TECNICAS DE DIAGNOSTICO DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO J López M MV MSc microbiología Fac Cs Veterinaria U de Concepción, Chile DAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO: AISLAMIENTO: Siembras en medios de cultivo Inoculación de cultivos celulares (Clamydia spp. , Clamydophila spp., Lawsonia intracelularis, micoplasmas en cultivos, etc.) Inoculación de animales de laboratorio o de aves (en determinados diagnósticos). AISLAMIENTO E IDENTIFICACION 1) relacionar con : Ex parasitológicos, bioquímicos, toxicológicos , virológicos, antec. Clínica, Anatomía Patológica, Epidemiología 2) Si agente primario o secundario 3) Los resultados positivos (aislamiento) no siempre implican la causa del proceso 4) Los resultados negativos no siempre comprueba ausencia del agente etiológico 5) Considerar contaminantes ambientales, portadores sanos o la flora normal 6)Tipo de muestra 7) Métodos y técnicas de siembra utilizados 8)Tiempo transcurrido entre toma de muestra y siembra bacteriológica 9) Animales tratados o no (antibióticos, quimioterapeúticos, vacunación) Esquema Técnicas Diagnóstico General Muestras (signos y lesiones) Estado agudo (muestra representativa) Estado crónico o sospecha de cepas de baja patogenicidad (varios tipos de muestras) Animales vivos (secreciones) Animales sacrificados (tejidos y orgános Incubar 370 C c/ ó s/ 5% CO2 (24, 48 horas hasta 7 días) Medio de cultivos Enriquecimiento Mejorados Selectivos Diferenciales Detección del microorganismo Aislamiento Detección de los anticuerpos específicos Estudio de caracteres Bioquímicos Digitonina, Fermentación de la glucosa Hidrólisis urea Hidrólisis arginina Técnicas moleculares Film y Spot Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Hibridación de ácidos nucleicos (HAN) Polimorfismo de fragmentos de restricción (RFLP) Análisis del DNA polimorfico (RAPD) Serológicos Seroaglutinación rápida en placa Inhibición de la hemoaglutinacion ELISA Dot-ELISA Inmunoperoxidasa de las colonias Inmunofluorescencia de las colonias Inhibición del crecimiento IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS AISLADAS COLONIAS: Crec (24 H o 48 H o más) Comparar crec AS y medios selectivos Observación: Tamaño, Hemólisis (presencia y tipo), Pigmento, Olor Lisas o rugosas, Planas o convexas, Bordes netos o irregulares, Opacas o translúcidas, Viscosas , mucosas o butiráceas, Brillantes, brillo metálico o sin brillo, Húmedas, como gotas de rocío o secas Morfología, disposición y tinción Gram (u otra) Obtener un cultivo a partir de una colonia separada BACTERIAS DE INTERÉS EN VETERINARIA: - Quimioorganotróficas - Mesófilas - 32º C y 35º C - Crecen AS carnero, las NO: Staphyococcus aureus (Agar Chocolate) - Anaero fac - Aerobiosis ( anaero fac, aero estrictas (met oxid) y anaero aerotolerantes (met ferm), las NO: microaerófilas anaerobias estrictas - No esporulan (excep Bacillus y Clostridium) - No AAR (excep Mycobacterium, Nocardia asteroides y Corynebacterium pseudotuberculosis) - Utilizan la glucosa (hay excep) Algunos TIPS para el diagnóstico BACTERIOLÓGICO BACTERIAS GRAM - DE INTERÉS VET, CREC RÁPIDO (24 H A 37º C), AS, AEROBIOSIS: Oxidasa, prueba más importante en su iden. EN 24 HORAS OXIDASA NEGATIVAS Familia: Enterobacteriaceae Acinetobacter (Dif TSI, OF y Mc Conkey -) DAGNÓSTICO. Esquema Muestras: Tejido, Heces, Leche, etc. Rutina Sospecha de Salmonella Sospecha de Yersinia * Agar Sangre, Agar MacConkey Lactosa + Caldos enriquecidos: Tetrationato Selenito, Rappaport ¿Kauffmann? Lactosa - Investíguese E. coli usando “IMVIC” Enriquecimiento en frío Subcultivo a las 24 horas Agar Verde Brillante, Agar MacConkey ¿SS? Colonias sospechosas Tubo con Agar inclinado TSI y prueba de la lisisna descarboxilasa IMVIC”+ “IMVIC - Lactosa + E. coli Pruebas de serottipificación o enteropatogenicidad Lactosa - Otras enterobacterias Si seconsidera significativo, identificar con pruebas bioquímicas Negativo Sueros polivalentes a Salmonella Positivo Serotipficación completa * Verde brillante, SS BACTERIAS GRAM - DE INTERÉS EN VETERINARIO, CREC LENTO (A 37ºC) EN AS, AEROBIOSIS: Descartar trat en el animal, TºC incubación u otro Actinobacillus (algunas spp, medio selectivo) Yersinia (col pequeñas 24 H Yersinia pseudotuberculosis en casos crónicos), crece en medios selectivos para enterobacterias oxidasa Brucella spp. , las que no necesitan microaerofilia Haemophilus spp, los que no necesitan Factor V CREC SÓLO AS CON STAPHYLOCOCCUS AUREUS (AGAR CHOCOLATE): Haemophilus spp. que necesitan Factor V Actinobacillus pleuroneumonie que necesita factor V (puede crecer a las 24 H de incubación) BACTERIAS GRAM POSITIVAS CULTIVABLES EN AEROBIOSIS BACILOS: COCOS: CATALASA + CATALASA - NO RAMIFICADOS CATALASA + CATALASA RAMIFICADOS COCOS CATALASA + CATALASA - Staphylococcus Streptococcus Micrococcus Diplococcus pneumoninae BACILOS NO RAMIFICADOS CATALASA + Listeria Corynebacterium (excepto Corynebacterium haemoliticum y actual Arcanobacterium pyogenes) Rhodococcus equi Bacillus Gruesos esporulados en determinadas condiciones) BACILOS NO RAMIFICADOS CATALASA - Erisipelothrix Lactobacillus Arcanobacterium pyogenes (hemólisis beta) Bacillus (algunos) BACILOS RAMIFICADOS Nocardia Streptomyces Dermatophilus congolensis Actinomyces (después del primer aislamiento) ANAEROBIOS ESTRICTOS GRAM POSITVAS: • Clostridium spp. (son bacilos gruesos) • (Corynebacterium ) E suis. Riñón y orina de cerdo. •Actinomyces bovis. Primocultivo de maxilar y/o lengua de bovinos GRAM NEGATIVAS: Dichelobacter nodosus y Bacteroides necrophorum. Patología de las extremidades en rumiantes (Pododermitis) Brachyspira hyodysenteriae. Intestino de cerdo. Streptobacillus moniliformis Primocultivo (produce poliartritis en ratones y artritis en pavos). Asistencia obligatoria: Miércoles 02 de septiembre a práctico demostrativo. API y cómo leer e interpretar resultados PRUEBAS ADICIONALES A LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS: Pruebas serológicas (algunas). Ej., Salmonella, Mycoplasmas spp., Fagos (algunas) Se han usado en la identificación de algunos géneros y de especies Inoculación de animales de laboratorio (pocas), para la determinación del poder patógeno, virulencia o caracteres toxigénicos Técnicas de ácidos nucleicos (Iden. algunos géneros y especies) TAREA (Del Miércoles 27 de agosto al Miércoles 10 de septiembre): Leer, entender, explicar y comunicar un artículo científico que utilice técnicas de diagnóstico bacteriológico NO TRADICIONAL Exponer trabajo Miércoles 10 de septiembre Otras Técnicas Otros métodos de laboratorio: RECUENTO BACTERIANO 1 Métodos Directos Recuento Bacteriano 2 Métodos Indirectos: a) APC, b) SPC a) b) Un Ej., DETECCION SALMONELLAS METODOS DE DETECCION: ALIMENTOS YAMBIENTE Pre-enriquecimiento (16 a 20 horas) Enriquecimiento (24 horas) Identificación (1 a 3 horas) CLINICA/PATOLOGIA EnriquecimientoDirecto (24 horas) Aislamiento directo (24 horas) Aislamiento (24 horas) Identificación (1 a 3 horas) Identificación (1 a 3 horas) Antibiograma (24 horas) Aislamiento (24 horas) CUALITATIVO (1/10) Usualmente 25g de muestra, aunque puede ser más para ampliar la sensibilidad. 0,1 a 1 Salmonella/g CUALITATIVO (10/100) Usualmente 2g de heces en 20 mL de medio de enriquecimiento. De 5 a 50 Salmonella/g CUANTITATIVO Usualmente 0,1 ml en una placa = 0,002g de heces) 500 Salmonella/g Fecas Otro Ej., DIAGNÓSTICO E IDENTIFICACIÓN DE CAMPYLOBACTER A1 direct o Medio de Skirrow Medio de Butzler Campybap Medio de Skirrow modificado Examen directo 48 h, 42-43 ºC A2 indirecto Medio selectivo Campy thio u otro (4 ºC, 18 h) – (42ºC) 48 h, 42-43 ºC OTROS MÉTODOS: PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A NTIMICROBIANA A) B) -Confluente - Semi confluente MÉTODOS SEROLÓGICOS AGLUTINACIÓN a) Simple: b) Microaglutinación (PDF anexo) IF ó IP FC IHA ELISA (PDF anexo) ID METODOLOGÍAS Los análisis de separación EP electroforesis Partículas Antígeno-Anticuerpo ensayos de reacción DA aglutinación directa HA Hemagllutination FC Citometría de Flujo LA aglutinación del látex (aglutinación de partículas de látex) Antígeno-anticuerpo solubles ensayos de reacción ID Identificación Inmunodifusión CoA coaglutinación HI Inhibición de la hemaglutinación RID Inmunodifusión radial RID NEPH nefelometría CIE Contrainmunoelectroforesis IEP Inmunoelectroforesis IFIX Inmunofijación Los ensayos inmunohistoquímicos FA anticuerpos fluorescentes Procedimientos de inmunoensayo RIA radioinmunoensayo DFA directa de anticuerpos fluorescentes IRMA radioinmunométricos Prueba RAST Radioalergoabsorbencia IFA inmunofluorescencia indirecta FPIA inmunoensayo de polarización fluorescente ACIF anticomplemento inmunofluorescencia ABIF avidina-biotina inmunofluorescencia Los ensayos de quimioluminiscencia CL EIA inmunoensayo enzimático EMIT de inmunoensayo enzimático-multiplicada Micro-IF micro-inmunofluorescencia ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Inmunoperoxidasa IP Captura del anticuerpo IgM MAC ICA Inmuno Ensayo Micropartículas MEIA Inmunoensayo enzimático RIPA radioinmunoprecipitación Ensayo IAA ImmunoArray Ensayo Técnicas de Biología Molecular Dot-Blot ADN Dot-blot hibridación Polimerasa Chain Reaction PCR RT-PCR PCR transcriptasa inversa SB Southern Blot NB Northern Blot BM inmunotransferencia / Western Blot RBC líticas ensayos para detectar Reacciones Antígeno-Anticuerpo CF Fijación de Complemento Nt Neutralización Técnicas Moleculares