
Tipo celular
Envoltura nuclear
Mitocondrias
Cloroplastos
Multicelularidad
Sistema nervioso
Nutrición
Motilidad
Medios de
recombinación
celular
Pertenecen
Monera
Procariótico
Ausente
Ausente
Ausente
(Membranas
fotosintéticas en
algunos tipos)
Unicelulares
Ausente
Ondulación y
contracción de la
membrana y del
citoplasma
Bipartición
Bacterias y algas
azuladas
Fungi
Eucariótico
Presente
Presente
Ausente
Eucariótico
Presente
Presente
Ausente o
presente (algas
verdes)
Unicelulares y
pluricelulares
Ausente
Unicelulares y
pluricelulares
Ausente
Fijos
Cilios y flagelos
9+2, ameboides,
fibrillas
contráctiles
Bipartición,
mitosis
Esporulación y
gemación
Levaduras,
mohos,
ficomicetos,
ascomicetos,
basidiomicetos
Ciliados,
flagelados,
sarcodarios,
algas diatomeas,
filamentosas,
rojas, marrón y
verdes
Animalia
Eucariótico
Presente
Presente
Ausente
Plantae
Eucariótico
Presente
Presente
Presente
Pluricelulares
Pluricelulares
Presente
Quimiosintética
Miembros
adaptados a su
ambiente natural
Ausente
Fotosintética
Fijas
Geotropismo
fototropismo
Fecundación
meiosis
Invertebrados,
vertebrados
y
y Fecundación y
meiosis
Briofitas,
pteridofitas,
gimnospermas,
angiospermas
36
REPRODUCCIÓN DE LAS CÉLULAS Y ORGANISMOS
Enriquezca su vocabulario definiendo los siguientes términos:
Centrómero:
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
Cigote:
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
Cofia (de la raíz):
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
Injerto:
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
Isogameto:
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
Meristemo:
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
Sinapsis:
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
REPRODUCCIÓN DE LAS CÉLULAS Y ORGANISMOS
Tipo de organismos
Tipo de Reproducción
Método
Fundamento
96
Unicelulares
1. Fisión
2. Gemación
Pluricelulares
Asexual
1. Gemación
2. Esporulación
3. Fragmentación
Mitosis
Sexual
Meiosis
LECCION SEIS
REPRODUCCIÓN ASEXUAL
En organismos unicelulares
• Fisión: La célula se alarga y divide por la mitad, incluso el núcleo,
formándose dos partes iguales que acaban por separarse para vivir
independientemente una de otra.
• Gemación: En la célula madre se forma una especie de tubérculo que
crece, se desarrolla y acaba por constituir un ser independiente. Las dos
partes producidas no son de igual tamaño.
En organismos pluricelulares
• Gemación: El organismo produce yemas.
• Esporulación: La reproducción se efectúa
Éstas son cuerpos pequeños que contienen
porción de citoplasma.
• Fragmentación: En estas especies el cuerpo
en varias partes; cada una de ellas puede
estructuras del organismo adulto.
por formación de esporas.
un núcleo y una pequeña
del organismo se fragmenta
luego regenerar todas las
Todos los tipos de reproducción asexual discutidos se llevan a cabo por
mitosis. Además, la mitosis es el mecanismo responsable del crecimiento.
Mitosis
Célula
2N (2 pares de cromosomas)
Profase
4N
Metafase
4N
Anafase
4N
Telofase
y división
celular
2N
97
2N
Para prepararse adecuadamente, explique que ocurre en cada una de las
etapas de la mitosis
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
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Mitosis en las plantas: En el extremo de la raíz se halla un meristemo que
produce las células a partir de las cuales aparecerán las primeras estructuras
de la planta. En él, las células experimentan mitosis, aumentando la longitud
de la raíz y posteriormente se inicia un proceso de diferenciación que
comprende el desarrollo de estructuras especializadas tales como células
epidérmicas y pelos radicales.
Un patrón similar de crecimiento vertical ocurre en los ápices de los tallos,
donde por mitosis del meristemo apical del tallo o yema terminal se produce un
conjunto de células nuevas que periódicamente dan origen a hojas. Nuevos
meristemos en forma de yemas laterales se desarrollan exactamente encima
del punto en donde se inserta la hoja (Kimbal, 1982).
Con miras a aplicar el concepto anterior en una propagación in vitro,
¿Cómo se diferencian y separan las células de la raíz?
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_______________________________________________________________
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REPRODUCCIÓN SEXUAL
Los nuevos individuos se originan por unión de dos juegos de información
hereditaria (ADN). Por lo general, cada uno de estos juegos está contenido
dentro de una célula especializada denominada gameto y cada gameto se
produce en un individuo separado. Para combinar su información hereditaria,
los dos gametos tienen que unirse en primer lugar, proceso que se conoce con
el nombre de fertilización. En la mayoría de los organismos se producen dos
tipos diferentes de gametos: los espermatozoos y los óvulos, que por su
apariencia disímil, se dice que son heterogametos. El producto de la
98
fertilización es el cigote, pero cuando se fusionan los heterogametos no se
habla de cigote sino de óvulo fecundado. En muchos organismos, tanto los
gametos masculinos como los femeninos se producen en un solo individuo,
caso en el cual se conocen como hermafroditas, pero aún en estos casos,
dos individuos suelen contribuir a la formación del cigote, dando origen a la
fertilización cruzada (Kimball, 1982).
Gametos
(Células especializadas que
Contienen la información hereditaria)
Espermatozoos
(Masculinos)
Óvulos
(Femeninos)
Fertilización
Cigote
(Óvulo fecundado)
La reproducción sexual posibilita entonces la unión de dos gametos y
proporciona el mecanismo por medio del cual los rasgos de dos progenitores
distintos pueden combinarse, originando descendencia con características
diferentes a aquellas de sus progenitores, lo cual a la vez implica variabilidad
dentro de la especie. En los animales, la meiosis conduce directamente a la
producción de gametos; en las plantas se utiliza en la producción de esporas
que después dan lugar a los gametos; en los hongos y en las algas suele
ocurrir inmediatamente después de la formación del cigote.
99
Meiosis
Célula
2N
Profase I
4N
Metafase I
4N
Anafase I
4N
Telofase I
y división
celular
2N
2N
Metafase II
2N
2N
Telofase II
y división
celular
N
N
N
N
Gametos
Haploide: Que posee un juego sencillo de cromosomas (n), tal como ocurre
en los gametos. También se emplea el término monoploide.
Diploide: Que posee el doble de cromosomas respecto del número de
cromosomas presentes en los gametos 2n, con excepción de los cromosomas
sexuales.
Para acrecentar su saber, explique que ocurre en cada una de las etapas
de la meiosis _________________________________________________
_______________________________________________________________
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100
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
LOS CROMOSOMAS
Más o menos para cuando Mendel hacía sus observaciones, se supo que la
herencia se transmitía por los óvulos y espermatozoides; y que éstos últimos,
en comparación con su núcleo, contienen relativamente poco citoplasma,
llevando a los investigadores a comprender que la función del núcleo era la de
contener los determinantes genéticos de la célula. Poco después, utilizando
tintes especiales, se visualizaron pares de cromosomas (2N) con tamaño y
aspecto diferente; además se descubrió que las células de los individuos de
una especie contienen un número constante y que éstos son capaces de
duplicarse antes de la división celular (mitosis) para volver exactamente a su
forma original una vez se presente.
Asimismo, estudios posteriores
determinaron que las células sexuales, óvulos y espermatozoides, tienen
exactamente el número haploide N; que el reparto de los cromosomas en la
mitosis es exacto, recibiendo cada célula hija una copia de los de la célula
original y, que durante la formación de las células sexuales (meiosis) el
número de cromosomas baja a N para durante la fertilización del óvulo por el
espermatozoide restaurar el 2N, característico de las células somáticas
(Watson et al., 1988).
Gameto
Núcleo
Cromosomas
Genes
Número de cromosomas presentes en diferentes organismos
101
Organismo
Cangrejo
Cebolla
Hombre
Mosca
Drosophila
melanogaster
Pares de
cromosomas
> 100
8
23
No. de
cromosomas
> 200
16
46
4
8
En los cromosomas se encontraron casi invariablemente dos componentes, el
ácido desoxirribonucleico (ADN) y un grupo de proteínas pequeñas,
llamadas histonas, cuyo carácter básico neutraliza la acidez del ADN. Ahora
se sabe que cada cromosoma contiene una molécula de ADN y que además
de los cromosomas principales (con unos cuatro millones de pares de bases)
es frecuente encontrar en las bacterias muchas moléculas circulares de ADN
con sólo unos millares de pares de bases. Estos minicromosomas, llamados
plásmidos, portan genes que confieren resistencia a antibióticos como las
tetraciclinas o la kanamicina y en cada célula hay mucho mayor número de
copias de los genes de los plásmidos que de los del cromosoma principal
(Watson et al., 1988).
EL ADN
El ADN consta de dos cadenas polinucleótidicas enrolladas (doble hélice), con
direcciones opuestas, unidas mediante puentes de hidrógeno entre los pares
de bases, donde los pares A-T se separan más fácilmente que los pares G-C,
debido a que tres puentes de hidrógeno unen la guanina a la citosina, mientras
que entre la adenina y la timina únicamente se forman dos.
Los
apareamientos no sólo se dan entre bases de cadenas opuestas, sino que
pueden formarse también dentro de una cadena si por suerte hay secuencias
repetidas invertidas (palíndromos) que permiten la formación de horquillas.
Es posible que la disociación local de regiones palindrómicas conduzca a la
formación de lazos cruciformes semiestables que pudieran ser reconocidos por
proteínas específicas.
En los procariotes generalmente se pliega en forma circular; en los eucariotes
el empaquetamiento es más complejo y compacto, necesita de la presencia de
proteínas como histonas o protaminas y da origen a la cromatina con sus
diferentes niveles de organización: nucleosoma, collar de perlas, fibra
cromatínica, bucles radiales y cromosoma. Cuando se somete a procesos de
calentamiento, se rompen los puentes de hidrógeno que unen las cadenas, se
separan las dos hebras y se desnaturaliza el ADN. Sin embargo, el ácido
102
nucleico desnaturalizado retorna a su forma original al bajar la temperatura y si
el procedimiento se realiza con ADNs de diferente naturaleza, se obtienen
dobles hélices híbridas. Entonces, las cadenas de ADN se pueden disociar y
reasociar, almacenan la información genética y sirven con mucha frecuencia
como una plantilla para las reacciones que necesitan acceso a esa
información.
Virus: No son procariotes. No poseen maquinaria enzimática con la cual
sintetizar ATP o efectuar otras funciones metabólicas. Son incapaces de
reproducirse entre sí. En realidad, podría argumentarse que fallan en cubrir
tantos de los criterios de la vida que no pueden inclusive considerarse como
organismos vivientes. Tienen dos fases en su existencia, una dentro de las
células vivas, y otra fuera de ellas. Fuera de las células de huésped, constan
de un núcleo interior de ácido nucleico (ADN o ARN) y de una cubierta de
proteína, denominada cápsida, la cual protege al núcleo de ácido nucleico,
define a que tipo de célula puede adherirse un virión (partícula viral)
determinado y ayuda de una u otra manera a la inserción de la partícula viral
en la célula huésped. Algunos virus poseen otros compuestos, por ejemplo:
lípidos, en sus cápsidas, y estas sustancias se pueden derivar de
constituyentes celulares del huésped (Kimbal, 1982).
Para proyectar lo aprendido, ¿Cómo se extrae el ADN en el laboratorio?
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
Enriquezca su vocabulario
Genotipo: Constitución genética de un organismo.
Fenotipo: (gr. phainein, mostrar, y tipos, tipos) Apariencia de un organismo,
resultante de la interacción del genotipo y del ambiente.
Genoma: Juego completo (haploide) de genes. En los procariotes existen
aproximadamente 2000 genes por genoma. La mayor parte de estos son
genes constitutivos, que codifican proteínas o moléculas de ARN que son
indispensables para las actividades normales de todas las células vivas.
Gen: Secuencia de ADN que se transcribe.
Gen estructural: Serie de nucleótidos que contienen los códigos para un solo
producto génico, es decir, que se transmite en una molécula ARN.
Gen operador: El gen que activa o inactiva los genes estructurales
adyacentes.
103
Gen regulador: Gen que produce un represor.
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
El flujo de la información biológica va del ADN al ARN y del ARN a las
proteínas. La información genética se mantiene de generación en generación
por la replicación del ADN y la complementariedad del ADN es el fundamento
de su replicación.
Replicación
ADN
Transcripción
ARN
Traducción
Proteína
Enriquezca su vocabulario
Replisoma: Máquina proteica que lleva
Contiene las polimerasas de replicación.
una de las dos horquillas de replicación.
Primosoma: Es parte del replisoma
síntesis de un cebador corto de ARN
cada segundo.
a cabo la reacción de polimerización.
Un replisoma está localizado en cada
y contiene la primasa. Cataliza la
de aproximadamente 10 nucleótidos
DNA polimerasas: Familia de enzimas que participan en la síntesis y
reparación del ADN.
DNA ligasa: Enzima que cataliza la formación de fosfodiésteres entre los
nucleótidos.
104
Cadena conductora:
La nueva cadena sintetizada, formada por la
polimerización 5’→3’ en la dirección del movimiento de la horquilla de
replicación.
Cadena retardada: La nueva cadena sintetizada, formada por la
polimerización 5’→3’ en la dirección opuesta al movimiento de la horquilla de
replicación.
Fragmentos de Okazaki: Pedazos cortos de ADN que son unidos por la
acción combinada de DNA polimerasa I y DNA ligasa. Cada fragmento tiene
aproximadamente 1000 nucleótidos.
Marco de lectura: Punto de partida de una secuencia única de palabras de
tres letras.
105
CAPITULO TRES
REPLICACIÓN:
El ADN puede ser lineal o circular y su replicación suele empezar en un punto
determinado llamado origen dentro de ella y alejarse bidireccionalmente hasta
completar la duplicación en un sitio de terminación. Cada cadena sirve como
una matriz para la síntesis de una cadena hija complementaria. La ADN
polimerasa cataliza la reacción de polimerización en una horquilla de
replicación. Después de una ronda de replicación, cada cadena de las
moléculas hijas contiene una cadena de la molécula madre y una cadena
recién sintetizada.
ADN
Replisoma
Sitio de origen
Topoisomerasas
Desenroscado del ADN
Helicasas
Ruptura de los enlaces de hidrógeno
Tetrámeros
SSB
Fijación de las horquillas de replicación
Holoenziama de la
DNA polimerasa III
Cebadores de ARN
Síntesis simultánea de las
cadenas conductora y retardada
en la horquilla de replicación
Holoenzima de la
DNA polimerasa III
Exonucleasa
DNA ligasa
Revisión y reparación
Mutación
DNA polimerasa I
DNA ligasa
Unión de fragmentos de Okazaki
106
ADN replicado
Para establecer un paralelo, ¿La replicación del ADN en los eucariotes es
similar a la replicación del ADN en los procariotes? _________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
5’
3’
5’
3’
5’
3’
Fragmentos de Okasaki
Mutaciones
Son las principales causas de variación en la naturaleza y en el laboratorio,
pueden incrementarse utilizando productos químicos, mutagénicos y radiación.
A nivel celular, una mutación es un cambio de secuencia en las bases de ADN
y resulta de un error en la replicación (Smith et al., 1998).
Cambio en el marco de lectura: A pesar de los sistemas destinados a
prevenir y corregir los posibles errores, de vez en cuando se produce alguno
en la réplica, bien por colocarse una citosina en lugar de una timina, o una
adenina en lugar de una guanina; porque el mecanismo de replicación se salta
algunas bases y aparece una mella en la copia, o porque se unen dos bases
de timina formando un dímero.
107
Debió leer
y
Leyó
CCAGTAC
GGTCATG
CCAGTAC
GGTCGTG
CGAAGCTA
GCTTCGAT
CGAAGCTA
G C T-T C G A T
Formación de un dímero de timina
Delección: Implica la pérdida de un trozo de cromosoma; los efectos que se
producen en el fenotipo están en función de los genes perdidos
A B C D E
A B C E
Duplicación: Se repite un trozo de cromosoma
A B C D E
A B C D E D E
Enriquezca su vocabulario
Operón: Es una unidad de transcripción.
Promotores: Sitios de iniciación de la transcripción. En las bacterias, con
frecuencia se cotranscriben diversos genes, a partir de un solo promotor. En
las células eucarióticas, por lo general cada gen tiene su propio promotor.
108
TRANSCRIPCIÓN
Es el proceso en el cual la información almacenada en el ADN es transferida al
ARN, la ARN polimerasa, una proteína multimérica, cataliza la síntesis del
ARN. La transcripción se inicia en las secuencias promotoras, se puede
regular y su terminación requiere de secuencias especiales (Horton et al.,
1995)
ADN
T
G
G
G
T
T
A
A
C
G
T
A
ARNm
A
C
C
C
A
A
U
U
G
C
A
U
ADN
Promotor - Operón
ARN polimerasa
El reconocimiento
de promotores
dependen de una
subunidad de la
ARN polimerasa
El complejo de transcripción
es ensamblado en las
secuencias promotoras
Formación de la burbuja de
transcripción y síntesis de
un cebador Operon
La transcripción de genes se puede regular
Secuencia de
- Los activadores incrementan la velocidad
terminación
de transcripción de promotores débiles.
- Los represores pueden inhibir la
Transcripción
ARN
Enriquezca su vocabulario
109
Intrones: Secuencias de ARN sin información que no forman parte de la
molécula madura de ARNm.
Exones: Secuencias de bases que codifican proteínas.
Sitios de empalme: Uniones de intrones y exones, en éstos sitios el
precursor de ARNm se cortará y unirá.
Spliceosomas: Complejo de multisubunidades proteína grande-ARN (3x106
Da), compuesto por 45 proteínas y 5 moléculas de ARN cuya longitud total es
de 5000 nucleótidos; cataliza las reacciones de corte y empalme de ARNm,
ayuda a retener los productos intermedios y a situar los sitios de corte y
empalme de modo que los exones puedan unirse con precisión.
PROCESAMIENTO DEL ARN
Muchas trascripciones iniciales de ARN no son liberadas del complejo de
transcripción en una forma por completo activa; más bien, son en extremo
alteradas antes que puedan adoptar sus estructuras y funciones maduras. Se
requieren muchas etapas diferentes de procesamiento para producir ARNt y
ARNr, estas caen dentro de tres categorías generales:
1. Remoción de nucleótidos de transcripciones iniciales del ARN.
2. Adición de nucleótidos con secuencias no codificadas por los genes
correspondientes
3. Modificación covalente de ciertas bases.
El procesamiento de las moléculas eucarióticas de ARNm comprende
modificación covalente, adición de nucleótidos y empalme (Horton et al.,
1995).
Exones
110
Intrones
Entonces, para apropiarse del conocimiento, explique mediante un
diagrama la conversión del ARN sintetizado a ARN maduro
Ahora, represente gráficamente los ARN maduros: ARNt, ARNr y ARNm
ARNt
ARNr
ARNm
Y sobre los diagramas previamente elaborados ubique:
Rama anticodón: Rama que contiene el anticodón.
Rama TΨC: Rama que contiene timina y pseudouridina seguida de citidina
Rama D: Rama con residuos de dihidrouridina, su longitud varía.
Rama variable: Esta ubicada entre la rama anticodón y la TΨC. Puede tener
una longitud de alrededor de 3 a 21 nucleótidos.
Enriquezca su vocabulario
Codones: El código genético está formado por palabras de tres letras, que no
se superponen.
Codón de iniciación: Es el codón de la metionina (AUG), se utiliza para
indicar el sitio de iniciación de la síntesis de proteínas.
Codones de terminación: UAA, UGA y UAG, es decir los que especifican
Paro
Codones sinónimos: Codones diferentes que especifican los mismos
aminoácidos.
111
Anticodón: Rizo de cadena sencilla opuesto al tallo aceptor que se fija a un
codón complementario en el ARNm.
ARNt iniciador: Moléculas de ARN que reconocen el codón AUG
Secuencia de Shine-Dalgarno: Región del ARNm rica en purinas que
precede el codón de iniciación y sobre la cual se fija el ribosoma para iniciar la
traducción.
TRADUCCIÓN
La secuencia de nucleótidos de un gen es información codificada que
especifica el orden de los aminoácidos en un polipéptido. Esta información
codificada se copia al ADN y se transcribe, en un mensaje (ARNm) que luego
se traduce en los ribosomas de la célula. Con algunas excepciones, todos los
organismos vivos utilizan el mismo código genético para especificar la
secuencia de aminoácidos de una proteína. La lectura de este código
genético, y por tanto, la traducción de la secuencia de los ácidos nucleicos a
una secuencia de aminoácidos es mediada por las moléculas de ARNt, las
cuales actúan como interfase entre el ARNm y las proteínas sintetizadas
(Horton et al., 1995).
Código genético universal
Primera
Base
U
C
A
G
112
U
Fenilalanina
Fenilalanina
Leucina
Leucina
Leucina
Leucina
Leucina
Leucina
Isoleucina
Isoleucina
Isoleucina
Inicio - Met
Valina
Valina
Valina
Valina
Segunda Base
C
A
Tirosina
Serina
Tirosina
Serina
Serina
Pare
Serina
Pare
Histidina
Prolina
Histidina
Prolina
Glutamina
Prolina
Glutamina
Prolina
Treonina Asparagina
Treonina Asparagina
Lisina
Treonina
Lisina
Treonina
Asparagina
Alanina
Asparagina
Alanina
Á.
Alanina
glutámico
Alanina
Á.
glutámico
G
Cisteina
Cisteina
Pare
Triptófano
Arginina
Arginina
Arginina
Arginina
Serina
Serina
Arginina
Arginina
Glicina
Glicina
Glicina
Glicina
Tercera
Base
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
Codón
ARNm
Aminoácidos
A
C
Tr
C
C
A
Glu
A
U
U
Leu
G
C
A
U
His
Antes de continuar, para tener una idea concisa, revise las diferentes
estructuras que poseen los ribosomas. Éstas son las fábricas de
proteínas.
113
LECCION OCHO
NOMENCLATURA GRÁFICA DEL ARN
Aminoácido
Ribosoma
ARNt
ARNm
El ribosoma se mueve a lo largo de la cadena de ARNm
114
Síntesis de proteínas en los ribosomas
ARNm
ARNt
Ribosoma
Aminoácidos
Proteínas
Enriquezca su vocabulario
Diana: Secuencia determinada de ADN.
Restrictasas: Nucleasas que rompen los enlaces fosfodiéster de los ácidos
nucleicos; algunas de ellas son BamH1, BalI, EcoRI, HaeII, HaeIII, HhaI,
HindII, HindIII, HpaI, HpaII, PstI, SalI, XorII. Las hay de corte liso o cohesivo.
Mapas de restricción: Ubica las dianas de la restrictasa en el ADN.
Ejemplos de restrictasas y sus dianas
Microorganismo
Bacillus amyloliquefaciens H
Brevibacterium albidum
Abreviatura
BamH1
BalI
Diana
5’ → 3’
3’ → 5’
G↓GATCC
CCTAG↑G
TGG↓CCA
ACC↑GGT
Fuente: Watson et al., 1988
Para mayor comprensión adjunte un mapa de restricción, indicando su
procedencia y describa un método de secuenciación del ADN con base
en los fragmentos de restricción.
115
MANIPULACIONES in Vitro
Los actuales éxitos de la biología se deben al desarrollo de métodos para
secuenciar ácidos nucleicos, cortes específicos de ADN con restrictasas,
métodos de secuenciación de ADN basados en fragmentos de restricción,
síntesis química de oligonucleótidos, replicación del ADN utilizando enzimas,
uso de plásmidos pequeños como vectores para clonar genes y análisis
molecular del ADN de los organismos superiores (Watson et al., 1988).
De ahí la importancia de las manipulaciones genéticas in vitro (también
conocidas como clonaje de ADN, clonaje de genes, tecnología de ADN
Recombinante o, de una manera un tanto evocadora aunque inexacta,
ingeniería genética), éstas permiten en primer lugar evitar los múltiples
mecanismos que restringen la transferencia de genes entre organismos no
relacionados y, en segundo lugar, que se lleven a cabo manipulaciones
extraordinariamente precisas y sutiles aprovechando la extremadamente
precisa y sutil naturaleza del proceso de recombinación. Estas técnicas
consisten en cortar el ADN en fragmentos específicos utilizando
endonucleasas de restricción y ligando los fragmentos a un vector, es decir,
una molécula de ADN que es capaz de ser incorporada y replicada por la
célula hospedadora (Wiseman, 1986).
Pasos para la manipulación genética in vitro
1. Corte y ligadura del ADN: Endonucleasas de restricción
2. Definición de vectores: Vectores para la transferencia de ADN clonado,
vectores de expresión y vectores de secreción
3. Identificación de los recombinantes: Determinación de secuencias de bases
4. Estrategias de la manipulación genética in vitro: Obtención de fragmentos
de ADN, uso de enzimas de restricción, obtención del ADN complementario
5. Expresión: Consiste en conseguir el gen clonado (Wiseman, 1986).
TÉCNICA DEL ADN RECOMBINANTE
Permite transferir genes de un organismo a otro, utilizando para ello vehículos,
por ejemplo plásmidos o fagos, que permiten introducir un gen extraño a un
microorganismo y obligar a esta a producir algo que normalmente no produce,
en pocas palabras se construye un nuevo microorganismo con características
especiales (Montoya, 1989).
Clonación del ADN Recombinante:
Los plásmidos experimentan
rompimientos por la acción de la endonucleasa que produce cortes disparejos,
de modo que se forman extremos de una sola cadena. La misma enzima se
utiliza para preparar una muestra de ADN foráneo. Los dos fragmentos de
ADN se juntan luego con ayuda de bases complementarias con respecto a las
116
bases presentes en los extremos disparejos y de la enzima ADN ligasa. Los
plásmidos híbridos se reintroducen en las células bacterianas, entonces,
células individuales, provistas cada una de su fragmento de ADN
Recombinante, pueden reproducirse fácilmente en clonos con cualquier
número de células que se desee. En algunos casos, el ADN foráneo en el
plásmido puede ser transcrito y traducido. En algunos casos se pueden
producir enormes cantidades del gen, el cual puede utilizarse luego en el
desarrollo de procedimientos bioquímicos, por ejemplo, el análisis secuencial.
Obsérvese, sin embargo, que no es posible predecir, antes de examinar el
clono cuál fragmento particular del ADN foráneo se incorporó en el plasmido
híbrido (Kimball, 1982).
ADN extraño
Vector: Plásmido
Cortar con Endonucleasas de restricción
Fragmentos de ADN con corte cohesivo
Unir con ADN Ligasas
ADN Recombinante
Introducción en células hospedadoras: Células bacterianas
Expresión del gen clonado en las células hospedadoras
Duplicación del ADN
o
Duplicación del ADN
Transcripción
Traducción
Selección de las células que contienen ADN Recombinante
117
Aplicaciones del clonaje de ADN: Aumento de la producción de una
determinada enzima, transferencia de la capacidad para producir un producto
biológico específico a un organismo que crezca fácilmente, por ejemplo, para
la producción de somatostatina, vacunas víricas, hormona del crecimiento
humano, insulina e interferón (Wiseman, 1986).
Amplíe lo aprendido explicando mediante un diagrama qué son y cómo
se utilizan las sondas para genes clonados.
Muta génesis in Vitro: El enfoque genético clásico era inducir in vivo y al
azar mutaciones por todo el genoma y aislar aquellas que tuvieran un fenotipo
determinado. Hoy se puede inducir in Vitro en un segmento de ADN cambios
específicos y analizar sus efectos in vivo una vez introducido el ADN mutante
en un organismo. Entonces se pueden mutar lugares predeterminados del
ADN creando delecciones, inserciones y sustituciones específicas.
Enriquezca su vocabulario
Plasmocito: Célula productora de anticuerpos.
Anticuerpo o inmunoglubulina:
Proteína capaz de reconocer
específicamente determinadas moléculas o partes de moléculas, los
antígenos. Se produce como resultado de la presencia de un antígeno y está
en capacidad de combinarse con él.
Antígeno: Sustancia capaz de provocar una respuesta inmune.
Inmunización:
Procedimiento que lleva a que un individuo produzca
anticuerpos determinados.
Mielomas: Tumores de células productoras de anticuerpos. Todas las células
de un mieloma obtenido de un animal descienden de una sola célula
cancerosa inicial.
118
Para tener una visión de conjunto del sistema inmune indique:
1. La diferencia entre los linfocitos T y β, así como su cooperación.
2. El comportamiento de las células inmunocomponentes: Receptores
de superficie, control genético, eventos intracelulares, homeostasis.
3. Cómo funciona el sistema de amplificación.
TÉCNICA DE HIBRIDOMAS
La técnica de hibridomas consiste en combinar la habilidad de las células β
para producir anticuerpos, con la “inmortalidad” de las células cancerosas, las
cuales a diferencia de las células normales, se pueden cultivar en el
laboratorio bajo condiciones apropiadas para dividirse y crecer de manera
indefinida, dando lugar a una célula híbrida que tiene propiedades de las
células originales, produce anticuerpos y vive mucho tiempo. A estos híbridos
se les ha denominado anticuerpos monoclonales (Montoya, 1989).
Células β: productoras de anticuerpos
+
Células cancerosas: inmortales
Célula híbrida = anticuerpo monoclonal
BIBLIOGRAFÍA DE APOYO
7. Chandra, P y Appel, W. Métodos de Biología Molecular. Editorial Acribia.
8. Krautwurst, Hans; Encinas, María Victoria; Marcus, Frank; Latshaw, Steven;
Kemp, Robert; Frey, Perry and Cardemil, Emilio. Saccharomyces cerevisiae
Phosphoenolpyruvate Carboxykinase: Revised Amino Acid Sequence, SiteDirected Mutagenesis, and Microenvironment Characteristics of Cysteines
365 and 458. Biochemistry. 1995. 34. 6382 - 6388.
9. Martínez de la Cuesta, Pedro J. y Rus Martínez, Eloísa. La Replicación de
los ácidos desoxirribonucleicos y su importancia en la síntesis de proteínas.
Alimentación: Equipos y Tecnología. Abril 1999.
10.Pellón y otros. La Ingeniería Genética y sus Aplicaciones. Editorial Acribia.
11.Scragg. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas Biológicos en Procesos
Tecnológicos. Editorial Limusa, S.A. de C.V. Grupo Noriega Editores.
México. 1996.
12.Werner, R. Fundamentos de Bioquímica Moderna. Editorial Acribia.
119
BIBLIOGRAFÍA
10.Bernal Villegas, Jaime. Genética Inmunológica. Principios básicos y
aplicaciones clínicas. Editorial Norma. 1982.
11.García Pelayo, Ramón y Gross. Nuevo Larousse Manual Ilustrado.
Editorial Larousse.
12.Hodson, Elizabeth. Presentación. Tecnologías de la Vida para el
Desarrollo. Bases para un Plan del Programa Nacional de Biotecnología.
Colciencias. 1993.
13.Horton, Robert; Moran, Laurence; Ochs, Raymond; Rawn, David y
Scrimgeour, Gray. Bioquímica. Prentice-Hall Hispanoamericana, S.A.
México. 1995.
14.Kimball. Biología. Cuarta Edición. Fondo Educativo Interamericano.
México. 1982.
15.Madden, Dean. Biotecnología de losAlimentos. Introducción. ILSI Europa.
Bélgica. 2000.
16.Montoya, Dolly. Las fermentaciones como soporte de los procesos
biotecnológicos. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, D.E. 1989.
17.Watson, James; Tooze, John y Kurtz, David.
ADN Recombinante.
Introducción a la ingeniería genética. Primera edición. Editorial Labor, S.A.
1988.
18.Wiseman, Alan. Principios de Biotecnología. Editorial Acribia, S.A.
Zaragoza. 1986.
TRABAJO DE COMPLEMENTACIÓN
1. Busque un artículo en inglés que describa el proceso de clonación
vegetal y con él construya un documento gráfico que permita
identificar cada parte del proceso; defina términos.
2. Explique mediante un ejemplo como las sondas de ADN pueden ser
utilizadas para detectar genes o fragmentos de ADN particulares que
han sido aislados de algunos organismos, permitiendo que las
características genéticas se confirmen rápidamente, sin necesidad de
hacer crecer una planta hasta la madurez.
3. Explique mediante un ejemplo, en qué consisten la transgenia y la
mutación sitio-dirigida.
4. La pectina es un componente esencial de muchas frutas, degradada
naturalmente por las enzimas poligalacturonasa y es posible utilizar la
tecnología antisentido para “neutralizar” la producción de
poligalacturonasa, retardando la maduración de las frutas una vez han
sido cosechadas. Explique entonces, el principio de la tecnología
antisentido?
120
LECCION NUEVE
ESTUDIO DE CASO : ESTUDIO Y PUESTA A PUNTO DE UN MÉTODO
“ELISA” PARA LA DETERMINACIÓN DE AFLATOXINAS EN
CHORIZOS
Las aflatoxinas son compuestos químicos, cumarinas intensamente sustituidas,
estructuralmente relacionadas con compuestos tóxicos producidos por ciertas
cepas de Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus. En la actualidad se conocen
por lo menos 8: B1 (carcinogénica), B2, B2a, G1, G2, G2a, M1 y M2. Éstas pueden
estar presentes en los productos cárnicos, bien en forma indirecta, como
residuo en el tejido de los animales que han consumido alimentos
contaminados con ella o en forma directa, cuando los mohos crecen sobre los
productos, caso en el cual su desarrollo depende de factores tales como
potencial genético, condiciones ambientales (sustrato, humedad, temperatura,
pH) y tiempo de contacto entre el hongo y el sustrato.
Objetivo
Definir si el método de extracción propuesto para la obtención de aflatoxina a
partir de una muestra de chorizo es el correcto, y si el test AFLA-10 CUP
diseñado para determinar la presencia de aflatoxinas B1, B2 y G1 en cereales,
cacahuetes y pienso, puede aplicarse a productos cárnicos.
Materiales y métodos
Métodos analíticos
Para determinar la presencia de hongos potencialmente productores de
aflatoxinas: Se utiliza la técnica de siembra en placa en medio Czapek Solution
Agar6 preparado de acuerdo con la fórmula dada por Thom y Church,
incubando a T1 = ambiente y T2 = 30ºC.
Para determinar la presencia de aflatoxinas: Se utiliza el test AFLA-10 CUP, el
cual proporciona resultados en 5 minutos, sin contar el tiempo de preparación
de la muestra ni el de los extractos. El método se basa en la técnica ELISA,
donde una cantidad control de anticuerpo se halla en el disco central de un
pocillo que sólo reaccionará frente a la aflatoxina, detectando niveles de toxina
entre 5 y 100 ppb, en muestras de alimentos y piensos. Su grado de exactitud
se acerca al 100%.
Éste medio produce un desarrollo moderadamente vigoroso de casi todos los saprofíticos
Aspergilli y produce micelas y conidios característicos, útiles para estudios comparativos.
6
121
Materiales y reactivos: Kit AFLA-10 CUP el cual proporciona pocillos con
anticuerpo para aflatoxina, enzima marcada, soluciones control (negativo),
para lavado, sustrato A, sustrato B y tampón para dilución de la muestra.
Todos los componentes del Kit se deben almacenar sin congelar, entre 4 y 8ºC.
Muestras: Para determinar la presencia de hongos en el chorizo se tomaron
muestras tanto en la superficie como en el interior del producto. Para
comprobar si el método ELISA era aplicable a productos cárnicos crudos y
curados, se tomaron ejemplares del embutido y a algunos de ellos se añadió
aflatoxina B1 cristalina disuelta.
Preparación de la muestra: La extracción se realiza con una solución metano :
agua (80 : 20), teniendo en cuenta que sólo se usan extractos acuosos con pH
entre 5 y 10. Es importante, entre muestra y muestra, limpiar el material con
lejía al 30%, así como utilizar los reactivos a temperatura ambiente. Una vez
transcurrido el plazo necesario para que la extracción de la muestra sea
completa, se procede a una dilución total del extracto con tampón de dilución y
a la aplicación del test, realizando paralelamente una prueba control.
Aplicación del test: Una solución control (negativo) de aflatoxina o la muestra
preparada del alimento a analizar se añade al pocillo, posteriormente se agrega
la enzima marcada y a continuación la solución de sustrato. Cantidades
crecientes de toxina originan en el pocillo una coloración más débil (blanco); su
ausencia, reporta un color azul intenso (control negativo). Los pasos a seguir
en orden riguroso y cronometrado son:
1. Aplicar 100 µl de la dilución total en el centro del pocillo, esperar 1 minuto y
añadir otros 100 µl.
2. Aplicar 2 gotas de enzima en el centro del pocillo. Esperar 1 minuto como
tiempo de reacción (tras la segunda gota) antes de continuar.
3. Lavar el pocillo con 30 gotas de la solución de lavado, utilizando cada vez,
tres series de 10 gotas.
4. Preparar la solución de sustrato en un tubo de ensayo pequeño, mezclando
10 gotas de la solución de sustrato A, con 10 gotas de la solución de sustrato
B; ésta mezcla se debe realizar máximo 10 minutos antes de utilizarla.
5. Añadir todo el contenido de la solución de sustrato al pocillo y usando el
cronómetro, esperar 1 minuto.
6. Leer e interpretar los resultados.
122
Como usted debe medir microlitros, consulte: ¿Qué tipos de
transferpipetas encuentra en el mercado?, ¿cuáles son sus rangos de
aplicación? y ¿cuál es su costo?
Resultados
Presencia de hongos en el chorizo
Tipo de
muestra
Superficie
Superficie
Interior
Diluciones de Desarrollo Desarrollo Características de los hongos
a 30ºC
la muestra
a Tambiente
4
10
+
+
Colonias filamentosas y
+
+
blanquecinas, con cabeza negra
104
+
+
en el extremo superior del
104
filamento
Directamente
+
+
Filamentosos, algodonoso
+
+
semiesférico, blanquecino, con
ligero tono verde en el centro
4
10
+
Pequeñas colonias blanquecinas
estriadas y muy extendidas
104
Análisis
Las colonias de aspecto filamentoso y blanquecino con cabeza negra en el
extremo superior de cada filamento, sugieren que el hongo superficial del
chorizo es el Krhizopus nigricans. Además, la siembra directa de los mohos
superficiales, presenta el aspecto característico de las colonias en procesos de
curado de embutidos cárnicos, es decir, colonias filamentosas de aspecto
algodonoso, semiesféricas, blanquecinas con un ligero tono verde en el centro.
Nótese que en ningún caso se encontraron colonias típicas de hongos
productores de aflatoxinas. Sin embargo, es importante considerar que aunque
estos microorganismos específicos no se encuentran en el alimento, éste sí
puede estar contaminado con la toxina, ya que el embutido pudo perder su
contaminación fúngica superficial, mediante técnicas de lavado, raspado o de
altas temperaturas.
Presencia de aflatoxinas en el chorizo
Tanto en las muestras control como en las que contenían sólo embutido, una
vez transcurrido el tiempo necesario de reacción se observó una coloración
azul intensa que iba aumentando conforme pasaba el tiempo. Esto indica que
123
las muestras de chorizo analizadas no contenían aflatoxina. Sin embargo, los
tests realizados sobre muestras con aflatoxina, dieron resultado positivo.
Análisis
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Conclusión
El método de extracción de la muestra para obtener la aflatoxina, en caso de
que la hubiera, es el correcto y el test AFLA-10 CUP puede aplicarse a
productos cárnicos.
¿Qué otras técnicas de ELISA conoce? _______________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Discuta la siguiente afirmación: “Las técnicas enzimoinmunocitoquímicas utilizan anticuerpos marcados con enzimas para localizar los
constituyentes presentes en los tejidos o en las células, o
alternativamente para demostrar los anticuerpos anticonstituyentes
celulares presentes en los sueros de ciertos enfermos”. ________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
La experiencia muestra que ciertos anticuerpos monoclonales pierden
totalmente su actividad después del acoplamiento a marcadores, ya
sea a macromoléculas como las enzimas o a haptenos como la biotina
o la fluoresceína.
Proponga entonces, una explicación a este
fenómeno. __________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
124
Bibliografía recomendada
1. Scragg. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas Biológicos en Procesos
Tecnológicos. Editorial Limusa, S. A. Grupo Noriega Editores. México.
1996.
2. Alguacil, M.; Fidalgo, M. y Jiménez, J. Detección de Brettanomyces/Dekkera en
instalaciones de vendimia mediante PCR. Alimentación: Equipos y
Tecnología. Octubre. 1998.
3. Pájaro, J. C.; Santos, V. y Vásquez, M. Producción Biotecnológica de asta
xantina por phaffia rodozyma. Alimentación: Equipos y Tecnología.
Enero/Febrero. 1996.
4. Prieto, Juan Carlos y Bermúdez, Ana Silvia. Producción de almidón bajo en
proteínas a partir de harina de arroz. Alimentos Hoy.
5. Sutherland, Ian y Tait, Michael. Biopolymers. Encyclopedia of Microbiology.
Volumen 1. Academic Press, Inc. 1992.
TRABAJO DE COMPLEMENTACIÓN
1. Elabore un cuadro sinóptico que permita visualizar las diferentes
aplicaciones de la biotecnología en la industria de alimentos.
2. Proponga un procedimiento biotecnológico para producir almidón
bajo en proteínas.
3. Construya un caso similar a los presentados. Describa el proceso de
producción de dextran utilizando Leuconostoc mesenteroides.
4. Explique el principio de la tecnología de fermentación anaerobia
para el tratamiento de aguas contaminadas con materia orgánica.
5. Describa la técnica para cuantificar glucosa en los alimentos,
utilizando glucosaoxidasa peroxidasa.
125
96
UNIDAD 2
Me atreveré a todo lo que pueda hacer un hombre.
Quien se atreva a más es un insensato.
Shakespeare
96
CAPITULO 4
LECCION DIEZ
LAS ENZIMAS Y SU TECNOLOGÍA
Introducción
En la década de 1940, se inició el desarrollo de equipo apropiado para la
producción a gran escala, conduciendo a la fabricación industrial eficiente y
dando origen al uso entre otros, de enzimas puras en la industria de alimentos.
Bajo esta perspectiva, los productores de proteína comenzaron a cultivar cepas
de microorganismos especialmente seleccionados, y a hacer grandes progresos
en la mejoras de eficiencia productiva, seguridad, calidad y espectro de
productos disponibles (Madden, 2000). Así pues, la presente unidad permite
aprender de las enzimas, aspectos tales como naturaleza, procedencia
comercial, procesos de producción, cinética e inmovilización, los cuales
permitirán entender su funcionamiento para posteriormente aplicarlas al
procesamiento de alimentos y biomateriales.
Objetivo
Al terminar la unidad el profesional debe estar en capacidad de definir la
naturaleza de los enzimas y sus diferentes aplicaciones, de describir los
mecanismos de síntesis, extracción y purificación, así como de aplicar los
conceptos de cinética, inmovilización y modificación enzimática a procesos
industriales.
Contenido
Naturaleza química de las enzimas
Procedencia comercial de las enzimas
Producción de enzimas
Cinética enzimática
Inmovilización enzimática
Aplicaciones industriales
Bibliografía de apoyo
Bibliografía
Trabajo de complementación
97
Bibliografía recomendada
1. Finchman, J.R.S y Ravetz, J.R. Genetically Engineered Organisms: Benefits
and Risks. Council for Science and Society/Open University Press, Milton
Keynes. 1991.
2. Gacesa, Peter y Hubble, John. Tecnología de las enzimas. Editorial Acribia.
Zaragoza. 1990.
3. Grebeshova, R.; Castellanos, Oscar; y Salcedo, L.
Estudio de las
propiedades catalíticas de las proteasa B. Subtilis. Revista Colombiana de
Biotecnología. Santafé de Bogotá, D. C. Vol. 1; 1; Enero, 1998. pp 57 –
62.
4. Hagenimana, Vital; Vézina, Louis-P y Simard Ronald E. Sweetpotato α- and
β-Amilases:
Characterization and Kinetic Studies with Endogenous
Inhibitors. Journal of Food Science. Volumen 59. No. 2. 1994.
5. Madden, Dean. Biotecnología de los Alimentos. Introducción. ILSI Europa.
Bélgica. 2000.
6. Marquez Moreno, M. C. y Fernández Cuadrado, V. Los Hidrolizados
Enzimáticos de Alimentos y su Aplicación en la Industria Alimentaria.
Alimentación: Equipos y Tecnología. Año XI. No. 4. Mayo. 1992.
7. Nakano, Hirofumi.
Recent Japanese Development in the enzymatic
production and application of oligosaccharides.
Japan International
Cooperation Agency.
8. Organización Mundial de la Salud. Strategies for Assessing the Safety Foods
Produced by Biotechnology. OMS. Ginebra. 1991.
9. Organization for Economic Cooperation and Development. Safety Evaluation
of Foods Derived by Modern Biotechnology. Concepts and Principles.
OECD. París. 1993.
10.Scragg. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas Biológicos en Procesos
Tecnológicos. Editorial Limusa, S. A. Grupo Noriega Editores. México.
1996.
98
TUS COMPROMISOS
Para abordar el capítulo
Hacer la ficha técnica de una enzima
Copiar el artículo de Grebeshova,
Castellanos y Salcedo relacionado en la
bibliografía recomendada.
Con el grupo
Presentar la técnica para determinar
experimentalmente las actividades catalíticas
siguientes:
• La actividad lipolítica
• La actividad proteolítica
• La actividad de la amilasa
• La actividad de la pululanasa
• La actividad de la glucoamilasa
Para aprender a aprender
•
•
•
•
•
99
Identificar el problema a resolver
Informarse sobre como se resuelve
Analizar las formas para resolverlo
Decidir la mejor alternativa
Aplicar la información adquirida para
ejecutar la alternativa seleccionada
NATURALEZA QUÍMICA DE LAS ENZIMAS
Al mismo tiempo que crece la proteína por incorporación de sucesivos
aminoácidos se multiplican las posibilidades de participar en interacciones
intramoleculares. Estas interacciones se materializan con la formación de
enlaces de hidrógeno que sirven de apoyo a las llamadas estructuras
secundarias (formas α y β) y muy probablemente su generación tentativa sirve
de germen a la estructura definitiva de la proteína. A continuación vienen las
interacciones entre cadenas laterales de los residuos de aminoácidos,
originando plegamiento de los diversos tramos de estructura secundaria hasta
generar regiones autónomas de la molécula proteíca dotadas de una estructura
supersecundaria característica, denominada dominio o centro de unión. Estas
regiones son como proteínas globulares en miniatura que se construyen de
acuerdo con principios generales de montaje (cuentan con un núcleo
hidrofóbico, residuos polares expuestos al disolvente acuoso y una capacidad
de unión específica con un determinado ligando). Dependiendo del tamaño de
la cadena polipeptídica, pueden coexistir mayor o menor número de regiones
autónomas que dotan la molécula de mayor o menor número de funciones y
dan nacimiento a la estructura terciaria, donde se observan interacciones entre
dominios, de las cuales depende la actividad biológica propia de la proteína.
Un caso extremo de este aspecto lo constituyen las proteínas multifuncionales,
que presentan numerosos dominios de unión y variadas actividades
enzimáticas con sede en una misma cadena polipeptídica. Sin embargo, en la
mayoría de los casos, se acumulan distintas funciones en la misma molécula
proteíca utilizando un recurso distinto: se produce en la célula la agregación
espontánea y altamente específica de varias cadenas polipeptídicas, cada una
de las cuales aporta sus propios dominios con áreas de unión específicas que
permiten el ensamblaje de subunidades y de cuyas interacciones depende la
llamada estructura cuaternaria de la proteína. En otros casos, parece más
probable que la trascendencia de la estructura cuaternaria derive de la
estructura oligomérica ya que la gran mayoría de las proteínas con estructura
cuaternaria son ologómeros (Cardenas, 1980).
100
PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS ENZIMAS
Tradicionalmente se han obtenido pocas enzimas de origen animal debido a
que éstas pueden ser reemplazadas por otras similares derivadas de
microorganismos; pero aunque los sustitutos microbianos son catalíticamente
eficaces presentan diferencias sutiles en sus propiedades. Las plantas también
han sido fuente tradicional de un cierto número de enzimas, así del látex
producido por la papaya o por la piña, se han aislado, sobre todo, cisteinproteasas. Como regla general, el látex se deja secar al sol o, si es necesario,
puede incluso usarse como preparación enzimática cruda (González, 2000).
Para ejemplificar lo anterior, enuncie dos enzimas de origen animal y
dos de origen vegetal; en cada caso indique su aplicación
Enzima
Origen
Aplicación
Ahora visualice su mercado: ¿El empleo industrial de éstas enzimas
está
aumentando
o
disminuyendo?
_______________________________________________________
¿Por qué?
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
Sin embargo, los microorganismos producen una enorme gama de enzimas
potencialmente útiles, muchas de las cuales son segregadas al exterior celular;
además, son capaces de desarrollarse fácil y rápidamente en su medio de
cultivo y la tecnología al respecto, a gran escala, se encuentra bien establecida
(Gacesa et al., 1990).
Complemente sus conocimientos indicando las enzimas que pueden
extraerse de los diferentes microorganismos
Microorganismo
101
Enzima
Microorganismo
Enzima
Represente gráficamente las estructuras típicas de las paredes
celulares de:
a. Un hongo
b. Una bacteria gram-positiva
c. Una bacteria gram-negativa.
Cuando la enzima ha sido segregada por un microorganismo, lo habitual es que
pueda difundirse libremente a través de la pared celular. En el caso de hongos
y bacterias gram-positivas, llega al medio externo o permanece asociada a
estructuras de la pared celular. En las bacterias gram-negativas la secreción es
más compleja debido a la presencia de una membrana externa, la cual retiene
a menudo, en el espacio periplásmico, las enzimas segregadas en lugar de
liberarlas al medio de cultivo (González, 2000).
Enzimas extracelulares
Son aquéllas que han cruzado la membrana celular o, en muchos casos se
encuentran asociadas a ella y no liberadas al medio de cultivo, se obtienen por
secreción co-translacional o mediante secreción y modificación posttranslacional, dependiendo de la naturaleza del microorganismo de donde
provienen.
En general, la membrana extra y la diferente localización de las
proteínas ha restringido el uso de los microorganismos gram-negativos para la
obtención de enzimas extracelulares; de hecho, la única enzima relevante
producida por una bacteria gram-negativa es la pullulanasa, de la Klebsiella
pulmoniae. A nivel industrial presentan las siguientes ventajas:
1. Dado que la molécula es segregada fuera de la célula, no se requieren
técnicas de ruptura celular, difíciles de aplicar a gran escala.
102
2. El número de proteínas segregado es limitado y por eso es relativamente
fácil aislar una enzima concreta a partir de la mezcla.
3. Las enzimas extracelulares suelen presentar una estructura más compacta y
son menos susceptibles a la desnaturalización que las correspondientes
intracelulares (Gacesa et al., 1990).
Secreción co-translacional de las proteínas bacterianas
Formación del complejo de iniciación ribosoma-ARNm
Comienzo de la biosíntesis proteica
ocurre antes de que el complejo
(dirigido por el péptido señal N-terminal)
se asocie a la membrana celular
El péptido señal N-terminal
dirige la ligadura del ribosoma
a la membrana plasmática
Separación del péptido señal mediante
una proteinasa ligada a la membrana
Terminación de la biosíntesis proteica
Para asimilar lo aprendido, enuncie tres microorganismos que den
origen a enzimas extracelulares e indique que enzimas se produce
industrialmente a partir de ellos:
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103
Secreción co-translacional de las proteínas
fúngicas y eucarióticas
Formación del complejo de iniciación ribosoma-ARNm
Comienzo de la biosíntesis proteica
Introducción de la cadena peptídica
en un lumen del retículo endoplasmático
Procesamiento de la enzima
a través del aparato de Golgi,
dando origen a modificaciones translacionales
Exportación de la enzima mediante vesículas
hacia la membrana celular.
Para confirmar lo aprendido:
Enuncie y explique las diferencias existentes entre la secreción cotranslacional de las proteínas bacterianas y la de las proteínas
fúngicas
y
eucarióticas
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Explique que quiere decirse cuando se habla de modificaciones
cotraduccionales
y
posttraduccionales
de
las
proteínas
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104
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MODIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS
Modificaciones post-translacionales que
pueden sufrir las enzimas eucariotas
al atravesar el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi:
Glucosilación
Formación de puentes disulfuro
Adición de lípidos
Sulfatación
Recorte de cadenas glucosídicas laterales
Glucosilación terminal
Procesamiento proteolítico
Concentración
Descarga exocitósica
105
Estas modificaciones suelen tener influencia sobre la estabilidad y propiedades
de la enzima.
¿Qué sustancias actúan como inhibidores en las síntesis de enzimas?
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Enzimas intracelulares
Defina las enzimas intracelulares:
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Para ejemplificar lo anterior, enuncie tres microorganismos que den
origen a enzimas intracelulares e indique que enzimas se produce
industrialmente a partir de ellos:
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_______________________________________________________
La mayoría de las enzimas que son comercialmente importantes se producen a
partir de un número limitado de microorganismos. Algunas pueden sintetizarse
durante la fase de crecimiento activo (exponencial) del microorganismo, otras
no aparecen sino hasta la fase estacionaria. Además, la presencia de un
compuesto carbonado simple como la D-glucosa, puede reprimir dicha síntesis.
Pero en cualquier caso, éstas enzimas pueden ser:
1. Constitutivas: están implicadas con aspectos centrales del metabolismo,
se producen continuamente, al margen de la presencia o no del sustrato.
106
2. Inductivas: son sintetizadas en baja proporción hasta cuando el sustrato
adecuado o un producto derivado de su degradación este disponible para
inducir un incremento de la síntesis (González, 2000).
Busque un artículo que describa la secreción de una enzima y
preséntelo junto con un diagrama explicativo
Sin embargo, es posible la incorporación de un gen animal o vegetal a un
microorganismo, la transferencia de genes de enzimas procedentes de
microorganismos patogénicos a huéspedes más aceptables (Gacesa et al.,
1990) y la mutagénesis sitio-dirigida para producir enzimas modificadas
(Horton et al., 1995).
Mutagénesis sitio-dirigida
Aislar el gen que codifica una enzima
Secuenciar del gen
Sintetizar la enzima en
células bacterianas insertando
el gen en un vector adecuado,
por ejemplo en un virus
Preparar el ADN con la
secuencia de bases alterada
para codificar una proteína
modificada
Comprobar que la
bacteria sintetizó la enzima
no modificada
Infectar las bacterias con el
nuevo ADN
Aislar la proteína mutante
Comprobar su estructura
por cristalografía de rayos X
para asegurar que la mutación
no alteró su conformación
107
Probar la proteína mutante
Purificar la enzima
Fuente: Horton et al., 1995.
LECCION DE ONCE
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS
Se producen por lo general en fermentación sumergida aerobia convencional,
proceso que presenta mayor control de las condiciones de crecimiento que la
fermentación en estado sólido o semisólido propia de la producción de lactasa,
α-amilasa, pectinasa y cuajo. Utiliza microorganismos productores de enzimas
que cumplan con las siguientes propiedades:
• Cepas no esporulantes ni formadoras de metabolitos tóxicos o
inmunogénicos
• Cepas fisiológicamente estables y fácilmente aceptadas por las autoridades
encargadas de controlar los alimentos y fármacos
• Cepas hiperproductoras de enzimas que pueden ser mutantes estables con
centros represores inactivos, baja represión por catabolitos, retroinhibición o
resistencia a la inhibición por producto final
• Cepas que presenten facilidad y rapidez de crecimiento en fermentadores
grandes con nutrientes sencillos y relativamente baratos que no necesiten
de inductores
• Cepas que den origen a productos fáciles de aislar, purificar y concentrar
Tipo de microorganismo
Aplicación
Microorganismos marinos
Bacteria patógena del ruibarbo
isomaltulosa
enzimas clorantes
enzima
Microorg. que crece a 250ºC
en fuentes volcánicas
enzimas estables al calor
Microorg. del intestino del
gusano que perfora la madera
enzimas que degradan la celulosa
y fijan nitrógeno
Durante su producción se distinguen cuatro etapas:
108
productora
de
1. Generación o producción:
Fermentación en el caso de enzimas
microbianas; producción agropecuaria o cultivo in vitro en el caso de
enzimas de tejidos.
2. Recuperación: Separación, concentración, extracción.
3. Purificación: Varía según el tipo de catalizador enzimático que se use;
puede incluir varias etapas o no existir.
4. Formulación: Acabado y normalización del producto enzimático.
Enzimas extracelulares
Fermentación
Torta celular
residual
Separación Sólido-líquido
Concentración
A Purificación o
Formulación
Enzimas intracelulares
Fermentación
Torta celular
residual
Separación Sólido-líquido
(Almacenamiento)
Extracción
Separación Sólido-líquido
109
Caldo gastado
Tejido vegetal
o animal
Concentración
A Purificación o formulación
Generación de enzimas
La célula microbiana puede ser visualizada como una compleja maquinaria que
transforma los nutrientes a su disposición en masa celular, productos
extracelulares (principalmente proteínas) y metabolitos terminales (CO2 y H2O
en metabolismo aerobio), utilizando básicamente dos tipos de control:
1. Inducción: Consiste en que ciertas enzimas, denominadas inducibles,
son sólo sintetizadas en respuesta a un estímulo ambiental (inductor). En
este modelo se considera la existencia de un gen controlador que produce
una proteína represora que, en ausencia del inductor, se ubicará en un lugar
genético denominado gen operador, impidiendo el desplazamiento de la
enzima ARN polimerasa desde su sitio de unión en el ADN (gen promotor)
hacia los genes estructurales, impidiendo por tanto la transcripción y
traducción de dichos genes. En presencia del inductor, la proteína represora
será inactivada, impidiendo su unión al gen operador, permitiendo el
desplazamiento de la ARN polimerasa hacia los genes estructurales y la
transcripción y traducción subsecuente de dichos genes.
2. Represión catabólica: Permite a la célula diferenciar entre los distintos
sustratos, reprimiendo la síntesis de aquellas enzimas involucradas en el
catabolismo de sustratos más difícilmente asimilables.
El mecanismo
genético postulado propone que la asimilación de un sustrato rápidamente
metabolizable (por ejemplo, glucosa) provocaría la disminución del
contenido de AMP cíclico (regulando la actividad de la enzima adenilato
ciclasa: ATP ------> AMP cíclico + PPi), el cual es requerido en el proceso de
transcripción de los genes estructurales que codifican la síntesis de las
enzimas. El AMP cíclico, el GMP cíclico u otro nucleótido polifosforilado
actuaría como facilitador o modulador positivo a nivel de gen promotor,
acomplejándose a una proteína receptora específica.
Los controles metabólicos están orientados hacia el uso eficiente de los
recursos para la propagación celular evitando la acumulación de metabolitos
específicos; pueden obviarse mediante mutación, dando origen a cepas
constitutivas que no requieran la adición de un inductor para sintetizar una
determinada enzima, a cepas insensibles a la represión catabólica que puedan
sintetizar la enzima en presencia de sustratos rápidamente metabolizables o
también, a cepas con permeabilidad alterada que excreten al medio una
enzima originalmente intracelular.
110
Para mayor comprensión, describa como actúa el represor lac en E.
coli.
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Recuperación de enzimas
En la recuperación de una enzima se engloban todas aquellas operaciones que
van desde el proceso de síntesis por parte del organismo productor hasta la
obtención de un preparado capaz de ser sometido a purificación o a
formulación, de acuerdo con las exigencia del caso. Las operaciones de
recuperación dependen de la localización celular de la enzima (extracelular o
intracelular: periplásmica, citoplásmica o asociada a membranas).
La extracción celular es crítica dentro del proceso de producción enzimática, no
por la ausencia de sistemas eficientes de disrupción celular, sino porque las
condiciones de extracción deben ser compatibles con la preservación de la
actividad enzimática. A continuación se muestran los procedimientos más
comunes para la lisis celular y la correspondiente extracción de enzimas:
Procedimientos para lisis celular y extracción de enzimas:
Tipo de enzima
Extracelular
liberada al medio
Extracelular
no liberada al
medio
Intracelular
De tejidos
animales
111
Tipo de lisis celular
Método de extracción
Centrifugación
Requieren la destrucción parcial o total de la célula
Disrupción mecánica
Sonicación
Tratamiento con
detergentes
Choque osmótico
Homogenización del tejido
en una solución tampón
Centrifugación diferencial
para seleccionar la
adecuada
De tejidos
vegetales
subfracción o el orgánulo
apropiado
La fuerza requerida desnaturaliza las enzimas deseadas.
Contienen compuestos fenólicos que son oxidados
enzimáticamente (polifenol oxidasas) por la
presencia de oxígeno molecular formando
productos que pueden inactivar rápidamente un
número elevado de enzimas.
Como se observa, los sistemas de extracción pueden clasificarse en:
1. Métodos físicos o mecánicos: Aquellos que producen fragmentación del
envoltorio celular por aplicación de esfuerzos cortantes. Entre éstos están la
presión, la homogenización, la molienda y la sonicación.
2. Métodos químicos o enzimáticos: Aquellos que producen digestión del
envoltorio celular.
Principales sistemas de disrupción celular y sus características:
Método
Presión
Homogenización
Molienda
Sonicación
Decompresión
Congelacióndescongelación
Digestión alcalina
Digestión con
solventes
Autolisis enzimática
Lisis enzimática
exógena
Principio de ruptura
Compresión, esfuerzo de
corte
Esfuerzo de corte, cavitación
Compresión, esfuerzo de
corte
Cavitación
Explosión por decompresión
Esfuerzo de corte
Digestión pared celular
Digestión membrana celular
Digestión pared celular y
ruptura osmótica
Digestión pared celular y
ruptura osmótica
Aplicación a gran
escala
Poco probable
Factible
Factible
Factible
Poco probable
Improbable
Improbable
Poco probable
Factible
Factible
Separación sólido-líquido: La separación de las células del caldo gastado
es el primer paso en la recuperación de la enzima, sea ésta extracelular o
intracelular.
112
De las operaciones de separación sólido-líquido, la filtración y la centrifugación
son las más empleadas, aunque ambas ofrecen dificultades debido al pequeño
tamaño de las células, a su baja densidad y a su compresibilidad.
La filtración es adecuada a la separación de microorganismos de morfología
multicelular (hongos, actinomicetes); en estos casos la baja densidad del
micelio puede hacer imposible la separación por centrifugación. El tipo de filtro
recomendado en estos casos depende del tamaño de la operación: a escala
piloto se utiliza el filtro de plato y marco; mientras que en escala industrial
resulta más conveniente el uso de equipos continuos como el filtro rotatorio a
vacío.
En el caso de muchas enzimas hidrolíticas provenientes de microorganismos de
morfología unicelular (levaduras y bacterias), la proteína se puede liberar en el
medio de cultivo y debe separarse de las células mediante centrifugación
siendo ésta la única etapa necesaria. Normalmente, es esencial que el medio
de extracción tenga además del pH y la fuerza iónica adecuada, los
estabilizadores apropiados, de tal forma que se genere un cierto grado de
floculación (Gacesa et al., 1990). A nivel piloto se emplea de preferencia la
centrifuga tubular y a escala industrial el equipo más empleado es la centrífuga
de discos, operando en forma continua o semicontinua.
Compuestos utilizados en los tampones de extracción:
Tipo de
estabilizante
Adsorbentes
Agentes quelantes
Compuestos tiólicos
Detergentes
Inhibidores
Sustratos
Análogos sustrato
113
Ejemplo
Polivinil
pirrilidona
EDTA
Usos
Fija compuestos reactivos, es útil para
extractos vegetales.
Quelantes catiónicos, particularmente
de metales pesados.
Ditiotreitol
Protección frente a la oxidación de
grupos
lugares
activos
con
sulfhidrílicos.
Tween 20
Solubilización de proteínas unidas a
membrana o disrupción de vesículas.
EDTA o reactivos Inhibidores de enzimas degradantes
alquilantes
tales como proteasas y ciertas
glicosidasas
Sustratos
Generalmente ayudan a estabilizar a la
Inhibidores
enzima frente a la inactivación térmica
competitivos
o frente a pH extremos.
Una alternativa interesante a la filtración convencional, para la separación
tanto de células como de fragmentos celulares en la recuperación de enzimas
intracelulares es la filtración cruzada o tangencial, empleando membranas
microporosas. Aquí la suspensión de células o fragmentos celulares es
alimentada en forma tangencial a la membrana de separación, provocando un
flujo de permeación perpendicular al flujo de alimentación. Poco después del
inicio del proceso, el flujo cae desde el nivel correspondiente al obtenido para
el agua pura, hasta un valor mucho menor que va descendiendo lentamente
con el tiempo. Las causas de este descenso son:
• Polarización por concentración: es decir, la acumulación de solutos
retenidos reversiblemente cerca de la superficie de la membrana.
• Los fenómenos de ensuciamiento: tales como la adsorción, el bloqueo
de poros y la deposición de solutos solidificados que, a lo largo del tiempo,
pueden ser procesos más o menos irreversibles (Torres et al., 1996).
Para fundamentar sus conocimientos:
Elabore un documento donde explique dos de los procesos de
filtración por membranas:
microfiltración y ultrafiltración
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Describa los diferentes tipos de membranas utilizados en procesos de
microfiltración
y
ultrafiltración
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Describa los procedimientos utilizados para caracterizar membranas
poliméricas
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_______________________________________________________
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114
EJEMPLO DE FLOTACIÓN (Separación de proteínas)
Ejemplo
Cepa estable de Bacillus subtilis
Conservada liofilizada a 4ºC
Fermentar
En erlenmeyer de 750 ml, con volumen efectivo = 50 ml
Velocidad de agitación = 180 rpm
T = 37ºC
pH = 7,5
Tiempo = 48 h
Centrifugar a 5000 g
Sobrenadante
Biomasa
Concentrar el sobrenadante
en un secador al vacío
Tratar con etanol
V del medio/V etanol = 1: 3,5
T = 4ºC
Preparar sln enzimática al 1%
Filtrar la sln enzimática
Centrifugar la sln enzimática
a 5000 g por 10 min.
115
Determinar la actividad catalítica
Método de Anson modificado
Fuente: Grebeshova et al., 1998.
También se ha estudiado como alternativa para la separación de células de
caldos fermentados, la flotación mediante inyección de aire o gas inerte con o
sin adición de agentes de flotación, donde la separación eficiente de las
células, requiere de tamaños de burbuja muy pequeños (del orden de 10 mm),
lo que hace preciso un diseño muy cuidadoso del difusor.
La extracción de proteína y la desnaturalización enzimática siguen
determinados comportamientos cinéticos, de modo que si se dispone de
modelos matemáticos que los describan, es posible optimizar el proceso de
extracción.
Purificación enzimática
El extracto enzimático, contiene muchos otros componentes celulares, así por
ejemplo, las células bacterianas lisadas liberan cantidades superiores de ácidos
nucleicos, esto hace posible pensar que si una enzima presenta una elevada
importancia, entonces, ella debería ser purificada hasta homogeneidad. Sin
embargo, para muchos propósitos biotecnológicos esto no es necesario y una
amplia variedad de procesos resultarían antieconómicos si la enzima fuese
completamente pura. Para la mayoría de las aplicaciones probablemente es
suficiente un menor grado de purificación aunque existan algunas actividades
contaminantes que no afecten al sustrato(s), al producto(s) o a la enzima(s)
involucrada en un proceso específico (Gacesa et al., 1990).
A nivel laboratorio, un proceso de purificación está concebido como una
secuencia de operaciones o etapas en las cuales los contaminantes
(especialmente proteicos) van siendo subsecuentemente removidos
aumentando la actividad específica de la enzima. Cada etapa de purificación
significa, sin embargo, una pérdida de actividad enzimática, por lo que esta
estrategia no es necesariamente adecuada al escalar un proceso de
purificación a nivel productivo.
Normalmente, es necesario para aislar cada una de las enzimas un proceso de
purificación diferente:
1. Fraccionamiento con sulfato amónico: El método depende de la
capacidad que presentan las concentraciones elevadas de sulfato amónico
para captar las moléculas de agua presentes y así evitan de manera efectiva
116
2.
3.
4.
5.
6.
7.
la solvatación de las proteínas. Tiene como ventaja que reduce el volumen
de material. Dentro de sus desventajas esta que el sulfato amónico
contiene trazas de metales pesados que pueden ser suficientes para
inactivar a un enzima y que la preparación enzimática contiene una
concentración elevada de sulfato amónico y normalmente esta sal debe
eliminarse mediante diálisis, ultrafiltración o columnas de desalado antes de
continuar con la siguiente etapa de la purificación.
Fraccionamiento con solventes orgánicos:
Utiliza acetona o alcoholes para precipitar las proteínas. Los solventes
deben ser usados a temperaturas bajas (<0ºC), de otra manera la mayoría
de las enzimas de desnaturalizan.
Cromatografía de líquidos de alta resolución: La aplicación de la
cromatografía líquida de alta resolución para la separación de proteínas
todavía está en una fase experimental.
Cromatografía de intercambio iónico:
Las proteínas, como
biomoléculas cargadas que son, se pueden retener e intercambiar con
resinas de intercambio iónico (Díaz et al., 1999). Las proteínas se aplican a
la columna bajo condiciones que faciliten al máximo las uniones y se eluyen
selectivamente mediante cambios en las condiciones iónicas. Generalmente
es mejor eluirlas utilizando un gradiente continuo que uno discontinuo.
Cromatoenfoque: Las proteínas son eluidas de una columna de
intercambiador iónico utilizando un amortiguador cuidadosamente
seleccionado, y como el nombre del método lo indica un efecto de enfoque
tiene lugar. En el cromatoenfoque la columna se equilibra con un tampón y
después de la aplicación de la muestra, se utiliza un segundo, amortiguador
de pH diferente para la elución.
Cromatografía de filtración en gel: El método está basado en la
capacidad de una molécula determinada para penetrar en los poros de las
partículas del gel. Esta metodología puede permitir etapas de purificación
en donde el porcentaje de recuperación de la actividad enzimática sea del
100%.
Cromatografía de afinidad: Este método utiliza la interacción específica
entre una enzima y un ligando adecuado inmovilizado como puede ser el
propio sustrato, el producto, el coenzima o algún otro compuesto, por
ejemplo, ciertos colorantes orgánicos.
La cromatografía de afinidad
funciona más adecuadamente cuando la constante de disociación para la
interacción entre la solución ligando libre y enzima es del orden de 10-4 a 108
mol/l (González, 2000).
Para la purificación a gran escala es importante considerar el factor de
purificación (FP) y el rendimiento (R), además de los siguientes aspectos:
117
1. La liberación de enzimas intracelulares por medios mecánicos está bastante
restringida al uso de molino de bolas y a homogenizadores.
2. La centrifugación de los materiales también presenta un problema en los
procesos a gran escala.
3. Una alternativa a la centrifugación es la filtración de las muestras a través
de filtros con diferentes matrices tales como Celita.
4. La diálisis y la concentración de soluciones diluidas en enzima son llevadas a
cabo más adecuadamente empleando aparatos de ultrafiltración.
5. Un método que puede servir y ser de utilidad para la obtención y
purificación de enzimas a gran escala es la extracción líquida en sistemas de
fase acuosa.
Generalmente, los sistemas de dos fases pueden ser
producidos utilizando combinaciones diversas bien de polietilenglicol/fosfato
potásico o de polietilenglicol/dextrano crudo.
6. Una alternativa a la cromatografía de columna es utilizar grupos de procesos
en tanques de agitación (Gacesa et al., 1990).
Formulación de preparados enzimáticos comerciales
Acabado: Las operaciones de acabado tienen por objeto dar forma definitiva
al producto enzimático y están orientadas a la preservación de la actividad
durante el almacenamiento y la comercialización.
Las enzimas se comercializan en estado líquido o sólido, por lo que las
operaciones de acabado dependen del estado físico del producto. Entre ellas
deben destacarse la desalinización, la esterilización, la concentración (y
secado), la estabilización y el recubrimiento.
Operaciones de acabado:
1. Desalinización: Puede efectuarse por diálisis, ultrafiltración o mediante
resinas de intercambio iónico o exclusión molecular.
2. Esterilización: Se logra mediante filtración en filtros profundos de material
fibroso, frecuentemente de tipo celulósico.
3. Concentración: La evaporación al vacío y la ultrafiltración son las más
empleadas.
4. Secado: Similares a los empleados en la industria de alimentos y
farmacéutica. Puede utilizarse la aspersión o la liofilización
La enzima se estabiliza para el almacenaje y para la utilización, teniendo en
cuenta que la estabilidad enzimática varía con el pH, la concentración del
reactivo y la presencia de agentes desestabilizantes. Por lo tanto, una vez
obtenido el preparado enzimático en su forma final, es necesario garantizar
una vida útil que permita márgenes razonables de almacenamiento y tiempos
118
de distribución y consumo. Como regla, se espera obtener tiempos de vida
media de almacenamiento superiores a un año. A fin de lograr este propósito,
es práctica usual la adición de preservantes.
Estabilización para la utilización: Las enzimas estables se encuentran
generalmente en organismos adaptados a vivir en condiciones hostiles, por lo
tanto son éstos los microorganismos más adecuados para su síntesis. No
obstante hay dos formas generales para la preparación de enzimas
estabilizadas: la modificación de la enzima mediante ingeniería genética o
mediante reacciones químicas. Una de las reacciones químicas es el
entrecruzamiento de la enzima original. Mediante éste método es posible
introducir enlaces covalentes en la molécula de proteína, la cual estabiliza la
conformación activa. Se ha encontrado que in vitro el entrecruzamiento de las
moléculas de enzima generalmente incrementa su estabilidad y uno de los
reactivos de entrecruzamiento efectivo y más ampliamente usado es el
glutardialdehído. Sin embargo, el entrecruzamiento de las moléculas de
enzima a través de sus cadenas laterales de aminoácidos, varias de las cuales
juegan un papel en la catálisis o en el mantenimiento de una conformación
activa enzimáticamente, frecuentemente origina pérdidas significativas de la
actividad enzimática (Cesi et al., 1993), así, en muchos casos la concentración
de reactivo influye significativamente en la estabilidad enzimática o restringe la
elección de las condiciones y la configuración del reactor. Por ejemplo, la
utilización de bajas concentraciones de agentes quelantes puede ser adecuada
en unos casos, pero otros estos aditivos son inaceptables por razones de salud
y seguridad.
Para visualizar la naturaleza química y la función estabilizadora de los
diferentes agentes estabilizantes, complete el siguiente cuadro:
Agentes de estabilización:
TIPO DE AGENTE UTILIZADO
NATURALEZA
Preservantes de la configuración activa de Sales
la molécula enzimática
Proteínas inertes
Polímeros
Azúcares
Glicoles
Preservantes que impiden el deterioro por Sales
agentes microbianos
Inhibidores reversibles
119
EJEMPLOS
NaCl o (NH4)2SO4
Albúmina
Polivinil alcohol
Polivinil pirrolidona
Polietilenglicol
CMC
Sacarosa
Glicerol
Sorbato
Benzoato
Sales de amonio
cuaternario
Cofactores
Reactivos sulfhidrilos
Agentes quelantes
La formulación de preparados enzimáticos en forma sólida tiene ventajas desde
el punto de vista del empaquetado y transporte, ya que el producto es con
frecuencia más estable. Sin embargo, sus principales desventajas son de tipo
sanitario y toxicológico, puesto que la formación de aerosoles, durante su
producción o uso, puede causar severos problemas alérgicos, especialmente en
personas sensibilizadas.
Estabilización para el almacenaje: La mayoría de las enzimas han
demostrado ser moderadamente estables en el intervalo de 0 - 4ºC, al igual
que en presencia de estabilizantes como glicoles, compuestos sulfhidrilo,
polímeros orgánicos, antioxidantes y agentes quelantes.
Normalización: En el producto enzimático se debe al menos indicar su
actividad específica (por unidad de peso o volumen de preparado) y estabilidad
de almacenamiento. A fin de elaborar el producto con una actividad específica
invariable, el preparado enzimático debe ser diluido con material inerte hasta
su valor de comercialización.
Es usual que se empleen los mismos
conservantes para normalizar.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Al estudiar la aplicabilidad comercial de un catalizador enzimático deben
tenerse en cuenta los siguientes aspectos:
1. La actividad catalítica: Velocidad de reacción
2. La constante de equilibrio: Extensión de la reacción
3. La estabilidad: Duración de la actividad catalítica
Velocidad de reacción
Enzima + Reactante <=====> Complejo ---------> Enzima + Producto
[E]
[R]
[ER]
[E]
[P]
El aumento de la velocidad se atribuye al descenso de la energía de activación
de la reacción. La etapa de formación del complejo es considerablemente
reversible, ya que el complejo tiene un estado energético semejante a la
mezcla enzima-reactante. La rotura subsiguiente del complejo para rendir los
productos se considera exotérmica, esta etapa puede ser prácticamente
irreversible en muchos casos (Gacesa et al., 1990).
120
Para poder entender, escriba la ecuación de Michaelis - Menten y
explique cada uno de sus términos:
Para predecir el comportamiento de un sistema enzimático es necesario
determinar Vmáx y Km para una enzima en particular
y
Km?
¿Cómo
pueden
determinarse
Vmáx
___________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Escriba la ecuación de Lineweaver-Burk e indique cada uno de sus
términos:
¿Para qué sirve?
______________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
La reacción puede ser efectuada en presencia de inhibidores capaces de
combinarse con la enzima y formar un complejo inactivo.
121
Inhibición acompetitiva: Cuando una concentración de reactante elevada
conduce a la unión de una segunda molécula a la enzima.
Inhibición por producto: Es frecuente que la molécula inhibidora sea similar
en estructura al reactante para competir con él por el sitio activo de la enzima.
Escriba la expresión de velocidad para un sistema con inhibición
acompetitiva e indique cada uno de sus términos:
Escriba la expresión de velocidad para un sistema de inhibición por
producto e indique cada uno de sus términos:
Describa el procedimiento que usted realizaría para determinar las
constantes de inhibición para cada uno de los casos estudiados:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
122
LECCION DOCE
EFECTOS DE LA TEMPERATURA Y PH EN REACCIONES ENZIMÁTICAS
La ecuación de Michaelis-Menten muestra que la velocidad de una reacción
enzimática es
k2[ER]
Por lo tanto, la velocidad de la reacción dependerá de la concentración de [ER]
y el valor de k2. En un esquema simplificado, la variación de la velocidad de la
reacción enzimática con la temperatura puede ser descrita en términos de
cambios en el valor de k2. Como en las reacciones químicas sencillas, ésta
puede ser descrita por la relación de Arrhenius.
Para fijar bases, escriba la relación de Arrhenius y explique cada uno
de sus términos:
Determinación de la termoestabilidad de las enzimas
Incubación de la solución enzimática
Rango de T = 20 - 60ºC con intervalo de 10ºC
Tiempo = 24 h con toma de muestras cada hora
Determinar la actividad enzimática
Determinación de la estabilidad al pH
Incubación de la solución enzimática
Rango de pH = 6,0 - 11,0
Tiempo = 24 h con toma de muestras cada hora
123
Determinar la actividad enzimática
INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA
Cuando una enzima es inmovilizada los procesos pueden operar en continuo y
ser controlados fácilmente, las enzimas pueden reutilizarse, los productos se
separan con facilidad, se minimizan los problemas de manejo de efluentes y de
materias primas y, en muchos casos, las propiedades de las enzimas (actividad
y estabilidad) pueden ser alteradas favorablemente (Berrueta et al., 1992)
como resultado del acoplamiento a un soporte insoluble, de la coinmovilización sobre residuos químicos específicos o del uso de ingeniería
proteica. Ahora bien, cada vez que una enzima es inmovilizada la actividad de
la preparación es siempre diferente a la de la forma natural debido a:
1. Efectos conformacionales:
Ocurren cuando hay perturbaciones
estructurales de la proteína y/o limitación del acceso del reactivo al centro
activo de la enzima
2. Efectos de partición: Ocurren cuando hay interacciones electrostáticas o
hidrofóbicas, y dependiendo del componente indicado, los efectos de
partición pueden intensificar o rebajar la velocidad de la reacción observada.
3. Efectos difusionales o de transferencia de masa: Pueden ser internos
o externos. La resistencia externa proviene de la presencia de una película
de líquido inmóvil alrededor de la partícula de enzima inmovilizada, la cual
permite que la velocidad de conversión catalítica sobrepase la velocidad de
difusión del reactivo en esta capa, que la concentración de reactivo en la
superficie sea más baja que en la solución y que el espesor de la capa
inmóvil esté correlacionado con las propiedades de flujo de la solución
alrededor de la partícula. La resistencia interna a la transferencia de masa
surge cuando las enzimas quedan atrapadas en polímeros, entonces, la
velocidad de reacción puede eliminar más rápido el reactivo de lo que se
difunde a través del gel (Gacesa et al., 1990).
Los métodos comunes de inmovilización de enzimas son:
1. Adsorción: Las enzimas pueden ser adsorbidas sobre la superficie de un
soporte.
2. Unión covalente: La unión covalente de enzimas solubles a un soporte
insoluble es el método más común para la inmovilización de enzimas
habiéndose utilizado una amplia gama de técnicas y soportes para este
propósito.
124
3. Atrapamiento: En este caso la enzima permanece en un estado sin
modificar, pero es atrapada en una gotita de disolvente dentro de una
matriz polimérica. Puede atraparse en microcápsulas, mediante reticulación
o por entrecruzamiento.
APLICACIONES INDUSTRIALES
Además de su aplicación en las industrias de alimentos, detergentes, cueros,
textiles, manufactura del papel, antibióticos y cefalosporinas, las enzimas se
utilizan para análisis clínico, usos médicos, catálisis en química orgánica,
síntesis de compuestos radiactivos, análisis de ADN, procesado bioquímico,
producción de ácidos orgánicos y aminoácidos, extracción de productos
naturales, procesado de proteínas, así como en la elaboración de saborizantes
y aromatizantes (Cheetham, 19??).
Análisis clínicos
Las enzimas se aceptan como reactivos estándar en los laboratorios de
bioquímica para el diagnóstico de enfermedades, para el control y seguimiento
de una enfermedad y de la respuesta de los pacientes a la terapia, y para la
identificación y control de la concentración de drogas o sus metabolitos en la
sangre o en otros fluidos corporales. Las técnicas enzimáticas también se
utilizan en la detección de drogas, análisis de antibióticos, detección de
antígenos o anticuerpos, o en la detección de enzimas y metabolitos en los
fluidos intracelulares, y son usualmente más rápidas que el inmunoanálisis,
más específicas que los análisis fotométricos y más baratas que los
cromatográficos o los inmunoanálisis con sustancias radiomarcadas (Cheetham,
19??).
Para visualizar el procedimiento, describa mediante un diagrama de
bloques el procedimiento que seguiría durante la elaboración de una
prueba de ELISA
125
Tratamientos terapéuticos con enzimas
Hasta el momento más de ciento cincuenta enfermedades metabólicas se han
atribuido a defectos enzimáticos específicos. En muchos de ellos la alteración
se debe a la falta total de la enzima, mientras que, en otros, la causa es su
sustitución por una isoenzima relativamente inactiva. En teoría, y una vez
conocido el defecto, debería ser posible administrar la enzima “ausente” al
paciente y aliviar o eliminar los síntomas de la alteración. Sin embargo, en la
práctica hay lesiones, particularmente el desarrollo del cerebro, que son
irreversibles. No obstante, existe un grupo significativo de enfermedades que
responderían a la terapia enzimática. El fundamento de esta forma de terapia
es simplemente la administración de una enzima concreta a un paciente,
esperando con optimismo que se produzca una progresiva mejoría en el
mismo. Otra forma de utilizar las enzimas desde el punto de vista tratamiento
terapéutico es para sustituir algunas funciones del riñón y el hígado, pues con
ellas se han desarrollado órganos artificiales (Gacesa et al., 1990).
Para complementar, dé dos ejemplos de enzimas que se usen para
tratamientos terapéuticos:
1. _____________________________________________________
_______________
2. _____________________________________________________
_______________
Sensores basados en enzimas
Una de las primeras áreas de aplicación de las enzimas fue en el campo del
análisis, en él, existen un cierto número de ensayos químicos colorimétricos
que implican una etapa previa de transformación enzimática. El procedimiento
más sencillo consiste en usar una enzima adecuada para convertir un
compuesto que no puede ser detectado fácilmente en un producto o
subproducto que sí lo es. Aunque existen muchos casos en los que esto no
puede lograrse en una sola reacción, es posible encadenar una secuencia de
reacciones de tal forma que el producto de la última reacción si puede ser
medido (Gacesa et al., 1990).
Ahora bien, para el control de procesos de fabricación de alimentos y para la
evaluación de la calidad de los productos, la determinación de compuestos
orgánicos y de algunos iones inorgánicos es importante y el uso de sensores
enzimáticos que midan directamente dichos compuestos es la mejor respuesta.
Estos sistemas presentan ventajas respecto a los métodos tradicionales de
126
análisis, debidas a las propiedades de las enzimas (sensibilidad, selectividad,
especificidad, etc.) y están disponibles en el mercado en kits de enzimas
solubles o de electrodos enzimáticos que permiten el análisis simple, rápido y
fiable de un gran número de componentes de los alimentos, incluyendo casos
cuya determinación por métodos convencionales sería difícil, si no imposible.
Así, por ejemplo, las muestras a analizar no requieren tratamientos de
separación de compuestos, ya que las reacciones de detección son posibles sin
ninguna interferencia en presencia de componentes afines (Berrueta et al.,
1992).
Aplicaciones en la industria química
La aplicación más conocida de las enzimas es la producción de agentes
enzimáticos para el lavado (detergentes “biológicos”). En ellos, se utilizan
proteasas para hidrolizar las manchas proteicas provenientes de hierba,
sangre, huevo y sudor humano; lipasas para eliminar las manchas grasas;
amilasas para eliminar residuos de alimentos ricos en almidón, así como
celulasas para intensificar el color y eliminar partículas de suciedad que se
encuentren atrapadas entre la red de microfibrillas. Además, existen diversas
aplicaciones en la industria textil (desencolar, proporcionar un aspecto suave y
brillante a la tela (biopolishing), dar a prendas informales el aspecto de
gastado o bien neutralizar el agente blanqueante (H2O2) con catalasa para
producir menos volumen de aguas residuales), en la papelera (para eliminar
lignina de la pasta Kraft, haciéndola más propensa a los agentes de blanqueo
químicos; para reducir el consumo de resina depositable sobre los rodillos y
demás partes del equipo mediante degradación de los triacilglicéridos propios
de la pasta o para modificar los almidones utilizados en el estucado del papel)
y en la del cuero, durante las operaciones de rendido, remojo, depilado y
desengrase (Novo Nordisk, 1988).
Aplicaciones en la industria alimentaria
Las industrias alimentarias constituyen hoy en día el más amplio campo de
aplicación de los procesos enzimáticos, a excepción del uso de proteasas
alcalinas, en la industria de los detergentes. Las razones más importantes para
su utilización son los efectos fisicoquímicos u organolépticos de su acción sobre
los alimentos:
•
•
•
•
•
Disminución de la viscosidad
Mejora de la filtrabilidad
Disminución de la tendencia a la cristalización
Clarificación y estabilización de líquidos con vistas a su conservación
Mejora de la fermentabilidad
127
•
•
•
•
•
Mejora de la estabilidad bacteriológica
Corrección de las deficiencias enzimáticas de origen natural
Mejora de la digestibilidad
Mejora de la textura y las características organolépticas
Aumento del poder edulcorante (Berrueta et al., 1992).
En este momento el principal usuario a nivel mundial, de las enzimas, es la
industria del almidón, especialmente debido al éxito del proceso de obtención
de jarabes de glucosa con el sistema α-amilasa/amiloglucosidasa; éxito que
continuo con la utilización de glucosa isomerasa inmovilizada para la
producción de los jarabes ricos en fructosa; sin embargo, pese al gran
desarrollo internacional, Colombia apenas inicia su exploración.
Casos
similares se observan en el uso de enzimas como antioxidantes (glucosa
oxidasa, superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa y colesterol
oxidasa), las cuales evitan la oxidación espontánea de los alimentos por el
oxígeno atmosférico o disuelto, o bien, en el uso de enzimas para preparados
proteicos, donde se utilizan ampliamente para incrementar el valor y la
disponibilidad de las proteínas. Sin embargo es importante mencionar que
industrias de procesado de pulpas de fruta, cerveza, vinos, fermentaciones
alcohólicas, lácteos, panadería y refinación de azúcar, actualmente presentan
un mercado interesante para el país (González et al., 2000).
Función que cumplen las diferentes enzimas en la industria de
alimentos:
Producto
Aceite
Enzima
Celulasa y
pectinasa
Alginatos
Celulasas
Carne tierna
Papaína o
bromelina
Cerveza
Proteasas
microbianas
Amilasas
Edulcorantes
Amilasas
Glucoamilasas
Celulasas
128
Función
Hidrolizan la celulosa y la pectina.
⇒ aumentan el rendimiento durante la
extracción.
Rompen el tejido de la pared celular de las algas
marinas.
⇒ aumentan la extracción de alginato.
Hidrólisis de proteínas.
⇒ ablandan la carne y sirve para elaborar
salsas.
Hidrólisis de proteínas solubles.
⇒ evitan la opacidad de la cerveza durante el
enfriamiento.
Rompe el almidón hasta azúcares solubles.
⇒ aumentan la producción de alcohol.
Rompen los enlaces α-(1,4) internos del almidón.
⇒ producen dextrinas.
Rompen los enlaces α-(1,4) externos del almidón.
⇒ producen glucosa.
Rompen los enlaces β-(1,4) internos de la celulosa.
⇒ producen glucosa.
Hidrolizan la celulosa
⇒ liberan azúcar fermentable y productos
nitrogenados.
Frutas
Celulasas
Están implicadas en la solubilización de las frutas.
También se emplean en algunos procesos
relacionados como la extracción de pigmentos y
pectinas presentes en la piel de la fruta.
Hidrolizan el gluten de la masa
Pan
Proteinasas
⇒ controlan la viscosidad durante la
manipulación e incrementan la textura y
apariencia final.
Amilasas
Rompen los almidones liberando azúcares reductores
⇒ Promociona las reacciones de Maillard.
Productos no Proteinasas
Hidrólisis de la gelatina.
gelificados
⇒ evita la gelificación posterior de los
productos.
Queso
Quimosina
Precipita la caseína.
Lipasas
Hidrolizan el componente graso lácteo,
proporcionando cambios característicos en el sabor.
⇒ se acelera la maduración de los quesos.
Vinos y
Pectinasas y
Reducen la viscosidad o liberan pulpa
Zumos de
amilasas
⇒ mejoran la clarificación y filtrabilidad.
frutas
aumentan la productividad.
1
Ensilado:
Es un producto para alimentación animal que se obtiene de la
fermentación de la hierba.
Ensilado1
Celulasas
Además, la hidrólisis enzimática presenta indudables ventajas frente a la
tradicional hidrólisis química, ácida o alcalina, entre las que cabe mencionar las
siguientes:
1. Selectividad: las enzimas son específicas para un tipo determinado de
enlace y, por tanto, no es frecuente la aparición de productos de
degradación. En cambio, la poca selectividad de los ataques ácido y básico
y su difícil control conduce inevitablemente a la aparición de productos de
degradación que pueden llegar a ser tóxicos.
2. Condiciones moderadas de temperatura y pH: la hidrólisis enzimática
transcurre a temperaturas próximas a la ambiente, generalmente en el
intervalo de 40 a 60ºC, y pH comprendido entre 4 - 8.
3. No se añaden sustancias extrañas: salvo la enzima. Evidentemente no
es así en los procesos de hidrólisis química, ya que la necesaria
neutralización posterior eleva considerablemente el contenido en sales.
4. Se mantiene el valor nutritivo: ya que no se produce degradación de
los componentes separados, mientras que en la hidrólisis alcalina de
proteínas se suelen destruir los aminoácidos arginina y cisteína y en la
129
hidrólisis ácida se destruye el triptófano, que es un aminoácido esencial para
el hombre.
No obstante, en la hidrólisis enzimática es necesario separar o desnaturalizar la
enzima, sobre todo en el caso de las proteasas, y trabajar en condiciones
asépticas, ya que por ser un proceso relativamente lento, puede producirse
contaminación microbiana de la mezcla reaccionante.
Sin embargo, la
desnaturalización térmica de las enzimas o su separación por ultrafiltración son
temas resueltos por la tecnología actual y la necesidad de asepsia es una
característica general de la industria alimentaria (Camacho et al., 1992).
Tratamiento de los residuos
La creciente conciencia medioambiental ha llevado consigo una intensificación
de la investigación sobre tecnologías alternativas limpias. Muchos creen que la
tecnología enzimática podrá facilitar algunas de estas alternativas,
reemplazando gradualmente procesos industriales químicos. Esta tendencia ya
es clara. Un ejemplo es el procesado de almidón donde las enzimas han
sustituido casi completamente los ácidos agresivos y las altas temperaturas
utilizadas para degradar el almidón (Novo Nordisk, 1988).
De otro lado, existen numerosas industrias de procesamiento de alimentos que
generan residuos poliméricos complejos, mismos que deben ser tratados para
incrementar su posterior degradación microbiológica.
Actividad industrial
Material de
residuo
Enzima a utilizar
Pan, harina
Papel, madera
Matadero, carnicería,
vaquería, aves de corral,
cuero, gelatina
Matadero, carnicería
almidón
Celulosa
Proteínas
α-amilasa
Celulasa
Proteasas
Grasas
Aves de corral, vaquería,
procesamiento de pescado,
procesamiento de semillas,
alimentos con cereales,
compuestos alimentarios
terminados
Industrias cuyos efluentes
Aceites
Lipasas asociadas con cultivos
bacterianos para eliminar los
depósitos de grasa procedentes
de las paredes de las tuberías
que transportan el efluente
Lipasas
Fenoles y aminas
Peroxidasa
130
presentan fenoles y aminas
aromáticas
aromáticas
Así por ejemplo, las semillas de uvas constituyen un importante subproducto
de la vinificación y de las industrias alcoholeras (2-4% del peso total de las
uvas), tienen un aprovechamiento posterior muy bajo en la elaboración de
abonos, sin embargo la mayor parte de ellas son quemadas, pese a presentar
un alto contenido de proteína y de aceite. La proteína, aunque deficitaria en
aminoácidos azufrados y lisina, contiene todos los aminoácidos esenciales. El
aceite presenta propiedades como elevado contenido de ádico linoleico, ácido
graso esencial en la dieta humana; ausencia de linolénico que le confiere alta
estabilidad, favorecida aun más por la presencia de tocoferol, que lo protege
de la oxidación; bajo contenido en ácidos grasos saturados; una digestibilidad
similar a la del aceite de oliva crudo y menos calorías que el aceite de semilla
convencional. Todas estas propiedades, junto con su agradable olor y sabor,
lo hacen adecuado para consumo crudo en alimentación. Debido a su color
claro y limpio se utiliza también para corregir el color de aceites de otras
semillas. Ahora bien, dado que la pepita de uva no es una oleaginosa típica,
su preparación es fundamental y precisa de un grado de molturación mayor
que otras oleaginosas como soja o girasol, debido al elevado grosor y dureza
de la cubierta. Así, las etapas empleadas para la obtención del aceite por el
procedimiento convencional consisten en clasificar la materia prima procedente
de las bodegas o destilerías, separando el bagazo de los granos de uva por un
proceso de lavado, secado y tamizado. La extracción del aceite puede hacerse
por los métodos clásicos o bien utilizando enzimas; con este último método se
aumenta sensiblemente el rendimiento de extracción y el ataque enzimático
separa de las paredes celulares el aceite de las proteínas, eliminando
sustancias no deseadas y evitando el uso de temperaturas altas. Por tanto,
además del aceite se extrae como en los procesos convencionales, una harina
comestible rica en proteínas o si se concentra, un producto proteico más puro
(Rodríguez et al., 1997).
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Causas del Descenso del Flujo.
Alimentación, Equipos y
Tecnología. Editorial Alción, S. A. Año XV. No. 10. Diciembre. 1996.
TRABAJO DE COMPLEMENTACIÓN
1. Consiga la ficha técnica de una enzima comercial e indique, nombre
común, sinónimos, organismos de donde proviene, especificaciones
del producto, condiciones de almacenamiento, condiciones de
seguridad, precauciones de manejo, comportamiento de la enzima
frente a la temperatura y al pH, inhibidores, aplicaciones.
2. De la gran variedad de enzimas disponibles, seleccione una que sea
de interés para usted, de las usadas en la industria de alimentos
(procesamiento de alimentos) y realice la revisión bibliográfica
correspondiente, elaborando un documento donde muestre fuente,
clasificación, estructura, procesos de obtención industrial (si los
tiene), presentación, tipo de reacción que cataliza, forma de acción
sobre el sustrato, productos que origina y aplicaciones.
3. Teniendo en cuenta que en el proceso de elaboración de una masa,
la actividad enzimática se inicia tan pronto como se añade el agua
a la harina: a.- Esquematice mediante una reacción actividad
133
amilolítica. b.- Describa el efecto de la dextrina y el almidón roto
en el desarrollo de la masa. c.- Explique los efectos de la
producción de maltosa en la fermentación de la masa. d.- Estudie
el comportamiento de la actividad amilolítica durante el proceso de
cocción.
4. Discuta la siguiente afirmación:
“El enzima parcialmente
purificado (después de la cromatografía de interacción hidrofóbica
sobre Phenyl Sepharose) ha sido inmovilizado covalentemente
sobre Nylon 6 (Portex Ltd., Hythe, Kent, Reino Unido) según el
método descrito por Hornby & Goldstein (1976). El soporte se
activa por hidrólisis controlada con HCl y los grupos NH2 liberados
del nylon se acoplan a la enzima a través de reactivos bifuncionales
como el glutaraldehído”.
5. En la actualidad se puede obtener quimosina pura para la
fabricación de queso a partir de levaduras modificadas
genéticamente, explique cómo.
134
LECCION TRECE
Y que yo jamás me olvide de
que la lucha por un mundo
mejor es una lucha de amor.
Michel Quoist
LOS MICROORGANISMOS
Teniendo en cuenta que Louis Pasteur en 1872 sentó las bases de la
microbiología e identificó a los microorganismos como responsables de
cambios tanto deseables como indeseables en los alimentos y que desde
entonces, se han catalogado más de 3500 alimentos tradicionales fermentados
cuyo procesamiento y preservación ha sido más segura y confiable (Madden,
2000)
TEMATICA
1. Los microorganismos y su tecnología
2. Tecnología de fermentación
135
1. TERMODINÁMICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Sistema termodinámico: Una reacción química, una célula o un organismo
completo.
Entorno del sistema: Todo aquello que no sea parte del sistema definido.
La primera ley de la termodinámica establece que la energía del universo,
esto es, el sistema más su entorno, es constante.
Dentro de un sistema dado son posibles cambios netos de energía, así:
1. La energía absorbida en la reacción directa es exactamente igual a la
energía liberada en la reacción inversa.
2. El cambio de energía interna del sistema, ∆E, antes y después del proceso
se puede expresar como: ∆E = q - w donde q se define como el calor que
el sistema absorbe de su entorno y w se define como el trabajo hecho por el
sistema sobre su entorno. En términos matemáticos, el trabajo se puede
definir como: w = P∆V + w’ donde P es igual a la presión, ∆V es el cambio
en el volumen que tiene lugar durante el proceso y w’ representa el trabajo
diferente al trabajo de presión-volumen. Para la mayor parte de estas
reacciones, w’ = 0. Dada esta restricción, al sustituir la segunda ecuación
en la primera y reacomodando se tiene: qp = ∆E + P∆V donde qp es el calor
absorbido a una presión constante. Como cualquier combinación de las
funciones de estado debe ser también una función de estado, qp es por
consiguiente una función de estado, que se denomina el cambio de
entalpía (∆H): ∆H = ∆E + P∆V. En los sistemas biológicos, el volumen
permanece prácticamente constante. Así, ∆H y ∆E son equivalentes
efectivamente.
Proceso exotérmico: Proceso en el cual el sistema desprende calor y ese
calor pasa al entorno. El ∆H es negativo.
Proceso endotérmico: Proceso en el cual el calor es absorbido por el
sistema a partir de su entorno. El ∆H es positivo.
El criterio para espontaneidad se encuentra en la segunda ley de la
termodinámica. Ella establece que en todo proceso espontáneo, la entropía
(S) del universo (el sistema más su entorno) se incrementa. En los sistemas
metabólicos, las fuerzas de la entropía son contrarrestadas por los procesos
celulares creadores de orden. Las vías metabólicas existen en un estado
estable que está lejos del estado de equilibrio. Así, por ejemplo:
A
136
B
C
Si se considera que no hay otros reactantes, sólo B en este sistema puede
estar en un estado estable. El estado estable ocurrirá si la velocidad de
formación de B a partir de A es igual a la velocidad de utilización de B para
formar C. Con el tiempo, la concentración de B en un estado estable no
cambiará, pero A se puede agotar, y C se puede acumular. Entonces, la
concentración de B es mantenida a expensas del cambio continuo en las
concentraciones de A y C.
Un criterio útil para estimar la espontaneidad de los procesos fue desarrollado
por J. Willard Gibbs. La nueva función de estado, denominada el cambio de
energía libre de Gibbs (∆G), se define en términos de H y S para los procesos
que tienen lugar a presión constante y es una medida de la energía disponible
para trabajar dentro de un sistema:
∆G = ∆H - T∆S
donde T es la temperatura absoluta y ∆G se expresa en unidades de Kcal/mol.
Procesos exergónicos: ∆G < 0. El proceso es espontáneo y se puede llevar
a cabo en ausencia de energía proporcionada por el exterior del sistema.
Procesos endergónicos: ∆G > 0. El proceso no puede tener lugar
espontáneamente, requiere del suministro de suficiente energía externa.
Proceso en equilibrio: ∆G = 0. Las concentraciones de los reactantes y de
los productos están en equilibrio y las velocidades de las reacciones en ambos
sentidos son iguales.
El cambio de energía libre de una reacción depende de las condiciones bajo
las cuales se efectúa la reacción. Por consiguiente, es útil tener un conjunto
de condiciones de reacción de referencia establecidas en forma convencional.
Estas condiciones de referencia se conocen como estado estándar (∆Gº’).
Para una reacción, el cambio de energía libre se puede calcular como
sigue:
∆G reacción = ΣG productos - ΣG reactantes
Cuando el sistema se encuentra en equilibrio:
∆Gº’reacción = -2.303 RT log Keq
Si se conoce ∆Gº’ para la reacción, la ecuación permite calcular Keq y
viceversa.
Para una reacción que no está en equilibrio:
137
Se observa una relación diferente de productos a sustratos (Q) y el cambio de
energía libre se deriva de:
∆G = ∆Gº’ + 2.303 RT log Q
donde Q es la relación de acción de masas.
En otras palabras, el cambio de energía libre es una medida de lo lejos que
está el sistema que reacciona del equilibrio. En consecuencia, es ∆G y no
∆Gº’, el criterio para evaluar la espontaneidad de una reacción y por
consiguiente su dirección dentro de un sistema en particular.
Entonces, las reacciones metabólicas se pueden dividir en:
1. Reacciones cerca del equilibrio: Reacciones en las cuales Q tiende a Keq.
Las enzimas que catalizan las reacciones cerca del equilibrio son capaces
de restablecer con rapidez los niveles de sustratos y productos a estados
cercanos al equilibrio debido a la gran actividad enzimática que existe.
2. Reacciones metabólicas irreversibles: Reacciones en las cuales Q esta
lejos de Keq. En las células las enzimas que catalizan las reacciones
metabólicas irreversibles existen en cantidades limitantes, insuficientes para
lograr estados cercanos al equilibrio para estas reacciones. Todos los
puntos de control de las vías son reacciones metabólicamente irreversibles
(Horton et al., 1995).
Proyecte sus conocimientos discutiendo la siguiente afirmación: “La
producción de calor en sistemas biológicos es usada como parámetro
energético característico del crecimiento y puede utilizarse para calcular
el crecimiento empleando el balance de entalpía”.
1. ¿Cuáles son los intervalos de temperatura a los cuales se
desarrollan los microorganismos psicrofílicos, mosofílicos y
termofílicos?
2. ¿Qué significa crecimiento balanceado y en qué etapa de
crecimiento es más probable que se presente?
3. ¿Cómo las células, en un cultivo estacionario, reciben oxígeno?
4. ¿Qué factores limitan la altura de un biorreactor?
2. Algunos productos industriales (diferentes a los antibióticos)
producidos por bacterias son:
Producto
Butanol-acetona
138
Microorganismo
Clostridium
Usos
Solventes, manufactura
acetobutylicum y otros.
2,3-butanodiol
Dihidroxiacetona
Bacillus polimixa,
Ent. aerogenes
Gluconobacter
suboxydans
química
Solvente, humectante,
intermediario químico
Químico fino
Ácido 2-cetoglucónico
Pseudomonas sp.
Intermediario para el
ácido D-arabo-ascórbico
G. suboxydans
Intermediaria para el
ácido tartárico
Lactobacillus delbrueckii
Productos alimenticios,
textiles y lavanderías,
manufactura química,
curtido de pieles
Ácido 5-cetoglucónico
Ácido láctico
Amilasa bacteriana
Bacillus subtilis
Modificador de almidones,
encolado de papel;
desencolado de textiles
Proteasa bacteriana
B. subtilis
Dextrán
Leuconostoc
mesenteroides
Laminado de pieles,
desencolado de fibras,
quita manchas,
ablandador de carnes
Estabilizador de productos
alimenticios, sustituto de
plasma sanguíneo
Sorbosa
G. suboxydans
Manufactura de ácido
ascórbico
Cobalamina
Ácido glutámico
Streptomyces olivaceus:
Propionibacterium
freudenreichii
Brevibacterium sp.
Tratamiento de la anemia
perniciosa; suplemento
alimenticio
Micrococcus glutamicus
Aditivo de alimentos
Lisina
Estreptoquinasaestreptodornasa
Streptococcus
hemolyticus
139
Aditivo de la alimentación
animal
Uso médico (disolvente de
coágulos sanguíneos)
Fuente: Pelczar et al., 1990
140
Algunos productos industriales producidos por levaduras son:
Producto Microorganism
Método de preparación
o
Cerveza S. cerevisiae o
Cebada, malta y almidones
S. carisbergensis juntos mezclados con agua
caliente; después de la
conversión enzimática del
almidón, la cerveza nueva se
filtra; luego se hierve con
lúpulo y finalmente se
fermenta con levadura
Ron
Se añaden como alimentos
S. cerevisiae u
otras levaduras melazas que contengan 12 14% de azúcar fermentable;
sulfato de amonio y
ocasionalmente fosfatos; se
destila después de la
fermentación
La masa de granos
Whisky
S. cerevisiae
cocinados se sacarifica con
escocés (generalmente
malta tratada con carbón y
levadura
se fermenta; la tanda
especial)
destilada y el destilado se
añejan en barricas de roble
durante 3 años por lo
menos; después se mezclan
con whisky en grano
Bourbon S. cerevisiae
La masa de granos
compuesta de maíz (al
menos 51%); generalmente
136
Factores que influyen en
la reacción
Aerobiosis en los estados
primarios, pero pronto se
hace anaeróbico, temp. 8 12ºC, pH al principio 5.0 5.4; al final 4.0 - 4.8; la
fermentación primaria por lo
menos 5-9 días
Función de los
microorganismos
Transforma azúcar en
alcohol y dióxido de
carbono; produce cambios
en las proteínas y otros
constituyentes menores que
modifican el sabor
Transforma azúcar en
pH óptimo = 4.0 - 4.7
T inicial = 21ºC elevándola a alcohol, el cual se obtiene
después por destilación
la T final de 35.5ºC;
fermentación por lo menos 3
- 7 días
pH óptimo = 4.0 - 5.0
T inicial = 26ºC
la fermentación se completa
en 72 hs
Produce alcohol y
sustancias congéneres
(ácidos, ésteres, varios
alcoholes) que con la malta
carbonosa dan el
característico sabor del
whisky escocés
Lo mismo que para el
whisky escocés
Lo mismo que para el
whisky escocés, pero el
sabor es el característico
Vino
137
S. ellipsoideus,
varias cepas
se fermenta con centeno
cocido y se sacarifica con
malta, se destila entre 110 y
130 grados, se madura en
barricas de centeno
carbonoso
Las uvas deben tener
concentración de azúcar
superior al 22%; al licor se le
agrega sulfito par reducir el
índice de fermentación; se
deja fermentar con cepas
especiales de levaduras, o
con las levaduras que
existen en las uvas en forma
natural; a la fermentación
primaria sigue un periodo de
almacenaje para maduración
del bourbon
Aerobiosis en los estadios
iniciales, pero
principalmente anaerobiosis
después
T inferior a 29.4ºC, pero
varía de acuerdo con las
condiciones locales, cepa
de levadura y tipo de vino;
la fermentación dura 7-11
días
Transforma el azúcar en
alcohol y también produce
cambios en los
componentes menores que
modifican el sabor y
bouquet; la cantidad de
alcohol varía según el tipo
de vino
Los hongos se usan para elaborar antibióticos, algunos productos alimenticios,
en la industria química y en la obtención de enzimas.
Algunos productos industriales (diferentes a los antibióticos) producidos
por hongos son:
Producto
Ácido cítrico
Microorganismo
Aspergillus niger o A.
wentii
Usos
Productos alimenticios,
citratos medicinales, en
sangre para
transfusiones
Rhizopus nigricans
Manufactura de resinas
alquídicas, agentes
humectantes
A. niger
Productos
farmacéuticos, textiles,
curtido de cueros,
fotografía
Ácido fumárico
Ácido glucónico
Ácido itacónico
A. terreus
Manufactura de resinas
alquídicas, agentes
humectantes
Pectinasas
A. wentii o A. aureus
11-γ-hidroxiprogesterona
R. arrhizus, R. nigricans
y otros
Agentes clarificantes en
la industria de jugos de
frutas
Intermediario para 17-γhidroxicorticoesterona
Ácido giberélico
Fusarium moniliforme
Guarnición de frutas,
producción de semillas
Ácido láctico
R. oryzae
Alimentos y productos
farmacéuticos
Fuente: Pelczar et al., 1990
Para ampliar su conocimiento sobre el uso de microorganismos a nivel
industrial.
1. Busque en una revista especializada, un artículo, que corresponda a la
elaboración de cualquiera de los productos anteriores y en él analice la
96
estructura del texto, determine la finalidad del documento y subraye
las partes importantes.
97
LECCION CATORCE
Y que yo jamás me olvide de
que la lucha por un mundo
mejor es una lucha de amor.
Michel Quoist
98
LOS MICROORGANISMOS Y SU TECNOLOGÍA
Introducción
Teniendo en cuenta que Louis Pasteur en 1872 sentó las bases de la
microbiología e identificó a los microorganismos como responsables de cambios
tanto deseables como indeseables en los alimentos y que desde entonces, se
han catalogado más de 3500 alimentos intracelularm fermentados cuyo
procesamiento y preservación ha sido más segura y confiable (Madden, 2000),
la presente unidad estudia los microorganismos y su tecnología, es decir, está
orientada a la
ntracelularme, cultivo y
ntracelul de microorganismos o
metabolitos.
Objetivo
Al terminar la unidad el ntracelula debe estar en capacidad de identificar los
factores que afectan el crecimiento microbiano; de reseñar los diferentes
modelos que lo describen; de diseñar, seleccionar, adecuar y optimizar los
medios de cultivo propios para el aislamiento y desarrollo de microorganismos;
de describir las rutas metabólicas que originan diferentes productos de
ntracelular, así como de definir los parámetros a controlar en un proceso
fermentativo.
Contenido
Los microorganismos y su tecnología
Tecnología de ntracelular
Bibliografía de apoyo
Bibliografía
Trabajo de complementación
Bibliografía recomendada
1. Andrews, G. F. The Yield Equiations in the Modeling and Control of
Bioprocesses. Biotechnology and Bioengineering. Vol. 42. John Wiley and
Sons, Inc. 1993.
2. Behrentz, E. Y Giraldo, E. Modelación a Escala del Proceso de Compostaje
Aerobio, en Pila Estática y con
ntracelu forzada. Desarrollo Teórico e
Implementación de Laboratorio. Revista Colombiana de Biotecnología.
Santafé de Bogotá, D. C. Vol II. No. 2. Junio, 1999. pp. 51 – 59.
99
3. Horton, Robert; Moran, Laurence; Ochs, Raymond; Rawn, David y
Scrimgeour, Gray. Bioquímica. Prentice-Hall Hispanoamericana, S. A.
México. 1995
4. Montoya, D.; Siera, J.; Silva, E.; ntracel, G.; y Ramos, J. Optimización de
un Medio de Cultivo Industrial para la
ntracelular acetobutílica (ABE).
Revista Colombiana de Biotecnología. Santafé de Bogotá, D. C. Vol. II. No.
2. Junio, 1999. pp. 37 – 42.
5. Scragg. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas Biológicos en Procesos
Tecnológicos.
ntracelu Limusa, S. A. Grupo Noriega Editores. México.
1996.
TUS COMPROMISOS
Para abordar el capítulo
Con el grupo
Saber como funcionan los
multiplicadores de Lagrange
Presentar la técnica para
determinar experimentalmente
biomasa por el método de:
Copiar del artículo de Montoya et al.,
1999; relacionado en la bibliografía
recomendada
Copiar del artículo de Behrentz et al.,
1999; relacionado en la bibliografía
recomendada
•
•
•
•
•
•
Peso seco
Proteína de Biuret
DNA
Proteína (Foling)
Opacidad
Conteo celular
Para aprender a aprender
• Establecer contacto con las cosas e ideas
• Comprender los fenómenos y textos
• Planear las acciones y solucionar los
problemas por sí mismos.
100
Los microorganismos fueron descubiertos en el siglo XVII. A continuación, van
Leeuwenhoek y los microscopistas que le sucedieron encontraron miríadas de
pequeños organismos con características que no correspondían a ninguno de
los dos reinos conocidos hasta entonces (Kimball, 1982). En 1797, Edward
Jenner inoculó a modo de vacuna gotas de pus de personas contagiadas con
viruela. Más tarde Pasteur realizó sus trabajos sobre microbiología y éstos
pueden clasificarse en tres series:
1. Toda fermentación se relaciona con el desarrollo de un microorganismo.
2. Toda enfermedad infecciosa resulta del desarrollo en el organismo de un
microbio especial.
3. El microorganismo de una enfermedad infecciosa, cultivado en condiciones
determinadas, se halla atenuado en su actividad nociva.
Cada una con consecuencias prácticas. El primero, proporcionó reglas para la
fermentación del vinagre y la cerveza, mostrando cómo es posible preservarlos
de la acción de microorganismos extraños que los alteran. El segundo, indicó
las normas para resguardar los ganados de las contaminaciones del carbunco2,
que causaba pérdidas inmensas en caballos, ovejas y vacas; además, abrió el
camino a la cirugía aséptica, llevando al desaparecimiento de las erisipelas y de
las acciones purulentas que en otro tiempo causaban frecuentemente la
muerte, como resultado de las operaciones. El último, condujo a las vacunas
(F.T.D., 1962).
La fermentación, conocida desde los tiempos más antiguos, se
mantuvo como un fenómeno inexplicable hasta el siglo XIX; gracias
especialmente a los trabajos de Cagniard de Latour y Schwann, de
Turpin, de Schröder, de Liebig, de Pasteur, de Nägeli, de Cohn, de De
Bary, de Düclaux y de Buchner entre otros. Para visualizar el
contorno histórico, profundice sobre la vida de uno de ellos.
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NOMBRES CIENTÍFICOS
El nombre científico de cada especie consta de dos partes. La primera es el
nombre del género al cual pertenece el organismo; la segunda es el “nombre
2
Ántrax
101
específico” e identifica la especie particular dentro del género. Ambas se
escriben en latín o utilizando palabras nuevas a las que se les da forma latina3,
en cursiva y con las letras del alfabeto romano, iniciando el nombre genérico
con mayúscula. Ocasionalmente se incluye en el nombre científico una tercera
palabra latinizada y escrita en letra cursiva, referente al nombre de la
subespecie y sirve para distinguir una forma particular o local de la especie
respecto de otras formas de la misma especie. En otras ocasiones, se
encuentra después del nombre científico, escrito sin cursiva, un nombre o una
inicial, que corresponde al nombre o a la inicial del taxónomo que acuñó el
nombre científico (Kimball, 1982).
Para facilitar la comprensión de lectura, ¿A qué se refiere la literatura
cuando
habla
de
las
formas
sp.
y
spp.?
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TAXONOMÍA DE LOS MICROORGANISMOS
El biólogo alemán Haeckel, hace más o menos cien años, sugirió crear el reino
protista, para incluir todos aquellos organismos que no encajaban dentro de
los reinos animal y vegetal; sin embargo como este artificio no explicaba las
propiedades de las bacterias procarióticas, las algas azul-verdosas y los
hongos, se comenzó a hablar de los reinos fungi y monera. De otro lado, el
naturalista sueco Carolus Linaeus (Linneo) apreció los aspectos
verdaderamente significativos en los cuales difieren o se parecen los
organismos, dando origen al sistema moderno de clasificación, basado en la
homología (Kimball, 1982).
La clasificación de los organismos tiene dos finalidades:
1. Descriptiva: agrupa organismos de la misma clase y describe la base para
este agrupamiento
2. Filogenética: hace que los sucesivos taxones (niveles de ordenación) en
un árbol familiar jerárquico (especie, género, familia, tribu, orden) apunten
hacia líneas de reflexión de la descendencia evolutiva
Para identificar un organismo desconocido y relacionarlo con organismos
previamente descritos, el taxonomista tiene que confiar en las siguientes
3
El género se escribe como sustantivo, la especie como adjetivo.
102
propiedades: rasgos visibles (forma, tamaño, color, tinción, movilidad, cápsula
y morfología colonial); formación de productos químicos característicos;
nutrición (con inclusión tanto de las necesidades de crecimiento como de la
capacidad para utilizar diversos alimentos); presencia de macromoléculas
superficiales características (detectadas por lo general inmunológicamente);
hábitat (con inclusión de la capacidad de parasitar organismos superiores y
causar enfermedad); patrones flagelares; vías productoras de energía y
composición química (especialmente del peptidoglucano y los lípidos totales
analizados por cromatografía gas-líquido); secuencias de ácidos nucleicos, y
diferencias en los mecanismos reguladores de sus vías biosintéticas (González,
2000).
Antes de continuar revise el origen griego o latino de las siguientes
palabras, esto facilitará el manejo del vocabulario:
Palabra
Cocos
Bacilos
Vibriones
Espirilos
Espiroquetas
Patógeno
Parásitos
Toxinas
Origen
Griego
Latino
Vocablo
kokkos
bacilus
Latino
Griego
Griego
Griego
Griego
Griego
spirula
speira
pathos
para
sitios
toxikon
Definición
Procariotes
Poseen sólo un cromosoma, al cual no se hallan asociadas histonas y se
clasifican en el reino monera.
Reino
Fílum
Schizomycetes (bacterias)
Monera
Cyanophita (algas azul -verdosas)
Bacterias: Las células se hallan encerradas en una pared celular. Según su
especie pueden ser esféricas (cocos), en forma de bastón (bacilos) o en
espiral (espirilos) y se organizan en pares, racimos, cadenas o filamentos. Se
reproducen por división directa, es decir por estrangulación, pero si les falta
alimento, la mayoría de ellas presenta esporulación.
La clasificación de las bacterias se halla en continuo proceso de revisión:
103
Bacterias
Fotosintéticas
Características
Usan la energía del sol para reducir el CO2 a carbohidrato.
La fuente de electrones nunca es el agua, las sulfurosas
púrpuras sulfurosas
utilizan H2 S. Contienen formas especiales de clorofila.
La mayoría son organismos anaerobios.
verdes sulfurosas
Quimioautotróficas
Son incoloras, comparten la capacidad de manufacturar
carbohidratos a partir de materiales inorgánicos, pero no
sulfurosas, ferrosas,
utilizan la energía lumínica sino que oxidan una sustancia
nitrificantes
del medio para producirla.
Gram positivas
Pueden ser bacilos o cocos.
Gram negativas
Pueden ser bacilos, cocos o espirilos.
Espirilos Poseen pared celular rígida, forma helicoidad y movilidad.
Actinomicetos
Crecen en forma de filamentos delgados.
Son los microorganismos dominantes del suelo, degradan
restos orgánicos y son fuente de antibióticos.
Micobacterias Microorganismos afines a los actinomicetos, resisten los
ácidos.
Corinebacterias Microorganismos afines a los actinomicetos.
Espiroquetas
Forma helicoidal, alargadas, delgadas y con longitudes que
van desde unas pocos µm hasta 500 µm. Tienen pared
celular menos rígida que la de los espirilos, son móviles.
Micoplasmas
Inmóviles, diminutas (0.1 µm), sin pared celular. Algunas
son de vida libre, otras parasitan en organismos superiores.
Rickettsias y
Pequeñas (1µm o menos), casi todas parásitos intracelulares
clamidias
obligatorios que probablemente dependen de la célula
huésped para tener buen suministro de coenzimas.
Deslizantes
Se deslizan sobre el sustrato, muchas son unicelulares, otras
forman filamentos (se parecen mucho a las algas verdeazules, no son fotosintéticas). La mayoría son heterótrofas;
pocas son quimioautótrofas.
Fuente: Kimball, 1982.
En biotecnología se trabaja mucho con bacterias, familiarícese
entonces con una de las siguientes: Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Bacillus thurigiensis, Lactobacillus bulgaricus, Corynebacterium
diphtheriae, Clostridium acetobutylicum, Clostridium tetani.
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________________________________________________________________
________________________________________________________________
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104
Describa el procedimiento seguido para identificar cuando una
bacteria es gram positiva o gram negativa
105
LECCIÓN QUINCE
LAS BACTERIAS
EUBACTERIAS GRAM POSITIVAS
Características distintivas
Familia
Cocos
Inmóviles
Forman agrupaciones cúbicas, organizadas
irregularmente.
Organizados en cadenas, presentan
fermentación láctica de los azúcares
Bacilos rectos
Inmóviles
Fermentación láctica o propiónica de los
azúcares.
Oxidativa, débilmente fermentativa.
Móviles, con flagelos perítricos y
formas inmóviles relacionadas
producen endosporas y pueden ser:
Aerobias
Anaerobias
Fuente: Davis et al., 1989
Género
Micrococáceas
Sarcina
Micrococcus
Staphylococcus
Streptococáceas
Streptococcus
Leuconostoc
Lactobaciláceas
Propionibacteriáceas
Lactobacillus
Propionobacter
corynebacter
Baciláceas
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Características distintivas
Familia
Bacillus
Clostridium
Género
Cocos
Casi todos permanentemente inmóviles,
Aerobios Neisseriáceas
Anaerobios
Bacilos rectos
Móviles, con flagelos perítricos y formas
inmóviles relacionadas
Anaerobios facultativos
Fermentación ácida mixta de azúcares.
106
Neisseria
Veillonella
Brucella
Pasteurella
Hemophilus
Bordetella
Enterobacteriáceas Escherichia
Erwinia
Shigella
Salmonella
Proteus
Yersenia
Bruceláceas
Aerobios
Fermentación butilenglicólica de los azúcares.
Enterobacteriáceas
Fijadores libres de nitrógeno.
Azobacteriáceas
Fijadores simbióticos de nitrógeno.
Rhizobiáceas
Móviles, con flagelos polares.
Aerobios
Oxidan compuestos inorgánicos.
Nitrobacteriáceas
Oxidan compuestos orgánicos
Pseudomonáceas
Enterobacter
Serratia
Azotobacter
Rhizobium
Nitrosomonas
Nitrobacter
Thiobacillus
Pseudomonas
Acetobacter
Bacilos curvos
Espiriláceas
Photobacterium
Zymomonas
Aeromonas
Vibrio
Desulfovibrio
Spirillum
Fuente: Davis et al., 1989
Orden
Actinomicetales
OTROS GRUPOS IMPORTANTES DE BACTERIAS
Familia
Género
Mycobacterium
Actinomyces
Nocardia
Streptomyces
Treponema
Borrelia
Leptospira
Spirocheta
Spiroquetales
1
Micoplasmatáceas
Mycoplasma
Rickettsiáceas
Rickettsia
Coxiella
Clamidiáceas1
Chlamydia
Bartoneláceas2
Bartonella
Son fácilmente filtrables.
2
Parásitos intracelulares, que limitan con los protozoos.
Fuente: Davis et al., 1989
107
El enfoque antes descrito ordena las bacterias en términos de rasgos
fenotípicos. Sin embargo, el crecimiento de la genética molecular proporciona
una base cuantitativa precisa para definir la afinidad biológica, ya que al
diferenciarse los organismos en la evolución, a través de la acumulación de
mutaciones, sus genes difieren no solamente en sus productos sino también en
las secuencias de sus bases.
De otro lado, algunos investigadores, con ayuda del computador y para evitar
la arbitrariedad de los caracteres, han revivido un intento taxonómico
introducido en el siglo XVIII por el biólogo francés Adanson. En este sistema
se determina un gran número de caracteres para cada una de las cepas y se
establecen los grupos basándose en la proporción de caracteres presentados,
sin que ningún carácter tenga más importancia que otro.
Algas azul-verdosas: Son fotosintéticas, poseen clorofila a (la misma
molécula encontrada en las plantas y en otras algas), utilizan agua como
fuente de electrones para reducir el bióxido de carbono a carbohidratos.
Luz
(CH2O)n + H2O + O2
CO2 + 2H2O
Dos eucariotes: protistos y hongos
Protistos: Fueron los primeros organismos eucarióticos en evolucionar y en
ningún caso presentan el desarrollo de tejidos especializados propios de las
plantas y los animales (Kimball, 1982).
Reino
1
2
Protista
Clasificación
Fílum
Características
1
Protozoos
Sarcodina (rizopos)
Movimiento por seudópodos
Mastigophora (flagelados)
Movimiento por flagelos
Ciliophora (ciliados)
Movimiento por cilios
Sporozoa (esporozoos)
Parásitos sin locomoción
Algas2
Rhodophyta (algas rojas)
Propias de aguas marinas
Pyrrophyta (dinoflagelados)
Reserva nutritiva: almidón
Euglenophyta (euglenofitos)
Unicelulares con flagelos
Chlorophyta (algas verdes)
Con pared rígida de celulosa
3
Chrysophyta (algas doradas) Unicelulares con flagelos
Phaeophyta (algas pardas)
Propias de aguas marinas
4
Hongos
Myxomycetes
Producen mucílago
(mucilaginosos)
Protozoos: La palabra protozoo ya no es un término taxonómico formal sino un nombre
común para unas 30.000 especies de organismos pequeños, unicelulares, desprovistos de
clorofila, que se clasifican de acuerdo con el modo de locomoción.
Algas: Tampoco corresponde a un término taxonómico formal, pero es el nombre común
para designar un gran número de organismos simples que contienen clorofila.
108
3
4
A este fílum pertenecen las algas diatomeas, sin embargo gracias a la homogeneidad del
grupo hay quienes las ubican en el fílum Bacillariophyta.
Hay quienes separan los hongos plasmodiales del mucílaco en un fílum (Myxomycetes) y los
hongos celulares del mucílago en otro fílum (Acrasiomycetes).
Actualmente hay especies de microalgas cultivadas comercialmente,
tales como: Dunaliella, Chlorella y Spirulina. Escoja una y consulte
sobre
ella.
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Hongos: Son organismos unicelulares, pluricelulares o dimórficos que carecen
de clorofila y poseen en la mayoría de los casos un talo (cuerpo vegetativo)
filamentoso, constituído por hilos delgados llamados hifas, las cuales crecen
apicalmente y en conjunto integran el micelio. Su reproducción es asexual
y/o sexual pero, por lo general producen esporas.
Reino
Fungi
Fílum
Phycomycetes
Ascomycetes
Basidiomycetes
Deuteromycetes
Clase
Ficomicetos
Ascomicetos
Basidiomicetos
Hongos imperfectos
Cuyas características son:
Clase
Ficomicetos
Ascomicetos
Esporas
Esporas
asexuales
sexuales
Endógenos Estructura
variable
Exógenos
Ascosporas, en
el interior de
sacos o ascas
Micelios
No tabicados
Género o grupo
representativo
Rhizopus, Mucor,
Hongos acuáticos
Tabicados
Neurospora,
Penicillium,
Aspergillus,
levaduras
verdaderas
Basidiomicetos
Exógenos
Basidiosporas,
en la superficie
de los basidios
Tabicados
Mohos
Deuteromicetos
(hongos
imperfectos)
Exógenos
Ausentes
Tabicados
La mayor parte de
los patógenos
humanos
Endógenos: En sacos Exógenos: Al final o en los lados de las hifas
Fuente: Davis et al., 1989
109
Aprenda sobre los hongos comerciales, escoja entre: Lentinus edodes
(Shiitake), Cantharellus cibarius (Rebozuelo o rusiñol), Lactarius
deliciosus (Rovellón), Clavaria botrytis (Pie de rata), Flamulina
velutipes (Hongo de invierno) y Volvariella volvacea (Hongo chino).
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El complejo constituido por un micelio fungoso y un alga embebida en
él se conoce como liquen, entonces, ¿Cuáles son los hongos y cuáles
las algas que se encuentran con mayor frecuencia en los líquenes?
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ESTRUCTURAS MICROBIANAS
Bacterias
Levaduras
Hongos
Eucarya
Fungi
Eucariote
Esporulación,
seguida de
germinación de
las esporas,
gemación y
fragmentación
de las hifas
Se duplican
entre 60 y 90
minutos.
Dominio
Reino
Tipo celular
División
Eubacteria
Monera
Procariote
Fisión
Eucarya
Fungi
Eucariote
Gemación, rara
vez por fisión
Velocidad de
división
Se duplican
90 a 120 en 45
minutos
110
Virus
Requieren de
un huesped
para su
reproducción
Diámetro
Formas
1 µm
cocos:
diplococos,
estreptococos,
estafilococos,
sarcinas
bacilos:
cocobacilos,
bacilos
fusiformes,
formas
filamentosas,
vibriones,
espirilos
Método típico
de análisis
Coloración de
Gram
3 a 5 µm
Dentro de
algunas
condiciones de
crecimiento las
gemas no se
separan de la
célula madre,
formando
cadenas
ramificadas de
pseudomicelio
Azul de
lactofenol
Fuente: Elaborado a partir de Davis et al., 1989
2 a 10 µm
Azul de
lactofenol
90 a 300 nm
Según los
huéspedes se
dividen en virus
animales,
bacterianos y
vegetales.
Según su
mofología
general pueden
ser
Icosaédricos,
helicoidales y
de estructura
más compleja
Acetato de
uranilo
Para tener un punto de referencia, identifique las diferentes formas y
partes microbianas, elaborando una representación gráfica y
describiendo con palabras sus principales características:
diplococos
estreptococos
estafilococos
____________________
____________________
____________________
____________________
____________________
____________________
bacilos
cocobacilos
____________________
____________________
____________________
____________________
111
bacilos fusiformes
____________________
____________________
formas bacilares
filamentosas
vibriones
espirilos
_______________
________________
__________________
__________________ _______________
_________________
sarcinas
pseudomicelio
micelio
__________________ _________________ ________________
__________________ _________________ _________________
hifa
Conidios
virón icosaédrico
desnudo
__________________ _________________ __________________
__________________ ________________
__________________
virón helicoidal
desnudo
virón icosaédrico
encapsulado
virón helicoidal
encapsulado
__________________ __________________ __________________
__________________ ______________
_________________
ULTRAESTRUCTURAS MICROBIANAS
Pared celular
Contenido
citoplásmico
Región nuclear
Estructuras
características
1
Bacterias
Rígida, rica en
péptidos
Mesosomas,
ribosomas
Sin membrana
nuclear
En ocasiones
cápsulas,
flagelos y pili1
Pili: Apéndices filamentosos
Fuente: Davis et al., 1989
112
Levaduras
Rica en polisacáridos
Mitocondrias,
retículo endoplasmático
Membrana
nuclear
Hongos
Rica en polisacáridos
Mitocondrias,
retículo endoplasmático
Membrana
nuclear
Virus
Ácido nucleico
y proteínas
Cápsida de
proteína
Para fundamentar sus conocimientos:
Distinga entre bacterias propiamente dichas, micoplasmas,
rickettsias
y
virus.
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
¿En qué aspectos son similares los virus ADN y los virus ARN?, ¿En
qué
aspectos
difieren?
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
NUTRICIÓN DE MICROORGANISMOS
Teniendo en cuenta los requerimientos nutricionales, es posible dividir las
bacterias en dos grupos:
Principales tipos de nutrición de las bacterias
Tipo
Fototróficas
1. Fotolitotróficas
(Autotróficas)
2. Fotoorganotróficas
(Heterotróficas)
Quimiotróficas
1. Quimiolitotróficas
(Autotróficas)
2. Quimioorganotróficas
(Heterotróficas)
Fuente: Merck, 19??
113
Fuente de
energía para
el desarrollo
Fuente de
carbono para el
desarrollo
Ejemplo del
género
Luz
CO2
Chromatium
Luz
Compuestos
orgánicos
Rhodopseudomon
as
Oxidación de
compuestos
inorgánicos
Oxidación de
compuestos
orgánicos
CO2
Thiobacillus
Compuestos
orgánicos
Escherichia
Además, todas las formas de vida, tienen en común determinadas necesidades
nutricionales en términos de requerimientos químicos para llevar a cabo su
crecimiento y funciones normales.
•
•
•
•
•
•
•
Todo organismo vivo necesita
Carbono.
Nitrógeno.
Agua.
Vitaminas.
Azufre
Fósforo.
Metales como sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso,
hierro, zinc, cobre, fósforo y cobalto.
El carbono generalmente se suministra como azúcar proveniente de melazas,
cereales sacarificados o materiales semejantes; sin embargo, el
microorganismo también puede adquirirlo a partir de aminoácidos, ácido
láctico, etanol u otras sustancias orgánicas. El nitrógeno se adiciona al medio
como amoniaco, sales amónicas (sulfato amónico, fosfato diamónico),
derivados proteínicos solubles (pectonas, péctidos y aminoácidos), urea o
aminoácidos de cereales hidrolizados. El fósforo como ácido fosfórico,
fosfatos (diamónico, ácido de potasio) o superfosfatos. El magnesio como
sulfato magnésico heptahidratado (Cate et al., 19??).
MANIPULACIÓN INDUSTRIAL
Encontrar el microorganismo adecuado para el objetivo deseado y la
determinación de los medios de cultivo para la conservación y mayor
productividad, son las primeras dificultades con las que se encuentra un
profesional en biotecnología (Caicedo, 1997).
Propiedades que deben poseer las variedades seleccionadas para
uso industrial
• Estabilidad bioquímica: características uniformes y constantes
• Estabilidad al cultivo: capacidad para reproducirse perfectamente y con
buen rendimiento en el medio de propagación
• Capacidad para adaptarse al sustrato
• Facilidad de desarrollarse rápidamente con elevado rendimiento
• Facilidad de recuperación.
• Buenas cualidades de conservación: posibilidad de resistir la autolisis
(Cate et al., 19??).
114
La fuente de microorganismos es variada y se puede recurrir a colecciones
especializadas en centros de referencia mundial, como la ATCC; a colecciones
privadas o al medio ambiente que nos rodea. En los dos primeros casos, los
medios y condiciones de conservación son suministradas por dichos centros, al
igual que la composición de los medios de producción. Sin embargo, la
necesidad de nutrientes específicos, difíciles de conseguir a nivel industrial, o la
necesidad de mejorar los rendimientos, obligan a diseñar medios de cultivo y
optimizarlos. En el último caso, se encuentran mezclas de microorganismos
que se deben aislar, conservar, caracterizar y diseñar los medios de cultivo
(Caicedo, 1997).
Procedimiento para utilizar un microorganismo de colección
Selección del microorganismo
Ejemplo: Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Definición de las especificaciones
propias del microorganismo
Activación de la cepa
La cepa elegida se reactiva en matraces de 250 ml con 50 ml de caldo nutritivo
Condiciones de incubación: Tiempo = 48 horas
Temperatura = 32ºC, con agitación rotatoria.
Preinóculo
El medio recomendado es: Stock de minerales 100 ml; K2HPO4 (5g/l),
MgSO4 (2.5 g/l); K2SO4 (1.0 g/l); MnSO4 (0.05 g/l); FeSO4 (0.05 g/l); FeCl3
(0.05 g/l); Biotina 20 g/l; Glucosa 50 g/l.
Condiciones de incubación: Un matraz de 300 ml de capacidad con 50 ml
de medio de cultivo se inoculó con el 10% v/v de la cepa activada en el paso
anterior, se incubó a 32ºC, durante 24 horas, con agitación. El pH fué de 7.5.
En estas condiciones se realizan curvas de crecimiento y se determina la
velocidad específica de crecimiento en h-1.
115
Éstas cepas comerciales pueden tener manipulación genética, por lo
tanto es importante consultar las variantes que se encuentran
disponibles, describir brevemente qué tipo de manipulación genética
pueden presentar y soportar la descripción con tres artículos
publicados en revistas.
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_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
Procedimiento para aislar un microorganismo y
condiciones de los medios de conservación y producción
Toma de muestras del medio ambiente
Se hace en un medio no selectivo
Incubación
A las condiciones ambientales originales
Aislamiento de las cepas de interés
Utilizando separación por:
Pretratamiento, dilución o medio enriquecido
Diseño del medio de cultivo
Optimización del medio de cultivo
116
definir
las
Como la toma de muestras del medio ambiente se hace en un medio
no selectivo y es importante conocer los productos disponibles en el
mercado, enuncie tres ejemplos de medios de cultivo comerciales e
indique los datos solicitados a continuación:
Nombre
comercial del
medio de cultivo
Composición
Cepas para las
cuales el medio
es adecuado
Características
de las colonias
Tipos de medio de cultivo
De enriquecimiento: El medio de cultivo de enriquecimiento es un medio en
el cual determinada especie de microorganismo prospera con mucha facilidad;
muchas veces el cultivo de enriquecimiento se usa para seleccionar entre
diferentes especies de microorganismos y para el aislamiento de cepas puras.
Diferencial: Es un medio de cultivo selectivo; debido a su composición
química especial, solo pueden crecer microorganismos de determinada clase.
Esto se usa para la identificación de los diferentes grupos por sus
características metabólicas diferentes.
Medio sintético o definido: Este tipo de medio se usa para la investigación
porque permite determinar los requerimientos específicos para crecimiento y
formación del producto adicionado o sustrayendo constituyentes del medio de
cultivo; con base en estos datos se elabora el medio de producción industrial.
Estos medios se caracterizan por tener una composición perfectamente
conocida de iones. Un ejemplo de medio definido es el medio Davis para
microorganismos fermentativos entéricos.
Medio complejo o natural: Estos tipos de medio son utilizados en
escalonamiento de fermentaciones para producción industrial.
Se usan
ingredientes de origen natural, los cuales no están completamente definidos
químicamente como extracto de carne, melazas, etc.
Medio de fermentación industrial: Los microorganismos son formas de
vida, con una gran capacidad de adaptación a diversas condiciones
ambientales. Esta adaptación viene acompañada de la reorganización de
estructuras macromoleculares, la inducción y/o represión de sistemas
enzimáticos y relocalización del material celular. La composición de la célula
varía en función de temperatura, pH, fuerza iónica y nutrientes que están en el
117
medio. La limitación de alguno de los nutrientes puede hacer que cambien
algunas reacciones metabólicas de la célula.
Para realizar el aislamiento de las cepas de interés se utilizan las siguientes
técnicas de separación:
Pretratamiento: La muestra se somete a calentamiento a diferentes
temperaturas y tiempos, o a filtración a través de membranas de diferentes
diámetros, dependiendo de los microorganismos a aislar.
Dilución: La muestra original se lleva a diferentes grados de concentración,
diluyéndola con solución salina (0.9% NaCl), solución tampón (NaCl + fosfato)
o medio de fermentación y posteriormente se siembra en un medio de cultivo
selectivo.
Medio enriquecido: La muestra se siembra en un medio de cultivo
enriquecido que permita exclusivamente, el desarrollo del microorganismo
deseado.
Para diseñar un medio de cultivo es necesario tener en cuenta el metabolismo
primario y secundario del microorganismo. Desafortunadamente es muy raro
que se puedan tener estudios completos de tales metabolismos. El medio
debe responder hasta donde sea posible a los requerimientos del
microorganismo, por lo tanto para el diseño del medio de cultivo, un buen
punto de partida es la composición de los medios de aislamiento, muchos de
los cuales son caracterizados por las casas productoras, además se consideran
los siguientes criterios:
La composición celular: Se trabaja bajo el criterio de que la composición
celular y la composición del medio deben ser similares, sin embargo, diversos
estudios han mostrado que no existe relación entre las dos composiciones.
La ecuación estequiométrica: Se parte de las fuentes de carbono,
nitrógeno, fósforo y otros nutrientes si la ecuación lo exige y llega a la
producción de células, producto principal y subproductos. Para ésto se
requiere del conocimiento de la fórmula de las células y de los diferentes
nutrientes.
Los factores estequiométricos experimentales: Permite compensar los
consumos de nutrientes dados por reacciones secundarias.
Partiendo del medio diseñado, se optimiza el medio de cultivo, el cual debe
cumplir con:
1. Los requerimientos nutricionales y energéticos de la célula
2. Las condiciones ambientales de temperatura, presión y concentración de
oxígeno
118
3. La función objetivo que se persiga (producción de biomasa o producto),
evitando las represiones por exceso de nutrientes o de productos
4. Las limitaciones comerciales de estabilidad, costo y disponibilidad de
materias primas, entre otras.
5. Un buen rendimiento, a un menor costo y con menor grado de
contaminación debida a los elementos sobrantes (Caicedo, 1997).
Técnicas para optimización de medios
Univariante:
Permite estudiar, por separado, cada elemento que se
considere crítico para el proceso, se realiza en un cultivo por lotes y es muy
usada para el estudio de fermentaciones. No evalúa el efecto multivariante de
los factores.
Quimiostato: Se realiza en un cultivo continuo, produciendo perturbaciones
escalón o pulso sobre un sistema estable. Se utiliza para optimizar biomasa y
productos.
Esterilización de los medios de cultivo
La mayoría de las fermentaciones industriales ocurren como cultivos puros con
cepas cuidadosamente seleccionadas.
La presencia de microorganismos
extraños al medio, o cualquier parte del equipo, afecta el consumo de
nutrientes y disminuye el rendimiento y la productividad del proceso. Además,
los productos de estos microorganismos pueden ser nocivos para la cepa
seleccionada y limitar su crecimiento. La esterilización destruye, inactiva o
remueve toda forma de vida microbiana, y produce en los microorganismos
una pérdida irreversible de su capacidad de reproducción en el ambiente
considerado.
La esterilización puede realizarse, entre otros procedimientos, con calor seco,
calor húmedo, filtración con filtros de porcelana no vitrificada (filtro
Chamberlad), tierra de diatomáceas (filtro Berkefeld o filtro Mandler), filtros de
placas de amianto utilizables una sola vez (filtro Seitz), filtros de ésteres de
celulosa (Millipore) y filtros de placas de vidrio sinterizado.
Los microorganismos presentes en un medio también pueden removerse
mediante centrifugación, agentes químicos, radiación (ultravioleta y rayos X), y
medios mecánicos (vibraciones sónicas y ultrasónicas).
A nivel industrial el método preferido de esterilización es el calentamiento
mediante vapor de agua en el mismo recipiente de fermentación, o en un
equipo separado. En este caso el aire presente en el equipo debe ser
cuidadosamente purgado, porque la temperatura de la mezcla aire-vapor
119
saturado no solo es menor que la del vapor sino que disminuye con el
contenido de aire en la mezcla y, si la esterilización se controla mediante la
observación de la presión, la temperatura alcanzada puede ser inferior a la
requerida por el proceso. Otro aspecto importante originado por la presencia
de aire en la esterilización del equipo con vapor de agua es la diferencia de
densidad; así, el aire más denso que el vapor, fluye hacia el fondo del equipo
originando gradientes de temperatura. Un segundo método, menos efectivo,
utilizado tanto para la esterilización del equipo como para el material de vidrio,
es la aplicación de calor seco mediante llama o aire caliente, debido a la
coagulación de las proteínas que conforman las células, originando el
endurecimiento de la capa externa de las mismas y dificultando la transferencia
del calor seco.
Se considera que la esterilización por calor sigue una cinética de muerte
térmica de primer orden, así:
dN
= −K d N
dt
donde: N es el número de microorganismos viables, Kd es la constante de
muerte térmica y t es el tiempo.
La constante de desactivación térmica se puede expresar de manera análoga a
la ley de Arrhenius, la cual es función de la temperatura:
⎛ E ⎞
K d = a × exp⎜ −
⎟
⎝ RT ⎠
donde: R es la constante universal de los gases 1.987 (cal/gmol.ºK), E es la
energía de activación (cal/gmol), a es la constante de Arrhenius (s-1), T es la
temperatura (ºK).
De las ecuaciones anteriores sale:
dN
⎛ E ⎞
= −K d N = − a × exp⎜ −
⎟N
dt
⎝ RT ⎠
Integrando:
t
t
No
∇ = ln
= K d dt = a exp(− E RT )dt
N
0
0
∫
120
∫
Donde ∇ es la relación logarítmica de la población de microorganismos inicial y
final. Esta relación es conocida como nabla o reducción fraccional de
microorganismos y es un indicador de la severidad del proceso de
esterilización.
Un ciclo de esterilización por lote típico se caracteriza por presentar tres
etapas: de calentamiento, de sostenimiento y de enfriamiento, causadas por
perfiles de temperatura que se originan de acuerdo al equipo de calentamiento
o enfriamiento utilizado y la reducción fraccional de microorganismos se logra
durante estos tres períodos.
Así:
∇ = ln
No
= ∇Calentamiento + ∇Sostenimie nto + ∇enfriamien to
N
En las etapas de calentamiento y enfriamiento donde la temperatura no es
constante, el factor nabla debe ser calculado resolviendo la integral que define
el perfil de temperatura el cual varía de acuerdo al equipo utilizado para
realizar la transferencia de calor. El tiempo total del ciclo será el resultado de
la suma de los obtenidos en las tres etapas (Moreno, 1996).
CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
Para evitar la contaminación microbiana de la cepa es necesario emplear
durante el almacenamiento, temperaturas bajas, además de tratamientos que
mejoren las cualidades de conservación, tales como el lavado del
microorganismo, durante una hora con solución alcohólica (C2-C5), seguido de
un proceso de prensado; o bien, el empleo de coloides (pectina, agar, gelatina,
goma tragacanto, dextrina) que permitan separar el agua para posteriormente
secar a una temperatura tal que no perjudique el microorganismo (Cate et al.,
19??).
DESARROLLO DEL INÓCULO
El desarrollo del inóculo en condiciones óptimas, permite obtener poblaciones
genotípicas idénticas, minimizar las pérdidas del microorganismo durante la
activación, estabilizar la fisiología con el objeto de mejorar la producción.
Algunos aspectos a tener en cuenta para obtener un buen inóculo tienen que
ver con las condiciones en las cuáles se trasladan las células del medio de
conservación al medio de activación; ello implica condiciones asépticas y un
buen método para determinar biomasa; así se logra obtener una curva de
121
crecimiento, la cual indica los cambios fisiológicos a través del tiempo
(Montoya, 1989).
REACTIVACIÓN DEL INÓCULO
Esta parte se realiza generalmente en matraces de 50 ml con un volumen de
medio de 5 a 10 ml y agitación de 220 rpm. Se inoculan los matraces con las
células obtenidas del medio de conservación, en porcentajes del 5 al 10%.
Los tamaños del inóculo varían de acuerdo al volumen de fermentación, por
ejemplo: Para un fermentador de 14 litros con 10 litros de volumen de medio
(volumen real), el inóculo al 10% será un litro.
Para 100 litros de
fermentación, el inóculo será de 10 litros. Generalmente se disminuye el
porcentaje del inóculo en la medida en que se aumente la escala de
fermentación. Así, para un tanque de 100.000 litros, se partirá de 10 litros de
laboratorio, escalando a 5.000 litros a nivel piloto, para inocular 100.000 litros
a escala industrial.
El inóculo se obtiene utilizando como reactor un matraz de 50 a 250 ml con
medio de cultivo (hasta 1/3 del volumen total). Se inocula del 5 al 10% (v/v),
del cultivo anterior. El medio se ha esterilizado a 121ºC durante 15 a 20
minutos.
La determinación de la biomasa es un indicador de las características del
inóculo, teniendo el tiempo de duplicación y la velocidad específica de
crecimiento se puede pensar en optimizar el sistema, el objetivo es disminuir el
tiempo en el cual empiezan a aparecer los productos y aumentar los
rendimientos, en la medida en que la biomasa también está en mayor
cantidad. El tiempo en el cual se transfiere el inóculo, está en relación con la
cantidad de producto obtenido (Montoya, 1989).
CRECIMIENTO MICROBIANO
Durante un cultivo por lotes el medio nutritivo es inoculado con un cultivo
semilla; los microorganismos toman selectivamente los nutrientes disueltos en
el medio y los convierten en biomasa y/o productos. Un cultivo típico por lotes
incluye diversas fases:
1. Fase lag: Ocurre inmediatamente después de la inoculación y es un
período de adaptación de las células a su nuevo ambiente. Durante este
período la biomasa se incrementa muy poco, y no existe reproducción
celular. La duración de la fase lag puede verse afectada por la baja
concentración de algunos nutrientes y/o factores de crecimiento, tales
122
2.
3.
4.
5.
6.
como: concentración de Mg+2, concentración de CO2, edad del inóculo,
composición del medio de cultivo, tamaño del cultivo y viabilidad del cultivo.
Fase de crecimiento exponencial: También conocida como fase de
crecimiento logarítmico o de crecimiento balanceado. En esta fase, las
células ya adaptadas a su nuevo ambiente, crecen y se reproducen
rápidamente.
Fase de desaceleración del crecimiento: Sigue a la fase de crecimiento
exponencial. El crecimiento se desacelera debido al agotamiento de uno o
más nutrientes esenciales o a la acumulación de subproductos tóxicos del
crecimiento, resultando en un crecimiento imbalanceado.
Fase estacionaria: Inicia al final de la fase de desaceleración cuando la
velocidad neta de crecimiento es cero (no hay división celular) o cuando la
velocidad de crecimiento es igual a la velocidad de muerte. En esta etapa,
las células aún son metabólicamente activas y se estimula la producción de
metabolitos secundarios.
Fase de muerte o declinación: Sigue la fase estacionaria y es causada
por agotamiento de nutrientes o sobreacumulación de productos. Las
células muertas suelen lisarse liberando sustancias intracelulares al medio de
cultivo.
Fase de crecimiento críptico: En fermentaciones limitadas por sustrato,
suele presentarse una segunda etapa de crecimiento, debido a la liberación
de las sustancias intracelulares de las células muertas, las cuales son
aprovechadas por las células vivas como sustrato (Caicedo, 1997).
Cantidad de biomasa
Fase estacionaria
de muerte
Fase
Fase de desaceleración
del crecimiento
Fase de crecimiento exponencial
Fase lag
Tiempo
Otro aspecto a considerar es que la actividad metabólica de las células modifica
la composición del medio en el cual crecen y uno o varios cambios pueden
eventualmente hacer disminuir la velocidad de crecimiento, dependiendo de las
modificaciones iniciales y de las propiedades de las cepas, entre estos están:
El agotamiento de algún nutriente, la acumulación de compuestos tóxicos
como producto del metabolismo y el cambio en el equilibrio iónico,
fundamentalmente el pH.
123
Factores que afectan la velocidad de crecimiento
1. Efecto de la concentración de sustrato: Para un medio fresco, con
todos los nutrientes excepto uno en exceso, la velocidad de crecimiento es
una curva de tipo hiperbólico, con saturación.
2. Temperatura: Cuando se eleva la temperatura hacia el óptimo, la
velocidad se dobla aproximadamente por cada 10ºC de incremento de
temperatura. Por encima de la temperatura óptima, la velocidad específica
de crecimiento (µ) baja y puede ocurrir muerte térmica. Otro aspecto
importante aquí, es la temperatura óptima de formación de producto, ya
que ésta, puede ser diferente a la temperatura óptima de crecimiento.
3. pH: Afecta la actividad de las enzimas y por tanto la velocidad de
crecimiento microbiano. El pH óptimo de crecimiento también puede ser
diferente del pH óptimo de formación del producto. Generalmente, el rango
de pH que un microorganismo puede soportar es de 1 a 2 unidades de pH,
aunque con adaptación gradual puede llegar a soportar variaciones mayores
(Caicedo, 1998). Para regularlo se utilizan soluciones de agua amoniacal y
sulfato amónico, ácido sulfúrico, amoniaco y carbonato o bicarbonato sódico
(Cate et al., 19??).
4. Oxígeno disuelto: Es un sustrato importante en cultivos aeróbicos y
puede ser limitante. En este caso, la velocidad específica de crecimiento
varía de acuerdo con la cinética de saturación y tiene como punto de
referencia la concentración crítica de oxígeno (Ccrít).
5. CO2 disuelto: En concentraciones muy altas puede ser tóxico, en
concentraciones muy bajas puede afectar algunas funciones metabólicas.
6. Fuerza iónica: Afecta las funciones metabólicas y la solubilidad de
nutrientes como el oxígeno, así como el transporte de iones hacia el exterior
de la célula.
7. Potencial redox: Afecta la velocidad y alcance de muchas reacciones de
oxido-reducción.
8. Concentración de sustratos: Altas concentraciones de sustrato pueden
causar inhibición, así por ejemplo, una concentración de glucosa mayor o
igual a 200 g/l inhibe por reducción de la actividad acuosa y una
concentración de cloruro de sodio mayor a 40 g/l inhibe por alta presión
osmótica (Caicedo, 1998).
Puede un microorganismo como el Saccharomyces cerevisiae dejar de
crecer si acumula etanol intracelularmente? Es viable que esto
suceda?
_______________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
124
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
125
LECCION DIECISEIS
MODELOS CINÉTICOS DE CRECIMIENTO CELULAR Y FORMACIÓN DE
PRODUCTO
Una de las relaciones que más interesa en procesos fermentativos, es la
variación de la concentración del biocatalizador (célula) con el tiempo, ya que
de ella depende el rendimiento y productividad del proceso.
Dentro de los modelos de crecimiento propuestos para células se encuentran:
Modelo
Segregado
Observaciones
Las células presentan
diferentes tiempos de
reproducción, edad,
viabilidad y estados
metabólicos
No segregado
Considera que todas las células
Es un modelo más simple.
se comportan exactamente igual Útil cuando no es muy
o que presentan características
claro el proceso de
medias
crecimiento o cuando la
población es homogénea
Estructurado
Considera los detalles de las
Intenta describir la forma
reacciones que existen dentro de y cinética de interacción
las células
entre los componentes del
medio de cultivo
No estructurado Considera la célula como una
Interactúa con el
caja negra. Las diferentes
ambiente y no importa
actividades de la biomasa se
que pasa en su interior.
consideran explicadas o
Su uso es válido
especificadas por una sola
únicamente para
variable
crecimientos en fase
exponencial
Estocástico
Considera la distribución
Útiles para procesos con
probabilística de las
población celular baja
características celulares de
(< 104 cel/ml) tales como,
interés
cinéticas de esterilización
Determinístico
Considera datos o variables
No considera mutaciones
determinados
Fuente: Elaborado a partir de los datos dados por Caicedo, 1998
126
Características
Considera cada célula como una
identidad independiente
Para ejemplificar lo anterior, enuncie tres modelos cinéticos de
crecimiento
celular
y
formación
de
producto.
____________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________
Es posible determinar la biomasa o masa celular (X) durante diferentes
tiempos de fermentación utilizando modelos matemáticos; así, por ejemplo:
Durante la fase de crecimiento exponencial en un reactor por lotes la
velocidad de crecimiento es constante e independiente del cambio de
la concentración de los nutrientes esenciales o sustratos para el
crecimiento y se puede escribir:
dX
= µX
dt
donde X es la masa molecular, dX/dt es la variación de masa celular con
respecto al tiempo y µ es la velocidad específica de crecimiento de las células.
Integrando desde el fin de la fase lag (X = Xo y t =tlag) hasta cualquier punto
en la fase exponencial (X, t):
x
t
∫ (dX/X) = µ ∫ dt
tlag
xo
se tiene:
X = Xo exp (µ(t-tlag))
Durante el crecimiento exponencial, µ es constante y al graficar el ln de la
concentración celular vs tiempo, se obtiene una recta con pendiente µ
Si
dX/dt = µX
⇒
El tiempo de duplicación cuando X2 = 2 X1 es:
127
X2
∫ dX/X = µ ∆t
X1
ln 2X1/X1 = µ ∆t
Cuando el crecimiento celular está en fase exponencial, µ es constante,
entonces:
ln 2/ ∆t = µ
Modelo de Monod: La reacción de Monod se cumple a velocidades altas de
crecimiento, como es el caso del cultivo continuo o quimiostato, en donde se
supone que (µ), velocidad específica de crecimiento, es continua y se halla en
la fase exponencial de crecimiento.
Para conocer el comportamiento del modelo de Monod, dibuje la
gráfica propuesta por él para relacionar el crecimiento del
microorganismo con la concentración del sustrato.
y escriba la ecuación que describe este comportamiento:
donde Ks es
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Así la velocidad de crecimiento específica es función de la concentración de
sustrato. Para Ks bajo, la velocidad de crecimiento específica durante la fase
128
logarítmica de crecimiento es constante.
La transición de latencia a
crecimiento logarítmico es bastante rápida o abrupta cuando el sustrato
residual (s) es bajo. La alta concentración celular utiliza rápidamente el
remanente de sustrato (s) y por esta razón es muy difícil determinar Ks en
cultivos por lotes. Es posible emplear la cinética con bajos niveles de sustrato
inicial antes de un cambio significativo en la concentración del mismo. Ks se
emplea más en cultivo continuo. El modelo de Monod es empírico y fué
determinado experimentalmente (Montoya, 1989).
LOS MICROORGANISMOS EN LA INDUSTRIA
Desde el punto de vista industrial, el sustrato se debe considerar como la
materia prima y los microorganismos como el proceso de transformación que
da origen a nuevos productos. Por lo tanto, la reacción general del proceso
puede escribirse así:
Sustrato + microorganismo
producto
proceso catabólico
o anabólico
Sólo cuando el microorganismo es capaz de convertir materias primas baratas
en productos útiles, es posible con fines industriales, realizar la reacción a gran
escala y para ello se necesita definir los siguientes prerrequisitos:
Microorganismo a utilizar: Debe ser capaz de producir o transformar
grandes cantidades de producto, ser estable frente a las diferentes condiciones
de trabajo, ser capaz de desarrollarse rápida y vigorosamente y no ser
patógeno.
Medio a utilizar: Incluye el sustrato del cual el microorganismo producirá el
nuevo producto, debe ser barato y fácilmente obtenible en grandes cantidades.
En ocasiones es posible aprovechar desperdicios que contienen material
nutritivo, tales como: suero lácteo, líquidos de desecho que resultan del
cocinado de la madera y líquidos de desecho con sulfitos.
Producto a obtener: El producto obtenido por el metabolismo de los
microorganismos queda en una mezcla heterogénea que contiene células
microbianas, componentes poco comunes del medio y algunos productos del
metabolismo distintos a los que se planea obtener. Cuando se hace a gran
escala, exige poner en marcha métodos de recuperación y purificación para
lograr un buen producto final (Pelczar et al., 1990).
129
METABOLISMO MICROBIANO
El objetivo principal del metabolismo microbiano es crecer y mantenerse.
Los microorganismos crecen y se alimentan extrayendo nutrientes, electrones y
energía del ambiente. Los nutrientes son el C, N, P, S y oligoelementos que
conforman la base de los constituyentes celulares:
carbohidratos,
aminoácidos, lípidos y ácidos nucleicos. Los electrones son necesarios para
reducir los nutrientes a la forma química utilizada por los constituyentes
celulares y para generar la energía necesaria que posibilite la síntesis y el
mantenimiento de la biomasa (Morris et al., 1998).
Ahora bien, en todos los seres vivientes se desarrollan complejos procesos
vitales que pueden dividirse en procesos que requieren energía o suministran
energía.
Los procesos anabólicos de asimilación o de síntesis, requieren energía para
poder desarrollarse. En el caso de las plantas, esta energía la suministran
directamente las radiaciones solares; en los animales y la gran mayoría de los
microorganismos son los procesos catabólicos, de degradación, los que facilitan
la energía necesaria.
Estos procesos de degradación reciben el nombre de respiración, fermentación
y glucólisis, y consisten esencialmente en procesos de oxidación mediante
sucesivas dehidrogenaciones de glúcidos y otras sustancias orgánicas
(aminoácidos, ácidos grasos, etc.). La respiración de las células requiere la
intervención del oxígeno atmosférico, al final del proceso de dehidrogenación,
como aceptor final del hidrógeno extraído de los sustratos.
Proceso básico
Es la transferencia de electrones desde un sustrato donante (SD) hasta un
sustrato receptor (SR). El sustrato donante puede oxidarse y emitir electrones;
algunos de éstos son transportados por un cosustrato interno reducido (CIR)
hasta un sustrato receptor, generando energía en forma de adenosintrifosfato
(ATP), un compuesto de almacenamiento de energía, empleado para satisfacer
las necesidades de mantenimiento de las células. El resto de los electrones y
parte del ATP se emplean para generar biomasa nueva (Morris et al., 1998).
130
SD
2e
-
CIox
2
CIR
SDox
Síntesis
de biomasa
Nutrientes
ADP
+
2 e
e
SR
-
ATP
Pi
SRred
Mantenimiento
de biomasa
Como la transferencia de electrones entre los sustratos donantes y receptores
es esencial para crear y mantener la biomasa, estos materiales se denominan
sustratos primarios. Ahora bien, una vez se tenga una biomasa activa, se
podrá producir cualquier reacción de biotransformación, siempre que los
microorganismos posean las enzimas necesarias para catalizar la reacción.
Sustrato secundario: Cuando existen otros materiales que sirven como
sustrato primario, un compuesto específico se puede biodegradar como
sustrato secundario, es decir, como un sustrato cuya oxidación (o, a veces,
reducción) produce un bajo flujo de electrones y energía que se muestra
incapaz de mantener la biomasa que lo degrada.
131
Sustratos secundarios
Sustrato de baja concentración
Sustratos de electrones que pueden aportar
flujos de electrones y energía al metabolismo
celular. La velocidad que presentan estos
flujos es menor que el flujo mínimo necesario
t
l bi
ti
Cometabolito clásico
Describe un compuesto cuya transformación no puede
generar flujos de energía y electrones. Generalmente, se
transforma mediante metabolismo incidental, es decir,
mediante una enzima que normalmente reacciona con
un compuesto diferente, pero relacionado, que cataliza
un paso de transformación sencillo para el cometabolito.
Moduladores: Compuestos que pueden afectar la cinética de transformación
y éstos pueden ser cosustratos, limitantes del sustrato e inductores.
1. Cosustratos: La mayoría son receptores o donantes de electrones,
reaccionan directamente con el compuesto degradado (o quizas con un
intermediario metabólico) en el punto de reacción de la enzima. La reacción
no forma parte del flujo de electrones que necesita la biomasa, sino que
reaccionan directamente con el sustrato específico.
2. Limitantes de los sustratos: Disminuyen la velocidad de las reacciones
catalizadas por las enzimas mediante su reacción directa con la enzima.
Entre ellos están los que originan la limitación competitiva, donde el
limitante compite para acceder al centro activo de la enzima; y los que
originan la limitación no competitiva, ya que el limitante se une a la
enzima en un lugar diferente al centro activo, pero lo hace de tal forma que
dificulta la capacidad de reacción hacia el sustrato específico.
La
132
autolimitación, es un caso especial de la limitación y se debe a que las
altas concentraciones de un sustrato limitan su propia degradación.
3. Inductor: Controla la formación de las enzimas que llevan a cabo las
reacciones de transformación (Morris et al., 1998).
Para adquirir una mayor compresión sobre la naturaleza y origen de
los productos obtenidos en un proceso microbiológico, represente
gráficamente dos de los procesos metabólicos solicitados, indicando
la estructura química de cada sustancia obtenida, su nombre común,
la enzima que actúa en cada paso y la coenzima requerida. Utilice
colores para visualizar claramente los cambios presentados en cada
paso:
1. Obtención bioquímica de ácido butírico
2. Obtención bioquímica de butanol
3. Obtención bioquímica de acetona
4. Obtención bioquímica de isopropanol
5. Obtención bioquímica de 2,3-butanodiol
6. Obtención bioquímica de ácido cítrico
7. Obtención bioquímica de ácido itacónico
Además conteste las siguientes preguntas:
1. ¿Cuál es la relación de moles de oxígeno consumidos a moles de
producidos
cuando
se
respira
glucosa?
CO2
_______________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
2. ¿Qué le ocurre a la relación anterior cuando se utilizan las grasas
como
el
combustible
de
la
respiración
celular?
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
133
TERMODINÁMICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Sistema termodinámico: Una reacción química, una célula o un organismo
completo.
Entorno del sistema: Todo aquello que no sea parte del sistema definido.
La primera ley de la termodinámica establece que la energía del
universo, esto es, el sistema más su entorno, es constante.
Dentro de un sistema dado son posibles cambios netos de energía, así:
3. La energía absorbida en la reacción directa es exactamente igual a la
energía liberada en la reacción inversa.
4. El cambio de energía interna del sistema, ∆E, antes y después del proceso
se puede expresar como: ∆E = q - w donde q se define como el calor que
el sistema absorbe de su entorno y w se define como el trabajo hecho por el
sistema sobre su entorno. En términos matemáticos, el trabajo se puede
definir como: w = P∆V + w’ donde P es igual a la presión, ∆V es el
cambio en el volumen que tiene lugar durante el proceso y w’ representa el
trabajo diferente al trabajo de presión-volumen. Para la mayor parte de
estas reacciones, w’ = 0. Dada esta restricción, al sustituir la segunda
ecuación en la primera y reacomodando se tiene: qp = ∆E + P∆V donde qp
es el calor absorbido a una presión constante. Como cualquier combinación
de las funciones de estado debe ser también una función de estado, qp es
por consiguiente una función de estado, que se denomina el cambio de
entalpía (∆H): ∆H = ∆E + P∆V. En los sistemas biológicos, el volumen
permanece prácticamente constante. Así, ∆H y ∆E son equivalentes
efectivamente.
Proceso exotérmico: Proceso en el cual el sistema desprende calor y ese
calor pasa al entorno. El ∆H es negativo.
Proceso endotérmico: Proceso en el cual el calor es absorbido por el sistema
a partir de su entorno. El ∆H es positivo.
El criterio para espontaneidad se encuentra en la segunda ley de la
termodinámica. Ella establece que en todo proceso espontáneo, la entropía
(S) del universo (el sistema más su entorno) se incrementa. En los sistemas
metabólicos, las fuerzas de la entropía son contrarrestadas por los procesos
celulares creadores de orden. Las vías metabólicas existen en un estado
estable que está lejos del estado de equilibrio. Así, por ejemplo:
A
134
B
C
Si se considera que no hay otros reactantes, sólo B en este sistema puede
estar en un estado estable. El estado estable ocurrirá si la velocidad de
formación de B a partir de A es igual a la velocidad de utilización de B para
formar C. Con el tiempo, la concentración de B en un estado estable no
cambiará, pero A se puede agotar, y C se puede acumular. Entonces, la
concentración de B es mantenida a expensas del cambio continuo en las
concentraciones de A y C.
Un criterio útil para estimar la espontaneidad de los procesos fue desarrollado
por J. Willard Gibbs. La nueva función de estado, denominada el cambio de
energía libre de Gibbs (∆G), se define en términos de H y S para los procesos
que tienen lugar a presión constante y es una medida de la energía disponible
para trabajar dentro de un sistema:
∆G = ∆H - T∆S
donde T es la temperatura absoluta y ∆G se expresa en unidades de Kcal/mol.
Procesos exergónicos: ∆G < 0. El proceso es espontáneo y se puede llevar
a cabo en ausencia de energía proporcionada por el exterior del sistema.
Procesos endergónicos: ∆G > 0. El proceso no puede tener lugar
espontáneamente, requiere del suministro de suficiente energía externa.
Proceso en equilibrio: ∆G = 0. Las concentraciones de los reactantes y de
los productos están en equilibrio y las velocidades de las reacciones en ambos
sentidos son iguales.
El cambio de energía libre de una reacción depende de las condiciones
bajo las cuales se efectúa la reacción. Por consiguiente, es útil tener un
conjunto de condiciones de reacción de referencia establecidas en forma
convencional. Estas condiciones de referencia se conocen como estado
estándar (∆Gº’).
Para una reacción, el cambio de energía libre se puede calcular como
sigue:
∆G
reacción
= ΣG
productos
- ΣG
reactantes
Cuando el sistema se encuentra en equilibrio:
∆Gº’reacción = -2.303 RT log Keq
Si se conoce ∆Gº’ para la reacción, la ecuación permite calcular Keq y viceversa.
135
Para una reacción que no está en equilibrio:
Se observa una relación diferente de productos a sustratos (Q) y el cambio de
energía libre se deriva de:
∆G = ∆Gº’ + 2.303 RT log Q
donde Q es la relación de acción de masas.
En otras palabras, el cambio de energía libre es una medida de lo lejos que
está el sistema que reacciona del equilibrio. En consecuencia, es ∆G y no ∆Gº’,
el criterio para evaluar la espontaneidad de una reacción y por consiguiente su
dirección dentro de un sistema en particular.
Entonces, las reacciones metabólicas se pueden dividir en:
3. Reacciones cerca del equilibrio: Reacciones en las cuales Q tiende a
Keq. Las enzimas que catalizan las reacciones cerca del equilibrio son
capaces de restablecer con rapidez los niveles de sustratos y productos a
estados cercanos al equilibrio debido a la gran actividad enzimática que
existe.
4. Reacciones metabólicas irreversibles: Reacciones en las cuales Q esta
lejos de Keq. En las células las enzimas que catalizan las reacciones
metabólicas irreversibles existen en cantidades limitantes, insuficientes para
lograr estados cercanos al equilibrio para estas reacciones. Todos los
puntos de control de las vías son reacciones metabólicamente irreversibles
(Horton et al., 1995).
Proyecte sus conocimientos discutiendo la siguiente afirmación: “La
producción de calor en sistemas biológicos es usada como parámetro
energético característico del crecimiento y puede utilizarse para
calcular el crecimiento empleando el balance de entalpía”.
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136
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PRINCIPALES
MICROBIANO
CLASES
DE
PRODUCTOS
DEL
METABOLISMO
Los productos del metabolismo microbiano han venido cobrando importancia
porque:
1. Son utilizables por sí mismos
2. Son utilizables como precursores para la síntesis de otras sustancias
3. Muchos pueden competir desde un punto de vista económico con la síntesis
química, tal es el caso de los metabolitos con una configuración
estereoespecífica.
Teniendo en cuenta los productos metabólicos obtenidos y la aplicación de los
mismos, las industrias biotecnológicas se pueden agrupar en:
1. Industrias productoras de bebidas alcohólicas: Son las industrias
microbiológicas más grandes y antiguas. Entre ellas están las cervecerías y
vinaterías, así como las fábricas de otras bebidas alcohólicas.
2. Industrias productoras de alimentos fermentados: También son
industrias antiguas, pero en su gran mayoría no muy grandes. Entre éstas
se incluyen las empresas elaboradoras de productos fermentados lácteos,
cárnicos, de frutas, verduras y panadería.
3. Industrias productoras de sustancias quimico-farmacéuticas: Las
productoras de antibióticos y esteroides son las más prominentes en esta
categoría. Sin embargo, hay otras sustancias para uso terapéutico que
pueden ser producidas por microorganismos.
4. Industrias productoras de suplementos alimenticios: Entre ellas
están, la producción masiva de levaduras y algas en medios que contengan
sales inorgánicas nitrogenadas y sustratos baratos, son una buena fuente de
proteínas y de productos orgánicos útiles como suplementos alimenticios.
Además, un proceso interesante, empleado en muchos países, es la
producción industrial de aminoácidos de origen microbiano.
5. Industrias
productoras
de
sustancias
químicas
valiosas
comercialmente: Varios preparados con enzimas microbianas tienen
aplicaciones industriales, y en consecuencia, son fabricadas a gran escala.
En otro tiempo, los procesos microbiológicos para producir acetona y alcohol
butílico fueron importantes.
137
6. Industrias productoras de vacunas (antígenos inmunizantes): El
cultivo masivo de microorganismos para ser usado en vacunas puede
considerarse como una empresa industrial.
7. Industrias orientadas a mantener el medio ambiente: Teniendo en
cuenta que los microorganismos juegan un papel importante en el deterioro
de materiales como pieles, textiles, hule, metales, lana, suero, aguas
residuales, sustancias orgánicas, etc. cada vez más, se desarrollan
procedimientos para mantener los diferentes ecosistemas.
8. Industrias para procedimientos analíticos: Se han adoptado técnicas
analíticas biotecnológicas para determinar vitaminas, aminoácidos, azúcares
y antibióticos, entre otros, las cuales son muy empleadas por los fabricantes.
9. Industrias para la producción de productos energéticos: Con la
escasez de gas natural, petróleo y carbón, la economía mundial habrá de
reorientarse progresivamente. Hasta ahora, únicamente el metano o
“biogas” y el etanol se han mostrado como sustancias prometedoras para
ello.
Para visualizar la naturaleza de las industrias anteriores, elija una de
su interés (asegúrese de no conocerla) y elabore un documento que
incluya: proceso industrial, diagrama de flujo, aplicaciones del
producto, empresas que trabajan dentro y fuera del país en el campo,
así como proyección nacional e internacional.
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Considerando que los científicos están hablando de elaborar
alimentos que sirvan para inmunizar la población frente a
determinadas enfermedades y que la producción de vacunas es una
industria interesante, documéntese sobre el tema y describa el
proceso a seguir, utilizando un diagrama en árbol. Emplee como
punto de partida las bases de datos. www.unad.gov.co (biblioteca hemeroteca).
138
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Algunos productos industriales (diferentes a los antibióticos)
producidos por bacterias son:
Producto
Butanol-acetona
Clostridium
acetobutylicum y otros.
Usos
Solventes, manufactura
química
2,3-butanodiol
Bacillus polimixa,
Ent. aerogenes
Solvente, humectante,
intermediario químico
Dihidroxiacetona
Gluconobacter suboxydans Químico fino
Ácido 2-cetoglucónico
Pseudomonas sp.
Intermediario para el
ácido D-arabo-ascórbico
Ácido 5-cetoglucónico
G. suboxydans
Intermediaria para el
ácido tartárico
Ácido láctico
Lactobacillus delbrueckii
Productos alimenticios,
textiles y lavanderías,
manufactura química,
curtido de pieles
Amilasa bacteriana
Bacillus subtilis
Modificador de almidones,
encolado de papel;
desencolado de textiles
Proteasa bacteriana
B. subtilis
Laminado de pieles,
desencolado de fibras,
quita manchas,
ablandador de carnes
139
Microorganismo
Dextrán
Sorbosa
Leuconostoc
mesenteroides
Estabilizador de productos
alimenticios, sustituto de
plasma sanguíneo
G. suboxydans
Manufactura de ácido
ascórbico
Cobalamina
Streptomyces olivaceus:
Propionibacterium
freudenreichii
Tratamiento de la anemia
perniciosa; suplemento
alimenticio
Ácido glutámico
Brevibacterium sp.
Aditivo de alimentos
Lisina
Micrococcus glutamicus
Aditivo de la alimentación
animal
Estreptoquinasaestreptodornasa
Streptococcus hemolyticus Uso médico (disolvente de
Fuente: Pelczar et al., 1990
140
coágulos sanguíneos)
Algunos productos industriales producidos por levaduras son:
Product Microorganism Método de preparación
o
o
Cerveza
S. cerevisiae o S. Cebada, malta y almidones
carisbergensis
juntos mezclados con agua
caliente; después de la
conversión enzimática del
almidón, la cerveza nueva se
filtra; luego se hierve con
lúpulo y finalmente se
fermenta con levadura
Ron
S. cerevisiae u
Se añaden como alimentos
otras levaduras melazas que contengan 12 14% de azúcar fermentable;
sulfato de amonio y
ocasionalmente fosfatos; se
destila después de la
fermentación
Whisky
S. cerevisiae
La masa de granos cocinados
(generalmente
escocés
se sacarifica con malta
levadura
tratada con carbón y se
especial)
fermenta; la tanda destilada
y el destilado se añejan en
barricas de roble durante 3
años por lo menos; después
se mezclan con whisky en
grano
Bourbon S. cerevisiae
La masa de granos
compuesta de maíz (al
136
Factores que influyen en
la reacción
Aerobiosis en los estados
primarios, pero pronto se
hace anaeróbico, temp. 8 12ºC, pH al principio 5.0 5.4; al final 4.0 - 4.8; la
fermentación primaria por lo
menos 5-9 días
Función de los
microorganismos
Transforma azúcar en
alcohol y dióxido de
carbono; produce cambios
en las proteínas y otros
constituyentes menores que
modifican el sabor
pH óptimo = 4.0 - 4.7
T inicial = 21ºC elevándola
a la T final de 35.5ºC;
fermentación por lo menos
3 - 7 días
Transforma azúcar en
alcohol, el cual se obtiene
después por destilación
pH óptimo = 4.0 - 5.0
T inicial = 26ºC
la fermentación se completa
en 72 hs
Produce alcohol y sustancias
congéneres (ácidos, ésteres,
varios alcoholes) que con la
malta carbonosa dan el
característico sabor del
whisky escocés
Lo mismo que para el
whisky escocés
Lo mismo que para el
whisky escocés, pero el
Vino
137
S. ellipsoideus,
varias cepas
menos 51%); generalmente
se fermenta con centeno
cocido y se sacarifica con
malta, se destila entre 110 y
130 grados, se madura en
barricas de centeno
carbonoso
Las uvas deben tener
concentración de azúcar
superior al 22%; al licor se le
agrega sulfito par reducir el
índice de fermentación; se
deja fermentar con cepas
especiales de levaduras, o
con las levaduras que existen
en las uvas en forma natural;
a la fermentación primaria
sigue un periodo de
almacenaje para maduración
sabor es el característico del
bourbon
Aerobiosis en los estadios
iniciales, pero
principalmente anaerobiosis
después
T inferior a 29.4ºC, pero
varía de acuerdo con las
condiciones locales, cepa de
levadura y tipo de vino; la
fermentación dura 7-11 días
Transforma el azúcar en
alcohol y también produce
cambios en los
componentes menores que
modifican el sabor y
bouquet; la cantidad de
alcohol varía según el tipo
de vino
Los hongos se usan para elaborar antibióticos, algunos productos alimenticios,
en la industria química y en la obtención de enzimas.
Algunos productos industriales
producidos por hongos son:
Producto
Ácido cítrico
Ácido fumárico
Ácido glucónico
Ácido itacónico
Pectinasas
11-γ-hidroxiprogesterona
(diferentes
Microorganismo
Aspergillus niger o A.
wentii
a
los
antibióticos)
Usos
Productos alimenticios,
citratos medicinales, en
sangre para
transfusiones
Rhizopus nigricans
Manufactura de resinas
alquídicas, agentes
humectantes
A. niger
Productos farmacéuticos,
textiles, curtido de
cueros, fotografía
A. terreus
Manufactura de resinas
alquídicas, agentes
humectantes
A. wentii o A. aureus
Agentes clarificantes en
la industria de jugos de
frutas
R. arrhizus, R. nigricans
y otros
Ácido giberélico
Intermediario para 17-γhidroxicorticoesterona
Fusarium moniliforme
Guarnición de frutas,
producción de semillas
R. oryzae
Alimentos y productos
farmacéuticos
Ácido láctico
Fuente: Pelczar et al., 1990
Para ampliar su conocimiento sobre el uso de microorganismos a
nivel industrial.
2. Busque en una revista especializada, un artículo en inglés, que
corresponda a la elaboración de cualquiera de los productos
37
anteriores y en él analice la estructura del texto, determine la
finalidad del documento y subraye las partes importantes.
3. Construya una guía de trabajo que permita estudiar el proceso de
inmovilización de un microorganismo.
38
LECCION DIECISIETE
TECNOLOGÍA DE FERMENTACIÓN
En biotecnología, el término fermentación se emplea en un sentido más
amplio de lo que se usa en la bioquímica clásica. Así, en general todos los
procesos que implican un crecimiento microbiano; ya sean anaeróbicos, o
aeróbicos, independientemente del sustrato que sea utilizado como fuente
energética, son denominados fermentaciones. La fermentación describe el
crecimiento y la formación de productos por microorganismos, no solamente
en cuanto a células activas, sino también en cuanto a restos de células, ya que
muchos productos de interés comercial se producen después de que el
crecimiento ha pasado. El estudio de las fermentaciones no solo está limitado
a los aspectos de crecimiento sino que también incluye el pH, temperatura,
nutrientes y en general, las condiciones adecuadas para el cultivo microbiano
(Montoya, 1989).
TIPOS DE FERMENTACIONES
Los cultivos microbiológicos pueden clasificarse en:
Sistemas abiertos: En un sistema abierto todos los materiales que componen
el sistema pueden entrar y salir simultáneamente, lo cual permite que éste
entre en contacto con el ambiente. Un proceso de flujo continuo, en el cual se
introduce medio fresco a una velocidad uniforme, para obtener biomasa y otros
productos, es un ejemplo de sistema abierto; en él, la velocidad de conversión
del sustrato, producto y biomasa es constante, debido a que es posible fijar la
velocidad de crecimiento entre cero y un valor máximo.
Sistemas cerrados: En un proceso cerrado ninguna de las partes esenciales
del sistema puede entrar y salir a la vez y por lo tanto, no existe relación con el
medio exterior. Un cultivo tradicional o de lote en el cual la cantidad de
nutrientes está limitada, es un ejemplo de sistema cerrado; en él, la velocidad
de crecimiento de biomasa (tiende a cero) ya sea por falta de nutrientes o por
acumulación de algún producto no tolerado por el microorganismo; por esta
razón los sistemas se encuentran siempre en estado transitorio.
Para mayor comprensión, presente ejemplos de cada uno de los
sistemas:
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39
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Los procesos fermentativos pueden ser:
Procesos discontinuos
Son los llamados procesos en lote, tienen gran importancia comercial por su
amplio uso. Las técnicas de instalación de los cultivos discontinuos van a
depender de si el proceso es aeróbico o anaeróbico.
1. Fermentaciones aeróbicas: Pueden llevarse a cabo como cultivos en
superficie o como fermentaciones en cultivos sumergidos
Cultivos en superficie: Se realizan en recipientes planos de poca profundidad
(bandejas), dentro de los cuales se coloca el medio de cultivo, que puede
ser líquido o sólido. Finalmente el medio se inocula con esporas del
microorganismo correspondiente y se cultiva a temperatura apropiada.
Cultivos sumergidos: se realizan sobre sustratos líquidos en recipientes
herméticamente cerrados y provistos de un eficiente sistema de agitación y
oxigenación.
2. Fermentaciones anaeróbicas: Se realizan en recipientes cerrados,
semejantes a los utilizados para la fermentación en sumergido pero en lugar
de aire se inyecta gas carbónico, o cualquier gas inerte, para suministrar
una atmósfera libre de oxígeno.
En los procesos por lotes, si se da el sistema de parámetros variables, no se
pueden controlar las reacciones, debido a que la concentración del sustrato es
función del tiempo.
Procesos continuos
Las técnicas de cultivo continuo han sido desarrolladas en las últimas décadas
y pueden ser:
1. Cultivo de flujo tapón: El cultivo viaja sin mezclarse a través de un tubo o
canal. Este sistema se emplea en el caso de inmovilización de células o
enzimas, cuando se trata de columnas empacadas.
2. Quimiostato: Consta de un tanque agitado con una suspensión de biomasa
perfectamente mezclada y homogénea, que se alimenta con medio fresco a
una tasa constante; el caldo de fermentación es extraído a la misma
velocidad de modo que el volumen permanece constante. La importancia
fundamental del quimiostato es que se puede fijar la velocidad específica de
crecimiento entre cero y un valor máximo (Montoya, 1989). La relación de
40
la velocidad a la cual el medio nuevo se agrega al cultivo (f), con el
volumen operativo del cultivo (V), es lo que se denomina índice de dilución
(D):
D = f/V. El índice de dilución corresponde al número de volúmenes de
medio que pasan a través del frasco de cultivo en el término de una hora.
Su inversa, 1/D, es la media del tiempo de residencia de un
microorganismo en el frasco de cultivo.
En el quimiostato los
microorganismos se están multiplicando pero también están siendo
“lavados” del tanque de cultivo. Por consiguiente el cambio neto en el
número de microorganismos en el tiempo está determinado por las tasas
relativas de crecimiento y “lavado”: dX/dt = µX - (f/V) (Joklik, 1995).
Las ventajas del cultivo continuo se fundamentan principalmente en:
1. La velocidad específica de crecimiento puede establecerse (dentro de los
límites de microorganismos) de acuerdo con las necesidades del
experimento. Se puede seleccionar un estado de actividad metabólico
particular y el control de éste.
2. Se pueden obtener células de un estado definido independiente del tiempo.
3. Con equipo de laboratorio se puede producir, comparativamente gran
cantidad de material celular definido.
Las variables susceptibles de ser estudiadas en un cultivo continuo son:
1. Variables independientes: Tiempo (t), velocidad de crecimiento (µ),
concentración del sustrato (S), sustrato limitante, concentración del
producto, cultivo mixto, pH, temperatura (T), aireación-agitación (KLa),
inhibidores (I), inductores de enzimas y agentes mutagénicos.
2. Variables dependientes: Tasas metabólicas (Qi), concentración celular
(X), composición celular, excreción celular, morfología celular, velocidades
de mutación, patrones metabólicos, selección de microorganismos, tiempo
de expansión del mutante y virulencia.
Para mayor entendimiento, presente ejemplos de cada uno de los
procesos:
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41
VARIABLES QUE SE DEBEN CONTROLAR EN UNA FERMENTACIÓN
Las variables que se deben controlar para lograr un efectivo conocimiento y
por consiguiente el control y la manipulación del proceso, en una fermentación
de interés económico o científico son:
1. Aquellas que se deben medir continuamente: Temperatura, pH,
velocidad de agitación, presión, espuma, oxígeno disuelto, adición de
nutrientes.
2. Aquellas que se deben medir intermitentemente: Biomasa, producto
y consumo de sustrato.
Temperatura: Afecta de manera importante el crecimiento microbiano, de
acuerdo con la especie. Así, por ejemplo, los microorganismos crecen en
rangos restringidos de temperatura: psicrófilos 5 - 15ºC; mesófilos 25 - 40ºC y
termófilos 45 - 60ºC; presentando éstos últimos, un gran potencial de
utilización, si se tiene en cuenta que la alta temperatura permite mejor
transferencia de calor, velocidades de reacción mayores y menores
posibilidades de contaminación.
La dependencia de la velocidad específica de crecimiento, respecto a la
temperatura puede expresarse como ecuación tipo: µ = A. e-Ea/RT donde, Ea
es la energía de activación y A es una constante. Por lo tanto, cuando se
grafica log µ vs l/T debe obtenerse una línea recta cuya pendiente es: Ea/2.3R
pH. El pH es la medida de la concentración de iones hidrógeno y tiene un
marcado efecto tanto en la velocidad de crecimiento como en el rendimiento.
Es óptimo para algunas especies, así: las bacterias se desarrollan mejor a un
pH entre 6,0 y 8,0; las levaduras entre 4,0 y 6,0, y los mohos entre 3,7 y 7,0.
Velocidad de agitación mecánica: La agitación permite mantener una
distribución homogénea en el tanque de fermentación, facilita la transferencia
de oxígeno, nutrientes y calor. Además, determina la morfología celular: si la
agitación muy intensa puede partir el micelio en caso de mohos, y si es muy
lenta limita la actividad en el tanque de fermentación.
Espuma: Se puede controlar mediante agentes químicos antiespumantes o
equipo mecánico de desespumación, asociado al ajuste de la velocidad de
aireación. El agente antiespumante empleado debe ser atóxico para el
microorganismo y para el consumidor final, eficaz a baja concentración, estable
en las condiciones de uso y de precio reducido. Tampoco debe interferir con la
recuperación del producto. Entre los agentes antiespumantes se encuentran
42
Vegifat®, DC Antifoam A®, dodecanol, aceite de ricino sulfonado y partes
iguales de hexadecanol o tetradecanol y parafina líquida (Cate et al., 19??).
Oxígeno disuelto: La oxigenación de la fuente de carbono y su
transformación en células, productos y CO2 establece una demanda de oxígeno
inicial que se debe satisfacer a través de la aireación y agitación del cultivo;
por lo tanto, es indispensable conocer los rendimientos de oxígeno del cultivo y
calcular las resistencias a la transferencia que encuentra el oxígeno antes de
llegar a la célula, para asegurarse de que su suministro sea suficiente.
El mecanismo de transferencia se puede dividir en varios pasos:
1. La transferencia difusional del oxígeno a través de las películas de gas y
líquido que rodean la burbuja de aire
2. El camino que siga en la solución
3. El paso a través de la película de líquido que rodea la célula
4. La reacción bioquímica intracelular
Se ha demostrado que la mayor dificultad la presenta la película de líquido que
rodea las burbujas, pero esto ocurre en caso de organismos unicelulares. En
los agregados celulares (pellets) la difusión en el agregado mismo, constituye
el paso limitante en la transferencia de oxígeno.
La velocidad de transferencia de oxígeno se puede expresar así:
Velocidad de transferencia = Coeficiente de transferencia de masa x
área x fuerza directriz de masa
Velocidad de transferencia de masa = KLa (Cg* - CL)
KL representa el coeficiente de transferencia de masa (cm/h), es la
concentración de oxígeno en la fase líquida y un área interfacial a, equivale a
la relación entre el coeficiente de difusión de oxígeno en el agua y el espesor
de la película a través de la cual se efectúa la transferencia; a representa la
superficie específica de transferencia (cm2/cm3); Cg* es la concentración de
oxígeno en la interfase gas-líquido y es casi igual a la solubilidad; CL es la
concentración de oxígeno en el seno de la solución y es proporcional a la
presión parcial del oxígeno en la burbuja, se calcula según la Ley de Henry:
CL = He.p
Siendo He la constante de Henry (n mol = 2/L atmóstera) y p la presión parcial
de oxígeno en la fase gaseosa (atmósfera) La contante de Henry varía con la
43
temperatura, haciendo variar la solubilidad que disminuye cuando la
temperatura aumenta a 37ºC. La concentración máxima de oxígeno que se
puede obtener con el aire como gas de oxigenación es alrededor de 7 ppm (p
en el aire = 0.209 atmósferas)
¿Cuáles son los problemas asociados al uso de erlenmeyers agitados
cuando se realizan experimentos de procesos fermentativos en el
laboratorio?
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Para aprender a controlar las variables que industrialmente se
utilizan en un proceso fermentativo, describa los métodos ofrecidos
por
el
mercado.
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Antes de continuar y para comprender los cálculos matemáticos que
se describen enseguida, es importante que usted recuerde el
funcionamiento de los multiplicadores de Lagrange4:
4
www.itpl.edu.mx /publica/tutoriales/investoper2/tema12
44
BALANCE DE MATERIA EN PROCESOS CON CÉLULAS
Representando el sistema como una caja negra donde todas las corrientes
entran:
O2
M5
M3
Producto
Biomasa (X)
M2
M4
Fuente
Fuente de
Nitrógeno
Carbono –
M1
(P)
de
(N)
Sustrato (S)
M7
M6
H2O (W)
CO2
y expresando las composiciones normalizadas de biomasa, sustrato y
producto por átomo de carbono:
CHa1Ob1Nc1
CHa2Ob2Nc2
CHa3Ob3Nc3
Cd4Ha4Ob4Nc4
Biomasa
Sustrato
Producto
Fuente de nitrógeno
Se pueden plantear los balances de carbón, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno
así:
Elemento
Carbón
Hidrógeno
Oxígeno
Nitrógeno
45
X
M1
a1M1
b1M1
c1M1
+S
M2
a2M2
b2M2
c2M2
+P
M3
a3M3
b3M3
c3M3
Balance
+N
+ O2 + CO2
d4M4
M6
a4M4
b4M4
2M5
2M6
c4M4
+W
2M7
M7
Suma
=0
=0
=0
=0
Revisando los grados de libertad:
Siete variables - cuatro ecuaciones = tres grados de libertad.
Aplicando multiplicadores de Lagrange para cada una de las ecuaciones:
λC (M1 + M2 + M3 + d4M4 + M6) = 0
λH (a1M1 + a2M2 + a3M3 + a4M4 + 2M7) = 0
λO (b1M1 + b2M2 + b3M3 + b4M4 + 2M5 + 2M6 + M7) = 0
λN (c1M1 + c2M2 + c3M3 + c4M4) = 0
Desarrollando los multiplicadores de Lagrange:
M1 (λC + λHa1 + λOb1 + λNc1) + M2 (λC + λHa2 + λOb2 + λNc2) + M3 (λC + λHa3
+ λOb3 + λNc3) + M4 (λCd4 + λHa4 + λOb4 + λNc4) + M5 (2λO) + M6 (λC + 2λO)
+ M7 (2λH + λO) = 0
Llamando los valores obtenidos entre paréntesis, grados generalizados de
reducción γi, y simplificando la ecuación, el balance de materia del sistema se
puede presentar así:
M1γ1 + M2γ2 + M3γ3+ M4γ4 + M5γ5 + M6γ6 + M7γ7 = 0
Suponiendo:
γ4 = γ6 = γ7 = 0 y λH = 1
y resolviendo:
0
0
M1γ1 + M2γ2 + M3γ3 + M4γ4 + M5γ5 + M6γ6 + M7γ7 = 0
γ1
γ2
γ3
γ4
γ5
γ6
γ7
=
=
=
=
=
=
=
γx = λC + λHa1 + λOb1 + λNc1
γs = λC + λHa2 + λOb2 + λNc2
γp = λC + λHa3 + λOb3 + λNc3
γn = λCd4 + λHa4 + λOb4 + λNc4
γo = 2λO
γco2 = λC + 2λO
γw = 2λH + λO
Como λH = 1 entonces:
γ7 = γw = 2(1) +λO = 0 ∴ λO = -2
46
0
γ6 = γco2 = λC + 2(-2) = 0 ⇒ λC = 4
γ4 = γn = (4)d4 + (1)a4 + (-2)b4 + λNc4 = 0 ∴ λN = (2b4 - a4 - 4d4)/c4
Si la fuente de nitrógeno es amoniaco (NH3), Cd4Ha4Ob4Nc4 queda: C0H3O0N1,
al reemplazar los valores de a4 = 3, b4 = 0, c4 =1 y d4 = 0
Por lo tanto λN = (2(0) - (3) - 4(0))/1 = -3
Ahora es necesario calcular los valores de los γi restantes:
γ1 = γx = 4 + a1 - 2b1 + [(2b4 - a4 - 4d4)/c4]c1
γ2 = γs = 4 + a2 - 2b2 + [(2b4 - a4 - 4d4)/c4]c2
γ3 = γp = 4 + a3 - 2b3 + [(2b4 - a4 - 4d4)/c4]c3
γ5 = γo = 2(-2) = -4
Como el balance se expresó en función de las masas y de los γi, es posible
dividirlo por M1 y quedaría presentado así:
γ1 + (M2/M1)γ2 + (M3/M1)γ3+ (M4/M1)γ4 + (M5/M1)γ5 + (M6/M1)γ6 + (M7/M1)γ7 =
0
Las relaciones presentadas se conocen como rendimientos (Y), de este
modo:
YX/S = M2/M1
YO/X = M5/M1
YP/X = M3/M1
YCO2/X = M6/M1
YN/X = M4/M1
YH20/X = M7/M1
Además, como unas corrientes entran y otras salen, la dirección de éstas se
representa por αi, de forma tal que las de entrada equivalen a +1 y las de
salida a -1, por lo tanto el balance de materia se debe escribir como sigue:
α1γ1 + α2γ2YS/X + α3γ3YP/X + α4γ4YN/X + α5γ5YO/X + α6γ6YCO2/X +
α7γ7YH2O/X = 0
47
LECCION DIESIOCHO
PARA COMPRENDER MEJOR EL BALANCE DE MATERIA,
REALICEMOS JUNTOS EL SIGUIENTE EJERCICIO:
Industrialmente se dispone de dos métodos para producir etanol. El primero
de ellos utiliza Saccharomyces cerevisiae y presenta un YX/S = 0.4; el segundo
utiliza Zymomonas mobilis y su YX/S = 0.06. Determinar para cada caso, el
porcentaje de rendimiento respecto al teórico cuando la fuente de carbono y
energía es glucosa y la fuente de nitrógeno es amoniaco. La reacción
metabólica es:
2 CH3CH2OH + CO2
C6H12O6
Cálculo del YP/S teórico: Para definirlo, es necesario plantear la ecuación
normalizada y balancearla:
6 CH2O
Sustrato
CH2O
Sustrato
4 CH3O0.5 + 2 CO2
Producto
4/6
CH3O0.5 + 2/6 CO2
Producto
Luego el YP/S|Teórico = 4/6 = 0.6667
Balance para el proceso con Saccharomyces cerevisiae: Recordemos
que γ4 = γ6 = γ7 = 0
Además como el proceso es anaeróbico no hay masa de oxígeno ∴M5 = 0
0
0
0
α1γ1M1 + α2γ2M2 + α3γ3M3 + α4γ4M4 + α5γ5M5 + α6γ6M6 + α7γ7M7 = 0
Como se conoce YX/S, se debe dividir todo por la masa del sustrato:
α1γ1(M1/M2) + α2γ2(M2/M2) + α3γ3(M3/M2) = 0
reemplazando ahora, por los Y correspondientes, se tiene:
α1γ1YX/S + α2γ2 + α3γ3YP/S = 0
48
0
Para definir los valores α, se ubican las corrientes de entrada y las de salida:
Corrientes de entrada: Biomasa y sustrato ⇒ α1 = α2 = +1
Corriente de salida: Producto ⇒ α3= -1
Entonces:
γ1YX/S + γ2 - γ3YP/S = 0
Por lo tanto:
YP/S = (γ1YX/S + γ2)/γ3
Bien, ahora se deben calcular los valores de γ1, γ2 y γ3, razón por la cual es
necesario definir la composición de cada una de las corrientes:
Corriente
Fórmula
general
Fórmula del
compuesto
Biomasa
CHa1Ob1Nc1
CHa2Ob2Nc2
Sustrato
CHa3Ob3Nc3
Producto
Fuente de nitrógeno Cd4Ha4Ob4Nc4
1
Fuente: Nagai, 19??
Luego:
a4 = 3.0
a1 = 1.75
a2 = 2.0
a3 = 3.0
b4 = 0.0
CH1.75O0.45N0.21
C6H12O6
C2H6O
NH3
b1 = 0.45
b2 = 1.0
b3 = 0.5
c4 = 1.0
Fórmula a
utilizar en el
balance
CH1.75O0.45N0.2
CH2ON0
CH3O0.5N0
C0H3O0N
c1 = 0.2
c2 = 0.0
c3 = 0.0
d4 = 0.0
Como:
γ1 = γx = 4 + a1 - 2b1 + [(2b4 - a4 - 4d4)/c4]c1
⇒
γ1 = 4 + 1.75 - 2(0.45) + [(2(0) - 3 - 4(0))/1.0]0.2
4.25
γ2 = γs = 4 + a2 - 2b2 + [(2b4 - a4 - 4d4)/c4]c2
γ3 = γp = 4 + a3 - 2b3 + [(2b4 - a4 - 4d4)/c4]c3
∴
γ2 = γS = 4.0
γ3 = γP = 6.0
Reemplazando en YP/S:
YP/S = (γ1YX/S + γ2)/γ3 = (4.25 (0.4) + 4)/6
49
γ1 = γx =
⇒
YP/S = 0.95
Cálculo del porcentaje de rendimiento con respecto al teórico,
utilizando levadura para producir etanol:
Como:
% Rendimiento = (YP/S / YP/S|Teórico) * 100
entonces:
% Rendimiento = (0.95/0.6667) * 100 = 142.49
Por lo tanto el % Rendimiento respecto al teórico, para la producción
de alcohol con levadura es del 142.49 %
Muy bien, continúe usted. Asegúrese de aplicar los conocimientos
adquiridos para definir el % de Rendimiento en la producción de
alcohol con Zymomonas mobilis, considere la composición
normalizada de la bacteria equivalente a CH1.8O0.5N0.2.
50
¿Cuál de los dos rendimientos es mayor?
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FERMENTADORES
Son recipientes para el cultivo de células microbianas, animales o vegetales
que buscan producir algún metabolito o bien la biomasa misma. Su función es
proporcionar, en forma homogénea, las condiciones químicas y fisicoquímicas
en las que el cultivo presente los máximos rendimientos.
Tipos de fermentadores
1. Tanque con agitador: Es el tipo de fermentador más usado en el ámbito
industrial. Es un tanque cilíndrico con una relación altura / diámetro
generalmente mayor a 2, equipado generalmente con cuatro mamparas y 3
a 5 agitadores de turbina (tipo Rushton), con una relación del diámetro del
impulsor a diámetro del tanque de 1/3. Por razones mecánicas, el tamaño
de estos fermentadores está limitado a volúmenes de 200 m3.
2. Columna de burbujeo: Este tipo de fermentador es usado en la industria
para la producción de ácido cítrico, enzimas, ácido láctico, esteroides,
levadura de panificación, entre los más importantes. Consiste en un cilindro
cuya relación altura / diámetro es mayor a 3. Se encuentra equipado con un
distribuidor de aire. Una de las desventajas de este tipo de reactor es la
excesiva generación de espuma.
3. Fermentador de recirculación: Las dos variantes más usadas son el
fermentador air lift y el fermentador jet de recirculación. El primero es
fundamentalmente una columna de burbujeo a la que se le ha agregado un
tubo concéntrico por el que se distribuye el aire. El segundo es similar al
fermentador air lift solo que, en adición a la corriente gaseosa, el líquido se
bombea para crear una velocidad de recirculación mayor. Se usan en la
producción comercial de anticuerpos monoclonales, en la producción de
proteína unicelular y en los sistemas de tratamiento de aguas (Galindo,
1995)
Para conocer información sobre los proveedores latinoamericanos de
fermentadores, revise en Internet la información referente a la New
Brunswick Scientific Co (U.S.A.) y a las firmas europeas Chemap, A.G.,
Bioengineering A.G., Braun y Biolafitte.
51
Características de los fermentadores más usados en varias escalas
Nivel de
escalado del
Características
fermentador
Investigació Matraces agitados de 200 ml.
n
Pueden utilizarse deflectores,
para incrementar la capacidad
de transferencia de oxígeno.
Se esterilizan en autoclave.
Laboratorio
Fermentadores agitados de
0.5 a 5 lts con dispositivos de
control de temperatura, pH y
rompimiento de espuma.
Se esterilizan en autoclave.
Banco
Fermentadores agitados,
similares a los de laboratorio,
pero con volúmenes de
trabajo entre 5 y 15 lts.
Se esterilizan en autoclave.
52
Usos
• Selección de cepas.
• Desarrollo y
optimización de
medios de cultivo.
• Establecimiento
preliminar de
condiciones de
cultivo (como pH y
temperatura)
• Estudios cinéticos de
crecimiento y de
formación de
productos.
• Estudios de
correlaciones de
transporte y
mezclado.
No son adecuados para el
desarrollo de cultivos viscosos.
• Estudios de
correlaciones de
transporte y
mezclado.
No son adecuados para el
desarrollo de cultivos viscosos.
Planta Piloto Fermentadores flexibles con
tamaños que oscilan entre tres
niveles:
1. 15 y 100 lts
2. 200 y 600 lts
3. 2500 y 3700 lts
Cuentan con sellos mecánicos.
Se esterilizan mediante
inyección de vapor directo
Industriales Son fermentadores cuyo
volumen de producción varía
entre los 100 y los 20000 m3.
Se utilizan “estoperas” para
lograr la operación estéril de
los sistemas de agitación.
Fuente: Galindo, 1995
Es una pequeña fábrica en
donde se desarrollan y
estudian procesos.
Producción industrial.
Para visualizar mejor el concepto, incluya en esta sección un plano
detallado de un fermentador e indique su aplicabilidad.
Conceptos básicos de diseño
Para diseñar un
características:
fermentador
es
preciso
establecer
las
siguientes
1. Dimensiones geométricas: Dependen de la capacidad de operación, la
cual está a su vez definida por el volumen de producción del producto en
cuestión. Se opera normalmente al 70% de la capacidad nominal (debido
en parte a la generación de espuma), el cálculo del volumen nominal se
reduce a establecer las dimensiones de un cilindro con relación altura /
diámetro de entre 1.5 y 2.5
2. Número y tipo de impulsores: Generalmente se utilizan las turbinas
Rushton, Mig e Intermig. El número de impulsores depende del volumen de
trabajo del fermentador y de las características reológicas del caldo de
cultivo.
3. Capacidad del motor: Está determinada por el tipo y número de
impulsores que se utilicen, la velocidad de agitación, la viscosidad del fluido,
las pérdidas por fricción y la eficiencia del motor.
4. Aireado: El aire se introduce por el fondo del tanque de fermentación a
través de aireadores de diversos tipos: de placas, tubos, en forma de
candela, de regadera, o de falsos fondos5, mediante instrumentos de tipo
utilizando una malla de salida ubicada de forma tal que distribuya las burbujas
uniformemente por la sección transversal del tanque (Cate et al., 19??).
5
53
fijo o móvil construidos con metal no corrosivo; empleando un tamaño de
burbujas entre 0,025 y 25 mm de diámetro, el cual se obtiene por ejemplo,
con tubos de aireación cuyos orificios están entre 0,4 y 0,8 mm de diámetro
o bien, si se quiere un tamaño de burbuja más fino, con dispositivos porosos
que pueden obstruirse y requieren mayores presiones de aire. De otro lado,
cuando una determinada cantidad de aire pasa a través del líquido, el área
superficial de las burbujas y el tiempo de contacto con el medio aumentan al
disminuir su tamaño. Además, la valoración correcta de las necesidades de
aire se basa en la información disponible en relación con la altura del caldo
(en cada momento) en el fermentador, la concentración del microorganismo
en relación con el tiempo, el rendimiento del microorganismo por unidad de
materia prima y la relación entre biomasa nueva y biomasa sembrada.
Generalmente, las necesidades de aire, se expresan en ft3/galón de caldo
(Cate et al.), 1992).
5. Capacidad para mezclar el líquido y el gas: En condiciones normales
de operación, los tiempos de circulación promedio en un tanque industrial
operando con un fluido viscoso y pseudoplástico son de alrededor de 70 s.
6. Capacidad de transferencia de oxígeno: La transferencia de oxígeno es
el parámetro de diseño más importante. En tanques agitados el KLa
(coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno) es una función de la
potencia aplicada por agitación, de la velocidad superficial del aire
introducido y de la viscosidad del fluido.
7. Capacidad de transferencia de calor: Los procesos de fermentación son
exotérmicos y requieren control permanente de la temperatura. El área de
transferencia disponible de la chaqueta no es suficiente y prácticamente
todos los fermentadores con capacidad superior a los 1000 litros necesitan
de un serpentín interno.
8. Diseño mecánico: Debe garantizar que el tanque soporte la presión de
esterilización, sea estructuralmente estable y conserve la asepsia. Además,
la flecha estará firme y alineada, será resistente al torque aplicado y no
llegará a su velocidad de resonancia.
Con el fin de observar los alcances de la automatización, consulte a
través de Internet sobre, El FERMACS: un sistema computarizado
para supervisión y control científico de fermentadores, desarrollado
por el CIGB.
De él, enuncie sus características generales, los
requerimientos de hardware, así como, sus diferentes opciones de
control y supervisión.
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Nacional. Universidad Nacional de Colombia. 1996.
56
17.Morris, Levin y Michael, Gealt. Biotratamiento de Residuos Tóxicos y
Peligrosos.
Selección, Estimación, Modificación de Microorganismos y
Aplicaciones. D’Vinni editorial Ltda. Colombia. 1998.
18.Nagai, S. Mass and Energy Balances for Microbial Growth Kinetics.
Departament of Fermentation Technology.
Faculty of Engineering.
Hiroshima University. Hiroshima, Japan. 19??.
19.Pelczar, Michael; Reid, Roger y Chan, E. C. S. Microbiología. Mc Graw Hill. Cuarta edición. México. 1990.
TRABAJO DE COMPLEMENTACIÓN
Conteste las siguientes preguntas
1. ¿Cuáles son los ceparios más conocidos y dónde están ubicados?
2. ¿Cuáles son los intervalos de temperatura a los cuales se
desarrollan los microorganismos psicrofílicos, mosofílicos y
termofílicos?
3. ¿En qué consiste o qué se entiende por medio mínimo y medio
complejo?
4. ¿Qué significa crecimiento balanceado y en qué etapa de
crecimiento es más probable que se presente?
5. ¿Cómo las células, en un cultivo estacionario, reciben oxígeno?
6. ¿Qué factores limitan la altura de un biorreactor?
7. ¿Qué ventajas tienen los reactores air lift sobre los reactores de
columna de burbujeo?
8. ¿Cuál es el principio físico del reactor U.A.S.B.?
9. ¿Cómo se consigue la transferencia de oxígeno en un reactor de
lloriqueo (trickle bed reactor)?
10.¿Por qué se prefiere incubar en una posición horizontal?
Resuelva los siguientes problemas
1. En una esterilización por lotes, los nutrientes se destruyen más
rápidamente que los microorganismos.
Se propone por
consiguiente el siguiente esquema: a.- Esterilizar los nutrientes
separadamente en un recipiente donde el volumen es menor Vo =
Va/100 del total a fermentar y donde se consigue una velocidad de
calentamiento 10 veces mayor, igual de enfriamiento.
b.Esterilizar el volumen restante en el fermentador y al final
adicionar la solución de nutrientes.
57
En qué porcentaje se incrementaría la concentración real de
nutriente al iniciar la fermentación con el nuevo sistema, referido
al tradicional por lotes?
Tomar como sustancia modelo, por ejemplo, el triptófano,
suponiendo que la concentración teórica que se conseguiría al
iniciar la fermentación fuera 0.001 g/l. Suponer coeficientes de
transferencia para tanque agitado, relación H/D = 1.5, volumen
útil 0.75 del volumen total. Temperatura del agua de enfriamiento
disponible: 15ºC
Cuq y Cheftel, en 1983 reportaron mediante curvas de correlación
la degradación térmica del triptófano:
En presencia de aire, la degradación del triptófano aumenta con la
temperatura y el tiempo, formándose derivados pardos parcialmente
insolubles. La reacción cinética puede estequiométricamente como sigue:
Triptófano + O2
Derivados oxidados
Polímeros pardos insolubles
d[derivados oxidados]/dt = k[triptófano]a x [O2]b
En presencia de aire o de oxígeno, puede asumirse que la concentración de
oxígeno disuelto remanente es constante durante la reacción y la ecuación
cinética de primer orden puede escribirse:
d[triptófano]/dt = kaparente x [triptófano]
y
ln [triptófano] = - kaparente x t + ln [triptófanoo]
Cuando el tratamiento térmico se realiza en presencia de aire, las líneas de
regresión y sus coeficientes de correlación son:
a 90ºC
a 110ºC
a 140ºC
ln [trp] = -2.5x10-3 x t + 2.30
ln [trp] = -15x10-3 x t + 2.30
ln [trp] = -78x10-3 x t + 2.28
r = 0.999
r = 0.992
r = 0.995
La energía de activación de la reacción puede ser calculada con la ecuación
de arrenius: ln k = (- Ea/RT) + constante
De resultados experimentales, a varias temperaturas, se obtuvo la
siguiente ecuación: ln K = (-9703 x (1/T)) + 20.9 r = 0.986
58
Por lo tanto la energía de activación de la degradación térmica del triptófano
en solución y en presencia de aire es igual a 80570J/mol.
2. Con base en la composición media de la melaza de caña, determine
su fórmula condensada y el factor de reducción, considerando C, N,
O, P, S, H.
3. Si en una fermentación alcohólica con Saccharomyces cerevisiae,
en ausencia de oxígeno, se emplea glucosa como fuente de carbono
y se sustituye el amoníaco por urea. ¿Cómo se afectan los factores
YP/S, y YX/S? Si se sustituye el amoníaco por nitrato de amonio,
¿qué pasará con estos factores y con la cantidad de CO2
producido?.
Haga e indique las consideraciones que crea convenientes.
4. Partiendo de las siguientes condiciones iniciales de biomasa y
sustrato limitante, respectivamente:
Xo = 4,468 g/l y So = 1.0 g/l.
Utilizando la ecuación de Monod expresada como:
dX/dt = µX
donde
µ = (µmáx.S)/(Ks +S) y (X-Xo) = Y(So-S)
Y haciendo uso de los datos experimentales dados en la tabla
adjunta, calcule los valores de µmáx, Ks y Y.
Datos experimentales para el modelo de Monod reportados para un
cultivo de Tricoderma viride en glucosa (Young, 1985)
Tiempo
(h)
0
1
2
3
4
5
59
[celular]
(g/l)
0,468
0,522
0,576
0,626
0,672
0,713
[sustrato]
(g/l)
1,0000
0,8709
0,7421
0,6177
0,5021
0,3986
Tiempo
(h)
10
11
12
13
14
15
[celular]
(g/l)
0,829
0,839
0,847
0,853
0,857
0,860
[Sustrato]
(g/l)
0,0946
0,0683
0,0490
0,0349
0,0248
0,0176
6
7
8
9
0,747
0,776
0,798
0,816
0,3095
0,2355
0,1761
0,1298
16
17
18
19
Rta: µmáx = 0.5 hr-1; Ks = 3.3 g/l; Y = 0.4
60
0,862
0,864
0,865
0,866
0,0124
0,0088
0,0062
0,0044
ANEXOS
ESTUDIO DE CASO: APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA EN LA
INDUSTRIA CERVECERA
Para comprender la aplicabilidad de la biotecnología en la industria cervecera
es importante que usted recuerde el proceso de producción e identifique los
puntos críticos de control. Elabore entonces, un documento que le permita
alcanzar este objetivo.
Para la resolución de este ejercicio deb leer todo la formulación del estudio de
caso y resuelva cada uno de los interrogantes y envíe la solución.
La información presentada a continuación corresponde a una serie de
afirmaciones del proceso, está intercalada con preguntas que permiten
consolidar conceptos y promueve la solución de problemas propios de la
industria.
Facilite la comprensión, ubicando cada afirmación sobre el diagrama
de flujo del proceso.
Materia prima
La malta de cebada fué la materia prima más importante para la producción de
extracto y, al mismo tiempo, la única fuente esencial de enzimas. Sin
embargo, es una materia prima cara, debido fundamentalmente, al tiempo
requerido en el proceso de malteado y a la pérdida de energía ocurrida durante
el mismo.
¿Es posible emplear otros granos como fuente de almidón para la
producción de extracto? __________ ¿Cuáles?
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_______________________________________________________
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Para obtener un extracto más barato se utilizan granos crudos (o adjuntos),
materiales no malteados preparados de granos de cereales, tales como arroz,
sémola de maíz o cebada.
Alternativa
Para obtener un rendimiento inalterado de extracto, deben utilizarse
1,2 kilogramos de cebada por kilogramo de malta sustituido (la
cebada tiene
un contenido de humedad más alto que la malta).
La cebada no necesita cocción, ya que el almidón se licúa más o
menos a la misma temperatura que la malta. Puede mezclarse con
la malta durante la maceración.
¿Contienen los granos crudos (o adjuntos), una cantidad adecuada de
enzimas? __________ ¿Cuáles?
_______________________________________________________
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¿Qué son los grits?
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Cuando se utilizan materiales no malteados, se limita la cantidad de grano
crudo en el total de la mezcla y es necesario sustituir o suplir las enzimas de la
malta.
Silos de malta
En ocasiones se utiliza malta poco modificada, en la que los β-glucanos no
están muy degradados.
62
Molienda
La molienda y trituración de la malta facilita la extracción de sus componentes
por el agua; permite el trabajo de las enzimas sobre los almidones y proteínas,
y finalmente, garantiza un mosto de composición adecuada para la producción
de cerveza.
Alternativa
Al igual que para la malta, para moler la cebada puede utilizarse
tanto el método de molienda en húmedo como el de molienda en
seco, sólo con pequeños ajustes:
Molienda en húmedo: El grano y la gluma se ablandan durante
la maceración. La cebada y la malta pueden molerse juntas, pero
es mejor moler la cebada por separado con una distancia de rodillos
de sólo 0,2 mm en un molino de dos rodillos, mientras que la
distancia típica para la malta es de 0,3 - 0,5 mm. Para la cebada es
apropiado un molino de malta con un 50% más de potencia de motor.
Molienda en seco: Mientras que normalmente se prepara la malta
antes de molerla para aumentar su contenido en humedad, esto no
es necesario para la cebada, ya que contiene un 10-12% de humedad.
Para sustitución baja de la malta por cebada, ésta debe mezclarse
con la malta antes de la trituración y deben molerse juntas.
Silos de adjuntos
Algunos de los cereales que se utilizan como granos crudos contienen grandes
cantidades de β-glucanasas y/o pentosanos.
Olla de crudos
La licuefacción de los granos crudos tradicionalmente se realiza en la caldera
de crudos, conjuntamente con un 10 - 20% de malta, como fuente de αamilasas.
63
La temperatura de empaste depende del proceso: al comienzo, puede estar
entre 45 - 65ºC, pero después, alcanza los 85 - 100ºC, durante 15 - 30
minutos. Sin embargo, como los gránulos de almidón gelatinizan a una
temperatura superior a la que soportan las enzimas de la malta, se obtiene
como resultado una mezcla bastante viscosa, cuya licuefacción es incompleta.
Solución
El empleo de una α-amilasa termoestable garantiza la completa
licuefacción de los granos de almidón y, por consiguiente, una
menor viscosidad. Facilita además, el proceso de bombeo y la
posterior adición a la olla de mezclas.
La dosis de estas enzimas depende de su actividad, pero puede
estar situada entre 250 - 500 g por tonelada de grano crudo.
La concentración del crudo debe estar entre el 20 y el 30%.
Olla de mezclas
Mientras la masa de triturados hierve en la olla de crudos, la masa de malta se
agita en la olla de mezclas. Después de un tiempo determinado, se bombea la
masa de crudos sobre la masa de malta y bajo ciertas condiciones de
temperatura y tiempo actúan las enzimas de la malta transformando los
almidones en azúcares fermentables.
Los mostos viscosos contienen polisacáridos como β-glucanos y pentosanos,
que causan una salida lenta en la cuba-filtro y en los filtros de producto
terminado.
Solución
El uso de β-glucanasa bacteriana en mostos viscosos reducirá
bastante, tanto el tiempo de salida de la cuba-filtro, como el de la
filtración final de la cerveza.
Las dosificaciones relativamente pequeñas tienen un efecto bastante
eficaz sobre el β-glucano. Se considera normal una dosificación
entre 0.2 y 0.5 Kg por tonelada de malta. Si se usan cantidades de
cebada, como grano crudo, superiores a un 10%, se aumenta la dosis
hasta 2.0 Kg por tonelada de malta/cebada.
64
La pérdida de extracto no sólo se debe a glucanos y pentosanos de alto grado
molecular, sino que también puede tener su origen en el material restante de
la pared celular, el cual impide una degradación y descomposición completa del
almidón.
Solución
Añadir un complejo de enzimas que, además de β-glucanasas,
contenga celulasas, hemicelulasas y pectinasas, entre otras, con el
fin de disminuir al mínimo la pérdida de extracto, así como la
salida y el tiempo de filtración.
La dosificación de estas enzimas debe establecerse mediante
ensayos en cada caso individual, pero suele ser entre 0.2 y 1.0 Kg
por tonelada de malta o malta/cebada.
Olla de cocción de mosto
El mosto pasa a la olla de cocción para hervirlo por un tiempo aproximado de
dos horas, con el objeto de estabilizarlo químicamente, esterilizarlo y agregarle
el lúpulo que da a la cerveza su sabor característico.
En ocasiones, el mosto contiene almidón y el almidón no convertido, presente
en la cerveza acabada, tiene un efecto negativo sobre la calidad, tanto en lo
que se refiere al sabor como a la estabilidad. Además, dificulta la filtración de
la cerveza.
Solución
Puede añadirse una pequeña cantidad de α-amilasa termoestable
a la caldera del mosto para convertir el almidón en dextrinas.
Se adicionan 2 g/hl de una α-amilasa termo-resistente antes de
hervir el mosto.
65
En otros casos, la fermentación presenta problemas y aunque es cierto que
puede ajustarse variando el tiempo de sacarificación y las temperaturas de
fermentación; otra manera de ajuste es mediante la adición de enzimas
microbianas en la sala de cocción.
Solución
Añadir 1 - 2 Kg de α-amilasa fúngica por tonelada de malta.
Sedimentación
El mosto se recibe en un tanque de sedimentación, donde se separan algunas
sustancias insolubles formadas durante la cocción.
Enfriador de mosto
El mosto se somete a temperaturas de 7 a 9ºC dependiendo de las
características que se deseen para el producto final y mediante la acción de la
levadura se inicia el proceso de fermentación.
Sobre el mosto frío también puede encontrarse almidón.
Solución
Debe añadirse α-amilasa fúngica cuanto antes, ya sea en la fase
de trasiego o en la de Krausening. Cuando el procesado se hace
sobre un Unitank, puede agregarse la enzima durante la circulación,
junto con los estabilizadores.
A una temperatura de 10 - 12 ºC, la dosis recomendada es 0,5 g/hl,
mientras que a 4 ºC la dosis es de 1,0 g/hl.
Si quedan β-glucanos presentes en la cerveza acabada se puede obtener una
filtración lenta y una cerveza turbia. Éste es uno de los momentos para
resolver el problema.
66
Solución
Este problema puede evitarse utilizando β-glucanasa fúngica
(0,5 – 1,0 g por hl de mosto) al mosto enfriado durante el sembrado.
Fermentación
El tiempo de fermentación es de siete días, sin embargo, cuando el mosto tiene
bajo contenido de α-aminoácidos y péptidos, la fermentación se torna
demasiado lenta.
Solución
La adición de una proteinasa bacteriana tiene un efecto positivo,
puesto que aumenta la solubilidad de los compuestos nitrogenados.
Sin embargo, cada vez menos empresas usan las enzimas durante
la fermentación. La razón principal es que hay grandes dificultades
para inactivarlas después de su uso.
Los β-glucanos presentes en esta sección, también pueden ocasionar una
filtración lenta y una cerveza turbia.
Solución
Este problema puede evitarse utilizando β-glucanasa durante la
fermentación.
Maduración
De los tanques de fermentación, la cerveza pasa por un enfriador y de allí a los
tanques de maduración, donde permanece por un período de 2 a 3 semanas a
0ºC para mejorar el sabor del producto y clarificar la cerveza.
67
En ocasiones se descubren residuos de almidón en la cerveza, justamente
antes de la filtración.
Solución
Es necesario transferir la cerveza a otro tanque, añadir una α-amilasa
fúngica y prolongar el período de maduración dos días.
Se adiciona 1,0 g/hl de enzima en cinco días o 3,0 g/hl en dos días.
Aún en esta sección se pueden detectar β-glucanos, polímeros que generarían
la filtración lenta y la cerveza turbia.
Solución
Debe añadirse aquí β-glucanasa fúngica y prolongar la maduración
en 2-5 días.
Filtración
A una temperatura de -1 ºC, la cerveza pasa a través de páneles de celulosa o
tierra de diatomaceas, para eliminar pequeñas cantidades de levadura y las
partículas que puedan producir turbiedad, obteniéndose así una cerveza clara y
brillante. Esta cerveza se recibe en tanques llamados de contrapresión,
quedando lista para ser envasada.
¿Qué tipo de enzima utilizaría usted si pese a todas las soluciones
propuestas, la cerveza sigue saliendo turbia, debido a la acción del
cobre o del hierro presentes en el agua sobre las albúminas?
Solución
68
De otro lado, por diversos motivos tecnológicos, se requiere de modelos
matemáticos que describan el proceso fermentativo y permitan:
1. Simular qué puede suceder al aplicar unas u otras estrategias.
2. Predecir, a partir de unas condiciones iniciales concretas, la evolución futura
de un proceso, lo cual puede ser útil a efectos de optimización,
monitorización y control.
3. Hacer posible la creación de “sensores en software”, que permitan medir
indirectamente, en tiempo real, las variables importantes, de tal modo que
se potencie de monitorización y supervisión de los procesos.
Planta de experimentación
Para poder realizar estudios experimentales, manteniendo la temperatura de
fermentación constante, se requiere del diseño y construcción de una planta de
experimentación isoterma, con dimensiones y características energéticas que
permitan la realización de varias fermentaciones simultáneas (hasta 24), en
idénticas condiciones de temperatura.
La planta debe constar de las siguientes partes:
1. Tanque de agua: Sirve de baño maría.
2. Fermentadores sumergidos
3. Sistema de enfriamiento del agua: Bombea agua para que pase a
través de un serpentín dentro de un congelador, con un caudal constante (3
l/min). Este circuito no debe pararse y debe estar conectado al tanque de
agua.
4. Sistema de calentamiento del agua: Bombea agua con un caudal
constante (3 l/min), y hace que pase por el interior de un tubo metálico al
que se arrolla una resistencia eléctrica aislada (1000 wat, 220 volt).
5. Sensores: De temperatura, pH
6. Electrónica de adaptación
7. Computadora: Mediante sus salidas digitales, controla la puesta en
marcha, o la desactivación, de la bomba de agua caliente y de la resistencia.
Mide la temperatura y el pH de las fermentaciones, y la temperatura del
agua del tanque. Deberá estar dotada de una placa de toma de datos con
un conversor analógico/digital con varios canales de entrada y varias salidas
digitales.
69
¿Qué es un conversor analógico/digital?
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Durante los experimentos, la computadora se ocupa de mantener la
temperatura del baño maría en un valor predeterminado y de visualizar en
pantalla, mediante gráficos, los datos que va tomando; también puede
detectar, durante los experimentos, discordancias en los valores medidos de
temperatura y pH, y avisar al operador.
Estudio preliminar
Para obtener un conocimiento cualitativo del proceso se pueden efectuar en la
planta isoterma cuatro experiencias con seis recipientes cada una.
Descripción de la reacción: Obtención de alcohol y anhídrido carbónico, a
partir de un mosto azucarado, mediante la acción de una levadura apropiada
(distintas variaciones de Saccharomyces, según la empresa fermentadora).
70
Observaciones
Durante el tiempo total que dura el proceso, se distinguen en el
interior de los fermentadores distintas etapas:
Llenado del fermentador con mosto: En esta etapa se controla
la concentración de azúcares, la oxigenación inicial y la forma
geométrica del fermentador.
Inoculación de la levadura: En esta etapa son importantes la cepa
de la levadura, su generación y la concentración que se inyecta.
A las 10 horas de fermentación: Se aprecian visualmente seis capas.
La primera de ellas corresponde al precipitado de la biomasa inicial,
las demás presentan distinto color y transparencia.
A las 16 horas de fermentación: Se identifican cuatro capas.
Entre las 18 y 24 horas de fermentación: La capa del
fondo aumenta n poco. Se aprecia una progresión continua de
concentración de biomasa, mayor en el fondo y menor en la superficie.
Aparecen por primera vez, en la superficie, pequeñas manchas blancas.
Aproximadamente a las 40 horas de fermentación: El líquido se
homogeniza. El número y extensión de las manchas de la superficie
se incrementa. Comienzan a verse burbujas. Hay agitación interna.
Entre las 45 y 50 horas de fermentación: La superficie se llena de
espuma blanca. En el interior hay gran agitación debida al anhídrido
carbónico que se produce. En el fondo del recipiente se incrementa
la cantidad de biomasa inactiva.
Aproximadamente a las 120 horas de fermentación: La superficie
queda limpia de espuma. Cae la biomasa al fondo. Disminuye la
actividad interna.
A las 150 horas de fermentación: La superficie queda limpia y la
biomasa se deposita en el fondo. El líquido queda transparente, con
un color rubio acaramelado. Pocas burbujas y pequeñas. Se puede
dar por terminado el proceso de fermentación.
71
Analice las anteriores observaciones a la luz del crecimiento
microbiano y encuadre las etapas en tres fases fundamentales: fase
de latencia, fase de fermentación principal o tumultuosa y fase de
fermentación secundaria.
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Conclusiones
Durante el tiempo que dura el proceso, se distinguen tres fases
fundamentales: fase de latencia, fase de fermentación primaria y
fase de fermentación secundaria.
A lo largo de la fermentación, hay un proceso de sedimentación de
la biomasa, que se ve contrarrestado por la agitación interna.
La biomasa activa en suspensión tiene un papel preponderante
en la fermentación, para comprobar este punto, se pueden realizar
diversas experiencias “ad hoc”, decantando la capa de levadura
depositada en el fondo.
72
Planteamiento de las fermentaciones
Para la realización de cada experiencia, el sistema se preparará de la siguiente
forma:
1. Se esterilizan previamente todos los componentes que puedan estar en
contacto con el cultivo durante el proceso.
2. Se llenan los recipientes con 2,5 litros de mosto industrial y se espera el
tiempo necesario para que adquiera la temperatura base de cada proceso.
La fermentación se realiza con el mosto filtrado, con el fin de calcular las
concentraciones de biomasa con el menor error posible.
3. Se inocula, en cada recipiente, la levadura en la concentración que vaya en
cada frasco (40 ml).
4. Se introducen los sensores de pH, presión, temperatura y fotocélulas.
5. Se pone en funcionamiento el programa preparado para el control del
proceso y toma de datos por ordenador.
Esquema de muestreo
Para cada una de las fermentaciones se realizan tomas de muestra a lo largo
del tiempo, con mayor proximidad en las primeras horas de la fermentación, y
partiendo siempre del mosto. Se considera como punto cero el mosto más la
levadura. La toma de la muestra se debe efectuar a una altura media dentro
del fermentador y corresponde a 25 ml. Una vez obtenida, se filtra a través de
un filtro Millipore de 0,25 µm; el líquido filtrado se utiliza para la determinación
de azúcares y alcoholes.
Métodos analíticos
Determinación de la biomasa: La muestra filtrada a través del filtro
Millipore de 0,25 µm en condiciones óptimas de estreno, se coloca en una
estufa de secado durante 12 horas, a 32ºC. A continuación se pesa en una
balanza de precisión de 0,0001 g y se hacen los cálculos necesarios para la
determinación de la concentración de biomasa.
Describa los cálculos requeridos para determinar la biomasa.
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73
Describa la técnica para determinar los azúcares, mediante
cromatografía líquida de alta eficiencia.
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Resultados
Concentración de azúcares en el instante cero
Glucosa
Fructosa
0,76 ± 0,20 g/l
Maltosa
Sacarosa
1,46 ± 0,31
Total de azúcares
Maltotriosa
4,48 ± 0,45
7,11 ± 1,34 g/l
34,94 ± 0,59
48,22 ± 1,67
Concentración de azúcares en la fermentación a 12ºC
Tiempo Fructos
(Horas)
a
(VM)
0
6
12
24
30
36
48
60
72
84
96
120
144
VM: Valor
74
Glucosa
(VM)
Sacaros
a
(VM)
Maltosa
(VM)
1,62
7,76
0,74
1,77
6,84
0,00
2,02
5,81
0,00
2,04
3,62
0,00
1,79
2,40
0,00
1,44
1,52
0,00
0,71
0,00
0,00
0,52
0,00
0,00
0,74
0,00
0,00
0,22
0,00
0,00
0,14
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,20
0,00
0,00
medio de cada muestra analizada
Maltotrios
a
(VM)
26,17
26,84
34,23
33,76
39,46
35,92
22,96
12,59
10,76
6,71
4,52
2,01
1,75
por triplicado
3,82
4,69
5,20
4,61
6,66
8,41
5,24
3,87
3,00
1,94
2,20
1,24
1,31
en g/l.
Totales
(VM)
40,11
40,15
47,75
44,04
49,90
47,59
28,93
20,18
14,58
10,15
7,08
3,25
3,46
Concentración de azúcares en la fermentación a 16ºC
Tiempo Fructos
(Horas)
a
(VM)
Glucosa
(VM)
Sacaros
a
(VM)
Maltosa
(VM)
Maltotrios
a
(VM)
0
1,12
8,74
1,96
34,63
6,32
6
1,63
7,75
0,77
36,12
7,86
12
1,66
3,31
0,40
39,18
7,67
24
0,55
0,39
0,20
29,28
8,74
30
0,21
0,17
0,27
20,07
6,82
36
0,21
0,00
0,00
10,56
4,30
48
0,00
0,00
0,00
2,15
2,53
60
0,00
0,00
0,00
0,97
1,66
72
0,00
0,00
0,00
0,71
1,27
96
0,00
0,00
0,00
1,29
0,07
144
0,00
0,00
0,00
2,21
0,08
VM: Valor medio de cada muestra analizada por triplicado en g/l.
Construya una gráfica que compare el comportamiento
azúcares cuando la fermentación ocurre a 12ºC.
Totales
(VM)
54,53
54,13
52,42
39,03
27,90
15,45
4,51
2,66
1,93
1,35
2,38
de los
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
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Bioprocesses. Biotechnology and Bioengineering. Vol. 42. John Wiley and
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77
ESTUDIO DE CASO: ESTUDIO DEL EFECTO DE LA VELOCIDAD DE
AGITACIÓN
EN
LA
PRODUCCIÓN
DE
POLISACÁRIDOS
EXTRACELULARES
Complete entonces el siguiente cuadro describiendo la naturaleza del
polisacárido obtenido y sus aplicaciones
Acetobacter aceti
Microorganismo
Polisacárido
Acetán
Características
Acetan también es un polisacárido anionico
con un estructura celulosica pero con una
fracción de pentasacarido el consiste en
una cadena lateral de alfa-L-Rha-(1->6) - ¤
- D-Glc-(1->6)-alfa-D-Glc-(1->4) - ¤-DGlcA-(1->2)-alfa-D-hombre-(1->3) se unió
a cada otra glucosa en la estructura. Por
consiguiente, Acetan tiene una estructura
química estrechamente relacionado con el
xanthan. Las propiedades de la solución
también son similares a aquéllas de
xanthan.
Alcaligenes faecalis
Curdian
b-1,3-Glucan, Hidrato
el Beta-1,3 -glucan es un azúcar compleja
del fibra-tipo (polisacárido) derivada de la
pared de la célular de los
levadura para
panaderia, de la fibra de la avena y de la
cebada, y de muchas setas medicinales,
tales como maitake . En sus estados
naturales, la levadura y las setas contienen
una mezcla de beta-1,3-glucan y de beta1,6-glucan. La avena y la cebada contienen
una mezcla de beta-1,3-glucan y de beta1,4-glucan. Además de beta-1,3-glucan
purificado de estas fuentes, usted puede
ver los productos enumerados como beta1,3/1,6-glucan en la caja de productos
levadura-derivados y como beta-1,3/1,4glucan cuando está derivado de avena. (si
no) las características idénticas similares se
han demostrado para los extractos betaglucan-ricos
y
el
beta-beta-glucan
purificado derivados de avena, de levadura
de los panaderos, y de setas .
Las dos aplicaciones primarias del beta-
78
beta-glucan son realzar el sistema inmune
y bajar niveles del colesterol de la sangre.
Los estudios experimentales numerosos en
tubos
y
animales
demostrado
el
de
prueba
han
beta-beta-glucan
para
activar las células blancas de la sangre, allí
han sido centenares de investigación en el
beta-beta-glucan desde los años 60.
6
la
investigación indica que beta-1,3-glucan,
en detalle, es muy eficaz en las células
blancas de la sangre que activan conocidas
como macrófagos y neutrophils. Estas
células proporcionan una de las primeras
líneas de defensa de los sistemas inmunes
contra invasores extranjeros. Un macrófago
o un neutrofil beta-glucan-activado puede
reconocer y matar a las células del tumor,
quita la ruina celular resultando de daño
oxidative, acelera la recuperación del tejido
fino dañado, y activa más lejos otros
7
componentes del sistema inmune.
8
aunque la investigación en tubo de prueba
y los estudios animales es prometedora,
muchas preguntas permanecen sobre la
eficacia
del
beta-beta-glucan
como
suplemento oral realzar la función inmune
en seres humanos.
el Beta-beta-glucan es el factor dominante
para el efecto colesterol-que baja del
salvado de la avena como con otros
componentes
de
la
soluble-fibra,
el
atascamiento el colesterol (y los ácidos de
la bilis) por el beta-beta-glucan y de la
eliminación que resulta de estas moléculas
en las heces es muy provechosos para
reducir el colesterol de la sangre resultados
de un número de ensayos doble pared con
el beta-beta-glucan de la avena o levaduraderivado
indican
reducciones
típicas,
después por lo menos de cuatro semanas
79
de uso, de el aproximadamente 10% para
el colesterol total y el 8% para el colesterol
de LDL ("malo"), con elevaciones en el
colesterol
de
HDL
("bueno")
que
se
extiende a partir de la cero hasta el 16%.
Aureobasidium pullulans
Azotobacter indicus
Pullulan
Alginato
-1.4 ' -; -1,6'-Glucan
Peso Molecular: 50000-100000
Característico:
Hhidrolizado
por
el
pullulanase en más de 94% de maltotriosa.
Color : Blanco
Aspecto: polvo
Se utiliza para personas glicemicas dando
muy buen resultado.
Los estudios estructurales de S-7, otro
polisacárido del exocelular que contiene
ácido 2-deoxy-arabino-hexuronico,
bDGlcp(1-6)bDGlcp(1-6)+
|
-4)bDGlcp(1-4)aLRhap(1-3)bDGlcp(14)bD2darapHexA(1D2daraHexA = 2-deoxy-D-arabinohexuronic acid
Erwinia tahitica
Heteroglicanos.
D- glcp – Dgalp – Lfuc- DglcpA
Polisacarido Zanflo En relación 6:4:2:3 contiene 4.5 % de
acetilo
Polisacarido Zanflo
bDGalp(1-4)+
|
-3)aDGlcp(1-4)bDGlcpA(1-4)aLFucp(1-
Leuconostoc mesenteroides
Dextranos
80
Lso dextranos son
homopolisacaridos de
molécular que tienen
con enlaces alfa 1,6
alfa-D glucanos o
glucosa de alto peso
una cadena principal
y ramificaciones alfa
Sclerotium
Scleroglucan
1,3. El limo extracelular producido por el
Leuconostoc Mesenteroides es un ploblema
en la industria del azucar, pues este limo
recubre los tanques y el equipo, ralentiza la
filtración y altera la cristalización del
azucar. Estas mismas dextrinas se utilizan
en la industria alimentaria, farmaceutica y
química como estabilizantes alimentarios,
como sustitutos del plasma sanguíneo,
como anticoagulantes y absorbentes.
D-glucanas.
Grupo de gomas producidas por hongos del
género Sclerotium y también por especies
de los géneros Corticium, Sclerotinia y
Stromatinia
Polisacárido ramificado formado por
uniones
Nigerosa -(1 3)
con
ramificaciones genciobiosa -(1 6)
Grados de polimerización entre 500 y
1600 unidades. Y la comercial de 800
Shizophyllum commune
Shizophyllan
Xanthomonas campestris
Xantano
Beta (1,3 )D- Glucano tiene propiedades
anticancerigenas pertenece a la familia de
los Beta glucanos
La goma de xantano se produce de manera
comercial
desde
1967
gracias
al
crecimiento Xanthomonas campestris sobre
glucosa, sacarosa, almidón, azucares de
maíz, solubles de destilería, o suero ácido.
Este polimero polianionico se compone de
D- glucosa, D- manosa y ácido Dglucoronico en una proporción molar 2:2:1
con dos tipos de grupos carboxilo (acetato
y piruvato) y un esqueleto de alulosa. La
unida que se repite es un pentasacarido
constituido por un esqueleto de glucosa
Beta 1,4.Las principales ventajas de la
goma xantano como polímero alimentario
son el elevado rendimiento de producción
obtenido, las altas viscosidades obtenidas
con producción diluida de xantano,
unintenso comportamiento seudo plastico y
la gran estabilidad en amplios rangos de
pH.
81
Antes de continuar, fundamente sus conocimientos:
¿Es la aireación un parámetro crítico en una fermentación
sumergida?
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
____________________________________________
¿Qué efectos tiene el aporte de oxígeno sobre los organismos
aerobios?
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
¿Cómo se transporta el oxígeno a través de microorganismos que
crecen como pellets o agregados celulares?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
¿Puede llegar a afectar negativamente el objetivo del proceso el uso
de sistemas mecánicos que generen agitación en el interior del
sistema?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
¿Cuándo la agitación se produce mediante una turbina de paletas, se
puede originar daño debido a los cambios bruscos de presión que se
dan delante y detrás de cada una de las paletas y a los grandes
esfuerzos tangenciales en las inmediaciones del extremo de las
mismas?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
82
¿Qué es más sensible a los cambios bruscos de presión, originados en
un flujo turbulento, los organismos filamentosos y pelletiformes o
una célula individual?
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
¿Cuáles son los factores que producen stress a un microorganismo?
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
Ahora, proponga un método para determinar la concentración de
biomasa y uno para determinar la concentración de polisacárido.
Además, escriba y explique la ecuación Ostwald de Waele.
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Concentración (g/l) de biomasa y polisacárido (PS)
Tiempo
200 rpm
(h)
Biomasa
PS
0
0.3
1.5
20
0.6
2.2
40
4.0
2.5
60
7.0
3.4
80
7.5
3.8
100
7.5
3.9
120
7.5
3.9
300 rpm
Biomasa
PS
0.1
1.4
1.0
3.2
2.5
6.5
3.0
9.0
4.0
9.3
4.0
9.3
4.5
9.4
400 rpm
Biomasa
PS
0.1
1.3
1.0
3.0
3.5
5.8
5.0
7.6
6.0
8.5
5.5
8.5
5.5
8.5
Con los resultados anteriores construya una gráfica que muestre la
evolución de la concentración de biomasa y polisacárido, durante el
83
proceso de fermentación, para las diversas velocidades de agitación
ensayadas: 200, 300 y 400 rpm.
Grafica 1. Evolución de biomasa y polisacárido en el tiempo.
Análisis
Diferencias morfológicas
Para analizar las diferencias morfológicas tenga en cuenta las
siguientes preguntas:
¿Al operar el sistema a mayor velocidad de agitación se puede dañar
el microorganismo?, ¿Por el tamaño reducido de los pellets, se podría
pensar que es posible disminuir las barreras difusionales e
incrementar el área interfacial de contacto entre fases, llevando a un
incremento en la producción de polisacárido?, ¿el comportamiento
mostrado se debe al efecto negativo irreversible que el empleo de un
agente mecánico, para lograr velocidades de agitación elevadas,
provoca sobre el hongo modificado su capacidad productora.
84
Análisis
Variación del esfuerzo cortante y la viscosidad aparente con el
gradiente de velocidad para las diferentes velocidades de agitación a
las 72 horas de fermentación
Gradiente de
velocidad (s1
)
200
400
600
800
1000
200
rpm
0.30
0.18
0.16
0.13
0.12
300
rpm
0.33
0.22
0.18
0.15
0.14
400
rpm
0.44
0.26
0.21
0.19
0.16
Elabore las gráficas correspondientes
85
Esfuerzo
(N/m2)
Viscosidad aparente
(Nm2/s)
200
rpm
35
48
59
65
70
300
rpm
55
67
80
86
95
400
rpm
66
84
92
103
110
Análisis
Concluya:
Un proceso de fermentación es un proceso complejo donde hay que
tener un cuenta muchas variables ya sean físicas como la
temperatura, la presión; fisicoquímicas como el pH y fisiológicas del
microorganismo, también afectan los aspectos mecánicos y de diseño
es por esta razón que al hacer una fermentación debemos estudiar
muy a fondo todas estas variables para el producto a fabricar.
86
ESTUDIO DE CASO APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA EN LA
INDUSTRIA ENOLÓGICA
Para comprender la aplicabilidad de la biotecnología en la industria
enológica es importante que usted recuerde el proceso de producción
e identifique los puntos críticos de control. Elabore entonces, un
resumen que le permita alcanzar este objetivo.
Durante la elaboración de vinos, la contaminación por Brettanomyces/Dekkera,
es especialmente problemática y causa a nivel mundial pérdidas que
Fulgelsang y otros en 1993 estimaron en muchos millones de dólares anuales.
Teniendo en cuenta lo anterior, es importante aplicar sistemas rápidos y
eficaces de detección, así como conocer el origen de las contaminaciones para
evitar en lo posible su acceso al vino. Al igual que en el primer caso, la
información presentada a continuación corresponde a una serie de
afirmaciones y está intercalada con preguntas que permiten consolidar
conceptos y promover la solución del problema.
Antes de comenzar, revise la literatura buscando información sobre
las levaduras Brettanomyces/Dekkera.
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
Facilite la comprensión, ubicando cada afirmación sobre el diagrama
de flujo del proceso o construyendo un diagrama de flujo que permita
visualizar los experimentos presentados.
87
Las levaduras Brettanomyces/Dekkera conforman uno
contaminantes más problemáticos en la industria enológica.
de
los
grupos
Requerimientos para su desarrollo
Se adaptan fácilmente a medios que contienen 15% v/v de etanol,
escasa o nula presencia de azúcares y alta presión de CO2.
Se han encontrado cepas de Brettanomyces/Dekkera en vinos tan diferentes
como Jerez, tintos de crianza en barril o espumosos embotellados.
Características organolépticas de los vinos
afectados por Brettanomyces/Dekkera
Las características organolépticas son muy variables dependiendo
del tipo de vino de que se trate. La levadura Brettanomyces/Dekkera
confiriere propiedades como olor a ratón, a animal, a especia o a
madera húmeda, que obedecen a la presencia de compuestos
derivados de su metabolismo como el ácido acético o fenoles volátiles
como los derivados del ácido p-cumárico entre otros.
La pregunta ahora es, ¿dónde realizar el control?
Solución
Es importante el análisis de todas las instalaciones de la vendimia,
ya que una proliferación sin control en alguna fase inicial del proceso
de vinificación podría provocar una propagación extensiva a fases
más tardías.
88
Métodos para la detección de Brettanomyces/Dekkera
Método convencional: Depende del aislamiento e identificación de las cepas
y es tan poco eficiente que existen casos en los que los vinos llegan a
manifestar una clara alteración organoléptica sin que las pruebas detecten a
tiempo la presencia de este contaminante. El proceso consiste en filtrar por
membrana estéril y sembrar en medio selectivo, por ejemplo con cicloheximida.
Éste método casi siempre resulta ineficaz debido a que en el ecosistema
proliferan numerosas especies microbianas y la mayoría de ellas presentan, en
medios de laboratorio, un crecimiento mucho más rápido que la
Brettanomyces/Dekkera, lo que enmascara su presencia e impide su detección.
Una vez se logra el aislamiento de la cepa, ésta se puede identificar mediante
métodos taxonómicos convencionales.
Describa en qué consisten:
1. El método de Elisa.
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
2. El método de cromatografía para realizar perfil de ácidos grasos.
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_____________________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
89
3. El método de PCR
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
______________________________________________________
____________________________________________________
______________. Éste es un procedimiento eficaz y presenta
sensibilidad de hasta una célula por muestra.
A continuación se describe el proceso experimental que permite
observar
la
eficacia
del
método
de
detección
de
Brettanomyces/Dekkera en instalaciones de vendimia mediante PCR
Controles para la detección por PCR
Cepas de levaduras:
Dekkera anómala STCC1008, CBS77
Dekkera bruxellensis STCC1451, CBS74, OSB101
Medio selectivo YPD:
Extracto de levadura
Glucosa
Peptona
Agar
Etanol
Cicloheximida
1%
2
2
2
10
0,005%
Muestreo
En las uvas
1. Tomar las uvas de las
viñas antes de entrar
en el lagar1.
2. Introducir las muestras
90
En las instalaciones
Tomar las muestras al
finalizar la jornada de
trabajo en el lagar, de
dos formas diferentes:
En las moscas
Drosophila
Coger, de la zona a
investigar, las moscas
vivas y mantenerlas en
frascos estériles a 4 ºC
en bolsas estériles.
3. Procesar las muestras
el mismo día de su
recogida.
1
1. Directamente 10 ml
hasta su procesado.
de agua de lavado de
las distintas
instalaciones de tubo
estéril.
2. Por contacto con hisopo estéril y resuspensión en 10 ml de agua
destilada estéril.
Mantener las muestras a
4 ºC hasta procesarlas al
día siguiente.
Lagar: Sitio donde se pisa o se prensa la uva.
Aislamiento de Brettanomyces/Dekkera
En uvas
En moscas Drosophila
Sumergir 15 - 20 granos
de uva en 50 ml de agua
estéril con SDS1 al
0,005%.
Introducir 5 - 10 moscas en un tubo ependorf con
100 µl de agua destilada estéril. Agitarlas. Retirar
la muestra de agua con-teniendo las levaduras en
suspensión y diluir2 o concentrar3 según la densidad celular. Sembrar 40 µl por extensión en cajas
de medio selectivo. Incubar a 30 ºC hasta por 10
días.
1
Como paso previo se realizó un experimento que permitió concluir que el
tratamiento con SDS no afecta la viabilidad de Brettanomyces/Dekkera, y por
tanto que es factible su aplicación a muestras reales.
2
La dilución se realiza de 10 a 106 veces según densidad, añadiendo agua
destilada estéril.
3
La concentración se realiza por filtración de 0,1 ml a 2 ml de la muestra a
través de membranas estériles de 0,22 µm de poro. En este caso se
depositan las membranas en placas Petri de medio selectivo.
Identificación de las colonias aisladas mediante PCR
Se buscan colonias que cumplan con las características descritas a
continuación, razón por la cual se recomienda hacer preparaciones para la
observación al microscopio óptico.
91
Características de la Brettanomyces/Dekkera
Pigmentación: Blanca o crema.
Morfología: Semiesférica, normalmente elipsoidales, muchas
ojivales o de cilíndricas a alargadas.
Textura: Brillante y lisa, a veces con relieves.
Tamaño: Pequeño, 2 - 6,5 x 4 - 22 mm.
Incluya en esta sección, la representación gráfica o una imagen
fotográfica de Brettanomyces/Dekkera.
Para confirmar que dicha colonia es efectivamente de Brettanomyces/Dekkara,
se realiza la identificación por PCR.
Procedimiento para identificación por PCR
Tomar con punta de pipeta estéril una porción de células
(del orden de 105) de la colonia.
Resuspenderlas directamente en la mezcla de la primera reacción
de PCR, con un volumen final de 50 µl.
Realizar el ensayo en un Termo Gene 1.7 (Bio-Rad).
Cuando el PCR genera un fragmento de ADN con los cebadores
empleados (ensayo positivo), la colonia es inequívocamente
perteneciente a una cepa de Brettanomyces/Dekkera.
92
Detección directa de Brettanomyces/Dekkera por PCR
En uvas1
En las instalaciones
En moscas Drosophila
Tomar 3 µl de muestra y Introducir 10 moscas de
añadirlos directamente a cada muestra en un tubo
ependorf con 100 ml de
la mezcla de la primera
reacción de PCR (sin Taq YPD. Mantener a tempepolimerasa). Mantener a ratura ambiente durante
1 hora. Resuspender el
100ºC durante 10 min.
contenido del ependorf.
en el termociclador.
Centri-fugar por 10 min. Tomar 3 µl para iniciar la
Tomar 3 µl para la
primera reacción de PCR,
a 6000 rpm. Añadir la
prime-ra reacción de PCR Taq poli-merasa e iniciar y 2µl de ésta para la sey una vez concluida,
la ampli-ficación por
gunda una vez concluida
2
emplear 2 µl de la
PCR .
la primera reacción.
primera reacción para
realizar la segunda.
1
Los compuestos de mosto de uva inhiben la reacción de amplificación por
PCR, por lo cual las uvas que de la recolección vienen impregnadas de
mosto, requieren un procedimiento diferente.
2
Si la densidad de levaduras es baja, la muestra debe concentrarse mediante
centrifugación y luego resuspenderse el precipitado en 10 µl de agua
destilada estéril.
Tomar 2 uvas por muestra. Incubar durante 5
días a 30 ºC en 5 ml de
medio líquido YPD enriquecido con gentamicina
al 0,025% y oxitetraciclina al 0,050%.
Consideraciones
Un positivo en la primera reacción indica que la muestra analizada
contiene más de 1000 células de esta levadura.
Un negativo en la primera que genera positivo en la segunda reacción
representa una muestra que contiene entre 1 y 1000 células
contaminantes.
¿Es fácil eliminar esta levadura, una vez instalada en la industria
vinícola?
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93
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Busque por lo menos dos métodos para lograrlo y explíquelos.
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Enuncie otros contaminantes biológicos que afectan la producción de
vinos e indique las alteraciones que producen en los mismos.
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Al aplicar la técnica descrita sobre muestras de diferentes fases del proceso y
materiales de las instalaciones de vendimia, en una fábrica dada; así como
sobre muestras de uva intacta provenientes de los viñedos que la alimentan, y
sobre Drosophilas propias del área de trabajo, se encontraron los siguientes
resultados:
Aislamiento e identificación de cepas
1
En uvas
No. de controles
Resultados de los controles
1. En muestras procedentes de
superficies con restos de
mosto
2. En muestras procedentes de
superficies sin restos de
mosto
No. de colonias que crecieron en
las cajas de medio selectivo
94
En las instalaciones
10
Se cubrieron con bacterias
u hongos, ocultando la
presencia de la levadura.
Crecieron en promedio 80
colonias, las cuales fueron
identificadas positivamente por PCR.
610
2000
Resultados de las muestras
reales, en muestras procedentes
de superficies con restos de
mosto
No. de cajas que presentaron
características macroscópicas y
microscópicas parecidas a las
cepas de
La mayoría de las muestras daban cajas cubiertas
de bacterias u hongos
20
56
0
2
1. Suelo de la zona de
depósitos de
almacenamiento del
vino recién fermentado
2. Exterior del depósito de
almacenamiento
• Los aislamientos en
caja de medio selectivo
no son eficaces para
detectar y controlar la
existencia de estas
levaduras.
• Las dos colonias que
dieron positivo, indican
la presencia de
Brettanomyces/Dekkera
Número de pruebas por PCR
positivas
Origen de las muestras
contaminadas
Conclusión
Ninguno de los
aislamientos correspondía
a este tipo de levaduras.
Brettanomyces/Dekkera
en las instalaciones
1
Para realizar los controles: Se añaden células de alguna de las cepas de Brettanomyces o
Dekkera a distintas muestras de forma que en las siembras en caja de medio selectivo
pudieran crecer de 100 a 200 colonias de estas levaduras.
Al observar los resultados, se encontró que las muestras procedentes
de superficies con mosto se cubren con bacterias u hongos. Explique
este fenómeno
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95
Detección por PCR de Brettanomyces/Dekkera en uvas
Primera Segunda
reacción reacción
de PCR de PCR
Muestra
Control positivo (agua + 105 células)
Uva sana viña 1 + 10 células de Brettanomyces/Dekkera
Uva sana viña 1
Uva sana viña 2 + 10 células de Brettanomyces/Dekkera
Uva sana viña 2
Uva sana viña 3 + 10 células de Brettanomyces/Dekkera
Uva sana viña 3
Uva sana viña 4 + 10 células de Brettanomyces/Dekkera
Uva sana viña 4
Uva sana viña 4 + 10 células de Brettanomyces/Dekkera
Uva sana viña 1
Uva sana viña 4 + 10 células de Brettanomyces/Dekkera
Uva sana viña 2
Uva podrida viña 1 + 10 células de
Brettanomyces/Dekkera
Uva podrida viña 1
Uva podrida viña 2 + 10 células de
Brettanomyces/Dekkera
Uva podrida viña 2
Control negativo (agua)
Fuente: Alguacil et al., 1998
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Elabore el análisis de estos resultados y conteste las siguientes
preguntas:
1. ¿Se
constata
en
forma
directa
Brettanomyces/Dekkera?_____ ¿Por qué?
la
presencia
de
_______________________________________________________
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_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
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96
2. ¿Qué función cumple el tratamiento de incubación con YPD durante
6 días?
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Detección por PCR de Brettanomyces/Dekkera en las instalaciones
Procedencia de la muestra
Tolva de recepción de uva y bomba de pistón
Característic A1 B2 C3
a
Agua lavado
Hisopo estéril
Desagüe de la zona de la tolva
Hisopo estéril
Tubería de conducción de uva
Agua lavado
Hisopo estéril
Zona de prensas horizontales
Agua lavado
Pocijón de las prensas
Agua lavado
Tubería de conducción del mosto
Agua lavado
Depósitos de desfangado
Agua lavado
Líneas de trasiego
Agua lavado
Suelo del lagar en la zona de fermentación
Hisopo estéril
Exterior depósito de reposo
Hisopo estéril
Suelo de lagar en la zona de depósitos en reposo Hisopo estéril
Pared del lagar en la zona de depósitos en reposo Hisopo estéril
7
2
1
7
1
7
6
6
8
1
1
1
1
1
4
1
1
3
1
3
2
3
0
0
0
1
1
0
1
0
0
3
0
2
2
3
6
1
0
0
0
0
TOTAL
50 20 18
1
Número de muestras
2
Número de muestras que dieron positivo en la 2ª reacción de PCR
3
Número de muestras que dieron negativo incluso en los controles positivos
Fuente: Alguacil et al., 1998
97
Análisis
La presencia de las innumerables bacterias y hongos que proliferan en
zonas con restos de mosto imposibilita el aislamiento tradicional de
colonias para analizar la presencia de levaduras contaminantes, aunque
este procedimiento ha permitido constatar su presencia.
Como en 20 de las 50 muestras tomadas se detectó la presencia de
Brettanomyces/Dekkera, en 12 no se detectó, y en las 18 restantes se
encontraron resultados negativos (incluso en el control positivo),
puede afirmarse que hay presencia de inhibidores, los cuales impiden
obtener conclusiones para estas últimas.
Continúe usted con el análisis.
Detección por PCR de Brettanomyces/Dekkera en las moscas
Procedencia de la muestra
Control positivo (agua + 105 células de Brett/Dekkera)
Zona de prensas (orujos)
Zona de prensas (orujos) + 10 células de Brett/Dekkera
Uva antes de molturar
Uva antes de molturar + 10 células de Brett/Dekkera
Boca de depósito de almacenamiento A
Boca de depósito de almacenamiento A + 10 cls de
Brett/
Boca de depósito de almacenamiento B
Boca de depósito de almacenamiento B + 10 cls de
Brett/
Control negativo (agua)
Fuente: Alguacil et al., 1998
98
Primera Segunda
reacción reacción
de PCR de PCR
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Análisis
En la tabla se observa que 3 de las 4 muestras procesadas dan positivo
para Brettanomyces /Dekkera, razón por la cual puede pensarse que
la mosca Drosophila colabora con la difusión del contaminante. Ésta
explicación se consolida aún más, al revisar los resultados anteriores,
en los cuales se confirma la presencia de las levaduras tanto en las
uvas como en las instalaciones de vendimia.
Conclusiones
Las levaduras están presentes en numerosas partes de las instalaciones
especialmente en la zona de recepción, conducción y prensado de la
uva. Aunque no resultaron positivos los análisis en los depósitos de
desfangado, estos valores no son significativos ya que la particular
composición del mosto inhibe el PCR, y de hecho en 6 de los 8 análisis
realizados no se obtuvo positivo en el control al que expresamente se
añaden levaduras contaminantes, por lo que no se puede excluir la
presencia de Brettanomyces/Dekkera en estos depósitos.
BIBLIOGRAFÍA DE APOYO
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la práctica. Editorial Acribia. Zaragoza. 1994
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Ibis S.A. Barcelona. 1994
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azúcares solubles en la fermentación experimental para la obtención de
cerveza. Alimentación, Equipos y Tecnología. Mayo. 1997
100
101